WO2022049726A1 - 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム - Google Patents

胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム Download PDF

Info

Publication number
WO2022049726A1
WO2022049726A1 PCT/JP2020/033613 JP2020033613W WO2022049726A1 WO 2022049726 A1 WO2022049726 A1 WO 2022049726A1 JP 2020033613 W JP2020033613 W JP 2020033613W WO 2022049726 A1 WO2022049726 A1 WO 2022049726A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hormones
sterols
bile acids
sample
molecules
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/033613
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和貴 池田
将己 石川
亨平 五十嵐
あつ子 太田
Original Assignee
株式会社アデランス
公益財団法人かずさＤｎａ研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社アデランス, 公益財団法人かずさＤｎａ研究所 filed Critical 株式会社アデランス
Priority to KR1020237010612A priority Critical patent/KR20230054473A/ko
Priority to US18/023,220 priority patent/US20230296574A1/en
Priority to CN202080103725.7A priority patent/CN116075720A/zh
Priority to PCT/JP2020/033613 priority patent/WO2022049726A1/ja
Priority to EP20952461.0A priority patent/EP4209782A4/en
Publication of WO2022049726A1 publication Critical patent/WO2022049726A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/622—Ion mobility spectrometry
    • G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/165—Electrospray ionisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
    • G01N2001/4061—Solvent extraction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/201—Injection using a sampling valve multiport valves, i.e. having more than two ports
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/202—Injection using a sampling valve rotary valves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/20—Injection using a sampling valve
    • G01N2030/207—Injection using a sampling valve with metering cavity, e.g. sample loop
    • G01N2030/208—Injection using a sampling valve with metering cavity, e.g. sample loop with more than one cavity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method and an analysis system for bile acids, sterols, and hormones.
  • MS mass spectrometer
  • Non-Patent Document 1 describes a method for MS analysis of cholesterol relatives, oxysterols, and vitamin Ds from human blood (serum). There is.
  • Non-Patent Document 2 describes oxysterols
  • Non-Patent Document 3 describes steroids
  • Patent Document 1 describes methods for MS analysis of steroid analogs and vitamin D3 analogs using derivatization methods. ing.
  • bile acids, sterols, and hormones are important components as biomarker candidates, and it is very useful to comprehensively detect these molecules by MS in biological samples. ..
  • the polarities of the molecules differ between these types, and many structural isomers have similar structures within the same species. For this reason, conventionally, the types to be analyzed are narrowed down in advance, and individual detection is performed according to the contained molecules, and a comprehensive analysis method has not yet been established.
  • Non-Patent Document 1 includes a pretreatment method such as derivatization, a plurality of separation methods (gas chromatography, liquid chromatography), and an ionization method for MS analysis (atmospheric pressure ionization method, electrospray ionization method). It is analyzed in combination and has not been detected including bile acids and hormones.
  • Non-Patent Document 2 is a technique for MS analysis of oxysterols
  • Non-Patent Document 3 is steroids
  • Patent Document 1 is a technique for MS analysis of steroid hormones using a derivatization method. Comprehensive analysis including hormones has not been realized. As described above, a technique for comprehensively analyzing bile acids, sterols, and hormones has not yet been established.
  • One aspect of the present invention is to realize a technique for comprehensively analyzing bile acids, sterols, and hormones in a biological sample.
  • the method for analyzing bile acids, sterols, and hormones is selected from bile acids, sterols, and hormones in the sample by reverse phase liquid chromatography. It includes a step of separating a plurality of molecules to be separated, a step of ionizing the separated molecule, and a step of detecting the ionized molecule by mass spectrometry.
  • the bile acid, sterol, and hormone analysis system is an apparatus for separating a plurality of molecules selected from bile acid, sterol, and hormone in a sample by reverse phase liquid chromatography. , And a mass spectrometer for ionizing the separated molecule and detecting the ionized molecule by MS analysis.
  • the analytical method comprises a step of separating molecules of bile acids, sterols, and hormones by reverse phase liquid chromatography without the need to derivatize the molecules in the sample in the pretreatment step. It includes a step of ionizing the separated molecule and a step of mass spectrometrically analyzing the ionized molecule to detect a plurality of components of bile acids, sterols, and hormones.
  • the target sample of this analysis method is not particularly limited, but may be a sample that may contain bile acids, sterols, and hormones. Further, these samples may be samples collected from humans, animals or plants, or biological samples prepared from living organisms. In addition, the biological sample may be selected from the group consisting of skin, nails, organs, tissues, cells, blood, urine, spinal fluid, feces, and cecal contents.
  • the biological sample can be hair.
  • Hair is also referred to as hair, and includes hair and body hair.
  • the hair is involved in the production of hair such as the root sheath and the hair matrix existing around the hair root in the hair follicles (or hair follicles) together with the hair shaft part on the outside of the skin and the hair root part on the inside of the skin. The part is also included.
  • the sample to be analyzed may be a sample extracted from a living body.
  • the extraction of the sample from the living body can be realized by a known method such as solvent extraction or solid-phase extraction. That is, the analytical method according to one aspect of the present invention may include a step of extracting molecules of bile acids, sterols, and hormones from a biological sample before the separation step.
  • the solvent used when extracting the sample is preferably a solvent having high solubility in the target bile acids, sterols, and hormones.
  • a solvent having high solubility in the target bile acids, sterols, and hormones for example, methanol, heptane, ethyl acetate, butanol, chloroform and the like can be mentioned.
  • LC-MS reverse phase liquid chromatography mass spectrometer
  • the extract from the solvent may be removed by purification by saponification reaction treatment or the like.
  • saponification reaction treatment for example, when extracting molecules of bile acids, sterols, and hormones from a biological sample, impurities such as phospholipids and triglycerides may be contained.
  • impurities such as phospholipids and triglycerides may be contained.
  • the biological sample is hair or the like, the amount of impurities contained in the extract is relatively small, so that the saponification reaction treatment does not necessarily have to be performed.
  • Examples of the extraction method and purification method from a biological sample containing a large amount of impurities include the methods shown below.
  • the biological sample is suspended in an organic solvent, and then water and potassium hydroxide are added.
  • the biological sample is a solid sample, about 1 mg to 10 mg may be suspended, and when the biological sample is a liquid sample, about 10 ⁇ L to 100 ⁇ L may be suspended in the solvent.
  • the ratio of the organic solvent in the biological sample-potassium hydroxide mixed solution is 70%, and the final concentration of potassium hydroxide is about 0.1 to 2.0 mol / L.
  • the biological sample-potassium hydroxide mixed solution is stirred, and a saponification reaction (hydrolysis reaction) of impurities such as phospholipids and triglycerides in the biological sample is performed.
  • the stirring conditions are, for example, 1000 rpm to 2000 rpm, 40 ° C. to 80 ° C., and 1 to 12 hours.
  • the saponification reaction can be stopped by adding acetic acid and water.
  • the molecules of bile acids, sterols, and hormones are recovered by the liquid-liquid extraction method.
  • Butanol, heptane and ethyl acetate can be used in this liquid-liquid extraction method.
  • the butanol used is 0.5 to 1.0 times the volume of butanol.
  • the stirring condition of the mixed solution is, for example, 1000 rpm to 2000 rpm.
  • a mixed solution of heptane and ethyl acetate stir, and centrifuge.
  • the stirring condition of the mixed solution is, for example, 1000 rpm to 2000 rpm.
  • the upper organic layer containing bile acids, sterols, and hormones is recovered (upper layer 1).
  • Heptane and ethyl acetate are added again to the remaining lower layer, and stirring and centrifugation are performed. After separating into two layers, the upper layer is collected (upper layer 2).
  • the heptane and ethyl acetate mixed solution used is, for example, a 0.5 to 1.0 times volume heptane and ethyl acetate mixed solution.
  • the volume ratio of heptane to ethyl acetate is, for example, 3: 1.
  • the obtained upper layer 1 and upper layer 2 are put together in the same tube and then dried with nitrogen. After this drying, it can be redissolved in a mixed solution of methanol, chloroform and water to prepare a sample for LC-MS analysis.
  • isotope-labeled standards of bile acids, sterols, and hormones may be used as internal standard substances, if necessary. Examples of internal standard substances include 7 ⁇ , 25-dihydroxycholesterol_d6, 25 - hydroxycholesterol_d6, testosterone_13C3 and the like.
  • Bile acids, sterols, and hormones detected in this analytical method are mainly cholesterol-precursor components.
  • Bile acids, sterols, and hormones can be components selected from the group consisting of bile acids, cholesterol relatives, oxysterols, vitamin Ds, hormones, and thyroid hormones.
  • Cholesterol analogs include cholesterols, cholesterol precursors, and phytosterols.
  • Bile acids, sterols, and hormones may be biosynthesized bile acids, sterols, and hormones in vivo, or foreign bile acids, sterols, and hormones such as plants. May be.
  • cholesterols examples include cholesterol, latosterol, desmosterol, timosterol, timostanol, lanosterol, dehydrolanosterol, coprostanol, 7-dehydrocholesterol, FF-MAS, dehydroFF-MAS, T-MAS, dehydroT-MAS, Examples thereof include squalene, cholesterol, cholesterol, coprostanol and the like.
  • phytosterols include campesterol, campesterol, sitosterol, cytostanol, brassicasterol, stigmasterol and the like.
  • oxysterols examples include 7-ketocholesterol, 7 ⁇ -hydroxycholesterol, 7 ⁇ -hydroxycholesterol, 5 ⁇ , 6 ⁇ -epoxycholesterol, 5 ⁇ , 6 ⁇ -epoxycholesterol, 24 (S), 25-epoxycholesterol, 25-.
  • vitamin D examples include ergosterol, vitamin D3, 25-hydroxyvitamin D3, 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D3, 24 (S), 25-dihydroxyvitamin D3, vitamin D2, 25-hydroxyvitamin D2 and the like.
  • hormones include dehydroepiandrosterone, dehydroepiandrosterone sulfate, testosterone, 5 ⁇ -dehydrotestosterone, estron, 17 ⁇ -estradiol, estriol, progesterone, 16,17-epoxyprogesterone, 17-hydroxyprogesterone, cortisol, cortisol.
  • Corticosterone Corticosterone, aldesterone, 11-deoxycorticosterone, 11-deoxycortisol, androsterone, androstendione, pregnenolone, 17-hydroxypregnenolone and the like.
  • bile acids include cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursocholic acid, hyocholic acid, muricholic acid, glycoholic acid, glycokenodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurokenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, Examples thereof include glycodeoxycholic acid, glycoursodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, tauroursodeoxycholic acid, lithocholic acid, glycolithocholic acid, taurolithocholic acid, 3-ketritocholic acid, and 7-ketritocholic acid.
  • thyroid hormones examples include triiodothyronine (T3), reverse T3, thyroxine and the like.
  • T3 triiodothyronine
  • the bile acids, sterols, and hormones detected in the analytical method may also include isomers of the above-mentioned molecules, sulfate conjugates, glucuronic acid conjugates, and the like.
  • molecules belonging to the above-mentioned bile acids, sterols, and hormones can be comprehensively detected.
  • the plurality of components detected in this analytical method can be, for example, a combination of cholesterol and latosterol among cholesterols and a combination of campesterol among cholesterols and phytosterols. Further, the components to be detected may be a combination of isomers such as 7 ⁇ -hydroxyoxysterol and 7 ⁇ -hydroxyoxysterol.
  • the number of bile acids, sterols, and hormones detected in the analysis method is not particularly limited and may be 2 or more, but 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50. As mentioned above, it may be 60 or more. High-throughput analysis can be realized by comprehensively analyzing many molecules at once.
  • the separation step molecules of bile acids, sterols, and hormones in the sample are separated by reverse phase liquid chromatography.
  • bile acids, sterols, and hormones are separated molecule by molecule by subjecting the sample to reverse phase liquid chromatography.
  • the sample to be subjected to the separation step is preferably prepared in a state suitable for reverse phase liquid chromatography, for example, the sample is extracted with a solvent.
  • the separation step the sample is separated by reverse phase liquid chromatography under acidic conditions.
  • the separation step it is not necessary to divide the sample for each of bile acids, sterols, and hormones, or to change the separation conditions. Classes and hormones can be separated from each other.
  • the particle size of the filler of the column for reverse phase liquid chromatography is more preferably 3 ⁇ m or less, and most preferably 2 ⁇ m or less.
  • the filler for the column for reverse phase liquid chromatography is preferably a filler for ultra-high performance liquid chromatography.
  • the solvent used in the reverse phase liquid chromatography under acidic conditions can be a mixed solvent of water and an organic solvent.
  • the organic solvent for example, methanol, acetonitrile, 2-propanol and the like can be preferably used.
  • a volatile acid is used to acidify the above-mentioned mixed solvent.
  • the volatile acid is, for example, acetic acid, formic acid and the like.
  • the ratio of the volatile acid to the organic solvent may be, for example, 1% or more.
  • the flow rate of the mobile phase in the reverse phase liquid chromatography is about 0.4 mL / min, and the temperature of the column oven is preferably 40 ° C. or higher and 50 ° C. or lower.
  • each molecule of bile acids, sterols, and hormones in the sample can be separated with a gradient solvent using two kinds of mobile phases.
  • the composition of such a mobile phase include a mixed solution of water and methanol (containing 1% acetic acid), a mixed solution of methanol and acetonitrile (containing 1% acetic acid), and the like.
  • the molecules separated by reverse phase liquid chromatography are ionized by MS.
  • it is ionized by an electrospray ionization method (ESI method).
  • the ion source for ionization in the ionization step is, for example, an ESI probe.
  • an ionization promoter that promotes ionization of bile acids, sterols, and hormones.
  • examples of such an ionization accelerator include volatile acids such as acetic acid and formic acid.
  • the carrier gas used in the ionization step for example, nitrogen gas can be mentioned.
  • the ionized molecules are subjected to MS analysis to detect a plurality of bile acids, sterols, and hormones contained in the sample.
  • the ionized molecule is analyzed using a known mass spectrometer such as a triple quadrupole MS.
  • the mass spectrometer In the detection step, it is not necessary to change the mass spectrometer for bile acids, sterols, and hormones, and a single MS analysis includes multiple bile acids, sterols, and hormones contained in the sample. Can be detected.
  • MS and MS / MS analysis of ionized bile acids, sterols, and hormones are performed, and a plurality of bile acids, sterols, and hormones are analyzed according to the obtained mass-to-charge ratio (m / z ratio). Identify each type.
  • the method for analyzing bile acids, sterols, and hormones may further include an arithmetic step for quantifying bile acids, sterols, and hormone molecules in a sample based on the detection results in the detection step.
  • MS and MS / MS spectra of each component in the sample may be generated based on the detection result in the detection step, and the peak region may be measured for quantification.
  • a plurality of bile acids, sterols, and hormones contained in a sample are subjected to a single reverse phase liquid chromatography, ionization, and detection treatment step. Can be analyzed by.
  • this analysis method can realize a comprehensive analysis of bile acids, sterols, and hormones, which were conventionally difficult to perform simultaneous analysis. Therefore, it is not necessary to detect bile acids, sterols, and hormones individually, and high-throughput analysis can be realized.
  • Bile acids, sterols, and hormones which are important lipid components, have a correlation with various diseases as well as health maintenance, and are very useful as biomarker candidates. According to this analysis method, it is possible to comprehensively analyze a plurality of bile acids, sterols, and hormones, which is effective for searching and discovering molecules that serve as biomarkers.
  • the analysis system is a device for separating molecules of bile acids, sterols, and hormones in a sample by reverse phase liquid chromatography, and an ionized molecule of the separated molecules is used as MS. It is equipped with a mass spectrometer that analyzes and detects these multiple components. That is, the above-mentioned analysis method for bile acids, sterols, and hormones is one aspect of the analysis method performed in the analysis system for bile acids, sterols, and hormones of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a main configuration of an analysis system according to an embodiment of the present invention.
  • the analysis system 100 includes a liquid chromatograph (separator) 10, a mass spectrometer 20, and an arithmetic unit 30.
  • the liquid chromatograph 10 and the mass spectrometer 20 may be independent devices or may be integrated devices having the functions of the respective devices.
  • a known reverse phase liquid chromatography mass spectrometer (LC-MS) can be used as an integrated device having the functions of the liquid chromatograph 10 and the mass spectrometer 20.
  • LC-MS reverse phase liquid chromatography mass spectrometer
  • the liquid chromatograph 10 is an apparatus for separating a sample by reverse phase liquid chromatography.
  • the liquid chromatograph 10 may be a conventionally known liquid chromatograph device, and a commercially available device can be preferably used.
  • the sample to be separated by the liquid chromatograph 10 may be a sample adjusted to a state suitable for separation in the apparatus, for example, a solvent extract obtained by extracting the sample with a solvent.
  • the liquid chromatograph 10 can separate molecules of bile acids, sterols, and hormones, which are target components in the sample, for each component.
  • the components separated by the liquid chromatograph 10 are introduced into the mass spectrometer 20.
  • the mass spectrometer 20 is a device for MS analysis of bile acids, sterols, and hormones in a sample.
  • the mass spectrometer 20 MS-analyzes the ionized molecules and the ionizing unit 21 that ionizes the molecules separated by the liquid chromatograph 10, and detects a plurality of components from the bile acids, sterols, and hormones contained in the sample. It has a detection unit 22.
  • the mass spectrometer 20 may be a conventionally known mass spectrometer, and a commercially available device can be preferably used.
  • the sample introduced into the mass spectrometer 20 is first introduced into the ionization unit 21, and the molecules of bile acids, sterols, and hormones in the sample are ionized.
  • the detection unit 22 separates and detects the molecules ionized in the ionization unit 21 according to the mass-to-charge ratio (m / z ratio).
  • the detection result in the mass spectrometer 20 is output to the arithmetic unit 30.
  • the arithmetic unit 30 generates MS and MS / MS spectra of bile acids, sterols, and hormones in the sample based on the detection result output from the mass spectrometer 20, and measures the peak region. Quantify the molecules of bile acids, sterols, and hormones in the sample.
  • the arithmetic unit 30 may be, for example, a computer incorporating software for executing an arithmetic related to MS analysis, a memory for storing the arithmetic result, a display for displaying the arithmetic result, and the like.
  • the calculation by the arithmetic unit 30 may be realized by a logic circuit (hardware) formed in an integrated circuit (IC chip) or the like, or may be realized by software using a CPU (Central Processing Unit).
  • a logic circuit hardware
  • IC chip integrated circuit
  • CPU Central Processing Unit
  • the arithmetic unit 30 is a CPU that executes instructions of a program that is software that realizes each function, a ROM (Read Only Memory) or a ROM (Read Only Memory) in which the above program and various data are readablely recorded by a computer (or CPU). It is equipped with a storage device (these are referred to as "recording media"), a RAM (RandomAccessMemory) for expanding the above program, and the like. Then, the object of the present invention is achieved by the computer (or CPU) reading the program from the recording medium and executing the program.
  • a "non-temporary tangible medium" for example, a tape, a disk, a card, a semiconductor memory, a programmable logic circuit, or the like can be used.
  • the program may be supplied to the computer via any transmission medium (communication network, broadcast wave, etc.) capable of transmitting the program.
  • the present invention can also be realized in the form of a data signal embedded in a carrier wave, in which the above program is embodied by electronic transmission.
  • a plurality of bile acids, sterols, and hormones contained in a sample are included by a single reverse phase liquid chromatography, ionization, and detection treatment. Can be analyzed.
  • Bile acids, sterols, and hormones in hair and serum were analyzed all at once as shown below.
  • the sample was recovered by a liquid-liquid extraction method using butanol, heptane and ethyl acetate.
  • butanol was added and then stirred.
  • a mixed solution of heptane and ethyl acetate the mixture was stirred and centrifuged.
  • the organic layer of the upper layer was recovered (upper layer 1).
  • a mixed solution of heptane and ethyl acetate was added again to the remaining lower layer, and stirring and centrifugation were performed.
  • the upper layer was recovered (upper layer 2).
  • the obtained upper layer 1 and upper layer 2 were put together in the same tube and then dried with nitrogen. After this drying, it was redissolved in a mixed solution of methanol, chloroform and water and subjected to LC-MS analysis.
  • Ionization of the separated molecules was performed by an electrospray ionization method (ESI method) in a triple quadrupole LCMS-8060 system (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the temperatures of the ion source, the orifice and the ion introduction part were set to 450 to 500 ° C, 350 to 400 ° C and 250 to 300 ° C, respectively.
  • Acetic acid was used as the ionization accelerator, and nitrogen gas was used as the carrier gas.
  • the ionized molecules were MS analyzed in the LCMS-8060 system to identify and quantify the components of bile acids, sterols, and hormones.
  • the present invention can be used in the medical field for predicting or diagnosing a health condition or a disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を包括的に分析する技術を実現する。胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する工程と、分離した前記の分子をイオン化する工程と、イオン化した前記の分子をＭＳ分析して検出する工程とを包含する。

Description

胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム
　本発明は、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システムに関する。
　生体から採取した血液や組織等に含まれる特定の成分を、健康や病気の指標（バイオマーカー）として質量分析計（ＭＳ）により検出することで、健康状態や疾患を予想又は診断する技術が知られている。このような生体成分の中でも、コレステロールを前駆体とする胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、生理活性を持つものが多く、様々な疾患との関連性も知られている。そのため、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類について、包括的な分析を可能にすることは、確度の高いバイオマーカーを効率的に探索や発見する上で極めて重要である。
　コレステロールを前駆体とする成分を分析する方法として、例えば、非特許文献１には、ヒトの血液（血清）からコレステロール類縁体類、オキシステロール類、ビタミンＤ類をＭＳ分析する方法が記載されている。また、非特許文献２にはオキシステロール類、非特許文献３にはステロイド類、特許文献１にはステロイド類縁体およびビタミンＤ３類縁体について、それぞれ誘導体化法を用いてＭＳ分析する方法が記載されている。
日本国特開２００７－１３２７４１号公報
Jeffrey G. McDonald, Daniel D. Smith, Ashlee R. Stiles, David W. Russell, A comprehensive method for extraction and quantitative analysis of sterols and secosteroids from human plasma, Journal of Lipid Research 53(7):1399-409. 2012 Akira Honda, Kouwa Yamashita, Takashi Hara, Tadashi Ikegami, Teruo Miyazaki, Mutsumi Shirai, Guorong Xu, Mitsuteru Numazawa, Yasushi Matsuzaki, Highly sensitive quantification of key regulatory oxysterols in biological samples by LC-ESI-MS/MS, Journal of Lipid Research 50(2):350-7. 2009 Teng-Fei Yuan, Juan Le, Shao-Ting Wang, Yan Li, An LC/MS/MS method for analyzing the steroid metabolome with high accuracy and from small serum samples, Journal of Lipid Research 61(4):580-586. 2020
　上述したように、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、バイオマーカー候補として重要な成分であるため、生体試料中からＭＳによりこれらの分子を包括的に検出することは、非常に有益である。その一方で、これらの種類間では分子の極性が異なり、同一種内では構造が類似した構造異性体が多い。このため、従来は分析の対象となる種類を予め絞り込み、含まれる分子に応じて個別的な検出が行われており、未だ包括的な分析方法は確立されていない。
　非特許文献１に記載された技術は、誘導体化などの前処理法、複数の分離法（ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）及びＭＳ分析のイオン化法（大気圧イオン化法、エレクトロスプレーイオン化法）を組み合わせて分析するものであり、胆汁酸類やホルモン類を含めた検出には至っていない。また、非特許文献２はオキシステロール類、非特許文献３にはステロイド類、特許文献１はステロイドホルモン類について、誘導体化法を用いてＭＳ分析する技術であり、胆汁酸類、ビタミンＤ類、甲状腺ホルモン類を含めた包括的な分析は実現できていない。このように、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類について、包括的に分析する技術は未だ確立されていない。
　本発明の一態様は、生体試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類について、包括的に分析する技術を実現することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する工程と、分離した前記の分子をイオン化する工程と、イオン化した前記の分子をＭＳ分析して検出する工程とを包含する。
　本発明の一態様に係る胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システムは、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する装置、及び分離した前記の分子をイオン化し、イオン化した前記の分子をＭＳ分析して検出する質量分析装置を備えている。
　本発明の一態様に係る分析方法を用いることで、生体試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を包括的に分析することが可能である。
本発明の一実施形態に係る分析システムの要部構成を示すブロック図である。 実施例のヒト血清から抽出した胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のＭＳ分析の結果を示す図である。 実施例のヒト血清から抽出した胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のＭＳ分析の結果を示す図である。 実施例のヒト毛髪から抽出した胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のＭＳ分析の結果を示す図である。
　〔胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法〕
　本発明の一態様に係る分析方法は、前処理工程において試料中の分子を誘導体化する必要がなく、逆相液体クロマトグラフィーにより胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する工程と、分離した前記の分子をイオン化する工程と、イオン化した前記の分子をＭＳ分析し、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の複数の成分を検出する工程とを包含する。
　＜試料＞
　本分析方法の対象となる試料は、特に限定されないが、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を含有する可能性のある試料であり得る。また、これらの試料については、ヒト、動物、植物から採取した試料又は生体から調製した生体試料であってもよい。さらに、生体試料は、皮膚、爪、臓器、組織、細胞、血液、尿、髄液、糞便、及び盲腸内容物からなる群より選択されるものであり得る。
　また、生体試料は、毛であり得る。毛は、毛髪ともいい、頭髪及び体毛も含む。また、毛には、皮膚の外側の毛幹部分及び皮膚の内側の毛根部分と共に、毛嚢（又は毛包）内において毛根の周囲に存在する毛根鞘や毛母等の毛の産生に関与する部分も含まれる。
　＜抽出＞
　分析の対象となる試料は、生体から抽出した試料であってもよい。この生体からの試料の抽出については、溶媒抽出や固相抽出等の公知の方法により実現することができる。すなわち、本発明の一態様に係る分析方法は、前記の分離工程の前に、生体試料から胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を抽出する工程を包含してもよい。
　試料を抽出する場合に用いられる溶媒は、対象である胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類と溶解性が高い溶媒であることが好ましい。例えば、メタノール、ヘプタン、酢酸エチル、ブタノール、クロロホルム等が挙げられる。
　生体試料中から胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子の包括的な抽出法の例を下記に示す。まず、生体試料を溶媒中に懸濁して、攪拌する。その際、生体試料が固体試料の場合には１ｍｇ～１０ｍｇ程度、液体試料の場合は１０μＬ～１００μＬ程度の生体試料を溶媒に懸濁する。次に、生体試料と溶媒との混合液を攪拌した後、遠心分離を行い、上清を回収する。回収した上清は、逆相液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）による分析に供する試料とすることができる。
　溶媒による抽出物について、夾雑成分が含まれている場合には、けん化反応処理等により精製することで、これらを取り除いてもよい。例えば、生体試料中から胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を抽出する場合、リン脂質や中性脂肪等の夾雑物が含まれる場合がある。一方、生体試料が毛などである場合には抽出物に含まれる夾雑物が比較的少量であるため、けん化反応処理を必ずしも行わなくてもよい。
　夾雑物を多く含む生体試料からの抽出方法及び精製方法として、下記に示す方法が例として挙げられる。まず、生体試料を有機溶媒に懸濁し、その後、水及び水酸化カリウムを添加する。この際、生体試料が固体試料の場合は１ｍｇ～１０ｍｇ程度、液体試料の場合は１０μＬ～１００μＬ程度の生体試料を溶媒に懸濁すればよい。また、生体試料－水酸化カリウム混合液中の有機溶媒の割合は７０％、水酸化カリウムの最終濃度は０．１～２.０ｍｏｌ／Ｌ程度であることが好ましい。
　次に、生体試料－水酸化カリウム混合液を攪拌し、生体試料中のリン脂質や中性脂肪等の夾雑物のけん化反応（加水分解反応）を行う。攪拌条件は、例えば、１０００ｒｐｍ～２０００ｒｐｍ、４０℃～８０℃、１～１２時間である。けん化反応は、酢酸および水を添加することにより停止させることができる。
　けん化反応の後、液－液抽出法により胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を回収する。この液－液抽出法には、ブタノール、ヘプタンおよび酢酸エチルを用いることができる。例えば、けん化反応後の混合液にブタノールを添加して攪拌する場合、使用するブタノールは、０．５～１．０倍容のブタノールである。また、混合液の攪拌条件は、例えば、１０００ｒｐｍ～２０００ｒｐｍである。
　次に、ヘプタン及び酢酸エチル混液を添加して攪拌し、遠心分離を行う。混合液の攪拌条件は、例えば、１０００ｒｐｍ～２０００ｒｐｍである。二層に分離後、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類が含まれる上層の有機層を回収する（上層１）。残った下層に、ヘプタンと酢酸エチルとを再び添加し、攪拌及び遠心分離を行う。二層に分離後、上層を回収する（上層２）。使用するヘプタン及び酢酸エチル混液は、例えば、０．５～１．０倍容のヘプタン及び酢酸エチル混液である。また、ヘプタンと酢酸エチルとの体積比は、例えば、３：１である。
　得られた上層１及び上層２を、同一のチューブにまとめた後、窒素により乾固する。この乾固後に、メタノール、クロロホルム及び水の混合液で再溶解し、ＬＣ－ＭＳ分析に供する試料とすることができる。前記の抽出工程において、必要に応じて同位体標識された胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の標準品を内部標準物質として用いて良い。内部標準物質の例として、７α，２５－ジヒドロキシコレステロール＿ｄ６、２５－ヒドロキシコレステロール＿ｄ６、テストステロン＿１３Ｃ３などが挙げられる。
　＜胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類＞
　本分析方法において検出される胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、主にコレステロールを前駆体とする成分である。胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、胆汁酸類、コレステロール類縁体類、オキシステロール類、ビタミンＤ類、ホルモン類、及び甲状腺ホルモン類からなる群より選択される成分であり得る。コレステロール類縁体類には、コレステロール類、コレステロール前駆体、及びフィトステロール類が含まれる。胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、生体内で生合成された胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類であってもよいし、植物などの外来の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類であってもよい。
　コレステロール類の例として、コレステロール、ラトステロール、デスモステロール、チモステロール、チモスタノール、ラノステロール、デヒドロラノステロール、コプロスタノール、７－デヒドロコレステロール、ＦＦ－ＭＡＳ、デヒドロＦＦ－ＭＡＳ、Ｔ－ＭＡＳ、デヒドロＴ－ＭＡＳ、スクアレン、コレステノン、コレスタノール、コプロスタノール等が挙げられる。フィトステロール類の例として、カンペステロール、カンペスタノール、シトステロール、シトスタノール、ブラシカステロール、スティグマステロール等が挙げられる。オキシステロール類の例として、７－ケトコレステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、７β－ヒドロキシコレステロール、５α，６α－エポキシコレスタノール、５β，６β－エポキシコレスタノール、２４（Ｓ），２５－エポキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２０α－ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）－ヒドロキシコレステロール、４β－ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２４（Ｒ）－ヒドロキシコレステロール、５α，６β－ジヒドロキシコレスタノール、７α，２５－ジヒドロキシコレステロール、７α，２７－ジヒドロキシコレステロール、７α，２４（Ｓ）－ジヒドロキシコレステロール、７β，２５－ジヒドロキシコレステロール、７β，２７－ジヒドロキシコレステロール、７α－ヒドロキシ－３－オキソコレステロール酸、７α－ヒドロキシコレステノン等が挙げられる。ビタミンＤ類の例として、エルゴステロール、ビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４（Ｓ），２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、ビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ２等が挙げられる。ホルモン類の例として、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート、テストステロン、５α－デヒドロテストステロン、エストロン、１７β－エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン、１６，１７－エポキシプロゲステロン、１７－ヒドロキシプロゲステロン、コルチゾン、コルチゾール、コルチコステロン、アルデステロン、１１－デオキシコルチコステロン、１１－デオキシコルチゾール、アンドロステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、１７－ヒドロキシプレグネノロン等が挙げられる。胆汁酸類の例として、コール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソコール酸、ヒオコール酸、ムリコール酸、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、リトコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸、３－ケトリトコール酸、７－ケトリトコール酸等が挙げられる。甲状腺ホルモン類の例として、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、リバースＴ３、サイロキシン等が挙げられる。分析方法において検出される胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、上述した分子の異性体、硫酸抱合体およびグルクロン酸抱合体等も含まれ得る。
　本分析方法においては、上記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類に属する分子を包括的に検出することができる。この分析方法において検出される複数の成分は、例えば、コレステロール類のうちのコレステロール及びラトステロールの組み合わせや、コレステロール及びフィトステロール類のうちのカンペステロールの組み合わせであり得る。また、検出される成分として、７α－ヒドロキシオキシステロール及び７β－ヒドロキシオキシステロールのように、異性体同士の組み合わせであってもよい。
　分析方法において検出される胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の数は特に限定されず、２以上であればよいが、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上であってもよい。一度に多くの分子を包括的に分析することで、ハイスループットな分析を実現できる。
　（分離工程）
　分離工程においては、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する。この分離工程では、試料を逆相液体クロマトグラフィーに供することにより、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を分子ごとに分離する。分離工程に供する試料は、逆相液体クロマトグラフィーに適した状態に調整されたものであることが好ましく、例えば、試料を溶媒により抽出したものである。また、分離工程においては、酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにより試料を分離する。
　分離工程においては、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類ごとに試料を分割することや、分離条件を変更したりする必要はなく、一度の分離工程により、同一の試料に含まれる胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類をそれぞれ分離することができる。
　逆相液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤の粒子径は、３μｍ以下であることがより好ましく、２μｍ以下であることが最も好ましい。
　また、逆相液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤は、超高速液体クロマトグラフィー用の充填剤であることが好ましい。
　酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにおいて用いる溶媒は、水と有機溶媒との混合溶媒であり得る。有機溶媒としては、例えば、メタノール、アセトニトリル、２－プロパノール等を好適に用いることができる。また、逆相液体クロマトグラフィーにおいては、揮発性酸を用いて上記の混合溶媒を酸性にする。揮発性酸は、例えば、酢酸、ギ酸等である。有機溶媒に対する揮発性酸の割合は、例えば、１％以上としてもよい。
　逆相液体クロマトグラフィーにおける移動相の流速は０．４ｍＬ／分前後であり、カラムオーブンの温度は４０℃以上、５０℃以下であることが好ましい。
　分離工程において、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の各分子の分離は、２種の移動相を用いたグラジエント溶媒にて行うことができる。このような移動相の組成例として、水およびメタノール混液（１％酢酸含有）、メタノールおよびアセトニトリル混液（１％酢酸含有）等が挙げられる。
　（イオン化工程）
　イオン化工程においては、逆相液体クロマトグラフィー分離した分子をＭＳによりイオン化する。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）によって、イオン化する。
　イオン化工程におけるイオン化のイオン源は、例えば、ＥＳＩプローブである。このイオン化工程では、イオン源、オリフィスおよびイオン導入部の温度をそれぞれ４００～５００℃、２５０～４００℃及び２００～３００℃に設定することが好ましい。
　また、イオン化工程においては、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のイオン化を促進するイオン化促進剤を用いることが好ましい。このようなイオン化促進剤として、例えば、酢酸、ギ酸等の揮発性酸が挙げられる。また、イオン化工程において用いられるキャリアガスは、例えば、窒素ガスが挙げられる。
　（検出工程）
　検出工程においては、イオン化した分子をＭＳ分析し、試料に含まれる複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を検出する。この検出工程では、イオン化した分子を、三連四重極ＭＳ等の公知の質量分析装置を用いて解析する。
　検出工程においては、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類ごとに質量分析装置を変更することは必要なく、一度のＭＳ分析によって、試料に含まれる複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を包括的に検出することができる。
　検出工程においては、イオン化した胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析し、得られた質量電荷比（ｍ／ｚ比）に応じて複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類をそれぞれ識別する。
　（演算工程）
　胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、検出工程における検出結果に基づいて、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類分子を定量する演算工程をさらに包含してもよい。演算工程においては、検出工程における検出結果に基づいて、試料中の各成分のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを生成し、ピーク領域を測定することで、定量化してもよい。
　上記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法によれば、試料中に含まれる複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を、一度の逆相液体クロマトグラフィー、イオン化、及び検出処理工程により分析することができる。つまり、従来では一斉分析が従来困難であった胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類について、本分析方法では包括的な分析を実現できる。そのため、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を個別に検出する必要はなく、ハイスループットな分析を実現できる。
　重要な脂質成分である胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、健康維持だけでなく種々の疾患と相関があり、バイオマーカー候補として非常に有用である。本分析方法によれば、複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の包括的な分析が可能であるため、バイオマーカーとなる分子の探索や発見に有効である。
　〔胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システム〕
　本発明の一態様に係る分析システムは、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する装置、及び、分離した分子をイオン化し、イオン化した分子をＭＳ分析して、これらの複数の成分を検出する質量分析装置を備えている。すなわち、上記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、本発明の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システムにおいて実行される分析方法の一態様である。
　図１は、本発明の一実施形態に係る分析システムの要部構成を示すブロック図である。図１に示すように、分析システム１００は、液体クロマトグラフ（分離装置）１０、質量分析装置２０、及び演算装置３０を備えている。なお、分析システム１００において、液体クロマトグラフ１０及び質量分析装置２０は、それぞれ独立した装置であってもよいし、それぞれの装置の機能を備える一体の装置としてもよい。液体クロマトグラフ１０及び質量分析装置２０の機能を備える一体の装置として、公知の逆相液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いることができる。
　（液体クロマトグラフ）
　液体クロマトグラフ１０は、逆相液体クロマトグラフィーにより試料を分離する装置である。液体クロマトグラフ１０は、従来公知の液体クロマトグラフ装置であり得、商業的に入手可能な装置を好適に使用可能である。液体クロマトグラフ１０により分離する試料は、当該装置における分離に適した状態に調整した試料であり得、例えば、試料を溶媒により抽出した溶媒抽出液である。
　液体クロマトグラフ１０により、試料中の標的成分である胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を成分ごとに分離することができる。液体クロマトグラフ１０により分離された成分は、質量分析装置２０に導入される。
　（質量分析装置）
　質量分析装置２０は、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類をＭＳ分析する装置である。質量分析装置２０は、液体クロマトグラフ１０により分離した分子をイオン化するイオン化部２１と、イオン化した分子をＭＳ分析し、試料に含まれる胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から複数の成分を検出する検出部２２とを有している。質量分析装置２０は、従来公知の質量分析装置であり得、商業的に入手可能な装置を好適に使用可能である。
　質量分析装置２０に導入された試料は、まず、イオン化部２１に導入され、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子がイオン化される。検出部２２は、イオン化部２１においてイオン化された分子を、質量電荷比（ｍ／ｚ比）に応じて分離し、検出する。質量分析装置２０における検出結果は、演算装置３０に出力される。
　（演算装置）
　演算装置３０は、質量分析装置２０から出力された検出結果に基づいて、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを生成し、ピーク領域を測定することで、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を定量する。
　演算装置３０は、例えば、ＭＳ分析に係る演算を実行するソフトウェアが組み込まれており、演算結果を格納するメモリ、演算結果を表示するディスプレイ等を備えたコンピュータであり得る。
　＜ソフトウェアによる実現例＞
　演算装置３０による演算は、集積回路（ＩＣチップ）等に形成された論理回路（ハードウェア）によって実現してもよいし、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を用いてソフトウェアによって実現してもよい。
　後者の場合、演算装置３０は、各機能を実現するソフトウェアであるプログラムの命令を実行するＣＰＵ、上記プログラムおよび各種データがコンピュータ（又はＣＰＵ）で読み取り可能に記録されたＲＯＭ（Read Only Memory）又は記憶装置（これらを「記録媒体」と称する）、上記プログラムを展開するＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えている。そして、コンピュータ（又はＣＰＵ）が上記プログラムを上記記録媒体から読み取って実行することにより、本発明の目的が達成される。上記記録媒体としては、「一時的でない有形の媒体」、例えば、テープ、ディスク、カード、半導体メモリ、プログラマブルな論理回路などを用いることができる。また、上記プログラムは、該プログラムを伝送可能な任意の伝送媒体（通信ネットワークや放送波等）を介して上記コンピュータに供給されてもよい。なお、本発明は、上記プログラムが電子的な伝送によって具現化された、搬送波に埋め込まれたデータ信号の形態でも実現され得る。
　胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システム１００によれば、試料中に含まれる複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を、一度の逆相液体クロマトグラフィー、イオン化、及び検出処理により包括的に分析することができる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　毛髪及び血清中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を、下記に示すように一斉分析した。
　〔抽出〕
　健常男性及び健常女性ヒト検体から採取した毛髪１ｍｇを２００μＬのメタノールに懸濁した後、１００μＬのクロロホルム及び２０μＬの水を添加し、攪拌した。混合液を攪拌した後、遠心分離を行い、上清をＭＳ分析計用測定バイアルに回収した。回収した上清を逆相ＬＣ－ＭＳによる分析に供した。
　市販のヒト標準血清（コージンバイオ株式会社製、ロット番号: ＢＪ１０２９０Ａ）２０μＬを９０μＬのメタノールに懸濁した後、１０μＬの水および８μＬの８ｍｏｌ／Ｌ　水酸化カリウムを添加した。混合液を攪拌し、夾雑物のけん化反応を行った。けん化反応を、酢酸及び水を添加することにより停止させた。
　その後、ブタノール、ヘプタンおよび酢酸エチルを用いた液－液抽出法により試料を回収した。まず、ブタノールを添加した後、攪拌した。次いで、ヘプタン及び酢酸エチル混液を添加後、攪拌し、遠心分離を行った。二層に分離後、上層の有機層を回収した（上層１）。残った下層に、ヘプタン及び酢酸エチル混液を再び添加し、攪拌及び遠心分離を行った。二層に分離後、上層を回収した（上層２）。得られた上層１及び上層２を同一のチューブにまとめた後、窒素により乾固した。この乾固後、メタノール、クロロホルム及び水の混合液で再溶解し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。
　〔分離〕
　抽出した試料の逆相液体クロマトグラフィーによる分離を、超高速液体クロマトグラフＮＥＸＥＲＡ　Ｘ２（株式会社島津製作所製）において、以下の通り行った。逆相液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤として、超高速液体クロマトグラフィー用の逆相充填剤を用いた。酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにて用いる移動相として２種の移動相を用い、グラジエント溶出を行った。移動相として、水とメタノールとの混合溶媒、及び、メタノールとアセトニトリルとの混合溶媒を用いた。それぞれの混合溶媒に、メタノールに対して１％の割合で酢酸を添加した。逆相液体クロマトグラフィーにおける移動相の流速を０．４ｍＬ／分、カラムオーブンの温度を４０℃とした。
　〔イオン化〕
　分離した分子のイオン化を、三連四重極型ＬＣＭＳ－８０６０システム（株式会社島津製作所製）において、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）により行った。イオン源、オリフィスおよびイオン導入部の温度をそれぞれ４５０～５００℃、３５０～４００℃および２５０～３００℃に設定した。イオン化促進剤として、酢酸を用い、キャリアガスとして窒素ガスを用いた。
　〔検出〕
　イオン化した分子は、前記のＬＣＭＳ－８０６０システムにおいてＭＳ分析し、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の各成分を識別及び定量した。
　〔結果〕
　図２～３及び表１に示すように、ヒト血清から抽出した試料中の４９種の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を包括的にＭＳ分析できた。また、図４及び表２に示すように、ヒト毛髪から抽出した試料中の２４種のステロール類、及びホルモン類を包括的にＭＳ分析できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明は、健康状態や疾患を予想又は診断する医療分野等に利用することができる。
　１０　　液体クロマトグラフ（分析装置）
　２０　　質量分析装置
　２１　　イオン化部
　２２　　検出部
　３０　　演算装置
　１００　分析システム

Claims (9)

  1. 　逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する工程と、
    　分離した前記の分子をイオン化する工程と、
    　イオン化した前記の分子をＭＳ分析して検出する工程と
    を包含する、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  2. 　前記の分離する工程において、酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する、請求項１に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  3. 　前記のイオン化する工程において、ＥＳＩ法により前記の分子をイオン化する、請求項１又は２に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  4. 　前記の分離する工程における試料は、生体から採取した生体試料からの抽出物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  5. 　前記の分離する工程の前に、生体から採取した生体試料から溶媒抽出又は固相抽出により前記の試料を抽出する工程をさらに包含する、請求項１から３のいずれか１項に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  6. 　前記の生体試料は、皮膚、爪、臓器、組織、細胞、血液、尿、髄液、糞便、及び盲腸内容物からなる群より選択される、請求項４又は５に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  7. 　前記の生体試料は、毛である、請求項４又は５に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  8. 　前記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、胆汁酸類、コレステロール類縁体類、オキシステロール類、ビタミンＤ類、ホルモン類、及び甲状腺ホルモン類からなる群より選択される成分である、請求項１から７のいずれか１項に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
  9. 　逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する装置、及び
    　分離した前記の分子をイオン化し、イオン化した前記の分子をＭＳ分析して検出する質量分析装置
    を備えた、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システム。
     
PCT/JP2020/033613 2020-09-04 2020-09-04 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム WO2022049726A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237010612A KR20230054473A (ko) 2020-09-04 2020-09-04 담즙산류, 스테롤류 및 호르몬류의 분석 방법 및 분석 시스템
US18/023,220 US20230296574A1 (en) 2020-09-04 2020-09-04 Analysis method and analysis system for bile acids, sterols, and hormones
CN202080103725.7A CN116075720A (zh) 2020-09-04 2020-09-04 胆汁酸类、固醇类及激素类的分析方法及分析系统
PCT/JP2020/033613 WO2022049726A1 (ja) 2020-09-04 2020-09-04 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム
EP20952461.0A EP4209782A4 (en) 2020-09-04 2020-09-04 ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS SYSTEM FOR BILE ACIDS, STEROLS AND HORMONES

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2020/033613 WO2022049726A1 (ja) 2020-09-04 2020-09-04 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022049726A1 true WO2022049726A1 (ja) 2022-03-10

Family

ID=80491871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/033613 WO2022049726A1 (ja) 2020-09-04 2020-09-04 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230296574A1 (ja)
EP (1) EP4209782A4 (ja)
KR (1) KR20230054473A (ja)
CN (1) CN116075720A (ja)
WO (1) WO2022049726A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114577949A (zh) * 2022-03-15 2022-06-03 北京华氏精恒医药科技有限公司 一种基于lc-ms/ms法检测25-羟基胆固醇的方法、试剂盒及其应用
CN115201357A (zh) * 2022-06-17 2022-10-18 陕西盘龙医药研究院 一种小儿咽扁颗粒中猪去氧胆酸的限量检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04365500A (ja) * 1991-06-12 1992-12-17 Tokyo Tanabe Co Ltd 胆汁酸の一斉分析法
JP2003139753A (ja) * 2001-11-02 2003-05-14 Mitsubishi Pharma Corp 胆汁酸１８成分の一斉分析法
JP2007132741A (ja) 2005-11-09 2007-05-31 Aska Pharmaceutical Co Ltd ステロイドの測定方法
JP2013541022A (ja) * 2010-10-29 2013-11-07 コヒーシブ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 広範囲の疎水性を有する被検成分の精製及び検出のためのｌｃ−ｍｓ構成
JP2015031541A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 株式会社Ｌｓｉメディエンス 胆汁酸同時分析方法
JP2017067510A (ja) * 2015-09-29 2017-04-06 花王株式会社 脂質の質量分析方法
JP2018077250A (ja) * 2009-12-11 2018-05-17 クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド 複合試料中のステロイド化合物の質量分析

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7618827B2 (en) * 2003-04-14 2009-11-17 Georgetown University Thyroid hormone analysis by mass spectrometry
US20130316462A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Rapid and high-throughput analysis of sterols/stanols or derivatives thereof
GB201215924D0 (en) * 2012-09-06 2012-10-24 Univ Swansea Kit and method for quantitative detection of steroids
WO2015161078A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 The Regents Of The University Of California Methods for comprehensive profiling of steroid metabolome

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04365500A (ja) * 1991-06-12 1992-12-17 Tokyo Tanabe Co Ltd 胆汁酸の一斉分析法
JP2003139753A (ja) * 2001-11-02 2003-05-14 Mitsubishi Pharma Corp 胆汁酸１８成分の一斉分析法
JP2007132741A (ja) 2005-11-09 2007-05-31 Aska Pharmaceutical Co Ltd ステロイドの測定方法
JP2018077250A (ja) * 2009-12-11 2018-05-17 クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド 複合試料中のステロイド化合物の質量分析
JP2013541022A (ja) * 2010-10-29 2013-11-07 コヒーシブ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 広範囲の疎水性を有する被検成分の精製及び検出のためのｌｃ−ｍｓ構成
JP2015031541A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 株式会社Ｌｓｉメディエンス 胆汁酸同時分析方法
JP2017067510A (ja) * 2015-09-29 2017-04-06 花王株式会社 脂質の質量分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA HONDAKOUWA YAMASHITATAKASHI HARATADASHI IKEGAMITERUO MIYAZAKIMUTSUMI SHIRAIGUORONG XUMITSUTERU NUMAZAWAYASUSHI MATSUZAKI: "Highly sensitive quantification of key regulatory oxysterols in biological samples by LC-ESI-MS/MS", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 50, no. 2, 2009, pages 350 - 7
GOTO, JUNICHI ET AL.: "Determination of Bile Acids by HPLC", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL CHEMISTRY, vol. 9, no. 2, 1980, pages 126 - 133, XP055913769 *
HAGIO MASAHITO, MEGUMI MATSUMOTO, MICHIHIRO FUKUSHIMA, HIROSHI HARA, SATOSHI ISHIZUKA: "Imroved analysis of bile acids in tissues and intestinal contents of rats using LC/ESI-MS", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 50, no. 1, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 173 - 180, XP055913763 *
JEFFREY G. MCDONALDDANIEL D. SMITHASHLEE R. STILESDAVID W. RUSSELL: "A comprehensive method for extraction and quantitative analysis of sterols and secosteroids from human plasma", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 53, no. 7, 2012, pages 1399 - 409
TENG-FEI YUANJUAN LESHAO-TING WANGYAN LI: "An LC/MS/MS method for analyzing the steroid metabolome with high accuracy and from small serum samples", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 61, no. 4, 2020, pages 580 - 586

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114577949A (zh) * 2022-03-15 2022-06-03 北京华氏精恒医药科技有限公司 一种基于lc-ms/ms法检测25-羟基胆固醇的方法、试剂盒及其应用
CN115201357A (zh) * 2022-06-17 2022-10-18 陕西盘龙医药研究院 一种小儿咽扁颗粒中猪去氧胆酸的限量检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116075720A (zh) 2023-05-05
US20230296574A1 (en) 2023-09-21
KR20230054473A (ko) 2023-04-24
EP4209782A1 (en) 2023-07-12
EP4209782A4 (en) 2023-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Keevil LC–MS/MS analysis of steroids in the clinical laboratory
Keevil Novel liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methods for measuring steroids
Gosetti et al. Ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry determination and profiling of prohibited steroids in human biological matrices. A review
Higashi et al. Chemical derivatization for enhancing sensitivity during LC/ESI–MS/MS quantification of steroids in biological samples: a review
US8470602B2 (en) Methods and systems for determining the presence or amount of delta 5 steroid compounds in a sample
Griffiths et al. Analytical strategies for characterization of oxysterol lipidomes: liver X receptor ligands in plasma
Ye et al. High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with intrahepatic cholestasis of pregnancy
US8415162B2 (en) Measuring levels of a metabolite
Moon et al. Metabolic profiling of cholesterol and sex steroid hormones to monitor urological diseases
WO2022049726A1 (ja) 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム
Sjövall et al. Newer approaches to the isolation, identification, and quantitation of steroids in biological materials
JP2008534955A (ja) 質量分析法による有利サイロキシンおよび遊離トリヨードサイロニン分析
WO2015161078A1 (en) Methods for comprehensive profiling of steroid metabolome
Honour et al. The evolution of methods for urinary steroid metabolomics in clinical investigations particularly in childhood
Hill et al. A method for determination of one hundred endogenous steroids in human serum by gas chromatography-tandem mass spectrometry
Qin et al. Parallel derivatization strategy coupled with liquid chromatography-mass spectrometry for broad coverage of steroid hormones
Griffiths et al. Analytical strategies for characterization of bile acid and oxysterol metabolomes
Teubel et al. Determination of neurosteroids in human cerebrospinal fluid in the 21st century: A review
KR101068993B1 (ko) 정량적인 스테로이드 인식 기술을 이용한 뇨 시료 간 대사 차별성 평가 방법
JP6806948B1 (ja) 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム
Shackleton et al. Midgestational maternal urine steroid markers of fetal Smith–Lemli–Opitz (SLO) syndrome (7-dehydrocholesterol 7-reductase deficiency)
Cawley et al. Complementary stable carbon isotope ratio and amount of substance measurements in sports anti‐doping
Genangeli et al. Simultaneous quantitation of 9 anabolic and natural steroidal hormones in equine urine by UHPLC-MS/MS triple quadrupole
Kunz et al. A comprehensive method to determine sterol species in human faeces by GC-triple quadrupole MS
Li et al. Simultaneous determination of sex hormones and bile acids in rat plasma using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20952461

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237010612

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020952461

Country of ref document: EP

Effective date: 20230404

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP