CN101884767A - 防治糖尿病并发症及衰老的植物提取物组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制晚期糖基化终产物形成的天然药物提取物组合物及其应用。具体地说，该组合物以车前草，葛根，山茱萸，姜黄四种天然植物中具有抑制晚期糖基化终产物形成的活性成分提取物为原料经优化配比组合制备而成。该提取物药物组合能够有效的预防和抑制由晚期糖基化终产物引起的糖尿病微血管并发症和心，脑血管动脉粥样硬化的发展。

Description

防治糖尿病并发症及衰老的植物提取物组合物及制备方法

【技术领域】

本发明属医药领域。具体涉及一种抑制晚期糖基化终产物形成的天然植物提取物组合物药物，以及其制备方法及应用。

【背景技术】

糖尿病是严重威胁人类健康的常见病，其死亡率已居肿瘤，心血管病之后的第3位。2007年，全世界估计有2.46亿糖尿病患者，到2025年，全球糖尿病患者将增至3.8亿。而我国是糖尿病患病率增长最快的国家之一，目前患病率为3％，患病人数有3,800万，具世界糖尿病患病人数的第二位。

尽管胰岛素和其它降血糖药物的使用极大的提高了糖尿病患者的生活质量，延长糖尿病患者的生存时间(life expectancy)，但随之而来的糖尿病晚期并发症，如加速性心，脑血管动脉粥样硬化，肾病，视网膜，外周神经末稍丧失及非创伤性截肢等，已成为影响患者的生活质量，早期死亡的主要原因。据联合国世界卫生组织估计，每年全世界大约有四百万人死于糖尿病晚期心血管并发症。除此，在全球范围内，超过60％的非外伤性下肢截肢，50％以上的失明患者是由长期糖尿病导致的下肢及视网膜病所致微微循环异常所致。在有10年以上糖尿病病史的病人中，40％的患者患有不同成度的糖尿病肾病，高达70％的糖尿病患者至少具有轻度神经系统损伤症状，约30％的患者下肢及足部的感觉受损，微循环异常。这些糖尿病微血管并发症不但极大影响患者本人的生活质量，同时对糖尿病晚期并发症患者的长期的医疗护理也给各国医疗保健系统带来了硕大的社会经济负担。在大多数地区和国家，糖尿病患者的最大单项医疗费用开支是住院治疗糖尿病晚期并发症。因此，预防和治疗糖尿病微血管并发症是一个重要的，急待解决的临床课题。

越来越多的基础和临床研究证明：长期糖尿病高血糖引起的蛋白质非酶糖基化，导致晚期糖化终产物(advanced glycation end product，AGE)在组织内形成和积累是引起糖尿病血管并发症的主要发病机制。晚期糖化终产物(AGEs)是还原糖的醛基与蛋白、脂质、氨基酸的自由氨基之间的非酶性糖基化反应的产物。反应首先由糖的羰基基团和蛋白质的氨基共价结合形成不稳定的希夫碱(Schiff base)开始，然后这种不稳定的希夫碱迅速重排得到稳定的阿马杜(Amadori)产物，阿马杜产物再经过一系列缓慢的重排和脱水氧化等不可逆反应形成晚期糖化终产物AGEs。AGEs结构复杂多样，具有其独特的生化特性：棕褐色、大多数具有荧光，不可逆、不易被蛋白降解酶所降解、有很强的交联性，即可经过侧链交联与其他AGEs形成更大分子量的物质，并在组织中大量沉积。这些化学反应性很强的晚期糖化终产物与微血管胶原，纤维连接蛋白，微管蛋白交联，形成糖化交联蛋白。随着时间的推移，这些交联蛋白变硬结缔组织，导致肾脏，视网膜，血管壁及神经损伤，引起糖尿病并发症。目前研究证实AGEs主要通过两个途径发挥生物学效应：一方面通过对蛋白质、脂质、核酸等的直接修饰改变其结构功能；二是通过与特异受体结合导致机体的病理改变。已经发现的AGEs受体包括：RAGE、Ⅰ型和Ⅱ型SR-A、CD36、SR-B1、寡糖转移酶48(OST48)、80KH磷酸蛋白(AGER2)、半乳糖结合蛋白3(AGER3)。其中通过RAGE(一种膜蛋白，属免疫球蛋白超家族的多配体成员，存在于多种细胞上)介导的损伤在糖尿病血管系统损伤中占主导地位。此外，晚期糖化终产物在胰腺β细胞(产生和分泌胰岛素的细胞)内积累，引起β细胞氧化应激反应(oxidative stress)增加，产生过量的氧化自由基(reactive oxidative species，ROS)和炎症细胞因子如白细胞介素-1，组织坏死因子-α，进而导致β细胞功能丧失，细胞凋亡。β细胞功能丧失和凋亡反过来又加剧了糖尿病的恶化，行成恶性循环。因此，抑制高血糖导致的晚期糖化终产物的产生是防止糖尿病并发症的有效治疗措施。

在过去的十多年中，已发现数种化学合成化合物能够抑制的形成(AGEinhibitor)或能够打破AGE与蛋白质之间形成的交联(Cross-link breaker)，如氨基胍(Aminoguanidine)，PTB，和ALT-711。其中最有希望能够成为预防和治疗糖尿病并发症的合成药物是氨基胍。它是一种小分子亲核性化合物，能够和阿马杜(Amadori)产物中的还原性羰基发生加成反应，与活性α-二羰基中间体发生反应，通过消除羰基和生成三嗪类化合物，阻止其阿马杜产物进一步重排生成形成交联结构的AGEs。动物研究和临床第二期和临床第三期阶段临床试验证实氨基胍能减低多种在糖尿病血管并发症的发生。但是，常期服用氨基胍产生的各种毒副作用如流感样综合症、诱导自身抗体产生、髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体、引起急进性肾炎限制了它在人体的应用。同样，其它几种抑制AGEs形成的化合物由于在临床前期动物研究中出现的毒副作用而使它们能否在人体内应用受到争议。迄今，在国内外市场上尚无被批准的抑制晚期糖化终产物形成的药物。因此，发展安全，有效的抗糖基化的药物是目前临床上的迫切需要和挑战。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种能够抑制晚期糖化终产物形成且无毒副作用，防治晚期糖化终产物对机体的危害的组合药物。

本发明的另一目的在于提供一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合药物的制备方法。

为达成前述目的，本发明一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合药物，其是由车前草、葛根、山茱萸、姜黄四种天然植物中分离提取的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物组合物组成。

进一步地，所述四种天然植物中活性成分提取物组合物中，各种天然植物的活性成分提取物重量百分比分别为：车前草5～85％；葛根5～85％；山茱萸5～85％；姜黄5～85％。

进一步地，其可用于预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况。

进一步地，所述的糖尿病并发症包括加速性心，脑血管动脉粥样硬化，糖尿病性肾病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性白内障，糖尿病性神经病变，糖尿病下肢及足部难愈溃疡。

进一步地，其为口服液、丸剂、胶囊剂、片剂、冲剂，乳剂，水悬浮剂，胶体液，丸剂，颗粒剂，粉剂、注射剂，霜剂，膏剂，贴剂及喷雾剂。

为达成前述另一目的，本发明一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合药物的制备方法，其包括如下步骤：

分别自车前草，葛根，山茱萸，姜黄中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物；将前述植物中分离提取的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物按一定比例混合制成活性成分提取物组合物；将所述活性成分提取物组合物与药物载体相结合形成药物组合物。

本发明包含车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性提取物组合物可以与药物载体结合制成药物组合物，或者添加到其他辅料中形成各种胶囊、片剂或者饮料等各种保健品，根据本发明的方法从车前草，山茱萸，葛根，姜黄中分离提取的活性成分组合物治疗能够减低晚期糖基化终产物(AGEs)在糖尿病大鼠胰腺，眼晶状体，胸降主动脉及肾脏组织的产生和累积；降低血糖，减少糖尿病大鼠24小时尿蛋白排出量，提高肾脏组织超氧化物歧化酶活性，减少脂质过氧化等功效。这些临床前动物试验结果表明包含该活性成分的组合药物能够预防和治疗糖尿病并发症以及抗衰老。能够有效防治糖尿病并发症和衰老。

【附图说明】

图1为本发明的活性成分提取物混合物对实验性糖尿病大鼠血糖浓度的影响。

图2为实验大鼠胰腺胰岛素免疫组织化学染色的结果图。

图3为本发明的活性成分提取物混合物对实验性糖尿病大鼠胰腺组织内荧光性晚期糖基化产物(AGEs)含量的影响。

图4为为本发明的活性成分提取物混合物对实验性糖尿病大鼠24小时尿白蛋白排出量的影响。

【具体实施方式】

在该说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”可能并非指的是同一个实施例，也不是与其它实施例相互排斥的相互独立或选择性的实施例。

天然植物活性提取物在预防和治疗多病因，多病理机制的慢性疾病如糖尿病及其各种并发症中具有多作用靶点，毒副作用小的优势。本发明首先分别自车前草，葛根，山茱萸，姜黄中分离提取有不同程度的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物。

下面对四种天然植物进行简单介绍：

车前草(Plantago astiatice)为车前科多年生草本。全草含有多种化学物质如车前甙、桃叶珊瑚甙、乌苏酸，B-谷甾醇、正三十一烷、棕榈酸B-谷甾酸酯、棕酸豆甾醇酯、维生素B、维生素C、以及蛋白质、琥珀酸、腺嘌呤、胆硷、梓醇、硬质酸、花生酸、亚麻酸、亚没酸等脂肪酸。有利水通淋、清热解毒、清肝明目、祛痰、止泻的功效，用于治疗慢性支气管炎：百日咳，腮腺炎，急性黄疸型肝炎，高血压，青光眼等疾病。

葛根(Pueraria Lobata)为多年生豆科藤本植物。葛根富含蛋白质、氨基酸、葛根素(Puerarin)和人体所需的铁、钙、硒等微量元素。现代医学证实，葛粉具有降低高血脂、降低高血压、降低血糖等作用，并能增加脑及冠状动脉血流量。对冠心病、心绞痛、以及高血压导致的疾病均有显著的辅助治疗效果。

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornus Officinalis)的果肉。含莫罗忍冬甙、7-甲基莫罗忍冬甙、獐牙菜甙、番木鳖甙、山茱萸鞣质等化学成分。具有增强机体的抗应激能力抗应激、抗氧化、降血脂等药理作用。

姜黄为姜科植物姜黄(Curcuma longa L)的根茎。主要成分含姜黄素(Curcumin)和挥发油。挥发油中含姜黄酮(Turmerone)、姜油烯(Zingerene)、水芹烯(Phellandrene)、去氢姜黄酮。具有降血脂，抗氧化，抗肿瘤作用。

下面对从每一种植物中分别分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的方法逐一说明。

从车前草中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的车前草100g粉碎成粗粉；(2)加5倍量水煮沸2次，每次1小时；(3)合并水提液，过滤，减压浓缩；(4)加4～6倍无水乙醇于浓缩液，静置于低温(4℃)沉淀过夜；过滤后的沉淀物经无水乙醇洗脱，减压干燥得粗提物；(5)取diaion HP-20吸附树脂，以生药重量比1∶2的比例装柱，将干燥的粗提物溶于适量的水，以15～20ml/min的流速通过此吸附树脂柱，完全通过后，再分别依次用去离子水和甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液，干燥后得车前草活性成分提取物。

从山茱萸中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的山茱萸原料100g粉碎成粗粉，加6～10倍量100％甲醇，加热回流(65-70℃)提取2次，每次2～3小时；合并醇提液，分别经滤孔为70和25μm的滤器过滤；滤液减压回收甲醇，真空干燥，得山茱萸粗提取物；(2)将此粗提取物溶于5～10倍量的去离子水，然后依次用丁烷和乙酸乙酯萃取；(3)收集水相溶液，浓缩后以15～20ml/min的流速通过diaion HP-20吸附树脂吸附树脂柱，完全通过后，再分别依次用H2O/MeOH梯度洗脱(H2O/MeOH＝100∶0→50∶50→0∶100)；(4)收集H2O/MeOH(50∶50)洗脱液，冷冻干燥后得山茱萸活性成分提取物。

从葛根中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥葛根原料100g粉碎成粗粉，加5～10倍量80％乙醇，在37℃温度下萃取2～3次，每次48小时。合并醇提液，滤过。滤液减压回收乙醇，真空干燥，得葛根乙醇粗提取物。(2)将葛根乙醇粗提取物溶于5倍量的纯水，然后用乙酸乙酯萃取；(3)收集水相溶液，浓缩后以15～20ml/min的流速通过diaion HP-20SS吸附树脂吸附树脂柱，再分别依次用H2O/MeOH梯度洗脱(H2O/MeOH＝100∶0→0∶100)；(4)收集甲醇洗脱液，冷冻干燥后得葛根活性成分提取物。

从姜黄中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的姜黄干粉100g加入加6～10倍量100％乙醇，加热回流(60～70℃)提取3次，每次2～3小时；(2)合并醇提液，分别经滤孔为70和25μm的滤器过滤，滤液减压浓缩回收甲醇后，得到姜黄活性成分提取物。

分别自车前草，葛根，山茱萸，姜黄中分离提取有不同程度的够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分之后，依据在体外对晚期糖化终产物(AGEs)形成的抑制试验结果，对各活性成分进行优化配比组合，形成本发明具有最大抑制AGEs形成药理作用组合药物。其中各种活性成分提取物混合的重量百分比分别为：5～85％。

为验证经过本发明方法制成的活性成分提取物或活性成分提取物组合物确实能够抑制晚期糖基化产物，下面通过试验对活性成分提取物或活性成分组合物的药效进行分析。

首先进行体外糖基化修饰的蛋白质(AGE-BSA)的制备及测定。其中用到的材料有：纯化的牛血清白蛋白(BSA)，甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)，磷酸盐缓冲液，叠氮钠(sodium azide)。

具体进行体外糖基化修饰的蛋白质(AGE-BSA)制备的方法包括：将BSA(最终浓度5mg/ml)溶于含2mmol/L的甲基乙二醛和0.02％叠氮钠的0.1M的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，形成蛋白质-糖基化修饰反应混合物。将上述白蛋白-甲基乙二醛反应混合物分装于2.0毫升试管内，通入氮气出后将试管密封，置于37℃孵育7天形成糖基化修饰的白蛋白(AGE-BSA)。

进行体外糖基化修饰的蛋白质(AGE-BSA)测定的方法是利用AGEs在激发波长370/发射波长440纳米有特征性吸收光谱，采用荧光光谱分析法测定其形成的AGE-BSA含量。

为验证从车前草，葛根，山茱萸和姜黄四种植物中提取的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物及这些活性成分提取物组合物能够在体外抑制晚期糖基化产物形成，下面对这些活性成分提取物或活性成分提取物组合物的药效进行测定，具体方法为：

将根据本发明的前述方法得到的活性成分提取物或活性成分提取物组合物溶解于2％的Tween80，加入上述BSA-MG混合液中，充分混合后，一式三份，每份500微升，分装密封于1.0毫升试管中，置于37℃孵育箱孵育。每次试验均包括三个对照组：空白对照(反应混合液中只含BSA，不含MG及任何测试物)；阳性对照(只含BSA-MG反应混合液，不含任何测试物)；阳性标准药物对照(BSA-MG反应混合液和2mM氨基胍盐酸盐)。孵育7天后，用上述描述的荧光光谱分析法测定其AGE-BSA含量。

抑制百分比的计算：活性成分提取物及活性成分提取物组合物在体外抑制晚期糖基化产物形成的抑制率按下列公式计算：百分抑制率(％)＝[1-(活性成分提取物测试管平均荧光强度-空白对照管平均荧光强度)/(阳性对照管平均荧光强度-空白对照管平均荧光强度)x100％]。

药效测定结果总结于表1。表中结果表明：(1)本发明所列举的四种天然植物单一的活性成分提取物均有明显的抑制晚期糖基化产物形成的药理作用；(2)四种天然植物活性成分提取物组合物在12.5，25，50和100mcg/ml每个浓度的抑制率均大于同浓度的单一提取物，提示在抑制晚期糖基化产物形成上具有协同作用；(3)四种天然植物活性提取物的组合物在12.5，25，50和100mcg/ml每个浓度的抑制率均大于同浓度的阳性标准对照药物氨基胍。

表1：姜黄、车前草、山茱萸、葛根活性成分提取物、活性成分提取物组合物和阳性对照药氨基胍在体外抑制晚期糖基化产物形成的药效测定

下面通过实验对车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物抑制糖尿病大鼠体内晚期糖化终产物形成和积累，防治糖尿病并发症的治疗效果进行观察。

其中实验动物为8周令，体重200～250克的雄性SD大鼠。

受试药物为：根据本发明的方法制备的车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物，以100mg/ml的浓度溶于2％吐温-80/0.5％甲基纤维素溶媒中。阳性对照药：氨基胍盐酸盐，粉剂，以10mg/ml的浓度浓度溶于2％吐温-80/0.5％甲基纤维素溶媒中。

糖尿病模型的建立及分组：所有动物适应性喂养1周后，禁食12小时，一次性腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型，STZ剂量为55mg/kg体重。注射72小时后由尾精脉取血，用微量血糖仪测定血葡萄糖水平。凡血糖浓度≥300m/dl者作为糖尿病模型鼠，按血糖水平随机平行分为：(1)提取物组合物治疗组(n＝8)，剂量为500mg/kg，每日一次，灌胃给药；(2)氨基胍治疗组(n＝8)，剂量为50mg/kg，每日一次，灌胃给药；(3)模型对照组(n＝8)，每日灌胃一次给予相同容量2％吐温-80/0.5％甲基纤维素溶媒。并另取健康雄性大鼠8只，作正常对照，每日灌胃一次给予相同容量溶媒液。糖尿病模型稳定1周后开始治疗，连续给药共12周。

观察指标及测定方法：实验期间，每2周测定一次大鼠体重，血糖。血糖测定采用尾精脉取血，Contour微量血糖仪检测。

实验结束前3天代谢笼收集24小时尿液，计24小时尿量，保存尿标本，用酶联免疫吸附测试大鼠尿微量白蛋白试剂盒测定24小时尿白蛋白排出量。

组织标本收集：在疗程结束，腹腔注射巴比妥处死动物后，迅速取出胰腺，眼晶状体，胸降主动脉及肾脏组织标本，经液氮冷冻后，-80℃冷藏。

胰腺，眼晶状体，胸降主动脉及肾皮质荧光性AGEs含量测定：组织样本制备参照Nakayama等人报导的碱溶性蛋白法进行，将组织破碎后，加氯仿-甲醇(2∶1)，4℃摇振过夜脱脂，经水化冲洗后，加0.1N NaOH溶液，匀浆，离心取上清液，用荧光分光光度法(λex370/λem 440nm)测定其荧光性AGEs含量。以1mg BSA/ml 0.1N NaOH溶液荧光值为1个标准任意荧光单位(AU)。组织样本蛋白质含量用Bradford法测定。组织样本中主要非荧光性晚期糖基化产物N-羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyl-lysine CML)，用CML特异性酶联免疫吸附试剂盒测定。

大鼠肾脏超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)含量按照试剂盒说明书检测。

大鼠胰腺内胰岛素免疫组织化学检测：5μm胰腺组织石蜡切片梯度脱蜡水化后，3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)洗涤，正常山羊血清封闭，依次加入兔抗大鼠胰岛素抗体、羊抗兔-Evision二抗、DAB显色、苏木精复染，树脂封片。显微镜下观察、拍照，阳性部位呈棕黄色。

上述实验结果为：

(1)车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物治疗显著地增加了实验性糖尿病大鼠体重(P＜0.01)，见表2。

表2车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物对实验性糖尿病大鼠体重的影响

注：表中数据为组间平均值±标准差。与正常对照组比较，**P＜0.01；与糖尿病模型组和氨基胍治疗组比较，##P＜0.01。

(2)与糖尿病模型组和氨基胍治疗组相比，车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物治疗显著地降低了实验性糖尿病大鼠血糖浓度(P＜0.01)，见图1。

(3)与糖尿病模型组和氨基胍治疗组相比，车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物治疗显著增加实验性糖尿病大鼠胰岛内胰岛素的合量。

如图2实验大鼠胰岛胰岛素免疫化学染色所示：正常对照大鼠胰岛呈规则椭圆状，有着很强的棕色胰岛素免疫组化染色；而模型对照组大鼠的胰岛呈不规则增生型，胰岛内含有大量纤维性组织，极其微弱的胰岛素免疫组化染色；经氨基胍治疗的大鼠胰岛内胰岛素免疫组化染色较对模型对照组无明显差异；但经车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物治疗大鼠的胰岛具有相当数量阳性胰岛素免疫组化染色。

(4)如图3所示，与糖尿病模型组相比，车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物和氨基胍治疗显著地减低糖尿病大鼠胰腺组织内晚期糖基化产物(AGEs)含量。

(5)如表3所示，与糖尿病模型组相比，车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物和氨基胍治疗显著地减低糖尿病大鼠眼晶状体内晚期糖基化产物(AGEs)含量。

表3：车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物对实验性糖尿病大鼠眼晶状体内晚期糖基化产物(AGEs)含量影响

注：表中数据为组间平均值±标准差。与正常对照组比较，***P＜0.001；与糖尿病模组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

(6)车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物和氨基胍治疗显著地减低糖尿病大鼠胸降主动脉血管壁内晚期糖基化产物(AGEs)含量(表4)

表4车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物对实验性糖尿病大鼠胸降主动脉血管壁内晚期糖基化产物(AGEs)含量影响

注：表中数据为组间平均值±标准差。与正常对照组比较，***P＜0.001；与糖尿病模组比较，##P＜0.01。

(7)车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物和氨基胍治疗显著地减低糖尿病大鼠肾皮质内晚期糖基化产物(AGEs)含量(表5)

表5车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物对实验性糖尿病大鼠肾皮质内晚期糖基化产物(ACEs)含量的影响

注：表中数据为组间平均值±标准差。与正常对照组比较，***P＜0.001；与糖尿病模组比较，##P＜0.01。

(8)与糖尿病模型组相比，车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物和氨基胍治疗显著地减少了实验性糖尿病大鼠24小时尿蛋白排出量(分别为-32％和-34％)，见图9。

(9)车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物显著地增加糖尿病大鼠肾脏超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量(表6)。

表6车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物对实验性糖尿病大鼠肾皮质内超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量的影响

注：表中数据为组间平均值±标准差。与正常对照组比较，***P＜0.001；与糖尿病模组比较，a：P＜0.01；与对照药物组比较，b：P＜0.01。

结论：上述结果提示车前草，山茱萸，葛根，姜黄活性成分提取物组合物治疗能够减低AGE在糖尿病大鼠胰腺，眼晶状体，胸降主动脉及肾脏组织的产生和累积；降低血糖，减少糖尿病大鼠24小时尿蛋白排出量，提高肾脏组织超氧化物歧化酶活性，减少脂质过氧化等功效，是一种潜在的防治糖尿病并发症的药物治疗方法。

在本发明的一个实施例中，根据本发明从车前草，山茱萸，葛根，姜黄四种植物中分离提取出的抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物可以和药用载体相结合形成药物组合物。这些“药用载体”包括但不限于：药物添加剂，如稀释剂，粘合剂，表面活性剂，芸滑剂，助流剂，崩解剂，包衣材料，增塑剂，着色剂，调味剂等混和，并根据配制方法来制备。稀释剂包括但不限于纤微素或纤微素衍生物，如微晶纤微素等；淀粉或淀粉衍生物，如玉米淀粉，小麦淀粉，环糊精等；糖或糖醇，如乳糖，D-甘露糖醇等；无机稀释剂如氢氧化铝萤胶，碳酸钙，铝硅酸镁，磷酸氢钙等。粘合剂可包括羟丙基纤微素，甲基纤微素，羟丙基甲基纤微素，聚乙烯吡硌烷酮，糊精，支链淀粉，羟丙基淀粉，聚乙烯醇，阿拉伯胶，琼脂，明胶，聚乙二醇等。表面活性剂可包括蔗糖酯，硬脂酸聚烃氧基酯，聚氧乙烯氢化的蓖麻油，聚氧乙烯聚丙二醇，失水山梨糖醇倍半油酸酯，失水山梨糖醇三油酸酯，失水山梨糖醇单硬脂酸酯，失水山梨糖醇单棕与酸酯，聚山梨糖醇，单硬脂酸甘油酯，十二烷基硫酸钠，月桂基聚乙二醇等。芸滑剂可包括硬脂酸，硬脂酸钙，硬脂酸镁，滑石等。助流剂可包括无水氢氧化铝萤胶，硅酸镁等。崩解剂可包括交联羧甲基淀粉钠，交联羧甲基纤微素钠，低取代羟丙基纤微素和交联PVP。包衣材料可包括羟丙基甲基纤微素2910，氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物E，聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯，聚乙二醇6000，氧化钛等。增塑剂可包括柠檬酸乙酯，聚乙二醇6000等。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的方法从车前草，山茱萸，葛根，姜黄植物中分离提取出的抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物与药用载体相结合形成的药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。肠道给药制剂包括但不限于胶囊，片剂，乳剂，水悬浮剂，胶体液，丸剂，颗粒剂，粉剂。非肠道给药制剂包括但不限于注射剂，霜剂，膏剂，贴剂及喷雾剂。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的方法从车前草，山茱萸，葛根，姜黄植物中分离提取出的抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物也可以配以常规辅料制成口服液，丸剂，胶囊剂，片剂及冲剂等剂型形成保健品，或者也可以添加到其他食品中，例如添加到奶类产品，肉类，香肠，面包，巧克力，糖果，点心，糖果，比萨饼，面条，炒面，牙龈和冰淇淋，各种汤类，饮料，茶，传统饮料，果肉果汁，果汁饮料，蔬菜汁，酒类饮品及复合维生素等食品中。

例如，在本发明的一个实施例中，可以将根据前述方法形成的活性成分与晶体纤维素以及玉米淀粉按每300mg胶囊成分中包含250mg前述活性成分、40mg晶体纤维素、10mg玉米淀粉的配比形成胶囊。

例如，在本发明的一个实施例中，可以将根据前述方法形成的活性成分与其他成分相混合形成片剂，以一片500mg的片剂为例，其各种成分的配比如下表：

表7：车前草，山茱萸，葛根，姜黄抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物药用500mg片剂

上述说明已经充分揭露了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。

Claims (15)

1.一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合物，其特征在于，其是由车前草、葛根、山茱萸、姜黄四种天然植物中分离提取的，能够抑制晚期糖化终产物形成的天然植物活性成分提取物经优化配比组合组成。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述四种天然植物活性成分提取物组合物，其中各种天然植物的活性成分提取物重量百分比分别为：车前草5～85％；葛根5～85％；山茱萸5～85％；姜黄5～85％。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其可用于预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述的糖尿病并发症包括加速性心，脑血管动脉粥样硬化，糖尿病性肾病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性白内障，糖尿病性神经病变，糖尿病下肢及足部难愈溃疡。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：其为口服液、丸剂、胶囊剂、片剂、冲剂，乳剂，水悬浮剂，胶体液，丸剂，颗粒剂，粉剂、注射剂，霜剂，膏剂，贴剂及喷雾剂。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述天然植物提取物组合物可以与药物载体相结合形成药物组合物。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述天然植物提取物组合物可以添加到固体或液体食品中形成保健食品或饮料。

8.一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合药物的制备方法，其包括如下步骤：

分别自车前草，葛根，山茱萸，姜黄中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物；

将前述植物中分离提取的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物按一定比例进行经优化配比组合形成活性成分提取物组合物；

将所述活性成分提取物组合物与药物载体相结合形成药物组合物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：在将所述四种天然植物中的活性成分提取物进行经优化配比组合形成活性成分提取物组合物时，各种天然植物的活性成分提取物重量百分比分别为：车前草5～85％；葛根5～85％；山茱萸5～85％；姜黄5～85％。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：从车前草中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的车前草粉碎成粗粉；(2)加水煮沸；(3)合并水提液，过滤，减压浓缩；(4)加无水乙醇于浓缩液，静置于低温沉淀过夜；过滤后的沉淀物经无水乙醇洗脱，减压干燥得粗提物；(5)将干燥的粗提物溶于适量的水，通过diaion HP-20吸附树脂柱；分别依次用去离子水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，干燥后得车前草活性成分提取物。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于：从山茱萸中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的山茱萸原料粉碎成粗粉，加甲醇，加热回流提取；合并醇提液，经滤器过滤；滤液减压回收甲醇，真空干燥，得山茱萸粗提取物；(2)将此粗提取物溶于去离子水，然后依次用丁烷和乙酸乙酯萃取；(3)收集水相溶液，浓缩后通过diaionHP-20附树脂柱，再分别依次用H2O/MeOH梯度洗脱；(4)收集H2O/MeOH洗脱液，冷冻干燥后得山茱萸活性成分提取物。

12.如权利要求8所述的方法，其特征在于：从葛根中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥葛根原料粉碎成粗粉，加乙醇进行萃取；合并醇提液，滤过，减压回收乙醇，真空干燥，得葛根乙醇粗提取物；(2)将葛根乙醇粗提取物溶于纯水，然后用乙酸乙酯萃取；(3)收集水相溶液，浓缩后通过diaion HP-20SS吸附树脂柱，再分别依次用H2O/MeOH梯度洗脱；(4)收集甲醇洗脱液，冷冻干燥后得葛根活性成分提取物。

13.如权利要求8所述的方法，其特征在于：从姜黄中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物的制备方法包括以下步骤：(1)将干燥的姜黄干粉加乙醇，加热回流提取；(2)合并醇提液，经滤器过滤，减压浓缩回收甲醇后，得到姜黄活性成分提取物。

14.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述药物组合物为口服液、丸剂、胶囊剂、片剂、冲剂，乳剂，水悬浮剂，胶体液，丸剂，颗粒剂，粉剂、注射剂，霜剂，膏剂，贴剂及喷雾剂。

15.一种预防和抑制由晚期糖基化终产物引起病理状况的天然植物提取物组合物的制备方法，其包括如下步骤：

分别自车前草，葛根，山茱萸，姜黄中分离提取能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物；

将前述植物中分离提取的能够抑制晚期糖化终产物形成的活性成分提取物按一定比例进行优化配比组合形成活性成分提取物组合物。

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