CN107621503A

CN107621503A - 胆汁和血清中熊脱氧胆酸的纯化分离和lc‑ms/ms检测

Info

Publication number: CN107621503A
Application number: CN201610554568.7A
Authority: CN
Inventors: 朱监宝; 官培龙; 郭孟磊
Original assignee: Guangzhou Force Mass Spectrometry Medical Instrument Co Ltd; Jiangsu Force Color Medical Equipment Co Ltd; Shanghai Kesai Love Silent Medical Instrument Ltd Co; Shanghai Able Mehta Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Force Mass Spectrometry Medical Instrument Co Ltd; Jiangsu Force Color Medical Equipment Co Ltd; Shanghai Kesai Love Silent Medical Instrument Ltd Co; Shanghai Able Mehta Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2016-07-14
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了胆汁和血清中熊脱氧胆酸的纯化分离和LC‑MS/MS检测。具体地，本发明提供了一种熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，包括质控品、同位素内标提取液、稀释液、转化液、复溶液、流动相添加剂A、流动相添加剂B。本试剂盒可以分别检测熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸，用时较短，检测效率高，检测灵敏度高。

Description

胆汁和血清中熊脱氧胆酸的纯化分离和LC-MS/MS检测

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，具体地涉及熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒。

背景技术

胆汁酸是肝脏中细胞色素氧化胆固醇的产物，在肠道消化吸收脂肪和机体维持胆固醇平衡上起着重要的作用。胆汁酸是胆汁中的主要成分，是人体内环境中重要的生理介质之一，主要有胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸，以及这5种游离胆汁酸对应的甘氨和牛磺结合型胆汁酸。健康人的胆汁和外周血液中，胆汁酸谱组分相对恒定；发生胆石症、动脉粥样硬化、高血压等多种疾病时，会引起人体胆汁酸代谢异常，导致血清中相应胆汁酸含量的改变。因此，通过胆汁、血清胆汁酸谱的检测，可以了解机体胆汁酸的代谢，并有助于疾病的临床诊治。

目前，胆汁和血清中胆汁酸的检测主要通过液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)的方法。质谱通过测定m/z来区别不同的化合物，因此其不能有效的区别同分异构体，然而胆汁酸成分中含有多种同分异构体，例如甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸，如何通过液相方法分离这些同分异构体至关重要。

熊脱氧胆酸作为胆汁酸的一种，其对原发性胆汁性肝硬化，囊胞性纤维症和婴幼儿胆道阻塞具有很好的疗效。胆汁中熊脱氧胆酸丰富的含量是治疗慢性胆道疾病的首要前提，因此准确的测定血清和胆汁中熊脱氧胆酸的含量具有重要的意义。对于熊脱氧胆酸而言，其存在多种同分异构体，主要有脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和猪脱氧胆酸。

目前测定熊脱氧胆酸的LC-MS/MS方法中，对于上述四种同分异构体的检测多多少少都存在不足，绝大多数方法中均缺乏猪脱氧胆酸的检测，有的方法则特异性不足。由于猪脱氧胆酸和熊脱氧胆酸在结构上的相似性，使其在色谱中具有几乎相同的保留时间，这使得检测得到的熊脱氧胆酸的含量往往是熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸浓度之和，从而造成临床诊断的假阳性升高。

本研究针对上述情况，利用高效液相色谱对包括熊脱氧胆酸在内的四种同分异构体进行的有效的分离，然后采用串联质谱来定量，大大提高了熊脱氧胆酸在临床检测和诊断中的准确性。

因此，本领域迫切需要开发新的检测灵敏度较高并且能够同时定量检测熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸的技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种检测灵敏度较高并且能够同时定量检测熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸的技术。

在本发明的第一方面，提供了一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)质控品，所述的质控品中含有熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸；

(2)同位素内标提取液，所述的同位素内标提取液包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5；

(3)稀释液，所述的稀释液为乙腈；

(4)转化液，所述的转化液为PTAD(4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮)；

(5)复溶液，所述的复溶液为甲醇；

(6)流动相添加剂A，所述的流动相添加剂A为饱和一元羧酸；

(7)流动相添加剂B，其中所述的流动相添加剂B为C1-C3胺化合物。

在另一优选例中，所述的C1-C3胺化合物选自下组：甲胺、乙胺、丙胺、或其组合。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的部件：

96孔反应板、说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的部件：

对照品用于建立标准曲线。

在另一优选例中，所述的流动相添加剂B为甲胺。

在另一优选例中，所述饱和一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸或其组合。

在另一优选例中，所述饱和一元羧酸为甲酸。

在另一优选例中，所述饱和一元羧酸为甲醇和乙醇之一或其组合。

在另一优选例中，所述饱和一元羧酸为甲醇。

本发明的第二方面，通过串联质谱法测定所取的生物样品中熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸的量的方法，其包括：

(i)通过利用电喷雾离子源(ESI)对所述熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸和内标进行电离，分别产生所述熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸和所述内标的至少一种前体离子；

(ii)分别产生所述熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和

(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸的量；

其中，色谱检测过程中的流动相中加入甲胺。

在另一优选例中，所述熊脱氧胆酸的所述母离子的质/荷比为391.1±0.5。

在另一优选例中，所述猪脱氧胆酸的所述母离子的质/荷比为391.3±0.5。

在另一优选例中，其中一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为391.2±0.5的离子的一种或多种离子。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：胆汁酸混标HPLC-MS/MS多反应监测模式(MRM)图谱。

图2：DCA、CDCA、HDCA、UDCA四种化合物标准曲线

图3：血清胆汁酸HPLC-MS/MS多反应监测模式(MRM)图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种高效液相色谱质谱联用法，所述方法采用特定的流动相以及特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。在此基础上完成了本发明。

术语

脱氧胆酸，是一种C-7上缺羟基的胆汁酸，是胆酸失去一个氧原子衍生而得的一种游离胆汁酸，在胆汁中主要以牛磺酸、甘氨酸结合形式存在。

熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)：它是双羟基胆汁酸，亲水性，在急性和慢性肝炎的应用正在扩大。胆盐促使水份、卵磷脂、胆固醇和结合胆红素从胆道排泄，熊脱氧胆酸盐比其它胆酸盐有大得多的利胆作用。胆盐肠—肝循环障碍，在淤胆的病理发生中是重要的，可能与淤胆时的皮肤瘙痒有关。口服熊脱氧胆酸后干扰胆酸和鹅脱氧胆酸在小肠的吸收，从而降低血液中的胆盐。

检测方法

如本文所用，“液相层析”(LC)是指当流体均一地通过细微分开的物质的柱或者通过毛细管道过滤时流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法。延迟是由于当该流体相对于固定相(或多个)移动时混合物的组分在一个或多个固定相和本体流体(bulk fluid)(即流动相)之间的分布。“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。

如本文所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。

如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。

术语“电子电离”如本文所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。

术语“化学电离”如本文所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。

术语“电离”如本文所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。

术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的质控品、同位素内标提取液、稀释液、转化液、复溶液、流动相添加剂A、流动相添加剂B的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、对照品等。该试剂盒可用于同时检测样品中熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸含量。

典型地，检测方法包括以下：

一、内标提取液准备：

依据本次试验标本量计算同位素内标提取工作液的量，按1:100将浓缩的内标提取液用稀释液进行稀释，注意充分混匀。

提取:

取100μL人血清加入500μL内标提取液，充分混匀后离心，接着移取上清液到96孔反应板中，氮气吹干。

衍生：

向吹干的96孔反应板中加入100μL的转化液，充分混匀后，室温衍生1小时。

复溶：

加入50μL复溶液，充分混匀。

二、液相条件

流动相准备

A相：按1:1000的比例将流动相添加剂A加入到水溶液中。

B相：按1:1000的比例分别将流动相添加剂A、流动相添加剂B加入到甲醇中。

液相色谱采用梯度模式洗脱，液相色谱条件包括：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂或相当者。

色谱柱柱温：40℃。

进样量：5μL。

流速：0.5mL/min。

梯度洗脱。

三、质谱条件

离子源参数：Curtain Gas(CUR)20,Collision Gas(CAD)8,ion spray voltage-4500V,source temperature 600℃,CUR 20.0,GS1 60.0,and GS2 65.0.

表1：化合物质谱检测参数

其他质谱参数

离子源：电喷雾(ESI)离子源。

离子化电压：5500V。

辅助加热气温度：550℃。

雾化气(GAS1)：60psi。

辅助加热气(GAS2)：60psi。

气帘气(CUR)：20psi。

碰撞气(CAD)：4psi。

四、上机检测

取处理好的质控品和检测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与检测样本熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸的峰面积和同位素内标熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸峰面积。

五、定量分析

标准曲线的绘制方法：以7个对照品的标示浓度为横坐标(x)，以7个对

照品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准

曲线。

标准曲线方程的拟合：以7个对照品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归。可获得回归方程：y＝a+bx，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为截距，b为斜率。

检测样本结果的计算：将检测样本的实际峰面积与内标峰面积的比值代入

上述标准曲线方程，计算检测样本中待测化合物的浓度。

本发明的主要优点包括：

(a)本试剂盒可以分别检测熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸，操作中不需萃取，故过程简便、用时短，且熊脱氧胆酸的母离子的质/荷比为391.1±0.5，猪脱氧胆酸的母离子的质/荷比为391.3±0.5，故检测灵敏度高。

(b)本试剂盒检测熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸的标准曲线线性相关性高，故检测结果准确度高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

人血清样本进行熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸的检测

一、内标提取液准备

取450μL内标提取液用45mL稀释液进行稀释，充分混匀。

提取

分别取100μL人血清加入500μL内标提取液，涡旋1分钟,14000转/分钟离心5分钟，移取400μL上清液到96孔反应板中，放96孔氮吹仪上进行吹干。

衍生

向吹干的96孔反应板中加入100μL的转化液，涡旋5分钟后，室温放置1小时。

复溶

加入50μL复溶液后，振荡10分钟。

二、液相条件

流动相准备

A相：取1mL流动相添加剂A加入到1000mL水溶液中。

B相：分别取1mL流动相添加剂A和1mL流动相添加剂B加入到甲醇中。

液相色谱采用梯度模式洗脱，液相色谱条件包括：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂或相当者。

色谱柱柱温：40℃。

进样量：5μL。

流速：0.5mL/min。

洗脱梯度：

表2：液相洗脱梯度

序号	时间(min)	％B	流速(mL/min)
				1	0.01	10	0.5
2	10.00	100	0.5
				3	13.00	10	0.5

柱温：40℃

样品池温度：8℃

进样体积：5uL

三、质谱条件

质谱：API 3200MD,AB Sciex.

化合物检测离子和检测条件通过纯净的标准品直接注射进样优化得到，优化结果如下表所示：

表3：化合物质谱检测参数

其他质谱参数

离子源：电喷雾(ESI)离子源。

离子化电压：5500V。

辅助加热气温度：550℃。

雾化气(GAS1)：60psi。

辅助加热气(GAS2)：60psi。

气帘气(CUR)：20psi。

碰撞气(CAD)：4psi。

上机检测：

根据色谱条件和质谱条件设置液质联用仪参数，将处理好的对照品、质控品和检测样本溶液注入仪器进行检测，并记录色谱图。

定量分析

标准曲线的绘制方法：以7个对照品的标示浓度为横坐标(x)，以7个对照品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

标准曲线方程的拟合：以7个对照品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归。可获得回归方程：y＝a+bx，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为截距，b为斜率。本例中熊脱氧胆酸的回归方程为Y＝411.6X-7.82，猪脱氧胆酸的回归方程为Y＝478.1X-11.56，见表4。

表4：化合物线性

检测样本结果的计算：将检测样本的实际峰面积与内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算检测样本中待测化合物的浓度。

实施例2

人血清样本进行熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸的检测

检测样品来自于一位肝胆疾病患者。四种化合物的浓度如下表所示。

表5：血清化合物浓度及四个样本测定标准偏差

化合物	浓度(nM)
		脱氧胆酸	375.5±8.23
鹅脱氧胆酸	342.5±16.90
		猪脱氧胆酸	123.6±8.23
熊脱氧胆酸	54.0±1.68

从表5中可以看出，肝胆疾病患者由于肝功能受到损伤，会造成体内胆汁酸含量的变化，猪脱氧胆酸含量可能大大增加，若不能很好的区分熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸，必然造成检测结果的不准确，从而影响疾病的诊断和治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)质控品，所述的质控品中含有熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸；

(3)稀释液，所述的稀释液为乙腈；

(5)复溶液，所述的复溶液为甲醇；

(6)流动相添加剂A，所述的流动相添加剂A为饱和一元羧酸；

2.根据权利1要求所述的检测试剂盒，其特征是：所述的流动相添加剂B为甲胺。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述饱和一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸或其组合。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述饱和一元羧酸为甲酸。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述饱和一元羧酸为甲醇和乙醇之一或其组合。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述饱和一元羧酸为甲醇。

7.通过串联质谱法测定所取的生物样品中熊脱氧胆酸和或猪脱氧胆酸的量的方法，其包括：

其中，色谱检测过程中的流动相中加入甲胺。

8.权利要求7的方法，其中所述熊脱氧胆酸的所述母离子的质/荷比为391.1±0.5。

9.权利要求7的方法，其中所述猪脱氧胆酸的所述母离子的质/荷比为391.3±0.5。

10.权利要求8或9的方法，其中一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为391.2±0.5的离子的一种或多种离子。