CN102486472A - 一种测定血清中药物活性成分的方法 - Google Patents

一种测定血清中药物活性成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属药物分析领域，涉及一种测定血清中药物活性成分的方法，尤其涉及测定血清中复方中药的活性成分的方法，本发明采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后大鼠血清、空白大鼠血清以及药物的提取液，测定该药物中能进入血液发挥药效的活性成分即药物的作用物质基础，并在此基础上确定这些作用物质基础在药物中的含量。本发明方法能将复方中药作为一个整体进行研究，分析血清中所含的来源于药物的化合物成分群，揭示药物的作用物质基础，并能测定药物活性成分的含量，具有稳定性和重现性好、可操作性强等优点。

Description

一种测定血清中药物活性成分的方法
技术领域
本发明属药物分析领域，涉及一种测定血清中药物活性成分的方法，尤其涉及测定血清中复方中药的活性成分的方法。 
背景技术
复方中药以其独特的疗效和较小的副作用，在临床上应用已经有数千年的历史。但是由于其中存在着众多的化学成分，使得对复方中药的作用物质基础以及复方中药的作用机制的研究相当困难。血清药物化学研究显示，中药中虽含有诸多成分，但只有被吸收入血的成分才能产生作用，被认为药物活性成分。传统中药多为口服给药，口服给药后药物成分或经过消化道直接吸收入血，或经肝微粒体酶代谢后入血，其活性成分以血液为介质输送到靶点，从而产生作用。血清中含有的成分被认为是中药在体内直接起作用的物质。自1992年Homma首次提出血清药物化学的概念以来(Homma M等Analytical Biochemistry 1992；202：179-187.)，血清药物化学已经已经在国际上获得广泛认可。 
麝香保心丸(国药准字Z31020068)主要含麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片。麝香保心丸是芳香温通类治疗胸痹(冠心病、心绞痛)的代表复方中药药物，因其疗效确切、安全方便、价格经济，而成为治疗冠心病、心绞痛的常用药物之一。据统计，麝香保心丸在芳香温通类治疗胸痹的中药中稳居第一，是唯一在全国拥有较高知名度的独家传统中药大品种。所述复方中药的药物活性成分测定已受到本领域研究者的关注。 
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血清中药物活性成分的方法，具体涉及一种测定血清中治疗心血管疾病的复方中药的活性成分的方法。 
本发明所涉及的治疗心血管疾病的复方中药是麝香保心丸(国药准字Z31020068)主要含下述原料药组分：麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片，目前该药物的作用物质基础仍然不明确。 
由于中药成分复杂，导致药物作用物质基础不明确。现有对中药的药效成分研究多偏重于单个成分的药理药效评价，脱离了中医整体协同作用的理论。本发明将复方中药作为一个整体进行研究，本发明采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后大鼠血清、空白大鼠血清以及药物的提取液，测定该药物中能进入血液发挥药效的活性成分即药物的作用物质基础，并在此基础上确定这些作用物质基础在药物中的含量。 
本发明方法包括如下步骤： 
1.配制药物提取液 
取500mg药物粉末，用6.5ml混合溶剂超声提取后12000r/min离心，上清液过0.45μm滤膜过滤，得到配制的药物提取液； 
本发明在制备药物提取液中，采用的混合溶剂及其比例为甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5(V/V)，超声时间为20min。 
2.制备空白血清样品 
羧甲基纤维素钠用纯水制成0.5％的混悬液，用于SD大鼠灌胃给药(1ml/kg大鼠体重)，灌胃0.5-3小时后，腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液(0.15ml/kg大鼠体重)麻醉大鼠，静脉取血，置于涂肝素钠的EP管中，在4℃条件下，3000r/min离心10min；取上清液400μl，加入到5ml EP管中；沉淀蛋白后，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心；上清液即为空白血清样品； 
3.制备给药后血清样品 
所述复方中药药物粉碎成细粉后，用0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液，药物的浓度为0.34g/ml；SD大鼠给予药物混悬液灌服(3.4g/kg大鼠体重)。服药0.5-3小时后，大鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液(0.15ml/kg大鼠体重)麻醉，静脉取血，置涂肝素钠的EP管中，4℃条件下，3000r/min离心10min，取上清液400μl，加入5ml EP管中，沉淀蛋白后，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心；上清液即为给药后血清样品； 
本发明在制备空白或给药血清样品中，采用灌胃后2小时从肝门静脉取血，每400μl血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流动相为乙腈∶0.5％甲酸水溶液。 
4.高效液相色谱-质谱联用分析 
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱，5μm，250mm×4.6mm；流动相为甲醇(流动相B)-水(流动相A)系统、乙腈(流动相B)-水系统(流动相A)、乙腈(流动相B)∶0.5％乙酸水溶液(流动相A)或乙腈(流动相B)∶0.5％甲酸水(流动相A)溶液；流速0.8mL/min； 柱温25℃；电喷雾离子化源(ESI)，源电压3.5kv；干燥气流速10L/min；干燥气温度350℃；喷雾气压力30psi；MS/MS打碎电压1.0V，扫描的范围为100-1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS和MS/MS图谱； 
数据分析采用Chemstation工作站软件。 
表1为梯度洗脱程序。 
表1 
Figure G2009100496650D00031
5.对给药血清以及空白血清的质谱图进行比较，扣除空白血清中的内源性成分，得到给药后血清中的差异性成分； 
通过上述差异性成分的质谱图和药物提取液的质谱图比较分析，得到16个共有色谱峰(见附图1和附图2)； 
分析结果表明，产生的所述16个色谱峰的成分(化合物)即所测得的药物的活性成分，分别为：日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸。 
表2是所述的16个色谱峰的保留时间Rt值、分子量、一级质谱离子数据和二级质谱离子数据(所有化合物均由对照品对照鉴定)。 
Figure G2009100496650D00041
Figure G2009100496650D00051
Figure G2009100496650D00061
Figure G2009100496650D00071
6.测定药物活性成分的含量 
(1)色谱条件与系统适用性实验色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈(流动相B)∶水-有机酸(流动相A)的混合物； 
表3是梯度洗脱条件，其中，ELSD的漂移管温度为40℃，压力为3.5bar，gain值为7，理论塔板数以蟾毒灵峰计算，不低于4000。 
表3 
Figure G2009100496650D00081
(2)制备对照品溶液 
分别精密称取对照品日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸，加混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V)分别制成每1ml含各对照品100-2000μg的溶液，作为对照品溶液。 
(3)制备供试品溶液 
取500mg所述复方中药药物粉末，用6.5ml混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V)超声提取20min后12000r/min离心10min。上清液过0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。 
(4)测定 
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以外标法计算，即得所测定的药物活性成分的含量。 
通过上述步骤测定，每1g复方中药药物含中含日本蟾蜍它灵0.1-0.5mg，人参皂苷Re 2.0-4.0mg，1β-羟基蟾毒灵0.1-0.4mg，人参皂苷Rb1 0.5-3.0mg，人参皂苷 Ra1 0.5-3.0mg，脂蟾毒精醇0.5-2.5mg，人参皂苷Rc 0.6-3.0mg，人参皂苷Rb21.0-4.0mg，人参皂苷Rb3 0.1-2.5mg，人参皂苷Rd 2.0-5.5mg，蟾毒灵0.1-2.0mg，胆酸2.0-4.5mg，猪去氧胆酸3.0-5.0mg，华蟾酥毒基0.5-2.5mg，鹅去氧胆酸0.1-2.0mg，去氧胆酸0.1-2.0mg。 
本发明具有以下优点和用途： 
本方法具有稳定性和重现性好、可操作性强等优点。能将复方中药作为一个整体进行研究，分析血清中所含的来源于药物的化合物成分群，揭示药物的作用物质基础，并能测定药物活性成分的含量。 
附图说明
图1是正离子模式下的LC-MS色谱图(a)药物提取液，(b)给药后血清，(c)空白血清。 
图2是负离子模式下LC-MS色谱谱图(a)药物提取液，(b)给药后血清，(c)空白血清。 
具体实施方式
实施例1
本发明涉及的仪器与试剂为： 
仪器：Agilent1100色谱系统和Chemstation色谱工作站，Agilent LC/MSD Trap XCT电喷雾质谱检测器；色谱柱：Waters Symmetry C18(5μm，250mm×4.6mm)。 
试剂：乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，实验所用其它试剂均为分析纯)。 
配制药物提取液： 
取500mg药物粉末，用6.5ml混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V)超声提取20min后12000r/min离心10min。上清液过0.45μm滤膜过滤，得到药物提取液的配制。 
制备空白血清样品： 
羧甲基纤维素钠用纯水制成0.5％的混悬液，用于SD大鼠灌胃给药(1ml/kg大鼠体重)。灌胃2小时后，腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液(0.15ml/kg大鼠体重)麻醉大鼠。肝门静脉取血，置于涂肝素钠的EP管中，在4℃条件下，3000r/min离心10min。取上清液400μl，加入到5ml EP管中。3ml甲醇沉淀蛋白后，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心。上清液即为空白血清样 品。 
制备给药后血清样品： 
药物粉碎成细粉后，用0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液，药物的浓度为0.34g/ml。SD大鼠给予药物混悬液灌服(3.4g/kg大鼠体重)。服药2小时后，大鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液(0.15ml/kg大鼠体重)麻醉。肝门静脉取血，置于涂肝素钠的EP管中，在4℃条件下，3000r/min离心10min。取上清液400μl，加入到5ml EP管中。3ml甲醇沉淀蛋白后，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心。上清液即为给药血清样品。 
高效液相色谱-质谱联用分析： 
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱，5μm，250mm×4.6mm；流动相A(0.5％甲酸)∶B(乙腈)；洗脱程序见下表；流速0.8mL/min；柱温25℃；电喷雾离子化源(ESI)，源电压3.5kv；干燥气流速10L/min；干燥气温度350℃；喷雾气压力30psi；MS/MS打碎电压1.0V，扫描的范围为100-1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS和MS/MS图谱。数据分析采用Chemstation工作站软件。 
表4 
Figure G2009100496650D00101
色谱峰的辨别和鉴定： 
通过对上述得到的给药血清以及空白血清的质谱图进行比较，扣除空白血清中的内源性成分，得到给药后血清中的差异性成分。通过把这些差异性成分的质谱图和药物提取液的质谱图进行比较，得到16个共有色谱峰(见附图1和附图2)。产生这16个色谱峰的化合物就是药物的作用物质基础。这16个色谱峰的保留时间Rt值、分子量、一级质谱离子数据和二级质谱离子数据如下表所示(所有化合物均由对照品对照鉴定)： 
Figure G2009100496650D00111
Figure G2009100496650D00121
Figure G2009100496650D00131
Figure G2009100496650D00141
药物作用物质基础的含量测定： 
(1)色谱条件与系统适用性实验色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈(流动相B)∶水-有机酸(流动相A)的混合物；梯度洗脱条件同下表；ELSD的漂移管温度为40℃，压力为3.5bar，gain值为7，理论塔板数以蟾毒灵峰计算，不低于4000 
表6 
(2)对照品溶液的制备分别精密称取对照品日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸，加混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V)分别制成每1ml含各对照品100-2000μg的溶液，作为对照品溶液。 
(3)供试品溶液制备取500mg药物粉末，用6.5ml混合溶剂(甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V)超声提取20min后12000r/min离心10min。上清液过0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。 
(4)测定法分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，以外标法计算，即得。 
(1)-(4)含量测定方法，所述每1g药物含日本蟾蜍它灵0.1-0.5mg，人参皂苷Re 2.0-4.0mg，1β-羟基蟾毒灵0.1-0.4mg，人参皂苷Rb1 0.5-3.0mg，人参皂苷Ra1 0.5-3.0mg，脂蟾毒精醇0.5-2.5mg，人参皂苷Rc 0.6-3.0mg，人参皂苷Rb2 1.0-4.0mg，人参皂苷Rb3 0.1-2.5mg，人参皂苷Rd 2.0-5.5mg，蟾毒灵0.1-2.0mg，胆酸2.0-4.5mg，猪去氧胆酸3.0-5.0mg，华蟾酥毒基0.5-2.5mg，鹅去氧胆酸0.1-2.0mg，去氧胆酸0.1-2.0mg。 

Claims (9)

1.一种测定血清中药物活性成分的方法，其特征是采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后血清、空白血清及药物的提取液，测定药物活性成分及药物活性成分的含量；包括以下步骤：
(1)配制药物提取液：
取药物粉末，用混合溶剂超声提取后12000r/min离心，过滤，得药物提取液；
(2)制备空白血清样品：
羧甲基纤维素钠用纯水制成混悬液，动物灌胃给药后，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，离心，沉淀蛋白后，上清液真空旋转蒸干，得空白血清样品；
(3)制备给药后血清样品：药物碎成细粉后，用0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液，药物的浓度为0.34g/ml，SD大鼠给予药物混悬液灌服3.4g/kg大鼠体重，服药0.5-3小时后，大鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液麻醉，0.15ml/kg大鼠体重，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，4℃条件下，3000r/min离心10min；取上清液400μl，加入5ml EP管中，沉淀蛋白，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心；上清液即给药后血清样品；
(4)高效液相色谱-质谱联用分析：
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱，5μm，250mm×4.6mm；流动相为甲醇-水系统、乙腈-水系统、乙腈-0.5％乙酸水溶液或乙腈-0.5％甲酸水溶液；流速0.8mL/min；柱温25℃；电喷雾离子化源ESI，源电压3.5kv；干燥气流速10L/min；干燥气温度350℃；喷雾气压力30psi；MS/MS打碎电压1.0V，扫描的范围为100-1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS和MS/MS图谱；
(5)比较给药血清和空白血清的质谱图，扣除空白血清中的内源性成分，得给药后血清中的差异性成分，即所测得的药物的活性成分。
2.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为治疗心血管疾病的复方中药。
3.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为麝香保心丸，国药准字Z31020068，主要含含下述原料药组分：麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤1的混合溶剂为甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V，超声时间为20min。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法中，制备空白或给药血清样品，采用灌胃后2小时从肝门静脉取血，每400μl血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流动相为乙腈：0.5％甲酸水溶液。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤5)的差异性成分以下述16个共有色谱峰的保留时间Rt值、分子量、一级质谱离子数据和二级质谱离子数据表示：
Figure F2009100496650C00031
Figure F2009100496650C00041
Figure F2009100496650C00051
Figure F2009100496650C00061
7.按照权利要求6所述的方法，其特征是：产生的所述的药物的活性成分，分别为：日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸。
8.一种测定血清中药物活性成分含量的方法，其特征是通过下述步骤；
(1)色谱条件与系统适用性实验
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为流动相B和流动相A的混合物，其中流动相B为乙腈，流动相A为水-有机酸；梯度洗脱条件如下表；ELSD的漂移管温度为40℃，压力为3.5bar，gain值为7，理论塔板数以蟾毒灵峰计算，不低于4000，
(2)制备对照品溶液
称取对照品日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸适量，加混合溶剂甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V分别制成每1ml含各对照品100-2000μg的溶液，作为对照品溶液；
(3)制备供试品溶液
取500mg药物粉末，用6.5ml混合溶剂甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V超声提取20min后12000r/min离心10min。上清液过0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；
(4)测定血清中药物活性成分含量
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以外标法计算，测得血清中药物活性成分含量。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于测得的血清中药物活性成分含量为每1g药物中含日本蟾蜍它灵0.1-0.5mg，人参皂苷Re 2.0-4.0mg，1β-羟基蟾毒灵0.1-0.4mg，人参皂苷Rb1 0.5-3.0mg，人参皂苷Ra1 0.5-3.0mg，脂蟾毒精醇0.5-2.5mg，人参皂苷Rc 0.6-3.0mg，人参皂苷Rb2 1.0-4.0mg，人参皂苷Rb3 0.1-2.5mg，人参皂苷Rd 2.0-5.5mg，蟾毒灵0.1-2.0mg，胆酸2.0-4.5mg，猪去氧胆酸3.0-5.0mg，华蟾酥毒基0.5-2.5mg，鹅去氧胆酸0.1-2.0mg，去氧胆酸0.1-2.0mg。
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