CN101744869B

CN101744869B - 用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物

Info

Publication number: CN101744869B
Application number: CN2008101890236A
Authority: CN
Inventors: 师彦平; 陈娟
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2028-12-19
Also published as: CN101744869A

Abstract

本发明公开了一种用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物。组合物由组分A和组分B组成，该组合物的组分A和组分B是在中药古方黄芪六一汤的基础上，从黄芪、甘草药材中经水煎煮、乙醇沉淀、有机溶剂萃取或者大孔吸附树脂分离得到，组分A与组分B按质量比1∶1进行组合构成。经体外细胞葡萄糖消耗实验证明，该组合物能促进HePG2细胞的葡萄糖消耗；动物体内实验证明，该组合物对四氧嘧啶所致的高血糖大鼠有明显的降低血糖作用，具有增加肝细胞对葡萄糖的摄取，促进肝糖原合成的作用，并能调整血脂的紊乱状态，对胰腺和肝组织病变有改善作用。

Description

用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物

技术领域

本发明涉及一种用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物。

背景技术

糖尿病是一种全球范围内的严重危害人类健康的常见内分泌代谢性疾病。糖尿病不仅发病率高，而且由此引发的心、脑、肾、眼、周围血管、神经等全身多系统和多器官的慢性并发症，是导致糖尿病致残率和病死率的主要原因，因此，糖尿病已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病的第三大杀手。努力探索和积极寻找治疗和控制糖尿病的理想方法和药物，已成为当今世界医学亟待解决和攻克的重点课题之一。中医药治疗糖尿病，从整体调节入手，立足于辨证论治，强调辨证求因，审因论治，因人因时因地制宜，具有用药灵活，疗效稳定，标本兼治，无明显毒副作用等优点，尤其在糖尿病慢性并发症的防治方面显示出明显优势，为世界医学所瞩目。为此，从治疗糖尿病的大量中药古方中筛选出高效、低毒的活性组分，研制成现代中药，是目前在糖尿病治疗药研究方面的热点之一。

古方黄芪六一汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由黄芪6份、甘草1份组成，具有益气扶正，生津止渴之功用，主治消渴(即现代医学上的糖尿病)。现代许多医家应用该方或在此基础上与其它药味进行配伍治疗2型糖尿病取得了很好的治疗效果。然而，在临床应用中，均是将原料药加水煎煮制成汤剂，工艺简单粗糙，服用量大，且活性组分不明确，作用机制不清楚。

发明内容

本发明提供了一种用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物。

复方提取物组合物，由组分A和组分B组成，该组合物的组分A和组分B是在中药古方黄芪六一汤的基础上，从黄芪、甘草药材中经水煎煮、乙醇沉淀、有机溶剂萃取或者大孔吸附树脂分离得到，组分A与组分B按质量比1∶1进行组合构成。

一种用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物，其特征在于该组合物由组分A与组分B，组分A与组分B的质量比为1∶1；

其中组分A通过以下步骤制备：

a、将黄芪、甘草两种药材按质量比6∶1比例混合，加水按常规煎煮，得提取液；

b、上述提取液浓缩至浓度为每1ml含生药0.8-1.2g，加入乙醇使浓缩液含醇量为55-75wt％，然后经过静置和分离得到上清液和沉淀物；

c、沉淀部分用乙醇洗涤后真空干燥成浸膏粉，得组分A；

其中组分B通过以下步骤制备：

步骤b的上清液回收溶剂后，加水溶解，依次用乙醚、正丁醇萃取，正丁醇萃取液减压浓缩后，真空干燥，粉碎制成浸膏粉，得组分B。

本发明所述的组分B也能够通过以下步骤制备：

步骤b的上清液回收溶剂后，加水溶解，大孔吸附树脂分离，依次用水，20％-80wt％乙醇洗脱，收集50％-70wt％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎制成浸膏粉，得组分B。

本发明的组合物中，组分A中含有多糖，多糖含量为45-55wt％(比色法测定)。

本发明的组合物中，组分B中含有皂苷类和黄酮类化合物，含量分别为25-40wt％和35-50wt％(比色法测定)。

我们通过高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用技术(HPLC-PDA-MSⁿ)以及采用常规的硅胶、聚酰胺等普通敞口柱色谱进行分离、制备与纯化，并依据核磁共振(NMR)、质谱(MS)、紫外(UV)、红外光谱(IR)等光谱和波谱技术进行结构确定，确定组分B中主要成分含有新西兰牡荆苷II、烟花苷、甘草素葡萄糖鼠李糖苷、葡糖基甘草苷、甘草素-7，4’二葡萄糖苷、异佛来心苷、甘草素-4’-芹糖基(1→2)葡糖糖苷、甘草素-7-O-β-D-呋喃芹糖-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘草苷、新甘草苷、异甘草素-葡糖糖芹糖苷、异甘草素、甘草糖苷A、甘草糖苷B、甘草酸、黄芪皂苷III、黄芪皂苷IV、黄芪皂苷V、黄芪皂苷VI、黄芪皂苷VII、黄芪皂苷IX、黄芪皂苷XI、黄芪皂苷B以及黄芪皂苷D。

组合物的应用：按药剂学方法，将所得提取物组合物加入药用辅料，能够制备成多种临床药物制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂中的任何一种。

我们通过测定四氧嘧啶所致的高血糖小鼠服药前后的血糖变化，观察比较原方、组分A、组分B及组合物的降糖效果，结果本发明组合物的降糖效果优于原方和各组分。

经体外细胞葡萄糖消耗实验证明，本发明提取物组合物能促进与人肝细胞表型极为相似的肝胚胎瘤细胞株HePG2的葡萄糖消耗。动物体内实验证明，本发明提取物组合物对四氧嘧啶所致的高血糖大鼠有明显的降低血糖作用，具有增加肝细胞对葡萄糖的摄取，促进肝糖原合成的作用，并能调整血脂的紊乱状态，对胰腺和肝组织病变也有明显改善作用。说明本发明提取物组合物具有很好的防治糖尿病的作用。

本发明的主要特点是本组合物源于具有重要临床应用背景的治疗消渴症的中药古方黄芪六一汤，并通过现代分离技术获得有效组分，由有效组分组成组合物，该组合物保留并突出了原方的抗糖尿病主效应，且药效物质明确，作用机理清楚。

具体实施方式

实施例1

将黄芪、甘草两种药材按6∶1比例混合，加水煎煮两次，每次加水量为药材量的10倍，煎煮时间为2小时。各次提取液过滤，合并滤液，减压浓缩至每1ml含1g生药的浓度，浓缩液加入乙醇使药液中含醇量为55％，静置12小时。沉淀用95％乙醇洗涤，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分A。上清液回收溶剂后，加适量水，用等体积的乙醚萃取3次后，用等体积的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分B。组分A和组分B按1∶1混合均匀，得组合物。

实施例2

将黄芪、甘草两种药材按6∶1比例混合，加水煎煮两次，每次加水量为药材量的12倍，煎煮时间为2小时。各次提取液过滤，合并滤液，减压浓缩至每1ml含0.8g生药的浓度，浓缩液加入乙醇使药液中含醇量为75％，静置12小时。沉淀用95％乙醇洗涤，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分A。上清液回收溶剂后，加适量水，上D101型大孔吸附树脂柱上，依次以水、30％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分B。组分A和组分B按1∶1混合均匀，得组合物。

实施例3

将黄芪、甘草两种药材按6∶1比例混合，加水煎煮两次，每次加水量为药材量的12倍，煎煮时间为1.5小时。药液过滤，合并滤液，减压浓缩至每1ml含1.2g生药的浓度，浓缩液加入乙醇使药液中含醇量为65％，静置12小时。沉淀用95％乙醇洗涤，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分A。上清液回收溶剂后，加适量水，上AB-8型大孔吸附树脂柱上，依次以水、20％乙醇、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂，真空干燥，粉碎成浸膏粉，得组分B。组分A和组分B按1∶1混合均匀，得组合物。

实施例4

制备胶囊剂

配方及配比

提取物组合物	280g
		淀粉	28g
90％乙醇	适量

按上述配比，将提取物组合物和淀粉分别过80目筛，混匀，用90％乙醇制软材，过40目筛，50℃干燥2小时，干燥颗粒过40目筛整粒，装入胶囊，制得1000粒胶囊。

实施例5

提取物组合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量的促进实验

1.实验材料

1.1药物与试剂

提取物组合物(由实施例1而来)；盐酸二甲双胍(上海医药集团有限公司信谊制药总厂)；DMEM培养基(GIBCO)；胰蛋白酶(Sino-American BiotechnologyCo.)；小牛血清(兰州民海生物工程有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sino-American Biotechnology Co.)；乙二胺四乙酸钠(EDTA，天津化学试剂有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津化学试剂有限公司)；葡萄糖酶法测定试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)。

1.2仪器

CO₂培养箱(SHEL.LAB 2300，美国)；倒置显微镜(OPTON IM 35)；酶标仪(WallAc 1420，芬兰)；紫外可见分光光度计(722S，上海精密科学仪器有限公司)；振荡器(SYM-B10，上海新波生物技术有限公司)。

1.3细胞株

HepG2细胞株由兰州医学院第一附属医院中心实验室提供。

2.实验方法

2.2.1细胞培养

HepG2细胞接种于细胞培养瓶，用含10％灭活小牛血清的低糖(5.5mM)DMEM培养液在37℃，5％CO₂条件下培养，每2天换一次液，消化液采用胰蛋白酶及EDTA消化液，胰蛋白酶终浓度为0.25％，EDTA终浓度为0.02％，并进行计数、传代。

2.2.2 HepG2细胞葡萄糖消耗试验

将HepG2细胞接种于96孔板，每竖排4个孔为一组，其中第1竖排不铺细胞，作为空白组。铺板后待细胞长至70～80％融合，将原培养液吸出，进行如下分组干预：

空白组：加入180μL含10％小牛血清的DMEM培养液和20μL DMEM培养液。

对照组：加入180μL含10％小牛血清的DMEM培养液和20μL DMEM培养液。

二甲双胍组：加入180μL含10％小牛血清的DMEM培养液和20μL 300mg·mL^-1的二甲双胍溶液(用DMEM培养液配制)。

提取物组合物组：分别加入180μL含10％小牛血清的DMEM培养液和20μL提取物组合物溶液(用DMEM培养液配制，浓度分别为480、240、120mg·mL^-1)

孵育24小时后，将培养液移出并用葡萄糖氧化酶法测定培养液中的葡萄糖含量，以空白组的葡萄糖含量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是24小时各孔细胞的葡萄糖消耗量。

上述实验分别在培养液葡萄糖浓度为5.5、11.1、22.2mM的条件下重复3次(不同浓度葡萄糖的培养液由低糖DMEM加入不同量的葡萄糖后抽滤而成)，实验结果为3次的平均值。

2.2.3 MTT法

用生理盐水配制5g·L^-1的MTT溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。在上述HepG2细胞葡萄糖消耗试验24小时孵育结束移出培养液后，每孔加入180μL含10％小牛血清的DMEM培养液，并加入20μL MTT溶液，继续孵育4小时，然后将培养液吸尽，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡器上混匀后置酶标仪上于570nm处测定吸光度值。

3.实验结果

见表1，表2和表3。

表1.低糖条件下组合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(x±s)

表2.中糖条件下组合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(x±s)

表3.高糖条件下组合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(x±s)

与对照组相比^**P＜0.01 ^***P＜0.001

结果可知，提取物组合物在低、中、高三种葡萄糖浓度下，均能显著促进HePG2细胞的葡萄糖消耗量，而且中剂量与二甲双胍作用相当，说明它不仅能提高肝细胞的基础糖耗量，而且还可能改善了高葡萄糖诱导的胰岛素抵抗；MTT实验表明，提取物组合物对HePG2细胞的增殖无抑制作用，说明其降糖作用并非通过提高细胞数量来完成。

实施例6

提取物组合物对四氧嘧啶糖尿病大鼠的防治作用

1.实验材料

1.1实验动物

Wistar大白鼠(品系一级标准)，体重200±20g，雄性，由兰州医学院实验动物中心提供。

1.2药物与试剂

提取物组合物(由实施例2而来)；消渴丸(广州中一药业有限公司)；四氧嘧啶(Fluka公司)；胰岛素放射免疫测定盒(北京北方生物技术研究所)；胰高血糖素放射免疫测定盒(北京北方生物技术研究所)；其余试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3仪器

721分光光度计(上海第三仪器厂)；20全自动生化仪(美国贝克曼库尔特公司)；TGL-16G冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；Leica组织切片机(德国)；Leica生物显微镜(德国)；JEM 1230电子显微镜(日本)；SN-695B智能γ计数仪(上海原子核研究所日环仪器厂)。

2.实验方法

取大鼠110只，禁食12小时后，随机取10只作为正常对照组。其余大鼠腹腔注射1.5％四氧嘧啶生理盐水溶液，剂量为120mg/kg，72小时后，禁食12小时，大鼠眼眶静脉取血，测定血糖值，将血糖值大于18.7mmol/L的大鼠用于实验。随机分为5组：模型对照组，消渴丸组，提取物组合物高、中、低剂量组。各给药组分别灌胃给予消渴丸0.58g/kg，组合物11.6g/kg，5.8g/kg，2.9g/kg，正常对照组和模型对照组给予同体积的蒸馏水，每日1次，连续14天。末次给药后24小时测定血糖、肝糖原、血脂、胰岛素、胰高血糖素等指标，并进行胰腺、肝脏病理组织学光镜和电镜检测。

3实验结果

3.1一般情况的观察

造模前各组动物反应灵敏，毛发光滑，饮食正常，行动敏捷。造模后3-4天后，出现多饮、多食、多尿，精神萎靡。模型组“三多一少”的症状尤其明显，并逐渐出现体毛枯黄、稀疏，大便稀溏，形体消瘦，行动迟缓，反应迟钝等症状。而各治疗组的整体情况要优于模型组，饮水量、饮食量、尿量随治疗的进展逐渐减少并恢复接近正常水平，体重逐渐增加，体毛光滑，大便成形，活泼好动，反应迅速，尤以高、中剂量组为佳。消渴丸组和模型组比较也有改善。

3.2对血糖的影响(见表4)

表4.组合物对四氧嘧啶高血糖大鼠血糖的影响(x±s)

^**与正常对照组相比P＜0.01 ^△与模型对照组相比P＜0.05 ^△△与模型对照组相比P＜0.01

3.3对肝糖原的影响(见表5)

表5.组合物对四氧嘧啶高血糖大鼠肝糖原的影响(x±s)

^*与正常对照组相比P＜0.05 ^△与模型对照组相比P＜0.05 ^△△与模型对照组相比P＜0.01

3.4对血脂的影响(见表6)

表6.组合物对总胆固醇和甘油三酯的影响(x±s)

3.5对胰岛素的影响(见表7)

表7.组合物对四氧嘧啶高血糖大鼠胰岛素的影响(x±s)

^*与正常对照组相比P＜0.05

3.6对胰高血糖素的影响(见表8)

表8.组合物对四氧嘧啶高血糖大鼠胰高血糖素的影响(x±s)

^**与正常对照组相比P＜0.01

3.7胰腺组织学光镜观察结果

正常组大鼠胰腺结构清晰正常，于胰腺腺泡间可见多个胰岛细胞团，胰岛形状正常，胰岛的大小不一，小的由十多个细胞组成，大的有上百个细胞组成，胰岛细胞界限清晰，核清楚，呈蓝紫色，胞浆淡红色，细胞间毛细血管清晰可见。模型组大鼠胰腺结构正常，多数胰岛体积变小，细胞数量减少，其中多数细胞界限不清，胞浆疏松并空泡变性，有极少量炎性细胞浸润，胰腺间质个别小动脉管壁玻璃样变性。阳性对照组大鼠胰腺病变无明显改善。提取物组合物高、中剂量组大鼠胰岛数目有所增加，胞浆空泡变性减少，与模型组比较略有好转。低剂量组变化不明显。

3.8胰腺组织学电镜观察结果

正常组大鼠腺细胞结构正常。模型组大鼠腺细胞酶原颗粒减少，细胞质内有空泡变性，某些细胞核出现浓缩现象。阳性对照组大鼠变化不明显。提取物组合物高剂量组空泡减少，核趋于正常。中剂量组变化不明显。

3.9肝脏组织学光镜观察结果

正常组大鼠肝脏结构清晰正常，肝索排列整齐，细胞形态和大小正常。模型组大鼠肝脏结构清晰，部分肝索排列紊乱，中央静脉扩张淤血，多数肝细胞胞浆疏松，肝血窦受压变窄，汇管区有大量淋巴细胞浸润，个别小叶间动脉管壁玻璃样变性，另见数个点状坏死灶。阳性对照组大鼠肝脏病变无明显改善。提取物组合物高、中、低剂量组肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，汇管区有少量淋巴细胞浸润。

3.10肝脏组织学电镜观察结果

正常组大鼠肝脏细胞正常，核居中，核染色质分布均匀，位于中央，线粒体数量多，嵴比较整齐，毛细胆管腔大小正常，内有微绒毛，连接面出现紧密连接。模型组大鼠核位置偏离中央，核染色质有边集现象，出现凋亡核，细胞质内有空泡出现，内质网扩张，胆管扩张，细胞连接接隙变宽。阳性对照组变化不明显。提取物组合物高剂量组变化比较明显，尤其是细胞内空泡减少，核趋于正常。中剂量组变化不明显。

4实验结论

提取物组合物对四氧嘧啶所致的高血糖大鼠有明显的降低血糖的作用。具有增加肝细胞对葡萄糖的摄取，促进肝糖原合成的作用，并能调整血脂的紊乱状态，且呈现出明显的剂量依赖关系，以高、中剂量组效果最好。光镜和电镜学检测，高、中剂量组对糖尿病大鼠胰腺和肝组织病变有改善作用。未能表现出刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素升高的作用。

Claims

1.一种用于防治糖尿病的中药复方提取物组合物，其特征在于该组合物由组分A与组分B，组分A与组分B的质量比为1∶1；

其中组分A通过以下步骤制备：

c、沉淀部分用乙醇洗涤后真空干燥成浸膏粉，得组分A；

其中组分B通过以下步骤制备：

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于组分B通过以下步骤制备：

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于组分A中含有多糖，多糖含量为45-55wt％。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于组分B中含有皂苷类和黄酮类化合物，含量分别为25-40wt％和35-50wt％。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于组分B中含有新西兰牡荆苷II、烟花苷、甘草素葡萄糖鼠李糖苷、葡糖基甘草苷、甘草素-7，4’二葡萄糖苷、异佛来心苷、甘草素-4’-芹糖基(1→2)葡糖糖苷、甘草素-7-O-β-D-呋喃芹糖-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘草苷、新甘草苷、异甘草素-葡糖糖芹糖苷、异甘草素、甘草糖苷A、甘草糖苷B、甘草酸、黄芪皂苷III、黄芪皂苷IV、黄芪皂苷V、黄芪皂苷VI、黄芪皂苷VII、黄芪皂苷IX、黄芪皂苷XI、黄芪皂苷B以及黄芪皂苷D。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于按药剂学方法，将组合物加入药用辅料，能够制备成临床药物制剂。