CN107064319B

CN107064319B - 贵州党参药材hplc特征图谱的测定方法

Info

Publication number: CN107064319B
Application number: CN201610850266.4A
Authority: CN
Inventors: 徐文芬; 孙庆文; 何顺志; 石玲玲
Original assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2016-09-27
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2036-09-27
Also published as: CN107064319A

Abstract

本发明公开了一种贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法。本发明采集10个以上不同产地的贵州党参，将它们分别制成供试品，获取它们及党参炔苷对照品的HPLC图和UV光谱图，确定党参炔苷峰为参照峰后，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统构建贵州党参药材的HPLC对照特征图谱，为有效鉴别贵州党参与同属其他党参药材提供依据，并为贵州党参的质量控制提供一套行而有效的方案。本发明简单易行，使用效果好。

Description

贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法。

背景技术

贵州党参《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)系收载品种，为桔梗科党参属植物管花党参Codonopsis tubulosa Kom.的干燥根。具有补中益气，健脾益肺等功效，用于脾胃虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽、内热消渴等症。主要分布于贵州的中西部及部分南部地区，尤其以西北部为主，是贵州著名的道地药材，由于其体结实肥壮，质坚而木质不重，有香气，甜味浓，嚼之能化渣，曾是历史上有名的“叙党”，是贵州道地药材外贸出口品种之一，在国内外市场上享有较高的声誉。现代药理研究证明，贵州党参具有增强造血功能，抗血栓，调血脂，抗心肌缺血缺氧，改善血液循环，增强机体免疫力等作用。但近几年由于无序采挖，生态环境严重破坏等原因导致其野生资源量急剧下降，现有的野生资源量已远不能满足当今市场需求，加之在其标准中仅通过性状和显微鉴别评价该药材的质量，质量控制水平较低，药材质量良莠不齐，严重影响了相关产业的健康可持续发展。因此，有必要对贵州道地药材贵州党参进行提高药材质量控制水平研究，以保证用药安全、有效及质量可控。

发明内容

本发明的目的是：提供一种贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，它能提高贵州党参药材的质量控制水平，使贵州党参药材的质量控制技术更为完善、科学。

本发明是这样实现的：贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，包括如下步骤：

1)在同年3-4月采集10组以上不同产地贵州党参，将采回的鲜品分别洗净后，低温烘干、粉碎过40目筛，获得干燥样品粉末备用；

2)取步骤1)中获得样品粉末5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，分别用质量百分比为70％的乙醇进行超声提取3次，每次30min，提取后过滤，并合并滤液；将滤液蒸干后，所得的残渣用甲醇完全溶解，并加甲醇定容，摇匀、滤过后，取续滤液，再用0.45μm有机微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；将党参炔苷对照品用甲醇配制成浓度为0.25mg/mL的参照物溶液；以甲醇为空白溶剂；将空白溶剂、参照物溶液及供试品溶液分别注入液相色谱仪；

3)色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent ZORBAXSB-C₁₈，150mm×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸水溶液，按0～15min、A：0.5％→5％，15～35min、A：5％→6％，35～60min、A：6％→12％，60～80min、A：12％→15％，80～100min、A：15％→16％，100～120min、A：16％→19％，120～140min、A：19％→21％，140～185min、A：21％→70％，185～190min、A：70％→80％进行梯度洗脱，流速为1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样体积：10μL；

4)从色谱图中获得15个共有特征峰，并根据党参炔苷对照品与样品粉末的HPLC色谱图对应色谱峰的保留时间及UV光谱图比较，确定党参炔苷峰为参照峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统构建贵州党参药材的HPLC对照特征图谱R。

步骤3)中色谱图的图谱信息采集时间为190min。

所述的超声提取的功率为100W、频率为50Hz。

为了验证本发明的技术效果，进行了以下试验：

1仪器与材料

1.1仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，安捷伦液相色谱系统化学工作站(美国安捷伦公司)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版、2004B版(国家药典委员会，以下简称指纹图谱软件)；SPSS 18.0主成分分析软件。

1.2试药

党参炔苷对照品(购于江西本草天工科技有限责任公司，纯度＞98％)，乙腈为色谱纯，甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯，水为重蒸水。

1.3样品来源

所有实验样品均由作者于2011年3月～4月到产地采集，并经贵阳中医学院何顺志教授准确鉴定为管花党参Codonopsis tubulosa Kom.。鲜品采回后，洗净，烘干，粉碎过40目筛，置干燥器中备用。样品产地及编号见表4。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸水溶液，按0～15min(A：0.5％→5％)，15～35min(A：5％→6％)，35～60min(A：6％→12％)，60～80min(A：12％→15％)，80～100min(A：15％→16％)，100～120min(A：16％→19％)，120～140min(A：19％→21％)，140～185min(A：21％→70％)，185～190min(A：70％→80％)进行梯度洗脱，流速为1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。

2.2参照物溶液的制备精密称取置于五氧化二磷干燥器中放置24h的的党参炔苷对照品适量，加甲醇溶解并制成每1mL含党参炔苷0.25mg的溶液，备用。

2.3供试品溶液的制备取样品粉末约5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加70％乙醇超声提取(功率100W、频率50Hz)3次(30mL，30mL，30mL)，每次30min，过滤，合并滤液，蒸干。残渣用甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。

2.4精密度试验取同一药材粉末(水城勺米乡鱼塘村磨石沟)约5g，精密称定，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，所得图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，相似度计算结果均大于0.991，表明仪器精密度良好。

2.5重复性试验取同一药材粉末(水城勺米乡鱼塘村磨石沟)6份，每份约5g，精密称定，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，所得图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，相似度计算结果均大于0.997，表明本法测定的重现性良好。

2.6稳定性试验取同一药材粉末(水城勺米乡鱼塘村磨石沟)约5g，精密称定，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、15、24、48h依法测定，所得图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，相似度计算结果均大于0.989，表明供试品溶液测定在48h内保持稳定。

2.7图谱信息采集时间考察取同一药材粉末(水城勺米乡鱼塘村磨石沟)1份，约5g，精密称定，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，测定其230min的HPLC图，发现在190min后样品不出峰，故确定图谱信息采集时间为190min。结果见图1。

2.8样品测定将17批贵州党参药材样品分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，取空白溶剂、党参炔苷对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录190min的色谱图，即得。

2.9特征峰的确定

根据17批贵州党参药材的HPLC图谱的测定结果，共分离出100多个色谱峰，对其峰数、峰值(积分值)、峰位(相对保留时间)及色谱峰的紫外扫描光谱图等相关参数进行分析比较，分析确定其中15个峰为共有特征峰。根据党参炔苷对照品与贵州党参药材样品的HPLC色谱图对应色谱峰的保留时间及UV光谱图比较，确认12号峰为党参炔苷峰，且达到了基线分离，峰信号较强，故设定12号峰为参照峰(S)。以12号峰为参照峰分别计算17批贵州党参药材15个特征峰的相对保留时间及峰面积比值。结果见图2、3，表1、2、3。

2.10相似度计算结果将17批贵州党参药材样品的HPLC图谱导入指纹图谱软件(2004A版)，设定S₁为参照谱，采用多点校正，时间窗宽度为0.1，对照图谱生成方法为中位数法，相似度计算评价结果表明，17批贵州党参药材样品中除S₅、S₇、S₉、S₁₂、S₁₅、S₁₆、S₁₇外，其它各批样品相似度均大于0.90，相关性较好。结果见表4。

表4 17批贵州党参药材HPLC特征图谱相似度评价计算结果

2.11主成分分析

由于将17批贵州党参药材样品的HPLC图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行相似度评价结果，6批样品的相似度均小于0.9，难以进行直观比较，故本实验又采用主成分分析方法进行其相关性分析，分别以17批贵州党参药材样品的15个特征峰的峰面积比值(表3)、峰面积经数据标准化处理后组成数据矩阵进行主成分分析，比较两种分析结果的差异。

2.11.1峰面积比值的主成分分析

将表3中的峰面积比值数据导入SPSS18.0主成分分析软件，提取3个主成分或2个主成分达到降维分析的目的，结果显示选择提取前3个成分的累积贡献率为95％，提取前2个成分的累积贡献率为91％，均满足累积贡献率达到80％～85％以上的原则，其余15个成分只占8％，说明前2个成分就可以解释总方差的绝大部分。其结果见表5，图4、图5。

表5峰面积比值的主成分分析解释的总方差结果

由图4、图5可知，以峰面积比值进行主成分分析，不论是提取3个主成分还是提取2个主成分，除S₇距离最远以外，S₁₂、S₁₆、S₁₇次之，其余13批样品均聚在一起，具有较好的相关性。

2.11.2峰面积标准化处理后主成分分析

如表2，由于17批贵州党参药材的15个特征峰峰面积的差异很大，峰面积大的成分的作用将大于峰面积小的成分，影响主成分分析结果的准确判断，所以需要将峰面积经标准化处理后进行主成分分析，结果显示选择提取前3个成分的累积贡献率为95％，提取前2个成分的累积贡献率为92％，均满足累积贡献率达到80％～85％以上的原则，其余15个成分只占8％，说明前2个成分就可以解释的总方差的绝大部分。其结果见表7，图6、图7。

表7峰面积标准化处理后的主成分分析解释的总方差结果

由图6、图7可知，以峰面积经标准化处理后进行主成分分析，不论是提取3个主成分还是提取2个主成分，除S₆、S₇距离最远以外，S₁₂、S₁₆、S₁₇次之，其余12批样品均聚在一起，具有较好的相关性。

3讨论

3.1相似度计算软件采用的是模糊信息分析法，相似度计算方法为夹角余弦法。主成分分析是将大量的测定数据(变量)降维，在尽可能不损失信息或者少损失信息的情况下，将多个变量减少为少数几个潜在的主成分，这几个主成分可以高度地概括大量数据中的信息，这样，既减少了变量个数，又同样能再现变量之间的内在联系，还可消除相互重叠的信息部分。本实验将中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)相似度评价结果，与化学识别模式方法主成分分析结果进行综合分析，得知17批贵州党参药材样品中S₁～S₅、S₈～S₁₁、S₁₃～S₁₅十二个产地的贵州党参药材相聚为一体，相关性较好，成为主体区域，而S₆、S₇、S₁₂、S₁₆、S₁₇远离该主体区域，与它们的相关性较差，说明这几批药材的产地差异较明显。将相关性较好的十二个产地的贵州党参药材的HPLC图谱，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)，初步构建贵州党参药材的HPLC对照特征图谱R。结果见表8、图8。

表8贵州党参药材对照特征图谱R的相对保留时间及峰面积比值

3.2本实验将于市场购买的同属其他党参药材党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.、川党参Codonopsis tangshen Oliv.，照上述方法制备供试液依法测定其HPLC图谱，分别导入指纹图谱软件(2004B版)进行分析，与贵州党参对照特征图谱R比较，其相似度评价计算结果分别为党参0.103、川党参0.665，同属其它党参药材与贵州党参的对照特征图谱相似度均小于0.9，表明它们之间的化学成分差异较大，所建立的贵州党参药材对照特征图谱具有较强的专属性，能有效鉴别贵州党参与同属其他党参药材。结果见图9。

3.3本实验在参考文献的基础上，分别对检测波长、C₁₈色谱柱类型、流动相组成和比例、进样量以及检测柱温等色谱条件进行了考察实验，供试品溶液制备方法的考察包括了提取方法、提取溶剂、提取时间和供试品称样量等实验。

由于采用了上述技术方案，本发明采集10个以上不同产地的贵州党参，将它们分别制成供试品，获取它们及党参炔苷对照品的HPLC图和UV光谱图，确定党参炔苷峰为参照峰后，采用中药色谱指纹图相似度评价系统构建贵州党参药材的HPLC对照特征图谱，为有效鉴别贵州党参与同属其他党参药材提供依据，并为贵州党参的质量控制提供一套行而有效的方案。本发明简单易行，使用效果好。

附图说明

图1为图谱信息采集时间考察HPLC图；

图2为17批贵州党参药材HPLC原始图谱的叠加图；

图3为党参炔苷对照品溶液与供试品溶液HPLC图和UV光谱图(A为对照品，B为供试品)；

图4、图5为17批贵州党参药材的15个特征峰峰面积比值的主成分分析成分图；

图6、图7为17批贵州党参药材的15个共有特征指纹峰峰面积标准化后的主成分分析成分图；

图8为贵州党参药材HPLC对照特征图谱R(时间窗宽度0.1，中位数法)；

图9为贵州党参药材与其他品种党参的匹配图谱(时间窗宽度1.5)。

具体实施方式

本发明的实施例：贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，在同年3-4月采集17组不同产地的贵州党参，将采回的鲜品分别洗净后，烘干、粉碎过40目筛，获得干燥样品粉末备用；取上述的各干燥样品粉末约5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，分别用质量百分比为70％的乙醇进行超声提取3次，每次30min，超声提取的功率为100W，频率为50Hz；提取后过滤，并合并滤液；将滤液蒸干后，所得的残渣用甲醇完全溶解，并加甲醇定容，摇匀、滤过后，取续滤液，再用0.45μm有机微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；将党参炔苷对照品用甲醇配制成浓度为0.25mg/mL的参照物溶液；以甲醇为空白溶剂；将空白溶剂、参照物溶液及供试品溶液分别注入液相色谱仪；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸水溶液，按0～15min、A：0.5％→5％，15～35min、A：5％→6％，35～60min、A：6％→12％，60～80min、A：12％→15％，80～100min、A：15％→16％，100～120min、A：16％→19％，120～140min、A：19％→21％，140～185min、A：21％→70％，185～190min、A：70％→80％进行梯度洗脱，流速为1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样体积：10μL；色谱图的图谱信息采集时间为190min；从色谱图中获得15个共有特征峰，并根据党参炔苷对照品与干燥样品粉末的HPLC色谱图对应色谱峰的保留时间及UV光谱图比较，确定党参炔苷峰(12号峰)为参照峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统构建贵州党参药材的HPLC对照特征图谱R。

Claims

1.一种贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：

3)色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为AgilentZORBAX SB-C₁₈，150mm×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸水溶液，按0～15min、A：0.5％→5％，15～35min、A：5％→6％，35～60min、A：6％→12％，60～80min、A：12％→15％，80～100min、A：15％→16％，100～120min、A：16％→19％，120～140min、A：19％→21％，140～185min、A：21％→70％，185～190min、A：70％→80％进行梯度洗脱，流速为1.0mL·min^-1；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样体积：10μL；

2.根据权利要求1所述的贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，其特征在于：步骤3)中色谱图的图谱信息采集时间为190min。

3.根据权利要求1所述的贵州党参药材HPLC特征图谱的测定方法，其特征在于：步骤2)所述的超声提取的功率为100W、频率为50Hz。