CN109810163A

CN109810163A - 一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法

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Publication number: CN109810163A
Application number: CN201910136242.6A
Authority: CN
Inventors: 张炜; 陈元涛; 雷蕾; 于小栋; 王志娟; 辛小丽; 田格; 甘文梅
Original assignee: Qinghai Normal University
Current assignee: Qinghai Normal University
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明提供了一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法，属于生物产品加工技术领域。本发明先将藜麦种皮、复合酶和去离子水混合酶解，得到酶解液；然后将酶解液与乙醇混合，利用超声波提取酶解液中的藜麦皂苷，固液分离，得到藜麦皂苷提取液；再将藜麦皂苷提取液与盐酸混合酸解，得到酸解液；最后用石油醚对酸解液进行萃取，得到萃取液；蒸发去除萃取液中的溶剂，得到皂苷元。本发明以藜麦种皮为原料制备皂苷元，不仅可以为专业药厂提供天然的皂苷元原料，还可以提高藜麦的综合利用率和经济附加值，有利于资源的再利用和可持续发展。本发明还提供了一种利用UPLC‑MS对藜麦种皮中的齐墩果酸和常春藤皂苷元同时进行分离定性的方法。

Description

一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法

技术领域

本发明属于生物产品加工技术领域，具体涉及一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法。

背景技术

藜麦(Chenopodium quinoa WilldL.)又称南美藜、藜谷等，属藜科，是起源于南美洲安第斯山脉地区的双子叶植物，富含维生素、微量元素(如矿物质钾，铁，钙等)、膳食纤维、蛋白质及必需氨基酸，同时含有皂苷、多酚类、黄酮类、植物甾醇等生物活性成分，具有抗真菌，抗病毒，抗癌，降胆固醇，降血糖，抗血栓，利尿，抗炎等多种功效，被称为“粮食之母”，被定义为“21世纪的粮食之一”。虽然藜麦引种已遍布全球，但目前对藜麦的研究多处于育种、种植和初加工阶段，对藜麦营养价值、活性物质及其应用的研究较少。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法。

本发明提供了一种利用藜麦种皮制备皂苷元的方法，包括如下步骤：

(1)将藜麦种皮、复合酶和去离子水按质量比1～3：0.02～0.04：25～35混合，48～52℃，pH值5.2～5.8条件下酶解15～20min，灭酶，得到酶解液；所述复合酶包括纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(2～4)：2；

(2)将所述酶解液与乙醇混合，调节混合后的乙醇的体积分数为68～72％，利用超声波提取酶解液中的藜麦皂苷，固液分离，得到藜麦皂苷提取液；

(3)将所述藜麦皂苷提取液与盐酸混合，调节混合后的酸浓度为0.8～1mol/L，85～95℃酸解1～3h，得到酸解液；

(4)用石油醚对所述酸解液进行萃取，得到萃取液；去除萃取液中的溶剂，得到皂苷元。

优选的，步骤(1)所述藜麦种皮为藜麦种皮粉，所述藜麦种皮粉的粒径为0.180～0.250mm。

优选的，步骤(1)所述灭酶采用高温灭酶，所述高温灭酶的温度为85～95℃，所述高温灭酶的时间为25～35s。

优选的，步骤(2)所述提取的方法为超声提取，所述超声提取的功率为200～250W，所述超声提取的时间为15～25min。

优选的，步骤(2)所述固液分离后，用体积分数为68～72％的乙醇水溶液对滤渣中的藜麦皂苷进行重复提取，合并滤液至藜麦皂苷提取液。

优选的，步骤(3)所述盐酸为质量分数36％～38％的盐酸水溶液；所述酸解在电磁搅拌下进行，所述电磁搅拌的电磁功率为0.08～0.12kW，所述电磁搅拌的搅拌速率为750～850r/min。。

本发明提供了上述方法制备得到的皂苷元，所述皂苷元包括齐敦果酸和常春藤皂苷元。

本发明还提供了一种利用UPLC-MS分离定性藜麦种皮中齐敦果酸和常春藤皂苷元的方法，包括如下步骤：

I，将上述皂苷元溶于甲醇中，得到复溶皂苷元；

II，将所述复溶皂苷元上色谱柱，利用甲醇水溶液对色谱柱上的皂苷元进行梯度洗脱；

III，对所述复溶皂苷元进行多反应监测扫描，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果。

优选的，步骤II中所述色谱柱为BEH C18，所述梯度洗脱步骤为：0～6min，70％～90％甲醇水溶液；6～7min，90％甲醇水溶液；7～7.1min，90％～70％甲醇水溶液；7.1～9min，70％甲醇水溶液；流速为0.3mL/min，柱温箱温度为40℃，进样量为5uL。

优选的，步骤III中所述多反应监测扫描用离子源为ESI，扫描时间为0.42s，离子源电压为-4500V；离子源温度为550.0℃；碰撞能量为：-76V；去簇电压为：-85V；气帘气为35psi；离子源气1为55psi；离子源气2为60psi；碰撞气为中等；离子阱参数：扫描速率为10000Da/s，碰撞能量为-85V，碰撞能量范围为±15V。

有益效果：本发明提供了一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法。本发明先将藜麦种皮、复合酶和去离子水按质量比1～3：0.02～0.04：25～35混合，48～52℃，5.2～5.8pH条件下酶解15～20min，灭酶，得到酶解液；所述复合酶包括纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(2～4)：2；然后将所述酶解液与乙醇混合，调节混合后的乙醇体积分数为68～72％，利用超声波提取酶解液中的藜麦皂苷，固液分离，得到藜麦皂苷提取液；再将所述藜麦皂苷提取液与盐酸混合，调节混合后的酸浓度为0.8～1mol/L，85～95℃酸解1～3h，得到酸解液；最后(4)用石油醚对所述酸解液进行萃取，得到萃取液；蒸发去除萃取液中的溶剂，得到皂苷元。本发明提供的方法以藜麦种皮为原料制备皂苷元，不仅可以为专业药厂提供天然的皂苷元原料，还可以提高藜麦的综合利用率和经济附加值，有利于资源的再利用和可持续发展。本发明还利用UPLC-MS对藜麦种皮中的皂苷元进行分离定性，能同时、有效地鉴别分离藜麦种皮中的齐墩果酸和常春藤皂苷元。

附图说明

图1为本发明实施例1所述齐墩果酸标准品和常春藤皂苷元标准品的TIC，XIC(472/393，456/407)和EPI(472，455)结果；

图2为本发明实施例1所述甲醇复溶的皂苷元粗品的TIC，XIC(472/393，456/407)和EPI(472，455)结果。

具体实施方式

(1)将藜麦种皮、复合酶和去离子水按质量比1～3：0.02～0.04：25～35混合，48～52℃，5.2～5.8pH条件下酶解15～20min，灭酶，得到酶解液；所述复合酶包括纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(2～4)：2；

本发明先将藜麦种皮、复合酶和去离子水混合。在本发明中，所述藜麦种皮优选为藜麦种皮粉，所述藜麦种皮粉的粒径优选为0.180～0.250mm，更优选为0.180mm。本发明对所述藜麦种皮的来源不作特别限定，本领域常规获取方式如购买等均可。藜麦种皮中含有丰富的皂苷，可作为天然皂苷的重要来源。藜麦中的皂苷质量分数为0.14％～2.30％，主要存在于种皮中，占总皂苷的68％，其中皂苷元主要为齐墩果酸和常春藤皂苷元，有效鉴别分离藜麦种皮中齐墩果酸和常春藤皂苷元可以解决天然皂素紧缺的问题，为专业药厂提供天然的皂苷元原料，还可以提高藜麦的综合利用率和经济附加值，有利于资源的再利用和可持续发展。

在本发明中，所述复合酶包括纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(2～4)：2；优选为3：2。本发明对所述纤维素酶、果胶酶的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明对所述去离子水的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述藜麦种皮、复合酶和去离子水的混合比例按质量份计为1～3：0.02～0.04：25～35，优选为1.5～2.5：0.025～0.035：28～32，更优选为2：0.03：30。

本发明将藜麦种皮、复合酶和去离子水混合后，得到酶解体系，进行酶解。在本发明中，所述酶解的温度为48～52℃，优选为50.5℃。所述酶解的pH值为5.2～5.8，优选为5.5。所述酶解的时间为15～20min，优选为17min。酶解后灭酶，得到酶解液。在本发明中，所述灭酶的方法优选采用高温灭酶，所述高温灭酶的温度优选为85～95℃，更优选为90℃。所述高温灭酶的时间优选为25～35s，更优选为30s。

得到酶解液后，本发明将所述酶解液与乙醇混合，利用超声提取酶解液中的藜麦皂苷，然后固液分离，得到藜麦皂苷提取液。在本发明中，所述乙醇的体积分数＞70％，优选≥95％，更优选为无水乙醇。所述乙醇的添加量以混合后乙醇的体积终浓度为标准，混合后乙醇的体积终浓度为68～72％，优选为70％。在本发明中，所述乙醇提取优选采用超声提取，所述超声提取的功率优选为200W～250W，更优选为250W，所述超声提取的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明对所述固液分离的方法不作特别限定，本领域常规方法如过滤、离心等均可。在本发明中，固液分离后优选用乙醇水溶液对滤渣中的藜麦皂苷进行重复提取，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为68～72％，更优选为70％，重复提取后合并滤液至藜麦皂苷提取液。

得到藜麦皂苷提取液后，本发明将所述藜麦皂苷提取液与盐酸混合，利用盐酸对藜麦皂苷进行酸解。在本发明中，所述盐酸优选为质量分数36％～38％的盐酸水溶液，更优选为38％的盐酸水溶液，所述盐酸的添加量以混合后盐酸的摩尔浓度为标准，混合后盐酸的摩尔浓度优选为0.8～1mol/L，更优选为0.9mol/L。在本发明中，所述酸解的温度优选为85～95℃，更优选为90℃。所述酸解优选在电磁搅拌下进行，所述电磁搅拌的电磁功率优选为0.08～0.12kW，优选为0.1kW；所述电磁搅拌的搅拌速率优选为750～850r/min，更优选为800r/min。所述酸解的时间优选为1～3h，更优选为1.5h。酸解后，得到酸解液。

本发明用石油醚对所述酸解液进行萃取，得到萃取液，然后去除萃取液中的溶剂，得到皂苷元。本发明对所述石油醚的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明对所述去除萃取液中溶剂的方法不作特别限定，本领域常规方法比如旋转蒸发等均可。

本发明提供了上述制备方法制备得到的皂苷元。在本发明中，所述皂苷元包括齐敦果酸和常春藤皂苷元。

I，将上述皂苷元溶于甲醇中，得到复溶皂苷元；

III，对所述复溶皂苷元进行多反应监测扫描，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果；

本发明先将皂苷元溶于甲醇中，得到复溶皂苷元。在本发明中，所述甲醇用于皂苷元的复溶；本发明对所述甲醇的用量没有特别限定，本领域常规用于复溶的用量即可。得到复溶皂苷元后，本发明将所述复溶皂苷元上色谱柱，利用甲醇水溶液对色谱柱上的皂苷元进行梯度洗脱。在本发明中，所述色谱柱优选为BEH C18，所述梯度洗脱的步骤优选为：0～6min，70％～90％甲醇水溶液；6～7min，90％甲醇水溶液；7～7.1min，90％～70％甲醇水溶液；7.1～9min，70％甲醇水溶液；流速为0.3mL/min，柱温箱温度为40℃，进样量为5uL。本发明还对所述复溶皂苷元进行多反应监测扫描，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果。在本发明中，所述多反应监测扫描用离子源优选为ESI，扫描时间优选为0.42s，离子源电压优选为-4500V；离子源温度优选为550.0℃；碰撞能量(CE)优选为：-76V；去簇电压(DP)优选为：-85V；气帘气优选为35psi；离子源气1优选为55psi；离子源气2优选为60psi；碰撞气优选为中等；离子阱参数：扫描速率优选为10000Da/s，碰撞能量优选为-85V，碰撞能量范围优选为±15V。本发明利用UPLC-MS对藜麦种皮中的皂苷元进行分离定性，能同时、有效地鉴别分离藜麦种皮中的齐墩果酸和常春藤皂苷元。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例所用材料和试剂包括：齐墩果酸标准品、常春藤皂苷元标准品，上海源叶生物科技有限公司(含量≥98(HPLC))；色谱级甲醇，美国MREDA公司。

本实施例所用仪器设备包括：QTRAP 6500+LCMS系统(三重四极杆-离子阱质谱仪)，美国AB SCIEX公司。

(1)藜麦皂苷的分离提取

准确称取2g藜麦种皮粉于500mL圆底烧瓶中，加入30mL去离子水和复合酶制剂总量为1.5％(0.03g)，酶配比〔m(纤维素酶)：m(果胶酶)〕为3:2，调节体系的温度为50.5℃，pH值为5.5，电磁搅拌酶解17min；待酶解完成后，90℃，30s灭酶；加入70mL无水乙醇，超声提取20min。将提取液进行减压过滤，滤渣重复提取一次(50mL体积分数为70％的乙醇溶液)，合并滤液。

(2)皂苷元的水解及皂苷元的提取

藜麦皂苷提取液经浓缩除去大部分水，取50mL于500mL圆底烧瓶中，加入一定量的盐酸，调节至酸浓度为0.9mol/L，控制酸解温度(油浴)为90℃，电磁搅拌1.5h。水解后得到的皂苷元采用石油醚进行萃取，旋转蒸发，得到皂苷元粗品用甲醇复溶。

(3)UPLC-MS皂苷元的分析

A.色谱条件：

色谱柱：BEH C18(2.1×50mm，1.7um)；流动相：甲醇(A)和水(B)；进行梯度洗脱：0～6min，70％A～90％A；6～7min，90％A；7～7.1min，90％A～70％A；7.1～9min，70％A。流速为0.3mL/min，柱温箱温度为40℃，进样量为5uL。

B.质谱条件：

离子源为ESI，扫描方式为多反应监测(multiple reaction monitor，MRM)方式，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果。质谱条件：负离子检测；扫描时间为0.42s，离子源电压为-4500V；离子源温度为550.0℃；碰撞能量(CE)：-76V；去簇电压(DP)：-85V。气帘气为35psi；离子源气1为55psi；离子源气2为60psi；碰撞气为中等。离子阱参数：扫描速率为10000Da/s，碰撞能量为-85V，碰撞能量范围为±15V。

C.皂苷元的UPLC-MS分析结果：

采用UPLC-MS分析对产品进行结构表征，混标及样品的TIC，XIC，EPI图谱见图1、图2。由TIC图可见，样品中含有两种物质，保留时间分别为3.79min，5.92min；由EPI图可见，样品中两种物质的分子离子峰分别为472.1，456.2，并且存在离子对m/z 472.1→m/z 393.3，m/z 456→m/z 407.2；由XIC图可见，472/393离子对和456/407离子对保留时间分别为3.79min，5.92min，与TIC图的保留时间一致。由于m/z 472.1→m/z 393.3为常春藤皂苷元的定性离子对，m/z 456→m/z 407.2为齐墩果酸定性离子对，并且样品的TIC图以及EPI图与齐墩果酸和常春藤皂苷元混标的TIC图以及EPI图一致。因此，确定样品中含有齐墩果酸和常春藤两种皂苷元。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用藜麦种皮制备皂苷元的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述藜麦种皮为藜麦种皮粉，所述藜麦种皮粉的粒径为0.180～0.250mm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述灭酶采用高温灭酶，所述高温灭酶的温度为85～95℃，所述高温灭酶的时间为25～35s。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述提取的方法为超声提取，所述超声提取的功率为200～250W，所述超声提取的时间为15～25min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述固液分离后，用体积分数为68～72％的乙醇水溶液对滤渣中的藜麦皂苷进行重复提取，合并滤液至藜麦皂苷提取液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述盐酸为质量分数36％～38％的盐酸水溶液；所述酸解在电磁搅拌下进行，所述电磁搅拌的电磁功率为0.08～0.12kW，所述电磁搅拌的搅拌速率为750～850r/min。

7.权利要求1～6任意一项所述的方法制备得到的皂苷元，其特征在于，所述皂苷元包括齐敦果酸和常春藤皂苷元。

8.一种利用UPLC-MS分离定性藜麦种皮中齐敦果酸和常春藤皂苷元的方法，其特征在于，包括如下步骤：

I，将权利要求7所述皂苷元溶于甲醇中，得到复溶皂苷元；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤II中所述色谱柱为BEH C18，所述梯度洗脱步骤为：0～6min，70％～90％甲醇水溶液；6～7min，90％甲醇水溶液；7～7.1min，90％～70％甲醇水溶液；7.1～9min，70％甲醇水溶液；流速为0.3mL/min，柱温箱温度为40℃，进样量为5uL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤III中所述多反应监测扫描用离子源为ESI，扫描时间为0.42s，离子源电压为-4500V；离子源温度为550.0℃；碰撞能量为：-76V；去簇电压为：-85V；气帘气为35psi；离子源气1为55psi；离子源气2为60psi；碰撞气为中等；离子阱参数：扫描速率为10000Da/s，碰撞能量为-85V，碰撞能量范围为±15V。