CN102028674A - 针叶聚戊烯醇在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了针叶聚戊烯醇在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。针叶聚戊烯醇是从松属、云杉属、落叶松属、冷杉属和雪松属等松科植物的针叶中提取分离纯化所得，它们是由14～24个异戊烯基单元组成的长链多萜类化合物。细胞和动物实验结果显示，针叶聚戊烯醇对阿尔茨海默病具有防治作用，其表现为针叶聚戊烯醇对β-淀粉样蛋白所致的PC12神经细胞损伤具有保护作用，能够提高痴呆小鼠被动回避记忆能力和空间学习记忆能力。因此针叶聚戊烯醇可用于制备防治阿尔茨海默病的药物。

Description

针叶聚戊烯醇在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及针叶聚戊烯醇的医药新用途，具体来说是指针叶聚戊烯醇在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病又称老年痴呆症，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，表现为进行性的记忆和认知功能的下降，行为异常和社交障碍。随着人类寿命的延长，以及社会老龄化时代的到来，阿尔茨海默病的发病率正日益增高，已成为仅次于心脏病、癌症、中风等导致老年人死亡的第四大杀手，预防和治疗阿尔茨海默病已成为世界各国关注的热点问题。目前对阿尔茨海默病的主要治疗措施有胆碱酯酶抑制剂治疗、基因载入治疗、抗氧化剂治疗、他汀类药物治疗、非甾体抗炎药治疗、激素替代疗法、阻断兴奋性中毒、疫苗治疗和免疫治疗等。这些治疗措施能够短暂提高记忆力，但由于自身的局限性而很难在临床长期应用。因此，研究开发新型有效的阿尔茨海默病防治药物具有重要意义。

针叶聚戊烯醇是从松属、云杉属、落叶松属、冷杉属和雪松属等松科植物的针叶中提取分离纯化所得，它们是由14～24个异戊烯基单元组成的长链多萜类化合物，与哺乳动物脏器中所含的多萜醇具有相似的结构特征和生理活性。针叶聚戊烯醇经生物代谢可转化为体内所需的多萜醇，参与细胞膜糖蛋白的生物合成，对于维持机体生命活动具有重要作用。现代药理研究表明，针叶聚戊烯醇能够促进机体造血功能、改善肝脏机能，对再生障碍性贫血、肝脏疾病、糖尿病以及高血脂、痛风、红斑狼疮等免疫功能疾病具有一定的疗效，且无毒副作用。

发明内容

本发明的目的就是为了克服目前治疗阿尔茨海默病无疗效好的药物的缺点，公开了针叶聚戊烯醇在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，提供了一种以针叶聚戊烯醇为有效成分制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，具有疗效好、无毒副作用的优点。

本发明的技术方案为：针叶聚戊烯醇在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

本发明的细胞实验表明，针叶聚戊烯醇对β-淀粉样蛋白诱导的PC12神经细胞损伤具有保护作用。动物实验也显示，针叶聚戊烯醇能够提高痴呆小鼠被动回避记忆能力和空间学习记忆能力。因此针叶聚戊烯醇可用于制备防治阿尔茨海默病的药物。

本发明以针叶聚戊烯醇为有效成分，配以药学上可接受的载体或赋形剂，按常规工艺制成片剂、颗粒剂、胶囊、软胶囊、滴丸、口服液或注射液等药物剂型，也可与其它药物活性成分复配制成复方制剂。

有益效果：

1、本发明的针叶聚戊烯醇对阿尔茨海默病具有防治作用，可用于制备防治阿尔茨海默病的药物，且无毒副作用。

2、本发明选择松针作为原料，资源丰富，来源广阔，开发利用成本低廉，且来自森林，受污染少。

3、本发明的针叶聚戊烯醇安全无毒，药理作用强，并可制成片剂、颗粒剂、胶囊、软胶囊、滴丸、口服液或注射液等药物剂型。

4、本发明为松针资源的药物利用开辟了一条新的途径，开拓了一个新的医药应用领域。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们并不是对本发明的限制。

本发明所述的针叶聚戊烯醇，是以松属、云杉属、落叶松属、冷杉属或雪松属等松科植物针叶为原料，通过溶剂提取、冷冻沉淀分离、溶剂萃取、柱层析分离或分子蒸馏等方法制备的针叶聚戊烯醇，可通过中国专利公开号CN 101397239A或CN 101654398A中记载的方法制备。

实施例1：针叶聚戊烯醇的提取

针叶聚戊烯醇的提取，同中国专利公开号CN101654398A中记载的方法，新鲜针叶烘干粉碎后，通过石油醚提取、稀碱皂化、石油醚萃取、减压浓缩、丙酮溶解、冷却除杂、乙醇萃取、丙酮溶解、冷冻沉淀分离和滤饼真空干燥后，制得针叶聚戊烯醇。

实施例2：针叶聚戊烯醇软胶囊

以针叶聚戊烯醇为药物活性成分，加入精制植物油、乳化剂、明胶、甘油、着色剂等辅料，按常规工艺经配料、化胶、压丸、定型、干燥，制成软胶囊剂型。

实施例3：针叶聚戊烯醇对β-淀粉样蛋白诱导PC12神经细胞损伤的保护作用

1材料与方法

1.1实验材料

针叶聚戊烯醇，纯度为76.2％，用DMSO配制成10^-2mol/L溶液，4℃保存备用。Aβ_1-42，购自北京博奥森公司，用生理盐水配制成1g/L的母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置37℃温育7天，“老化”为具有神经毒性的聚集状态，-20℃保存备用。

1.2药物处理

取对数生长期PC12细胞计数后以4×10⁵/mL的密度接种于96孔培养板培养，每孔150μl。将细胞分为3组：正常对照组，加入等量DMSO溶液；模型对照组，加入老化7天的Aβ_1-4250μmol/L孵育48h；聚戊烯醇组，加入终浓度为25、50、100μmol/L的针叶聚戊烯醇孵育1h，然后再入终浓度为50μmol/L的Aβ_1-42孵育48h。每组设6孔，实验重复3次。

1.3MTT法检测细胞存活率

PC12细胞按1.2节药物处理后，加入MTT使其终浓度为0.5mmol/L，37℃继续孵育4h后，吸出培养液，每孔加入150μl的DMSO溶液，振摇10min使充分溶解，用酶标仪于570nm处测定吸光度(OD值)。

1.4LDH法测定乳酸脱氢酶活性

吸取1.3节各组细胞培养上清液，按试剂盒所述方法进行LDH活性测定，并按公式计算各组细胞上清液LDH活力。

2结果

2.1细胞存活率测定

MTT法实验结果见表1，与正常对照组相比，模型对照组OD值显著降低(P＜0.01)，说明线粒体脱氢酶活性低，活细胞较少，Aβ_1-42对PC12细胞有很强的损伤作用；与模型对照组相比，聚戊烯醇50μmol/L和100μmol/L剂量组的OD值显著升高(P＜0.05、P＜0.01)，说明线粒体脱氢酶活性高，活细胞数多，提示针叶聚戊烯醇对Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤具有显著的保护作用，且呈现良好的量效关系。

2.2LDH活性测定

LDH法实验结果见表1，与正常对照组相比，模型对照组上清液LDH活性显著升高(P＜0.01)，说明细胞膜损伤严重，有大量LDH漏出；与模型对照组相比，聚戊烯醇50μmol/L和100μmol/L剂量组的上清液LDH活性显著降低(P＜0.05、P＜0.01)，说明细胞膜损伤减轻，提示针叶聚戊烯醇具有显著保护细胞膜的作用，且呈现良好的量效关系。

表1MTT、LDH测定结果(n＝6×3)

注：与正常对照组相比，^##P＜0.01；与模型对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例4：针叶聚戊烯醇对β-淀粉样蛋白引起痴呆(AD)小鼠学习记忆的改善作用

1材料与方法

1.1实验材料

针叶聚戊烯醇，纯度为76.2％wt，用植物油配制成母液，加入生理盐水和少许吐温80稀释混匀至所需浓度。石杉碱甲片剂，购自上海复华药业有限公司，溶于乙醇配成母液，生理盐水稀释至所需浓度。Aβ_1-42，购自北京博奥森公司，用生理盐水配制成1g/L的母液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置37℃温育7天，“老化”为具有神经毒性的聚集状态，-20℃冻存备用。

1.2实验动物

ICR清洁级雄性小鼠，由南通大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(苏)-2003-0002。

1.3分组及给药

将ICR小鼠随机分为正常对照组、假手术组、AD模型组、阳性药石杉碱甲组(石杉碱甲0.3mg/kg)、聚戊烯醇低剂量组(20mg/kg)、中剂量组(40mg/kg)、高剂量组(80mg/kg)组，每组20只动物。药物灌胃量为0.1ml/10g体重，灌胃给药14天后行右侧侧脑室注射Aβ_1-42，造模后继续给药7天，然后开始进行学习记忆能力测试。正常组、假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

1.4被动回避实验——避暗实验

避暗实验可用于检测动物的被动回避学习记忆能力。避暗实验为期2天，第1天进行学习记忆训练，第2天进行测试。实验第1天将小鼠头朝外放入避暗箱明室，暗室底部电栅通电(0.4mA，50HZ)。小鼠一般会因为趋暗的习性进入暗室，受到电击1～2次后会产生记忆。24h后进行测试，将小鼠头朝外放入明室，同时启动计时器，记录小鼠从放入明室至首次进入暗室并遭电击的时间(潜伏期)及小鼠四肢全部进入暗室的次数(错误次数)，测定时限为300s。如小鼠在5min内未进入暗室，其潜伏期以300s计，并记录5min内小鼠进入暗室的次数(错误次数)，评价其被动回避学习记忆功能。

1.5空间辨识实验——Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验在侧脑室注射后第7天进行，为期5天，前4天为定位航行试验，第5天为空间搜索试验。Morris水迷宫的直径1m，水深30cm，水面高于站台1cm，实验过程中水温保持在20～25℃。实验前一天将动物放置于站台上站立60s，进行站台适应训练。

1.5.1定位航行实验

将水迷宫平台置于第4象限，每天将小鼠从1、2、3、4四个象限(4个入水点)分别面向池壁放入水中，使其自由游泳90s。动物在爬上站台后，让动物在站台上站立10s。若动物在90s内未找到水池中的站台或未能爬上站台，则将动物引领至站台上站立30s后将其从平台上取下休息，这时潜伏期记为90s。共进行4个训练日。记录和监测动物自入水至爬到站台上所需时间(逃避潜伏期)、以及小鼠从入水至找到站台的游泳路程。

1.5.2空间探索实验

定位航行实验后，第5天撤除平台。任选一象限将各组小鼠依次从该象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，记录动物自入水后第一次到达原站台所在位置所需的时间(第一次穿环时间)和90s内探索游过原平台所在位置区域的次数(穿环次数)。

实验时采用各实验组的组间循环和每组内的动物循环相结合的随机实验方式进行，数据采集和处理均由图像自动监视和处理系统完成。

2结果

2.1针叶聚戊烯醇对AD小鼠避暗实验的影响

由表2可以看出，正常对照组和假手术组小鼠之间潜伏期和错误次数无明显差异；与正常对照组和假手术组相比，AD模型组小鼠的潜伏期显著缩短、错误次数显著增加(P＜0.01)，表明侧脑室注射Aβ_1-42对小鼠被动回避记忆能力造成损害；聚戊烯醇中、高剂量组与AD模型组相比，潜伏期显著延长，错误次数显著减少(P＜0.05、P＜0.01)，高剂量组的作用与石杉碱甲组接近，提示针叶聚戊烯醇具有改善AD小鼠被动回避记忆能力。

表2针叶聚戊烯醇对AD小鼠避暗实验的影响(n＝20)

注：与正常对照组相比，^aP＜0.01；与假手术组相比，^bP＜0.01；与AD模型组相比，^cP＜0.05，^dP＜0.01；下表相同

2.2针叶聚戊烯醇对AD小鼠定位航行实验的影响

由表3、表4可以看出，正常对照组和假手术组小鼠之间逃避潜伏期和游泳路程无明显差异；与正常对照组和假手术组相比，AD模型组小鼠的逃避潜伏期和游泳路程都显著延长(P＜0.01)，表明侧脑室注射Aβ_1-42伤害小鼠的空间学习记忆能力；聚戊烯醇中、高剂量组与AD模型组相比，小鼠的逃避潜伏期和游泳路程都显著缩短(P＜0.05、P＜0.01)，高剂量组的作用与石杉碱甲组接近，提示针叶聚戊烯醇具有改善AD小鼠空间学习记忆能力。

表3针叶聚戊烯醇对AD小鼠定位航行逃避潜伏期的影响(

n＝20)

表4针叶聚戊烯醇对AD小鼠定位航行游泳路程的影响(

n＝20)

2.3针叶聚戊烯醇对AD小鼠空间探索实验的影响

由表5可以看出，正常对照组和假手术组小鼠之间第一次穿环时间和穿环次数无明显差异；与正常对照组和假手术组相比，AD模型组小鼠的第一次穿环时间显著延长而穿环次数显著减少(P＜0.01)，表明侧脑室注射Aβ_1-42伤害小鼠的空间学习记忆能力；聚戊烯醇中、高剂量组与AD模型组相比，小鼠的第一次穿环时间显著缩短而穿环次数显著增加(P＜0.05、P＜0.01)，高剂量组的作用与石杉碱甲接近，提示针叶聚戊烯醇具有改善AD小鼠空间学习记忆能力。

表5针叶聚戊烯醇对AD小鼠第一次穿环时间及穿环次数的影响(

n＝20)

由前述实验可以看出，以针叶聚戊烯醇为有效成分，配以药学上可接受的载体或赋形剂，按常规工艺制成片剂、颗粒剂、胶囊、软胶囊、滴丸、口服液或注射液等药物剂型，或与其它药物活性成分复配制成复方制剂，可以有效地预防和/或治疗阿尔茨海默病。

Claims (1)

1.针叶聚戊烯醇在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。