CN103599339B - 治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用，该组合物由以下重量份的组分制成：白芍1‑5重量份、知母1‑5重量份、苦参1‑5重量份、化橘红1‑5重量份。该药物组合物可通过醇提或水提方法制备得到。上述药物组合物对于治疗和预防糖尿病及其肾并发症具有显著性效果。

Description

治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症，DN可以看作为糖尿病微血管并发症之一，除此之外还包括糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变。DN是糖尿病最常见的并发症，其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升，已成为引起终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因之一，过去20年DN的发病率一直在增加。西方国家的DN占ESRD的25%～42%，中国的DN占ESRD的6%～10%，ESRD的治疗花费巨大。

目前西药治疗ESRD，没有理想的药物。中药复方具有多组分、多靶点的特点，开发在降血糖的同时治疗糖尿肾并发症的复方具有可能性和空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物。

本发明的另一目的是提供上述药物组合物的制备方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成：

白芍1-5份、知母1-5份、苦参1-5份、化橘红1-5份。

该组合物优选由以下重量份的组分制成：

白芍1-3份、知母1-3份、苦参1-3份、化橘红1-3份。

该组合物进一步优选由以下重量份的组分制成：

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红1份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红1份；

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红2份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红2份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红2份；

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红3份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红3份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红3份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红1份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红2份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红3份；

白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红1份；

白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红3份；

白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红2份；

白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红1份。

该组合物最优选由以下重量份的组分制成：白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份。

上述组合物与药学上可接受的载体制成制剂。所述的制剂为口服液、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或注射剂。

上述组合物可通过醇提方法制备得到，具体的制备方法包括以下步骤：称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量浓度为10%-90%的乙醇加热回流提取1-3次，每次提取1-3小时，过滤，合并滤液，浓缩。优选乙醇质量浓度为60%-70%。

上述组合物也可以通过水提方法制备得到，具体的制备方法包括以下步骤：称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量水，加热提取1-3次，每次提取0.5-1小时，过滤，合并滤液，浓缩。

本发明药物组合物可在制备治疗或预防糖尿病及其肾并发症的药物中的应用。所述的糖尿病引起的肾并发症为肾损伤。

白芍味苦、酸，微寒，具有平肝止痛、养血调经，敛阴止汗的功效。知母（RhizomaAnemarrhenae）味苦、甘，寒、功效清热泻火，生津润燥。苦参（Sophora flavescens）味苦；性寒、功效清热燥湿，杀虫（外用），利尿。化橘红（Exocarpium citrl Grandis，PummeloPeel）味辛、苦，温，功效散寒，燥湿，利气，消痰。发明人综合上述原料药材的优势，结合现代新药研究手段，研制出能有效治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，该药物组合物还具有使用安全、起效快的特点。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明具有显著的降低血糖及治疗糖尿病肾并发症的作用；与阳性对照药二甲双胍、消渴丸、二甲双胍加羟苯磺酸钙合用相比，总体药效具有优效性；该组方同时具有组方创新性和活性创新性。

以下通过具体试验例对上述效果进行进一步说明：

试验例1.HepG2细胞胰岛素抵抗模型实验

治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物由白芍、知母、苦参、化橘红味药物组成。白芍、知母、苦参、化橘红四种药物可以在1-5：1-5：1-5：1-5的重量比例范围内任意组合。现列出该药物组合物的药物组合序号和该序号下的4味药物的组合比例关系。下列药物组合物的重量比例关系和序号，在后面的体外抑制α糖苷酶实验、胰岛素增敏实验、促进胰岛素分泌实验和修复高微血管内皮损伤实验以及糖尿病大鼠模型实验中也具体使用到。

组方1组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:2:3:1

组方2组：白芍:知母:苦参:化橘红=2:3:1:1

组方3组：白芍:知母:苦参:化橘红=3:1:2:1

组方4组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:2:3:2

组方5组：白芍:知母:苦参:化橘红=2:3:1:2

组方6组：白芍:知母:苦参:化橘红=3:1:2:2

组方7组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:2:3:3

组方8组：白芍:知母:苦参:化橘红=2:3:1:3

组方9组：白芍:知母:苦参:化橘红=3:1:2:3

组方10组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:1:1:1

组方11组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:1:1:2

组方12组：白芍:知母:苦参:化橘红=1:1:1:3

组方13组：白芍:知母:苦参:化橘红=2:2:2:1

组方14组：白芍:知母:苦参:化橘红=2:2:2:3

组方15组：白芍:知母:苦参:化橘红=3:3:3:2

组方16组：白芍:知母:苦参:化橘红=3:1:1:1

1.实验材料：

细胞株：肝癌细胞（HepG2），FROM ATCC，中国药科大学国家新药筛选中心。

试药：高糖DMEM培养基（批号：914292，Gibco公司）；低糖DMEM培养基（批号：914292，Gibco公司）；胰蛋白酶（Amresco,USA）；胎牛血清（赛默飞世尔公司）；MTT；DMSO（南京化学试剂有限公司）；棕榈酸；葡萄糖测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2.相关试剂和培养基的配制：

低糖DMEM培养基的配制:

1袋DMEM+800ml蒸馏水于磁力搅拌器上搅拌1h；再加3.7g(实际上称得3.7005g)NaHCO3+0.06g青霉素(实际上称得0.0604g)+0.1006g链霉素(实际上称得0.1006g)，搅拌3h以上；0.22μm滤过除菌，放于4℃保存备用。

高糖DMEM的配制:

1袋DMEM+800ml蒸馏水于磁力搅拌器上搅拌1h；再加3.7g(实际上称得3.7005g)NaHCO3+0.06g青霉素(实际上称得0.0604g)+0.1006g链霉素(实际上称得0.1006g)，搅拌3h以上；0.22μm滤过除菌，放于4℃保存备用。

胰蛋白酶消化液配制:

称取胰蛋白酶0.25g，置于100ml的烧杯中，量取100mlPBS溶液，磁力搅拌溶解1h。

1×10^-7mol/L胰岛素的高糖DMEM诱导液的配制:

已知胰岛素注射液规格为10ml含有400IU胰岛素，胰岛素28IU约等于1mg胰岛素（5778g/mol），则配制1×10^-7mol/L胰岛素高糖DMEM诱导液操作方法为：吸取40μl胰岛素注射液和1ml血清，加入高糖DMEM培养液100ml，充分混匀，于超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得100mL胰岛素浓度为1×10^-7mol/L、血清浓度为1%的胰岛素高糖DMEM诱导液。

含1%血清的高糖培养基的配制:

取1ml胎牛血清，加高糖培养基至100ml。用于正常组实验。

含10^-9mol/L的胰岛素和1%血清的低糖培养基的配制:

取7.5μl的胰岛素注射液于一玻璃瓶中，加19.5mL的低糖培养基，混匀，得胰岛素浓度为10^-7mol/L的母液；取该溶液1mL至100mL容量瓶中，加1mL血清，再用低糖培养基定容至100mL，超净台中过0.22μm滤膜除菌，即得所需胰岛素浓度为10^-9mol/L的诱导溶液100mL。

3.实验方法

将HepG₂细胞按8×10⁴浓度接种于96孔板上，每孔200μL，造模组使用浓度为10^-6mol/L胰岛素诱导液诱导24h后，更换胰岛素浓度为10^-9mol/L培养液继续孵育12h，测定各组细胞的葡萄糖消耗量。

3.1HepG2细胞培养及接板

HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，每瓶加入约12mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37℃含有5%CO₂的培养箱中培养，约每3天一次0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化传代，在细胞状态较好时胰酶消化后接板。

3.2组方样品液16（2.5mg生药/ml）配制：

组方16药物的提取：称取白芍30g，知母10g，苦参10g，化橘红10g置于圆底烧瓶中，加药材总重10倍量的浓度为60%的乙醇溶液，浸泡1h后，加热回流提取1h，16层纱布过滤，得滤液。同法提取3次，合并3次滤液，70℃减压回收至无醇味，70℃水浴锅上蒸至近干后60℃减压干燥，得该组方的干膏粉末24.114g，得率40.19%。

组方待测样品液16（2.5mg生药/ml）配制：称取组方样品0.0020g于2mlEP管中，加2ml低糖DMEM培养液涡旋溶解，于超净台中过0.22μm滤膜除菌，得浓度为2.5mg生药/ml的母液。

组方样品液1-15（2.5mg生药/ml）配制：分别按试验例1项下的规定比例，取组方1-15组各组药材，然后按“组方16样品液（2.5mg生药/ml）配制”方法，配制组方1-15组样品液（2.5mg生药/ml）。

组方样品液17（2.5mg生药/ml）配制：

组方17药物的提取：按组方16的药材3:1:1:1的比例，称取白芍30g，知母10g，苦参10g，化橘红10g，置于圆底烧瓶中，加药材总重10倍量水，浸泡1h后，水浴提取1h，16层纱布过滤，得滤液。同法提取3次，合并3次滤液，80℃水浴锅上蒸至近干后60℃减压干燥，得该组方样品的干膏粉末31.2g，得率52%。

组方样品液17（2.5mg生药/ml）配制：称取组方样品0.0026g于2mlEP管中，加2ml低糖DMEM培养液涡旋溶解，0.22μm滤膜除菌，得浓度为2.5mg生药/ml的母液。

3.3HepG2细胞分组、造模及给药

HepG2细胞生长至80～90%融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25%的胰蛋白酶消化约40s，倒出胰酶，加入含10%血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10%胎牛血清的培养基，轻轻吹打细胞至均匀，将细胞稀释至8×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL，周围每孔加入200μLD-Hank's溶液。将96孔板置于5%CO₂、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至80-90%融合时，吸出培养液，分组如下，每组6个复孔，各孔加入如下培养基、诱导液及药液后继续培养：空白组：200μL高糖DMEM；模型组：180μL高糖DMEM和20μL10^-5mol/L胰岛素诱导液；样品组：160μL高糖DMEM，20μL诱导液和20μL400μg/mL阿卡波糖、20μL400μg/ml二甲双胍、20μL0.025mg/ml格列本脲、20μL436μg/mL羟苯磺酸钙、20μL2.5mg/ml和血明目片及各20μL组方样品液1-17。

3.4细胞培养液中葡萄糖含量测定

诱导培养16-20h后，将含药培养液取出，每孔加入新鲜的含10^-9mol/L胰岛素并含1%FBS的低糖培养基200μL，培养12h后从各孔吸取20μl培养液于1.5mLEP管中，加入1000μL的葡萄糖浓度测定工作液，充分混匀，置于37℃水浴15min。显色后，在波长492nm处，测定各样品的吸光值，计算培养前后培养基中葡萄糖的含量差值即为各组葡萄糖消耗量。实验结果如表1所示。

表1.不同药物及组方样品液1-17组对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响(n=6)

注：与空白组比较，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01；与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

实验结果表明：组方样品液1-17组、二甲双胍组均可极显著增加HepG2细胞的胰岛素敏感性（P<0.01）；其他阳性药未见显著增敏效果。

试验例2α糖苷酶抑制模型实验

1.实验材料

试药：α-葡萄糖苷酶（日本TCI，批号:）；4-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷（alfa aesar，批号：）；阿卡波糖片（拜耳医药保健有限公司，批号：117893）；格列本脲（天津太平洋制药有限公司，批号：120108）；二甲双胍（北京京丰制药有限公司，批号：120915）；羟苯磺酸钙(西安利君制药有限公司，批号：1202023)；和血明目片（西安碑林药业股份有限公司，201205009）。

2.相关溶剂的配制

磷酸盐缓冲液（PBS）的配制（pH=6.8，0.1M）(按照2005版药典规定的方法配制):

不同浓度PNPG底物溶液的配制:

精密称取60.68mg PNPG于10mL容量瓶中，加入PBS定容到10ml，漩涡至溶解，得到20mmol/L的PNPG溶液。倍半稀释，制备浓度分别为10、5、2.5mmol/L的PNPG底物溶液。

3.实验方法

将1mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶PBS溶液100μL与各样品50μL加入96孔板中，摇匀，在37℃水浴中孵育10min后加入浓度10mmol/L的PNPG溶液50μL，摇匀，37℃反应45min后，加入0.3mol·L^-1的Na₂CO₃100μL，终止反应。于405nm处测定并记录吸光值计算抑制率。

3.1分组及给药

反应在96孔板上进行，考虑排除药液颜色干扰，将实验分为模型组及模型空白组、阳性药阿卡波糖组及阳性药空白组、样品组及样品对照组，各组样品同试验例1。每组设6个复孔。

3.2α-糖苷酶抑制率的测定

将α-葡萄糖苷酶溶液100μL与各样品溶液50μL混合后摇匀，在37℃水浴中孵育10min后加入10mmol·L^-1PNPG溶液50μL，摇匀，37℃反应45min，加入0.3mol·L^-1的Na₂CO₃100μL，终止反应。于405nm处测定并记录吸光值。实验结果如表2所示。

按照如下公式计算各组药物对α-葡萄糖苷酶的抑制率：

抑制率=（1－A样品/A模型）×100%

表2.不同药物及组方样品液1-17组对对α-糖苷酶的抑制率(n=4)

注：与空白组比较，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01；与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

实验结果表明，组方样品液1-17组对α-糖苷酶的抑制率为19.27%—25.69%，与模型组比较，具有极显著性抑制作用（P<0.01）；和血明目片对α糖苷酶的抑制率为11.092%，具有显著性抑制作用（P<0.05）；二者均不及阿卡波糖86.11%的抑制率；其他阳性药未表现出对α糖苷酶的抑制作用；除阿卡波糖组外，组方样品液1-17组与其它阳性对照药组比较，具有优效性。

试验例3.RIN-m5F细胞胰岛素促泌模型实验

1.实验材料

细胞株：RIN-M5F大鼠胰岛瘤细胞（中国医学科学院肿瘤细胞库）。

试药：低糖DMEM培养基（批号：914292，Gibco公司）；胰蛋白酶（Amresco,USA）；胎牛血清（赛默飞世尔公司）；DMSO（Solarbio）；DMSO（南京化学试剂有限公司）；HEPES缓冲盐（sunshine）。胰岛素ELISA试剂盒（胰岛素ELISA试剂盒（南京迪兆生物，批号：CK-E30620R）；阿卡波糖片（拜耳医药保健有限公司，批号：117893）；格列本脲（天津太平洋制药有限公司，批号：120108）；二甲双胍（北京京丰制药有限公司，批号：120915）；羟苯磺酸钙(西安利君制药有限公司，批号：1202023)；和血明目片（西安碑林药业股份有限公司，201205009）。

2.试验方法

RIN-m5F细胞用含有10%的胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃含有5%的CO₂的培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化传代。细胞状态较好时胰酶消化后调整细胞密度为5×10⁵～1×10⁶个·mL^-1接板，培养36h后，吸出培养液，进行分组给药。实验设空白组和阳性药组。空白组每孔加入200μL低糖DMEM培养液，样品组每孔加入180μL低糖DMEM培养液和20μL浓度为，每组6个复孔。

继续培养24小时后，换用葡萄糖浓度为15mmol/L的DMEM培养基培养4h，吸出培养液，测定其中胰岛素含量。吸取每孔中培养液10μL，按照试剂盒说明书使用胰岛素ELISA试剂盒测定各组培养液中胰岛素含量。

2.1RIN细胞培养及接板

RIN-M5F细胞接种于细胞培养瓶中，每瓶加入约12mL含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃含有5%CO₂的培养箱中培养，约每4天一次0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化传代，在细胞状态较好时胰酶消化后接板。

2.2RIN细胞接板、分组及给药

RIN细胞培养至约80%融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化约30-40s，倒掉胰酶，加入含10%血清的培养基终止消化后倒掉培养基，加入新的含10%胎牛血清的培养基，吹打细胞至均匀，将细胞稀释至5×10⁵-1×10⁶个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL，将96孔板置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养。

培养36h后，吸出培养液，分为空白组、格列本脲组、羟苯磺酸钙组、和血明目片组、二甲双胍组、阿卡波糖组及组方样品液1-17组，各组样品同试验例1。空白组每孔加入200μL低糖DMEM培养液，样品组每孔加入180μL低糖DMEM培养液和20μL样品液，每组6个复孔。

2.3细胞培养液中胰岛素含量测定

继续培养24小时后，换用葡萄糖浓度为15mmol/L的低糖DMEM培养基培养4h，吸出培养液，测定其中胰岛素含量。吸取每孔中培养液10μL，按照试剂盒说明书使用胰岛素ELISA试剂盒测定各组培养液中胰岛素含量。实验结果如表3所示。

表3.不同药物及组方样品液1-17组对RIN细胞胰岛素分泌量的影响(n=3)，

注：与空白组比较，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01。

实验结果表明：只有格列本脲组及组方样品液1-17组可显著增加RIN细胞胰岛素分泌量（P<0.01），其他组药物均不能增加RIN细胞分泌胰岛素。

试验例4.高糖致HUVEC内皮细胞损伤模型实验

1.实验材料：

细胞株：人脐静脉内皮细胞，（HUVEC，中国药科大学国家新药筛选中心）。

试药：高糖DMEM培养基（批号：914292，Gibco公司）；低糖DMEM培养基（批号：914292，Gibco公司）；胰蛋白酶（Amresco,USA）；胎牛血清（赛默飞世尔公司）；DMSO（Solarbio）；DMSO（南京化学试剂有限公司）；HEPES缓冲盐（sunshine）；阿卡波糖片（拜耳医药保健有限公司，批号：117893）；格列本脲（天津太平洋制药有限公司，批号：120108）；二甲双胍（北京京丰制药有限公司，批号：120915）；羟苯磺酸钙(西安利君制药有限公司，批号：1202023)；和血明目片（西安碑林药业股份有限公司，201205009）。

2.培养基及试剂的配制

PBS和D-Hanks的配制：

称取NaCl8.0g，KCl0.2g，Na₂HPO₄3.49g，KH₂PO₄0.2g，用纯净水溶解，用磁力搅拌器搅拌1h，补加纯净水至1000mL，用酸度计测定其pH为7.4。

低糖DMEM培养基的配制：

取低糖DMEM干粉一包（GIBCO），加纯净水900mL，用电磁搅拌器搅拌是其充分溶解，用纯净水冲洗包装袋内2-3次，冲洗液并入培养基中，搅拌1h。加入NaHCO₃3.7g，充分溶解。最后加入青霉素0.06g，链霉素0.1g，充分溶解。补加纯净水至1000mL，搅拌3h，得到低糖DMEM培养基。

不同浓度高糖DMEM培养基的配制：

11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmol/L高糖DMEM培养基的配制：取低糖培养基100ml，分别加入D-葡萄糖，继续搅拌1h，分别得到葡萄糖浓度为11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmol/L的DMEM培养基。同法配制等渗甘露醇培养基100mL。

MTT溶液的配制：

精密称取50mgMTT置西林瓶中，加入10mLPBS液，纸盒遮光磁力搅拌1小时，使之溶解，4℃保存备用。

胰蛋白酶消化液配制：

称取胰蛋白酶0.25g和EDTA粉末0.01g，置于100ml的烧杯中，量取100ml自制的PBS溶液，磁力搅拌溶解1h。将已经高压湿热灭菌的玻璃瓶，以及0.22μm微孔滤膜紫外消毒30分钟后，使用胰酶微孔滤膜过滤除菌，分装在不同的玻璃瓶中。

3.实验方法

在HUVEC细胞状态较好时使用胰酶消化，将细胞稀释至3×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL。将96孔板置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至90%融合时，换用含1%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养24h使细胞同步化，再换用葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1%FBS的DMEM培养基培养72h，即得到高糖诱导的内皮细胞损伤模型。

3.1HUVEC细胞培养及接板

HUVEC细胞接种于细胞培养瓶中，每瓶加入约12mL含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃含有5%CO₂的培养箱中培养，约每4天一次0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化传代，在细胞状态较好时胰酶消化后接板。

3.2HUVEC细胞分组、造模及给药

培养瓶中HUVEC细胞长至80～90%融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25%的胰蛋白酶消化约1min，倒掉胰酶，加入含10%血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10%胎牛血清的培养基并吹打细胞至均匀，将细胞稀释至3×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200μL。将96孔板置于5%CO₂、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至80-90%融合时，换用含1%胎牛血清的低糖DMEM培养基同步培养24h后将细胞按3.1.3项下分组，每组设5个复孔,按照如下分组加入相应培养基、诱导液及药液后继续培养：空白对照组：加入200μL含1%FBS的低糖DMEM培养基培养；模型对照组：加入200μL葡萄糖浓度为33mmol/L的并含有1%FBS的DMEM培养基；给药组：加入180μL葡萄糖浓度为33mmol/L且含有1%FBS的DMEM培养基，20μL不同待实验药液，各组待实验药液同试验例1。

3.3HUVEC细胞活力的测定

培养72h后，将含药培养液取出，每孔加入低糖DMEM培养基200μL，再加入20μL5mg/mL的MTT，继续培养4h，然后将孔内液体吸除，每孔中加入200μL DMSO并振摇10min，于492nm下检测每孔的吸光值，并记录结果。实验结果如表4所示。

表4.不同药物及组方样品液1-17组对高糖所致内皮细胞损伤的保护作用(n=5)

注：与空白组比较，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01；与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

实验结果表明，组方样品液1-17组、羟苯磺酸钙及和血明目片均可极显著增加HUVEC细胞活力（P<0.01），组方样品液1-17组效果优于和血明目片，与羟苯磺酸钙作用持平。

试验例5糖尿病并发症模型大鼠实验

1实验材料

动物：SD大鼠，雄性，180-220g，190只。

试药：尿链佐菌素（STZ，sigma；批号：S-0130）；消渴丸（广州白云山中一药业有限公司，批号：R01252）；氧化苦参碱（纯度＞98%，南京青泽医药科技开发公司）；知母（产地河北，购于南京先声药店，符合药典规定）；白芍（产地安徽，购于南京先声药店，符合药典规定）；苦参（产地山西，购于南京先声药店，符合药典规定）；化橘红（产地广州，购于南京先声药店，符合药典规定）。

2实验方法

2.1模型的制备、给药周期与给药剂量

本实验采用高糖高脂饲料喂养和注射小剂量STZ的方法制备糖尿病大鼠模型。该模型被广泛认为为近似2型糖尿病模型，与单纯STZ造模的大鼠相比较该模型具有明显的高脂和胰岛素抵抗的特征；与只用高脂饲料制备的2型糖尿病模型相比较该模型的实验周期更短适合研究糖尿病的各种并发症。

该模型的制备方法：一直喂食高糖高脂饲料；在高糖高脂饲料喂养3周后，即第4周起，腹腔注射STZ30mg/kg造模；测定造模大鼠的随机血糖，选取血糖值大于16.7mol/l的大鼠作为糖尿病模型大鼠；第5周起，将糖尿病大鼠按血糖分组，给药，连续给药12周；在给药结束前，糖尿病模型大鼠持续用高糖高脂饲料喂养，共喂食高糖高脂饲料16周。

在190只大鼠中，选取血糖值大于16.7mol/l的大鼠作为糖尿病模型大鼠176只，分为22组，分别为空白对照组、模型对照组、二甲双胍阳性对照组、双胍+羟苯磺酸钙组阳性对照组、消渴丸阳性对照组、组方样品液1-17组。给药剂量空白对照组给予等体积（20mL/kg）的水，模型对照组给予等体积（20mL/kg）的水，二甲双胍阳性对照组给药剂量为0.18g/kg，双胍+羟苯磺酸钙组阳性对照组的盐酸二甲双胍给药剂量为0.18g/kg、羟苯磺酸钙给药剂量为0.15g/kg，消渴丸阳性对照组给药剂量为0.8g/kg，组方样品液1-17组给药剂量均为10g/kg。

2.2给药剂量的确定及药液的配制

空白对照组给予20mL·kg^-1水。模型对照组给予20mL·kg^-1水。

2.2.3消渴丸组样品液的配制

称取研为细粉的消渴丸24g，溶解于600mL凉开水中，超声，得到40mg/mL消渴丸混悬液。大鼠给药体积为20mL/kg；给药剂量为0.8g/kg。

2.2.4二甲双胍组样品液的配制

称取研为细粉的盐酸二甲双胍片5.4g，溶解于600mL凉开水中，超声，得到9mg/mL消渴丸混悬液。大鼠给药体积为20mL/kg；给药剂量为0.18g/kg。

2.2.5二甲双胍+羟苯磺酸钙组样品液的配制

取5.4g二甲双胍粉末和4.5g羟苯环酸钙胶囊粉末，溶解于600mL水中（需长时间超声或用研钵研磨），即得到盐酸二甲双胍水溶液浓度为9.0mg/mL、羟苯磺酸钙溶液浓度为7.5mg/mL。给药体积为20mL/kg；则盐酸二甲双胍给药剂量为0.18g/kg、羟苯磺酸钙给药剂量为0.15g/kg。

2.2.6组方样品液16的配制

按试验例1项下组方16的规定比例量称取组方药物，即称取白芍1500g，知母500g，苦参500g，化橘红500g，放入50L的提取罐中，用60%乙醇回流提取，共提取3次，每次为药材总重10倍量浓度为60%的乙醇，每次提取2h。过滤，合并三次滤液。减压回收乙醇至无醇味，再在水浴上浓缩至小体积，以水定容至6000mL，即得到浓度，0.5g生药/mL的组方样品液1。给药体积为20mL/kg；给药剂量为10g/kg；样品液的浓度为0.5g/mL。

2.2.7组方样品液1-15的配制

按试验例1项下组方1-15的规定比例量称取组方药物，按“组方样品液16的配制方”法配制0.5g生药/mL的组方样品液1-15。给药体积为20mL/kg；给药剂量为10g/kg；样品液的浓度为0.5g/mL。

2.2.8组方样品液17的配制

按试验例1项下组方16的规定比例量称取组方药物，采用水煎法提取组方药物，共提取3次，每次10倍量的水，每次提取2h。过滤，合并三次滤液。在水浴上浓缩至小体积，以水定容至6000mL，即得到浓度为0.5g生药/mL的组方样品液17。给药体积为20mL/kg；给药剂量为10g/kg；样品液的浓度为0.5g/mL。

2.3各种指标检测的方法

2.3.1空腹血糖（FBG）的测定方法

血糖升高是糖尿病最直接的表现。检测方法：每4周测定糖尿病大鼠的血糖，大鼠断尾取血，采用血糖仪和血糖试纸测定血糖。

2.3.2尿量的测定方法

尿量增多是糖尿病的典型临床表现，检测大鼠尿量可以判断药物是否对该症状有改善作用。检测方法：收集大鼠尿液，测量体积，离心后按试剂盒说明书操作即可。

2.3.3空腹胰岛素（FINS）含量测定方法

造模后会导致大鼠的胰岛细胞受损，进而导致胰岛素的分泌降低，通过检测体内胰岛素水平，可以评价药物是否具有促进胰岛素分泌的作用。检测方法：实验结束后，取血，离心得到血清，按照试剂盒说明书操作即可。

2.3.4稳态胰岛素抵抗系数（HOMA-IR）的计算方法

HOMA-IR用于评价胰岛素的抵抗水平。检测方法：HOMA-IR=空腹血糖水平（FPG，mmol/L）×空腹胰岛素水平（FINS，μU/L）÷22.5。

2.3.524h尿蛋白的测定方法

尿蛋白是肾脏疾病最主要的临床表现。检测方法：将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，测量体积，离心，取上清液，按试剂盒说明测定尿液中蛋白含量。

2.3.624h尿白蛋白测定方法

尿白蛋白是肾脏疾病最主要的临床表现，相比尿蛋白其更加敏感，在糖尿病肾病早期即可以检测到。检测方法：将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，测量体积，离心，取上清液，按试剂盒说明测定尿液中蛋白含量。

2.3.7血清肌酐和肌酐清除率测定方法

肌酐是肾脏疾病最主要的临床表现之一。检测方法：将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，测量体积，离心，取上清液，按试剂盒说明测定尿液中肌酐含量；在给药结束后，取血，离心得到血清，按试剂盒说明测定血清中肌酐的含量。

肌酐清除率=尿液肌酐含量×24h尿量÷血肌酐含量

2.3.8尿素氮（血/尿）测定方法

肌酐是肾脏疾病最主要的临床表现之一。检测方法：将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，测量体积，离心，取上清液，按试剂盒说明测定尿液中肌酐含量；在给药结束后，取血，离心得到血清，按试剂盒说明测定血清中肌酐的含量。

2.3.9肾脏系数的测定方法

糖尿病肾病大鼠会发生肾脏肥大。检测方法：将大鼠处死后，取肾脏，称重。肾脏系数=肾重÷体重。

2.3.10糖基化终末产物(AGE)测定方法

AGE可以诱导TGF-β1的过度激活并增加活性氧集团，导致糖尿病肾病的发生。检测方法：给药结束后，取大鼠肾脏，分离出皮质部，匀浆，根据试剂盒说明测定。

2.3.11SOD抗氧化指标测定方法

氧化应激是糖尿病发生的重要机制，也是治疗DN途径之一，通过测定肾脏中SOD、MDA、CAT、MPO和GSH-Px可以判断药物是否通过抑制氧化应激发挥治疗DN的作用检测方法：给药结束后，取大鼠肾脏，分离出皮质部，匀浆，根据试剂盒说明测定上述指标。

3实验结果

3.1血糖值的测定结果

大鼠给药前和连续给药12周过程中血糖值变化如下表所示。

表5组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠血糖值的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表5所示，给药前各给药组血糖值与模型组血糖值一致，给药后各给药组的血糖值持续低于模型对照组。组方样品液1-17组的血糖在给药第4周给药第8周和给药第12周均显著性低于模型对照组，组方样品液1-17组的降糖作用弱于二甲双胍组，强于消渴丸组和二甲双胍+羟苯磺酸钙组。

3.2血清胰岛素含量的测定结果

实验结束时，通过ELISA法测定了各组大鼠的胰岛素含量，结果如表6所示。

表6组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠胰岛素含量的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表6可知，模型组大鼠的胰岛素含量显著低于空白对照组；组方样品液1-17组的胰岛素含量显著地高于模型对照组，说明组方样品液1-17组显著性够促进胰岛素的分泌。在促进胰岛素分泌方面，组方样品液1-17组优于二甲双胍组、消渴丸组和二甲双胍+羟苯磺酸钙组。

3.3胰岛素敏感性指标HOMA-IR的计算结果

本实验以胰岛素抵抗系数HOMA-IR值来评价胰岛素的敏感性，HOMA-IR值越大说明胰岛素敏感性越低。结果见表7。

表7组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠HOMA-IR的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表7可知，模型组的HOMA-IR值显著高于空白对照组，说明模型组存在着明显的胰岛素抵抗；三个阳性药组、组方样品液1-17组的HOMA-IR显著地低于模型对照组，显示组方样品液1-17组能够增加胰岛素的敏感性，但组方样品液1-17组的增敏作用弱于二甲双胍组，优于消渴丸组和二甲双胍+羟苯磺酸钙组。

3.4尿量和尿糖量测定的结果

药物对大鼠尿量和尿糖的影响如表8所示。

表8组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠尿量和尿糖的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表8可知，模型对照组的尿糖和尿量显著性地高于正常对照组；组方样品液1-17组的尿糖和尿量显著地低于模型对照组，作用与二甲双胍相当，优于优于消渴丸组和二甲双胍+羟苯磺酸钙组。

3.5尿蛋白和尿白蛋白的测定结果

尿蛋白和尿白蛋白分泌增加是判断肾病的主要指标。按照如下公式计算24h尿蛋白和尿白蛋白的排泄量。

24h尿蛋白排泄量=尿蛋白浓度×24h尿量；

24h尿白蛋白排泄量=尿白蛋白浓度×24h尿量；

表9组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠尿量和尿糖的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表9可知，模型对照组的尿蛋白和尿白蛋白显著地高于正常对照组，说明模型组大鼠形成了糖尿病肾病；组方样品液1-17组的尿蛋白和尿白蛋白显著地低于模型对照组，说明组方样品液1-17组具有显著性治疗糖尿病肾病的作用；组方样品液1-17组治疗糖尿病肾病的作用优于二甲双胍组、消渴丸组和二甲双胍+羟苯磺酸钙组。

3.6肾脏系数测定结果

肾功能的降低会导致肾脏代偿性的增大，肾脏的纤维化也会导致肾脏重量增加，肾脏系是肾损伤的重要指标。

表10组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠肾脏重量的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表10可知，模型对照组的肾脏重量显著地高于正常对照组；组方样品液1-17组的肾脏重量低于模型对照组，且具有显著性差异，组方样品液1-17组的作用略好于各阳性对照组。

3.7血清尿素氮（BUN）和尿液尿素氮的测定结果

肾脏损伤会导致体内的BUN生成增加，本实验考察了药物对糖尿病大鼠体内BUN含量和尿液尿素氮排泄量的的影响。

表11组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠BUN含量和尿液中尿素氮的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表11可知，模型对照组的血清尿素氮、尿液尿素氮显著性地高于正常对照组；组方样品液1-17组的血清尿素氮、尿液尿素氮显著低于模型对照组；组方样品液1-17组在降低血清尿素氮、尿液尿素氮方面的作用优于双胍+磺酸钙组；而另外2组阳性对照组二甲双胍组、羟苯磺酸钙组没有降低血清尿素氮、尿液尿素氮的作用。

3.8血清Cr和肌酐清除率（CCr）的测定结果

血清Cr和肌酐清除率可以评价肾脏损伤的程度，肾损伤越严重血清Cr的含量越高，肾脏肌酐酐清除越低。

肌酐清除率=尿肌酐含量×每分钟尿量÷血清肌酐含量

表12组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠血清CR和肌酐清除率的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表12可知，模型对照组的血清肌酐显著地高于正常对照组，对肌酐清除率显著地低于正常对照组；组方样品液1-17组的血清肌酐量显著低于模型对照组，对肌酐清除率显著地高于模型对照组；双胍+磺酸钙组有降低血清肌酐量的作用，有升高肌酐清除率的作用，但作用均低于组方样品液1-17组；阳性对照组二甲双胍组、消渴丸组不具有降低血清肌酐量、升高肌酐清除率的作用。

3.9糖基化终末产物（AGEs）的测定结果

AGEs能够激活TGF-β1和增加ROS而导致糖尿病肾病，高血糖会导致体内AGEs增加。有效的降低AGEs的含量，可以治疗糖尿病肾病。

表13组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠糖基化终末产物（AGEs）的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表13可知，模型对照组的AGEs显著地高于正常对照组；而组方样品液1-17组、双胍+磺酸钙组的AGEs显著低于模型对照组；阳性对照组二甲双胍组、消渴丸组不具有降低AGEs的作用。

3.10抗氧化指标SOD测定结果

抗氧化是药物治疗糖尿病并发症的途径之一，本实验考察了药物对SOD的影响。

表14组方样品液1-17组与各阳性对照组对模型大鼠SOD的影响结果

注：与空白对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

由表14可知，模型组大鼠的SOD均显著降低；而组方样品液1-17组的SOD显著高于模型对照组；各阳性对照组均无升高SOD的作用。

5结论

上述实验结果显示：组方样品液1-17组具有降糖和治疗糖尿病肾病的作用。在降血糖方面该复方优于消渴丸；在治疗糖尿病肾病方面该复方优于消渴丸、二甲双胍以及二甲双胍和羟苯磺酸钙同时给药的药效。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。

实施例1

白芍1重量份、知母2重量份、苦参3重量份、化橘红1重量份。

制备方法：称取白芍，知母，苦参，化橘红用浓度60%的乙醇加热回流提取三次，每次提取2、2、1.5小时，每次用乙醇的量分别为药材的12、10、8倍重量，滤过，合并3次滤液，减压回收乙醇，浓缩。

实施例2

白芍2重量份、知母3重量份、苦参1重量份、化橘红1重量份。制备方法同实施例1。

实施例3

白芍3重量份、知母1重量份、苦参2重量份、化橘红1重量份。制备方法同实施例1。

实施例4

白芍1重量份、知母2重量份、苦参3重量份、化橘红2重量份。制备方法同实施例1。

实施例5

白芍2重量份、知母3重量份、苦参1重量份、化橘红2重量份。制备方法同实施例1。

实施例6

白芍3重量份、知母1重量份、苦参2重量份、化橘红2重量份。制备方法同实施例1。

实施例7

白芍1重量份、知母2重量份、苦参3重量份、化橘红3重量份。制备方法同实施例1。

实施例8

白芍2重量份、知母3重量份、苦参1重量份、化橘红3重量份。制备方法同实施例1。

实施例9

白芍3重量份、知母1重量份、苦参2重量份、化橘红3重量份。制备方法同实施例1。

实施例10

白芍1重量份、知母1重量份、苦参1重量份、化橘红1重量份。制备方法同实施例1。

实施例11

白芍1重量份、知母1重量份、苦参1重量份、化橘红2重量份。制备方法同实施例1。

实施例12

白芍1重量份、知母1重量份、苦参1重量份、化橘红3重量份。制备方法同实施例1。

实施例13

白芍2重量份、知母2重量份、苦参2重量份、化橘红1重量份。制备方法同实施例1。

得到的药液加入常规药学可接受的辅料按照常规方法制成胶囊剂。

实施例14

白芍2重量份、知母2重量份、苦参2重量份、化橘红3重量份。制备方法同实施例1。

得到的药液加入常规药学可接受的辅料按照常规方法制成颗粒剂。

实施例15

白芍3重量份、知母3重量份、苦参3重量份、化橘红2重量份。制备方法同实施例1。

得到的药液加入常规药学可接受的辅料压制成片剂。

实施例16

白芍3重量份、知母3重量份、苦参3重量份、化橘红1重量份。制备方法同实施例1。

得到的药液加入常规辅料按照常规方法制成丸剂。

实施例17

白芍3重量份、知母3重量份、苦参3重量份、化橘红1重量份。

制备方法：按照上述比例称取白芍，知母，苦参，化橘红，用水加热提取三次，每次提取1、1、0.5小时，每次用水的量分别为药材的12、10、8倍重量。滤过，合并3次滤液，浓缩。

Claims (5)

1.一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物在制备具有抑制α糖苷酶、显著增加RIN细胞胰岛素分泌量、修复高微血管内皮损伤作用的药物中的用途，其中，该组合物由以下重量份的组分制成：

白芍1-3份、知母1-3份、苦参1-3份、化橘红1-3份；

该组合物是通过以下步骤制备得到的：称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量浓度为10%-90%的乙醇加热回流提取1-3次，每次提取1-3小时，过滤，合并滤液，浓缩；

或者称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量水，加热提取1-3次，每次提取0.5-1小时，过滤，合并滤液，浓缩。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成：

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红1份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红1份；

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红2份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红2份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红2份；

白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红3份；

白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红3份；

白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红3份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红1份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红2份；

白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红3份；

白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红1份；

白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红3份；

白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红2份；

或白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红1份。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成：白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份。

4.根据权利要求1、2或3 所述的用途，其特征在于所述的组合物与药学上可接受的载体制成制剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的制剂为口服液、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或注射剂。