CN108186731A

CN108186731A - 一种提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法

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Publication number: CN108186731A
Application number: CN201810149726.XA
Authority: CN
Inventors: 谈娜娜; 王乐
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2018-06-22

Abstract

本发明使用超滤离心法结合UPLC‑MS/MS技术，从黄芩根的黄芩活性成分溶液中快速筛选出13种具有α‑葡萄糖苷酶结合活性的化合物，并获得其化学结构信息。这些成分之间的协同作用使得该天然产物样品具有很强的α‑葡萄糖苷酶抑制活性(其IC₅₀值为阳性对照阿卡波糖的50％)。超滤离心法结合高分辨质谱技术与传统的生物分析引导柱分离技术相比，具有远高于传统手段的筛选效率。

Description

一种提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。

背景技术

世界上，糖尿病患者已超过1.7亿，已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病。糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病，是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者共同存在引起的。临床上，根据糖尿病发病机制不同，主要分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，我国以II型居多。治疗II型糖尿病的药物主要分为：胰岛素及类似物：如赖脯胰岛素等；促胰岛素分泌剂：如磺酰脲类；胰岛素增敏剂：如噻唑烷类衍生物；α-葡萄糖苷酶抑制剂等。

α-葡萄糖苷酶是一种在机体代谢过程中起关键作用的酶，与许多因代谢紊乱失调引起的疾病密切相关。α-葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中α-淀粉酶及小肠刷状缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α-临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成，II型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者的共同作用，血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞及在细胞内的氧化利用发生障碍，同时，肝糖输出增多导致高血糖。由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力，部分血糖随尿排出而形成糖尿病。因此，可以通过降低α-葡萄糖苷酶活性，限制或延缓碳水化合物在消化道内分解为糖类的速度，达到预防和治疗这类疾病的目的。α-葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似寡糖，能够与寡糖竞争α-葡萄糖苷酶的结合位点，与α-葡萄糖苷酶结合，抑制酶的活性，减少寡糖分解，从而延缓肠道对单糖特别是葡萄糖吸收，避免了餐后可能发生的血糖过高，从而达到治疗Ⅱ型糖尿病的目的。但是研究发现，合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂会导致许多严重的肠胃疾病，如腹部不适、腹泻及肥胖等，因此，对于来自天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂进行探索和研究有益于新型降糖药物的研发。

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科的多年草本植物，其根部作为一种传统中草药，也是许多配方中的关键成分，并在中国和其他东亚国家都有广泛应用。据报道，黄芩中的主要活性成分为黄酮类化合物，该类化合物是一种重要的天然多酚衍生物，因其大多数可作为葡萄糖苷酶抑制剂而被用于治疗Ⅱ型糖尿病。此外，黄酮类成分还具有抗血小板聚集和醛糖还原酶抑制活性，有助于降低糖尿病综合征。目前，对于黄芩中的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的快速筛选研究仍未见报道。

发明内容

针对黄芩中的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的快速筛选研究与应用中存在的科技问题，本发明的目的是通过超滤离心法结合液相色谱-质谱联用技术检测，可迅速筛选出黄芩中的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分，且获得其化学结构信息，以为高效、安全地开发天然降糖药物提供依据，且有助于Ⅱ型糖尿病及其相关并发症的临床治疗研究。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。

一种快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该方法包括下述步骤：

(1)称取100g黄芩，粉碎，过100目筛，使用有机溶剂热回流提取3次，提取时间2-3h，70-80℃，使用正丁醇溶液对70％乙醇提取物进行萃取，取有机相溶液减压浓缩后旋干，最后加甲醇复溶得到10μg/mL样品液，过0.22μm滤膜，即得到黄芩活性成分溶液，装瓶，4℃保存，备用。

(2)在反应器中加入190μL乙酸铵缓冲液和2μL上述步骤制得的黄芩活性成分溶液，再加入8μLα-葡萄糖苷酶，得混合液体积200μL，置于恒温反应器中孵育，之后将混合液加入超滤离心管(2mL,10,000MWCO)中超滤离心，收集滤渣，弃掉滤液；再用乙酸铵缓冲液洗涤，重复三次，然后加入200μL体积比为1:1的甲醇-水混合溶液后超速离心，重复三次，收集滤液，将滤液过膜，通过液相色谱-质谱联用技术检测，得到天然α-葡萄糖苷酶抑制剂。

进一步地，所述热回流有机溶剂依次为正己烷、氯仿和浓度70％的乙醇溶液。

进一步地，所述正丁醇为水饱和后的溶液。

进一步地，所述洗脱剂依次为浓度10％、30％、50％、70％、90％的乙醇水溶液。

进一步地，所述孵育条件为在37℃下孵育25-35min。

进一步地，所述超速离心为在离心力10000g下离心8-12min。

进一步地，还包括α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。

本发明采用的超滤离心法结合液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)，即将中药提取物中的化合物与特定受体混合，具有潜在活性的小分子化合物与生物靶分子结合成受体-配体的复合物和游离的非活性的小分子化合物。然后将这些混合物置于可以按分子量不同截留部分化合物的超滤离心管中，通过离心使生物靶分子及其复合物被挡在一侧，游离态的小分子则自由通过超滤膜，实现活性分子与非活性分子的分离。再利用特定条件处理受体-配体复合物，使先前结合的具有潜在活性的小分子化合物从配体中释放出来，经离心使具有蛋白结合活性的配体小分子化合物透过超滤膜而被分离开来。最后，利用LC/MS联用技术对这些活性配体小分子化合物进行分离和鉴别。该方法因其分析速度快、操作简单、可靠性强以及在线筛选等优势，对天然产物中的降糖活性成分筛选研究具有重要意义。

附图说明

图1是阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率随浓度变化曲线；

图2是本发明天然α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率随浓度变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法做出详细说明。

1.本发明需要使用的材料主要包括下述部分：

1.1植物

黄芩根(未炮制，粉碎)，100g。

1.2药物

标准品：汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和去甲汉黄芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

对照药物：阿卡波糖。

1.3试剂

α-葡萄糖苷酶(来自酿酒酵母)、牛血清蛋白、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(α-PNPG)、甲醇(色谱级)、超纯水(自制)、甲酸(色谱级)、乙酸(色谱级)和乙酸铵(色谱级)等。

1.4仪器

液相色谱-质谱联用仪(Shimadzu LC-20AD XR-AB TripleTOF 4600)、台式高速离心机、微孔板分光光度计、超纯水处理系统、旋转蒸发仪、超滤离心管、粉碎机和电子天平等。

2.本发明的实施例实验方法如下所述：

2.1样品制备

(1)标准液的配制

准确称量标准品，用甲醇溶解，并稀释至浓度5μg/mL，4℃保存，备用。

(2)黄芩活性成分溶液的制备

称取100g黄芩，粉碎，过100目筛。原料依次用正己烷、氯仿和70％乙醇热回流提取2-3小时，本实施例中热回流提取2.5小时，温度控制在75℃，然后将70％乙醇提取液用正丁醇(水饱和后溶液)萃取，取有机相溶液减压浓缩至旋干，最后，加甲醇复溶得到10μg/mL样品液，过0.22μm滤膜，得到黄芩活性成分溶液，装瓶，4℃保存，备用。

2.2LC-MS/MS检测

LC条件如下：

色谱柱：Shim-pack XR-ODS(100mm×2.0mm,2.2μm)；

流动相：A：水+0.1％甲酸、B：甲醇+0.1％甲酸；

流速：0.3mL/min；

柱温：40℃；

检测波长：280nm；

洗脱梯度见表1：

表2-1液相洗脱梯度

ESI-MS及ESI-MS/MS条件如下:

离子化模式：(±)ESI；

去簇电压(DP)：100V；

喷雾电压(IS)：5500V(+)、4500V(－)；

离子化温度：550℃；

雾化气(GS1)：55psi；

辅助气(GS2)：55psi；

气帘气(Curtain Gas)：30psi；

扫描范围为220-800m/z全扫描；

碰撞能量：一级和二级模式下分别为10、50eV；

数据采集及处理软件采用Analyst和PeakView 2.0。

2.3黄芩活性成分溶液的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

在96孔板中，加入20μL磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.0)、20μLα-葡萄糖苷酶(磷酸缓冲液配成0.1U/mL)、20μL黄芩活性成分溶液(磷酸缓冲液配成浓度分别为：3.1250、2.3438、1.5625、1.1719、0.7813、0.3906、0.1953、0.0977mg/mL)，恒温摇床中混合，37℃孵化15min。再加入20μL底物α-PNPG(磷酸缓冲液配成2.5mM)，37℃反应15min。最后加入80μL Na₂CO₃(0.2M)终止反应。用阿卡波糖作为阳性对照。反应混合物的吸光度值(OD)在405nm下测量。抑制率(％)是根据公式计算：

抑制率(％)＝[1-(OD_test-OD_control)/OD_blank]×100

其中，“OD_test”代表测试组的吸光度值；“OD_control”代表控制组(不加酶)的吸光度值；“OD_blank”代表空白组(不加样品)的吸光度值。每组反应重复三次，并利用计算其半抑制率(IC₅₀)。

2.4黄芩活性成分溶液中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

在两个1mL反应器中分别加入190μL乙酸铵缓冲液(10mM，pH 6.86)和2μL黄芩正丁醇提取物(乙酸铵缓冲液，50mg/mL)，再分别加入8μLα-葡萄糖苷酶(乙酸铵缓冲液，100μM)，混合液体积均达200μL，置于恒温反应器，37℃孵育30min。之后将混合液加入2mL超滤离心管(PES，10,000MW)中，在室温下，转速10,000g离心10min，弃掉滤液。再用乙酸铵缓冲液(pH6.86)洗涤三次以去除未与α-葡萄糖苷酶结合的物质。然后加入200μL CH₃OH-H₂O(1:1,v/v)(PH 3.30)，10000g离心15min，步骤重复三次，用来解离与α-葡萄糖苷酶结合的成分，收集滤液。对照组不加BSA和α-葡萄糖苷酶，其他条件相同。最后，将上述收集的全部滤液样品过膜，进行LC-MS分析。

3.实验结果

3.1黄芩活性成分溶液的化学成分信息

通过UPLC-MS/MS在线鉴定，对比标准品并结合质谱谱图的碎片解析，共鉴定出32种化学成分。结果见表2。

表2黄芩正丁醇萃取物中已鉴定的黄酮类成分

3.2黄芩活性成分溶液的α-葡萄糖苷酶抑制活性

对不同浓度的黄芩活性成分溶液进行α-葡萄糖苷酶抑制率的测试，绘制抑制率曲线并计算IC₅₀。如图1和2所示，黄芩活性成分溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性表现出浓度依赖性，半数抑制浓度IC₅₀为0.551mg/mL，接近阳性对照(阿卡波糖)的一半(IC₅₀＝1.079mg/mL)，同时，当样品浓度为2.34mg/mL时，其抑制率可达90.55％，而当阿卡波糖的抑制率达到90.59％时，其浓度为15mg/mL，是将近样品的7倍。由此可见，黄芩活性成分溶液具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3.3黄芩活性成分溶液中的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分

基于超滤离心结合UPLC-MS/MS高通量筛选检测到黄芩活性成分溶液中具有α-葡萄糖苷酶结合活性的化合物共13种。结果见表3-2。

表3-2黄芩正丁醇萃取物中具有α-葡萄糖苷酶结合活性的化合物

4结论

本发明使用超滤离心法结合UPLC-MS/MS技术，从黄芩根的黄芩活性成分溶液中快速筛选出13种具有α-葡萄糖苷酶结合活性的化合物，并获得其化学结构信息。这些成分之间的协同作用使得该天然产物样品具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性(其IC₅₀值为阳性对照阿卡波糖的50％)。超滤离心法结合高分辨质谱技术与传统的生物分析引导柱分离技术相比，具有远高于传统手段的筛选效率，且结果明确，因此超滤离心法结合UPLC-MS/MS是一种可快速筛选和鉴定天然产物中降糖活性成分的优秀技术。

Claims

1.一种提取与快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的提取与快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述热回流有机溶剂依次为正己烷、氯仿和浓度70％的乙醇溶液。

3.根据权利要求1所述的提取与快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述正丁醇溶液为水饱和后的溶液。

4.根据权利要求1所述的提取与快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于所述洗脱剂依次为浓度10％、30％、50％、70％、90％的乙醇水溶液。

5.根据权利要求1所述的提取与快速筛选黄芩中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述孵育条件为在37℃下孵育25-35min。

6.如权利要求1所述的提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述超速离心为在离心力10000g下离心8-12min。

7.根据权利要求1所述的提取与快速筛选黄芪中天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，还包括α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。