CN114010668A - 小花青藤提取物的制备方法及其在制备抗t2dm产品中的应用 - Google Patents

小花青藤提取物的制备方法及其在制备抗t2dm产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了小花青藤提取物在制备抗T2DM产品中的应用，所述小花青藤提取物直接作为抗T2DM产品或者作为组分添加于抗T2DM产品中；所述小花青藤提取物可制成丸剂、片剂、散剂、胶囊、注射剂或者作为组分添加于抗T2DM产品中制成丸剂、片剂、散剂、胶囊、注射剂。本发明还公开了小花青藤提取物的制备方法，包括粉碎过筛的步骤、浸提的步骤和纯化的步骤。本发明首次发现并证实了小花青藤提取物具有显著的降低血糖活性的效果，该发现对于扩充糖尿病用药储备具有显著的积极意义；小花青藤在西南地区有大量分布，其来源广泛、可靠，由其制成的抗T2DM产品原料充足，可大幅降低T2DM患者的医疗成本。

Description

小花青藤提取物的制备方法及其在制备抗T2DM产品中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及小花青藤提取物的制备方法 及其在制备抗T2DM产品中的应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌系统疾病，是 由于体内的一种激素——胰岛素的绝对缺乏或相对不足，或是该物质 本身质量及其他原因造成不能发挥正常生理作用，而引起的以糖代谢 为主的糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢混乱的一种综合病症，以高 血糖为特征。糖尿病分为四型：即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖 尿病和特殊类型糖尿病。其中2型糖尿病患者(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)约占糖尿病人数90％。2型糖尿病(T2DM)是遗 传和环境因素共同作用的结果，以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不 足，多在35-40岁之后发病。
当前治疗糖尿病的药物按其作用机制可以分为(1)胰岛素及胰岛 素类似物；(2)胰岛素促分泌药物(磺脲类药物：格列苯脲、格列美脲； 非磺脲类：瑞格列奈)；(3)胰岛素增敏剂(二甲双胍类；罗格列酮，吡 格列酮等噻唑烷二酮类等)；(4)醛糖还原酶抑制剂(如托瑞司他等)； (5)α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖，米格列醇和伏格列波糖)，阿卡波 糖是复杂的低聚糖，其结构类似寡糖，这种非寡糖的“假寡糖”可在小 肠上部细胞刷状缘处和寡糖竞争而与α-葡萄糖苷酶可逆地结合，抑制 各种α-葡萄糖苷酶如麦芽糖酶、异麦芽糖酶、葡萄糖淀粉酶及蔗糖酶 的活性，使淀粉分解成寡糖如麦芽糖(双糖)、麦芽三糖及糊精(低聚糖) 进而分解成葡萄糖的速度减慢，使蔗糖分解成葡萄糖和果糖的速度减 慢，因此造成肠道葡萄糖的吸收减缓，从而缓解餐后高血糖，达到降 低血糖的作用。长期服用，可降低空腹血糖和糖化血红蛋白的浓度。 此类药物能延缓碳水化合物的吸收，降低餐后血糖水平。
由于我国糖尿病用药市场规模逐年大幅度扩容，具有抗糖尿病活 性的植物资源也受到了广泛关注。西南地区中草药的盛产区，其中， 小花青藤(Illigera parviflora)主产云南、贵州、广西等省区，生长于海 拔350-1400米山地密林、疏林或灌丛中。其根在民间做药用，有驱 风除湿之效，用于治疗风湿骨痛[27]。前期研究结果显示，小花青藤 提取物有一定的抗炎作用，迄今为止，尚未见小花青藤提取物具有降 血糖活性的报道。
发明内容
本发明通过实验研究首次发现并证实了小花青藤提取物具有显 著的降低血糖活性的效果，而小花青藤在西南地区分布广泛，来源稳 定、可靠，将其应用于直接作为抗T2DM的产品或者添加至抗T2DM 的产品中将会大幅降低T2DM的治疗成本，降低T2DM患者的医疗负担。
本发明通过以下技术方案实现的：
小花青藤提取物在制备抗T2DM产品中的应用，所述小花青藤 提取物直接作为抗T2DM产品或者作为组分添加于抗T2DM产品中。
进一步的，所述小花青藤提取物可制成丸剂、片剂、散剂、胶囊、 注射剂或者作为组分添加于抗T2DM产品中制成丸剂、片剂、散剂、 胶囊、注射剂。
同时，本发明还提供了小花青藤提取物的制备方法，包括以下步 骤：
S1、粉碎过筛：将小花青藤植物根或者根茎净制、粉碎、过筛， 获得小花青藤粉；
S2、浸提：向步骤S1中获得的小花青藤粉(重量为W)中加入 乙醇，浸泡24小时，渗漉提取，滤液浓缩得浸膏；
S3、纯化：向步骤S2中获得的浸膏加入乙醇为溶剂，加热溶解、 过滤，室温静置、抽滤，得到沉淀物，对沉淀物进行干燥，得到小花 青藤提取物。
进一步的，在所述步骤S1净制后应进行干燥处理。
进一步的，所述步骤S1中过筛选用60目筛。
进一步的，所述步骤S2中，乙醇为15％-95％乙醇水溶液(体积为 V)，加入量为药材重量的6-15倍(即V:W＝6-15)。
进一步的，所述步骤S2中，渗漉的速度为0.3-3.0L/小时。
本发明的有益效果如下：
1、本发明首次发现并证实了小花青藤提取物具有显著的降低血 糖活性的效果，该发现对于扩充糖尿病用药储备具有显著的积极意 义。
2、小花青藤在西南地区有大量分布，其来源广泛、可靠，由其 制成的抗T2DM产品原料充足，可大幅降低T2DM患者的医疗成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本 发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发 明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种小花青藤提取物的制备方法，该方法按照如 下步骤进行：
S1：以干燥的小花青藤植物根或根茎为原料，经净制，粉碎，过 60目筛，得小花青藤粉；
S2：向获得的小花青藤粉中加入重量比17倍量85％乙醇，搅拌 至无气泡，室温(20℃)浸泡24小时后，以2.5L/小时流速渗漉，合 并渗漉液，过滤，真空减压浓缩至稠膏状。
S3：所得浸膏，趁热加入重量比1倍量的纯净水，60℃水浴加热 至全溶，趁热过滤，滤液室温(20℃)静置24小时，出现大量水不 溶物，抽滤，80mL纯净水洗涤，继续抽滤15分钟，抽干不溶物于 真空干燥24小时，即得小花青藤提取物。
实施例2：
本实施与实施例1的区别在于：B步骤是向获得的小花青藤粉中 加入重量比15倍量的80％乙醇浸泡，以1.0L/小时流速渗漉；C步骤 是加入重量比2.5倍量的纯净水，滤液室温(25℃)静置24小时。
实施例3：
本实施与实施例1的区别在于：B步骤是向获得的小花青藤粉中 加入重量比12倍量的95％乙醇浸泡，以2L/小时流速渗漉；C步骤是 加入重量比2.3倍量的纯净水，滤液室温(25℃)静置18小时。
实施例4
以实施例1～3所制备的任一小花青藤提取物进行对α-葡萄糖苷 酶抑制活性的影响实验。
1.实验材料
α－葡萄糖苷酶，Sigma-Aldrich公司；对硝基苯基W－D－吡喃 半乳糖苷，上海源叶公司；磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司； 二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司；Na2CO3，上海泰坦科技 股份有限公司；阿卡波糖：Sigma-Aldrich公司；酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。
2.实验方法
2.1PNP标准曲线的绘制
精确配制1 000μmol/L PNP溶液，稀释为7个浓度梯度：0、5、 25、50、100、200、400μmol/L，各取100μL加入Na2CO3(1mol/L) 终止液100μL，振荡混匀15min，测定反应体系在405nm波长处的 光密度(OD)值再于405nm处测定其吸光度，以PNP浓度为横坐标， OD值为纵坐标，绘制PNP溶液标准曲线。
2.2PNPG法测α-葡萄糖苷酶抑制活性。
对分离得到的流份和化合物，采用以PNPG为底物的筛选模型。 在96孔板中，依次加入磷酸盐缓冲液(PBS)、样品溶液和底物，混合 均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的 酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入50μL 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。每组设3个复孔，各组反应液体 积如表1所示。
表1 PNPG法不同反应液的反应体积(μL)
Figure BDA0003349606860000051
2.1数据统计
汇总数据，实验数据采用均数±标准差
Figure BDA0003349606860000052
表示，两组间比 较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异 有显著性。使用GraphPad Prism 9进行统计分析。
3.实验结果
小花青藤提取物对α-葡萄糖苷酶抑制有抑制作用，在浓度为0.38 mg/ml时对酶的抑制率为50％。提示小花青藤能够有效抑制α-葡萄糖 苷酶，在2型糖尿病的治疗中具有潜在的应用价值。
3.3小结
与模型组相比，加小花青藤提取物处理后，在剂量为0.38mg/ml 时显著提高对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果表明小花青藤提取 物能够改善高血糖作用,具有开发应用的潜力。
实施例5:
以实施例1～3所制备的任一小花青藤提取物进行对db/db糖尿病 小鼠的影响实验
1.实验材料
db/db小鼠(清洁级，7周龄)，C57 BL/6小鼠(清洁级，7周龄)： 常州卡文斯实验动物有限公司；盐酸二甲双胍：中美上海施贵宝制药 有限公司；葡萄糖试剂盒(GLU):南京建成生物研究所(批号:F006)； 小花青藤提取物：实施例1所述提取物。血脂诊断试剂盒：威特曼生 物科技(南京)有限公司。胰岛素试剂盒：上海贤绵生物科技有限公 司。
Mutil-Scan GO型酶标仪：美国Thermo公司；万分之一分析天 平：德国赛多利斯公司；高速台式冷冻离心机：德国Eppendorf公 司；全自动高压灭菌锅:TOMY SX-500；生化分析仪(济南格利特科 技有限公司)。
2.实验方法
2.1动物分组及给药
db/db小鼠适应饲养1周，禁食16h测定空腹血糖，选择空腹血 糖高于11.0mmol/L的动物随机分为以下5组，(1)db/db小鼠模型 组；(2)-(4)组分别为小花青藤低剂量、中剂量组、高剂量组。每 组8只。另外8只C57 BL/6小鼠为正常对照组(5)。
每组每日定时灌胃给药，给药体积为0.01mL/g，连续给药8周。 分组及给药剂量如下：(1)db/db模型组，0.01mL/g生理盐水；(2) 小花青藤提取物低剂量，50mg/kg；(3)小花青藤提取物中剂量组， 150mg/kg；(4)小花青藤提取物高剂量组，500mg/kg；(5)正常对照，0.01mL/g生理盐水。以上给药均每日一次，各组小鼠均给予标准饲料 喂养，自由饮水。
2.2标本采集及指标检测
小鼠每周称重1次，小鼠每2周眼眶采血(0,2,4,6,8周)，测 定空腹血糖1次；于给药第8周，小鼠禁食过夜，末次给药12h后， 采血液，进行胰岛素(Ins)、总胆固醇(TC)，三酰甘油(TG)的测定。
2.3数据统计统计学方法
所得资料运用graphpad prism 9.0统计软件进行处理，各组数据 以均数±标准差
Figure BDA0003349606860000061
表示，两组比较采用t检验，组间比较采用 单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3实验结果
3.1小花青藤提取物对小鼠体重的影响
实验期间各组小鼠体重变化结果如表2所示。正常小鼠体重为 20-40g，db/db小鼠体重增加明显，为45-60g，小花青藤中高剂量组 自给药第四周可显著降低db/db小鼠的体重，改善肥胖症状。
表3小花青藤提取物对db/db小鼠体重影响(g,
Figure BDA0003349606860000071
n＝6)
对照组 模型组 RE-L RE-M RE-H
0 22.1±1.5 49.8±4.1<sup>ΔΔ</sup> 49.3±4.4 53.1±3.8 49.7±4.7
1 23.1±0.9 54.9±4.4<sup>ΔΔ</sup> 50.9±4.0 52.5±3.6 49.8±3.4
2 24.8±1.1 55.3±4.4<sup>ΔΔ</sup> 48.9±3.7 51.2±3.2 49.1±4.4
3 26.9±0.8 55.5±3.5<sup>ΔΔ</sup> 49.7±4.0 49.9±3.5 49.8±3.7<sup>**</sup>
4 26.1±1.7 55.7±4.0<sup>ΔΔ</sup> 49.2±3.7<sup>*</sup> 48.4±3.9<sup>*</sup> 48.8±2.6<sup>**</sup>
5 26.5±2.4 55.1±3.9<sup>ΔΔ</sup> 48.1±3.8<sup>*</sup> 49.3±4.0<sup>*</sup> 49.6±3.3<sup>**</sup>
6 27.4±2.6 57.3±4.3<sup>ΔΔ</sup> 49.2±3.7<sup>*</sup> 48.2±3.3<sup>*</sup> 47.4±3.2<sup>**</sup>
模型组与相同时间对照组相比ΔΔP<0.01；n＝6
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； n＝6
3.2小花青藤提取物对db/db小鼠空腹血糖的影响
给药4周后，小花青藤提取物中、高剂量组对db/db小鼠空腹血 糖有显著的降低作用，其中高剂量组降糖作用较强。
表4小花青藤提取物对db/db小鼠空腹血糖比较(g,
Figure BDA0003349606860000072
n＝6)
对照组 模型组 RE-L RE-M RE-H
0 5.5±0.7 27.8±3.4<sup>ΔΔ</sup> 25.3±2.1 27.2.1±3.1 27.8±4.3
1 5.2±0.8 27.2±2.8<sup>ΔΔ</sup> 26.4±2.7 26.8±2.8 27.8±2.8
2 5.8±0.6 26.1±3.2<sup>ΔΔ</sup> 26.0±3.4 26.2±3.1<sup>*</sup> 26.1±2.3<sup>*</sup>
3 5.5±0.7 29.2±3.0<sup>ΔΔ</sup> 27.1±2.9<sup>*</sup> 25.7±2.1<sup>*</sup> 25.0±3.1<sup>**</sup>
4 5.7±0.6 28.7±3.4<sup>ΔΔ</sup> 27.5±2.1<sup>*</sup> 24.3±3.0<sup>**</sup> 24.1±2.8<sup>**</sup>
模型组与相同时间对照组相比ΔΔP<0.01；n＝6
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，**P<0.01；n＝6
3.3小花青藤提取物对db/db小鼠胰岛素及血脂的影响
如表5所示，与对照组相比，db/db模型组小鼠血清胰岛素及总 胆固醇、总甘油三酯浓度显著升高。与模型组对照，小花青藤提取物 低、中、高剂量组均能显著降低db/db小鼠血清胰岛素及总胆固醇、 总甘油三酯浓度。
表5小花青藤提取物对db/db小鼠血清胰岛素、血脂的影响(g,x±s, n＝8)
组别 INS(μIU/ml) TG(mmol/ml) TC(mmol/ml)
正常对照组 24.12±3.94 1.05±0.067 3.65±0.41
模型对照组 57.85±5.65<sup>ΔΔ</sup> 1.53±0.069<sup>ΔΔ</sup> 4.99±0.51<sup>ΔΔ</sup>
低剂量组 55.77±6.56<sup>*</sup> 1.37±0.088<sup>*</sup> 4.59±0.36<sup>*</sup>
中剂量组 47.71±5.43<sup>*</sup> 1.36±0.107<sup>**</sup> 4.68±0.36<sup>**</sup>
高剂量组 40.21±6.45<sup>**</sup> 1.29±0.099<sup>**</sup> 3.71±0.51<sup>**</sup>
模型组与相同时间对照组相比ΔΔP<0.01；n＝6
药物组与相同时间模型组相比*P<0.05，**P<0.01；n＝6
3.4小结
本次实验选用的db/db小鼠为遗传性肥胖型2型糖尿病动物模 型，其糖尿病病程与人极为相似，是研究2型糖尿病的理想动物模型。 本研究观察了不同剂量小花青藤提取物对8周龄db/db小鼠体重、空 腹血糖、胰岛素、血总胆固醇和甘油三酯的影响，发现小花青藤提取 物中高剂量组(150、500mg/kg)自给药第四周可显著降低db/db小鼠 的体重，改善肥胖症状；给药4周后，小花青藤提取物中、高剂量组 对db/db小鼠空腹血糖有显著的降低作用，其中高剂量组降糖作用较 强。小花青藤提取物低、中、高剂量组均能显著降低db/db小鼠血清 胰岛素及总胆固醇、总甘油三酯浓度。综合来看，小花青藤提取物 对8周龄的db/db小鼠血糖、血脂有调节作用，2型糖尿病常伴随脂 质代谢紊乱症状。现代医学研究研究表明高血脂可引起胰岛β细胞脂 质过氧化，损害β细胞功能何胰岛素抵抗，是导致糖尿病发生发展的 重要诱因。因此调节体内脂质代谢对糖尿病的防治具有重要意义。本 研究中小花青藤提取物能显著降低db/db小鼠血清TC,TG浓度，显示 了良好的降脂作用，同时显著降低db/db小鼠血清胰岛素浓度，改善 胰岛素抵抗作用，提示小花青藤提取物具有开发为新型口服降糖药物 的价值。

Claims (7)

1.小花青藤提取物在制备抗T2DM产品中的应用，其特征在于，所述小花青藤提取物直接作为抗T2DM产品或者作为组分添加于抗T2DM产品中。
2.根据权利要求1所述的小花青藤提取物在制备抗T2DM产品中的应用，其特征在于，所述小花青藤提取物可制成丸剂、片剂、散剂、胶囊、注射剂或者作为组分添加于抗T2DM产品中制成丸剂、片剂、散剂、胶囊、注射剂。
3.小花青藤提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、粉碎过筛：将小花青藤植物根或者根茎净制、粉碎、过筛，获得小花青藤粉；
S2、浸提：向步骤S1中获得的小花青藤粉中加入乙醇，浸泡24小时，渗漉提取，滤液浓缩得浸膏；
S3、纯化：向步骤S2中获得的浸膏加入乙醇为溶剂，加热溶解、过滤，室温静置、抽滤，得到沉淀物，对沉淀物进行干燥，得到小花青藤提取物。
4.根据权利要求3所述的小花青藤提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1净制后应进行干燥处理。
5.根据权利要求3所述的小花青藤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中过筛选用60目筛。
6.根据权利要求3所述的小花青藤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，乙醇为15％-95％乙醇水溶液，加入量为小花青藤粉重量的6-15倍。
7.根据权利要求3所述的小花青藤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，渗漉的速度为0.3-3.0L/小时。
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