CN101229349B - 一种治疗老年痴呆的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的治疗老年痴呆的中药有效成分复方药物，药物组成以补肾、益气、化痰、活血中药为主，由以淫羊藿、人参茎叶、细叶远志、郁金为原料的有效成分提取物配制而成，对老年痴呆尤其阿尔茨海默病具有显著的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗老年痴呆的药物及其制备方法，更具体地说，涉及一种以中草药为原料制备的治疗以阿尔茨海默病为主的老年痴呆的药物及其制备方法。
背景技术
老年痴呆包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和血管性痴呆(vascular dementia，VaD)等类型。迄今为止，尚无理想的治疗方法。美国FDA批准的药物有三种胆碱酯酶抑制剂，如盐酸多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)和艾斯能(Rivastigmine)和一种兴奋性氨基酸受体拮抗剂，如盐酸美金刚(Memantine)，它们能短期改善痴呆患者的症状但不能延缓疾病发展。目前，国内外学者开始关注中药有效成分尤其中药复方对在AD治疗领域的应用研究。其中由补肾益气药组成的中药复方(如调心方、补肾方等)药物血清对β淀粉样肽(beta-amyloid peptide，Aβ)的神经细胞毒有抑制作用，具有保护AD动物模型的神经元和提高其学习记忆能力的作用。而单味中药及其成分如人参(人参总皂苷及其单体如Rg1，Rb1等)、银杏(银杏甙、白果内酯)、丹参(丹参酮、丹参总酸等)等，对AD动物模型中Aβ的生成、聚集、神经毒性以及保护拟AD动物的学习记忆能力等方面具有有益的作用。
AD是一种多因素复杂性疾病，肾虚、痰浊、血瘀等证候常交替或重叠出现，单一化合物或单一靶位治疗药物的反应非常有限，且缺乏对中医辨证论治临床应用的指导意义。AD发生与“肾虚”有密切关系，肾亏之年，精髓乏源，髓海失养，神机失用，则渐发痴呆。同时年老脏腑虚衰，生理或病理产物不能及时排除，蓄积体内，生痰生瘀，痰蒙清窍和/或淤阻脑络，使脑气与脏气不相连接，神机失用，便发痴呆。临床研究表明，AD病程中的肾气不足、痰浊蒙窍和脑络淤阻证候分别占97％、78％和76％，且与AD患者认知记忆积分具有显著相关性。
目前基于AD的核心病理机制“Aβ级联假说”，中药研究从抑制Aβ产生到对抗其神经毒性都取得了一定的成效，但有关防治AD的中药复方研究尚存在一些不足。首先，研究模型选择不当，如对Aβ生成、降解影响的研究所采用的痴呆模型大多由“铝制剂”或“D-半乳糖”等非淀粉样肽所诱导，铝制剂或半乳糖等虽然与AD发生有关，但不是主要原因，而转基因小鼠能很好的复制出人类AD的特征性病理表现，并有大量的Aβ生成及其老年斑和神经纤维缠结等。第二，对减少Aβ沉积面积和数量观察较多，而对Aβ清除和降解的机制干预研究较少。第三，对Aβ神经毒性关注较多，而对神经元损伤后修复、促神经元再生的研究较少。第四，“一药一靶点”的化学药物效应的研究模式，难以揭示“一药多靶点”的中药复方作用特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种治疗老年痴呆的药物。
本发明的另一个目的是提供一种治疗阿尔茨海默病的药物。
本发明的再一个目的是提供一种缓解大脑神经退行性变的药物。
本发明又一个目的是提供一种改善认知障碍的药物。
本发明的发明人针对现有技术中存在的问题进行了广泛深入的研究，以传统中药为基础，进行中药有效组分配伍，并采用现代药理研究手段，进行了药理药效实验，从而完成了本发明。
本发明提供了一种治疗老年痴呆的药物，其药物活性成分主要为淫羊藿、细叶远志、人参茎叶和郁金的有效成分提取物。
按照本发明的一个方面，本发明的药物活性成分由包括下列重量比的原料制成：
人参茎叶1-15份， 远志1-15份，
淫羊藿1-15份， 郁金1-15份。
优选的重量比为：
人参茎叶4-12份， 远志2-10份，
淫羊藿4-12份， 郁金2-10份。
更优选的重量比为：
人参茎叶10份， 远志8份，
淫羊藿10份， 郁金8份。
本领域技术人员可根据上述药物的配伍原则加入增强某种性能的其它药物原料。
例如，本发明的药物原料还可以包含至少一种下列重量比的成分：
丹参1-15份， 石菖蒲1-15份，
当归1-15份， 肉苁蓉1-15份，
优选的重量比为：
丹参8份， 石菖蒲8份，
当归8份， 肉苁蓉8份。
按照本发明的一个方面，本发明提供了制备上述药物的方法，该方法包括：用水煎煮所述重量比的原料，并优选进一步浓缩、调制；
优选的，将原料置于煎煮器中，加水浸没药材，浸泡一段适宜的时间(优选大约0.5小时-24小时，更优选8小时-12小时)后，加热至沸，煎煮1-4次，优选2-3次，每次0.5-4小时，优选1-3小时，尽量使药物浸出，合并滤液；
选择性的，将滤液浓缩成一定浓度；
选择性的，加入可与水混溶的溶剂调制，所述溶剂例如醇类，优选采用乙醇，特别是50％-100％乙醇，醇沉浓度为60％以上，优选80％以上，更优选95％乙醇；
选择性的，静置一段时间(例如大约1-5小时，优选3-4小时)，优选在冷藏条件下静置；
选择性的，进行分离，弃去沉淀；
选择性的，进一步浓缩上清液，干燥，得到干燥品；
还可进一步按照本领域技术人员已知的方法将干燥品制成任何一种适宜的药用剂型，如果需要，可以加入任何可药用载体和/或赋形剂。
优选本发明药物的剂型为口服制剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或汤剂，其中制备所述制剂的方法以及所使用的可药用载体和/或赋形剂是本技术领域的常规技术。优选所述载体和/或赋形剂选自崩解剂、粘合剂、润滑剂、填充剂中一种或几种混合。其中填充剂优选为预胶化淀粉、淀粉、糊精、甘露醇、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸氢钙、轻质氧化镁中的一种或几种混合；润滑剂优选为硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉或聚乙二醇中的一种或几种混合；崩解剂优选为干淀粉、交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素中的一种或几种混合；粘合剂优选为淀粉浆、糊精、纤维素及其衍生物的一种或几种混合。优选本发明药物的剂型为口服制剂，其可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或汤剂。
本发明的技术方案可以实现本发明的一个或多个目的。本发明的药物可以用于治疗老年痴呆，尤其阿尔茨海默病型痴呆、改善患者记忆和认知能力、缓解患者大脑神经退行性变、改善患者的生活能力，尤其是阿尔茨海默病属脾肾气虚、痰瘀阻窍证，患者施用了本发明药物后特别有效。
本发明药物的给药方式是常规的，给药剂量依据疾病的性质、患者的年龄、体重、病情、给药方式等因素由主治医师来判断。将补肾、益气、化痰、活血治法中各具代表性的中药组成本发明的药物，具有标本兼治、扶正祛邪的作用，不同于单一治法，临床和实验证明其治疗痴呆、认知和记忆损害的效果显著优于化学药品，具有有效部位明确、疗效肯定、药味少、成本小的优点。
本发明分别从细胞实验、动物实验和临床试验三个层面对本发明的药物进行了疗效观察研究，在模型上选择了淀粉样前体蛋白(Amyloid precusor protein，APP)转基因小鼠、Aβ海马注射拟AD大鼠、Aβ静脉注射拟脑淀粉样血管病(cerebral amyloidangiopathy，CAA)大鼠以及AD细胞模型为研究对象，观测了本发明药物对老年人学习记忆的改善作用，对模型动物和细胞的Aβ生成、降解和清除的作用，以促进神经修复和再生的作用，同时从多个环节多靶点较系统地进行了研究。
附图说明
图1.实验实施例1中，大鼠的游泳模型。
图2.实验实施例3中，NGF在大鼠脑中的表达。
图3.实验实施例4中，各组小鼠大脑APP蛋白的表达(Western印迹)。分子量100kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
图4.实验实施例4中，各组小鼠大脑Aβ蛋白的表达(Western印迹)。分子量15kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
图5.实验实施例4中，各组小鼠大脑BACE蛋白的表达(Western印迹)。分子量70kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
图6.实验实施例4中，各组小鼠大脑PS1蛋白的表达(Western印迹)。分子量50kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
图7.实验实施例4中，各组小鼠大脑IDE蛋白的表达(Western印迹)。分子量110kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
图8.实验实施例4中，各组小鼠大脑NEP蛋白的表达(Western印迹)。分子量100kD；条带从左至右，依次为正常组、模型组、盐酸多奈哌齐组、大剂量组、中剂量组、小剂量组。
具体实施方案
下面的实验实施例用来举例说明本发明药物的制备及其效能，但无论如何它们不能构成对本发明的限制。
制备实施例
制备实施例1：
人参茎叶10份，远志8份，
淫羊藿10份， 郁金8份。
人参茎叶、远志、淫羊藿及郁金中药原料(购自北京同仁堂制药有限公司)，重量份如上；80％乙醇，95％乙醇(分析纯，北京化工厂)。
制备方法：
中药原料加约8-10倍于药材体积的水，浸没药材，浸泡适宜时间(大约10小时)后，加热至沸，煎取药液，连续提取3次，第一次2小时，第二次1.5小时，第三次1小时，尽量使药物浸出，合并水提液，小火浓缩，浓缩至密度为1.03-1.10(50℃)的稠膏，冷却并静置一段时间(大约4小时)，放冷，静置大约24小时，滤过，浓缩成浸膏状，加入赋形剂(糊精等，调节软硬度和松散度)，制成软材，软材以“捏之成团，松之即散”为度，再用20目-60目的药典筛制颗粒，干燥，过筛，得到干燥品。
制备实施例2：
人参茎叶10份， 远志8份，
淫羊藿10份， 郁金8份
丹参8份， 石菖蒲8份，
当归8份， 肉苁蓉8份。
制备方法同实施例1，只是原料中加入了上述重量份的丹参、石菖蒲、当归和肉苁蓉。
制备实施例3：
人参茎叶1份， 远志1份，
淫羊藿1份， 郁金1份。
制备方法同实施例1，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例4：
人参茎叶3份， 远志1份，
淫羊藿3份， 郁金1份。
制备方法同实施例1，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例5：
人参茎叶1份， 远志3份，
淫羊藿1份， 郁金3份。
制备方法同实施例1，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例6：
人参茎叶6份， 远志1份，
淫羊藿6份， 郁金1份。
制备方法同实施例1，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例7：
人参茎叶1份， 远志6份，
淫羊藿1份， 郁金6份。
制备方法同实施例1，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例8：
人参茎叶3份， 远志1份，
淫羊藿3份， 郁金1份，
丹参3份， 石菖蒲1份，
当归3份， 肉苁蓉1份。
制备方法同实施例2，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例9：
人参茎叶3份， 远志2份，
淫羊藿3份， 郁金2份，
丹参3份， 石菖蒲2份，
当归3份， 肉苁蓉2份。
制备方法同实施例2，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例10：
人参茎叶6份， 远志1份，
淫羊藿6份， 郁金1份，
丹参6份， 石菖蒲1份，
当归6份， 肉苁蓉1份。
制备方法同实施例2，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例11：
人参茎叶1份， 远志4份，
淫羊藿1份， 郁金4份，
丹参1份， 石菖蒲4份，
当归1份， 肉苁蓉4份。
制备方法同实施例2，只是原料各重量份比例不同。
制备实施例12：
人参茎叶1份， 远志6份，
淫羊藿1份， 郁金6份，
丹参1份， 石菖蒲6份，
当归1份， 肉苁蓉6份。
制备方法同实施例2，只是原料各重量份比例不同。
实验实施例
实验实施例1：本发明药物对Aβ1-42海马注射致拟阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆行为学的影响
材料与方法
1.材料
1.1实验动物
二级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只(鼠龄8～10月)，由北京维通利华实验动物中心提供(合格证号：0042808)。置于SPF环境中饲养。实验过程中动物自由摄食和饮水(术前禁食除外)。
1.2药品及制备
本发明药物(制备实施例1的产物)，盐酸多奈哌齐(英国Boots公司产品)，Aβ1-42，等。
2.动物模型
2.1动物模型的选择
根据文献选择并制备Aβ海马注射大鼠模型[3]。
2.2模型制备与动物分组
动物的选择：用跳合实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。
凝聚态Aβ1-42的制备：Aβ1-42用二甲基亚枫溶解后在37℃恒温箱中温育7天。SD大鼠用10％水合氯醛以0.35ml/kg进行腹腔麻醉，脑立体定位仪固定，于前囱后3.0mm，中线右侧2.0mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm，选择大鼠右侧海马缓慢注入2μlAβ1-42(10μg/μl，溶于生理盐水中)，每侧注射时间为5min，留针5min，缓慢起针，局部消毒后缝合皮肤，肌注青霉素预防感染。假手术组注射等体积的生理盐水(含与模型组等比例的二甲基亚枫)。
大鼠分生理盐水组、模型组、盐酸多奈哌齐组及本发明药物提取物组。于造模后3天开始给药，盐酸多奈哌齐按0.92mg/kg的剂量灌胃；本发明药物提取物配置成0.36g/ml的浓度，按0.7ml/100g的剂量给药；模型组及空白对照组给与等体积的双蒸水，均每日一次。四周后进行行为学测试，取材。
3.测定指标
行为学观察
测试大鼠的学习、记忆能力，采用Morris水迷宫测试。
Morris水迷宫测试，测试程序包括：(1)定位航行试验(placenavigation)：共4天，每天上下午各进行1次。将大鼠面向池壁分别从两个象限的入水点放入水中，记录其在120s内寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期(escape latency)。如果大鼠120s内不能找到平台，则由实验者用手牵引其到平台上停留30s，再放回到笼中。此项反应大鼠的学习能力；(2)空间探索试验(spatial probe test)：实验第5天，撤除平台，将大鼠任意选1个入水点放入水中，记录其60s的游泳轨迹，分别计算其跨越目标象限内的游泳时间及距离与整个游泳时间和距离的百分比，以此项反应大鼠的空间记忆能力。(3)记录大鼠搜索站台的轨迹，分为边缘式、随机式、趋向式和直线式，学习记忆能力依次增强。
4.统计学处理
所得数据以均数±标准差
表示，采用统计软件SPSS11.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05为差异有显著性意义。
结果
行为学特征
在实验中，应用Morris水迷宫对动物进行了5天的测试。前4天测试其学习能力，第5天撤去平台测试其记忆能力。第1天测试时，对照组、盐酸多奈哌齐组和本发明药物提取物组逃避潜伏期及游泳距离均较模型组动物缩短，差异具显著性(p＜0.01)。第2天对照组逃避潜伏期和距离与模型组差异显著(分别为p＜0.05；p＜0.01)，盐酸多奈哌齐组和本发明药物提取物组的游泳距离与模型组差异显著(p＜0.05)。第3天测试时，对照组和本发明药物提取物组逃避潜伏期及游泳距离仍较模型组动物显著缩短(分别为p＜0.05；p＜0.01)。测试的第4天，各组动物在逃避潜伏期和游出距离间已无明显差异，到达平台期结果(表1、2)。第5天撤去平台后模型组大鼠的游泳模式以边缘式和随机式居多，而对照组、盐酸多奈哌齐组和本发明药物提取物组则以趋向式居多(图1)；对照组、盐酸多奈哌齐组和本发明药物提取物组大鼠的游泳时间及距离百分比与模型组比较均有显著性差异(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐组和本发明药物提取物组二者之间无明显差异(p＞0.05)。
表1不同组大鼠逃避潜伏期比较(s)
| 组别 | 例数 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天(％) |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物组 | 8888 | 42.69±31.53＊＊97.72±36.7338.09±37.07＊＊47.46±25.15＊＊ | 1.24±37.26＊81.41±53.450.6±40.9855.09±44.7 | 28.16±27.19＊＊90.43±46.4864.32±42.1443.27±36.39＊ | 26.83±27.4371.36±48.8247.64±53.4651.07±45.12 | 33.32±12.59＊21.69±8.6933.02±5.25＊30.91±7.63＊ |
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。
表2不同组大鼠游泳距离比较(cm)
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。
讨论
学习和记忆的过程中，中枢胆碱能递质起重要的调节作用。AD患者的痴呆程度与新皮质和海马中ACh的缺失程度密切相关。基底前脑的Meynert核和内侧隔核是脑内主要的胆碱能神经元分布区，他们发出纤维投射至海马和大脑皮质各层，所释放的ACh占大脑皮质释放的ACh的绝大部分。在AD脑中，基底前脑的胆碱能神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)在脑内的表达出现异常，尤以皮质和海马显著。盐酸多奈哌齐为AchE抑制剂，可改善老年痴呆患者记忆功能障碍症状，实验结果提示盐酸多奈哌齐可显著改善AD模型大鼠的空间学习、记忆障碍，本发明药物的作用与其相似。
实验实施例2：本发明药物对APPV717I转基因小鼠AD模型学习记忆行为学的影响
近年来，根据APP的突变可使Aβ生成增加这一发现采用基因工程的方法研制成功了APP转基因小鼠模型，其优点是能够在基因水平上模拟AD发病的病理学改变，模拟Aβ的产生过程，是AD病因研究和病理学研究以及药效评价的比较理想的实验模型[1]。本试验拟采用APPV717I转基因小鼠AD模型，观察本发明药物提取物对其学习记忆能力的影响。
1.材料与方法
1.1实验动物
3月龄APP695V717I转基因小鼠30只(雌雄各半)，购自中国医学科学院实验动物研究中心，同时购买同月龄同背景C57BL/6J小鼠6只(雌雄各半)作为正常对照。所有小鼠饲养于SPF级清洁鼠房。
1.2药品与试剂：所述本发明药物采用了制备实施例2的产物。
1.3分组与给药
将APP695V717I转基因小鼠随机分为模型组(Model)、本发明药物大剂量组(Large0.3g/kg·d)、中剂量组(Middle 0.15g/kg·d)、小剂量组(Small 0.75g/kg·d)和盐酸多奈哌齐组(Donepezil0.92mg/kg·d)(雌雄各半)，每组6只；同月龄同背景C57BL/6J小鼠6只作为正常对照组(Normal)。对照组和模型组给以蒸馏水灌胃，均每日1次。各组小鼠灌胃至11月龄时进行行为学实验。
1.4学习记忆能力测试采用Morris水迷宫试验法。方法同前。
1.5统计学处理同前。
2.实验结果
2.1各组APP转基因小鼠空间学习记忆能力的变化
2.1.1定位航行实验
历时5天的实验中，各组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离都呈下降趋势，前两天各组间没有明显差异。第3天开始，模型组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离与正常组和各给药组的相比明显延长(P＜0.05/P＜0.01)。本发明药物治疗组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离与正常组小鼠的比较无显著差异(P＞0.05)。本发明药物各剂量组与盐酸多奈哌齐组比较无显著差异，本发明药物大、中、小剂量组之间比较未见显著性差异(P＞0.05)(见表3、4)。
表3各组小鼠逃避潜伏期的比较(s)
| 组别 | 例数 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天 |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物大剂量组发明药物中剂量组发明药物小剂量组 | 666666 | 79.73±31.9885.82±33.1885.79±32.3182.75±28.3966.45±30.8676.05±30.69 | 67.41±40.6972.40±28.9271.97±34.2576.31±29.9663.09±34.1958.28±22.57 | 57.76±29.00*71.79±17.4559.80±35.56*57.04±29.24*50.08±24.86**44.76±23.45** | 45.69±26.93**70.87±21.3142.14±25.74**33.96±15.89**35.11±20.53**24.67±16.05** | 32.45±19.53**59.89±20.0740.05±18.68*39.12±20.19*36.86±20.94**43.79±27.78* |
注：*代表其他各组与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
表4各组APP695V717I小鼠游泳距离的比较
| 组别 | N | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天 |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物大剂量组发明药物中剂量组发明药物小剂量组 | 666666 | 1064.71±693.031487.34±596.451448.34±400.191394.34±643.081059.41±653.301380.20±762.12 | 743.75±423.45**1315.62±471.441140.35±604.331051.65±426.821004.69±578.47954.46±552.59 | 669.27±342.54**1140.25±420.09843.79±629.84861.15±548.43652.18±492.75**724.83±431.69** | 578.71±331.69*842.44±291.17548.48±395.49*504.66±361.06**421.63±351.43**369.85±219.14** | 488.91±354.26*769.55±187.55502.39±268.38*570.23±343.09515.79±324.65*615.87±319.00 |
注：*代表其他各组与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.1.2空间探索实验结果
除本发明药物小剂量组在20％边缘区域所占百分比极少外，其余各组小鼠所占百分比相差不多，组间比较无显著性差异(P＞0.05)。但在中心区百分比比较中，模型组少于正常组和其他各给药组(P＜0.05/P＜0.01)。模型组小鼠2分钟穿越原隐匿平台位置的探索次数最少。本发明药物各剂量组组小鼠的平均穿越次数比模型组小鼠显著增多(P＜0.01)，与正常组和盐酸多奈哌齐组比较无显著差异(P＞0.05)，本发明药物大、中、小剂量组比较无显著性差异(P＞0.05)(见表5)
表5各组小鼠空间探索实验结果比较
| 组别 | N | 通过时间 | 边缘区(％) | 中心区(％) |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物大剂量组发明药物中剂量组发明药物小剂量组 | 666666 | 2.88±0.99**1.25±0.462.50±1.07**2.83±0.98**2.63±0.92**2.25±0.46* | 13.47±3.6914.99±4.3012.64±3.1311.68±4.6912.40±5.125.46±1.78** | 60.43±11.18*45.29±10.6457.06±11.54*57.97±14.81*57.27±10.14*70.69±8.72** |
注：*代表其他各组与模型组比较显著增多有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
3讨论
本实验在水迷宫定位航行测试中观察到，APP695V717I转基因小鼠寻找隐匿平台能力比正常组小鼠明显减退((P＜0.05)，表明其学习获取能力较差。本发明药物各剂量组小鼠隐匿平台潜伏期比模型组明显缩短(P＜0.05)，提示其受损的空间学习能力得以显著改善。
本实验还在水迷宫空间探索中观察到，模型组小鼠探索能力比正常组明显减退((P＜0.01)，而本发明药物各剂量组小鼠比模型组有明显改善(P＜0.05/P＜0.01)。在空间探索过程中，模型组小鼠多在池中作穿梭样游泳，表现出没有目的性；而本发明药物各剂量组与正常组类似，多在原平台所在位置附近反复寻找，中心区域探索百分比明显高于模型组(P＜0.05)，穿越原平台位置次数较模型组显著增加(P＜0.01)，表现出明显的目的性。提示本发明药物各剂量组对APP695V717I转基因小鼠空间记忆力(记忆再现过程)有显著影响，明显改善了小鼠的空间记忆保持能力的下降。有意义的是，模型组小鼠的20％边缘区域探索百分比与正常组和其他各给药组没有差别，这可能与小鼠的种属有关[2]。
实验实施例3：本发明药物对拟AD模型大鼠神经元突触损伤的保护作用及其机制
材料与方法
1.材料
1.1实验动物同实验实施例1。
1.2药品及制备：所述本发明药物采用了制备实施例6的产物。
抗体：一抗Aβ1-40、PSD-95、Shank、NGF、MAPK、p-CREB由首都医科大学宣武医院北京脑老化研究重点实验室应用美国PE公司431A型全自动多肽合成仪固相法合成相关肽段，HPLC纯化，与血蓝蛋白交联后免疫小鼠或兔制成多克隆抗体，ELISA检测抗体效价最高可达1∶16000。TrkA为Senta Cruz产品。
免疫组化用试剂盒-SPKit试剂盒内包括：封闭用正常山羊血清，生物素标记的羊抗鼠和羊抗兔通用二抗，过氧化物酶标记的抗生素抗体。Western-印迹印迹法所用二抗为北京中山生物技术公司的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG通用二抗，其它试剂等。
1.4主要仪器
620-E冰冻切片机，DIAX900型电动匀浆器，DYY III型转移电泳仪，DYY-II12型稳压稳流电泳仪，Microfuge R低温离心机，VISILOG5.0图象分析系统，BS-2型多功能电子恒温水浴锅，奥立龙868型pH仪，Morris水迷宫仪、数据自动采集及处理系统，江湾I型C立体定向器。
2.动物模型
2.1动物模型的选择根据文献选择Aβ海马注射大鼠模型[3]。
2.2模型制备与动物分组同实验实施例1。
3.测定指标
3.1免疫组化染色
检测大鼠皮质和海马Aβ1-40、NGF、ChAT、PSD-95、Shank、TrkA、MAPK、p-CREB的表达。大鼠以用10％水合氯醛按0.35ml/kg的剂量进行腹腔麻醉。行快速心脏灌注固定。完整取出鼠脑，冰冻切片机切片厚45μm。免疫组化按说明书操作。免疫组织化学染色结果的图象分析：每组随机选取4只大鼠行免疫组化切片，将切片置于10×10显微镜下观察海马CA1区及皮质阳性细胞，用Visilog 5.0by Noesis软件采集图象并分析，记录阳性细胞平均面积及平均光密度。
3.2Western-印迹蛋白印迹
检测大鼠脑组织NGF的表达。大鼠在非麻醉状态下断头取脑，冰盒上迅速分离脑组织，称重，置于eppendorf管中。加入预冷的0.01MPBS液洗2次，按照1∶5的比例加入预冷的脑组织匀浆液，在冰浴环境中应用电动匀浆器匀浆2分钟、冰浴裂解30分钟，15000rpm，，4℃离心30分钟，取上清，分装，-70℃保存。Folin酚比色法对脑组织进行蛋白定量。将待检样品冷冻抽干，配成每10ul样品中含200ug蛋白质的浓度，取10ul待检样品加10ul 2xSDS凝胶加样缓冲液，煮沸变性5min，-20℃保存、备用。NGF按照1∶1000的浓度稀释。其余步骤与第一部分材料与方法2.2.3.5中的步骤相同。
4.统计学处理同前。
结果
4.1.Aβ1-40在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区和皮质Aβ1-40阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著增加(p＜0.05)，而盐酸多奈哌齐和本发明药物提取物组虽仍较对照组增高，但无显著性差异(p＞0.05)，盐酸多奈哌齐组较模型组减少，但无显著性差异(p＞0.05)，本发明药物提取物较模型组显著下降(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐和本发明药物提取物之间差异不显著(p＞0.05)(见表6)。
表6大鼠Aβ1-40蛋白表达比较
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
4.2.突触后蛋白的表达变化
4.2.1PSD-95在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区PSD-95阳性细胞的平均面积和平均光密度与对照组比较差异显著(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐和本发明药物提取物组则较模型组显著增加(p＜0.05)，二者之间无明显差异(p＞0.05)。而皮质PSD-95阳性细胞的平均面积的变化与海马相似，平均光密度各组之间差异不显著(p＞0.05)(见表7)。
表7大鼠PSD-95表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
4.2.2ProSAP/Shank在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区和皮质ProSAP/Shank阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著降低(p＜0.05)，而盐酸多奈哌齐组只有海马CA1区的平均光密度与模型组差异明显(p＜0.05)，本发明药物提取物组的海马CA1区和皮质ProSAP/Shank则较模型组显著增加(p＜0.05)(见表8)。
表8大鼠脑ProSAP/Shank表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
4.3海马CA1区ChAT、NGF表达
各组大鼠大脑海马均见ChAT、NGF阳性细胞。正常组海马CA1区可见大的、深染的ChAT、NGF阳性神经元，数目多。模型组海马CA1区ChAT、NGF阳性神经元数目少，胞体染色浅。安理申和本发明药物组ChAT、NGF阳性神经元数目则较模型组显著增加，染色与正常组相似。结果见下表9。
表9模型大鼠海马CA1区ChAT、NGF阳性神经元数目比较
注：与正常组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比，＊＊P＜0.01
4.4.NGF受体TrkA在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区和皮质TrkA阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著降低(p＜0.05)，而盐酸多奈哌齐和本发明药物提取物组则较模型组显著增加(p＜0.05)，二者之间无明显差异(p＞0.05)(见表10)。
表10大鼠脑TrkA表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
4.5.MAPK(ERK)在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区和皮质MAPK阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著降低(p＜0.05)，而盐酸多奈哌齐只有海马CA1区的平均面积和模型组有差异(p＜0.05)，本发明药物提取物组海马CA1区和皮质阳性细胞的平均面积和平均光密度均较模型组显著增加(p＜0.05)(见表11)。
表11大鼠脑MAPK(ERK)表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05。
4.6.p-CREB在海马CA1区与皮质的表达变化
模型组海马CA1区和皮质p-CREB阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著降低(p＜0.05)，而盐酸多奈哌齐只有海马CA1区的平均面积和模型组有差异(p＜0.05)，本发明药物提取物组海马CA1区和皮质阳性细胞的平均面积和平均光密度均较模型组显著增加(p＜0.05)(见表12)。
表12大鼠脑p-CREB表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
4.7.NGF在脑组织中的表达变化
NGF在各组脑组织中的表达变化无显著性差异如图2所示。
5.讨论
5.1本发明药物提取物对突触后蛋白变化的影响
本研究中模型组PSD-95表达的减少说明突触弱化、功能受损，ProSAP/Shank蛋白表达下降，表明Aβ聚集损害了海马突触的功能和可塑性。而本发明药物提取物和盐酸多奈哌齐治疗组中PSD-95和Prosap/Shank表达较模型组增加，说明突触的功能及可塑性有所恢复。本研究提示本发明药物提取物对突触的功能和可塑性具有改善作用。
5.2本发明药物提取物对ChAT/NGF表达变化的影响
本实验AD模型大鼠出现了明显的学习和记忆障碍，并伴有明显的ChAT、NGF神经元的减少，说明与胆碱能神经的功能下降有关。给予本发明药物治疗后，ChAT、NGF神经元的表达明显增多，大鼠的学习和记忆能力显著提高，可能与调整胆碱能神经的功能有关。试验结果还有趣地显示，ChAT、NGF在神经元中的表达同升同降，反映了NGF对胆碱能神经的营养支持作用。同时也反映胆碱能神经对NGF的合成和释放的影响。
5.3本发明药物提取物对神经生长因子及其受体的表达变化的影响
本实验本发明药物提取物可使TrkA的表达水平增加，提高了NGF的生物利用度，激活了受体后的信号途径，促进了神经元的存活。
5.4本发明药物提取物对MAPK(ERK)表达变化的影响
实验中发现模型大鼠的海马和皮质的MAPK表达减少，说明其维持神经元存活的信号途径受到了抑制。而本发明药物提取物组中的相应区域表达增高，提示它可有效地促进神经存活的信号途径。
5.5本发明药物提取物对转录因子p-CREB变化的影响
本发明药物提取物促使CREB表达水平明显增高，神经元内的CREB蛋白含量增多，相应地逆转了上述过程，使神经元和突触避免了凋亡侵害，保持正常的形态和功能。
实验实施例4：本发明药物对APPV717I转基因小鼠脑内Aβ代谢的影响
1.材料与方法
1.1实验动物：同实验实施例2。
1.2药品与试剂：同实验实施例3。只是所述本发明药物采用了制备实施例7的产物。
1.3分组与给药：同前。
1.4脑组织样品处理：同实验实施例3。
1.5免疫组化染色方法同前。
1.6Western-印迹蛋白印迹同实验实施例3。
1.7统计学处理
所得数据以均数±标准差()表示，采用统计软件SPSS11.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05为差异有显著性意义。
2.实验结果
2.1各组APP转基因小鼠海马CA1区APP表达的变化
用APPN末端抗体对APP转基因小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组APP阳性细胞较正常对照组增多，胞浆着色明显加深，而其他各用药组APP阳性细胞较模型组减少，着色较浅。Image-proPlus图象分析系统分析结果见表13。
表13各组小鼠海马CA1区APP的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 12.83±6.48**48.33±13.04▲▲38.00±10.89*▲▲30.58±12.52**▲38.75±18.12*▲▲21.08±7.55** | 4227.33±635.79**18629.67±4225.12▲▲9763.50±3647.52**▲▲5320.50±1287.59**7406.83±4395.06**▲6207.67±3058.99**▲ | 133.24±3.47**175.44±3.98▲▲145.26±7.31**▲▲158.45±1.63**▲▲152.00±11.45**▲▲153.14±8.65**▲▲ |
注：▲代表与正常组比较显著增高并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.2各组APP转基因小鼠海马CA1区Aβ表达的变化
用Aβ40-42抗体对APP转基因小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组Aβ阳性细胞较正常对照组增多，胞浆着色明显加深，并且出现细胞外阳性着色，而其他各用药组Aβ阳性细胞较模型组减少，着色较浅。Image-proPlus图象分析系统分析结果见表14。
表14各组小鼠海马CA1区Aβ的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 21.17±8.57**52.67±23.22▲▲42.33±4.79▲▲43.08±15.72▲▲47.33±15.66▲▲28.92±11.55** | 4857.50±640.75**9638.33±706.58▲▲7748.67±1803.59**▲▲5603.00±690.99**6658.17±936.62**3947.50±501.58** | 166.49±1.47*179.25±2.02▲156.71±5.10*▲157.30±2.79*▲147.43±3.29*▲163.50±4.93* |
注：▲代表与正常组比较显著增高并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.3各组APP转基因小鼠海马CA1区BACE表达的变化
用特异性BACE抗体对APP转基因小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组BACE阳性细胞较正常对照组增多，胞浆着色明显加深，而其他各用药组BACE阳性细胞较模型组减少，着色较浅。Image-proPlus图象分析系统分析结果见表15。
表15各组小鼠海马CA1区BACE的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 26.17±4.78**54.67±11.44▲▲47.25±7.09*▲▲54.00±5.92▲▲46.42±10.09*▲▲38.50±8.23**▲▲ | 3036.00±590.58**11711.67±1875.48▲▲6561.50±555.12**▲▲7080.50±1253.77**▲▲9505.83±1641.25**▲▲3040.50±621.96** | 100.85±11.84**146.54±5.02▲▲143.27±6.91▲▲107.42±9.12**138.29±4.61▲▲145.32±5.69▲▲ |
注：▲代表与正常组比较显著增高并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.4各组APP转基因小鼠海马CA1区PS-1表达的变化
用早老蛋白-1(PS-1)抗体对APP转基因小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组PS1阳性细胞较正常对照组增多，胞浆着色明显加深，而其他各用药组PS1阳性细胞较模型组减少，着色较浅。Image-proPlus图象分析系统分析结果见表16。
表16各组小鼠海马CA1区PS1的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 15.33±2.15**40.92±7.74▲▲25.00±6.59**▲28.83±11.58**▲▲32.08±13.30*▲▲14.83±2.33** | 1855.50±428.38**6467.50±1016.97▲▲5444.67±1899.21▲▲1805.83±314.48**2610.50±967.67**4725.50±1227.02*▲▲ | 146.34±4.79*155.89±1.73▲150.92±6.76155.74±3.57▲139.64±4.47*▲152.19±6.14▲ |
注：▲代表与正常组比较显著增高并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著减少并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.5各组小鼠海马CA1区IDE表达的比较
用IDE抗体对各组小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组IDE阳性细胞表达与正常对照组相似，但胞浆着色明显加深，而其他各用药组IDE阳性细胞较模型组增多，着色较深。Image-proPlus图象分析系统分析显示：(1)小鼠海马CA1区表达的IDE阳性细胞平均数目比较，模型组与正常对照组相似(P＞0.05)；本发明药物小剂量组与模型组及正常组无差异(P＞0.05)，而本发明药物大、中剂量组与模型组差异明显(P＜0.01)。(2)小鼠海马CA1区表达的IDE阳性细胞总面积比较，模型组较正常对照组减少；本发明药物中剂量组较模型组显著增多(P＜0.05)，与正常组相比无显著差异(P＞0.05)。(3)小鼠海马CA1区表达的IDE阳性细胞平均密度比较，模型组较正常对照组明显降低(P＜0.05)；本发明药物大、中剂量组较模型组显著增高(P＜0.05/P＜0.01)，中剂量与正常组比较有显著差异(P＜0.01)(见表17)。
表17各组小鼠海马CA1区IDE的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 25.75±7.9823.83±6.1932.08±8.06**31.75±5.74**34.50±9.33**21.50±3.45 | 3526.33±588.013094.00±699.273534.67±406.273207.00±552.123765.17±477.12*3255.67±538.48 | 149.82±3.45*144.17±3.59▲149.96±2.83*149.56±3.51*155.24±2.62**145.96±2.52 |
注：▲代表与正常组比较显著减少并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著增多并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.6各组小鼠海马CA1区NEP表达的比较
用NEP抗体对各组小鼠脑片进行免疫组化染色后，各组小鼠海马CA1区均可见阳性反应物，分布于神经元胞膜和胞浆。模型组NEP阳性细胞表达与正常对照组相似，而其他各用药组NEP阳性细胞较模型组增多，着色较深。Image-proPlus图象分析系统分析显示：(1)小鼠海马CA1区表达的NEP阳性细胞平均数目比较，模型组与正常对照组相似(P＞0.05)；本发明药物小剂量组与模型组及正常组无差异(P＞0.05)，而本发明药物大、中剂量组与模型组差异明显(P＜0.05)。(2)小鼠海马CA1区表达的NEP阳性细胞总面积比较，模型组较正常对照组减少；本发明药物大、中剂量组较模型组显著增多(P＜0.01)，与正常组相比有显著差异(P＜0.05)。(3)小鼠海马CA1区表达的NEP阳性细胞平均密度比较，模型组与正常对照组相似；本发明药物中剂量组较模型组明显增高(P＜0.05)，与正常组比较有显著差异(P＜0.05)(见表18)。
表18各组小鼠海马CA1区NEP的表达
| 组别 | 例数 | 平均数 | 总面积 | 平均光密度 |
| 对照组模型组多奈哌齐组大剂量组中剂量组小剂量组 | 555555 | 20.75±7.0517.17±8.5821.25±5.2126.25±8.07*24.33±9.01*15.83±3.95 | 2710.33±660.692016.83±533.822808.33±569.254107.33±818.65**▲▲4452.17±581.18**▲▲2598.67±541.57 | 152.14±6.93155.29±4.43153.34±3.75153.09±6.06161.45±4.99*▲149.09±2.91 |
注：▲代表与正常组比较显著减少并有统计学意义：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；*代表与模型组比较显著增多并有统计学意义：*P＜0.05；**P＜0.01
2.7各组APP转基因小鼠全脑APP蛋白表达的变化
取小鼠全脑进行匀浆，采用Western印迹方法，用APPN端抗体测全脑APP的蛋白含量。结果显示：各组在100kD处皆出现一明显条带，模型组条带比正常组明显增粗，颜色加深，表明蛋白表达增加；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带明显变细，颜色变浅，表明蛋白表达减少(见图3)。
2.8各组APP转基因小鼠脑内Aβ表达的变化
采用Western印迹方法，用Aβ42抗体测全脑Aβ的蛋白含量。结果显示：各组在6kD～15kD处皆出现一明显宽条带，模型组条带比正常组颜色加深，表明蛋白表达增加；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带颜色变浅，表明蛋白表达减少(见图4)。
2.9各组APP转基因小鼠全脑BACE蛋白表达的变化
取小鼠全脑进行匀浆，采用Western印迹方法，用BACE抗体测全脑BACE的蛋白含量。结果显示：各组在70kD处皆出现一明显条带，模型组条带比正常组明显增粗，颜色加深，表明蛋白表达增加；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带明显变细，颜色变浅，表明蛋白表达减少(见图5)。
2.10各组APP转基因小鼠全脑PS-1蛋白表达的变化
取小鼠全脑进行匀浆，采用Western印迹方法，用PS1抗体测全脑PS1的蛋白含量。结果显示：各组在50kD处皆出现一明显条带，模型组条带比正常组明显增粗，颜色加深，表明蛋白表达增加；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带明显变细，颜色变浅，表明蛋白表达减少(见图6)。
2.11各组小鼠脑内IDE蛋白的表达
取小鼠全脑进行匀浆，采用Western印迹方法，用IDE抗体测全脑IDE的蛋白含量。结果显示：各组在110kD处皆出现一明显条带，模型组条带与正常组相当，颜色浅，表明蛋白表达较少；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带明显增宽，颜色加深，表明蛋白表达增多(见图7)。
2.12各组小鼠脑内NEP蛋白的表达
取小鼠全脑进行匀浆，采用Western印迹方法，用NEP抗体测全脑NEP的蛋白含量。结果显示：各组在100kD处皆出现一明显条带，模型组条带比正常组减细，颜色变淡，表明蛋白表达减少；本发明药物各剂量组与模型组相比，条带增宽，颜色加深，表明蛋白表达增多(见图8)。
3.讨论
3.1对APP转基因小鼠脑内APP表达的影响
本发明药物各剂量组的小鼠脑中APP的表达明显低于模型小鼠，说明本发明药物能降低APP的表达。
3.2对APP转基因小鼠脑内Aβ表达的影响
本发明药物各剂量颜色较模型组减淡，表明经本发明药物治疗后可使ADDLs减少。我们推测本发明药物可以通过减少ADDL的产生，降低Aβ的神经毒性，改善突触可塑性，进而保护小鼠的学习记忆功能。
3.3对APP转基因小鼠脑内BACE表达的影响
本发明药物各剂量组能明显降低BACE的表达，这也许是本发明药物减少Aβ产生的原因之一。但各剂量组在降低阳性神经元数目和表达的密度上并不同步，是否暗示本发明药物剂量的不同在改善神经元凋亡和BACE活性表达上存在差异。
3.4对APP转基因小鼠脑内PS-1表达的影响
本发明药物组对PS-1的表达具有抑制作用，从而可能抑制γ分泌酶活性。结合前面的实验，本发明药物可通过抑制β和γ分泌酶活性而使Aβ产生减少。
3.5本发明药物对APP转基因小鼠脑内IDE表达的影响
本发明药物治疗组可明显增加IDE的含量和表达，提示本发明药物可增强IDE的活性，从而提高降解Aβ的能力，减少脑中Aβ水平，阻止AD病理的形成。正常组小鼠IDE的含量和表达较少，可能与小鼠增龄有关。
3.6本发明药物对APP转基因小鼠脑内NEP表达的影响
本发明药物通过提高NEP的表达，增强对Aβ1-42的降解，减少Aβ的聚集和纤维化，从而减少淀粉样斑块的形成。
实验实施例5：本发明药物改善Aβ40静脉注射致AD大鼠学习记忆行为障碍的研究
1.材料与方法
1.1实验动物
二级雄性SD大鼠32只，实验条件同前。
1.2药品、试剂及制备：同前，只是所述本发明药物采用了制备实施例8的产物。
1.3Aβ1-40静脉注射拟AD模型大鼠的制备
(1)动物入选：用跳合实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。
(2)可溶性Aβ1-40的配制：Aβ1-40用生理盐水溶解，配制成50ug/ml的溶液，4℃冰箱保存备用。
(3)模型制备：根据文献选择Aβ血管内注射大鼠模型[11]。SD大鼠适养1周后，用10％水合氯醛按0.35ml/kg的剂量进行腹腔麻醉，颈部局部消毒，切开颈部皮肤、暴露右侧颈外静脉，向心端留置静脉插管(PE10)，开口端留置在头顶部。每日两次向插管中注射10ug/0.2ml可溶性Aβ1-40，生理盐水冲管，肝素封闭，连续注射14天(10μg/0.2ml/次)。对照组给与等体积的生理盐水。
(4)动物分组：大鼠分对照组、模型组、安理申组及发明药物组。
1.4药物干预方法同前。
1.5行为学观察同前。
1.6数据处理与分析方法同前。
2.结果
在实验中，应用Morris水迷宫对动物进行了5天的测试。前4天测试其学习能力，第5天撤去平台测试其记忆能力。第1天测试时，对照组和本发明药物组逃避潜伏期及游泳距离均较模型组动物缩短，差异具显著性(p＜0.05)。第2天对照组逃避潜伏期和距离与模型组差异显著(p＜0.05)，本发明药物组的逃避潜伏期和游泳距离与模型组差异显著(分别为p＜0.05；p＜0.01)。第3天测试时，对照组逃避潜伏期及游泳距离仍较模型组动物显著缩短(p＜0.05)，本发明药物组的逃避潜伏期与模型组差异显著(p＜0.05)。测试的第4天，各组动物在逃避潜伏期和游出距离间已无明显差异，到达平台期结果。第5天撤去平台后模型组大鼠的游泳模式以边缘式和随机式居多，而对照组、盐酸多奈哌齐组和本发明药物组则以趋向式居多；对照组、盐酸多奈哌齐组和本发明药物组大鼠的游泳时间及距离百分比与模型组比较均有显著性差异(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐组和本发明药物组二者之间无明显差异(p＞0.05)。
表19不同组大鼠逃避潜伏期比较(s)(
)
| 组别 | 例 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天(％) |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物组 | 8888 | 18.51±17.44**77.84±50.5453.27±56.1228.29±22.99* | 18.56±4.87*74.04±50.7965.03±50.0021.68±25.43* | 16.30±10.43*70.31±53.8263.40±40.3740.70±40.58* | 38.12±24.5368.03±40.2841.46±30.7044.97±27.54 | 31.30±6.98**22.64±6.9030.65±7.34*30.10±3.83* |
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
表20不同组大鼠游泳距离比较(cm)(
)
| 组别 | 例 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天(％) |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物组 | 8888 | 553.72±458.52*2472.26±2034.111698.33±1856.54748.81±658.91* | 576.51±287.08*1716.17±1240.381236.70±859.76539.98±632.92** | 352.19±244.84*981.86±770.63881.49±673.71542.29±415.34 | 645.44±367.93832.46±433.80720.17±424.56700.01±435.29 | 31.30±8.11*21.14±6.6629.80±8.11*29.56±4.80* |
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
3.讨论
本发明药物组大鼠的记忆损害可明显改善，而且神经元和血管损害得到减轻，海马和皮质的Aβ1-40表达量减少，提示其能改善模型大鼠的记忆损害，拮抗Aβ1-40造成的神经元和血管损伤，作用与拮抗循环中的Aβ1-40进入脑组织中的途径有关。
实验实施例6：本发明药物改善STZ海马注射致AD大鼠学习记忆行为障碍的研究
1.材料与方法
1.1动物与分组清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠78只，体重250～300g，购自北京维通利华实验动物中心，其它条件同前。78只大鼠随机分成假手术组(Sham)、STZ侧脑室注射组(Model)、STZ侧脑室注射加本发明药物大、中、小剂量组、STZ侧脑室注射加多奈哌齐组(Donepezil)，每组13只。
1.2药物与试剂STZ(链脲佐菌素)购自默克公司，其它同前，只是所述本发明药物采用了制备实施例10的产物。
1.3模型制备：除假手术组外，所有大鼠经10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉后，固定于江湾I型C大鼠立体定位仪上，常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜，锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。微量注射器每侧侧脑室各注射STZ约18ul(3mg/kg，注射前将STZ溶于生理盐水，浓度为25mg/ml)。坐标参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》：前囟后1.5mm，矢状缝左右旁开1.5mm，脑表面下3.5mm。第3天重复注射，剂量同前。假手术组操作同前，以等量生理盐水替代STZ。术后常规饲养至21d，随后应用DigBehv动物行为分析系统(上海吉量软件科技有限公司)对所有大鼠进行测试，观察5min内其在暗箱中的活动情况，将模型组与正常组进行比较，以剔除未成模的动物。
1.4给药方法：同前。
1.5外周血糖检测：分别于术前和术后尾静脉采血，微量血糖仪(Roche)测定外周血糖。
1.6Morris水迷宫行为学测试同前。
1.7统计学处理同前。
2.结果
2.1动物自发活动实验
DigBehv动物行为分析系统是观察实验动物在自然状态下的活动情况，用于评价药物对神经精神系统的影响。本实验中对所有大鼠进行测试，结果发现假手术组大鼠活动路线多呈边缘式，行动迅速，5min内行走路程(17660.60±990.87)mm；STZ模型组大鼠表现出无目的性，反应迟钝，5min内行走路程(11898.86±533.76)mm，与假手术组比较，差异有显著性(P＜0.01)。
2.2外周血糖检测
ic-STZ组和假手术组术前和术后(取材前)相比，外周血糖无差别。
2.3Morris水迷宫结果
2.3.1定位航行实验：在5天的定位航行实验中，各组大鼠的平均逃避潜伏期和游泳距离都呈逐渐下降趋势，表明各组大鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均得到提高。从第2天开始，模型组大鼠平均逃避潜伏期和游泳距离较假手术组明显延长(P＜0.05或P＜0.01)；从第3天开始，本发明药物大、中剂量组和多奈哌奇组平均逃避潜伏期和游泳距离较模型组明显缩短(P＜0.05或P＜0.01)，本发明药物小剂量组大鼠平均逃避潜伏期和游泳距离较模型组亦有明显缩短(P＜0.05)。；各用药组组间比较，金思维各剂量组以及与多奈哌奇组比较差别不是很大，无显著性差异。
表21各组大鼠在定位航行实验中的平均逃避潜伏期(X±s)
| 组别 | 例 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天 |
| 对照组模型组多奈哌齐组药物大剂量组药物中剂量组药物小剂量组 | 131313131313 | 84.89±5.3188.67±6.7485.10±6.7085.82±6.6587.82±6.6787.58±10.01 | 54.16±3.6663.11±7.45*57.08±7.8556.40±5.3257.49±8.1460.72±9.89 | 27.50±6.0041.86±2.38**35.05±10.01△35.78±5.87△35.96±2.09△38.30±3.29 | 24.60±4.8535.80±3.30**27.14±2.69△27.78±6.29△28.46±6.94△29.72±7.04△ | 18.86±6.0233.90±7.24**22.97±6.49△△23.56±5.61△△24.48±7.51△△28.48±4.45△ |
注：(1)与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；
(2)与模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01
表22各组大鼠在定位航行实验中的游泳距离(X±s)
注：(1)与假手术组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；
(2)与模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01
2.3.2空间探索实验：假手术组、本发明药物组和多奈哌奇组大鼠运动轨迹多位于原平台所在象限(第I象限)，而模型组大鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向原平台附近，其运动轨迹随机分布于各个象限中。撤去站台后，以在原平台象限的活动时间为指标，模型组(29.52±9.31)与假手术组(41.86±9.57)比较，原平台象限活动时间明显缩短(P＜0.01)；本发明药物各剂量组及多奈哌齐组与模型组比较，原平台象限活动时间明显延长(P＜0.01)。
表23各实验组空间探索实验第I象限活动时间(X±s)
| 组别 | 例 | 第I象限活动时间(s) |
| 对照组模型组多奈哌齐组药物大剂量组药物中剂量组药物小剂量组 | 131313131313 | 41.86±9.5729.52±9.31*38.99±9.08△38.36±3.85△38.05±3.89△37.39±4.26△ |
注：(1)与假手术组比较：*P＜0.01；
(2)与模型组比较：△P＜0.01
3.讨论
本实验引用侧脑室注射微量STZ建立散发性AD大鼠模型，通过Morris水迷宫检测本发明药物对该模型学习和记忆功能的影响。结果显示模型组与假手术组比较出现学习和记忆功能受损，而经过本发明药物治疗后，其空间学习记忆能力获得明显改善，提示本发明药物在一定程度上可以缓解痴呆大鼠的智能障碍，从行为学上证实了ic-STZ模型可以模拟AD样的认知障碍，同时为本发明药物的临床应用提供了理论依据。
实验实施例7：本发明药物调节Tau蛋白磷酸化酶失衡的机制研究
1.材料与方法
1.1实验动物：清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，条件同前。
1.2模型制备及分组：同前。
1.3药物与试剂：所述本发明药物采用了制备实施例1的产物。
1.4给药方法：同前。
1.5外周血糖检测：分别于术前和术后尾静脉采血，微量血糖仪(Roche)测定外周血糖。
1.6动物取材：同前。
1.7免疫组织化学染色：同前。
1.8免疫组化定量分析：同前。
1.9数据资料处理：同前。
2.结果
2.1外周血糖检测
ic-STZ组和假手术组术前和术后(取材前)相比，外周血糖无差异。
2.2形态学观察
电镜观察微管超微结构显示，假手术组大鼠海马神经元轴突内微管排列整齐成束，线粒体形态大小正常，未见肿胀；模型组微管结构有明显的断裂或溶解现象，神经元胞体固缩，线粒体肿胀，核糖体有部分解聚，高尔基体部分扩张；盐酸多奈哌奇组和金思维各剂量组微管结构基本保持完好，神经元近于正常。
2.3免疫组化结果
各组大鼠海马CA1区均可见阳性反应物，位于神经元胞体周边及突起中。模型组GSK-3β表达较假手术组明显增多，染色深；金思维治疗组和盐酸多奈哌奇组染色结果与正常组相似。
假手术组大鼠用PP-1、PP-2A染色后海马内阳性神经元数目多，染色深，突起长；模型组PP-1/PP-2A阳性神经元数目明显少于假手术组，染色淡；金思维各剂量组和盐酸多奈哌奇组阳性神经元数目较模型组表达增多，与假手术组相似。各组大鼠不同抗体免疫组化染色阳性细胞的数目和面积比较见表。
表24各组大鼠免疫组化染色阳性细胞数比较(x±s，个/视野)
| 组别 | GSK-3β | PP-1 | PP-2A |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物大剂量组发明药物中剂量组发明药物小剂量组 | 15.90±9.1847.00±14.07**30.38±4.47△△28.38±11.85△△30.00±8.65△△36.00±5.56△△ | 32.78±9.4914.80±3.70**30.25±7.32△△29.38±9.49△△25.70±8.38△△23.20±6.14△ | 50.75±11.6128.80±15.23**47.20±14.58△△46.63±7.05△△46.60±9.36△△41.11±6.21△ |
注：(1)与假手术组比较，**P＜0.01；
(2)与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
表25各组大鼠免疫组化染色阳性细胞表达面积比较(x±s)
| 组别 | GSK-3β | PP-1 | PP-2A |
| 对照组模型组多奈哌齐组发明药物大剂量组发明药物中剂量组发明药物小剂量组 | 3265.89±1774.888558.29±1957.37**6018.43±1463.96△△5610.75±1684.42△△6286.67±1759.50△6048.63±1710.79△△ | 9373.38±3501.223785.38±1941.97**8696.00±1803.45△6931.57±1836.27△7017.44±1709.01△6573.20±3651.20 | 12435.10±6512.234918.14±2216.29**11198.00±2467.18△12262.67±7653.35△△10153.89±3230.00△7736.63±3560.07 |
注：(1)与假手术组比较，**P＜0.01；
(2)与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
3.讨论
本实验引用侧脑室注射微量STZ建立AD大鼠模型，通过Morris水迷宫检测发现金思维在一定程度上可以缓解痴呆大鼠的智能障碍，其空间学习记忆能力获得明显改善。电镜观察发现AD大鼠海马神经元的微管出现断裂，甚至显示局部溶解现象，表明微管结构已受到明显损害，而应用本发明药物治疗后的海马神经元未发生明显断裂或溶解现象。电镜观察本发明药物各剂量组之间微管超微结构的改变无明显差别，表明本发明药物确能维护微管的正常结构，能保持海马神经元tau蛋白的正常磷酸化程度。我们检测到AD大鼠中存在GSK-3β表达异常增高，而PP-1和PP-2A表达下降，经过本发明药物治疗后，GSK-3β明显降低，PP-1和PP-2A表达有所升高，说明本发明药物可在一定程度上调节蛋白激酶和磷酸酶的平衡，但蛋白激酶升高和磷酸酶下降之间是否存在相应的因果关系，仍有待进一步研究。
实验实施例8：本发明药物调节神经元存活胰岛素信号通路的机制研究
1.材料
1.1实验动物二级雄性SD大鼠32只，条件同前。
1.2药品、试剂及制备。所述本发明药物采用制备实施例1的产物。
1.3主要仪器同前。
1.4模型制备与动物分组 模型制备方法同前。
1.5免疫组化染色检测大鼠皮质和海马IRS-1、IRS-2、PI3K的表达。按免疫组化染色试剂盒说明步骤进行。
1.6统计学处理同前。
2.结果
2.1.IRS-1的表达变化
模型组海马CA1区和皮质IRS-1阳性细胞的平均面积和平均光密度与对照组比较差异显著(p＜0.01)，发明药物组则较模型组显著降低(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐组的变化与模型组比较差异不显著(p＞0.05)。
表26大鼠海马CA1区IRS-1表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
表27大鼠皮质区IRS-1表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
2.2.IRS-2的表达变化
模型组海马CA1区和皮质IRS-2阳性细胞的平均面积和平均光密度与对照组比较差异显著(分别为p＜0.01，p＜0.05)，发明药物组则较模型组显著降低(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐组的变化与模型组比较差异不显著(p＞0.05)。
表28大鼠海马CA1区IRS-2表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05
表29大鼠皮质区IRS-2表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
2.3.PI3K的表达变化
模型组海马CA1区PI3K阳性细胞的平均面积和平均光密度与对照组比较差异显著(分别为p＜0.01，p＜0.05)，发明药物组则较模型组显著降低(p＜0.05)，盐酸多奈哌齐组的变化与模型组比较差异不显著(p＞0.05)。模型组皮质PI3K阳性细胞的平均面积和平均光密度与对照组比较差异显著(p＜0.01)，发明药物组和盐酸多奈哌齐组则较模型组显著降低(p＜0.05)。
表30大鼠海马CA1区PI3K表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
表31大鼠皮质区PI3K表达
注：与模型组比较：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01
3.讨论
实验中模型组IRS-1、IRS-2的阳性表达均较对照组降低，说明二者介导的IGF-1信号传导障碍，但不能确切地分辨是哪一条途径起的作用更重要。二者的下游信号PI3K表达均降低说明它们具有共同的下游靶位。本发明药物组IRS-1、IRS-2及PI3K的阳性表达显著提高，提示它可有效改善IRS家族介导的神经存活信号。
参考文献
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Claims (20)
1.一种用于治疗老年痴呆的药物，其特征在于其活性成分是由下述重量配比的原料获得的水提取物组成的：
人参茎叶4-12份，远志2-10份，
淫羊藿4-12份，郁金2-10份，
所述药物还含有选择性的药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物，其中各原料的重量配比为：
人参茎叶10份，远志8份，
淫羊藿10份，郁金8份。
3.一种用于治疗老年痴呆的药物，其特征在于其活性成分是由下述重量配比的原料获得的水提取物组成的：
人参茎叶4-12份，远志2-10份，
淫羊藿4-12份，郁金2-10份，
丹参8份，石菖蒲8份，
当归8份，肉苁蓉8份，
所述药物还含有选择性的药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物，其中所述的药物用于改善老年痴呆患者的记忆和认知功能、改善患者生活能力、缓解大脑神经退行性变。
5.根据权利要求1-3任一项所述的药物，其中所述的药物用于治疗阿尔茨海默病。
6.根据权利要求1-3任一项所述的药物，其中所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或汤剂。
7.权利要求1-6中任一项所述药物的制备方法，其特征在于其中所述的提取物是由下列方法获得的：将原料置于煎煮器中，加水浸没药材，浸泡0.5小时-24小时后，加热至沸，煎煮1-4次，每次0.5-4小时，使药物浸出，合并滤液。
8.根据权利要求7的制备方法，其中所述的提取物是由下列方法获得的：将原料置于煎煮器中，加水浸没药材，浸泡8小时-12小时后，加热至沸，煎煮2-3次，每次1-3小时，使药物浸出，合并滤液。
9.根据权利要求8的制备方法，其中进一步包括将滤液浓缩成一定浓度。
10.根据权利要求7-9任一项的制备方法，其中进一步包括加入50％-100％乙醇作为溶剂调制，静置1-5小时；进行分离，弃去沉淀。
11.根据权利要求10的制备方法，其中在冷藏条件下静置。
12.根据权利要求10的制备方法，其中醇浓度为80％以上。
13.根据权利要求10的制备方法，其中进一步包括浓缩上清液，干燥，得到干燥品。
14.根据权利要求13的制备方法，其中进一步包括将干燥品制成适宜的药用剂型。
15.由下述重量配比的原料获得的水提取物组成的活性成分在制备治疗老年痴呆的药物中的用途：
人参茎叶4-12份，远志2-10份，
淫羊藿4-12份，郁金2-10份。
16.根据权利要求15所述的用途，其中各原料的重量配比为：
人参茎叶10份，远志8份，
淫羊藿10份，郁金8份。
17.由下述重量配比的原料获得的水提取物组成的活性成分在制备治疗老年痴呆的药物中的用途：
人参茎叶4-12份，远志2-10份，
淫羊藿4-12份，郁金2-10份，
丹参8份，石菖蒲8份，
当归8份，肉苁蓉8份。
18.根据权利要求15-17任一项所述的用途，其中所述的药物用于改善老年痴呆患者的记忆和认知功能、改善患者生活能力、缓解大脑神经退行性变。
19.根据权利要求15-17任一项所述的用途，其中所述的药物用于治疗阿尔茨海默病。
20.根据权利要求15-17任一项所述的用途，其中所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或汤剂。
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| 刘峘，田金洲，燕莉，等.血管性痴呆患者证候学研究.北京中医药大学学报29卷 1期.2006,29(1),52-55. |
| 刘峘,田金洲,燕莉等.血管性痴呆患者证候学研究.北京中医药大学学报29卷 1期.2006,29(1),52-55. * |
| 李小黎，田金洲，盛树力，等.复方金思维对阿尔茨海默病大鼠脑组织突触后致密区蛋白95表达的影响.中国临床康复9卷 17期.2005,9(17),139-141. |
| 李小黎,田金洲,盛树力等.复方金思维对阿尔茨海默病大鼠脑组织突触后致密区蛋白95表达的影响.中国临床康复9卷 17期.2005,9(17),139-141. * |
| 田金洲，朱爱华，钟剑.金思维治疗社区轻度认知损害老年患者记忆减退症状的1年随访.中国中药杂志28卷 10期.2003,28(10),987-991. |
| 田金洲,朱爱华,钟剑.金思维治疗社区轻度认知损害老年患者记忆减退症状的1年随访.中国中药杂志28卷 10期.2003,28(10),987-991. * |
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