CN1935169A

CN1935169A - 一种罗布麻提取物的制备方法及其药物制剂与应用

Info

Publication number: CN1935169A
Application number: CN 200610083712
Authority: CN
Inventors: 杨新波; 黄正明; 曹文斌; 陈红艳; 杨坤
Original assignee: Individual
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2007-03-28
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: CN100548319C

Abstract

本发明公开一种罗布麻总黄酮及其所含有效成分金丝桃苷、异槲皮苷、、槲皮素等。本发明还公开了罗布麻总黄酮的制备方法，其包括以下步骤，取罗布麻药材，加乙醇提取，回收乙醇，得醇浸膏，以沸水溶解，过滤，上清液上聚酰胺柱，先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥得干浸膏，用比色法测定罗布麻总黄酮含量，以此干浸膏为药用有效部位，罗布麻总黄酮含量达到50％以上，达到国家5类中药原料药标准。本发明罗布麻总黄酮用于抗衰老，抗脑缺血，对四氧嘧啶小鼠血糖及肾功能的影响。由于本发明洗脱剂无毒性，适用于工业化生产。因此，本发明为生产罗布麻5类原料药提供了高效、可行，且适用于工业应用的方法，为进一步进行罗布麻制剂研究打下了基础。

Description

一种罗布麻提取物的制备方法及其药物制剂与应用

技术领域

本发明属于植物药有效部位分离、纯化技术领域，可使罗布麻有效部位总黄酮含量大于50％，达到国家5类中药原料药标准。

罗布麻的药理活性，文献报道有罗布麻总黄酮的抗脑缺血作用，抗衰老作用研究，对四氧嘧啶小鼠血糖及肾功能的影响

背景技术

常用提取分离工艺为：醇提-水沉-乙酸乙酯提取法，得总黄酮，这些方法或有效成分损失大或成分被破坏，使得总黄酮得率低，成本高。因此需要研究一种新的简便、高效的提取分离方法，并适用于工业化生产。

发明内容

本发明目的在于公开制备罗布麻总黄酮的方法；文献报道有罗布麻总黄酮的抗脑缺血作用，抗衰老作用研究，对四氧嘧啶小鼠血糖及肾功能的影响。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

将干燥的罗布麻叶粉碎成粗粉，用10-30倍量的亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗滤提取，热提2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重1.15-1.30(70℃)的浸膏；加入原生药量4-6倍热水，分次溶解，静置24小时，过滤，滤液聚酰胺为载体的柱层析，用水冲洗及用水：醇比例为50∶50-5∶95的混合溶剂洗脱，收集水-醇洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻总黄酮提取物。

按药剂学方法，可以将本发明的罗布麻总黄酮制备成多种临床药物剂型作为保肝，降酶药物，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型中的一种。

第一部分罗布麻总黄酮的抗脑缺血作用

1.材料与方法

1.1动物：SD大鼠，体重300±30g，雄性，购自总医院动物中心。分成6组：对照组、假手术组、复方丹参注射液组(2000mg/kg、LBM总黄酮小、中、大三个剂量组。

1.2药物：罗布麻总黄酮由安徽天科药物研究所提供；氯代三苯基四氮唑(红四氮唑)购自北京试剂商店；肝素。

1.3模型制备

1.3.1手术：取鼠称重腹腔麻醉2％戊巴比妥钠0.2ml/100g，固定于鼠台上，剪开颈部皮肤，分离两侧颈总动脉和右侧颈外静脉，静脉插管，同时结扎右侧颈总动脉近心端，并插管记录正常血压，将鼠台置37℃恒温水浴锅上。

1.3.2给药：称取30、60、90mg罗布麻分别加入1mlPEG(药用)中，待加热溶解后加入1ml生理盐水，充分溶解后再加入3ml、6ml及9ml生理盐水摇匀。对照组：量取1mlPEG溶于生理盐水，摇匀即得。分别静脉给予三个剂量LBM总黄酮0.2ml/100g(30、60、90mg/kg)，30min后测血压，夹闭左颈总动脉，从右侧颈总动脉放血，再经静脉注入，持续30min后停止放血，3h后用NS从静脉注入，冲洗脑内浮血，处死，取出大脑，称重，冷冻后冠状切割约2mm厚的切片，放入TTC中染色30min，染色后用10％福尔马林固定24h照相。

2％戊巴比妥钠(0.2ml/100g)

染色剂：4％TTC(蒸馏水配制)

1.4观察指标：测大脑未染色面积(即脑梗死面积)，并计算梗死面积百分比。

1.5仪器：恒温水浴锅

2.结果

通过染色后观察大脑，可以看出没给药的大鼠的脑组织表面水肿，颜色浅白，梗塞面积接近全脑80％；罗布麻三个治疗组梗塞面积分别为65.8％、38.2及21.4％。表明罗布麻总黄酮对大鼠脑缺血有保护作用。见表1。

表1.罗布麻对大鼠全脑脑梗塞面积的影响

组别	剂量(mg/Kg)	脑梗塞面积(％)
组别	剂量(mg/Kg)	脑梗塞面积(％)	对照组LBM总黄酮LBM总黄酮LBM总黄酮假手术复方丹参注射液	3060902000	78.3±8.665.8±7.4^38.2±6.2^21.4±5.2^044.5±6.8^*

^*p＜0.05，^**p＜0.01与对照组比较

第二部分罗布麻总黄酮抗衰老作用研究

非酶糖基化(nonenyzymatic glycation，NEG)反应最早由Maillaid在研究食品工业时发现，现代医学已经把他作为糖尿病及其并发症的一种机理予以普遍承认。1985年Cexami A等[1]总结并提出了NEG其终末产物(AGEs)致衰老学说，目前得到一定认可。本部分用AGE-ELISA方法进行了罗布麻总黄酮抗NGE反应研究，观察了其抗衰老作用。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

D-半乳糖(D-galactose)，L-葡萄糖，6-磷酸葡萄糖，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶菌酶，氨基胍(Aminoguanidine-HCL，AG)等均为Sigma产品。AGE(糖基化终末产物)多克隆抗体由美国Picower医学研究中心惠赠。

1.2方法

(1)非酶糖基化抑制剂体外筛选模型的建立

在反应体系中试用了不同的蛋白质和还原糖类，检测AGE形成情况。最终确定选用BSA和D-半乳糖。

(2)AGE的检测：采用竞争性AGE-ELISA方法进行

(3)罗布麻总黄酮的制备

黄酮含量：本产品中含有5种黄酮苷成分，其中金丝桃苷含量为17.5％，异槲皮苷为19.5％，其他三种黄酮类均在13％以上。合计超过50％等，二类新药标准。

2.结果

三个剂量罗布麻总黄酮(LBM)对非酶糖基化产物有明显抑制作用，提示有较强的抗衰老作用。抑制率见表2。

Tab 2.In vitro screening of NEG inhibitors

drug	dosemg/ml	inhibition
drug	dosemg/ml	inhibition	LBMLBMLBM人参提取物	1.00.20.041.0	+++++-++

AGE production were detected by method of AGE-ELISh after 20 days of incubation.“-”accelerant rate＜10％；“+”inhibition rate＞10％；“++”＞20％；“+++”＞40％。

3.结论罗布麻总黄酮有较强的抗衰老作用。

第三部分：罗布麻总黄酮对四氧嘧啶小鼠血糖及肾功能的影响

1.目的研究罗布麻总黄酮对四氧嘧啶糖尿病动物血糖、肾功、血脂等血液生化指标的影响。

2.方法给小鼠尾静脉注射四氧嘧啶90mg·kg^-1，造成糖尿病模型。用自动生化仪测定血糖、血脂、肌酐、谷草转氨酶等血液生化指标。成摸后灌胃给药，罗布麻总黄酮的剂量分别为50、100、200mg/kg；阳性对照药二甲双胍为100mg/kg.末次给药后5h摘眼球取血，将血标本离心10min(2000rpm)，取血清在自动生化分析仪(美国制造)上测定血糖(Glu)、总胆固醇(Chol)、甘油三酯(Trig)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)。分别于给药7天和14天尾部取血。用快速血糖仪测血糖，用自动生化仪测血液生化指标。

3.结果罗布麻总黄酮可使糖尿病动物血糖、血脂轻度降低；但使升高的血清尿素氮(BUN)却明显降低，见表3。

表3 罗布麻总黄酮对四氧嘧啶糖尿病小鼠血液生化指标的影响

	Glu	Bun	ALT	TC	TG	Amy
	Glu	Bun	ALT	TC	TG	Amy	正常组模型组二甲双胍罗布麻总黄酮小剂量罗布麻总黄酮中剂量罗布麻总黄酮大剂量	9.6±1.425.4±9.222.8±7.021.4±3.820.3±4.318.4±5.2^*	6.6±0.815.6±5.917.2±10.512.2±2.49.6±3.2^8.6±2.8^*	40.5±11.554.8±14.946.0±16.243.0±59.055.1±15.554.4±57.7	2.4±0.82.9±0.73.1±0.62.7±0.62.5±0.92.4±0.6	1.7±0.92.3±0.61.9±0.91.7±0.61.7±0.71.7±1.0	734.6±154.6436.4±125.8554.0±199.1569.0±122.0575.8±186.0^619.0±79.9^*

^*p＜0.05，^**p＜0.01与模型组比较

4.结论罗布麻总黄酮对实验性糖尿病肾功能损害有明显保护作用。

实施例1：

取罗布麻叶，粉碎，加10倍量70％乙醇回流提取2小时，共3次，合并提取液，放冷，过滤，减压回收乙醇至无醇时，并浓缩至相对密度为1.3的浸膏，加相当于生药六倍量的沸水搅拌溶解，过滤，滤液滤液加相当于生药7倍量，已处理好的14-30目，14×80cm的聚酰胺柱，用水冲至呈淡黄色，用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱业，减压回收乙醇，80℃真空干燥得浸膏，粉碎，得罗布麻总黄酮。

实验例2：

胶囊剂的制备

罗布麻总黄酮原料100g，药用淀粉100g

将罗布麻总黄酮和药用淀粉分别过100目筛，并混合均匀，用适量乙醇制粒。于60℃干燥，整粒，装入胶囊。

实验例3：

片剂的制备

罗布麻总黄酮原料100g，药用淀粉100g

将罗布麻总黄酮和药用淀粉分别过100目筛，并混合均匀，用适量乙醇制粒。于60℃干燥，经整粒机整粒，压片。

实验例4：

颗粒剂的制备

罗布麻总黄酮原料100g，药用淀粉100g，糖粉40g

将罗布麻总黄酮、药用淀粉和糖粉分别过100目筛，并混合均匀，用适量乙醇制粒。于60℃干燥，整粒，分装。

实验例5：

注射剂的制备

罗布麻总黄酮原料10g，丙二醇20ml，聚乙二醇-400 50ml，注射用水300ml，混合，水浴加热30min，加苯甲醇50ml，再用注射用水加至1000ml，在超声波中处理10min，再在水浴上加热30min，调PH值5.5-6.5，过滤澄明，灌封，灭菌即得。

Claims

1.一种罗布麻总黄酮原料药，其特征在于该原料药含罗布麻总黄酮55％～80％。

2.一种如权利要求1所述的罗布麻总黄酮原料药的制备方法，其特征在于该制备方法为：

将干燥的罗布麻叶粉碎成粗粉，用10～30倍量的亲水性溶剂加热回流提取或冷浸渗滤提取，热提2～3次，每次1～3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重1.15～1.30(70℃)的浸膏：加入原生药量4～6倍热水，分次溶解，静置24小时，过滤，滤液上聚酰胺为载体的柱层析，用水冲洗及用水∶醇比例为50∶50～5∶95的混合溶剂洗脱，收集水-醇洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻总黄酮提取物。

3.如权利要求2所述的罗布麻总黄酮原料药的制备方法，其特征在于该制备方法为：

将干燥的罗布麻叶粉碎成粗粉，加10倍量的70％乙醇加热回流提取2小时，共3次，合并提取液，放冷，过滤，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至密度1.15～1.30(70℃)的浸膏；加入原生药量6倍热水，分次溶解，静置24小时，过滤，滤液加于相当于生药5倍量，已处理好的聚酰胺柱上，用水冲洗至流出液呈淡黄色后，用70％醇洗脱，收集乙醇洗脱液至洗脱液承担黄色为止，于低于60℃的条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻总黄酮提取物。

4.一种含有如权利要求1所述原料药的药物制剂，为了提高其溶解度和生物利用度，可采用添加助溶剂如吐温-80，或采用能与水混溶的丙二醇、聚乙二醇-400溶解，或采用与有机碱形成盐等方法制成水溶性制剂。

5.一种含有如权利要求1和权利要求4所述的药物制剂，其特征在于含有0.5％～99.5％的本发明原料药和99.5％～0.5％的药物赋形剂，优选1％～60％的本发明原料药和99％～40％的药物赋形剂。

6.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于所说的药物是口服制剂或非肠道给药剂型。

7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。

8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于所述的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂、或皮下给药剂型当中的任何一种。

9.本发明罗布麻总黄酮原料药在制备抗脑缺血，抗衰老等药物中的应用。