JP6806948B1 - 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一態様に係る分析方法は、前処理工程において試料中の分子を誘導体化する必要がなく、逆相液体クロマトグラフィーにより胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する工程と、分離した前記の分子をイオン化する工程と、イオン化した前記の分子をMS分析し、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の複数の成分を検出する工程とを包含する。
本分析方法の対象となる試料は、特に限定されないが、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を含有する可能性のある試料であり得る。また、これらの試料については、ヒト、動物、植物から採取した試料又は生体から調製した生体試料であってもよい。さらに、生体試料は、皮膚、爪、臓器、組織、細胞、血液、尿、髄液、糞便、及び盲腸内容物からなる群より選択されるものであり得る。
分析の対象となる試料は、生体から抽出した試料であってもよい。この生体からの試料の抽出については、溶媒抽出や固相抽出等の公知の方法により実現することができる。すなわち、本発明の一態様に係る分析方法は、前記の分離工程の前に、生体試料から胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を抽出する工程を包含してもよい。
本分析方法において検出される胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、主にコレステロールを前駆体とする成分である。胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、胆汁酸類、コレステロール類縁体類、オキシステロール類、ビタミンD類、ホルモン類、及び甲状腺ホルモン類からなる群より選択される成分であり得る。コレステロール類縁体類には、コレステロール類、コレステロール前駆体、及びフィトステロール類が含まれる。胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、生体内で生合成された胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類であってもよいし、植物などの外来の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類であってもよい。
分離工程においては、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する。この分離工程では、試料を逆相液体クロマトグラフィーに供することにより、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を分子ごとに分離する。分離工程に供する試料は、逆相液体クロマトグラフィーに適した状態に調整されたものであることが好ましく、例えば、試料を溶媒により抽出したものである。また、分離工程においては、酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにより試料を分離する。
イオン化工程においては、逆相液体クロマトグラフィー分離した分子をMSによりイオン化する。例えば、エレクトロスプレーイオン化法(ESI法)によって、イオン化する。
検出工程においては、イオン化した分子をMS分析し、試料に含まれる複数の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類を検出する。この検出工程では、イオン化した分子を、三連四重極MS等の公知の質量分析装置を用いて解析する。
胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、検出工程における検出結果に基づいて、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類分子を定量する演算工程をさらに包含してもよい。演算工程においては、検出工程における検出結果に基づいて、試料中の各成分のMS及びMS/MSスペクトルを生成し、ピーク領域を測定することで、定量化してもよい。
本発明の一態様に係る分析システムは、逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する装置、及び、分離した分子をイオン化し、イオン化した分子をMS分析して、これらの複数の成分を検出する質量分析装置を備えている。すなわち、上記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法は、本発明の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システムにおいて実行される分析方法の一態様である。
液体クロマトグラフ10は、逆相液体クロマトグラフィーにより試料を分離する装置である。液体クロマトグラフ10は、従来公知の液体クロマトグラフ装置であり得、商業的に入手可能な装置を好適に使用可能である。液体クロマトグラフ10により分離する試料は、当該装置における分離に適した状態に調整した試料であり得、例えば、試料を溶媒により抽出した溶媒抽出液である。
質量分析装置20は、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類をMS分析する装置である。質量分析装置20は、液体クロマトグラフ10により分離した分子をイオン化するイオン化部21と、イオン化した分子をMS分析し、試料に含まれる胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から複数の成分を検出する検出部22とを有している。質量分析装置20は、従来公知の質量分析装置であり得、商業的に入手可能な装置を好適に使用可能である。
演算装置30は、質量分析装置20から出力された検出結果に基づいて、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類のMS及びMS/MSスペクトルを生成し、ピーク領域を測定することで、試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を定量する。
演算装置30による演算は、集積回路(ICチップ)等に形成された論理回路(ハードウェア)によって実現してもよいし、CPU(Central Processing Unit)を用いてソフトウェアによって実現してもよい。
健常男性及び健常女性ヒト検体から採取した毛髪1mgを200μLのメタノールに懸濁した後、100μLのクロロホルム及び20μLの水を添加し、攪拌した。混合液を攪拌した後、遠心分離を行い、上清をMS分析計用測定バイアルに回収した。回収した上清を逆相LC−MSによる分析に供した。
抽出した試料の逆相液体クロマトグラフィーによる分離を、超高速液体クロマトグラフNEXERA X2(株式会社島津製作所製)において、以下の通り行った。逆相液体クロマトグラフィー用カラムの充填剤として、超高速液体クロマトグラフィー用の逆相充填剤を用いた。酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにて用いる移動相として2種の移動相を用い、グラジエント溶出を行った。移動相として、水とメタノールとの混合溶媒、及び、メタノールとアセトニトリルとの混合溶媒を用いた。それぞれの混合溶媒に、メタノールに対して1%の割合で酢酸を添加した。逆相液体クロマトグラフィーにおける移動相の流速を0.4mL/分、カラムオーブンの温度を40℃とした。
分離した分子のイオン化を、三連四重極型LCMS−8060システム(株式会社島津製作所製)において、エレクトロスプレーイオン化法(ESI法)により行った。イオン源、オリフィスおよびイオン導入部の温度をそれぞれ450〜500℃、350〜400℃および250〜300℃に設定した。イオン化促進剤として、酢酸を用い、キャリアガスとして窒素ガスを用いた。
イオン化した分子は、前記のLCMS−8060システムにおいてMS分析し、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の各成分を識別及び定量した。
20 質量分析装置
21 イオン化部
22 検出部
30 演算装置
100 分析システム
Claims (8)
- 逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する工程と、
分離した前記の分子をイオン化する工程と、
イオン化した前記の分子をMS分析して検出する工程と
を包含し、
前記の分離する工程において、酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。 - 前記のイオン化する工程において、ESI法により前記の分子をイオン化する、請求項1に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 前記の分離する工程における試料は、生体から採取した生体試料からの抽出物である、請求項1又は2に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 前記の分離する工程の前に、生体から採取した生体試料から溶媒抽出又は固相抽出により前記の試料を抽出する工程をさらに包含する、請求項1から3のいずれか1項に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 前記の生体試料は、皮膚、爪、臓器、組織、細胞、血液、尿、髄液、糞便、及び盲腸内容物からなる群より選択される、請求項3又は4に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 前記の生体試料は、毛である、請求項3又は4に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 前記の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類は、胆汁酸類、コレステロール類縁体類、オキシステロール類、ビタミンD類、ホルモン類、及び甲状腺ホルモン類からなる群より選択される成分である、請求項1から6のいずれか1項に記載の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法。
- 逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類から選択される複数の分子を分離する装置、及び
分離した前記の分子をイオン化し、イオン化した前記の分子をMS分析して検出する質量分析装置
を備え、
前記の分離する装置において、酸性条件下における逆相液体クロマトグラフィーにより試料中の胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分子を分離する、胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析システム。
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