CN113155766A - 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法 - Google Patents

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，是先将待筛选的若干种中药材分别粉碎，再分别用有机溶剂提取，得若干上清液作为待测样本溶液；再在微孔板中加入反应体系；将空白对照样品和待测样本溶液一起置于酶标仪中震荡孵育，加入pNPG溶液摇匀测定各样品在400‑405nm处的吸光值；利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对应样品及待测样品吸光度值变化曲线；得出样品曲线净面积Net AUC值；本发明方法一次可筛选几十种甚至上百种中药材，快速、准确率高，操作方便。

Description

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法。
背景技术
现有研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制小肠中的α-葡萄糖苷酶，阻断1，4-糖苷键水解，有效降低餐后血糖水平，市场上存在多种α-葡萄糖苷酶活性抑制药物，但是成本高且会产生不良反应。我国中草药资源丰富，且中医药治疗糖尿病历史悠久疗效显著，现有研究发现部分中药能有效抑制餐后血糖快速升高，如桑叶、升麻等。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法主要有对-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)法、葡萄糖氧化酶法和固定化酶法。其中较为常用的为pNPG法，该法操作方便简单，但目前该研究多采用终点法(测定反应某一时间点的结果作为最终评估结果)进行测定，反应过程不明朗，反应终点的选取对测定结果影响较大；同时测定样品数量有限，目前仍缺乏一种能够快速筛选并验证具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物质的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于，提出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，提高具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材筛选效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，包括以下步骤：
体外高通量筛选模型构建：建立α-葡萄糖苷酶和底物pNPG的体外反应模型，利用酶标仪检测生成物PNP的吸光值变化，进而反映中药材对酶的抑制活性；
药材库的建立：选取不同种类的中药材，粉碎后用不同浓度的有机试剂进行提取，获得提取液，建立药材库；
活性筛选：对药材库中的提取液进行过滤，取上清液稀释后加入反应模型使用酶标仪记录起吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算抑制效果。
优选的是，所述体外反应模型的反应底物组分为0.05-0.1mol/L、pH6.8-7.2的磷酸钠缓冲液50-150μL，0.8-1U/mLα-葡萄糖苷酶10～25μL，0.00193-0.00232mol/L pNPG溶液10-25μL。
优选的是，所述药材库建立步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。
优选的是，所述药材库建立步骤中，分别用30％-90％浓度的乙醇溶液对药材进行提取，提取料液比为1:10-20，提取时间40-60min。
优选的是，所述活性筛选步骤中，使用酶标仪对生成物吸光度进行测定时，测定波长为400-405nm。
优选的是，所述活性筛选步骤中，每1min进行一次测定，持续90min。
优选的是，所述活性筛选步骤中，用空白吸光度曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)，曲线下净面积(Net AUC)与空白曲线下面积的比值即为抑制率，计算公式为：
抑制率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC空白×100。
优选的是，当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。
本发明产生的有益效果是：可以利用酶标仪多孔板进行活性测定，短时间内完成几十甚是上百种样品的活性测定，节约资源同时极大提升效率。本发明中建立的高通量分析模型通过酶标仪在400-405nm处全程监控α-葡萄糖苷酶与pNPG反应过程，使反应过程表现为吸光度数值变化，全面且直观掌控反应变化过程。本发明采用曲线积分法测定，通过测定样品与空白反应曲线下面积之差，客观且精准地反映样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，排除假阳/阴性现象，使结果更具有可信度。
附图说明
图1是实施例1中的阿卡波糖标准曲线；
图2是实施例2中的阿卡波糖标准曲线；
图3是实施例3中的阿卡波糖标准曲线。
具体实施方式
实施例1
α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建
实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.08mol/L、pH6.8磷酸钠缓冲溶液125μL、0.8-U/mLα-葡萄糖苷酶溶液25μL、25μL样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，Acarbose)，31℃保温孵育10min，然后迅速加入0.00213mol/LpNPG溶液25μL，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定400nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度OD值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)。
抑制率计算公式为：抑制率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC(空白)×100；
当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。
精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/mL，稀释成不同浓度，分别加入0.08mol/L、pH6.8磷酸钠缓冲溶液125μL、0.8-U/mLα-葡萄糖苷酶溶液25μL，31℃孵育10min，再迅速加入0.00213mol/L pNPG溶液25μL，于400nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(NetAUC)为纵坐标，建立如图1的标准曲线。求得回归曲线方程为:Y＝27.316X+2.9985(R2＝0.9985)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/mL-0.8mg/mL范围内线性关系良好。药材库的建立
选择表1中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:10(mg:mL)超声提取40min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。
表1
Figure BDA0003077896320000041
Figure BDA0003077896320000051
35％乙醇提取成分的筛选
将35％乙醇提取溶液加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
75％乙醇提取成分的筛选
将75％乙醇提取溶液加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
实施例2
α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建
实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.07mol/L、pH7.1磷酸钠缓冲溶液50μL，0.9U/mLα-葡萄糖苷酶溶液10μL、10μL样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，Acarbose)，34℃保温孵育20min，然后迅速加入0.00198mol/LpNPG溶液10μL，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定402nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度OD值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)。
抑制率计算公式为：抑制率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC(空白)×100；
当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。
精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/mL，稀释成不同浓度，分别加入0.07mol/L、pH7.1磷酸钠缓冲溶液50μL，0.9U/mLα-葡萄糖苷酶溶液10μL、10μL阿卡波糖溶液，34℃孵育20min，再迅速加入0.00198mol/L pNPG溶液10μL，于402nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(NetAUC)为纵坐标，建立如图2的标准曲线。求得回归曲线方程为:Y＝26.261X+2.9649(R2＝0.9973)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/mL-0.8mg/mL范围内线性关系良好。
药材库的建立
选择表2中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:15(mg:mL)超声提取50min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。
表2
Figure BDA0003077896320000061
Figure BDA0003077896320000071
35％乙醇提取成分的筛选
将35％乙醇提取溶液稀释30倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
75％乙醇提取成分的筛选
将75％乙醇提取溶液稀释30倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
实施例3
α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的构建
实验在96孔板中进行，在96孔板中加入0.1mol/L、pH7.0磷酸钠缓冲溶液100μL、1U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20μL、20μL样品溶液或阳性对照(阿卡波糖，Acarbose)，37℃保温孵育30min，然后迅速加入0.00228mol/L pNPG溶液20μL，于酶标仪中摇匀后迅速开始测定405nm处吸光值。利用酶标仪配备软件记录吸光度OD值，每1min测定一次，持续90min，当出现fx为最大值且稳定时标志着反应结束。无样品的空白曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)。
抑制率计算公式为：抑制率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC(空白)×100；
当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。
精确配制阿卡波糖母液浓度1mg/mL，稀释成不同浓度，分别加入0.1mol/L、pH7.0磷酸钠缓冲溶液100μL、1U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20μL、20μL阿卡波糖溶液，37℃孵育30min，再迅速加入0.00228mol/LpNPG溶液20μL，于405nm波长下测定其吸收值，以阿卡波糖浓度为横坐标，曲线下净面积(NetAUC)为纵坐标，建立如图3的标准曲线。求得回归曲线方程为:Y＝27.658X+2.4865(R2＝0.9979)，说明在阿卡波糖浓度0.05mg/mL-0.8mg/mL范围内线性关系良好。
药材库的建立
选择表3中的常见中药材170味，选择35％、75％乙醇溶剂对每味中药材进行提取。称取适量中药材，粉碎，准确称取2g，按中药材：溶剂＝1:20(mg:mL)超声提取60min，滤纸过滤，上清液冷藏于4℃。
表3
Figure BDA0003077896320000091
Figure BDA0003077896320000101
35％乙醇提取成分的筛选
将35％乙醇提取溶液稀释50倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下6个样品：高良姜、肉桂、丁香、墨旱莲、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
75％乙醇提取成分的筛选
将75％乙醇提取溶液稀释50倍，加入反应体系中并计算抑制率。按照以上筛选方案，筛选出活性较强(抑制率>90％)的以下9个样品：高良姜、肉桂、丁香、盐补骨脂、补骨脂、墨旱莲、赤芍、金荞麦、西青果。与现有文献报道相符。
综上所述，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，但上述优选实施例并非用以限制本发明，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。

Claims (8)

1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
体外高通量筛选模型构建：建立α-葡萄糖苷酶和底物pNPG的体外反应模型，利用酶标仪检测生成物PNP的吸光值变化，进而反映中药材对酶的抑制活性；
药材库的建立：选取不同种类的中药材，粉碎后用不同浓度的有机试剂进行提取，获得提取液，建立药材库；
活性筛选：对药材库中的提取液进行过滤，取上清液稀释后加入反应模型使用酶标仪记录起吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算抑制效果。
2.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述体外反应模型的反应底物组分为0.05-0.1mol/L、pH6.8-7.2的磷酸钠缓冲液50-150μL，0.8-1U/mLα-葡萄糖苷酶10～25μL，0.00193-0.00232mol/L pNPG溶液10-25μL。
3.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述药材库建立步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。
4.根据权利要求3所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述药材库建立步骤中，分别用30％-90％浓度的乙醇溶液对药材进行提取，提取料液比为1:10-20，提取时间40-60min。
5.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述活性筛选步骤中，使用酶标仪对生成物吸光度进行测定时，测定波长为400-405nm。
6.根据权利要求5所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述活性筛选步骤中，每1min进行一次测定，持续90min。
7.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：所述活性筛选步骤中，用空白吸光度曲线下面积(AUC空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)，曲线下净面积(Net AUC)与空白曲线下面积的比值即为抑制率，计算公式为：
抑制率％＝(AUC空白-AUC样品)/AUC空白×100。
8.根据权利要求7所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，其特征在于：当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。
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