CN103360456B

CN103360456B - 三萜类化合物及制备和应用

Info

Publication number: CN103360456B
Application number: CN201210095797.9A
Authority: CN
Inventors: 戚建华; 叶英; 陈欢; 向兰; 王彦
Original assignee: ZHEJIANG BAICAO TRADITIONAL CHINESE MEDICINE PIECES CO Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang Zuo Libaicao prepared slices of Chinese crude drugs company limited; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: CN103360456A

Abstract

本发明提供一种三萜类化合物，将中药母草粉碎和浸提，提取物经硅胶柱分离和高效液相色谱纯化获得。本发明通过体外细胞活性实验证实所分离的这类化合物有显著的类似神经生长因子NGF的活性，体内动物实验证实分离得到的化合物B具有增强老年痴呆症模型鼠记忆功能的效果，因此此类化合物可在制备预防及治疗老年痴呆症等神经退行性疾病药物或食品中应用，尤其是在制备治疗阿尔茨海默症（AD）等神经退行性疾病药物或食品中的应用。本发明提供的制备方法合理，操作简便。为预防及治疗老年痴呆症等神经退行性疾病提供新的治疗药物。本发明的结构通式为：

Description

三萜类化合物及制备和应用

技术领域

本发明属于医药、食品领域，具体涉及从中药材母草中分离提取和制备一类天然化合物的方法，尤其涉及三萜类化合物的结构及制备方法，以及该类化合物在防治老年性痴呆症等神经退行性疾病和神经营养保护药物、食品中的应用。

背景技术

老年痴呆症(Alzheimer’s disease，阿尔茨海默病)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。目前，阿尔茨海默病仅次于心脏病、癌症、中风，已成为人类死亡的第四大病因。我国阿尔茨海默病的患者已超过500万，约占世界总病例数的1/4，随着人口老龄化的加快，患者数量会更为巨大，会严重影响社会的稳定与发展。因此，开发有效的预防和治疗老年性痴呆等神经退行性疾病的药物已成为全世界迫切需要解决的医学问题。

针对老年性痴呆的治疗药物种类，主要有胆碱能药，例如作为乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）抑制剂上市的药物有他克林（tacrine）、酒石酸卡巴拉汀（rivastigmine）、石衫碱甲（huperzine A）、多奈哌齐（donepezil）等；β、γ分泌酶抑制药；脑代谢调节剂，如长春胺、尼莫地平、脑益嗪；影响自由基代谢的药物，如维生素C结合维生素E等。但这些治疗药物只能延缓AD病程的进展，且随病情发展药物疗效逐渐降低，有副作用，所以寻找针对AD病因的治疗药物和方法成为医药界的热点和难点。

研究表明，神经营养因子对神经发育和成年神经系统的疾病过程都有重要的影响。其中神经生长因子（nerve growth factor, NGF）在神经退行性疾病动物模型中发现能阻止或减少神经元的退变。作为人类发现的第一个最重要的神经营养因子，NGF对神经细胞的生长、发育、分化和功能保持等方面具有重要调控作用。进一步发现神经营养因子能阻止或减少神经萎缩、神经变性，促进外伤后的神经修复。但是NGF是含有100多个氨基酸的蛋白质，较大的分子量和较强的极性使之不能通过血脑屏障，限制了它在临床上的应用。因此，寻找具有拟NGF活性并且能通过血脑屏障的小分子化合物自然成为研究热点。拟NGF活性的小分子化合物应该具有神经营养和神经保护功能。

中草药是中药学的物质基础，为天然活性有机化合物提供了巨大的资源。我国几千年的中医药发展历史，分布有宝贵的道地药材。利用巨大的中药材资源来进行新的成分和新的活性的研究是十分重要和有意义的。一些中药对老年性痴呆症有显著疗效，其中最著名的是从蛇足石杉中提取的生物碱——石杉碱钾（huperzine A）。作为中国科学院药物研究所开发的具有自主知识产权的创新药物，它不仅是高效高选择性的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制药，而且还能减少谷氨酸诱发的神经细胞死亡；具有明显的保护神经细胞对抗β淀粉样多肽（Aβ）产生的氧化应激反应；能够对抗过氧化氢、蛋白激酶C抑制剂等诱导神经细胞凋亡作用。

母草，别名：公母草、旱田草、开怀草、牛耳花、四方草、四方拳草、公草母草、蓝猪耳、陌上菜、铺地莲、四方拳、田草、田荖、田蟹目、细白花草、小号蟹目草、小四方草、小叶蛇针草、蟹目草；具有清热利湿，解毒；活血止痛等功效。①广州部队《常用中草药手册》：“清热利湿。治细菌性痢疾，肠炎，腹泻，消化不良，蛇咬伤”。②广州空军《常用中草药手册》：“治感冒，肝炎，肾炎水肿，痈疮，疔毒”。③《广西药植名录》：“治跌打，乳痈，胃癌”。迄今为止，没有关于母草活性组分具有拟神经生长因子活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供三萜类化合物，所述三萜类化合物具有如下的结构通式：

其中1-2位，5-6位虚线表示有或无双键；

R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₁₀分别独立地选自氢、羟基、=O、-OAc、甲氧基、糖基、取代糖基；

R₆，R₇，R₉，R₁₁，R₁₂，R₁₃分别独立地选自甲基、-CH₂OH；

R₈独立地选自氢、羟基、巯基、氨基。

代表性化合物的结构式如下（化合物A和B）：

。

本发明的另一个目的是提供所述的三萜类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）粉碎和浸提：中药母草粉碎后，用甲醇（工业级）室温下浸提4至5天（震荡），抽滤浓缩，得甲醇浸提物粗样，再用水和乙酸乙酯进行溶剂分配，得到乙酸乙酯层粗样及水层粗样；

（2）分离和纯化：将乙酸乙酯层粗样经硅胶柱分离,利用PC12细胞活性鉴定系统引导，将含目标化合物的活性组分用HPLC纯化，流动相为甲醇水溶液，得到目的化合物A和化合物B；

将水层粗样通过十八烷基键合硅胶色谱柱（ODS）分离，在PC12细胞活性鉴定系统引导下，将含目标化合物的活性组分用HPLC纯化，流动相为甲醇水溶液，得到目的化合物A。

本发明的再一个目的是提供这类三萜化合物在制备防治老年性痴呆等疾病药物或食品中的应用。尤其是在制备防治阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物或食品中的应用。所述药物或食品含有药学或食品可接受的载体或稀释剂。

本发明在PC12细胞生物活性鉴定系统的引导，经过简单提取分离，从母草Lindernia crustacea提取物中获得一类三萜类化合物，其具有显著拟神经生长因子活性。

所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如是等，填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等；湿润剂如硬脂酸镁、微分硅胶、聚乙二醇等；吸收促进剂聚山梨酯，卵磷脂等，表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯等等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明所述的三萜类化合物可以以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，包括口服、肌肉、皮下和鼻腔。

本发明所述的活性组分给药途径可为静脉给药。注射包括静脉给药、肌肉注射、皮下注射和穴位注射。

本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性组分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

给药剂型可以是固体制剂、胶囊剂或液体制剂，包括片剂、胶囊剂、分散片、口服液、大输液、小针、冻干粉针、软膏、搽剂或栓剂。

所述食品剂型为固体或液体。

本发明的有益效果在于：(1)通过有机溶剂浸提、溶剂分配、色谱柱分离，高效液相色谱（HPLC）纯化等系列流程得到，制备方法具有简单、快速、获得的化合物纯度高等优点。(2)活性化合物具有显著的的拟神经生长因子的活性，可以在预防老年痴呆症等神经退行性疾病中获得应用。(3)作为小分子化合物，天然分离的活性化合物在老年性痴呆的体外筛选模型PC12细胞中表现出显著的拟NGF活性。以此类化合物作为先导物，优化结构，为预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药研发进行基础性研究，将具有重要的现实意义。

附图说明

图1是加入化合物B 48小时后PC12细胞的神经突起分化率随剂量增加的变化。

图2是加入化合物B 48小时后PC12细胞神经突起的显微照片，图中a，1% DMSO为阴性对照；b，NGF 40 ng/ml,为阳性对照；c，化合物B 300 nM。

图3 化合物B具有改善痴呆病理模型记忆功能的新奇物体辨别实验结果。

图4 化合物B具有改善痴呆病理模型记忆功能的Y迷宫交替进臂率实验结果。

图5 化合物B具有改善痴呆病理模型记忆功能的Morris水迷宫实验结果。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下属的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 化合物A和化合物B的制备

从中药母草中获得具有显著的拟NGF活性的化合物A，B的制备方法，具体步骤为：

（1）粉碎和浸提：300 g中药母草粉碎后，用1L甲醇（工业级）室温下浸提5天（震荡）。抽滤浓缩后，得到甲醇浸提物粗样，用水和乙酸乙酯进行溶剂分配，共得到乙酸乙酯层粗样6克，水层粗样14克。

（2）分离和纯化：将乙酸乙酯层粗样经一次硅胶开口柱分离（200-300目，以下是溶剂体积比，正己烷：氯仿=2:8,1:9,0:10，氯仿：甲醇=98:2,96:4,94:6,92:8,90:10），分别收集合并氯仿:甲醇为90:10的洗脱部位及96:4的洗脱部位，浓缩，得到含有A、B的来源于乙酸乙酯层的样品。

将水层粗将经一次ODS开口柱分离(以下是溶剂体积比，甲醇：水=50:50，55:45，60:40，65:35)，收集合并甲醇:水为55:45的洗脱部位，浓缩，得到含化合物A的来源于水层的样品。

化合物A的HPLC纯化的色谱条件为：ODS-UG-5，流速8 ml/min，检测波长228 nm，流动相为60%甲醇水溶液的等度，得到化合物A，保留时间为27 min。

化合物B的HPLC纯化的色谱条件为：ODS-UG-5，流速8 ml/min，检测波长228 nm，流动相为65%甲醇水溶液的等度，得到化合物B，保留时间为35 min。

实施例2 对实施例1所得到的化合物A、B的理化特征及化合物结构的定性鉴定：

化合物A和B的化学结构经质谱（包括高分辨质谱）和核磁共振谱确定。

化合物A，无色固体，易溶于甲醇。用TLC分析时，以氯仿:甲醇（8:2）为展开剂，在高为5 cm正向silica板上，其Rf值的0.5。该样品在228 nm下具有显著的紫外吸收。

化合物B，无色固体，易溶于甲醇。用TLC分析时，以氯仿:甲醇（9:1）为展开剂，在高为5 cm正向silica板上，其Rf值的0.5。该样品在228 nm下具有显著的紫外吸收。

化合物A，分子式为C₃₆H₅₆O₁₁；HR FT-ICR MS: m/z 687.3707[M+Na]⁺，理论值C₃₆H₅₆O₁₁Na：687.3720。¹³C NMR (125 Mz，CD₃OD) δ：19.71，20.47，20.64，21.68，21.71，22.29，24.75，25.22，25.57，32.57，33.89，34.93，43.17，44.36，46.64，49.17，49.79，49.85，51.86，59.66，62.89，71.51，71.74，75.68，78.01，78.08，79.83，80.94，83.22，105.86，119.92，122.75，142.36，155.83，205.14，216.42。

化合物B，分子式为C₃₀H₄₆O₆；HR FT-ICR MS: m/z 503.3351[M+H]⁺，理论值C₃₀H₄₇O₆：503.3373。¹³C NMR (125 Mz，CD₃OD) δ：19.75，20.54，20.65，21.70，21.72，22.27，24.75，25.34，25.56，32.59，34.78，34.96，43.36，44.36，46.65，49.71，49.77，49.85，51.88，59.60，71.61，71.69，79.79，81.91，119.97，122.72，142.69，155.80，205.08，216.21。

实施例3 化合物在老年性痴呆的体外筛选模型PC12细胞中表现出显著的拟NGF活性。

试验方法：

1）PC12细胞的培养：接种20×10⁴个细胞于100 mm的培养皿中，含10 ml DMEM 培养基(其中含10%马血清、5%胎牛血清），每两天后更换一次培养基，当细胞密度达到要求时进行继代培养。先用PBS将细胞洗两次，再加入10 ml PBS于培养皿中，在37 ℃，5% 的CO₂培养箱内静置10分钟，取出后吹洗，将悬浮有细胞的PBS转移到15 ml的一次性离心管，离心后用血球计数板计数，在24孔板中每孔先加入1 ml含血清的DMEM培养基，细胞计数后，每孔接2×10⁴个细胞，混匀，在CO₂培养箱培养24小时后加样。

2）活性测试：以DMSO为阴性对照，NGF 40 ng/mL为阳性对照，将化合物配置成不同浓度的DMSO溶液，用1 ml含1% DMSO和样品的DMEM溶液（不含血清）将24孔细胞板的每孔原培养基取代后，放入37℃，5% CO2的培养箱中培养。在倒置显微镜下每隔24小时、连续6天观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率（神经突起长度大于胞体直径的细胞数目与视野下总细胞数目的比值），每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。

3）实验结果：参见图1、图2，在10-1000 nM的浓度下，48小时后化合物B显示出显著的拟NGF活性。图1中C：阴性对照：1% DMSO；NGF(40 ng/ml):阳性对照）。图2中a，1% DMSO为阴性对照；b，NGF 40 ng/ml, 为阳性对照；c，化合物B 300 nM。

实施例4

由于神经生长因子具有神经营养和神经保护作用，所以推测拟NGF活性的化合物具有神经营养和保护的功能。因而注射东莨菪碱造成乙酰胆碱缺失的化学损伤动物模型，用行为学评价化合物在体内是否具有神经营养和保护功能，是否可以改善注射东莨菪碱后造成的学习记忆缺失。

实验主要材料：ICR小鼠（8周龄雄性，各35只）购于上海斯莱克动物公司。

实验操作：ICR8周龄小鼠被随机分成5组：对照组、东莨菪碱组、药物治疗低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组7只。各组均在实验前禁食12小时，实验前1.5小时口腔给予1%吐温80的生理盐水或者化合物，实验前0.5小时腹腔注射生理盐水或2 mg/kg东莨菪碱；然后进行行为学测试，检测化合物对于化学损伤模型鼠学习记忆及空间记忆功能的改善效果。（1）新奇物体辨别实验：新奇物体辨别实验是根据啮齿类动物辨别熟悉和新奇物体的能力。首先，盒子里不放任何物体，每次从相同位置点释放小鼠，让其自由活动5分钟以适应环境，称为适应期，共两天。第三天为熟悉期和测试期。熟悉期：先放入两个相同物体后，将小鼠放入，自由活动5分钟，以小鼠鼻子距物体小于2厘米或趴在被识别的物体上算为探究行为，分别记录下对两个相同物体的探究时间。测试期：间隔1小时后，换上两个不同物体（其中一个是和熟悉期相同的物体（f），另一个是新奇物体(n)），让其自由活动5分钟，并记录下小鼠对熟悉物体的探究时间f 和对新奇物体的探究时间n。熟悉期和测试期按随机数字组合两种物体及位置摆放。认知指数的计算公式为:对新奇物体探究的时间n/总的探究时间n+f。（2）Y-maze 实验：自发性的交替行为可以用Y-maze 实验来评估。Y-maze 即黑色Y形三等分辐射式迷路箱，由3个支臂和一个连接区组成，三臂互相间夹角120°，每臂长38.5厘米，上宽8厘米,下宽3.5厘米，高12厘米，三个臂可任选一臂为起始臂。每只小鼠从固定一臂的末端释放，让小鼠自由活动8分钟，记录每次进臂的次序。三次连续进入不同的三个臂,被定为交替进臂（如：ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA）。交替进臂率的计算为：1－错误次数/（总次数－2）×100%。（3）水迷宫实验：利用老鼠天生厌恶处于水中的习性，考察老鼠的空间学习记忆能力。实验可分为两个时期：适应期和实验期。适应期是连续四天将老鼠面向池壁放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，用登台潜伏期长短来评价；实验期为在适应期后，将水迷宫中隐藏在水面下的平台撤掉，记录老鼠的运动轨迹，考察老鼠对于原平台位置的记忆。

实验结果（参见图3、图4、图5）：

（1）与对照组小鼠相比，腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱小鼠对新奇物体的辨别能力明显降低；化合物B处理能恢复腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱小鼠对新奇物体的辨别能力（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）（图3）；

（2）与对照组小鼠相比，腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱小鼠学习记忆功能明显降低（#p < 0.01）；化合物B处理能恢复腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱小鼠的学习记忆功能（*p < 0.05,**p< 0.01）（图4）；

（3）与对照组小鼠相比，腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱小鼠在第一天的登台潜伏期要长（##p < 0.01）；化合物B处理后，可以降低腹腔注射2 mg/kg 东莨菪碱登台潜伏期到空白对照组水平（*p < 0.05, ***p<0.001）（图5）。

Claims

1.一种三萜类化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构通式：

当R=Glc时为化合物A，当R=H时为化合物B。

2.根据权利要求1所述一种三萜类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）粉碎和浸提：中药母草粉碎后，用工业级甲醇室温下浸提4至5天，抽滤浓缩，得甲醇浸提物粗样，再用水和乙酸乙酯进行溶剂分配，得到乙酸乙酯层粗样及水层粗样；

将水层粗样通过十八烷基键合硅胶色谱柱分离，利用PC12细胞活性鉴定系统引导，将含目标化合物的活性组分用HPLC纯化，流动相为甲醇水溶液，得到目的化合物A；

化合物A和化合物B 结构为：

。

3.根据权利要求1所述一种三萜类化合物在制备防治老年痴呆症药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一种三萜类化合物在制备防治阿尔茨海默症药物中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为肠道和非肠道。

6.根据权利要求3或4所述的的应用，其特征在于，所述药物的剂型为固体制剂或液体制剂。

7.根据权利要求1所述一种三萜类化合物在制备防治老年痴呆症食品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述一种三萜类化合物在制备防治阿尔茨海默症食品中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的的应用，其特征在于，所述食品剂型为固体或液体。