KR101916603B1 - 무청 추출물을 포함하는 뇌신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분인 에루카아미드의 뇌신경질환 예방, 치료 또는 개선용 용도를 제공한다. 이들 성분은 우수한 아세틸콜린 에스터라아제(AChE) 저해 효과를 나타낸다. 따라서, 이들을 유효성분으로 포함하는 조성물은 알츠하이머병(Alzheimer‘s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성뇌질환 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분인 에루카아미드를 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer’s disease, AD)은 중추신경, 특히 전뇌(forebrain), 소뇌편도(amygdala), 해마(hippocampus) 및 대뇌피질 같은 피질과 변역계(limbic system)의 신경을 파괴하는데, 이들은 뇌에서 학습, 기억, 사고, 해동, 감정조절 등과 관련된 부위이다. 특히 AD에서 아세틸콜린과 같은 신경전달물질의 부족이 가장 중요한 지표이며 이것을 회복시키는 것이 AD 치료목표의 하나가 되고 있다.
알츠하이머 병의 특징적인 병변으로 뇌조직 중에 β-amyloid가 포함된 amyloid plaques, neurofibrillary tangles 등이 형성되고, 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine, Ach)의 양을 감소시킴으로서 기억력, 인지기능의 감퇴증상이 서서히 나타나는 것으로 보고되고 있다. 현대 의학점 관점은 대부분 뇌 콜린성 신경세포의 광범위한 변성 및 소실을 인지기능 감퇴의 가장 주요한 원인으로 간주하고 있으며, 이를 극복하기 위한 방편으로 손상되지 않고 남아있는 콜린성 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지기능을 부분적으로 회복시키는 연구가 주종을 이루고 있다.
또한, AD의 치료는 근본적 병변의 치료 보다는 환자의 증세를 가볍게 하고, 병의 진행속도를 지연시키는데 주안을 두고 있다. AD환자의 뇌에서는 기저전뇌(basal forebrain)에 있는 mynert nucleus 신경세포가 대부분 죽어 있어서, 이 뇌신경세포가 지배하는 시냅스(synapse)와 대뇌피질과의 연결이 퇴화되어 있다 이들 신경세포는 신경전달 물질인 아세틸콜린(Ach)을 생산하는 콜린성 신경세포(cholinersic nerve cell)인데, 그 사멸로 인해서 AD환자 뇌에서는 ACh 생산량이 크게 회복된다고 보고된 바 있다. 실제로 임상에서는 이를 위해서 뇌 안에 있는 ACh를 분해시키는 효소 저해제(enzyme inhibitor)를 사용하고 있다.
즉, AD에서 아세틸콜린(Ach)과 같은 신경전달 물질의 부족이 가장 중요한 지표이며, 이것을 회복시키는 것이 AD 치료목표의 하나가 되고 있다. 부교감신경성 약물은 muscarinic 또는 니코틴 길항제(nicotinic agonist), 콜린에스테라아제 저해제(cholinesterase inhibitors, ChEIs), 간접적으로 아세틸콜린 유리를 조절하는 약물들로 나눌 수 있다. 상기 ChEIs는 많은 약물들이 개발되어 사용되고 있는데, 타크린(tacrine), 파이소스티그민(physostigmine), 도네페질(donepezil), ENA 713, 메트리포네이트(metrifonate), 갈란타민(galanthamine) 또는 리바스티그민(rivastigmin)이 대표적이며, 최근 들어서는 메만틴(memantin)이 사용되고 있다. 제 2세대 제약 (도피네질, ENA 713, 메트리포네이트, 갈란타민, 리바스티그민)은 제 1세대 제약(타크린, 파이소스티그민)에 비해 작용시간이 길고 안정적이며, 혈뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과율이 높아서 중추신경 내 농도가 높은 경향이 있다. 제 1세대 제약은 아세틸콜린 에스테라아제(AChE), 부티릴콜린 에스테라아제(BChE) 및 다른 말초 콜린 에스테라아제(ChE)를 비 선택적으로 억제하는 반면, 몇몇 새로운 제약은 AChE에 대한 선택성이 높아 말초부작용의 발생이 감소한다. 이러한 제제의 작용기전은 ACh의 분해를 억제함으로써 시냅스(synapse) 내의 ACh농도를 증가시키는 것에 기인하는 것으로 알려져있다.
한편, 무청(Radish leaves)은 십자화과의 한해살이풀 순무 Brassica rapa의 뿌리와 잎이며, 장의 기능을 활성화시켜 소화를 잘되게하는 약재로 잘 알려져있으며, 단백질, 당질을 비롯하여 비타민A, C 등과 각종 무기질을 많이 함유하고 있으며, 이들 성분은 각종 효소, 호르몬, 항체의 구성 및 영양성분 또는 활성물질의 운반과 저장 등에 쓰이며, 유해산소로부터 세포를 보호하는 작용에 효과적인 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 뇌신경 질환의 예방 및 개선 효과가 있는 천연물 개발에 대한 연구 결과, 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분인 에루카아미드가 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase, AChE) 활성을 저해함에 있어 뛰어난 효과를 보임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서는 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 뇌신경세포 보호 물질을 식용생물자원으로부터 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 뇌신경세포 보호 물질을 식용생물자원으로부터 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분인 에루카아미드의 뇌신경질환 예방, 치료 또는 개선용 용도를 제공한다. 이들 성분은 우수한 아세틸콜린 에스터라아제(AChE) 저해 효과를 나타낸다. 따라서, 이들을 유효성분으로 포함하는 조성물은 알츠하이머병(Alzheimer‘s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성뇌질환 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 무청 에탄올 추출물의 핵산 분획(H1, H2, H3), 클로로포름 분획(C1, C2, C3) 및 에틸아세테이트 분획(E1, E2, E3)의 AChE 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 클로로포름 분획(C2, C3)에 대하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻어진 소분획들의 AChE 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻어진 소분획 중 CHCl3 : EtOH = 70:30(v/v) 세 번째 소분획(70:30-3)을 preparative thin layer chromatography(PLC)를 이용하여 분리된 활성 밴드의 AChE 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 3을 통해 분리된 활성 분획의 HPLC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 무청 추출물의 정제 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 무청 추출물을 이용한 Y-미로 테스트(Y-maze test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 무청 추출물을 이용한 수동 회피 반응 테스트(Passive avoidance test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 이용하여 무청 추출물의 독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)를 이용하여 무청 추출물의 독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 에루카아미드(erucamide)의 농도별 AChE 저해능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 클로로포름 분획(C2, C3)에 대하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻어진 소분획들의 AChE 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻어진 소분획 중 CHCl3 : EtOH = 70:30(v/v) 세 번째 소분획(70:30-3)을 preparative thin layer chromatography(PLC)를 이용하여 분리된 활성 밴드의 AChE 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 3을 통해 분리된 활성 분획의 HPLC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 무청 추출물의 정제 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 무청 추출물을 이용한 Y-미로 테스트(Y-maze test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 무청 추출물을 이용한 수동 회피 반응 테스트(Passive avoidance test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 이용하여 무청 추출물의 독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)를 이용하여 무청 추출물의 독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 에루카아미드(erucamide)의 농도별 AChE 저해능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 뇌신경 질환에 대하여 천연물을 대상으로 연구를 진행하던 중 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분인 에루카아미드가 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase, AChE) 활성을 저해함에 있어 뛰어난 효과를 발휘함으로써 대뇌의 아세틸콜린 수준을 크게 증가시켜 뇌신경 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 뛰어남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 무청 추출물의 제조시에는 건조 또는 미건조시킨 무청 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출의 효율성을 위해 무청은 잘게 부수어 사용될 수 있다. 또한, 효과적인 뇌신경 질환 예방, 치료 및 개선용 무청 추출물을 얻기 위해, 무청의 분쇄 전에 약 100℃의 높은 온도에서 약 5분간 블랜칭(blanching)을 수행하여 세포내 효소를 불활성화시키는 과정을 거칠 수 있다.
무청 추출물의 제조를 위해서는 무청의 3 내지 10 배의 추출 용매를 사용하여 통상적인 추출 방법에 따라 추출할 수 있다.
추출 용매로는 천연물 추출에서 널리 이용되고 있는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출될 수 있다. 상기 유기 용매로는 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 에탈아세테이트 등이 포함된다. 이러한 유기용매는 물과 혼합하여 사용할 수 있으나, 활성 성분의 용이한 용출을 위해서는 물과 혼합하지 않고 사용할 수도있다. 일 구체예에서, 상기 무청 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 무청 추출물은 1차 추출에서 사용된 유기 용매와는 극성이 다른 유기 용매를 사용하여 추가로 분획할 수 있다. 이 경우, 상기 무청 추출물은 무청을 유기용매로 추출하고, 그 잔사를 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획함으로써 수득한 무청 추출물 분획일 수 있다.
또한, 상기 무청 추출물 또는 무청 추출물 분획에 대해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 본 발명에 있어서, '무청 추출물'에는 이와 같이 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 무청 추출물은 무청을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 무청 추출물은 무청을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 얻은 무청 추출물 분획일 수 있다.
상기 수득한 무청 추출물 분획에 대해 컬럼크로마토그래피를 반복적으로 수행하거나 TLC(thin layer chromatography) 또는 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하여 추가로 정제된 무청 추출물 분획을 얻을 수도 있다.
하기 실시예에서는 이러한 추가적인 정제과정을 통해 무청 추출물로부터 뇌신경 질환 치료, 예방 및 개선 효과를 나타내는 활성 성분이 에루카아미드임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 에루카아미드를 함유하는 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경세포 보호용 조성물을 제공한다.
비록 에루카아미드가 본 발명에 따른 무청 추출물로부터 분리된 것이긴 하나, 이는 화학적으로 합성되거나 상업적으로 입수할 수 있으며, 또한 다른 식물로부터 분리해 낼 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 무청 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한
(a) 무청을 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 무청 추출물 분획을 얻는 단계를 포함하는 무청 추출물 분획의 정제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(a) 무청을 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 무청 추출물 분획을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)로부터 수득한 무청 추출물 분획에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하는 단계;를 포함하는 에루카아미드(erucamide)의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 하기 실시예에서는, 무청을 100% 에탄올로 추출하여 얻은 잔사를, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트의 순으로 분획하여 무청 추출물 분획을 제조하였다. 또한, 상기 무청 추출물 분획 중 클로로포름 분획을 추가로 분획하고 정제하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 본 발명의 무청 추출물, 무청 추출물 분획, 및 에루카아미드는 우수한 뇌신경 질환 치료, 예방 및 개선 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 에루카아미드는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 무청 추출물 또는 이로부터 분리된 에루카아미드는 뇌신경 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.
뇌신경 질환은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 질환일 수 있다.
상기 조성물은 본 발명의 유효성분뿐만 아니라 기존에 공지된 뇌신경 질환 예방, 치료 및 개선용 물질과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 무청 추출물 또는 에루카아미드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 무청 추출물 또는 에루카아미드를 유효 성분으로 포함하는 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 무청 추출물 또는 에루카아미드를 투여하는 것을 포함하는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 무청 추출물 또는 에루카아미드를 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~1000㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 무청 추출물 또는 에루카아미드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
1: 무청 추출물의 제조 및
AChE
저해능
확인
무청(Radish leaves)을 건조 후, 핸드 믹서로 곱게 마쇄한 후 4.2kg의 조말을 5배 부피의 에탄올(v/v)로 24시간 동안 쉐이킹(shaking)하여 5회 추출한 후 감압 농축하여 무청 에탄올 추출물을 재조하였다.
무청 추출물의 AChE 저해활성 측정 시, 대조군으로는 이미 AChE 저해활성 효과가 입증된 타크린(농도 300nM)을 사용하였다.
실시예
2: 무청 추출물 분획의 제조 및
AChE
저해능
확인
실시예 1로부터 제조된 무청 추출물로부터 에탄올을 완전히 제거한 후 핵산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 이용하여 각각 3배의 부피로 환류 추출하여 각각의 분획(H1, H2, H3, C1, C2, C3, E1, E2, E3)을 제조하였다.
이렇게 제조된 무청 에탄올 추출물의 핵산 분획(H1, H2, H3), 클로로포름 분획(C1, C2, C3) 및 에틸아세테이트 분획(E1, E2, E3)의 AChE 저해활성을 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 세 번째 클로로포름층(C3)에서 우수한 AChE 저해활성을 나타내었다.
가장 높은 저해 효과를 나타낸 C2, C3 분획에 대하여 open silica gel column chromatography를 시행하여 33개의 소분획(CHCl3 : EtOH = 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100 순으로 각각 3회)으로 분획하였다. 상기 분획은 선정된 C2, C3 분획을 감압 농축하여 샘플을 준비해놓고 실리카를 클로로포름으로 현탁하여 칼럼에 충전시킨 뒤, 상기 충전된 칼럼에 선정된 분획의 샘플을 로딩(loading)하고 에탄올과 클로로포름의 농도 기울기를 이용하여 정제하는 방법으로 수행하였다.
이렇게 제조된 소분획(1mg/ml)에 대해 위와 동일한 방법으로 AChE 저해활성을 측정하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, CHCl3 : EtOH = 70:30(v/v) 조건에서 얻은 세 번째 소분획(70:30-3)이 38.8%의 저해율로 가장 높은 저해 활성을 나타내었다.
실시예
3: TLC를 이용하여 분리된 활성 밴드의
AChE
저해능
확인
실시예 2에서 가장 높은 저해 효과를 나타낸 CHCl3 : EtOH = 70:30(v/v) 세 번째 소분획(70:30-3)을 preparative silica-gel plate(glass, 200×200mm)를 사용하여 preparative thin layer chromatography(PLC)를 실시하였다. 선정 분획을 233.75mg/ml 농도로 에탄올에 녹이고 10μl씩 spotting 하여 건조시켰다. 클로로포름과 에탄올(50:50, v/v)으로 전개시킨 후 밴드를 분리하여 AChE 저해활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4번 밴드에서 가장 높은 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예
4:
HPLC를
통한 활성물질의 분리
가장 높은 저해활성을 나타낸 4번 밴드 부분의 활성성분을 분리하기 위해 Aegispak C18 μL column을 이용한 HPLC 분석을 실시하였다.
상기 HPLC는 0내지 100%의 에탄올(gradient elution)과 물의 직선농도 구배로 변화를 주어 80분간 실행하였다. 파장 범위는 210nm로 설정하고, flow rate는 분당 0.5ml로 하였으며, 한번에 10μl씩 시료 주입을 하였다. 그 결과, 5 min에 활성 물질의 픽을 확인하였다. 사용 용매는 특급 ethanol과 3차 증류수를 사용하였다.
| Instrument | YL9100HPLC |
| Detector | YL9160 PDA detector |
| Column | Aegispak C18 μL (5 μm, 100Å, 4.6×250mm) |
| Flow rate | 0.5 ml/min |
| Mobile phase | gradient 0f 0~100% ethanol in distilled water |
| Injection volume | 10 μl |
도 4의 HPLC분석 결과, 이 활성성분은 에루카아미드(Erucamide)임을 확인하였다.
실시예 1 내지 3을 통한 무청 추출물의 정제 과정을 정리하면 도 5와 같다.
실시예
5: 무청 추출물의 뇌신경질환 예방 활성에 대한
인비보
실험
(1) Y-미로 테스트
ICR 수컷 마우스에 무청 에탄올 추출물 시료를 섞은 사료를 농도별로(400, 800, 1200 mg/kg per day) 약 3주간 ad lib의 상태로 공급하였다. 식이 시작 후 21일째에 치매 유발성 물질인 trimethyltin(TMT)을 주입(injection)하고, Y-미로 테스트를 수행하였다.
길바꿈행동(alternation behavior)을 측정하기 위해, 각각 A, B, C 세 개의 arms를 갖는 Y-미로에서 행동실험을 실시하였다. Y-미로는 길이 32.5cm, 높이 15cm, 넓이 4cm로서 각각의 arms를 A, B, 로 정한 다음 들어 간 arm을 기록했다. 마우스를 미로에 넣고 아무런 자극 없이 8분 동안 자유롭게 움직이도록 둔 뒤, 꼬리를 제외하고 arm에 두 뒷발이 들어간 것을 측정하여 그 수치를 계산하였다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, TMT 및 sample이 mouse의 운동능력에는 영향을 주지 않았으며, sample이 공급된 group에서 기억력이 향상되었음을 확인할 수 있다.
이때, 상기 도 6에서 Control은 시료 무첨가 식이만 공급한 대조구, TMT는 시료 무첨가 식이 공급 후 TMT를 처리한 구, 무청 400은 무청 추출물을 400 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 800은 무청 추출물을 800 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 1200은 무청 추출물을 1,200 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구이다.
(2) 수동 회피 반응 테스트(Passive avoidance test)
ICR 수컷 마우스에 무청 에탄올 추출물 시료를 섞은 물을 농도별로(400, 800, 1200 ㎎/㎏ per day) 약 3 주간 ad lib의 상태로 공급하였다. 식이 시작 후 21일째에 치매 유발성 물질인 trimethyltin(TMT)을 주입(injection)한 뒤, 수동 회피 반응 테스트를 수행하여 혐오자극(전기쇼크)이 제시되었던 사자를 기억하여 동일한 상자로 다시 들어가는데 걸리는 시간(step-through latency)를 측정하였다.
이 실험은 실제 실험에 들어가기 하루 전, 마우스를 기억상자와 같은 장소에서 트레이닝(training)을 시킨 다음 행동실험을 실시했다. 모든 마우스를 실험 상자에서 적응 훈련(명(明)실-명(明)실, 쇼크 없음-명(明)실, 쇼크 있음)을 실시한 후, 24 시간 후 쇼크는 없고 빛은 있는 상태에서 1 마리당 300 sec 동안 실험했다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, TMT를 투여한 군에서 현격히 학습능력이 떨어짐을 보였으나, 무청 추출물을 섭취한 군에서 학습능력 보호 및 증진 효과가 나타남을 확인하였다.
이때, Control은 시료 무첨가 식이만 공급한 대조구, TMT는 시료 무첨가 식이 공급 후 TMT를 처리한 구, 무청 400은 무청 추출물을 400 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 800은 무청 추출물을 800㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 1200은 무청 추출물을 1,200 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구이다.
실시예
6: 무청 추출물 독성 평가
본 발명의 무청 추출물의 독성을 평가하기 위하여 ICR 수컷 마우스에 무청 에탄올 추출물 시료를 섞은 물을 농도별로(400, 800, 1200 ㎎/㎏ per day) 약 3 주간 ad lib의 상태로 공급하였다. 식이 시작 후 21일째에 치매 유발성 물질인 trimethyltin(TMT)을 주입(injection)한 후 GPT(glutamic pyruvic transaminase) 및 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)로 간독성을 확인하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9를 통해 알 수 있는 바와 같이, 무청추출물 처리 시 대조군과 비교하여 GPT 및 GOT에 있어 유의적인 변화가 없음을 확인할 수 있었으며 이로써 무청추출물이 독성을 가지지 않음을 확인하였다.
도 8 및 도 9에서, Control은 시료 무첨가 식이만 공급한 대조구, TMT는 시료 무첨가 식이 공급 후 TMT를 처리한 구, 무청 400은 무청 추출물을 400 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 800은 무청 추출물을 800㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구, 무청 1200은 무청 추출물을 1,200 ㎎/㎏ per day로 첨가한 식이를 공급한 후 TMT를 처리한 구이다.
실시예
7:
에루카아미드(erucamide)의
농도별
AChE
저해능
확인
본 발명에서 최종적으로 수득한 활성물질인 에루카아미드(erucamide)의 농도별 AChE 저해능을 평가하였다. 그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 것과 같이 대조군인 300nM의 타크린보다도 더 우수한 억제활성을 나타냄을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 무청 추출물을 유효성분으로 포함하고,
알츠하이머 병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매 추출물인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 에탄올 추출물인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 무청을 유기용매로 추출하고, 그 잔사를 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획함으로써 수득한 무청 추출물 분획인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 무청을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 무청을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 얻은 무청 추출물 분획인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 무청 추출물은 에루카아미드를 포함하는 것인 뇌신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 무청 추출물을 유효성분으로 포함하고,
알츠하이머 병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뇌신경 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물. - (a) 무청을 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 무청 추출물 분획을 얻는 단계를 포함하는 무청 추출물 분획의 정제 방법. - (a) 무청을 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0~80:20의 전개용매 조건에서 무청 추출물 분획을 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)로부터 수득한 무청 추출물 분획에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하는 단계;를 포함하는 에루카아미드(erucamide)의 정제 방법.
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Cited By (2)
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| KR20200125155A (ko) | 2019-04-26 | 2020-11-04 | 한국식품연구원 | 무청 추출물을 포함하는 비만 및 대사성질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20200125207A (ko) | 2019-04-26 | 2020-11-04 | 한국식품연구원 | 무청 추출물을 포함하는 장내 염증 또는 장누수증후군 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
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2017
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Planta Med., vol.82(S 01) (2016.) |
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| KR20200125207A (ko) | 2019-04-26 | 2020-11-04 | 한국식품연구원 | 무청 추출물을 포함하는 장내 염증 또는 장누수증후군 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
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