CN113563408A - 利用藜麦制备皂苷的方法及藜麦皂苷的分离鉴定法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用藜麦制备皂苷的方法、制得的藜麦皂苷提取物和分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，制备方法具体包括以下步骤：1)取藜麦粉和脱脂剂搅拌得到混合液，离心后取下层沉淀物进行干燥；2)取干燥后的样品加入提取剂中，依次进行水浴、超声和离心，将得到的上清液浓缩得到浓缩液；3)往浓缩液中加入水和纯化剂，依次进行涡旋和离心后取上层溶液，之后重复操作；4)收集步骤3)中得到的上层溶液并蒸干，之后冻干，得到藜麦皂苷提取物。与现有技术相比，本发明制得的藜麦皂苷提取物纯度高，并改善了藜麦皂苷组成复杂且不易出峰的情况。

Description

利用藜麦制备皂苷的方法及藜麦皂苷的分离鉴定法

技术领域

本发明涉及功能食品领域，具体涉及一种利用藜麦制备皂苷的方法、藜麦皂苷提取物和藜麦皂苷的分离鉴定法。

背景技术

藜麦是一种唯一能满足人体基本营养需求的单体植物，被认为是最适宜人类的全谷物食品。藜麦中皂苷含量丰富，皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎症和抗菌等，在人们健康和应用领域起到重要作用。然而，藜麦及其相关制品的皂苷含量检测没有明确的标准。目前，普遍使用的高氯酸-香草醛法能够检出含有与皂苷类似官能团的酚类物质，但存在检测范围广、检测结果不准确等问题。因此，有必要基于藜麦皂苷的特点，建立一套标准的高效液相色谱测定法，才能对藜麦皂苷进行定性定量分析。

专利CN106176847A公开了一种具有增强抑菌作用的藜麦皂苷及其制备方法与应用。该制备方法，包括以下步骤：对藜麦麸皮粉碎70％甲醇提取、过滤浓缩提取液、乙酸乙酯和正丁醇除杂、碱溶液改性、脱盐、大孔树脂纯化，最后冷冻干燥得藜麦皂苷。进一步地，具体包括以下步骤：1)提取：将藜麦麸皮粉碎，过60目筛，加入8-12倍量70％的甲醇，在45-65℃水浴中搅拌提取，得提取液；2)浓缩：将提取液离心过滤，再将滤液旋蒸浓缩到一定体积，得浓缩液；3)除杂：向浓缩液中加入2倍量体积的乙酸乙酯，震荡分层，去掉乙酸乙酯层，再加入2倍量体积的正丁醇，震荡分层，取正丁醇层，于50℃水浴挥干，得藜麦粗皂苷；4)改性：用蒸馏水配制5-10g/L的藜麦粗皂苷溶液，加入0.1-0.2倍量体积1mol/L的NaOH溶液，于90-95℃下搅拌反应2-4小时，冷却至室温，加入0.1mol/L的盐酸调节pH至7，得中和液；5)脱盐：将步骤4)得到的中和液置于透析袋中，透析脱盐，浓缩；6)纯化：将步骤5)脱盐后的浓缩液过AB-8大孔树脂柱，进行分离纯化，收集目的洗脱液，冷冻干燥得藜麦皂苷。该专利中采取碱水解的方式，不容易将皂苷水解成皂苷元，且水解时间更长，同时考虑到藜麦是作为食物被人食用进入到胃肠中，而人体胃部的消化液呈酸性，即碱水解条件和实际情况不太符合，而酸解条件更符合实际，另外透析袋存在的问题为分子量大小不是特别合适，透析脱盐效果不好，成本高，而大孔树脂纯化需要大量的样品且操作繁琐，过柱纯化收集不方便。而本发明只需要调节pH后冻干甲醇纯化，方便快捷，且皂苷元损失少。

专利CN109223809A公开了一种藜麦皂苷组合物及其在抗耐药菌方面的应用，并公开了藜麦皂苷化合物的制备方法，具体包括以下步骤：(1)提取：将藜麦麸皮粉碎，过40目筛，加入8-10倍重量的75％的乙醇，室温超声震荡40min，静置两个小时得提取液；(2)浓缩：将提取液过滤，再将滤液旋蒸去除大部分乙醇，得到浓缩液；(3)除杂：向浓缩液中加入2倍体积的石油醚，震荡分层，去掉石油醚层，再加入2倍体积的乙酸乙酯，震荡分层，去掉乙酸乙酯层；(4)萃取：加入2倍体积的正丁醇层，萃取2-3遍，静置分层，取正丁醇层，于60℃旋蒸浓缩，得藜麦皂苷粗提物浓缩液；(5)烘干：将上述得到的浓缩液置于60℃水浴中烘干，得到粗提皂苷；(6)粗分：使用大型大孔吸附树脂柱进行大量的分离，使用乙醇和水的混合液对其进行梯度洗脱，得到大量的粗分的皂苷；(7)精分：使用C18反相液相色谱柱进行精确分离，得到所需的藜麦皂苷。该专利在液相色谱法这一步骤中直接分离的是皂苷，且文中提及到的藜麦皂苷1-6均无标品，无法明确其方法的准确性。

CN109810163A一种利用藜麦种皮制备皂苷元及其分离定性的方法，包括如下步骤：(1)将藜麦种皮、复合酶和去离子水按质量比1～3：0.02～0.04：25～35混合，48～52℃，pH值5.2～5.8条件下酶解15～20min，灭酶，得到酶解液；所述复合酶包括纤维素酶和果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(2～4)：2；(2)将所述酶解液与乙醇混合，调节混合后的乙醇的体积分数为68～72％，利用超声波提取酶解液中的藜麦皂苷，固液分离，得到藜麦皂苷提取液；(3)将所述藜麦皂苷提取液与盐酸混合，调节混合后的酸浓度为0.8～1mol/L，85～95℃酸解1～3h，得到酸解液；(4)用石油醚对所述酸解液进行萃取，得到萃取液；去除萃取液中的溶剂，得到皂苷元。该专利虽然采用了酸水解的方法得到皂苷元，但它的目的只是得到皂苷元，而且皂苷元仅为齐墩果酸和常春藤皂苷元两种，这说明制备方法有不足，无法提取出其他的皂苷元，另外提取过程比较复杂，用了多种酶，针对的是种皮中的皂苷，而本发明提取方法和该专利有差异，且针对的是提取藜麦籽粒中的皂苷，可得到3种皂苷元，并通过3种皂苷元定量测得皂苷含量，整个过程比该专利更简洁。

发明内容

本发明的第一个目的就是提供一种利用藜麦制备皂苷的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种利用藜麦制备皂苷的方法，所述方法具体包括以下步骤：

1)取藜麦粉和脱脂剂搅拌得到混合液，离心后取下层沉淀物进行干燥，此步骤是为了进行脱脂；

2)取干燥后的样品加入提取剂中，依次进行水浴、超声和离心，将得到的上清液浓缩得到浓缩液，此步骤是为了进行提取，可节约后续纯化所需的醇类的量，否则每100g藜麦粉一次性要消耗4L正丁醇；

3)往浓缩液中加入水和纯化剂，依次进行涡旋和离心后取上层溶液，之后重复操作，此步骤是为了进行纯化，因为浓缩液中有很多醇溶性物质，导致皂苷含量特别低；

4)收集步骤3)中得到的上层溶液并蒸干，之后冻干，得到藜麦皂苷提取物，冻干有利于后续进行酸解，使皂苷提取物有更好的酸解效果。

步骤1)中，所述藜麦粉由藜麦在研磨机中研磨得到。

步骤1)中，所述藜麦选自白藜麦、黑藜麦、红藜麦以及其他颜色的藜麦。

步骤1)中，所述脱脂剂采用正己烷或石油醚。其中，正己烷可重复利用，且价格低廉，便于大批量制备皂苷。

步骤1)中，所述藜麦粉和脱脂剂的料液比为1:2.5～4.0(w/v)。

步骤1)中，搅拌的时间为1～2h。

步骤1)中，离心的速率为4000～5000rpm，离心的时间为10～15min。

步骤1)中，在通风橱中通风干燥24～30h，脂质会进入正己烷等脱脂剂中，但是因为离心后依旧会有少量正己烷存在，而正己烷存在一定的毒性，因此通常正己烷脱脂离心后，所得到的脱脂粉末需要通风橱中干燥。

步骤2)中，所述提取剂采用甲醇。甲醇的提取效果最优。

步骤2)中，所述藜麦粉和提取剂的料液比为1:10～15(w/v)。

步骤2)中，水浴的温度为40～50℃，水浴的时间为1～2h。

步骤2)中，超声的频率为30～40kHz，超声的时间为1～2h，由于使用的超声设备自带水浴功能，所以水浴和超声的时间设置成相同的，也可根据实际情况进行选择。

步骤2)中，离心的速率为4000～5000rpm，优选为5000rpm，离心的时间为10～15min，优选为15min。

步骤2)中，上清液采用旋转蒸发仪进行浓缩，旋转蒸发仪设置的温度为40～50℃，转速为80～110rpm。

步骤3)中，所述纯化剂采用正丁醇。常温下，皂苷在正丁醇中的溶解度最优。

步骤3)中，涡旋的转速为2500～3000rpm，涡旋的时间为1～2min。

步骤3)中，离心的速率为4000～5000rpm，离心的时间为10～15min。

步骤3)中，水和正丁醇的体积比为1:2～3(v/v)。

步骤4)中，采用旋转蒸发仪进行蒸干，旋转蒸发仪设置的温度为55～65℃，转速为80～110rpm。

步骤4)中，冻干过程具体为：先在-30～-10℃预冻8～12h后再在-60～-80℃下冻干22～26h，真空度为6～20Pa。

本发明的第二个目的是提供一种采用如上述所述的方法制备得到的藜麦皂苷提取物，所述藜麦皂苷提取物中包含皂苷，还包含脂肪、甘油酯等有机成分，这些有机成分是由于使用了有机溶剂而溶解出来的，所述皂苷包括齐墩果酸皂苷、常春藤皂苷和商陆皂苷，且皂苷的总含量高于10％。

本发明的第三个目的是提供一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

(Ⅰ)取皂苷提取物进行酸解得到皂苷元溶液，其中齐墩果酸皂苷酸解得到齐墩果酸，常春藤皂苷酸解得到常春藤皂苷元，商陆皂苷酸解得到商陆皂苷元，之后冻干溶解，得到上清液，复溶后的皂苷元沉淀很少，但仍存在部分沉淀，皂苷提取物中的皂苷水解后形成皂苷元，但是以水相甲醇相萃取的方式所得的皂苷元含量很低，不能准确地表达皂苷元含量，冻干将水去除，有利于皂苷元的复溶；

(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的上清液上色谱柱进行等度洗脱，同时进行检测扫描，利用保留时间定性，即先过柱分离物质，然后检测器检测被分离的物质，可看到检测对应波长下的出峰情况。皂苷提取物中含有齐墩果酸皂苷、常春藤皂苷和商陆皂苷，但是现阶段还没有相关的技术方法可直接使用液相方法检测这三种皂苷，也没有相关皂苷的标品，因此必须将这些皂苷酸解成皂苷元才能得到标品，也才能使用液相法进行检测。

步骤(Ⅰ)中，酸解过程具体为：取皂苷提取物，加入HCl溶液后90～100℃水浴1～2h，之后再调节pH。

HCl溶液的浓度为1～2mol/L，采用浓度为1mol/L的NaOH溶液进行pH的调节。

步骤(Ⅰ)中，采用甲醇进行溶解。

步骤(Ⅰ)中，冻干的温度为-60～-80℃，冻干的时间为22～26h。

步骤(Ⅱ)中，所述色谱柱中的流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，所述流动相A为乙腈+0.05％TFA的混合，所述流动相B为纯水+0.05％TFA的混合，所述流动相C为体积比为1:1的甲醇和水的混合。

步骤(Ⅱ)中，所述色谱柱为XTERRARP C18(250×4.6mm，5μm)，所述等度洗脱参数为：洗脱时间为0～25min，流动相A，体积浓度为80～95％(在洗脱时，需将流动相A和流动相B混合，此体积浓度是指混合后的相中流动相A的比例)；流速为0.4mL/min；柱温箱温度为25℃；进样量为20μL，流动相A和流动相B关于洗脱时间、流速、柱温箱温度的参数均一致，流动相C主要用于清洗进样针，因此不对其相关参数进行限定，按一般参数即可。

本发明先自行从藜麦中提取皂苷，以保证之后分离鉴定实验的准确性与可信度以及可行性，再进行酸解，使得皂苷糖基与皂苷元断裂分离，最终不同皂苷元可以通过液相进行分离鉴定，三种皂苷元的标准曲线线性关系良好(R²>0.999)，保留时间相对标准偏差(RSD)均小于0.1％，含量测定相对标准偏差(RSD)均小于5％。可根据以下换算公式，通过皂苷元含量来定量藜麦皂苷的含量。因此，本发明为藜麦皂苷的测定提供了一种简便快捷准确的方法。

(1)齐墩果酸皂苷：M1＝C1V1×800/457

(2)常春藤皂苷：M2＝C2V2×800/473

(3)商陆皂苷：M3＝C3V3×800/533

其中，公式中C1、C2、C3为经高效液相法分离后获得的上清液中所得皂苷元浓度；V1、V2、V3为三者甲醇复溶体积；800为藜麦皂苷平均分子量；457、473、533分别为齐墩果酸、常春藤皂苷元与商陆皂苷元的相对分子量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明可准确测定藜麦中的齐墩果酸皂苷、常春藤皂苷与商陆皂苷的含量，方法操作简单、可重复性好、设备要求简单。1.本发明先使用甲醇提取、正丁醇纯化得到藜麦皂苷提取物，提取物的纯度高(即在提取物中皂苷的含量高)，且制备方法相比旧方法效果更好，速度更快；2.本发明中藜麦皂苷提取物与盐酸混合酸解，冻干后用甲醇复溶，得到皂苷元溶液，改善了藜麦皂苷组成复杂且不易出峰的情况。3.本发明提供了一种利用反相高效液相色谱法等度洗脱测量藜麦中主要皂苷元(齐墩果酸、商陆皂苷元和常春藤皂苷元)的方法，改变了藜麦皂苷含量与类型难以鉴定的困难，为藜麦皂苷的测定提供了简便快捷的方法。4.本发明可以进行大批量实验(本发明可直接提取上百克重的藜麦，而已报道的相关专利或文献的提取对象一般是1g左右的藜麦粉)，且重复性良好。

附图说明

图1为实施例1中齐墩果酸、常春藤皂苷元和商陆皂苷元标准品的高效液相色谱图结果；

图2为实施例1中甲醇复溶的白藜麦皂苷元粗品的高效液相结果；

图3为实施例2中甲醇复溶的白藜麦皂苷元粗品的高效液相结果；

图4为实施例3中甲醇复溶的黑藜麦皂苷元粗品的高效液相结果；

图5为对比例1中甲醇复溶的白藜麦皂苷元粗品的高效液相结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实施例。

本实施例所用材料和试剂包括：齐墩果酸标准品、常春藤皂苷元标准品、商陆皂苷元标准品，均购自上海源叶生物科技有限公司；正己烷、甲醇、正丁醇、盐酸、色谱级甲醇、色谱级乙腈，均购自国药集团。

本实施例所用仪器设备包括：研磨机；岛津LC，号为SHIMADZU Essentia LC-16；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂RE-2000A；色谱柱为XTERRA RP C18(250×4.6mm，5μm)。

一种利用藜麦制备皂苷的方法，所述方法具体包括以下步骤：

1)取藜麦粉和脱脂剂搅拌1～2h得到混合液，以4000～5000rpm的速率离心10～15min后取下层沉淀物在通风橱中通风24～30h进行干燥，其中，脱脂剂采用正己烷或石油醚，藜麦粉和脱脂剂的料液比为1:2.5～4.0(w/v)；

2)取干燥后的样品加入提取剂中，依次进行水浴(40～50℃、1～2h)、超声(30～40kHz、1～2h)和离心(4000～5000rpm、10～15min)，将得到的上清液浓缩(40～50℃、80～110rpm)得到浓缩液，其中，藜麦粉和提取剂的料液比为1:10～15(w/v)；

3)往浓缩液中加入体积比为1:2～3(v/v)的水和纯化剂，依次进行涡旋(2500～3000rpm、1～2min)和离心(4000～5000rpm、10～15min)后取上层溶液，之后重复操作，此步骤是为了进行纯化，因为浓缩液中有很多醇溶性物质，导致皂苷含量特别低；

4)收集步骤3)中得到的上层溶液并蒸干(55～65℃、80～110rpm)，之后冻干(先在-30～-10℃预冻8～12h后在-60～-80℃下冻干22～26h，真空度为6～20Pa)，得到藜麦皂苷提取物，冻干有利于后续进行酸解，使皂苷提取物有更好的酸解效果。

本发明的第二个目的是提供一种采用如上述所述的方法制备得到的藜麦皂苷提取物，藜麦皂苷提取物中包含皂苷，还包含脂肪、甘油酯等有机成分，皂苷包括齐墩果酸皂苷、常春藤皂苷和商陆皂苷，且皂苷的总含量高于10％。

本发明的第三个目的是提供一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

(Ⅰ)取藜麦皂苷提取物，加入酸后90～100℃水浴1～2h进行酸解，之后再调节pH，得到皂苷元溶液，之后在-60～-80℃下冻干22～26h溶解，得到上清液；

(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的上清液上色谱柱进行等度洗脱，同时进行检测扫描，利用保留时间定性，其中，色谱柱中的流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，流动相A为乙腈+0.05％TFA的混合，流动相B为纯水+0.05％TFA的混合，流动相C为体积比为1:1的甲醇和水的混合，等度洗脱参数为：洗脱时间为0～25min，流动相A，体积浓度为80～95％；流速为0.4mL/min；柱温箱温度为25℃；进样量为20μL。

实施例1

一种利用藜麦制备皂苷的方法，具体包括以下步骤：

取100g白藜麦在研磨机中研磨80s，制得100g藜麦粉。所得藜麦粉与正己烷以1：3(w/v)的料液比例混合，搅拌2h得到混合均匀的混合液，然后将混合液以5000rpm的转速离心15min，取下层沉淀物，在通风橱中室温通风干燥24h。往脱脂后的样品中按1:15(w/v)的料液比例加入甲醇纯溶液，以40kHz的频率超声1h(超声同时进行水浴，温度为45℃)后离心(转速为5000rpm，时间为15min)，取上清液，将收集到的上清液利用旋转蒸发仪旋蒸浓缩，旋转蒸发仪设置的温度为55℃，转速为100rpm(具体旋蒸的时间根据旋蒸每次环境、升温速率以及旋蒸用的容器体积大小进行设定，下同)。往得到的浓缩液中以1:10(v/v)的体积比加入超纯水，然后按水:正丁醇＝1:3(v/v)的体积比再加入正丁醇，以2800rpm的转速涡旋1min之后，再在5000rpm的转速下离心15min取上层溶液，在相同比例下重复操作1次后收集。收集最后得到的上层溶液，利用旋转蒸发仪旋蒸浓缩，旋转蒸发仪设置的温度为65℃，转速为100rpm，蒸干后加少量水溶解倒出(本实施例中的冻干机无法冻干醇溶液，因此需要旋蒸水溶)，-20℃预冻10h后再在-70℃和8Pa的真空度下冻干24h，得到650.6mg藜麦皂苷提取物，并在-20℃冰箱中干燥避光保存。

将得到的藜麦皂苷提取物进行分离鉴定，具体步骤如下：

1)藜麦皂苷元的提取

称取10mg前文制备的藜麦皂苷提取物，加入配好的0.5mL HCl溶液(浓度为2mol/L)，放入水浴锅中100℃水浴1h进行水解，再加入1mL NaOH溶液(浓度为1mol/L)，之后将整个反应体系在-70℃下冻干24h后用甲醇溶解，12000rpm的转速下离心10min后取1.5mL上清液(即换算公式中V1＝V2＝V3＝1.5mL)。

2)反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦粉麸皮中的齐墩果酸、常春藤皂苷元和商陆皂苷元

A.色谱条件

色谱柱：XTERRA RP C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A相，还含0.05％TFA)，水(B相，还含0.05％TFA)；洗脱程序：0～25min，95％A；流速为0.4mL/min；柱温箱为25℃；进样量：20μL。

B.反相高效液相色谱法分析结果

混合标准品采用相同的色谱条件得到的液相图如图1所示，由图1可见，齐墩果酸、常春藤皂苷元和商陆皂苷元分离且具有良好的出峰情况，具体出峰时间为：商陆皂苷元：9.223min，常春藤皂苷元：14.355min，齐墩果酸：20.116min。商陆皂苷元的标准曲线为：y＝3*10^7x+306915，R²＝0.9994；常春藤皂苷元的标准曲线为：y＝2*10^7x+202547，R²＝0.9998；齐墩果酸的标准曲线为：y＝2*10^7x+18662，R²＝0.9998。x表示各皂苷元通过高效液相所得的对应峰面积，y代表各皂苷元的浓度，单位为mg/mL。

本实施例分析得到的样品的液相图如图2所示。图2中显示在9.223min处、14.355min处和20.116min处分别有明显峰(虽然有些偏移，但都属于合理范围)，与混合标准品的液相图一致。因此，可确定酸解样品中含有商陆皂苷元、常春藤皂苷元跟齐墩果酸三种皂苷元。本实施例中，通过标曲可得到上清液中商陆皂苷元的浓度C3为0.6347mg/mL，常春藤皂苷元的浓度C2为0.2173mg/mL，齐墩果酸的浓度C1为0.1007mg/mL，经换算公式可得到皂苷提取物中商陆皂苷的含量为M3＝0.6347*1.5*800/533＝1.429mg，常春藤皂苷的含量为M2＝0.2173*1.5*800/473＝0.551mg，齐墩果酸皂苷的含量为M1＝0.1007*1.5*800/457＝0.264mg，由此可知皂苷提取物中这三种皂苷的占比为(1.429mg+0.551mg+0.264mg)/10mg*100％＝22.44％，而国内外相关的专利或文献中能得到总皂苷含量占提取物10％以上的不多，一般为8％左右，而本发明所提供的制备方法可得到皂苷含量大于10％的藜麦皂苷提取物。

实施例2

一种利用藜麦制备皂苷的方法，除了将藜麦粉和正己烷的料液比例改为1:2.5(w/v)；往脱脂后的样品中按1:10(w/v)的料液比例加入甲醇纯溶液之外，其余部分完全同实施例1。

将得到的藜麦皂苷提取物进行分离鉴定，具体步骤如下：

1)藜麦皂苷元的提取

除了水解时水浴时间为2h，此步骤其余部分完全同实施例1。

2)反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦粉中的齐墩果酸、常春藤皂苷元和商陆皂苷元

A.色谱条件

色谱条件完全同实施例1。

B.反相高效液相色谱法分析结果

本实施例分析得到的样品的液相图如图3所示，显示在标品峰处分别有明显峰，因此，确定酸解样品中含有商陆皂苷元、常春藤皂苷元跟齐墩果酸三种皂苷元，最后计算得到的三种皂苷的含量和实施例1所得的含量基本接近。

实施例3

一种利用藜麦制备皂苷的方法，除了采用的原料为黑藜麦之外，其他参数及步骤同实施例1。

将得到的藜麦皂苷提取物进行分离鉴定的步骤也完全同实施例1。

本实施例分析得到的样品的液相图如图4所示，显示在标品峰处分别有明显峰，显示黑藜麦皂苷酸解液中也含有商陆皂苷元、常春藤皂苷元跟齐墩果酸三种皂苷元，通过标曲可得到上清液中商陆皂苷元的浓度C3为0.7447mg/mL，常春藤皂苷元的浓度C2为0.3447mg/mL，齐墩果酸的浓度C1为0.0707mg/mL，经换算公式可得到皂苷提取物中商陆皂苷的含量为M3＝0.7447*1.5*800/533＝1.677mg，常春藤皂苷的含量为M2＝0.3447*1.5*800/473＝0.874mg，齐墩果皂苷酸的含量为M1＝0.0707*1.5*800/457＝0.1856mg，由此可知皂苷提取物中这三种皂苷的占比为(1.677mg+0.874mg+0.1856mg)/10mg*100％＝27.37％。可看到，从黑藜麦中提取得到的三种皂苷各自的含量分别与从白藜麦中提取得到的三种皂苷的含量对应接近，且皂苷含量也大于10％。

对比例1

本对比例采用和实施例1相同的方法制备得到藜麦皂苷提取物，在取藜麦皂苷提取物进行反相高效液相色谱法分离鉴定时，除了不进行水解之外，其余均与实施例1相同，所得的液相图如图5所示，可看到，只出现了一个特征峰，此特征峰为杂质峰，主要可能为脂肪酸甘油酸之类，另外其他皂苷元的峰不明显或者没有，表明不进行酸解的话，液相法便难以检测到皂苷或皂苷元。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用藜麦制备皂苷的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)取藜麦粉和脱脂剂搅拌得到混合液，离心后取下层沉淀物进行干燥；

2)取干燥后的样品加入提取剂中，依次进行水浴、超声和离心，将得到的上清液浓缩得到浓缩液；

3)往浓缩液中加入水和纯化剂，依次进行涡旋和离心后取上层溶液，之后重复操作；

4)收集步骤3)中得到的上层溶液并蒸干，之后冻干，得到藜麦皂苷提取物。

2.根据权利要求1所述的利用藜麦制备皂苷的方法，其特征在于，步骤1)中，所述脱脂剂采用正己烷或石油醚；

步骤1)中，所述藜麦粉和脱脂剂的料液比为1:2.5～4.0(w/v)；

步骤1)中，离心的速率为4000～5000rpm，离心的时间为10～15min；

步骤1)中，在通风橱中通风干燥24～30h。

3.根据权利要求1所述的利用藜麦制备皂苷的方法，其特征在于，步骤2)中，所述提取剂采用甲醇；

步骤2)中，所述藜麦粉和提取剂的料液比为1:10～15(w/v)；

步骤2)中，水浴的温度为40～50℃，水浴的时间为1～2h；

步骤2)中，超声的频率为30～40kHz，超声的时间为1～2h；

步骤2)中，离心的速率为4000～5000rpm，离心的时间为10～15min；

步骤2)中，上清液采用旋转蒸发仪进行浓缩，旋转蒸发仪设置的温度为40～50℃，转速为80～110rpm。

4.根据权利要求1所述的利用藜麦制备皂苷的方法，其特征在于，步骤3)中，所述纯化剂采用正丁醇；

步骤3)中，水和纯化剂的体积比为1:2～3(v/v)；

步骤3)中，涡旋的转速为2500～3000rpm，涡旋的时间为1～2min；

步骤3)中，离心的速率为4000～5000rpm，离心的时间为10～15min。

5.根据权利要求1所述的利用藜麦制备皂苷的方法，其特征在于，步骤4)中，采用旋转蒸发仪进行蒸干，旋转蒸发仪设置的温度为55～65℃，转速为80～110rpm；

步骤4)中，冻干过程具体为：先在-30～-10℃预冻8～12h后再在-60～-80℃下冻干22～26h，真空度为6～20Pa。

6.一种采用如权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的藜麦皂苷提取物，其特征在于，所述藜麦皂苷提取物中包含皂苷，所述皂苷包括齐墩果酸皂苷、常春藤皂苷和商陆皂苷。

7.一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定如权利要求6所述的藜麦皂苷提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(Ⅰ)取藜麦皂苷提取物进行酸解得到皂苷元溶液，之后冻干溶解，得到上清液；

(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的上清液上色谱柱进行等度洗脱，同时进行检测扫描，利用保留时间定性。

8.根据权利要求7所述的一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，酸解过程具体为：取皂苷提取物，加入HCl溶液后90～100℃水浴1～2h，之后再调节pH；

步骤(Ⅰ)中，采用甲醇进行溶解；

步骤(Ⅰ)中，冻干的温度为-60～-80℃，冻干的时间为22～26h。

9.根据权利要求7所述的一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，其特征在于，步骤(Ⅱ)中，所述色谱柱中的流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，所述流动相A为乙腈+0.05％TFA的混合，所述流动相B为纯水+0.05％TFA的混合，所述流动相C为体积比为1:1的甲醇和水的混合。

10.根据权利要求9所述的一种利用反相高效液相色谱法分离鉴定藜麦皂苷提取物的方法，其特征在于，步骤(Ⅱ)中，所述等度洗脱参数为：洗脱时间为0～25min，流动相A，体积浓度为80～95％；流速为0.4mL/min；柱温箱温度为25℃；进样量为20μL。

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