CN112505230B - 一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离及鉴别方法 - Google Patents

一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离及鉴别方法，包括清热养阴活血祛瘀口服液供试品溶液的成分分离：取脉络宁口服液，调节pH值至6～8，取不超过1倍柱体积上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用1～3倍柱体积水抽洗，直至抽干，弃去水液，依次用2～3倍柱体积20％甲醇、1～3倍柱体积40％甲醇、1～3倍柱体积60％甲醇、1～3倍柱体积甲醇抽洗，每次均抽干，收集各洗脱液；取20％甲醇洗脱液进行牛膝鉴别，取40％甲醇洗脱液进行山银花鉴别，取60％甲醇洗脱液进行金银花鉴别，取甲醇洗脱液进行石斛鉴别。本发明操作方便、快速准确、特征性强、耐用性良好，可以作为评价清热养阴活血祛瘀口服液质量的有效方法。

Description

一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离及鉴别方法
技术领域
本发明属于食品、保健品、药品及医疗领域，涉及一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离及鉴别方法。
背景技术
脉络宁口服液由金银花、山银花、石斛、牛膝、玄参等5味药材制成，具有清热养阴、活血化瘀的作用。用于血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等病。药理研究显示：脉络宁口服液具有保护心、脑血管组织、抗血栓形成、改善微循环及改善血液流变性等作用。
脉络宁口服液的药学研究相对比较薄弱，质量标准所载薄层色谱鉴别方法中指标性成分的特征性较弱。2010年版《中国药典》将金银花、山银花单列，脉络宁口服液中含有金银花、山银花，仅以绿原酸作为指标性成分来鉴别金银花药材已无法符合现行药典要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清热养阴活血祛瘀的脉络宁口服液成分分离及鉴别方法，选择β-蜕皮甾酮为指标性成分进行牛膝药材的薄层色谱鉴别，选择灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙为指标性成分进行山银花药材的薄层色谱鉴别，选择木犀草苷为指标性成分进行金银花药材的薄层色谱鉴别，选择石斛酚为指标性成分、采用高效液相色谱法进行石斛药材的鉴别。
发明人采用聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，即柱体积6mL；上样前预处理：分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)对脉络宁口服液进行洗脱分离。脉络宁口服液质量标准中pH值规定的范围为5.0～7.0，不同批次的脉络宁口服液的pH值存在一定的差异。针对固相萃取技术，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留，而目标物的离子化程度则与pH值有关。为减少不同批次脉络宁口服液经聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱洗脱后结果的差异，在洗脱前调节脉络宁口服液的pH值为6～8，优选为7。金银花对照药材和山银花对照药材也需经聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱洗脱，为确保和脉络宁口服液洗脱成分的一致性，在洗脱前调节两者提取液的pH值为6～8，优选为7。
发明人分别选取20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、甲醇等溶剂进行洗脱，并对各溶剂的洗脱体积和洗脱成分进行筛选：
脉络宁口服液洗脱液中β-蜕皮甾酮考察
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用6mL水抽洗，直至抽干，弃去水液；用18mL 20％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续用18mL 40％甲醇分三次抽洗，每次6mL；每次均抽干，收集各洗脱液。分别吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液、各洗脱液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，晾干，显色，见图1。表明，20％甲醇第一次洗脱液中明显可见与对照品色谱相应的斑点，20％甲醇第二次洗脱液中的色谱斑点较弱，而20％甲醇第三次洗脱液及40％甲醇三次洗脱液中均未见与对照品色谱对应的斑点，故采用6～12mL，优选采用12mL20％甲醇洗脱，洗脱液浓缩后制得溶液作为鉴别牛膝药材的供试品溶液。
脉络宁口服液洗脱液中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙考察
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用6mL水抽洗，直至抽干，弃去水液；用18mL 20％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续用18mL 40％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续用18mL 60％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续用18mL甲醇分三次抽洗，每次6mL；每次均抽干，收集各洗脱液。分别吸取灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙混合对照品溶液10μL、各部分洗脱液5μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，展开，晾干，显色，结果见图2。表明，40％甲醇洗脱液中可见与对照品相应的清晰斑点，20％甲醇洗脱液、60％甲醇洗脱液、甲醇洗脱液中与对照品相应的斑点较弱，采用40％甲醇洗脱液已可对灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙进行鉴别。因此，采用合并40％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为鉴别山银花药材的供试品溶液。
脉络宁口服液洗脱液中木犀草苷考察
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用6mL水抽洗，直至抽干，弃去水液；用18mL 20％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续18mL用40％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续18mL用60％甲醇分三次抽洗，每次6mL；继续用18mL甲醇分三次抽洗，每次6mL；每次均抽干，收集各洗脱液。分别吸取木犀草苷对照品溶液、各部分洗脱液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，展开，晾干，显色，结果见图3。表明，60％甲醇洗脱液中可见与对照品相应的清晰斑点，20％甲醇洗脱液中未见与对照品相应的斑点，40％甲醇洗脱液、甲醇洗脱液中有极少量与对照品相应的斑点。因此，考虑合并60％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇2mL溶解，作为鉴别金银花药材的供试品溶液。
不同浓度甲醇对石斛酚洗脱效果考察
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用6mL水抽洗，直至抽干，弃去水液，继续依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇及甲醇各12mL洗脱，收集各洗脱液，分别进样，检测石斛酚，HPLC色谱图见图10。结果表明20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇的洗脱液中均未检出石斛酚，甲醇洗脱液中能明确检出石斛酚，说明60％甲醇杂质净化效果和石斛酚富集效果最佳。
甲醇洗脱体积对石斛酚的洗脱效果考察
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，依次用6mL水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇各18mL洗脱，直至抽干，弃去洗脱液；继续用甲醇18mL洗脱，分3次收集，每次6mL，收集甲醇洗脱液，分别进样，测定石斛酚峰面积值。结果表明，甲醇6mL已能将石斛酚大部分洗脱，因此采定用甲醇6mL洗脱，收集洗脱液，作为鉴别石斛的供试品溶液。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，包括清热养阴活血祛瘀口服液(即脉络宁口服液)供试品溶液的成分分离：取脉络宁口服液，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6～8，取不超过1倍柱体积上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用1～3倍柱体积水抽洗，直至抽干，弃去水液，依次用2～3倍柱体积20％甲醇、1～3倍柱体积40％甲醇、1～3倍柱体积60％甲醇、1～3倍柱体积甲醇抽洗，每次均抽干，收集各洗脱液；取20％甲醇洗脱液进行牛膝鉴别，取40％甲醇洗脱液进行山银花鉴别，取60％甲醇洗脱液进行金银花鉴别，取甲醇洗脱液进行石斛鉴别。
所述的聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱的规格500mg/6mL。上样前对聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱进行预处理：分别用甲醇和水各3倍柱体积抽洗，直至抽干。
优选的，取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5/6倍柱体积上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用1倍柱体积水抽洗，直至抽干，弃去水液，依次用2倍柱体积20％甲醇、3倍柱体积40％甲醇、3倍柱体积60％甲醇、1倍柱体积甲醇抽洗，每次均抽干，收集各洗脱液。
采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材牛膝，包括：
供试品溶液制备：取20％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为供试品溶液；
β-蜕皮甾酮对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成β-蜕皮甾酮浓度1mg/mL的对照品溶液；
对照药材溶液的制备:取牛膝对照药材粉末1g，加80％甲醇10～100mL，加热回流1～6小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～30mL，微热使溶解，上D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，依次用100mL水、100mL 20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，用80％乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇溶解，作为对照药材溶液；
牛膝薄层色谱鉴别：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、β-蜕皮甾酮对照品溶液、对照药材溶液5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材山银花，包括：
供试品溶液制备：取40％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品，加50％甲醇制成含灰毡毛忍冬皂苷乙浓度0.6mg/1mL、川续断皂苷乙浓度0.2mg/1mL的混合对照品溶液；
对照药材溶液的制备:取山银花对照药材1g，加50％乙醇10～60mL加热(90℃)回流0.5～4小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，加5mL水溶解，转速5000转/分钟离心5～30分钟，上清液调节pH值至6～8，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，上样前分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)，依次用12mL水、12mL20％甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液，继续用12mL 40％甲醇抽洗(滴速约2滴/秒)，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为山银花对照药材溶液；
山银花薄层色谱鉴别：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液2～5μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板(青岛海洋或德国MERCK)上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材金银花，包括：
供试品溶液制备：取60％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取木犀草苷对照品，加70％乙醇制成木犀草苷浓度0.1mg/1mL的对照品溶液；
对照药材溶液的制备:取金银花对照药材1g，加70％乙醇10～100mL，超声处理(功率500W，频率40kHz)0.5～4小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加5mL水溶解，过滤，滤液转速5000转/分钟离心5～30分钟，上清液调节pH值至6～8，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，上样前分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)，依次用12mL水、12mL20％甲醇、12mL 40％甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液，继续用12mL 60％甲醇抽洗(滴速约2滴/秒)，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇溶解，作为金银花对照药材溶液。
金银花薄层色谱鉴别：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
采用高效液相色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材石斛，包括：
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈－0.05％三氟乙酸溶液(35:65V/V)，流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长206nm；理论板数按石斛酚峰计算应不低于6000；
供试品溶液的制备：取甲醇洗脱液，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取石斛酚对照品，加甲醇制成石斛酚浓度10μg/1mL的对照品溶液；
测定法：量取供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪；供试品高效液相色谱图中，应出现与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰。
所述的色谱柱优选为Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
本发明的有益效果：
本发明采用聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱对脉络宁口服液中各指标性成分进行提取分离，将脉络宁口服液中牛膝药材指标性成分β-蜕皮甾酮，山银花药材指标性成分灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙，金银花药材指标性成分木犀草苷，石斛药材中石斛酚富集在特定洗脱液中，并针对牛膝药材指标性成分β-蜕皮甾酮，山银花药材指标性成分灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙，金银花药材指标性成分木犀草苷建立薄层色谱鉴别方法，针对石斛药材中石斛酚建立HPLC鉴别方法。
本发明方法操作方便、快速准确、特征性强、耐用性良好，可以作为评价脉络宁口服液质量的有效方法。
附图说明
图1为脉络宁口服液洗脱液中β-蜕皮甾酮考察；其中，1、β-蜕皮甾酮对照品，2、20％甲醇第一次洗脱液，3、20％甲醇第二次洗脱液，4、20％甲醇第三次洗脱液，5、40％甲醇第一次洗脱液，6、40％甲醇第二次洗脱液，7、40％甲醇第三次洗脱液。
图2为脉络宁口服液洗脱液中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙考察；其中，1、混合对照品，2、20％甲醇第一次洗脱液，3、20％甲醇第二次洗脱液，4、20％甲醇第三次洗脱液，5、40％甲醇第一次洗脱液，6、40％甲醇第二次洗脱液，7、40％甲醇第三次洗脱液，8、混合对照品，9、60％甲醇第一次洗脱液，10、60％甲醇第二次洗脱液，11、60％甲醇第三次洗脱液，12、甲醇第一次洗脱液，13、甲醇第二次洗脱液，14、甲醇第三次洗脱液。
图3为脉络宁口服液洗脱液中木犀草苷考察；其中，1、木犀草苷对照品，2、20％甲醇第一次洗脱液，3、20％甲醇第二次洗脱液，4、20％甲醇第三次洗脱液，5、40％甲醇第一次洗脱液，6、40％甲醇第二次洗脱液，7、40％甲醇第三次洗脱液，8、木犀草苷对照品，9、60％甲醇第一次洗脱液，10、60％甲醇第二次洗脱液，11、60％甲醇第三次洗脱液，12、甲醇第一次洗脱液，13、甲醇第二次洗脱液，14、甲醇第三次洗脱液。
图4为β-蜕皮甾酮鉴别专属性考察；其中，1、β-蜕皮甾酮对照品，2、牛膝对照药材，3、供试品，4、阴性(缺牛膝)，5、供试品+对照品。
图5为脉络宁口服液中牛膝的薄层色谱图；其中，a、β-蜕皮甾酮对照品，b、牛膝对照药材，c、脉络宁口服液20％甲醇洗脱液。
图6为灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙鉴别专属性考察；其中，1、阴性(缺山银花)，2、山银花对照药材，3、混合对照品，4、供试品，5、供试品+对照品。
图7为脉络宁口服液中山银花的薄层色谱图；其中，a、山银花对照药材，b、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品，c、脉络宁口服液40％甲醇洗脱液。
图8为木犀草苷鉴别专属性考察；其中，1、阴性(缺金银花)，2、木犀草苷对照品，3、金银花对照药材，4、供试品。
图9为脉络宁口服液中金银花的薄层色谱图(a、金银花对照药材，b、木犀草苷对照品，c、脉络宁口服液60％甲醇洗脱液)
图10为脉络宁口服液中石斛酚鉴别不同浓度甲醇洗脱效果考察的HPLC色谱图。
图11为脉络宁口服液中石斛酚鉴别专属性HPLC色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
清热养阴活血祛瘀的口服液成分分离
取脉络宁口服液适量，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，取5mL上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，上样前分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)，用6mL水抽洗，直至抽干，弃去水液，继续分别用12mL 20％甲醇、18mL 40％甲醇、18mL 60％甲醇、6mL甲醇先后抽洗(滴速约2滴/秒)，每次均抽干，收集各洗脱液。
清热养阴活血祛瘀的口服液中牛膝、山银花、金银花、石斛的鉴别方法：
1.1牛膝薄层色谱法鉴别
1.1.1供试品溶液的制备：取脉络宁口服液20％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加2mL50％乙醇溶解，作为供试品溶液。
1.1.2β-蜕皮甾酮对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的对照品溶液。
1.1.3牛膝对照药材溶液的制备:取牛膝对照药材粉末1g，加80％甲醇30mL，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，微热使溶解，上D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，用100mL水洗脱，弃去水液，再用100mL 20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继续用100mL 80％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％甲醇1mL溶解，作为对照药材溶液。
1.1.4展开剂的选择
吸取上述β-蜕皮甾酮对照品溶液5μL，供试品溶液、牛膝对照药材溶液各10μL，点于硅胶G薄层板上，分别以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(7:3:0.5:0.05V/V/V/V)，乙酸乙酯-乙醇-甲酸(4:1:0.05V/V/V)，乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)三种展开系统展开，取出薄层板晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。结果，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂时，斑点分离效果好且清晰。
1.1.5β-蜕皮甾酮考察
吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液5μL，牛膝对照药材溶液10μL，20％甲醇洗脱液、40％甲醇洗脱液20μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。结果可知β-蜕皮甾酮主要在20％甲醇洗脱液、40％甲醇洗脱液的薄层色谱图中未见对应斑点。故脉络宁口服液的20％甲醇洗脱液中的指标性成分为β-蜕皮甾酮。
1.1.6重复性试验
依据“1.1.1”项下的制备方法，分别制备5份供试品溶液。吸取上述β-蜕皮甾酮对照品溶液5μL，供试品溶液、牛膝对照药材溶液各10μL，点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。5份供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.1.7耐用性试验
吸取上述β-蜕皮甾酮对照品溶液5uL，供试品溶液、牛膝对照药材溶液各10μL，分别点于硅胶G薄层板(青岛海洋、安徽良臣)、高效硅胶G薄层板(青岛海洋)等3块薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。结果，3种薄层板所显斑点无明显区别。
1.1.8专属性试验
按照脉络宁口服液配方量称取除牛膝外四味药材，以脉络宁口服液工艺制备阴性样品(缺牛膝)，照供试品溶液制备方法，制得阴性溶液(缺牛膝)。分别吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液3μL，牛膝对照药材溶液、供试品溶液、阴性溶液(缺牛膝)、加β-蜕皮甾酮对照品的供试品溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，展开，显色，见图4。
结果可见，阴性溶液(缺牛膝)对本方法无干扰，供试品在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.1.9牛膝薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液、供试品溶液、牛膝对照药材溶液5～10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇(4:1V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。供试品色谱(图5)中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.2山银花薄层色谱法鉴别
1.2.1供试品溶液制备：取脉络宁口服液40％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加5mL50％乙醇溶解，作为供试品溶液。
1.2.2对照品溶液的制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品，加50％甲醇制成每1mL含灰毡毛忍冬皂苷乙0.6mg、川续断皂苷乙0.2mg的混合对照品溶液。
1.2.3对照药材溶液的制备:取山银花对照药材1g，加50％乙醇20mL加热(90℃)回流1小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，加水5mL溶解，离心(转速为每分钟5000转)10分钟，上清液用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，上样前分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)，依次用12mL水、12mL 20％甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液；继续用12mL 40％甲醇抽洗(滴速约2滴/秒)，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇2mL使溶解，作为山银花对照药材溶液。
1.2.4薄层板的选择
吸取灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品溶液5μL，山银花对照药材溶液、供试品溶液各2μL，分别点于硅胶G薄层板、高效硅胶G薄层板(青岛海洋)、硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。结果，硅胶G薄层板、硅胶H薄层板的分离效果较差，斑点模糊；高效硅胶G薄层板的分离效果好，斑点清晰。
1.2.5灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙考察
分别吸取对照品溶液、山银花对照药材溶液、20％甲醇洗脱液、40％甲醇洗脱液、60％甲醇洗脱液、甲醇洗脱液各10μL、分别点于高效硅胶G薄层板(青岛海洋)上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。结果可知，40％甲醇洗脱液的薄层色谱中可见对照品对应斑点，其他洗脱液的薄层色谱中未见对应斑点，故脉络宁口服液的40％甲醇洗脱液中的指标性成分为灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙。
1.2.6重复性试验
依据“1.2.1”项下的制备方法，分别制备5份供试品溶液。吸取灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品溶液5μL，山银花对照药材溶液、供试品溶液各2μL，分别点于高效硅胶G薄层板(青岛海洋)上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。5份供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.2.7专属性试验
按照脉络宁口服液配方量称取除山银花外四味药材，以脉络宁口服液工艺制备阴性样品(缺山银花)，照供试品溶液制备方法，制得阴性溶液(缺山银花)。分别吸取灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙混合对照品溶液5μL、山银花对照药材溶液5μL、供试品溶液5μL、阴性溶液(缺山银花)10μL、加灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品的供试品溶液10μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，展开，显色，结果见图6。
可见，阴性溶液(缺山银花)对本方法无干扰，供试品在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.2.8耐用性试验
吸取对照品溶液5μL、山银花对照药材溶液2μL、供试品溶液2μL，分别点于不同品牌的高效硅胶G薄层板(青岛海洋、德国MERCK、青岛鼎康、青岛胜海、烟台江友)上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。结果，青岛海洋和德国MERCK高效硅胶G薄层板的分离效果好，斑点清晰，其他品牌的高效硅胶G薄层板的分离效果差。最终，选择青岛海洋或德国MERCK的高效硅胶G薄层板。
2.2.9山银花薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，分别吸取对照品溶液、供试品溶液、牛膝对照药材溶液2～5μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板(青岛海洋或德国MERCK)上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱(图7)中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
1.3金银花薄层色谱法鉴别
1.3.1供试品溶液制备：取脉络宁口服液60％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50％乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。
1.3.2对照品溶液的制备：取木犀草苷对照品，加70％乙醇制成每1mL含0.1mg的对照品溶液。
1.3.3对照药材溶液的制备：取金银花对照药材1g，加70％乙醇50mL，超声处理(功率500W，频率40kHz)1小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加5mL水溶解，过滤，滤液离心(转速为每分钟5000转)10分钟，上清液用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱(规格500mg/6mL，上样前分别用甲醇和水各18mL抽洗，直至抽干)，依次用12mL水、12mL 20％甲醇、12mL 40％甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液，继续用12mL60％甲醇抽洗(滴速约2滴/秒)，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加2mL 50％乙醇溶解，作为金银花对照药材溶液。
1.3.4木犀草苷的考察
分别吸取木犀草苷对照品溶液、金银花对照药材溶液、20％甲醇洗脱液、40％甲醇洗脱液、60％甲醇洗脱液、甲醇洗脱液各2μL，分别点于聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。结果可知，60％甲醇洗脱液的薄层色谱中可见对照品对应斑点，其他洗脱液的薄层色谱中未见对应斑点，故脉络宁口服液的60％甲醇洗脱液中的指标性成分为木犀草苷。
1.3.5专属性试验
按照脉络宁口服液配方量称取除金银花外四味药材，以脉络宁口服液工艺制备阴性样品(缺金银花)，照供试品溶液制备方法制得阴性溶液(缺金银花)。分别吸取金银花对照药材溶液、木犀草苷对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液(缺金银花)各2μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1V/V/V)为展开剂展开，显色，见图8。供试品在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性溶液(缺金银花)在相应位置无斑点，说明对本方法专属性较好。
1.3.6重复性试验
依据“1.3.1”项下的制备方法，分别制备5份供试品溶液。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。5份供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.3.7耐用性试验
吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各2μL，分别平行点于不同品牌聚酰胺薄膜(浙江四甲生化、武汉鑫思锐科技)上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。结果，2种品牌的聚酰胺薄膜所显斑点无明显差异。
1.3.8金银花薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水-冰醋酸(5:5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
1.4用高效液相色谱法鉴别石斛
1.4.1高效液相色谱条件：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈－0.05％三氟乙酸溶液(35:65V/V)，流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长206nm；理论板数按石斛酚峰计算应不低于6000。
1.4.2供试品溶液的制备：取脉络宁口服液的甲醇洗脱液，作为供试品溶液。
1.4.3对照品溶液的制备：取石斛酚对照品，加甲醇制成每1mL含10μg的对照品溶液。
1.4.4测定法：量取供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪。供试品高效液相色谱图中，应出现与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰。
1.4.5专属性试验
取除石斛外的四味药材按脉络宁口服液工艺制备阴性溶液(缺石斛)，量取石斛酚对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液(缺石斛)各20μL，分别注入液相色谱仪，HPLC色谱图见图11。结果表明，阴性溶液(缺石斛)高效液相色谱图中未出现与石斛酚峰相一致的色谱峰。脉络宁口服液供试品溶液中出现与石斛酚对照品色谱峰保留时间与吸收光谱一致的色谱峰。
特别需要指出的是，本发明的技术方案已经通过较佳实施例进行描述，本领域技术人员可以借鉴本文内容，在不脱离本发明内容、精神和范围内适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

Claims (9)

1.一种清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于包括清热养阴活血祛瘀口服液供试品溶液的成分分离：取清热养阴活血祛瘀口服液供试品溶液，调节pH值至6～8，取不超过1倍柱体积上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用1～3倍柱体积水抽洗，直至抽干，弃去水液，依次用2～3倍柱体积20%甲醇、1～3倍柱体积40%甲醇、1～3倍柱体积60%甲醇、1～3倍柱体积甲醇抽洗，每次均抽干，收集各洗脱液；取20%甲醇洗脱液进行牛膝鉴别，取40%甲醇洗脱液进行山银花鉴别，取60%甲醇洗脱液进行金银花鉴别，取甲醇洗脱液进行石斛鉴别；
其中，采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材金银花，包括：
供试品溶液制备：取60%甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50%乙醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取木犀草苷对照品，加70%乙醇制成木犀草苷浓度0.1mg/1mL的对照品溶液；
对照药材溶液的制备: 取金银花对照药材1g，加70%乙醇10～100mL，超声0.5～4小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加水溶解，过滤，滤液离心5～30分钟，上清液调节pH值至6～8，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，依次用12mL水、12mL 20%甲醇、12mL 40%甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液，继续用12mL 60%甲醇抽洗，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加50%乙醇溶解，作为金银花对照药材溶液；
金银花薄层色谱鉴别：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比为5:5:1的乙醇-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于取清热养阴活血祛瘀口服液供试品溶液适量，调节pH值至7，取5/6倍柱体积上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，用1倍柱体积水抽洗，直至抽干，弃去水液，依次用2倍柱体积20%甲醇、3倍柱体积40%甲醇、3倍柱体积60%甲醇、1倍柱体积甲醇抽洗，每次均抽干，收集各洗脱液。
3.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于上样前对聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱进行预处理：分别用甲醇和水各3倍柱体积抽洗，直至抽干。
4.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于所述的聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱的规格500mg/6mL。
5.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材牛膝，包括：
供试品溶液制备：取20%甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50%乙醇溶解，作为供试品溶液；
β-蜕皮甾酮对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成β-蜕皮甾酮浓度1mg/mL的对照品溶液；
对照药材溶液的制备: 取牛膝对照药材粉末1g，加80%甲醇10～100mL，加热回流1～6小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水5～30mL，微热使溶解，上D101型大孔吸附树脂柱，依次用100mL水、100mL 20%乙醇洗脱，弃去洗脱液，用80%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇溶解，作为对照药材溶液；
牛膝薄层色谱鉴别：吸取供试品溶液、β-蜕皮甾酮对照品溶液、对照药材溶液5～10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为4:1的乙酸乙酯-乙醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液加热显色；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
6.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于采用薄层色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材山银花，包括：
供试品溶液制备：取40%甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加50%乙醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品，加50%甲醇制成含灰毡毛忍冬皂苷乙浓度0.6mg/1mL、川续断皂苷乙浓度0.2mg/1mL的混合对照品溶液；
对照药材溶液的制备: 取山银花对照药材1g，加50%乙醇10～60mL加热回流0.5～4小时，放冷，过滤，滤液水浴蒸干，加水溶解，离心5～30分钟，上清液调节pH值至6～8，上聚苯乙烯/二乙烯苯固相萃取小柱，依次用12mL水、12mL 20%甲醇抽洗，直至抽干，弃去抽洗液，继续用12mL 40%甲醇抽洗，直至抽干，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加50%乙醇溶解，作为山银花对照药材溶液；
山银花薄层色谱鉴别：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液2～5μL，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以体积比为6:4:1的三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液加热，紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
7.根据权利要求6所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于所述的高效硅胶G 薄层板为青岛海洋或德国MERCK公司生产的高效硅胶G薄层板。
8.根据权利要求1所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于采用高效液相色谱法鉴别清热养阴活血祛瘀口服液中药材石斛，包括：
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为体积比为35:65的乙腈－0.05%三氟乙酸溶液，流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长206nm；理论板数按石斛酚峰计算应不低于6000；
供试品溶液的制备：取甲醇洗脱液，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取石斛酚对照品，加甲醇制成石斛酚浓度10μg/1mL的对照品溶液；
测定法：量取供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪；供试品高效液相色谱图中，应出现与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰。
9.根据权利要求8所述的清热养阴活血祛瘀口服液成分分离方法及鉴别方法，其特征在于色谱柱为Kromasil C18色谱柱，长度250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。
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