CN112229924A - 一种快速筛选藜麦麸皮中α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选藜麦麸皮中α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法，采用SPR、UPLC/MS联用技术，用SPR捕获藜麦麸皮提取物中具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，再采用液相色谱和质谱联用的方法分离鉴定出各个化合物结构，成功筛选出藜麦麸皮中18个化合物具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性，高效快捷。

Description

一种快速筛选藜麦麸皮中α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及α-葡萄糖苷酶抑制剂领域，特别是涉及采用SPR、UPLC/MS联用技术筛选藜麦麸皮中可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的化合物的方法。
背景技术
α-葡萄糖苷酶抑制剂(alpha-glucosidase inhibitors，AGI)是用于治疗2型糖尿病的一类药物，目前已经成为单纯饮食控制不佳的2型糖尿病患者的首选药物及1型糖尿病患者使用胰岛素治疗的首选辅助药物。近年大量临床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂能够严格控制餐后血糖的升高，减轻糖尿病患者高糖环境对机体组织、器官的刺激，延缓糖耐量异常患者向2型糖尿病转化的进程，能克服传统降糖药物的一些缺点，在调节糖脂代谢、提高胰岛素敏感性、保护胰岛细胞功能及改善多种糖尿病并发症等方面具有广泛的应用前景。
目前该类药物品种少，上市应用的品种有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，其制备工艺繁琐成本高，合成研究进展缓慢。因此，越来越多的学者青睐于从天然产物资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，以期寻找到新的安全、有效的药物。现已发现黄酮类、生物碱类、多糖类、酚类等具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
在药物的研发过程中，通常需要大规模合成大量的化合物并进行药理活性实验，筛选得到具有活性的药物。这样的筛选方式工作量较大，合成过程通常也较为繁琐。
其实，目前已有报道，一些植物提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，如果能筛选、鉴定出这些植物提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物结构，则有望得到高活性的α-葡萄糖苷酶抑制剂，采用这种方法进行活性药物筛选，必然比常规的设计合成新化合物的方法更直接、有效。
因此，开发一种能够从具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的混合物中快速筛选、鉴定出活性化合物的结构的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选藜麦麸皮中α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，采用SPR、UPLC/MS联用技术，能够对复杂体系中的化合物进行快速筛选。
藜麦(Chenopodium quinoaWilld)，原产于南美洲安第斯山区，是印加土著居民的主要传统食物，有5000-7000多年的食用和种植历史。藜麦具有独特的丰富、全面的营养价值，含有丰富的总酚与黄酮醇含量，具有抗氧化、免疫调节及抗癌活性。藜麦麸皮(即藜麦的外种皮)中含有大量藜麦皂苷，皂苷味苦，食用前常通过水洗或者研磨去除，所以藜麦实际加工过程中会产生大量的藜麦麸皮。
本发明发明人通过以PNPG为底物的方法测定出藜麦麸皮提取物(CQE)具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，则其中必然含有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，但此类植物提取物的体系非常复杂，要对其中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物进行筛选、分离、鉴定的难度很大。
经过长期的不断研究和探索，发明人得到了可以成功筛选、分离、鉴定藜麦麸皮提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的18种化合物的方法，将藜麦麸皮提取物注入SPR系统进行配体捕获，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物将被捕获，洗脱收集这些化合物。随后，用UPLC-Q-TOF-MS对捕获的化合物进行结构鉴定，得到了 18个化合物，8个黄酮类化合物，10个为三萜皂苷，通过化合物解析以及谱库对照推断了化合物结构，实现了藜麦麸皮中活性化合物的快速筛选。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
提供藜麦麸皮中可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的化合物的筛选方法，采用SPR捕获藜麦麸皮提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，再采用液相色谱和质谱联用的方法分离鉴定出各个化合物结构；
液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：waters HSS T3或等效色谱柱；
流动相：流动相A、流动相B；其中，流动相A为水，流动相B为乙腈；所述流动相A和/或流动相B中还含有甲酸；流动相采用如下梯度洗脱程序：
表1
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
0 95～99 5～1
8～12 55～65 45～35
14～18 3～7 97～93
在本发明的具体实施方式中，流动相采用如下梯度洗脱程序：
表2
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
0 98 2
10 60 40
16 5 95
进一步地，流动相在16min以后采用如下梯度洗脱程序：
表3
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
17 5 95
进一步地，所述流动相中甲酸的质量分数为0.05～0.2％，优选为0.1％。
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.0～2.1μm；
ii柱温：30～40℃；
iii流速：0.2～1.0ml/min；
iv检测波长：254±2nm。
在本发明的具体实施方式中，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.8μm；
ii柱温：35℃；
iii流速：0.5ml/min；
iv检测波长：254nm。
更进一步地，进样量为5～50μL，优选为10μL。
在本发明的具体实施方式中，质谱条件为：采用负离子扫描模式；离子源温度：550℃；离子源电压：-4500V；一级扫描：去簇电压：100V；聚焦电压：10V；二级扫描：使用TOFMS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和 -60V。
进一步地，质谱扫描范围：m/z 100～1500；
进一步地，雾化气(GS1)：50psi；雾化气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；
更进一步地，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
进一步地，SPR对活性化合物捕获方法为：将α-葡萄糖苷酶作为SPR芯片表面的固定相，藜麦麸皮提取物溶液为流动相。
进一步地，所述藜麦麸皮提取物的提取方法为：将藜麦麸皮用体积分数为60～85％的乙醇水溶液提取得到藜麦麸皮提取液，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；料液比为1g：5～15mL，优选1g：10mL。
本领域常用的提取方法，如超声法、蒸馏提取法、微波提取法、震荡提取法等，只要溶剂是采用体积分数为60～85％的乙醇水溶液，优选体积分数为75％的乙醇水溶液，均可适用于本发明。
对植物中有效成分的提取，关键因素在于溶剂，只要是采用相同溶剂得到的提取物，其中的组分几乎相同，区别仅在与提取率或组分含量可能有差异。
在本发明的具体实施方式中，所述提取方法包括如下内容：
(1)将藜麦麸皮粉末与体积分数为60～85％的乙醇水溶液混合进行均质得到匀浆液体，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；
(2)将步骤(1)得到的匀浆液体进行震荡萃取，固液分离，去除固形物，得到藜麦麸皮提取液。
进一步地，步骤(1)中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g： 5～10mL，优选1g：8mL；
进一步地，震荡萃取时，匀浆液体中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g：5～15mL，优选1g：10mL；
更进一步地，震荡萃取的温度为20～40℃，优选30℃；震荡萃取时间为 6～20h，优选12h。
进一步地，藜麦麸皮提取物溶液为，藜麦麸皮提取液：DMSO：PBST体积比为 2:1:7配制得到；进一步地，所述藜麦麸皮提取液是通过前述的提取方法得到。
进一步地，将藜麦麸皮提取物通过0.45μm滤膜后，再用来配制溶液作为SPR 的流动相。
进一步地，捕获芯片的制备方法为：将200μg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液作为打印工作液，在芯片上进行阵列打印，点间距280μm，点直径180μm，将打印后的芯片干燥，再依次进行光交联反应、使用H2O进行摇洗、氮气吹干；进一步地，打印过程中重复点样2～4次，优选3次。
在本发明的具体实施方式中，筛选出藜麦麸皮中至少包括化合物1～18具有α- 葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1～18的结构为：
Figure BDA0002711048400000041
1R1＝OH R2＝O-α-L-rhamnopyranosyl(1->2)[α-L-rhamnopyranosyl(1->6)]-β-D-glucopyranoside
2R1＝OH R2＝O-β-D-apiofuranosyl(1->2)-O-<α-L-rhamnopyranosyl(1->6)>-β-D-glucopyranoside
3R1＝H R2＝O-β-D-apiofuranosyl(1->2)-O-<α-L-rhamnopyranosyl(1->6)>-β-D-glucopyranoside
4R1＝OH R2＝O-β-D-glucuronopyranosyl-(2->1)-O-β-D-xylopyranoside
5R1＝OH R2＝O-β-D-glucopyranosyl-(2->1)-O-β-D-xylopyranoside
6R1＝OH R2＝O-β-D-glucuronopyranoside
7R1＝H R2＝O-β-D-glucuronide
8R1＝OCH3 R2＝O-β-D-glucuronide
Figure BDA0002711048400000051
本发明还提供了藜麦麸皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的检测方法，采用SPR捕获藜麦麸皮提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，再采用液相色谱进行检测，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：waters HSS T3或等效色谱柱；
流动相：流动相A、流动相B；其中，流动相A为水，流动相B为乙腈；所述流动相A和/或流动相B中还含有甲酸；流动相采用如下梯度洗脱程序：
表4
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
0 95～99 5～1
8～12 55～65 45～35
14～18 3～7 97～93
进一步地，流动相采用如下梯度洗脱程序：
表5
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
0 98 2
10 60 40
16 5 95
进一步地，流动相在16min以后采用如下梯度洗脱程序：
表6
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％
17 5 95
进一步地，所述流动相中甲酸的质量分数为0.05～0.2％，优选为0.1％。
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.0～2.1μm；
ii柱温：30～40℃；
iii流速：0.2～1.0ml/min；
iv检测波长：254±2nm。
在本发明的具体实施方式中，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.8μm；
ii柱温：35℃；
iii流速：0.5ml/min；
iv检测波长：254nm。
更进一步地，进样量为5～50μL，优选为10μL。
进一步地，SPR对活性化合物捕获方法为：将α-葡萄糖苷酶作为SPR芯片表面的固定相，藜麦麸皮提取物溶液为流动相。
进一步地，所述藜麦麸皮提取物的提取方法为：将藜麦麸皮用体积分数为60～85％的乙醇水溶液提取得到藜麦麸皮提取液，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；料液比为1g：5～15mL，优选1g：10mL。
在本发明的具体实施方式中，所述提取方法包括如下内容：
(1)将藜麦麸皮粉末与体积分数为60～85％的乙醇水溶液混合进行均质得到匀浆液体，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；
(2)将步骤(1)得到的匀浆液体进行震荡萃取，固液分离，去除固形物，得到藜麦麸皮提取液。
进一步地，步骤(1)中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g： 5～10mL，优选1g：8mL；
进一步地，震荡萃取时，匀浆液体中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g：5～15mL，优选1g：10mL；
更进一步地，震荡萃取的温度为20～40℃，优选30℃；震荡萃取时间为 6～20h，优选12h。
进一步地，藜麦麸皮提取物溶液为，藜麦麸皮提取液：DMSO：PBST体积比为 2:1:7配制得到；进一步地，所述藜麦麸皮提取液是通过前述的提取方法得到。
进一步地，将藜麦麸皮提取物通过0.45μm滤膜后，再用来配制溶液作为SPR 的流动相。
进一步地，捕获芯片的制备方法为：将200μg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液作为打印工作液，在芯片上进行阵列打印，点间距280μm，点直径180μm，将打印后的芯片干燥，再依次进行光交联反应、使用H2O进行摇洗、氮气吹干；进一步地，打印过程中重复点样2～4次，优选3次。
进一步地，所述化合物包括化合物1～18。
本发明中还提供了一种藜麦麸皮提取物，它包括化合物1～18中的一种或多种。
本发明所述藜麦麸皮提取物经前述UPLC/MS分析，其总离子流图如图2所示。
前述藜麦麸皮提取物的制备方法，包括：(1)提取；(2)SPR捕获。提取和捕获的方法如前所述。
另外，本发明还提供了前述藜麦麸皮提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途。
本发明还提供了化合物1～18中的一种或多种在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途。
本发明还提供了前述藜麦麸皮提取物在制备降血糖或治疗糖尿病的产品中的用途。
本发明还提供了化合物1～18中的一种或多种在制备降血糖或治疗糖尿病的产品中的用途。
本发明所述产品，包括但不限于食品、保健品或药品。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用SPR技术与UPLC/MS技术联用，实现了藜麦麸皮中具有α- 葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选，成功分离、鉴定出18个活性化合物，与常规的药物筛选方法相比筛选效率大大提升，为藜麦麸皮在降低餐后血糖、防治糖尿病等方面的开发利用提供了数据支撑。
(2)本发明证实了藜麦麸皮提取物(CQE)具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有多种α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物，具有开发潜质，提高了藜麦的综合利用价值。
附图说明
图1是流通药物提取液，芯片表面点样区与空白区的信号峰图；
图2是藜麦麸皮提取物捕获的活性化合物UPLC/MS分析的总离子流图；
图3是化合物9的质谱图及裂解情况。
具体实施方法
下面通过具体实施方式和实验对本发明检测方法做进一步说明。
实施例1
1.材料和方法
1.1.材料
藜麦麸皮由青海博基生物技术有限公司提供，粉末状，白藜麦(ChenopodiumquinoaWilld)机械脱去的麸皮；
酵母α-葡萄糖苷酶(美国sigma公司，G5003，1KU)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(阿拉丁试剂(上海)有限公司)、阿卡波糖(上海源叶科技有限公司)、其他试剂均为国产分析纯；
芯片：BetterWays 3D Carboxylation Chip,Cat:BW38204,BetterWays(China)
PBS:HyClone PBS缓冲液,Cat:SH30256.01B,Thermo Fisher(USA)
Glycine:Millipore Glycine for analysis,Cat:1042010250,Merck(Germany)
HCl:Sigma Hydrochloric acid,Cat:H1758-500ML,Merck(Germany)。
1.2仪器
Berthold bScreen LB 991生物芯片分析系统(Biacore T200系统(GEHealthcare，瑞典))；UPLC-Triple-TOF/MS系统：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱，配有电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司)；酶标仪(BioTek公司，型号：EPOCH2)；恒温振荡器(THOMMO SHAKER, 型号：BE-9010)；Eppendorf minispan离心机(德国Eppendorf公司)
1.3样品处理
称取样品粉末10g，加入80mL 75％冷乙醇，加入烧杯中，使用VS-35S均质仪冰浴破碎10min。匀浆液体转移至新螺口瓶，使用20mL 75％冷乙醇洗涤原烧杯并转移至螺口瓶内。密封螺口瓶，处于30℃环境震荡萃取12h。将萃取液过200目筛，弃去沉淀，上清11000g离心15min去沉淀，取上清通过0.45μm滤膜作为萃取母液。之后按照母液：DMSO：PBST(0.05％Tween-20)＝2:1:7(v:v)配置溶液，摇匀后观察外观不产生浑浊，离心无沉淀，作为样品溶液。
1.4藜麦麸皮提取物对α-葡萄糖苷酶活性的测定
实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表7中剂量在96 孔板中进行加样，每组3个平行，混合均匀，在恒温振荡器中37℃保温10min，结束后，取出，加入50μL 0.5mmol/L pNPG溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入50μL 0.1mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，使用酶标仪测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率。
公式:
Figure BDA0002711048400000091
表7各反应物添加计量和顺序(单位：μL)
Figure BDA0002711048400000092
配制不同浓度的提取物和阳性对照阿卡波糖分别按上述方法测定，绘制药物浓度与对酶的抑制率的关系曲线，并求出相应的IC50值。每个试验重复3次。
测试结果表明，CQE对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈剂量依赖性，α-葡萄糖苷酶的抑制率随提取物浓度的增加而增加。IC50值是常用的量效回归曲线计算的测量指标。实验条件下，CQE和阿卡波糖的IC50分别为0.620±0.057g/L和0.851±0.053g/L，说明CQE的抑制作用与阿卡波糖相当。
1.5酶的预处理及芯片制备
称取1.0mgα-葡萄糖苷酶样品，使用1.0mL灭菌PBST(0.05％Tween-20，pH ＝7.4)溶解，配制成浓度为200.0μg/mL作为打印工作液。为控制点样量的一致，采用BioDotTM-1520阵列打印机进行阵列打印，设置点间距280μm，点直径180μm，采用双针打印系统，芯片表面含有50×50点阵，预计点溶液量2.5nL，重复点样3 次，芯片表面点样量为18.75μL。将打印后的芯片进行真空干燥，之后放置于光交联仪器内进行光交联反应；然后使用H2O进行摇洗15min，氮气吹干，装配Flowcell Cover备用。
1.6采用SPR对活性化合物捕获过程
为检测芯片质量及检测体系是否正常运转，在芯片上的独立质控区域内点样雷帕霉素(Rapamycin，阳性对照)和DMSO(阴性对照)，在测试完毕后进行一次重生，之后流通100nM的FKBP12蛋白标准品，通过观察对照点的结合情况及数据，对实验所用芯片及信息收集系统进行质检，芯片质量及检测体系正常。
对活性化合物进行捕获：SPR测试过程中，流动相为药物提取液，芯片表面固定相为α-Glucosidase。使用SPR生物芯片分析仪实时监测芯片表面固定的分子与提取液中配体分子的结合情况(见图1)，图中α-Glucosidase点样区域信号曲线(红色) 表示芯片上的化合物点样区的信号变化，背景噪声信号曲线(黑色)表示未点样区域信号变化。时间轴区段操作为：0s-260s：体系预洗涤，使芯片表面在缓冲液中浸润。此时共振强度约为0RU。260s-520s：样品结合，芯片表面固定的分子捕获提取液中的化合物配体。图中该区域表明：提取液中的化合物配体开始结合到芯片表面的蛋白分子上；同时非点样区也会受范德华力、疏水作用力影响结合一定的化合物，但非点样区的蛋白结合信号相对点样区信号有明显差别。520s～820s：芯片洗涤，去除芯片表面的非特异性粘附的化合物配体。图中该区域表明：芯片表面经过洗涤后，可与芯片表面分子特异性结合的化合物配体保留在了芯片表面，不可结合的分子及非特异性分子逐渐离开芯片表面，共振强度下降并达到平台期(～381.33RU)；非点样区的非特异性结合也逐渐被清洗，背景值的共振强度逐渐回落到基线水平(～22.40 RU)，芯片背景噪声恢复正常。
1.7活性化合物的UPLC/MS鉴定
捕获过程结束后，向流通室内注入22.5μLGlycine·HCl(pH＝3.0)，封闭芯片循环管路，洗涤系统、泵和检测器，之后将除芯片循环管路外的所有通道充满灭菌 ddH2O。芯片内孵育10min后启动样品收集，之后再次注入22.5μLGlycine·HCl (pH＝3.0)孵育10min，共重复3次，收集所有洗脱液。为提高样品捕获量，重复捕获过程5次，共收得到15份洗脱液，混合均匀后进行UPLC/MS分析。液相色谱分析中，分离柱选择waters HSS T3(50mm×4.6mmi.d.,1.8μm),0.1％甲酸乙腈水梯度洗脱，流速：0.5mL/min，柱温35℃；质谱分析中，雾化气(GS1)：50psi；雾化气 (GS2)：50psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：550℃(负)，离子源电压 (IS)：-4500V(负)，一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和 -60V。扫描范围为m/z 100-1500，负离子扫描模式；进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。TIC图见图2。
1.8统计分析
所有实验结果，均测量三次，以平均值±标准差表示(n＝3)。数据用GraphPadPrism7处理。
在SPR分析中，CQE具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性的化合物与α-葡萄糖苷酶结合，通过解析液解离下来，通过UPLC/MS对解析液进行分析，检测到至少18个化合物，根据保留时间、紫外光谱和质谱裂解图谱，通过与参考化合物和已发表数据的比较，对活性化合物进行了鉴定。
化合物1～8紫外吸收谱显示在220～280nm及300～400nm有2个吸收带，推测这几个化合物为黄酮类化合物；在负离子模式下，黄酮碳苷发生糖环裂解，而黄酮氧苷的裂解是直接丢失糖部分；化合物1～8均为直接丢失糖部分，因此，这些化合物均为黄酮氧苷。黄酮苷类化合物含有的糖基主要有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、芸香糖，主要产生丢失该糖的碎片离子[M-H-162]-、[M-H-162]-、[M-H-146]-、[M-H-308]-； [M-H-132]-则是丢失1个五碳糖的碎片离子，如木糖。[M-H-179]-则是丢失1个葡萄糖醛酸的碎片离子。化合物1、2、4、5、6的二级质谱均有m/z 301，推断这些化合物的母核为槲皮素；化合物3、7根据二级质谱m/z 285[M-308-146-H]，这2个化合物的母核为山柰酚，化合物3结构中存在1个六元己糖和2个鼠李糖，化合物7 结构中存在1个葡萄糖醛酸。化合物8根据二级质谱m/z 315[M-176-H],该化合物的母核为异鼠李素，结构中存在1个葡萄糖醛酸。根据Scifinder和Reaxy数据库检索，推测化合物1～8的结构如下所示。
Figure BDA0002711048400000111
1R1＝OH R2＝O-α-L-rhamnopyranosyl(1->2)[α-L-rhamnopyranosyl(1->6)]-β-D-glucopyranoside
2R1＝OH R2＝O-β-D-apiofuranosyl(1->2)-O-<α-L-rhamnopyranosyl(1->6)>-β-D-glucopyranoside
3R1＝H R2＝O-β-D-apiofuranosyl(1->2)-O-<α-L-rhamnopyranosyl(1->6)>-β-D-glucopyranoside
4R1＝OH R2＝O-β-D-glucuronopyranosyl-(2->1)-O-β-D-xylopyranoside
5R1＝OH R2＝O-β-D-glucopyranosyl-(2->1)-O-β-D-xylopyranoside
6R1＝OH R2＝O-β-D-glucuronopyranoside
7R1＝H R2＝O-β-D-glucuronide
8R1＝OCH3 R2＝O-β-D-glucuronide
化合物9～18紫外吸收谱显示在200～250nm有微弱吸收，推测这几个化合物可能为萜类化合物。藜麦三萜类化合物的核心结构中含有四环或五环类化合物。它们大多是以皂甙的形式存在的五环三萜类化合物,这些化合物都来源于β-胰淀素。糖可以连接到C-3和C-28的苷元上。在主要糖类中，常见的有葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖醛酸(GlcA)和木糖(Xyl)，与上述黄酮氧苷类化合物一致，主要产生丢失该糖的碎片离子[M-H-162]-、[M-H-162]-、[M-H-146]-、[M-H-179]- 以及[M-H-132]-。分子结构够大，但分子中无酸性基团，那么该化合物容易产生 [M+HCOOH-H]-，皂苷类化合物经常出现该加荷离子，如化合物9、10、14、15。根据二级质谱[M-44-H]，说明化合物结构中存在羧基，如化合物11、12、13、16、 17。以化合物9为例，裂解如图3所示，855.4383为[M+HCOOH-H]-，[M-H]-为809.4316，647.3861是[M-H-162]-为失去1分子葡萄糖；515.3406是苷元齐墩果酸，为[M-H-162-132]-又失去1分子木糖。其他化合物裂解类似。根据Scifinder和Reaxy 数据库检索，推测化合物9～18的结构如下所示。
Figure BDA0002711048400000121
藜麦麸皮提取物中捕获的HPLC/MS结果见表8：
表8
Figure BDA0002711048400000131
Figure BDA0002711048400000141
Figure BDA0002711048400000151
Figure BDA0002711048400000161
本发明证实了藜麦麸皮提取物(CQE)具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有开发潜质。利用SPR与UPLC/MS联用技术从藜麦麸皮提取物中快速筛选了18 个具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，其中8个黄酮类化合物，10个为三萜皂苷。通过化合物解析以及谱库对照推断了化合物结构。为藜麦麸皮在降血糖方面的应用提供了依据及数据支撑。该方法证实了通过制备α-葡萄糖苷芯片，SPR检测，并利用UPLC/MS对化合物的鉴定技术，是从复杂体系中快速筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的有效方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.藜麦麸皮中可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的化合物的筛选方法，其特征在于，采用SPR捕获藜麦麸皮提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，再采用液相色谱和质谱联用的方法分离鉴定出各个化合物结构；
液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：waters HSS T3或等效色谱柱；
流动相：流动相A、流动相B；其中，流动相A为水，流动相B为乙腈；所述流动相A和/或流动相B中还含有甲酸；流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％ 0 95～99 5～1 8～12 55～65 45～35 14～18 3～7 97～93
。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％ 0 98 2 10 60 40 16 5 95
；
进一步地，流动相在16min以后采用如下梯度洗脱程序：
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％ 17 5 95
；
更进一步地，所述流动相中甲酸的质量分数为0.05～0.2％，优选为0.1％。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.0～2.1μm；
ii柱温：30～40℃；
iii流速：0.2～1.0ml/min；
iv检测波长：254±2nm；
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×50mm，1.8μm；
ii柱温：35℃；
iii流速：0.5ml/min；
iv检测波长：254nm；
更进一步地，进样量为5～50μL，优选为10μL。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，质谱条件为：采用负离子扫描模式；离子源温度：550℃；离子源电压：-4500V；一级扫描：去簇电压：100V；聚焦电压：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V；
进一步地，质谱扫描范围：m/z 100～1500；
进一步地，雾化气GS1：50psi；雾化气GS2：50psi；气帘气CUR：35psi；
更进一步地，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
5.根据权利要求1～3任一项所述的筛选方法，其特征在于，SPR对活性化合物捕获方法为：将α-葡萄糖苷酶作为SPR芯片表面的固定相，藜麦麸皮提取液溶液为流动相。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述藜麦麸皮提取液的提取方法为：将藜麦麸皮用体积分数为60～85％的乙醇水溶液提取得到藜麦麸皮提取液，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；料液比为1g：5～15mL，优选1g：10mL；
进一步地，所述提取方法包括如下内容：
(1)将藜麦麸皮粉末与体积分数为60～85％的乙醇水溶液混合进行均质得到匀浆液体，优选体积分数为75％的乙醇水溶液；
(2)将步骤(1)得到的匀浆液体进行震荡萃取，固液分离，去除固形物，得到藜麦麸皮提取液。
进一步地，步骤(1)中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g：5～10mL，优选1g：8mL；
进一步地，震荡萃取时，匀浆液体中藜麦麸皮粉末:乙醇水溶液的质量体积比为1g：5～15mL，优选1g：10mL；
更进一步地，震荡萃取的温度为20～40℃，优选30℃；震荡萃取时间为6～20h，优选12h。
7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，藜麦麸皮提取液溶液为，藜麦麸皮提取液：DMSO：PBST体积比为2:1:7配制得到；所述藜麦麸皮提取液是通过权利要求6中所述的提取方法得到；
进一步地，将藜麦麸皮提取物通过0.45μm滤膜后，再用来配制溶液作为SPR的流动相。
8.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，捕获芯片的制备方法为：将200μg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液作为打印工作液，在芯片上进行阵列打印，点间距280μm，点直径180μm，将打印后的芯片干燥，再依次进行光交联反应、使用H2O进行摇洗、氮气吹干；进一步地，打印过程中重复点样2～4次，优选3次。
9.根据权利要求1～8任一项所述的筛选方法，其特征在于，筛选出藜麦麸皮中至少包括化合物1～18具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1～18的结构为：
Figure FDA0002711048390000031
10.藜麦麸皮或其提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的检测方法，其特征在于，采用SPR捕获藜麦麸皮提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，再采用液相色谱进行检测，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：waters HSS T3或等效色谱柱；
流动相：流动相A、流动相B；其中，流动相A为水，流动相B为乙腈；所述流动相A和/或流动相B中还含有甲酸；流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间/min 流动相A/vol.％ 流动相B/vol.％ 0 95～99 5～1 8～12 55～65 45～35 14～18 3～7 97～93
。
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