CN102688454B - 一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：制首乌10-20份、黄芩8-16份、黄芪10-20份、郁金8-16份、川芎8-16份。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物用于治疗阿尔茨海默病，药效明确，为临床提供了一种新的选择。

Description

一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，属药物领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种原因未明的神经系统的退行性病变，其主要临床表现为记忆障碍、智力减退和行为人格退化，其发病与年龄密切相关，65岁是一个拐点，年龄每增加5岁发病率和患病率增加1倍，65岁以上患病率为5%，80岁以上高达20%，病程一般为5-10年。AD主要病理改变为脑的广泛神经细胞脱落凋亡、神经细胞外老年斑(senile plague，SP)沉积、胞内神经原纤维缠结(neuro fibrillary tangles,NFT)以及大脑皮层和海马区神经细胞的减少。我国2005年的一项流行病学调查结果显示，65岁以上AD的患病率为3.5％，血管性痴呆(Vascular Dementia，VaD)的1.1％，其中AD的发病率提高了4.8%，且随着患病率年龄的增长而增长，地域上北方高于南方，而发病年龄则西部高于东部。保守估计，目前我国AD已经超过600万人，预计到2020年将突破1000万人。随着老龄人口的增加，本病的发病和患病人数也将急剧增加。在西方国家，AD已经成为所有年龄段人群的第7位致死原因和65岁及以上人群的第5位致死原因。据美国公共健康机构报告，1991年美国用于老年痴呆患者费用大约为1131亿美元，而平均每例老年痴呆患者的直接费用为$4.7万/年，若计入间接费用，则每例患者耗费为$17.4万/年，由此美国政府认为AD是目前耗资最高的疾病，已经成为严峻的健康问题和社会问题。我国的情况与世界大体相同，如果平均耗费医疗护理费用按2000-3000元/年/人计算，那么每年需要付出上百亿费用。如果再考虑到患者造成的家庭劳动力成本等支出，其造成的社会问题和经济问题则更为突出。因此，AD不仅是一个健康问题，而且还已经成为严重制约生产力发展的社会问题。

AD归属于中医“呆证”、“健忘”、“痴呆”等病范畴。本病病位在脑，如清·王清任《医林改错》曰：“灵机记性在脑，......高年无记性者，脑髓渐空。”脑府的功能强弱与人的智力、记忆力直接相关。《灵枢经·海论篇》云：“脑为髓之海”，当精髓充足，则脑海满，脑得所养，则精力充沛，意识清晰，思维敏捷；若脑髓不足，脑失所养，则神机失灵，精神倦怠，记忆减退，思维迟缓，反应迟钝。因此，髓海失养、脑窍闭塞是AD直接的病理机制，而其导致原因又在脾与肾。脾肾两虚，即可导致精微不足，髓海失充，脑失所养；又可病及心、肺、肝，产生气、火、痰、瘀诸毒邪，阻滞脑络，终至脑窍闭塞而发病，形成本虚标实之证。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

制首乌10-20份、黄芩8-16份、黄芪10-20份、郁金8-16份、川芎8-16份。

进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

制首乌15份、黄芩12份、黄芪15份、郁金12份、川芎12份。

其中，它是由制首乌、黄芩、黄芪、郁金、川芎的原生药材打粉、水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的制剂是片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液。

本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取重量配比的原料药；

b、将原料药直接打粉；或加水或有机溶剂提取，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

本发明还提供了该药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

其中，所述的药物在制备具有益智、增强海马IDE活性、海马异常高表达的cdk5和GSK-3有抑制作用、海马突触素异常低表达有拮抗作用、促进神经突触重塑的药物中的用途。

本发明药物是根据AD的病因病机拟定的抗AD的中药复方，主要由制首乌、黄芪、黄芩、川芎、郁金等组成。其中制首乌、黄芩为君，制首乌补肾益精髓，《本草纲目》谓其“益精髓、延年不老”；黄芩清热解毒，即可解除闭阻脑络之诸毒邪，又可清除气、瘀、痰所化之邪火，二药合用，标本兼顾。黄芪、川芎、郁金共为臣药，黄芪补诸虚，《名医别录》谓其有“补丈夫虚损，五劳赢瘦”之功；川芎为血中气药，有活血化瘀、行气解郁之功效；郁金一则可化痰醒脑开窍，二则可行气解郁，再则可凉心解热，三药合参，共助君药补髓解毒，攻补兼施。诸药合参，标本兼顾，共奏补髓充脑、解毒益智之功效。

本发明药物用于治疗阿尔茨海默病，药效明确，为临床提供了一种新的选择。

附图说明

图1本发明药物对Aβ注射模型逃避潜伏期的影响

图2搜索策略（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图3模型组SP（10×10）

图4各组动物脑病理形态学（10×10）（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图5各组大鼠海马IDE表达（10×20）（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图6本发明药物对Aβ注射模型海马IDE平均光密度的影响

图7各组大鼠海马CDK5表达（10×20）（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图8本发明药物对Aβ注射模型海马cdk5平均光密度的影响

图9各组大鼠海马GSK-3表达（10×20）（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图10本发明药物对Aβ注射模型海马GSK-3平均光密度的影响

图11各组大鼠海马SYN表达（10×20）（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

图12本发明药物对Aβ注射模型海马SYN平均光密度的影响

具体实施方式

实施例1本发明药物的制备

取制首乌15g，黄芩12g,黄芪15g，郁金12g,川芎12g，加水煎煮，浓缩，制备口服液。

实施例2本发明药物的制备

取制首乌10g、黄芩16g、黄芪20g、郁金8g、川芎8g，打粉，装胶囊。

实施例3本发明药物的制备

取制首乌20g、黄芩8g、黄芪10g、郁金16g、川芎16g，加水煎煮，浓缩，加入辅料，制粒，装胶囊。

以下通过具体临床试验及药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物临床试验

从2008年1月-2010年6月的门诊病人中进行了本发明药物治疗AD的临床观察。26例病人均符合《中国精神疾病分类方案与诊断标准》第3版(CCMD23,2001)的诊断标准，精神状态简易速查表(MMSE)评分为13～24分的轻、中度痴呆，Hachinski缺血指数量表<4分，并排除脑血管性痴呆、Pick病、Lewy体痴呆、老年人良性健忘症、帕金森病伴发的痴呆、抑郁症等精神障碍所致的假性痴呆。其中男11例，女15例；年龄最小65岁，最大83岁；病程最短半年，最长5年；受教育程度：0～22年。既往有高血压病史者17人；有冠心病史者13人，合并高脂血症11人，有糖尿病史9人。12周为1疗程，疗效按照精神状态简易速查表(MMSE)进行智力评分,以治疗前后提高分率为判断疗效标准。结果显示出良好的临床疗效，其中显效9例，占34.6%，有效15例，占57.7%，无效2例，占7.7%，总有效率为92.3%。提示本发明药物具有较好的改善智力，提高生活质量的作用。

试验例2本发明药物对Aβ海马注射模型学习记忆功能的影响

一、实验材料

1.实验药物  按实施例1称取原料药：制首乌、黄芪、黄芩、川芎、郁金均购自北京同仁堂药店，经鉴定专家马云桐教授鉴定为2010版药典正品。上方加水4`0ml，水煎15min，2次，浓缩成2g/ml的本发明药物标准煎液，4℃冰箱保存备用；盐酸多奈哌齐（安理申），卫材（中国）制药有限公司生产，批号：100319A。

2.试剂仪器  淀粉样蛋白片段(Aβ_25-35)，SIGMA公司产品；BP61型电子天平（万分之一），Sartorious天平公司；DW-5大鼠脑立体定位仪，成都泰盟科技有限公司；5μL微量进样器，上海安亭进样器厂；SAESHIN 90+102电动牙科钻，Saeshin Precision Co.,Ltd；HH-W21-600型电热恒温水浴箱，上海医用恒温设备厂；MT-200型Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司。

3.实验动物  SD大鼠，SPF级，3～4月龄，雌雄各半，体重200±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：川实动管质SCXK(川)2008-24。实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号：TCM2032043。大鼠均在室温22-24℃，明暗周期12h/12h条件下饲养，自由饮水摄食。

二、试验方法

1.模型制备

1.1Aβ老化处理  Aβ_25-35溶入0.9%生理盐水（终浓度为2μg/μL），37℃恒温箱孵育72小时老化备用。

1.2模型制备  参考文献制备模型。将大鼠用0.3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉（30mg/kg，ip）后，备皮，将大鼠固定在脑立体定位仪上，用碘伏和75%酒精常规消毒头皮后，用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，然后根据大鼠脑立体定位图谱，先在大鼠前囟后3.0mm，右侧2.0mm处用无菌牙科钻钻开颅骨，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠右侧海马背部，进针深度3.3mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ25-35，注射速度为1ul/min，于5min注射完毕，留针2min，以保证溶液充分弥散，缓慢撤针；同样方法在左侧海马背部注射5μL凝聚态Aβ25-35，造成拟痴呆大鼠模型。术后缝合创口，消毒，肌肉注射庆大霉素（1ml/kg），每天1次,连续3天，预防感染。假手术组注射等容积的生理盐水。

2.动物分组

造模7天后，进行Morris水迷宫测定评价，剔除造模不理想的大鼠，剩余大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、本发明药物高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半；随机选取假手术大鼠10只为假手术对照组。

3.干预方法

分组后开始灌胃给药，给药情况如下

模型成功后7天开始药物灌胃给药，给药时间、剂量见下表。

4.Morris水迷宫测定

4.1实验设备

MT-200型Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司。该系统包括：由摄像机、计算机、图像监视器组成的图像自动采集和处理系统、乳白色圆形铁皮水桶（直径100cm，高60cm，水池水深为40cm）、可调节高度和可移动位置的透明的有机玻璃站台（顶端为圆形，直径为6cm）、水加热器。

4.2实验装置

选择安静、明亮和清洁的房间进行Morris水迷宫实验。实验室内陈设简单的物品，并且物品、仪器与主试站台的位置相对固定。实验前将水桶灌以清水至预订高度（约40cm），再加入适量的奶粉，使水池成为不透明的乳白色。水温控制在23-25℃之间。在圆桶的上缘等距离地设东、南、西、北4个标记点，作为动物进水池的入水点。以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分分成均等的4个象限。将站台放置在水池的第一象限，作为动物入水后搜索的目标。站台的顶端平面低于水池液面2cm。这样，动物凭视觉无法辨认水池中有无站台。

4.3测定方法

参照J N.Crewley等的方法进行。

大鼠预训练（Pretraining）：大鼠置于平台上几秒钟，轻柔地使大鼠跳入水中游15sec左右，引导大鼠至平台，使其在平台上停留15sec。预训练仅在实验第一天进行，每只大鼠预训练3次，每次间隔15min以上。

隐藏平台获得实验：平台置于某一象限（目标象限）中央，位于水面以下1.5cm，整个实验过程中平台位置保持不变。使大鼠在目标象限之外的任意一位置入水，记录在60sec之内大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期。如大鼠在水中游60sec之内未找到平台，将大鼠引导至平台上并停留15sec，逃避潜伏期记为60sec。每天训练2次，每次间隔60min以上，训练5天，至正常对照大鼠能在15sec内找到平台训练结束。

空间探索实验：在第5天将水迷宫中平台取走，在目标象限之外任意选一入水点使大鼠入水，大鼠在水中游泳时间为120sec，记录小鼠在120内目标象限象限和对侧象限停留时间及路程，第一次穿越目标区域时间、穿越目标区域次数、搜索距离以及平均速度等指标。

5.统计分析

结果用“均数±标准差”

表示，统计采用单因素方差分析，方差齐性时采用t检验，方差不齐时采用基于t检验成对比较检验；组间比较采用独立样本t检验。

三、实验结果

1.本发明药物对Aβ海马注射痴呆模型逃避潜伏期的影响

由于模型组大鼠实验过程中因操作失误死亡1只（6号，雄性），考虑行为学实验测试时间和各组样本的平衡，因此将各组6号剔除，剩余9只进行行为学的测定。

表1本发明药物对Aβ海马注射模型逃避潜伏期的影响

注：与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01。

由表1、图1可知，模型对照组与假手术对照组比较，不同训练时间点大鼠的逃避潜伏期均显著延长，具有显著的统计学意义（P<0.05）；给药各组与模型组比较，除训练第一天外，其余各训练时间点本发明药物高、中、低剂量组大鼠逃避潜伏期均较模型对照组显著缩短，具有显著的统计学意义（P<0.05），提示本发明药物具有改善模型大鼠学习记忆的功能的作用。

2.本发明药物对Aβ海马注射痴呆模型空间探索的影响

表2本发明药物对Aβ海马注射模型空间探索的影响

注：与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01。

由表2和图2可知，模型对照组与空白对照组比较，第一象限时间和平台停留时间显著缩短，经过平台次数显著减少，有显著的统计学意义（P<0.05）；给药组与模型组比较，本发明药物高、中、低剂量组第一象限时间和平台停留时间均较模型对照组显著延长、经过平台次数显著增多，有显著的统计学意义（P<0.05），提示本发明药物具有改善模型大鼠学习记忆的功能的作用。

四、实验结论

本发明药物具有改善Aβ海马注射痴呆模型学习记忆的作用，提示其具有良好的益智作用。

试验例3本发明药物对Aβ海马注射痴呆模型脑病理形态学的影响

一、实验材料

1.实验药物  制首乌、黄芪、黄芩、川芎、郁金均购自北京同仁堂药店，经鉴定专家马云桐教授鉴定为2010版药典正品。上方加水450ml，水煎15min，2次，浓缩成2g/ml的本发明药物标准煎液，4℃冰箱保存备用；盐酸多奈哌齐（安理申），卫材（中国）制药有限公司生产，批号：100319A。

2.试剂仪器  淀粉样蛋白片段(Aβ_25-35)，SIGMA公司产品；BP61型电子天平（万分之一），Sartorious天平公司；DW-5大鼠脑立体定位仪，成都泰盟科技有限公司；5μL微量进样器，上海安亭进样器厂；SAESHIN 90+102电动牙科钻，Saeshin Precision Co.,Ltd；HH-W21-600型电热恒温水浴箱，上海医用恒温设备厂；切片机（徕卡-2015，德国）；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机；BMJ-Ⅲ型包埋机；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司）；光学显微镜OLYMPUS BX51。

3.实验动物  SD大鼠，SPF级，3～4月龄，雌雄各半，体重200±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：川实动管质SCXK(川)2008-24。实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号：TCM2032043。大鼠均在室温22-24℃，明暗周期12h/12h条件下饲养，自由饮水摄食。

二、试验方法

1.模型制备

1.1Aβ老化处理  Aβ_25-35溶入0.9%生理盐水（终浓度为2μg/μL），37℃恒温箱孵育72小时老化备用。

1.2模型制备  参考文献制备模型将大鼠用0.3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉（30mg/kg，ip）后，备皮，将大鼠固定在脑立体定位仪上，用碘伏和75%酒精常规消毒头皮后，用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，然后根据大鼠脑立体定位图谱，先在大鼠前囟后3.0mm，右侧2.0mm处用无菌牙科钻钻开颅骨，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠右侧海马背部，进针深度3.3mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ25-35，注射速度为1ul/min，于5min注射完毕，留针2min，以保证溶液充分弥散，缓慢撤针；同样方法在左侧海马背部注射5μL凝聚态Aβ25-35，造成拟痴呆大鼠模型。术后缝合创口，消毒，肌肉注射庆大霉素（1ml/kg），每天1次,连续3天，预防感染。假手术组注射等容积的生理盐水。

2.动物分组

造模7天后，进行Morris水迷宫测定评价，剔除造模不理想的大鼠，剩余大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、本发明药物高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半；随机选取假手术大鼠10只为假手术对照组。

3.干预方法

分组后开始灌胃给药，给药情况如下：

模型成功后7天开始药物灌胃给药，给药时间、剂量见下表。

4.标本制备及分析

末次给药24小时后，股动脉放血处死大鼠，无菌迅速取脑，常规固定，进行病理形态学检测。

4.1切片制作：取大脑海马处大体组织标本，常规75%-100%梯度脱水，二甲苯媒浸，55-60度浸腊，石蜡包埋，切片（切片厚度4μm），常规苏木素-伊红染色，脱水透明、封片。

4.2光学显微镜观察及采图拍照（OLYMPUS BX51带显微摄像系统）：分别用物镜4、10、20、40×目镜10倍数观察组织切片海马区，记录描述组织学病变特点。在10×10倍数下采图拍海马CA区及病变特征区，部分病变特征区在10×20倍数下采图拍照。

三、实验结果

由于模型组大鼠实验过程中因操作失误死亡1只（6号，雄性），考虑行为学实验测试时间和各组样本的平衡，因此将各组6号剔除，剩余9只取脑进行病理形态学检测。

病理形态学检查如图3,4所示，空白组海马灰质、白质区组织结构正常，灰质区锥体细胞排列整齐，形态正常，细胞大小、数目、分布均正常，细胞着色均匀，胞浆呈淡红色，胞核呈蓝色且较清亮。模型组可见SP，其中心为同质性褐色物，周围呈环状纤维物质；多数病例不同程度神经细胞（锥体细胞）减少，排列紊乱、密集，部分退变的神经元呈现凋亡特征（细胞皱缩成圆形或卵圆形；核染色质固缩、边集或碎裂；胞浆皱缩，嗜酸性增加）。亦可见均质红染坏死物质和细胞核固缩、溶解等坏死特征，胶质细胞增生；CA1区出现密集嗜碱性深染不规则梭形结构，周围水肿。安理申对照组有不同程度神经细胞细胞固缩，排列密集，部分细胞皱缩成圆形或卵圆形；核染色质固缩、边集或碎裂；胞浆皱缩，嗜酸性增加。胶质细胞增生；CA1区出现密集嗜碱性深染不规则梭形结构，周围水肿，但较模型对照组显著减轻。本发明药物高、中、低剂量组较模型组比较，除见少量神经细胞似减少，间质水肿，部分标本有灶性细胞固缩、溶解，少量胶质细胞增生，但较模型对照组为轻。

（A假手术组B模型组C阳性组D高剂量组E中剂量组F低剂量组）

四、实验结论

本发明药物对Aβ海马注射导致的脑病理形态学改变具有保护作用。

试验例3本发明药物对Aβ海马注射痴呆模型Aβ降解酶IDE表达的影响

一、实验材料

1.实验药物  制首乌、黄芪、黄芩、川芎、郁金均购自北京同仁堂药店，经鉴定专家马云桐教授鉴定为2010版药典正品。常规方法制备为2g/ml的本发明药物标准煎液，4℃冰箱保存备用；盐酸多奈哌齐（安理申），卫材（中国）制药有限公司生产，批号：100319A。

2.实验试剂  淀粉样蛋白片段(Aβ_25-35)，SIGMA公司产品；冰乙酸(AR级），批号：20060709，规格：500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产；甲醛(AR级），批号：20090813，规格：500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。95％乙醇（AR级），批号：20081008，规格：25L/桶，成都科龙化工试剂厂生产；无水乙醇（AR级），批号：20081025，20070304，规格：500m1/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。二甲苯（AR级），批号：20091023，规格500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产；中性树胶，规格：100g/瓶，批号：20090730，中国上海懿洋仪器有限公司。重铬酸钾：（AR级），批号：20080620，规格：500g/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产；浓硫酸：(AR级），批号：20080714，规格：500ml/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产。IDE一抗：bs-0018M：兔抗大鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L）,ZB-2010.LotV0527,北京中山金桥生物有限公司生物素化山马抗小鼠IgG（H+L）,ZB-2020.LotV0522,北京中山金桥生物有限公司；三抗：辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白（HRP/A-V）LotV7023；DAB：Kit ZL1-9032Lot753223A北京中衫金桥生物有限公司。

3.实验仪器  BP61型电子天平（万分之一），Sartorious天平公司；DW-5大鼠脑立体定位仪，成都泰盟科技有限公司；5μL微量进样器，上海安亭进样器厂；SAESHIN 90+102电动牙科钻，Saeshin Precision Co.,Ltd；HH-W21-600型电热恒温水浴箱，上海医用恒温设备厂；切片机（徕卡-2015，德国）、TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司），Motic BA400显微摄像系统（麦克奥迪公司）、Image-Pro Plus图像分析系统（Media Cybernetics,Inc.）。

4.实验动物  SD大鼠，SPF级，3～4月龄，雌雄各半，体重200±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：川实动管质SCXK(川)2008-24。实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号：TCM2032043。大鼠均在室温22-24℃，明暗周期12h/12h条件下饲养，自由饮水摄食。

二、试验方法

1.模型制备

1.1Aβ老化处理  Aβ_25-35溶入0.9%生理盐水（终浓度为2μg/μL），37℃恒温箱孵育72小时老化备用。

1.2模型制备  参考文献制备模型^[153]将大鼠用0.3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉（30mg/kg，ip）后，备皮，将大鼠固定在脑立体定位仪上，用碘伏和75%酒精常规消毒头皮后，用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，然后根据大鼠脑立体定位图谱，先在大鼠前囟后3.0mm，右侧2.0mm处用无菌牙科钻钻开颅骨，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠右侧海马背部，进针深度3.3mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ25-35，注射速度为1ul/min，于5min注射完毕，留针2min，以保证溶液充分弥散，缓慢撤针；同样方法在左侧海马背部注射5μL凝聚态Aβ25-35，造成拟痴呆大鼠模型。术后缝合创口，消毒，肌肉注射庆大霉素（1ml/kg），每天1次,连续3天，预防感染。假手术组注射等容积的生理盐水。

2.动物分组

造模7天后，进行Morris水迷宫测定评价，剔除造模不理想的大鼠，剩余大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、本发明药物高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半；随机选取假手术大鼠10只为假手术对照组。

3.干预方法

分组后开始灌胃给药，给药情况如下

模型成功后7天开始药物灌胃给药，给药时间、剂量见下表。

4.标本制备及免疫组化操作

末次给药24小时后，股动脉放血处死大鼠，无菌条件下取出脑组织，常规固定，泡蔗糖溶液后，行连续冠状切片，片厚约20～30μm，每隔5片取2片，切片反复漂洗后SP法行免疫组织化学反应。

具体操作步骤：

①石蜡切片微波修复抗原染色程序：APRS，捞片后置烤箱60℃-60分钟以使切片紧密粘附。

②切片常规脱蜡至水。

③30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。

④热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.O），微波炉中高火加热至沸腾后断电，间隔5分钟后，反复1次，冷却后PBS（PH7.2-7.6）洗涤2次。

⑤滴加5%BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗。

⑥滴加适当稀释的一抗（IDE I抗稀释浓度为1:100），4℃过夜，PBS（PH7.2-7.6）洗2分钟3次。

⑦滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG，37℃30分钟，PBS（PH7.2-7.6）洗2分钟3次。

⑧滴加试剂S-V/HRP30分钟（37℃）PBS（PH7.2-7.6）洗5分钟4次。

⑨DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反映时间，一般2分钟左右，蒸馏水洗涤。

⑩苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

5.图象分析

选取海马切片均采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统（MediaCybernetics,Inc.）进行图像分析，每例标本测5张切片，每张切片的每个测定部位随机选取三个视野，取平均值。所有平均光密度（AOD）值测定均在相同的光学条件下完成。阳性：棕黄色-黄色表达于细胞浆，阴性细胞核为蓝色。

6.统计学分析

SPSS 11.5统计软件包进行数据统计分析，数据以“均数±标准差”表示，各组数据呈正态分布进行单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用K-W检验。

三、试验结果

1.本发明药物对Aβ注射痴呆鼠海马区IDE表达的影响

由于模型组大鼠实验过程中死亡1只（6号，雄性），考虑实验成本问题和各组之间大鼠性别平衡，剔除1号雌性大鼠，取剩余雌雄大鼠各4只用于免疫组化检测。

镜下可见胰岛素降解酶阳性免疫反应产物为棕黄色-黄色点片状或颗粒状,主要分布在细胞浆和细胞膜，阴性细胞核为蓝色。模型对照组显著低表达，与见假手术对照组比较，差异具有显著性(P<O.05)，表明Aβ海马注射后脑IDE表达显著降低；本发明药物高和中剂量组IDE表达较模型对照组阳性表达显著增高(P<O.05)，低剂量与模型对照组比较无显著差异(P>O.05)。各组大鼠海马区IDE表达情况见图5。

2.本发明药物对痴呆鼠海马区IDE表达表达平均光密度的影响

表3本发明药物对Aβ注射模型海马IDE平均光密度的影响

与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表3、图6可知，模型对照组海马区平均光密度值较假手术组显著降低，有极显著的统计学意义（P<0.01），提示模型对照组海马IDE活性显著低下；本发明药物高、中、低剂量组与与模型对照组比较，平均光密度值较模型组显著增高（P<0.05），提示其有增强IDE活性的作用。

四、实验结论

Aβ注射后能导致大鼠海马IDE活性降低，本发明药物具有增强海马IDE活性的作用。

试验例5本发明药物对Aβ海马神经毒性的的影响

一、实验材料

1.实验药物  制首乌、黄芪、黄芩、川芎、郁金均购自北京同仁堂药店，经鉴定专家马云桐教授鉴定为2010版药典正品。上方加水450ml，水煎15min，2次，浓缩成2g/ml的本发明药物标准煎液，4℃冰箱保存备用；盐酸多奈哌齐（安理申），卫材（中国）制药有限公司生产，批号：100319A。

2.实验试剂  淀粉样蛋白片段(Aβ_25-35)，SIGMA公司产品；冰乙酸(AR级），批号：20060709，规格：500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产；甲醛(AR级），批号：20090813，规格：500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。95％乙醇（AR级），批号：20081008，规格：25L/桶，成都科龙化工试剂厂生产；无水乙醇（AR级），批号：20081025，20070304，规格：500m1/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。二甲苯（AR级），批号：20091023，规格500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产；中性树胶，规格：100g/瓶，批号：20090730，中国上海懿洋仪器有限公司。重铬酸钾：（AR级），批号：20080620，规格：500g/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产；浓硫酸：(AR级），批号：20080714，规格：500ml/瓶，成都市科龙化工试剂厂生产。CDK5一抗:bs-6263R,兔抗大鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司；SYN一抗：bs-3501R，兔抗大鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司；GSK-3一抗：bs-2091R，兔抗大鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L）,ZB-2010.LotV0527,北京中山金桥生物有限公司生物素化山马抗小鼠IgG（H+L）,ZB-2020.LotV0522,北京中山金桥生物有限公司；三抗：辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白（HRP/A-V）LotV7023；DAB：Kit ZL1-9032Lot753223A北京中衫金桥生物有限公司。

3.实验仪器  BP61型电子天平（万分之一），Sartorious天平公司；DW-5大鼠脑立体定位仪，成都泰盟科技有限公司；5μL微量进样器，上海安亭进样器厂；SAESHIN 90+102电动牙科钻，Saeshin Precision Co.,Ltd；HH-W21-600型电热恒温水浴箱，上海医用恒温设备厂；切片机（徕卡-2015，德国）、TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司），Motic BA400显微摄像系统（麦克奥迪公司）、Image-Pro Plus图像分析系统（Media Cybernetics,Inc.）。

4.实验动物  SD大鼠，SPF级，3～4月龄，雌雄各半，体重200±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：川实动管质SCXK(川)2008-24。实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号：TCM2032043。大鼠均在室温22-24℃，明暗周期12h/12h条件下饲养，自由饮水摄食。

二、实验方法

1.模型制备

1.1Aβ老化处理  Aβ_25-35溶入0.9%生理盐水（终浓度为2μg/μL），37℃恒温箱孵育72小时老化备用。

1.2模型制备  参考文献制备模型将大鼠用0.3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉（30mg/kg，ip）后，备皮，将大鼠固定在脑立体定位仪上，用碘伏和75%酒精常规消毒头皮后，用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，然后根据大鼠脑立体定位图谱，先在大鼠前囟后3.0mm，右侧2.0mm处用无菌牙科钻钻开颅骨，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠右侧海马背部，进针深度3.3mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ25-35，注射速度为1ul/min，于5min注射完毕，留针2min，以保证溶液充分弥散，缓慢撤针；同样方法在左侧海马背部注射5μL凝聚态Aβ25-35，造成拟痴呆大鼠模型。术后缝合创口，消毒，肌肉注射庆大霉素（1ml/kg），每天1次,连续3天，预防感染。假手术组注射等容积的生理盐水。

2.动物分组

造模7天后，进行Morris水迷宫测定评价，剔除造模不理想的大鼠，剩余大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、本发明药物高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半；随机选取假手术大鼠10只为假手术对照组。

3.干预方法

分组后开始灌胃给药，给药情况如下

模型成功后7天开始药物灌胃给药，给药时间、剂量见下表。

4.标本制备及免疫组化操作

末次给药24小时后，股动脉放血处死大鼠，无菌条件下取出脑组织，常规固定，泡蔗糖溶液后，行连续冠状切片，片厚约20～30μm，每隔5片取2片，切片反复漂洗后SP法行免疫组织化学反应。

具体操作步骤：

①石蜡切片微波修复抗原染色程序：APRS，捞片后置烤箱60℃-60分钟以使切片紧密粘附。

②切片常规脱蜡至水。

③30%H₂O₂1份+蒸馏水10份混合，室温10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。

④热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.O），微波炉中高火加热至沸腾后断电，间隔5分钟后，反复1次，冷却后PBS（PH7.2-7.6）洗涤2次。

⑤滴加5%BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗。

⑥滴加适当稀释的一抗（CDK5I抗稀释浓度为1:50；SYN I抗稀释浓度为1:50；GSK-3 I抗稀释浓度为1:50），4℃过夜，PBS（PH7.2-7.6）洗2分钟3次。

⑦滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG，37℃30分钟，PBS（PH7.2-7.6）洗2分钟3次。

⑧滴加试剂S-V/HRP30分钟（37℃）PBS（PH7.2-7.6）洗5分钟4次。

⑨DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反映时间，一般2分钟左右，蒸馏水洗涤。

⑩苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

5.图象分析

选取海马切片均采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统（MediaCybernetics,Inc.）进行图像分析，每例标本测5张切片，每张切片的每个测定部位随机选取三个视野，取平均值。所有平均光密度（AOD）值测定均在相同的光学条件下完成。阳性：棕黄色-黄色表达于细胞浆，阴性细胞核为蓝色。

6.统计学分析

SPSS 11.5统计软件包进行数据统计分析，数据以“均数±标准差”

表示，各组数据呈正态分布进行单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用K-W检验。

三、实验结果

1.本发明药物对Aβ注射痴呆鼠海马区cdk5表达的影响

1.1本发明药物对大鼠海马区cdk5表达的影响

由于模型组大鼠实验过程中死亡1只（6号，雄性），考虑实验成本问题和各组之间大鼠性别平衡，剔除1号雌性大鼠，取剩余雌雄大鼠各4只用于免疫组化检测。

cdk5主要分布在室周区、海马、小脑及部分神经核团内，成棕黄色或黄色颗粒，阳性表示主要在细胞浆、膜，阴性细胞核为蓝色。模型组较假手术组显著高表达，具有显著的统计学意义(P<O.05)，表明Aβ海马注射模型cdk5高度活化；本发明药物各给药组大鼠海马区cdk5的表达均明显低于模型组(P<O.O5)，提示本发明药物可以抑制模型cdk5的异常高表达。各组大鼠海马区cdk5表达情况见图7。

1.2本发明药物对大鼠海马区cdk5表达平均光密度的影响

表4本发明药物对Aβ注射模型海马cdk5平均光密度的影响

与模型对照组比较，^**P＜0.01

由表4、图8可知，模型对照组海马区平均光密度值较空白对照组显著增高，有极显著的统计学意义（P<0.01），提示模型对照组海马cdk5过度表达；本发明药物高、中、低剂量组与模型对照组比较，平均光密度值均较模型组显著降低，有显著的统计学意义（P<0.05），提示本发明药物能够抑制模型海马cdk5的过度表达。

2.本发明药物对Aβ注射痴呆鼠海马区GSK-3表达的影响

2.1本发明药物对大鼠海马区GSK-3表达的影响

由于模型组大鼠实验过程中死亡1只（6号，雄性），考虑实验成本问题和各组之间大鼠性别平衡，剔除1号雌性大鼠，取剩余雌雄大鼠各4只用于免疫组化检测。

各组大鼠海马CA1区均可见阳性反应物,位于神经元胞体周边及突起中。模型组GSK-3表达较假手术组明显增多,染色深;本发明药物各剂量组染色结果与假手术组相似，表达显著减少，染色较淡。各组大鼠海马区GSK-3表达情况见图9。

2.2本发明药物对大鼠海马区GSK-3表达平均光密度的影响

表5本发明药物对Aβ注射模型海马GSK-3平均光密度的影响

与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表5、图10可知，模型对照组海马区平均光密度值较空白对照组显著增高（P<0.01）,提示模型组海马GSK-3活性显著增强；本发明药物各组与模型对照组比较GSK-3的平均光密度显著降低（P<0.01），但组间无显著差异（P>0.05），提示本发明药物对模型异常增强的GSK-3活性有良好的抑制作用。

3.本发明药物对Aβ注射痴呆鼠海马区SYN表达的影响

3.1本发明药物对大鼠海马区SYN表达的影响

由于模型组大鼠实验过程中死亡1只（6号，雄性），考虑实验成本问题和各组之间大鼠性别平衡，剔除1号雌性大鼠，取剩余雌雄大鼠各4只用于免疫组化检测。

镜下可见SYN免疫反应产物为棕黄色点片状或颗粒状,主要分布在神经毡内，有些颗粒围绕在神经元周围，衬托出神经元胞体和轴突的轮廓，而在白质及胶质细胞分布区域中几乎没有SYN出现。假手术组的表达高于模型组，差异具有显著性(P<O.05)，表明Aβ海马注射导致海马SYN的表达显著降低；本发明药物各给药组大鼠海马区SYN的表达均明显高于模型组(P<O.O1)。各组大鼠海马区SYN表达情况见图11。

3.2本发明药物对大鼠海马区SYN表达的平均光密度的影响

表6本发明药物对Aβ注射模型海马SYN平均光密度的影响

与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表3、图12可知，模型对照组海马区平均光密度值较假手术组显著降低，有极显著的统计学意义（P<0.01），提示模型对照组海马突触前膜功能受损；本发明药物高、中、低剂量组与模型对照组比较，平均光密度值较模型组显著增高（P<0.05），提示其有促进突触重塑的作用。

四、实验结论

本发明药物对Aβ海马注射痴呆模型海马异常高表达的cdk5和GSK-3有显著的抑制作用，提示其对痴呆tau蛋白过度或异常磷酸化形成神经元纤维缠结有抑制和/或拮抗作用；此外，对模型海马SYN异常低表达有拮抗作用，可以提高海马CA1区SYN的表达水平，提示其具有促进神经突触重塑的作用。

Claims (7)

1.一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

制首乌10-20份、黄芩8-16份、黄芪10-20份、郁金8-16份、川芎8-16份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

制首乌15份、黄芩12份、黄芪15份、郁金12份、川芎12份。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：它是由制首乌、黄芩、黄芪、郁金、川芎的原生药材打粉、水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液。

5.一种制备权利要求1-4中任意一项所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取重量配比的原料药；

b、将原料药直接打粉；或加水或有机溶剂提取，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

6.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

7.权利要求1所述的药物组合物在制备具有益智、增强海马IDE活性、抑制海马异常高表达cdk5和GSK-3、海马突触素异常低表达有拮抗作用、促进神经突触重塑的药物中的用途。

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