CN110772563B - 一种苞叶大黄提取物的制备方法和其在制备抗2型糖尿病产品中的应用 - Google Patents

一种苞叶大黄提取物的制备方法和其在制备抗2型糖尿病产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苞叶大黄提取物的制备方法和其作为活性成分在制备抗2型糖尿病产品中的应用。所述的苞叶大黄提取物的制备方法，是以干燥的苞叶大黄植物的根、茎为原料，经渗漉提取、浸膏浓缩、加水溶解过滤、干燥分离而得来。以通过上述制备方法获得的提取物在随后药效试验中显示出显著的功效，在作为制备治疗2型糖尿病药物或保健食品中方面有广泛的用途。

Description

一种苞叶大黄提取物的制备方法和其在制备抗2型糖尿病产 品中的应用
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及苞叶大黄提取物的制备方法及其在制备抗2型糖尿病产品中的应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌系统疾病，是由于体内的一种激素——胰岛素的绝对缺乏或相对不足，或是该物质本身质量及其他原因造成不能发挥正常生理作用，而引起的以糖代谢为主的糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢混乱的一种综合病症，以高血糖为特征。糖尿病分为四型：即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病。其中2型糖尿病患者（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）约占糖尿病人数90%。2型糖尿病（T2DM）是遗传和环境因素共同作用的结果，以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足，也叫成人发病型糖尿病，多在35-40岁之后发病。
我国糖尿病治疗药物主要有口服降糖化学药、胰岛素、中药三大类。其中口服降糖化药概括起来主要有：(1)磺酰脲类：主要通过促进胰岛素分泌而发挥作用，抑制ATP依赖性钾通道，使K+ 外流，β细胞去极化，Ca2+ 内流，诱发胰岛素分泌。此类药物还可加强胰岛素与受体结合，解除受体后胰岛素抵抗的作用，使胰岛素作用加强。常用的药物有：格列吡嗪，格列本脲，格列齐特，格列美脲，格列波脲等。(2)双胍类：本类药物不刺激胰岛素β细胞，对正常人几乎无作用，而对糖尿病人降血糖作用明显。不影响胰岛素分泌，通过促进外周组织摄取葡萄糖，抑制葡萄糖异生，降低肝糖原输出，延迟葡萄糖在肠道吸收。常用药物有：二甲双胍。(3) α糖苷酶抑制剂：竞争性抑制麦芽糖酶、葡萄糖淀粉酶及蔗糖酶，阻断1,4-糖苷键水解，延缓淀粉、蔗糖及麦芽糖在小肠分解为葡萄糖，降低餐后血糖。常用药物有：阿卡波糖，伏格列波糖。(4) 胰岛素增敏剂：通过提高靶组织对胰岛素的敏感性，提高利用胰岛素的能力，改善糖代谢及脂质代谢，能有限降低空腹及餐后血糖，单独使用不引起低血糖，常与其它类口服降糖药合用，产生明显的协同作用。常用药物有：罗格列酮，瑞格列奈。(5) 非磺酰脲类促胰岛素分泌剂：对胰岛素的分泌有促进作用，其作用机制与磺酰脲类药物类似，但该类药物与磺酰脲受体结合与分离均更快，因此能改善胰岛素早时相分泌，减轻胰岛β细胞负担。常用药物有：瑞格列奈。胰岛素类药物包括：普通胰岛素、基因工程胰岛素、低精蛋白锌人胰岛素、中性可溶性人胰岛素、双时相低精蛋白锌人胰岛素、门冬胰岛素等。中药糖尿病的治疗中处于辅助治疗的地位，主要改善患者临床症状，控制糖尿病慢性并发症以及辅助降血糖作用明确，常用的单味中药有地黄、桑白皮、人参、知母、黄连等，中成药有玉泉丸、消渴丸，参芪降糖片等。
由于我国糖尿病用药市场规模逐年大幅度扩容，具有抗糖尿病活性的植物资源也受到了广泛关注。苞叶大黄（Rheum alexandrae Batalin）又称水黄、大苞大黄，为廖科（Polygonaceae）大黄属（Rheum L.）植物，主产于西藏东部、四川西部及云南西北部，生于海拔3000-4500米山坡草地，常长在较潮湿处。据考证，苞叶大黄为藏药曲玛孜的基源植物之一。曲玛孜用药历史悠久，藏医经典著作《四部医典》记载:“曲玛 孜消黄水及水肿”。《晶珠本草》载:“本品解烦渴，泻黄水、恶性腹水病，内服后，服任何泻药均不吐”。《新修晶珠本草》及《中华藏本草》载本品:“清热、 消渴、除烦、泻黄水和恶性腹水。治黄水病，恶性腹水，心热烦躁，口干舌燥” 的功效。《中华本草·藏药卷》记载本品:“味酸，苦，消化后味酸，性温。消肾水肿，引黄水，治培根病”。现代研究结果显示，苞叶大黄提取物有一定的泻下、镇痛、抗菌作用及抗HIV-1病毒活性[5]作用。迄今为止，尚未见苞叶大黄提取物具有降血糖活性的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种苞叶大黄提取物的制备方法；本发明的目的在之二是提供所述苞叶大黄提取物在制备抗2型糖尿病产品中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了苞叶大黄提取物的制备方法，包括如下步骤：
A步骤：苞叶大黄植物根或根茎进行净制，粉碎后过筛，获得苞叶大黄粉；
B步骤：向步骤A获得的苞叶大黄粉（重量为W）中加入乙醇浸泡12小时，渗漉提取，滤液浓缩得浸膏。
C步骤：B步骤所得浸膏，以水为溶剂加热溶解，过滤，室温静置，抽滤，得到沉淀，干燥，即得所述苞叶大黄提取物。
优选地，A步骤所述净制后进行干燥。
优选地，A步骤所述过筛为过60目筛。
优选地，B步骤所述乙醇为10%-90%乙醇水溶液(体积为V)，加入量为药材重量的8-15倍(即V:W=8-15)。
优选地，B步骤所述渗漉速度为0.5-3L/小时。
本发明还提供了以上任一所述制备方法制得的苞叶大黄提取物在制备抗2型糖尿病产品中的用途。
本发明苞叶大黄提取物在药效试验中显示出显著的功效，其作为活性成分应用于制备治疗2型糖尿病产品中具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种苞叶大黄提取物的制备方法，该方法按照如下步骤进行：
A步骤：以干燥的苞叶大黄植物根或根茎为原料，经净制，粉碎，过60目筛，得苞叶大黄粉；
B步骤：向获得的苞叶大黄粉中加入重量比8倍量70%乙醇，搅拌至无气泡，室温（20℃）浸泡12小时后，以2L/小时流速渗漉，合并渗漉液，过滤，真空减压浓缩至稠膏状。
C步骤：所得浸膏，趁热加入重量比1倍量的纯净水，60℃水浴加热至全溶，趁热过滤，滤液室温（20℃）静置12小时，出现大量水不溶物，抽滤，100 mL纯净水洗涤，继续抽滤10分钟，抽干不溶物于真空干燥18小时，即得苞叶大黄提取物。
实施例2：
本实施与实施例1的区别在于：B步骤是向获得的苞叶大黄粉中加入重量比15倍量的10%乙醇浸泡，以0.5L/小时流速渗漉；C步骤是加入重量比1.5倍量的纯净水，滤液室温（30℃）静置10小时。
实施例3：
本实施与实施例1的区别在于：B步骤是向获得的苞叶大黄粉中加入重量比10倍量的90%乙醇浸泡，以3L/小时流速渗漉；C步骤是加入重量比1.2倍量的纯净水，滤液室温（25℃）静置24小时。
实施例4
以实施例1~3所制备的任一苞叶大黄提取物进行对胰岛素抵抗HepG-2细胞的影响实验。
1．实验材料
HepG-2细胞(人肝癌细胞)，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库;高糖 DMEM培养基及胎牛血清：美国 Gibco 公司；胰蛋白酶：北京索来宝科技有限公司；牛胰岛素(bovine insulin, INS): 美国 Sigma 公司；青霉素和链霉素的混合液：美国Hyclone公司；盐酸二甲双胍 ：中美上海施贵宝制药有限公司;葡萄糖试剂盒 (GLU): 南京建成生物研究所(批号: F006)；Mutil-Scan GO 型酶标仪：美国 Thermo 公司; 3111型二氧化碳培养箱：美国 ThermoForma 公司； 超净工作台：珠海造鑫仪器有限公司；万分之一分析天平：德国赛多利斯公司；高速台式冷冻离心机：德国 Eppendorf 公司；细胞培养瓶及96孔细胞培养板：美国 Corning 公司；全自动高压灭菌锅: TOMY SX-50。
2．实验方法
2.1 MTT细胞存活实验
常规细胞复苏，将对数生长期的HepG-2细胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后用10%胎牛血清的 DMEM 完全培养液制成细胞悬液，将细胞稀释至 5.0×104/ml，再将其接种至96孔培养板中, 每孔198 μL，于37℃、5% CO2的培养箱内培养，待细胞完全贴壁后，各实验组每孔加入含不同浓度(10-4、10-5、10-6 mol/L)药物（实施例1所述苞叶大黄提取物）。阴性对照组加入含等体积药物溶剂的 DMEM 培养液200 μL。另单设不含细胞的DMEM 培养液200 μL 为空白对照组。每一个浓度设10个平行孔，培养24 h后各孔分别加入5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，再培养4 h后，倾去各孔培养液，分别加入200 μL DMSO，震荡10 min 后用酶标仪在570 nm 波长处测定各孔吸收度 (OD) 值。用以下公式计算各个浓度药物的细胞存活率。实验结果见表1。
HepG-2细胞的存活率计算： 存活率 (%)=(OD实验/ OD对照)×100%
2.2. HepG2细胞株胰岛素抵抗（IR）模型的建立
常规细胞复苏，培养于含有10% FBS的DEME培养液中, 置37℃, 5% CO2饱和湿度下培养。隔天换一次培养液。每天观察细胞生长情况，细胞融合80%后进行实验。取对数生长期的HepG-2细胞细胞计数后以每孔1×105个细胞的密度接种于96孔培养板中，更换无血清培养液，将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2饱和湿度下培养8h，使其形成单层贴壁细胞，后弃去培养液，用不含血清的DMEM洗涤细胞2次。加入含有或不含有5×10-7 mol/L的胰岛素于37℃、5% CO2饱和湿度下培养36 h，建立细胞株高胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型。
2.3 苞叶大黄提取物对IR模型的作用研究
取对数生长期的HepG-2细胞细胞计数后以每孔1×105个细胞的密度接种于96孔培养板中，将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞长至贴壁，换上含5×10-7 mol/L 胰岛素的无血清培养液（培养液含25.6 mol/L葡萄糖），37℃，5% CO2条件下孵育36 h，细胞即为IR细胞。造模成功后，将细胞分为正常对照组（不含药物和胰岛素），模型组（含5×10-7 mol/L 胰岛素, 阳性药组:高剂量（含1×10-3 mol/L二甲双胍），低剂量（含5×10-4 mol/L二甲双胍）；不同浓度药物（药物为实施例1所述苞叶大黄提取物）组：高剂量（含1×10-4 mol/L药物）, 中剂量（含1×10-5 mol/L药物），低剂量（含1×10-6 mol/L药物）。根据MTT细胞比色结果，选取合适的剂量进行降糖活性筛选。每组设置四个复孔, 分别作用12小时和24小时, 用葡萄糖氧化酶试剂盒检测细胞培养上清的葡萄糖含量。实验结果见表2。
2.4数据统计
汇总数据，实验数据采用均数±标准差（
Figure 811318DEST_PATH_IMAGE001
）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。使用GraphPad Prism 5进行统计分析。
3．实验结果
3.1 四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞存活实验
表1 苞叶大黄提取物对HepG-2细胞存活率的影响(
Figure 96805DEST_PATH_IMAGE002
, n=10)
Figure DEST_PATH_IMAGE003
*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001与相同时间模型组组相比；n=10
结果如表1所示，与正常组相比，苞叶大黄提取物在低(1×10-6 mol/L)、中剂量(1×10-5 mol/L)和高剂量(1×10-4 mol/L)能促进细胞的增值，但各剂量组之间没有显著性差异。该结果显示苞叶大黄提取物对细胞无毒。
3.2各给药组作用于IR模型后细胞上清液中葡萄糖消耗量的变化
表2 各给药组作用于IR细胞模型后葡萄糖消耗量的变化(x±s)
Figure 866441DEST_PATH_IMAGE004
模型组与相同时间对照组相比
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；n=10
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001；n=10
表2显示，与正常组比较，经过高胰岛素作用后，模型组细胞的葡萄糖消耗量显著降低，造模成功。加药物作用12小时和24小时后，与模型组相比，阳性药物各剂量组(5×10-4、1×10-3mol/L)、苞叶大黄提取物中(1×10-5mol/L)、高剂量组(1×10-4 mol/L)显著增加了细胞对葡萄糖消耗的消耗量。其中苞叶大黄提取物中剂量组与阳性对照药活性相当，高剂量组活性优于阳性对照。提示苞叶大黄能够促进胰岛素抵抗HepG-2细胞对葡萄糖的消耗，在2型糖尿病的治疗中具有潜在的应用价值。
3.3 小结
胰岛素抵抗是指机体靶组织对胰岛素的反应性低于正常的一种病理生理状态，是包括2型糖尿病、高血压病、肥胖等常见临床疾病在内的共同危险因素。胰岛素抵抗的细胞模型，便于观察药物对胰岛素抵抗的直接影响，特别方便于筛选改善胰岛素抵抗的药物。
本研究用5×10-7 mol·L-1胰岛素浓度作用HepG-2细胞36 h, 细胞对葡萄糖消耗量显著降低，造模成功。与模型组相比，加苞叶大黄提取物处理12小时和24小时后，其中、高剂量组(1×10-5mol/L、1×10-4 mol/L)显著增加细胞对葡萄糖消耗的消耗量。实验结果表明拉萨大黄提取物能够改善HepG-2细胞的胰岛素抵抗状态,促进葡萄糖的摄取；具有开发应用的潜力。
实施例5:
以实施例1~3所制备的任一苞叶大黄提取物进行对db/db糖尿病小鼠的影响实验
1．实验材料
db/db小鼠（清洁级，7周龄），C57 BL/6小鼠（清洁级，7周龄）：常州卡文斯实验动物有限公司; 盐酸二甲双胍：中美上海施贵宝制药有限公司；葡萄糖试剂盒 (GLU): 南京建成生物研究所(批号: F006)；苞叶大黄提取物：实施例1所述提取物。血脂诊断试剂盒：威特曼生物科技（南京）有限公司。胰岛素试剂盒：上海贤绵生物科技有限公司。
Mutil-Scan GO 型酶标仪：美国 Thermo 公司; 万分之一分析天平：德国赛多利斯公司；高速台式冷冻离心机：德国 Eppendorf 公司；全自动高压灭菌锅: TOMY SX-500；生化分析仪（济南格利特科技有限公司）。
2．实验方法
2.1 动物分组及给药
db/db小鼠适应饲养 1周，禁食16h测定空腹血糖，选择空腹血糖高于11.0 mmol/L的动物随机分为以下5组，（1）db/db小鼠模型组；（2）-（4）组分别为苞叶大黄低剂量、中剂量组、高剂量组。每组8只。 另外8只C57 BL/6小鼠为正常对照组（5）。
每组每日定时灌胃给药，给药体积为0.01mL/g，连续给药8周。 分组及给药剂量如下：（1）db/db模型组，0.01mL/g生理盐水；(2)苞叶大黄提取物低剂量，50mg/kg；（3）苞叶大黄提取物中剂量组，150mg/kg；（4）苞叶大黄提取物高剂量组，300mg/kg；（5）正常对照，0.01mL/g生理盐水。以上给药均每日一次，各组小鼠均给予标准饲料喂养，自由饮水。
2.2标本采集及指标检测
小鼠每周称重1次，小鼠每2周眼眶采血（0, 2, 4, 6, 8周），测定空腹血糖1次；于给药第8周，小鼠禁食过夜，末次给药12h后，采血液，进行胰岛素(Ins)、总胆固醇（TC），三酰甘油(TG)的测定。
2.3 数据统计 统计学方法
所得资料运用SPSS18.0 统计软件进行处理，各组数据以均数±标准差（
Figure 920984DEST_PATH_IMAGE006
）表示，两组比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，Ｐ< 0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 苞叶大黄提取物对小鼠体重的影响
实验期间各组小鼠体重变化结果如表3所示。正常小鼠体重为20-40g，db/db小鼠体重增加明显，为50-70g，苞叶大黄中高剂量组自给药第四周可显著降低db/db小鼠的体重，改善肥胖症状。
表3 苞叶大黄提取物对db/db小鼠体重影响 (g,
Figure 881987DEST_PATH_IMAGE006
, n=8)
Figure 858033DEST_PATH_IMAGE007
模型组与相同时间对照组相比
Figure 929894DEST_PATH_IMAGE008
；n=8
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001；n=8
3.2 苞叶大黄提取物对db/db小鼠空腹血糖的影响
给药4周后，苞叶大黄提取物中、高剂量组对db/db小鼠空腹血糖有显著的降低作用，其中高剂量组降糖作用较强。
表4 苞叶大黄提取物对db/db小鼠空腹血糖比较 (g,
Figure 307786DEST_PATH_IMAGE009
, n=8)
Figure 174111DEST_PATH_IMAGE010
模型组与相同时间对照组相比
Figure 699770DEST_PATH_IMAGE011
；n=8
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，** P<0.01；n=8
3.3 苞叶大黄提取物对db/db小鼠胰岛素及血脂的影响
如表5所示，与对照组相比，db/db模型组小鼠血清胰岛素及总胆固醇、总甘油三酯浓度显著升高。与模型组对照，苞叶大黄提取物低、中、高剂量组均能显著降低db/db小鼠血清胰岛素及总胆固醇、总甘油三酯浓度。
表5苞叶大黄提取物对db/db小鼠血清胰岛素、血脂的影响 (g, x±s, n=8)
Figure 513005DEST_PATH_IMAGE012
模型组与相同时间对照组相比
Figure 542141DEST_PATH_IMAGE013
；n=8
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，** P<0.01；n=8
3.4小结
本次实验选用的db/db小鼠为遗传性肥胖型2型糖尿病动物模型，其糖尿病病程与人极为相似，是研究2型糖尿病的理想动物模型。本研究观察了不同剂量苞叶大黄提取物对8周龄db/db小鼠体重、空腹血糖、胰岛素、血总胆固醇和甘油三酯的影响，发现苞叶大黄提取物中高剂量组(150、300 mg/kg)自给药第四周可显著降低db/db小鼠的体重，改善肥胖症状；给药4周后，苞叶大黄提取物中、高剂量组对db/db小鼠空腹血糖有显著的降低作用，其中高剂量组降糖作用较强。苞叶大黄提取物低、中、高剂量组均能显著降低db/db小鼠血清胰岛素及总胆固醇、总甘油三酯浓度。 综合来看，红芪多糖对8周龄的db/db小鼠血糖、血脂有调节作用，2型糖尿病常伴随脂质代谢紊乱症状。现代医学研究研究表明高血脂可引起胰岛β细胞脂质过氧化，损害β细胞功能何胰岛素抵抗，是导致糖尿病发生发展的重要诱因。因此调节体内脂质代谢对糖尿病的防治具有重要意义。本研究中苞叶大黄提取物能显著降低db/db小鼠血清TC,TG浓度，显示了良好的降脂作用，同时显著降低db/db小鼠血清胰岛素浓度，改善胰岛素抵抗作用，提示苞叶大黄提取物具有开发为新型口服降糖药物的价值。

Claims (4)

1.一种具有降血糖血脂活性的苞叶大黄提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A步骤：苞叶大黄植物根或根茎进行净制，粉碎后过筛，获得苞叶大黄粉；
B步骤：向步骤A获得的苞叶大黄粉中加入8-15倍苞叶大黄粉重量的10％-90％的乙醇浸泡12小时，以0.5-3L/小时的速率进行渗漉提取，滤液浓缩得浸膏；
C步骤：B步骤所得浸膏，以水为溶剂加热溶解，过滤，室温静置，抽滤，得到沉淀，在不超过40℃温度下进行干燥，即得所述苞叶大黄提取物；其中，加入水量按溶液体积：苞叶大黄粉末重量为1-1.5：1加入，静置时间为10-24小时。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于A步骤所述净制后进行干燥。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于A步骤所述过筛为过60目筛。
4.一种权利要求1-3任一所述制备方法制得的苞叶大黄提取物在制备治疗抗2型糖尿病药物中的应用。
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