CN103933111A - 花生浸提物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生浸提物的应用。所述花生浸提物用于制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品。本发明还提供了花生活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用，花生活性组分为整颗花生或花生局部通过乙醇水溶液浸提、非极性树脂吸附，并经乙醇洗脱、浓缩、干燥步骤制备得到。本发明还提供了花生浸提物、花生活性组分在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药品中的应用。本发明花生浸提物、花生活性组分具有显著的拟神经生长因子的活性，能够改善小鼠的认知功能，能够发挥预防、治疗老年性痴呆症、改善认知及学习记忆能力的作用，为制备预防及治疗神经退行性疾病、改善认知及学习记忆能力的食品和药品提供新思路。

Description

花生浸提物的应用

技术领域

本发明涉及食品、药品用途领域，尤其涉及整颗花生或局部的浸提物、活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病以及改善认知、学习记忆能力的食品和药品中的应用。

背景技术

随着全球社会人口的发展，老年人口的增长是世界性的趋势，而老年性痴呆的患病率和发病率也逐渐增高，老年性痴呆不仅是一个医学难题，而将成为一个突出的社会问题。目前，全球老年性痴呆患者可能已达1700万，随着人口老龄化的进程，老年性痴呆的发病率已上升为常见死亡原因的第4位，仅次于心脑血管病，癌症和中风。老年性痴呆症在我国也已逐渐成为严重威胁老年人健康的顽症。

老年期痴呆是指老年期发生的痴呆，包括阿尔茨海默病(AD，Alzheimer’s Dementia)，血管性痴呆(Vascular dementia)，混合性痴呆(mixed dementia)和其他原因所致痴呆。阿尔茨海默病的病理学特征表现为脑内大量淀粉样老年斑(SP)，神经纤维缠结(NFT)及选择性神经元和突触缺失，多种神经递质尤其是乙酰胆碱严重下降，相应地形成了以β淀粉样蛋白(Aβ)、tau蛋白及神经元缺失三大机制研究领域。

近年来随着对AD的神经生理、生化、药理等方面不断的深入研究，防治AD的药物开发研究不断取得进展。目前对老年痴呆的药物治疗主要是通过抑制acChE来提高患者体内的乙酰胆碱水平，即乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂，它是临床上用于治疗AD最早最为成熟的一类药物。目前，对于轻、中度AD患者的治疗，经美国FDA批准上市的药品有4种，他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)，均为乙酰胆碱酯酶抑制剂。其他的治疗药物如β、γ分泌酶抑制药，长春胺、尼莫地平等脑代谢调节剂，还有司来吉林、维生素E等影响自由基代谢的药物等。

目前用于治疗AD的药物品种繁多，适用于不同的作用机制，它们在某种程度上，是起到了缓解老年痴呆的作用，但是无论是上市或者在研的药物，都有一定的毒副作用，目前AD仍为一个没有办法根治的顽疾。因此，寻找针对AD病因的新的有效治疗药物和方法，成为当今研究的热点和难点。在众多的待选药物中，我们把目光投向了神经生长因子。

神经生长因子(NGF)属于神经营养因子(NTF)家族的成员，维持神经元的数量和存活。NGF对神经系统的正常发育及功能维持，促进损伤神经的再生与修复具有重要作用。NGF作为一种可能治疗AD的有效方法，但目前仍存在下列问题:(1)价格昂贵；(2)相对分子质量大，不能透过血-脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)，只可脑室内注射，长期治疗存在许多技术问题。因此，寻找拟NGF活性，并且可以通过血脑屏障的小分子化合物即NGF mimics，已经成为了目前的研究热点。到目前为止，科学家们已经发现了近百种NGF mimics，可以有效的促进神经细胞增长，部分化合物已经完成了结构修饰或是全合成。目前，NGF mimics已有化合物处于三期临床阶段。

民以食为天，我国地大物博，果蔬鱼肉，山珍海味，十分富饶，人类的生存和繁衍离不开饮食，通过饮食，获得能量及各种营养以满足机体的需要。因此，在日常食物中开发具有药用价值的成分不仅可以避免药品的毒副作用，还能够大大降低药品的研发、生产成本。

发明内容

本发明提供了花生浸提物在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用。

所述花生浸提物是指水、醇或两者混合液的浸提物。

花生浸提物具有显著的拟神经生长因子的活性，动物药理学实验也证明花生浸提物能改善小鼠的记忆障碍，因此可将花生浸提物作为有效成分，添加药学或食品可接受的载体，制备预防、治疗老年性痴呆症(特别是阿尔茨海默病)等神经退行性疾病的食品和药品。

所述的食品可接受的载体是指食品领域常规的载体，例如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等填充剂，淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等粘合剂，硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等湿润剂，聚山梨脂、卵磷脂等吸收促进剂，伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等表面活性剂，另外还可以添加香味剂、甜味剂等其它辅剂。

所述的药学可接受的载体可参照现有技术。

将所述的花生浸提物制成药品后，可以以单位剂量形式给用，给药途径可以为肠道或非肠道给药。

药品的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体剂型，上述各种剂型可采用现有生产方法进行制备。

所述花生浸提物具体可通过如下方法制备：

取整颗花生或局部，粉碎后加溶剂浸提，收集浸提液，除去溶剂，干燥，获得所述浸提物。

所述溶剂为水、醇或两者的混合，更优选的，所述溶剂为醇和水的混合溶液。

所述醇与水的体积比为20：80～80：20，优选为40：60～60：40。

所述醇为乙醇。

制备花生浸提物时，可以以花生的整体为原料，也可以以花生的局部如花生仁、花生壳或花生衣为原料，可针对不同的人群如儿童、老人等具体需求相应的进行选择。

将整颗花生或局部粉碎后，有利于浸提过程中原料中的活性成分的释放，一般粉碎至粒度为50～300目，优选为100～150目，更优选为100目。

通常粒径越小越有利于活性成分析出，但是如果过细，容易造成原料粉末对活性成分和浸提溶剂(水、醇或两者的混合液)的吸附量增加，造成活性成分的损失，同时破碎的细胞过多，浸出的杂质多，也导致后续固液分离困难。

浸提时间为0.5～120h，优选为5～48小时，更优选为24h。

浸提温度为20～50℃，优选为25～35℃，更优选为25℃。

适宜的浸提温度和时间有利于原料中活性成分的浸出，但是浸提时间过长会使杂质浸出量增加，并容易导致已浸出的活性成分的水解。

浸提液料比为2：1～50：1，优选为3：1～15：1，更优选为10：1。

本领域人员可以理解，液料比为浸提液的体积(ml)与原料的质量(g)的比。

浓缩可采用常规的方法进行，浓缩结束后，通常干燥至含水量≤5％。

花生整体或局部的浸提物可进一步纯化，纯化后，多酚类化合物的重量百分含量大于50％。

本发明还提供了花生浸提物在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物中的应用。实验证明，本发明的花生浸提物能够改善正常小鼠的学习记忆、认知功能，因此，可利用该花生浸提物来制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物。所述的花生浸提物即上述“花生浸提物在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用”中所涉及的花生浸提物。

本发明还提供了花生活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用，所述花生活性组分通过如下方法制备：取整颗花生或局部，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，浸提液过滤后用非极性树脂进行吸附，水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述的花生活性组分，其中，所述的局部为花生壳或花生仁。

动物药理学实验证明，本发明的花生活性组分能改善小鼠的认知功能，因此可将花生活性组分作为有效成分，添加药学或食品可接受的载体，制备预防、治疗老年性痴呆症(特别是阿尔茨海默病)等神经退行性疾病的食品和药品。其中，药学或食品可接受的载体可参照上述涉及的相关载体。

在提取花生活性组分的过程中，浸提的时间为0.5～120h，优选为5～48小时，更优选为24h，浸提的温度为20～50℃，优选为25～35℃，更优选为25℃。浸提的液料比为3：1～15：1，更优选为10：1，浸提时，乙醇和水的体积比为20：80～80：20，优选为40：60～60：40，更优选为40：60。

浸提、过滤后，可以先将滤液浓缩后再用树脂吸附，一般滤液浓缩至1/50体积。

所述的非极性树脂可以为XAD、HP、SP等系列的能用于食品和药品生产的品种。通过非极性树脂能够洗脱浸提物中的糖类等极性较强的成分，对活性成分进一步浓缩，同时去除糖类更加适用于老年人，具体的，所述的非极性树脂可以为HP-20树脂或XAD16树脂，最好为XAD16树脂(罗门哈斯(Amberlite)公司)。

洗脱时，用乙醇作为洗脱剂，洗脱时，乙醇与非极性树脂的体积比为2：1～5：1，更优选为4：1。

本发明还提供了花生活性组分在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物中的应用，所述花生活性组分通过如下方法制备：取整颗花生或局部，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，浸提液过滤后用非极性树脂进行吸附，水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述的花生活性组分，其中，所述的局部为花生壳或花生仁。实验证明，本发明的花生活性组分能够改善正常小鼠的学习记忆、认知功能，因此，可利用该花生活性组分来制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物。所述的花生活性组分即上述“花生活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用”中所涉及的花生活性组分。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了花生浸提物的一种新用途，花生浸提物具有显著的拟神经生长因子的活性，能够发挥预防和治疗老年性痴呆症的作用，为制备预防、治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的食品和药品提供新的思路。

(2)花生浸提物以日常所食的花生为基本原料，产品安全性高，对人体无毒副作用，且原料来源广，成本低廉，同时花生浸提物的制备方法简单、快速，大大降低了产品的研发和生产成本。

(3)本发明还对花生浸提物进一步纯化，纯化的花生活性组分具有显著的拟神经生长因子的活性，能够发挥预防和治疗老年性痴呆症的作用。

(4)本发明提供了花生浸提物、花生活性组分在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药品的应用。

附图说明

图1A为48小时后，其中一部分不同处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片。

图1B为48小时后，另一部分不同处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片；

其中，图1A～图1B中；

a-1％DMSO，阴性对照；b-40ng/mL NGF，阳性对照；

c-花生衣100％水提物(HSY，1ug/mL)；d-花生衣20％醇提物(HSY20，1ug/mL)；

e-花生衣40％醇提物(HSY40，1ug/mL)；f-花生衣60％醇提物(HSY60，1ug/mL)；

g-花生衣80％醇提物(HSY80，1ug/mL)；h-花生衣100％醇提物(HSY100，0.3ug/mL)；

i-花生壳100％水提物(HSK，1ug/mL)；j-花生壳20％醇提物(HSK20，1ug/mL)；

k-花生壳40％醇提物(HSK40，1ug/mL)；l-花生壳60％醇提物(HSK60，1ug/mL)；

m-花生壳80％醇提物(HSK80，1ug/mL)；n-花生壳100％醇提物(HSK100，0.3ug/mL)；

o-花生100％水提物(HS，3ug/mL)；p-花生20％醇提物(HS20，3ug/mL)；

q-花生40％醇提物(HS40,3ug/mL)；r-花生60％醇提物(HS60，10ug/mL)；

s-花生80％醇提物(HS80，1ug/mL)；t-花生100％醇提物(HS100，1ug/mL)；

u-花生仁100％水提物(HSR，1ug/mL)；v-花生仁20％醇提物(HSR20，1ug/mL)；

w-花生仁40％醇提物(HSR40，10ug/mL)；x-花生仁60％醇提物

(HSR60，10ug/mL)；

y-花生仁80％醇提物(HSR80，1ug/mL)；z-花生仁100％醇提物

(HSR100，1ug/mL)。

图2a为24和48小时后一部分不同花生衣浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2b为24和48小时后另一部分不同花生衣浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2c为24和48小时后一部分不同花生壳浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2d为24和48小时后另一部分不同花生壳浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2e为24和48小时后一部分不同花生浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2f为24和48小时后另一部分不同花生浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2g为24和48小时后一部分不同花生仁浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图2h为24和48小时后另一部分不同花生仁浸提物对PC12细胞的神经突起分化率的影响。

图3a为花生衣浸提物对小鼠的Y迷宫试验影响结果图。

图3b为花生衣浸提物对小鼠的新奇物体辨别实验影响结果图；

图3c为花生衣浸提物对小鼠的水迷宫试验影响结果图。

图4a为花生壳浸提物对小鼠的Y迷宫试验影响结果图。

图4b为花生壳浸提物对小鼠的新奇物体辨别实验影响结果图。

图4c为花生壳浸提物对小鼠的水迷宫试验(登台潜伏期)影响结果图。

图4d为花生壳浸提物对小鼠的水迷宫试验(穿台次数)影响结果图。

图5为48小时后，花生壳活性组分处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片。

图6a为花生壳组分对小鼠的Y迷宫试验影响结果图。

图6b为花生壳组分对小鼠的新奇物体辨别实验影响结果图。

图6c为花生壳组分对小鼠的水迷宫试验(登台潜伏期)影响结果图。

图7a为花生仁浸提物对小鼠的Y迷宫试验影响结果图。

图7b为花生仁浸提物对小鼠的新奇物体辨别实验影响结果图。

图7c为花生仁浸提物对小鼠的水迷宫试验(登台潜伏期)影响结果图。

图7d为花生仁浸提物对小鼠的水迷宫试验(穿台次数)影响结果图。

图8为48小时后，花生仁组分处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片。

图9为花生仁组分对小鼠的水迷宫试验影响结果图。

图10为全花生浸提物对小鼠的水迷宫试验影响结果图。

图11为48小时后，全花生组分处理对PC12细胞神经突起分化影响的显微照片。

图12为全花生组分对小鼠的水迷宫试验影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明。

实施例1花生衣浸提物的制备

(1)取10g花生衣粉碎至100目后，用100mL不同乙醇含量的水溶液室温(25℃)浸提24小时，抽滤，得到浸提液；

(2)将花生衣浸提液浓缩、干燥至含水量为4％后得到花生衣浸提物。

样品名、花生衣质量、料液比、乙醇含量及浸提物质量的对应关系参见表1。

表1实验因素对花生衣浸提物质量的影响

经上述方法制备得的浸提物，呈棕色、褐色或棕褐色，略带有气味；易溶于乙醇、水或乙醇的水溶液，微溶于氯仿。

实施例2花生壳浸提物的制备

(1)取10g花生壳粉碎100目后，用100mL不同乙醇含量的水溶液浸提(25℃)浸提24小时，抽滤，得到浸提液；

(2)将花生壳浸提液浓缩、干燥至含水量为4％后得到花生壳浸提物。

样品名、花生壳质量、料液比、乙醇含量及浸提物质量的对应关系参见表2。

表2实验因素对花生壳浸提物质量的影响

实施例3花生浸提物的制备

(1)取10g花生(整颗花生)粉碎100目后，用100mL不同乙醇含量的水溶液室温(25℃)浸提24小时，抽滤，得到浸提液；

(2)将花生浸提液浓缩、干燥至含水量为4％后得到花生浸提物。

样品名、花生质量、料液比、乙醇含量及浸提物质量的对应关系参见表3。

表3实验因素对花生浸提物质量的影响

实施例4花生仁浸提物的制备

(1)取10g花生仁粉碎100目后，用100mL不同乙醇含量的水溶液室温(25℃)浸提24小时，抽滤，得到浸提液；

(2)将花生仁浸提液浓缩、干燥至含水量为4％后得到花生仁浸提物。

样品名、花生仁质量、料液比、乙醇含量及浸提物质量的对应关系参见表4。

表4实验因素对花生仁浸提物质量的影响

实施例5浸提物的体外活性实验

在神经退行性变动物模型中，研究发现神经生长因子具有促进神经生长和神经保护功能，能阻止或减少神经元的退变，一定程度上可阻止老年痴呆症的进展。由于PC12细胞具有神经细胞的一般特征，在神经生长因子的作用下PC12细胞会停止分裂，长出突起，转化成神经元样细胞。因此，利用PC12细胞作为生物活性鉴定系统，筛选具有活性的样品用于制备预防和治疗老年性痴呆的保健食品或药物具有可靠性。

(1)PC12细胞的培养

接20×10⁴个PC12细胞接种于含10ml DMEM培养基(其中含10％马血清、5％胎牛血清)培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱内培养，两天后更换一次培养基，再过三天继代培养；

用PBS将细胞洗两次，再加入10ml PBS于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱内培养10分钟，再转移到15ml的一次性离心管，离心后血球计数板上计数。

(2)活性测试

细胞计数后，在24孔细胞培养板中每孔先加入1ml含血清(10％马血清、5％胎牛血清)的DMEM培养基，每孔接入2×10⁴个细胞，CO₂培养箱培养24小时；

弃去培养基，加入1ml含不同浸提物(用0.5％DMSO溶解)的DMEM溶液(不含血清)，放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养，以1％DMSO为阴性对照，40ng NGF为阳性对照；

倒置显微镜下每隔24小时，连续观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率，每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。

神经突起分化率：神经突起长于胞体直径一倍的细胞数目与视野下总细胞数目的比值。

(3)实验结果

参见图1A、图1B以及图2a～图2h(纵坐标为神经突起分化率)，在0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml或10μg/ml的浓度下，24h或48h后，花生以及花生的不同部位如花生衣、花生壳或花生仁的浸提物均显示出显著的拟NGF活性，神经突起分化率在30～60％之间，其中乙醇：水的体积比为40：60(HSY40)的花生衣浸提物活性最显著，在24小时和48小时均具有显著的拟神经生长因子活性，且在这两个不同的时间点活性变化不大。

实施例6花生衣浸提物的动物实验

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍为特征的神经系统退行性疾病。新生神经元是否能替代病变的神经元，改善AD的认知功能障碍已成为AD研究的一个新靶点。研究发现，AD脑海马的前体细胞向神经元的分化比例明显减少，同时新生神经元的存活率显著降低，并且新生神经元的突起生长异常。这些研究都已证实，AD脑的神经再生过程受到严重的损害，提示神经再生障碍可能是AD认知功能进行性减退的重要病理机制之一。

实验主要材料：APP/PS1转基因AD小鼠(6月龄雌雄鼠)(购于南京大学动物模式中心)。

实验操作：花生衣HSY40灌胃给药(10mg/kg)，花生衣HSY40溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为100μl，给药次数为28次；对照组为APP/PS1小鼠，正常组为正常B6小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能的检测。

(1)Y迷宫试验

自发性的交替行为可以用Y迷宫实验来评估。Y迷宫即黑色Y形三等分辐射式迷路箱，由3个支臂和一个连接区组成，三臂互相间夹角120°，每臂长38.5厘米，上宽8厘米，下宽3.5厘米，高12厘米，三个臂可任选一臂为起始臂。每只小鼠从固定一臂的末端释放，让小鼠自由活动8分钟，记录每次进臂的次序。三次连续进入不同的三个臂被定为交替进臂(如：ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA)。

正确率的计算为：1－[错误次数/(总次数－2)]×100％。

(2)新奇物体辨别实验

新奇物体辨别实验是根据啮齿类动物辨别熟悉和新奇物体的能力。使用到的装置为白色无盖的盒子(长×宽×高：40×20×18厘米)。

首先，盒子里不放任何物体，每次从相同位置点释放小鼠，让其自由活动5分钟以适应环境，称为适应期，共两天。第三天为熟悉期和测试期。

熟悉期：先放入两个相同物体后，将小鼠放入，自由活动5分钟，以小鼠鼻子距物体小于2厘米或趴在被识别的物体上算为探究行为，分别记录下对两个相同物体的探究时间。

测试期：间隔1小时后，换上两个不同物体(其中一个是和熟悉期相同的物体(旧物体，f)，另一个是新奇物体(新物体，n))，让其自由活动5分钟，并记录下小鼠对熟悉物体的探究时间f和对新奇物体的探究时间n。

熟悉期和测试期按随机数字组合两种物体及位置摆放。

认知指数的计算公式为对新奇物体探究的时间n/总的探究时间(n+f)。

(3)水迷宫试验

水迷宫实验为测试动物空间记忆能力的行为学实验，其过程分为训练和测试两个阶段。前面连续四天将动物放入水迷宫中，记录其登上平台的时间评价动物的学习记忆能力；第五天将平台撤掉，记录动物穿越平台的次数及在放有平台象限的滞留时间评价动物的学习记忆能力。

如图3a所示，与对照相比，在Y迷宫试验中，花生衣浸提物HSY40口服给药能提高APP/PS1小鼠进臂的正确率；如图3b所示，花生衣浸提物HSY40口服给药能提高APP/PS1小鼠对新奇物体的辨别能力；如图3c所示，与对照相比，在水迷宫试验中，花生衣浸提物HSY40口服给药能显著缩短APP/PS1小鼠的登台时间。

因此，花生衣浸提物HSY40灌胃给药能部分改善APP/PS1小鼠的认知功能，提示花生衣HSY40对AD认知功能障碍有改善作用。

实施例7花生壳浸提物的动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(8周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：将实施例2的花生壳浸提物(选择HSK40样品，图4a～图4d中标注为HSK)灌胃给药(剂量分别为10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg)，花生壳浸提物(HSK40)溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为300μl，给药次数为42次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能主要通过Y迷宫，新奇物体及水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图4a所示，与对照相比，在Y迷宫试验中，不同剂量(10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg)的花生壳浸提物(HSK40)灌胃给药能提高ICR小鼠进臂的正确率；如图4b所示，不同剂量(10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg)的花生壳浸提物(HSK40)灌胃给药能提高ICR小鼠对新奇物体的辨别能力；如图4c和4d所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量的花生壳浸提物HSK40灌胃给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间和增加穿台次数。

因此，花生壳浸提物(HSK)灌胃给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示花生壳浸提物(HSK)对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。

实施例8花生壳活性组分的制备及动物实验

1、花生壳活性组分(花生壳组分)的制备

方法一：

(1)将干燥花生壳400克用4升含40％乙醇的醇水混合溶剂在室温(25℃)摇床中提取24小时后，过滤，获得滤液；

(2)将4L滤液在40℃减压浓缩到1/50的体积后用Amberlite(罗门哈斯)吸附树脂XAD161升进行吸附，随后，用6升水洗脱。最后，用4升乙醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在40℃减压浓缩到1/50的体积后，冷冻干燥，获得花生壳活性组分(HSK组分)。

方法二：

将XAD16树脂替换为HP-20树脂，其他条件不变。获得的花生壳活性组分命名为活性组分2。

2、体外细胞活性试验。

试验方法参照实施例5。

结果见图5，a为阴性对照，b为阳性对照：浓度为40ng/ml NGF，c为方法一的花生壳活性组分：浓度为1μg/ml，d为方法二的活性组分2：浓度为1μg/ml。阴性对照的神经突起分化率为10％，阳性对照的神经突起分化率为80％，经HP-20纯化后的活性组分2试验后，神经突起分化率为53％，而经XAD16纯化后的活性组分的活性更高，神经突起分化率达60％，说明XAD16树脂的纯化效果更好，故下述实施例时，采用XAD16树脂进行纯化。

3、动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(7周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：方法一的花生壳组分(HSK组分)灌胃给药(给药剂量分别为5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)，花生壳组分(HSK组分)溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为320μl，给药次数为42次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能主要通过Y迷宫，新奇物体及水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图6a所示，与对照相比，在Y迷宫试验中，不同剂量(5mg/kg，15mg/kg,45mg/kg)的花生壳组分(HSK组分)灌胃给药能提高ICR小鼠进臂的正确率；如图6b所示，不同剂量(5mg/kg，15mg/kg,45mg/kg)的花生壳活性组分(HSK组分)灌胃给药能提高ICR小鼠对新奇物体的辨别能力；如图6c所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量(5mg/kg，15mg/kg,45mg/kg)的花生壳活性组分(HSK组分)灌胃给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间。

因此，花生壳活性组分HSKA灌胃给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示花生壳组分(HSK组分)对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。

实施例9花生仁浸提物的动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(5周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：将实施例4的花生仁浸提物(选择HSR40样品，图7a～图7d中标注为HSR)灌胃给药(给药剂量分别为10mg/kg，30mg/kg,90mg/kg)，花生仁浸提物(HSR40)溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为300μl，给药次数为28次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能主要通过Y迷宫，新奇物体及水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图7a所示，与对照相比，在Y迷宫试验中，不同剂量(10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg)的花生仁浸提物(HSR40)灌胃给药能提高ICR小鼠进臂的正确率；如图7b所示，不同剂量(10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg)的花生仁浸提物(HSR40)灌胃给药能提高ICR小鼠对新奇物体的辨别能力；如图7c和图7d所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量(10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg)的花生仁浸提物(HSR40)灌胃给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间和增加穿台次数。

因此，花生仁浸提物HSR灌胃给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示花生仁浸提物(HSR)对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。实施例10花生仁活性组分(HSR组分)的制备及动物实验

1、花生仁活性组分(花生仁组分)的制备

(1)将干燥花生仁400克用4升含40％乙醇的醇水混合溶剂在室温(25℃)摇床中提取24小时后，过滤，获得滤液；

(2)将4L滤液在40℃减压浓缩到1/50的体积后用Amberlite(罗门哈斯)吸附树脂XAD161升进行吸附，随后，用6升水洗脱。最后，用4升乙醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在40℃减压浓缩到1/50的体积后，冷冻干燥，获得花生仁活性组分(HSR组分)。

2、体外细胞活性实验

试验方法参照实施例5。

结果见图8，a为阴性对照，b为阳性对照：浓度为40ng/ml NGF，c为花生仁组分：浓度为1μg/ml。阴性对照的神经突起分化率为10％，阳性对照的神经突起分化率为80％，经花生仁组分处理后，神经突起分化率为55％，说明花生仁组分具有较好的拟神经生长因子活性。

3、动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(6周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：花生仁活性组分HSR组分灌胃给药(剂量分别为5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)，花生仁HSR组分溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为300μl，给药次数为28次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

空间记忆功能主要通过水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图9所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量(5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)的花生仁组分(HSR组分)口服给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间。

因此，花生仁活性HSR组分灌胃给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示花生仁活性HSR组分对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。

实施例11花生浸提物的动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(6周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：将实施例3的整颗花生的浸提物(选择HS40样品，图10中标注为QHS)灌胃给药(剂量分别为10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg)，全花生浸提物(HS40)溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为300μl，给药次数为28次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能主要通过水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图10所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量的全花生浸提物(HS40)灌胃给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间。

因此，全花生浸提物(HS)给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示全花生浸提物(HS)对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。

实施例12花生活性组分的制备及动物实验

1、花生活性组分(全花生组分)的制备

(1)将干燥的整颗花生(全花生，包括花生壳和花生仁)400克用4升含40％乙醇的醇水混合溶剂在室温(25℃)摇床中提取24小时后，过滤，获得滤液；

(2)将4L滤液在40℃减压浓缩到1/50的体积后用Amberlite(罗门哈斯)吸附树脂XAD161升进行吸附，随后，用6升水洗脱。最后，用4升乙醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在40℃减压浓缩到1/50的体积后，冷冻干燥，获得全花生活性组分(QHS组分)。

2、体外细胞活性实验

试验方法参照实施例5。

结果见图11，a为阴性对照，b为阳性对照：浓度为40ng/ml NGF，c为全花生组分：浓度为1μg/ml。阴性对照的神经突起分化率为10％，阳性对照的神经突起分化率为80％，经花生组分处理后，神经突起分化率为57％，说明全花生组分具有较好的拟神经生长因子活性。

3、动物实验

实验主要材料：ICR小鼠(6周龄雄鼠，购于浙江中医药大学)。

实验操作：全花生组分(QHS组分)灌胃给药(剂量分别为5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg)，全花生组分(QHS组分)溶于水，每间隔24小时给药1次，给药的最大体积为300μl，给药次数为28次；对照组为ICR小鼠，每个处理10只小鼠。

学习记忆及空间记忆功能主要通过水迷宫试验进行检测。检测方法详见实施例6。

如图12所示，与对照相比，在水迷宫试验中，不同剂量的全花生组分(QHS组分)口服给药能显著缩短ICR小鼠的登台时间。

因此，全花生组分(QHS组分)给药能改善ICR小鼠的认知功能，提示全花生组分(QHS组分)对正常小鼠的认知、学习记忆功能有改善作用。

Claims (15)

1.花生浸提物在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述花生浸提物通过如下方法制备：

取整颗花生或局部，粉碎后加溶剂浸提，收集浸提液，除去溶剂，干燥，获得所述花生浸提物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述溶剂为水、醇或两者的混合。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述溶剂为醇和水的混合溶液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述醇与水的体积比为20：80～80：20。

6.如权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述醇为乙醇。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，花生局部为花生衣、花生仁或花生壳。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，浸提时间为0.5～120h，浸提温度为20～50℃。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，浸提液料比为2：1～50：1。

10.花生浸提物在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物中的应用。

11.花生活性组分在制备预防、治疗神经退行性疾病的食品和药品中的应用，所述花生活性组分通过如下方法制备：取整颗花生或局部，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，浸提液过滤后用非极性树脂进行吸附，水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述的花生活性组分，其中，所述的局部为花生壳或花生仁。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，浸提时间为0.5～120h，浸提温度为20～50℃。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，浸提时，乙醇与水的体积比为20：80～80：20。

14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的非极性树脂为HP-20树脂或XAD16树脂。

15.花生活性组分在制备改善认知、学习记忆能力的食品和药物中的应用，所述花生活性组分通过如下方法制备：取整颗花生或局部，用乙醇和水的混合溶液浸提，收集浸提液，浸提液过滤后用非极性树脂进行吸附，水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥后制得所述的花生活性组分，其中，所述的局部为花生壳或花生仁。