CN103360451B - 葫芦素类化合物的制备及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类葫芦素类化合物的制备方法，将中药甜瓜蒂粉碎和浸提，浸提物粗样用甲醇水溶液和正己烷进行溶剂分配，浓缩，浓缩物分别经正相硅胶色谱柱分离，高效液相色谱纯化，得到纯化的一类葫芦素类化合物。本发明分离得到一类葫芦素类化合物具有显著的拟神经生长因子活性，可在制备预防老年痴呆症等神经退行性疾病药物中应用，特别是在制备治疗阿尔茨海默症等神经退行性疾病的药物中应用。开拓了有效成分葫芦素类化合物的药物用途。本发明原材料-中药甜瓜蒂来源广泛，取材便利，制备方法简便，易于工业化生产。本发明的结构通式为：

Description

葫芦素类化合物的制备及其药物用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及葫芦素类化合物的制备方法，以及其在制备预防及治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的药物中的应用。

背景技术

老年痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)是发生在早老及老年期以进行性痴呆和精神行为异常为主的中枢神经系统退行性疾病，在老年人死因中仅次于心脏病、肿瘤和中风，占第四位。据国际阿尔茨海默协会2010年报告，2010年全球有3556万老年痴呆症患者，预计到2030年增加至6569万人，到2050年患者将增加到1.15亿人。2010年，老年痴呆症的费用消耗达到6040亿美元，且以令人担忧的速度继续增加。中国随着社会逐渐迈向老龄化，老年痴呆症也已逐渐成为严重威胁老年人健康的顽症。如何对包括老年痴呆症在内的一系列神经退行性疾病进行有效地预防和早期治疗，直接关系到我国的人口质量和全民健康水平，现已成为我国面临的一项关系到国家人口与健康的战略问题。

老年痴呆症的主要病理学特征为：大脑内神经细胞表面由于异常的淀粉样蛋白斑沉淀而呈现的老年斑(Senile plaque，SP)，神经纤维丝缠结(NFT)，以及选择性神经元和突触缺失，多种神经递质尤其是乙酰胆碱严重下降。淀粉样蛋白斑主要是由细胞内异常产生的大量β淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外积聚形成的。目前广为接受的“Aβ假说”就是认为细胞外异常沉积的β淀粉样蛋白通过一系列细胞级联反应(包括自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等)，直接或间接地作用于神经元和胶质细胞，最终导致神经元功能异常或死亡，引起认知障碍。

近年来，随着对AD的神经生理、生化、药理等方面不断的深入研究，防治AD的药物开发研究不断取得进展。目前治疗AD的药物品种繁多，适用于不同的作用机制，其中对AD的药物治疗主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)来提高患者体内的乙酰胆碱水平，即AChE抑制剂。它是临床上用于治疗AD最早最为成熟的一类药物，适用于轻、中度AD患者的治疗，经美国FDA批准上市的药品共有4种，他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)。虽然在某种程度上这些药物起到了缓解老年痴呆症的作用，但是都有一定的毒副作用，因此，寻找针对AD病因的新的有效治疗药物和方法，成为当今研究的热点和难点。在众多的待选药物中，我们把目光转向了神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)。

近年神经科学进展和中枢神经营养因子(NTF)的发现，对中枢神经元变性和再生的研究，具有重要理论和实际意义，也为AD病因学和治疗开辟了新途径。特别是在神经系统疾病过程中，NTF对神经细胞和神经再生都有重要的保护作用。NTF能阻止或减少神经萎缩、神经变性，促进外伤后的神经修复。NGF属于NTF的成员，具有维持神经元的数量和存活功能。动物实验证明，NGF能促进增殖和分化，调节AD神经元存活和生长，还能对受损神经元有修补和保护作用，是治疗的重要目的。但是，作为一种可能治疗AD的有效方法，NGF价格昂贵，相对分子质量大，不能透过血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)，只可脑室内注射，长期治疗存在许多技术问题。因此，寻找拟神经生长因子活性且可以顺利通过BBB的小分子化合物，已经成为研究热点。到目前为止，科学研究工作者已经发现了近百种拟神经生长因子活性化合物，可以有效的促进神经细胞增长，部分化合物已经完成了结构修饰或是全合成。

我国天然资源丰富，对天然产物中新成分和新药理活性的研究也日益广泛起来。其中，中药对老年痴呆症有显著疗效，最著名的是从石杉科石杉属植物蛇足石杉(千层塔)提取出来的生物碱类化合物-石杉碱甲(huperzine A)。它是我国首次开发研究的选择性作用于脑部的高效高选择性的可逆性乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制药物。

葫芦素归属于四环三萜类化合物，主要存在于葫芦科植物当中，十字花科屈曲花属和玄参科水八角属植物中也有分布，至今已发现多种，是中国传统药物的活性成分。其中，有些葫芦素化合物已被应用于慢性肝炎和肝癌初期的治疗。随着葫芦素的分离和结构的确定，对其药理及应用方面的研究越来越广泛。

甜瓜蒂(Pedicellus Melo)，又名瓜蒂、甜瓜把、瓜丁、苦丁香，为葫芦科植物甜瓜(Cucumismelo)的干燥成熟果柄，即甜瓜花果与枝茎相连部分。具有涌吐痰食；除湿退黄的功效，主治中风；癫痫；喉痹；痰涎壅盛；呼吸不利；宿食不化；胸脘胀痛；湿热黄疸。甜瓜蒂中含有的葫芦素(Cucurbitacins)类化合物具有抗肿瘤、抗炎、保肝、提高机体免疫力、改善肠胃等功能。目前，市场上用于治疗肿瘤疾病的葫芦素片主要为葫芦素B和E的混合物。现在研究发现，甜瓜蒂是葫芦素类化合物的含量最高的中药之一。

发明内容

本发明的目的是提供一类葫芦素类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)粉碎和浸提：

中药甜瓜蒂经粉碎后，用工业级乙醇室温下浸提3天，抽滤浓缩，得甜瓜蒂乙醇浸提物粗样；

(2)萃取、分离和纯化：

将甜瓜蒂乙醇浸提物粗样用80％的甲醇水溶液和正己烷(体积比＝1∶1)进行溶剂分配，得到80％的甲醇水溶液层样品。所得层样品进行旋转蒸发，得到浓缩物。浓缩物经正相硅胶色谱(silica gel)柱分离(溶剂系统体积比为正己烷∶乙酸乙酯，100％甲醇)，得到一类葫芦素类化合物；将其中一部分葫芦素类化合物直接进行高效液相色谱纯化，得到纯化的葫芦素类化合物(I-a～e)；另一部分通过二次正相硅胶柱分离(溶剂系统体积比为氯仿∶甲醇)，再进行高效液相色谱纯化，得到另一些纯化的葫芦素类化合物(I-f～g)。

本发明制备的葫芦素类化合物的通式如下：

其中：表示单键或双键；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉分别独立的选自氢、羟基、酰基、＝O、酯基、酰胺或卤素；

R₁₀、R₁₁、R₁₂分别独立的选自甲基、氢、酰基、羟基、葡萄糖氧基、甲氧基、丁氧基、羧基、酯基、酰胺或卤素；

R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇分别独立的选自氢、甲基、羟基、羟甲基、甲氧基、酯基、酰胺或卤素。

化合物I-a～g的结构式如下：

化合物I-a(1)r₁＝OH，r₂＝Ac

化合物I-b(2)r₁＝OH，r₂＝Ac，23，24dihydro

化合物I-e(5)r₁＝OH，r₂＝H

化合物I-f(6)r₁＝OGlu，r₂＝Ac

化合物I-c(3)

化合物I-d(4)t₁＝Ac

化合物I-g(7)t₁＝H

本发明的另一个目的是提供葫芦素类化合物在制备预防老年痴呆症等神经退行性疾病的药物中的应用。主要是在制备治疗阿尔茨海默症(AD)等神经退行性疾病药物中的应用。

本发明进一步还提供一种预防老年痴呆症等神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物含有生理有效量的葫芦素类化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂等，填充剂如蔗糖、淀粉等；粘合剂如羟丙纤维素、淀粉浆等；湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等；吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂脂肪酸山梨坦、伯洛沙姆等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如甜味剂、香味剂等。

本发明所述的葫芦素类化合物可以以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道和非肠道。

本发明所述的葫芦素类化合物给药途径可为静脉给药。注射包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、穴位注射和皮下注射。

本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使葫芦素类化合物与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

给药剂型可以是固体制剂、胶囊剂或液体制剂，包括片剂、胶囊剂、口服液、小针、输液、软膏、冻干粉针、搽剂或栓剂。

本发明的优点是：用本发明制备的葫芦素类化合物，其有效成分为以上7种葫芦素类化合物，含量约占50％，且经过纯化后的葫芦素类化合物纯度高。葫芦素类化合物均具有显著的拟神经生长因子的活性，可以在预防老年痴呆症等神经退行性疾病中获得应用。尤其在制备治疗阿尔茨海默症等神经退行性疾病的药物中应用。本发明的葫芦素类化合物是从中药甜瓜蒂中分离纯化得到的，在PC 12细胞模型中表现出显著的拟神经生长因子活性，为预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药研发具有重要的现实意义。本发明采用PC 12细胞作为有效的生物活性鉴定系统，从中药甜瓜蒂中分离得到一类葫芦素类化合物及7个纯化的葫芦素类化合物，具有显著的拟神经生长因子活性。此外，中药甜瓜蒂具有来源广泛，取材便利等优点，且容易获得大量的葫芦素类化合物，对预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药开发具有重要意义。

附图说明

图1是葫芦素类化合物的拟神经生长因子的活性图，加入葫芦素类化合物，经48和72小时后PC 12细胞的神经突起分化率。C：阴性对照0.5％DMSO，阳性对照NGF：40ng/mL。

图2是化合物I-a～g的拟神经生长因子的活性图，加入化合物I-a～g，经72小时后PC 12细胞的神经突起分化率。

图3是化合物I-e的拟神经生长因子活性的剂量依赖图，加入化合物I-e，经48和72小时后PC 12细胞的神经突起分化率。

图4是加入化合物I-e和葫芦素类化合物，经72小时后PC 12细胞神经突起的显微照片。

图5A是化合物I-e抗老年痴呆症的功能评价：新奇物体实验。

图5B是化合物I-e抗老年痴呆症的功能评价：Y-maze实验。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。

实施例1 葫芦素类化合物的制备

1)粉碎和浸提：

中药甜瓜蒂500g粉碎后，用12.5L乙醇(工业级)室温下震荡浸提3天。抽滤、浓缩后，得到乙醇浸提物粗样93.4g。

2)萃取、分离和纯化：

将甜瓜蒂乙醇浸提物粗样(90g)用80％的甲醇水溶液和正己烷(体积比＝1∶1)进行溶剂分配2次，所得的80％的甲醇水溶液层样品进行旋转蒸发，得到浓缩物(72.5g)。浓缩物经正相硅胶色谱(silica gel，200-300目)柱分离(溶剂系统为正己烷∶乙酸乙酯＝90∶10，80∶20，70∶30，40∶60，0∶100，100％甲醇)，得到葫芦素混合物(22.5g)。将其中一部分进行高效液相色谱纯化，得到纯净的葫芦素类化合物(I-a～e)；另一部分通过二次正相硅胶柱分离(溶剂系统为氯仿∶甲醇＝99∶1，97∶3，95∶5，93∶7，91∶9，80∶20，70∶30，50∶50，100％甲醇)，再进行高效液相色谱纯化，得到另一些纯净的葫芦素类化合物(I-f～g)。

本发明制备了7种纯净的葫芦素类化合物。经结构鉴定，这7种葫芦素类化合物包括：化合物(1)为葫芦素B(Cucurbitacin B)；化合物(2)为23，24-dihydro-Cucurbitacin B；化合物(3)为23，24-dihydro-Isocucurbitacin B；化合物(4)为Cucurbitacin E；化合物(5)为Cucurbitacin D；化合物(6)为Cucurbitacin B glucoside；化合物(7)Cucurbitacin I。

实施例2 对实施例1所得化合物1-7的理化特征及化学结构的定性鉴定：

化合物1-7的化学结构经¹H NMR、¹³C NMR、MS测试，并与文献数据对比后确定。

化合物(1)的理化性质：白色固体， ¹³C NMR(125MHz，in CD₃OD)：215.8(C-11)，214.0(C-3)，205.3(C-22)，171.9(C-31)，151.6(C-24)，142.1(C-5)，122.7(C-23)，121.3(C-6)，81.1(C-25)，80.3(C-20)，72.9(C-2)，72.8(C-16)，60.0(C-17)，51.8(C-13)，51.7(C-4)，50.0(C-9)，49.4(C-12)，49.4(C-14)，46.5(C-15)，44.2(C-8)，37.1(C-1)，34.9(C-10)，29.9(C-28)，26.9(C-27)，26.4(C-26)，25.3(C-21)，24.9(C-7)，21.9(C-29)，21.6(C-32)，20.7(C-18)，20.1(C-19)，19.5(C-30)；ESI-MS m/z：499[M+H-AcOH]⁺。

化合物(2)的理化性质：白色粉末， ¹³C NMR(125MHz，inCDCl₃)：214.0(C-22)，212.9(C-3)，212.8(C-11)，170.2(C-31)，140.5(C-5)，121.0(C-6)，81.3(C-25)，79.0(C-20)，71.7(C-2)，71.0(C-16)，57.0(C-17)，50.9(C-13)，50.8(C-4)，48.8(C-9)，48.4(C-14)，48.0(C-12)，45.0(C-15)，42.4(C-8)，36.0(C-1)，34.8(C-24)，33.1(C-10)，30.8(C-23)，29.4(C-28)，26.2(C-27)，25.9(C-26)，24.9(C-21)，23.9(C-7)，22.3(C-32)，21.8(C-29)，20.0(C-18)，19.8(C-19)，18.7(C-30)；ESI-MS m/z：561[M+H]⁺。

化合物(3)的理化性质：无色针晶， ¹³C NMR(125MHz，inCDCl₃)：212.6(C-11)，211.1(C-2)，202.5(C-22)，170.3(C-31)，140.0(C-9)，138.4(C-5)，122.1(C-6)，79.5(C-3)，79.4(C-25)，78.2(C-20)，71.7(C-16)，58.2(C-17)，50.5(C-13)，48.7(C-12)，48.3(C-14)，45.5(C-15)，42.4(C-8)，40.9(C-4)，36.5(C-1)，36.1(C-24)，32.3(C-10)，30.5(C-23)，27.7(C-29)，26.4(C-27)，25.9(C-26)，24.4(C-28)，23.9(C-21)，23.7(C-7)，21.2(C-32)，20.0(C-19)，19.2(C-18)，18.5(C-30)；ESI-MSm/z：501[M+H-AcOH]⁺。

化合物(4)的理化性质：白色粉末， ¹³C NMR(125MHz，inCDCl₃)：212.7(C-11)，202.5(C-22)，198.6(C-3)，170.2(C-31)，152.0(C-24)，144.5(C-2)，136.7(C-5)，120.8(C-6)，120.4(C-23)，114.8(C-1)，79.3(C-25)，78.2(C-20)，71.3(C-16)，58.2(C-17)，50.7(C-13)，48.8(C-9)，48.8(C-12)，48.1(C-14)，47.5(C-4)，45.6(C-15)，41.6(C-8)，34.7(C-10)，27.9(C-29)，26.4(C-27)，25.8(C-26)，24.0(C-21)，23.6(C-7)，21.9(C-32)，20.2(C-28)，20.2(C-19)，19.8(C-18)，18.3(C-30)；ESI-MS m/z：579[M+Na]⁺。

化合物(5)的理化性质：白色晶体， ¹³C NMR(125MHz，inCDCl₃)：213.1(C-11)，212.9(C-3)，202.3(C-22)，154.6(C-24)，141.2(C-5)，120.4(C-6)，119.8(C-23)，78.3(C-20)，72.8(C-25)，71.3(C-2)，70.8(C-16)，58.4(C-17)，50.8(C-4)，50.4(C-13)，48.6(C-9)，48.6(C-12)，48.5(C-14)，45.9(C-15)，41.6(C-8)，36.7(C-1)，34.9(C-10)，30.6(C-26)，28.8(C-27)，28.5(C-28)，24.4(C-7)，23.9(C-21)，20.6(C-19)，20.2(C-18)，20.1(C-29)，19.4(C-30)；ESI-MS m/z：499[M-H₂O+H]⁺。

化合物(6)的理化性质：白色固体， ¹³C NMR(125MHz，inCD₃OD)：215.0(C-11)，213.5(C-3)，205.1(C-22)，171.7(C-31)，151.2(C-24)，141.1(C-5)，122.4(C-23)，121.2(C-6)，104.1(C-1’)，81.4(C-25)，80.5(C-20)，79.8(C-2)，78.4(C-5’)，77.5(C-3’)，75.1(C-2’)，71.5(C-16)，71.3(C-4’)，62.7(C-6’)，60.1(C-17)，52.2(C-4)，51.2(C-13)，49.3(C-9)，49.2(C-12)，49.1(C-14)，46.4(C-15)，44.0(C-8)，35.6(C-1)，35.2(C-10)，29.2(C-29)，26.5(C-27)，26.2(C-26)，25.3(C-21)，24.5(C-7)，21.5(C-32)，21.4(C-30)，20.3(C-18)，20.1(C-19)，18.8(C-28)；ESI-MS m/z：721[M-H]^-。

化合物(7)的理化性质：白色粉末， ¹³C NMR(125MHz，inCDCl₃)：212.6(C-11)，202.5(C-22)，198.1(C-3)，155.2(C-24)，144.3(C-2)，136.7(C-5)，120.3(C-6)，119.1(C-23)，114.8(C-1)，78.3(C-20)，71.7(C-16)，71.2(C-25)，57.6(C-17)，50.9(C-13)，48.9(C-9)，48.8(C-12)，48.3(C-14)，47.6(C-4)，45.2(C-15)，41.3(C-8)，34.7(C-10)，29.6(C-26)，29.2(C-27)，27.7(C-28)，23.7(C-21)，23.4(C-7)，20.1(C-29)，20.1(C-19)，20.0(C-18)，18.4(C-30)；ESI-MS m/z：532[M+H₂O]⁺。

实施例3中药甜瓜蒂来源的葫芦素类化合物的生物活性

研究发现，在神经退行性变的动物模型中，NGF能阻止或减少神经元的退变，一定程度可阻止AD进展，具有促进神经营养和神经保护作用。PC 12细胞就是一个被广泛运用模拟神经元的成功体外模型。它来源于大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，与交感神经元和感觉神经元一样，起源于神经嵴，经NGF处理后，细胞停止增殖，生长出神经突起，表现为成熟交感神经元样细胞表型。因此，采用PC 12细胞生物活性鉴定系统，从天然产物中筛选具有拟神经生长因子活性的有效成分，将成为预防和治疗老年痴呆症的有效药物。

实验方法：

1)PC 12细胞的培养：在含10mL DMEM培养基(其中含10％马血清、5％胎牛血清)的100mm培养皿中，接入20×10⁴个PC 12细胞，两天后更换一次培养基，再过三天继代。先用5mLPBS将细胞洗两次，再加入10mL于培养皿中，在37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱内培养10分钟，轻轻吹洗，并转移到15mL的一次性离心管，800rpm离心5min后，血球计数板上计数。24孔细胞培养板每孔试先加入1mL含血清的DMEM培养基，每孔接2×10⁴个细胞，CO₂培养箱培养24小时后准备进行活性测试。

2)活性测试：以0.5％DMSO为阴性对照，NGF 40ng/mL为阳性对照，将葫芦素类化合物配置成不同浓度的DMSO溶液。用1mL含1％DMSO和样品的DMEM溶液(不含血清)将24孔细胞板的每孔原培养基取代后，放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养。倒置显微镜下每隔24小时、连续6天观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率(神经突起长于胞体直径一倍的细胞数目与视野下总细胞数目的比值)，每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。

3)实验结果：

在10μg/mL的浓度下，加入葫芦素类化合物48和72小时后，PC12细胞的神经突起显著伸长，分别达到77％和78％的分化率，此实验说明葫芦素类化合物具有显著的拟神经生长因子的活性(见图1)。

在有效浓度范围内，葫芦素类化合物I-a～g在加入48和72小时后，样品均显示出较明显的拟神经生长因子活性。其中，在72小时后的分化率要比48小时的高，且72小时分化率达到最高。图2为葫芦素类化合物I-a～g的拟神经生长因子活性图，其中化合物I-e的活性比其它葫芦素类化合物的活性更有优势。

以化合物I-e为例，0.5％的DMSO作为阴性对照，NGF 40ng/mL为阳性对照，化合物I-e的神经突起伸长活性的有效浓度范围是0.01～1μg/mL，其中在最佳浓度0.08μg/mL的条件下，诱导PC 12细胞产生的神经突起率与阳性对照NGF诱导的突起率相当，活性最显著(见图3和图4)。其中，图3是加入化合物I-e经48和72小时后PC 12细胞的神经突起分化率随剂量增加的变化(C：阴性对照0.5％DMSO，阳性对照NGF：40ng/mL，化合物I-e的浓度：0.01～1μg/mL)。图4是化合物I-e和葫芦素类化合物加样72小时后PC12细胞神经突起的显微照片(a：0.5％DMSO为阴性对照，b：NGF 40ng/mL为阳性对照，c：化合物I-e，0.08μg/mL，d：葫芦素类化合物，10μg/mL)。

实施例4

NGF是重要的神经营养因子，具有神经营养和保护功能，所以推测拟神经生长因子活性化合物也应具有神经营养和保护的功能。PC 12细胞是一个被广泛运用研究神经营养活性的体外模型，研究发现葫芦素类化合物具有促进PC 12细胞神经突起伸长的显著活性，也应均具有神经营养功能。因而，注射东莨菪碱造成乙酰胆碱缺失的化学损伤动物模型，可用行为学评价葫芦素类化合物是否可以改善注射东莨菪碱后造成的学习记忆缺失。化合物I-e的拟神经生长因子活性比其它化合物有优势，且可以通过大量葫芦素B的水解反应得到，故选取化合物I-e为代表进行动物实验的研究。

实验主要材料：ICR小鼠(8周龄雄性，各35只)购于上海斯莱克动物公司。

实验操作：ICR 8周龄小鼠被随机分成5组，对照组、东莨菪碱组、药物治疗低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组7只。各组均在实验前禁食12小时，实验前1.5小时口腔给予1％吐温80的生理盐水或者化合物I-e，实验前0.5小时腹腔注射生理盐水或2mg/kg东莨菪碱；然后进行行为学测试，检测化合物对于学习记忆及空间记忆功能改善。

(1)新奇物体辨别实验：新奇物体辨别实验是根据啮齿类动物辨别熟悉和新奇物体的能力。使用到的装置为白色无盖的盒子(长×宽×高：40×20×18厘米)。首先，盒子里不放任何物体，每次从相同位置点释放小鼠，让其自由活动5分钟以适应环境，称为适应期，共两天。第三天为熟悉期和测试期。熟悉期：先放入两个相同物体后，将小鼠放入，自由活动5分钟，以小鼠鼻子距物体小于2厘米或趴在被识别的物体上算为探究行为，分别记录下对两个相同物体的探究时间。测试期：间隔1小时后，换上两个不同物体(其中一个是和熟悉期相同的物体(f)，另一个是新奇物体(n))，让其自由活动5分钟，并记录下小鼠对熟悉物体的探究时间f和对新奇物体的探究时间n。熟悉期和测试期按随机数字组合两种物体及位置摆放。认知指数的计算公式为：(对新奇物体探究n-对熟悉物体的探究时间f)/总的探究时间n+f。

(2)Y-maze实验：自发性的交替行为可以用Y-maze实验来评估。Y-maze即黑色Y形三等分辐射式迷路箱，由3个支臂和一个连接区组成，三臂互相间夹角120°，每臂长38.5厘米，上宽8厘米，下宽3.5厘米，高12厘米，三个臂可任选一臂为起始臂。每只小鼠从固定一臂的末端释放，让小鼠自由活动8分钟，记录每次进臂的次序。三次连续进入不同的三个臂臂被定为交替进臂(如：ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA)。交替进臂率的计算为：1-错误次数/(总次数-2)×100％。

实验结果参见图5A和图5B，其中图5A为新奇物体实验，图5B为Y-maze实验：

(1)与对照组小鼠相比，腹腔注射2mg/kg东莨菪碱小鼠对新奇物体的辨别能力明显降低(#p＜0.05)；化合物I-e处理能恢复腹腔注射2mg/kg东莨菪碱小鼠对新奇物体的辨别能力(*p＜0.05，**p＜0.01)(图5A)；

(2)与对照组小鼠相比，腹腔注射2mg/kg东莨菪碱小鼠学习记忆功能明显降低(##p＜0.01)；化合物I-e处理能恢复腹腔注射2mg/kg东莨菪碱小鼠学习记忆功能(*p＜0.05，**p＜0.01)(图5B)。

Claims (4)

1.一种葫芦素类化合物在制备预防老年痴呆症疾病的药物中的应用，其特征在于，所述化合物为化合物I- a~g，结构式为：

。

2.一种葫芦素类化合物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，所述化合物为化合物I- a~g，结构式为：

。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为固体制剂或液体制剂。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为肠道或非肠道。