CN109613154A - 一种威宁党参药材hplc特征图谱的建立方法 - Google Patents

一种威宁党参药材hplc特征图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，本发明通过建立了威宁党参HPLC特征指纹图谱分析方法，从化学成分方面较全面地反映该药材中化学成分信息，为充分发掘地方资源、提升威宁党参的品牌效应及该药材的质量控制水平提供了理论依据。且用该方法检测到的威宁党参药材特征图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。

Description

一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，属于药品技术的领域。
背景技术
“威宁党参”主产贵州省威宁县，栽培历史可追溯到上世纪70年代。2011年8月国家质量检测总局以第121号公告，确认威宁党参为地理标志产品，批准“威宁党参”为专用标志使用。2011年种植规模已上万亩，对当地经济建设和贵州中药产业的发展起到了积极的推动作用。“威宁党参”来源于桔梗科Campanulaceae党参属Codonopsis植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf的干燥根，具有补中益气、健脾益肺、补血、生津之功，主治脾肺气虚、气津两伤、气血两虚、食少便溏、虚喘咳嗽等证。目前，产于甘肃、四川、山西等地的党参药材化学指纹图谱研究较多，但对“威宁党参”化学指纹图谱和质量标准的研究还未见报道。
发明内容
本发明目的在于，提供一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法。本发明通过建立了威宁党参HPLC特征指纹图谱分析方法，从化学成分方面较全面地反映该药材中化学成分信息，为充分发掘地方资源、提升威宁党参的品牌效应及该药材的质量控制水平提供了理论依据。且用该方法检测到的威宁党参药材特征图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将新鲜党参洗净，烘干，粉碎过40目筛，得样品粉末，取样品粉末2.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇超声提取3次，每次加入量为30mL，每次提取30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干，加甲醇溶解定容至5mL容量瓶，静置6h，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：称取党参炔苷对照品，五氧化二磷干燥后，加甲醇溶解制成每1mL含党参炔苷0.250mg的溶液，即得对照品溶液；
(3)色谱条件：色谱柱：广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP 80A；250mm×4.6mm；流动相：乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量10μL；
(4)特征图谱的制作：按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下进样，记录谱图得到党参的HPLC特征图谱；
(5)特征谱图的确认：按照上述提供的方法，对11批次党参建立了HPLC特征图谱，通过分析比较确定了10个共有峰，这些共有峰构成了党参的图谱特征，作为党参的HPLC特征图谱。
前述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法中，梯度洗脱时：梯度洗脱程序为：0-25min，0％→5％A；25-80min，5％→15％A；80-125min，15％→25％A；125-145min，25％→55％A；145-175min，55％→80％A；175-180min，80％→100％A；180-202min，100％A。
前述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法中，所述的超声提取是：在超声提取的功率为100W，频率为50Hz下进行超声提取。
前述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法中，所述10个共有峰，以5号峰党参炔苷峰为参照峰，其余峰相对保留时间分别为105.740min。
前述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法中，所述的柱温为30℃；流速为1.0mL/min；检测波长为270nm；进样量10μL。
发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
实验例
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1100型HPLC仪、化学工作站(美国Agilent公司)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-5000E型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A、2004B版(国家药典委员会，以下简称指纹图谱软件)。
1.2试药
1.2.1试剂
党参炔苷对照品(购于江西本草天工科技有限责任公司，纯度＞98％)。甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，乙醇、甲醇、磷酸等均为分析纯，实验用水为重蒸水。
1.2.2药材
药材采于贵州省威宁县的不同产地，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根。样品采集详见表1。
表1威宁党参药材来源
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP 80A(250mm×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0-25min，0％→5％A；25-80min，5％→15％A；80-125min，15％→25％A；125-145min，25％→55％A；145-175min，55％→80％A；175-180min，80％→100％A；180-202min，100％A)；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样量10μL。
2.2对照品溶液的制备
称取党参炔苷对照品适量(五氧化二磷干燥)，精密称定，加甲醇溶解制成每1mL含党参炔苷0.250mg的溶液，备用。
2.3供试品溶液的制备
取党参药材样品粉末约2.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入70％超声提取3次(30、30、30mL)，每次30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干，加甲醇溶解，转移定容至5mL容量瓶，静置6h，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3方法学考察
3.1精密度试验
取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录其HPLC图谱，并将其导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，可得相似度计算结果均大于0.99，结果表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
3.2稳定性试验
取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、6、12、24、36、48h依法测定，所得图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，可得相似度计算结果均大于0.97，结果表明供试品溶液至少在48h内稳定。
3.3重复性实验
取同一样品粉末6份，每份约2.5g，精密称定，分别按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件平行测定，所得图谱导入指纹图谱软件(2004A版)进行分析，可得相似度计算结果均大于0.96，结果表明本方法重复性良好，符合指纹图谱技术要求。
4样品测定
分别取不同批次的威宁党参药材粉末，按“2.3”项下制备方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件，进行分析测定，记录202min的色谱图。
5特征图谱的建立
5.1指纹图谱共有峰的确定
根据11批次威宁党参供试品溶液测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数，进行分析比较，以S1作为相似度计算的校正参照谱图，时间窗宽度1.0，采用多点校正，自动匹配方式生成对照特征图谱，结果见图1和图2。
5.2特征峰的标定和确认
根据11批次威宁党参药材供试品和甲醇溶剂的检测结果，HPLC色谱图分离出了80多个色谱峰，分析比较党参炔苷、甲醇溶剂以及11批样品的HPLC谱图，标定10个峰为特征峰。根据党参炔苷与供试品色谱图中对应色谱峰的保留时间及UV光谱图一致性比较，确认5号峰为党参炔苷，其保留时间为105.740min。见图3、4、5。
6相似度评价计算结果
将11批次威宁党参药材HPLC图谱分别导入指纹图谱软件进行相似度分析计算。结果见表2。
表2 11批次威宁党参药材供试品HPLC特征图谱相似度(设定S1为参照谱)
由表2可知，11批威宁党参药材特征图谱中只有S1、S9批次的相似度小于0.9，其他几个批次的相似度均大于0.9。
7主成分分析
7.1峰面积比值的主成分分析
将11批威宁党参药材的10个特征指纹峰的峰面积比值数据(见表3)导入SPSS17.0分析软件中，进行主成分分析。提取2个主成分，其累积贡献率为96.727％，其结果见表3。S1、S9距离最远，其余9批样品密集地聚在一起，结果见图6。
表3 11批次威宁党参药材供试品10个特征峰相对峰面积比值
注：以5号特征指纹峰为参照峰，其保留时间作为1，峰面积作为1。
表4峰面积比值的主成分分析解释的总方差结果
8结论
8.1供试品提取条件的选择
实验中分别考察了超声提取法与加热回流提取法，结果表明超声提取的样品峰个数较多，信号较强，故选择超声提取法。本试验分别考察70％乙醇、甲醇、正丁醇3种溶剂，结果表明70％乙醇提取较完全，故选择70％乙醇为提取溶剂。
实验中采用70％乙醇30mL超声提取(功率为90W)3次(每次加入70％乙醇30mL)分别考察了超声提取30min和60min，结果表明超声30min和60min无明显区别，为提高效率，故选择超声提取30min。
8.2色谱条件的选择
实验分别考察了菲罗门(5μm，4.6mm×150mm)柱和广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP80A(250mm×4.6mm)色谱柱，结果表明广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP 80A(250mm×4.6mm)柱分离效果最好，故选择该色谱柱。分别考察了乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.4％磷酸溶液和乙腈-水溶液作为流动相进行梯度洗脱，同时考察了所选3种流动相不同梯度洗脱，结果表明流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度为上文中表2中梯度，其供试品溶液的色谱峰分离效果及峰形较好，数目也较为合适。故选择乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相，按照表2选取的梯度洗脱进行试验。本实验采用二极管阵列检测器同时考察了5个波长检测(220nm、245nm、255nm、270nm和290nm)。结果检测波长为270nm时，峰数目较多，各峰分离的较好，故选则270nm作为检测波长。本实验分别考察了25℃、30℃和35℃柱温，结果30℃的柱温所得的分离效果及峰形较好，故选择30℃作为色谱柱温度。
8.3主成分分析
通过对11批党参样品的10个特征峰相对峰面积比值进行主成分分析，结果S1、S9较分散，其余9批都聚一起，具体见图6。
与现有技术相比，本发明通过建立了威宁党参HPLC特征指纹图谱分析方法，从化学成分方面较全面地反映该药材中化学成分信息，为充分发掘地方资源、提升威宁党参的品牌效应及该药材的质量控制水平提供了理论依据。且用该方法检测到的威宁党参药材特征图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
附图说明
图1是11批次威宁党参药材供试品HPLC特征图谱共有模式图(中位数法，时间窗宽度1.0)；
图2是11批次威宁党参药材供试品HPLC特征图谱对照图(中位数法，时间窗宽度1.0)；
图3是党参炔苷对照品及贵州威宁党参供试品HPLC色谱叠加图；
图4是党参炔苷对照品UV光谱图；
图5是威宁党参供试品党参炔苷峰的UV光谱图；
图6是主成分分析成分图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将新鲜党参洗净，烘干，粉碎过40目筛，得样品粉末，取样品粉末2.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇超声提取的功率为100W，频率为50Hz下超声提取3次，每次加入量为30mL，每次提取30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干，加甲醇溶解定容至5mL容量瓶，静置6h，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：称取党参炔苷对照品，五氧化二磷干燥后，加甲醇溶解制成每1mL含党参炔苷0.250mg的溶液，即得对照品溶液；
(3)色谱条件：色谱柱：广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP 80A；250mm×4.6mm；流动相：乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0-25min，0％→5％A；25-80min，5％→15％A；80-125min，15％→25％A；125-145min，25％→55％A；145-175min，55％→80％A；175-180min，80％→100％A；180-202min，100％A；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量10μL；
(4)特征图谱的制作：按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下进样，记录谱图得到党参的HPLC特征图谱；
(5)特征谱图的确认：按照上述提供的方法，对11批次党参建立了HPLC特征图谱，通过分析比较确定了10个共有峰，这些共有峰构成了党参的图谱特征，作为党参的HPLC特征图谱。

Claims (5)

1.一种威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将新鲜党参洗净，烘干，粉碎过40目筛，得样品粉末，取样品粉末2.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇超声提取3次，每次加入量为30mL，每次提取30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干，加甲醇溶解定容至5mL容量瓶，静置6h，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：称取党参炔苷对照品，五氧化二磷干燥后，加甲醇溶解制成每1mL含党参炔苷0.250mg的溶液，即得对照品溶液；
(3)色谱条件：色谱柱：广州菲罗门synergi 4u Hydro-RP 80A；250mm×4.6mm；流动相：乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量10μL；
(4)特征图谱的制作：按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下进样，记录谱图得到党参的HPLC特征图谱；
(5)特征谱图的确认：按照上述提供的方法，对11批次党参建立了HPLC特征图谱，通过分析比较确定了10个共有峰，这些共有峰构成了党参的图谱特征，作为党参的HPLC特征图谱。
2.如权利要求1所述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，其特征在于：梯度洗脱时：梯度洗脱程序为：0-25min，0％→5％A；25-80min，5％→15％A；80-125min，15％→25％A；125-145min，25％→55％A；145-175min，55％→80％A；175-180min，80％→100％A；180-202min，100％A。
3.如权利要求1所述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，其特征在于：所述的超声提取是；在超声提取的功率为100W，频率为50Hz下进行超声提取。
4.如权利要求1所述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，其特征在于：所述10个共有峰，以5号峰党参炔苷峰为参照峰，其余峰相对保留时间分别为105.740min。
5.如权利要求1所述的威宁党参药材HPLC特征图谱的建立方法，其特征在于：所述的柱温为30℃；流速为1.0mL/min；检测波长为270nm；进样量10μL。
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