CN104435306A

CN104435306A - 养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用

Info

Publication number: CN104435306A
Application number: CN201410483630.9A
Authority: CN
Inventors: 吴迺峰
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-09-22
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2015-03-25
Also published as: WO2015039619A1; TWI733061B; TW201919678A; TW201542219A; TWI715521B

Abstract

本申请公开了一种中药组合物用于治疗阿尔茨海默氏(老年痴呆)中应用；具体公开了该中药组合物可以显著清除早中期阿尔茨海默脑内老年斑的作用，该作用的主要机理为该中药组合物清除脑内Aβ蛋白、促进APP的生理性α切割、促进了的可溶性神经营养性sAPPα蛋白的生成、促进APP的生理性α切割、抑制致病性γ分泌酶早老素PS1。

Description

养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用

技术领域：

本发明涉及一种中药组合物制剂的新用途，特别涉及养血清脑制剂在制备治疗阿尔茨海默症(老年痴呆)的药物中的应用。

背景技术：

养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司研制的现代中药制剂，并于1996年获得国家新药证书，并于1999年被列入国家基本药物目录，2000年被列入国家医保药品目录。养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、熟地黄、决明子、夏枯草、细辛、延胡索和珍珠母11味中药，经现代高科技手段提取后，加入适当辅料，经混合制粒等制剂过程制成的一种颗粒剂。该制剂具有有效成分溶出快，生物利用度高等优点。养血清脑颗粒具有养血平肝，活血通络的功效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症，在临床上具有显著的疗效。

养血清脑制剂为现有技术，中国专利93100050.5描述了其配方及制备方法，该专利描述的配方还可以根据制剂学常规技术制备成不同的剂型，如片剂，胶囊，口服液等。

阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD)，也称为老年痴呆症，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。

目前治疗阿尔茨海默症的药物包括：多奈哌齐(donepezil)，利斯的明(Rivastigmine)，加兰他敏(Galantamine)，石杉碱甲(Huperzine A)，美金刚(Memantine)，司来吉兰(Selegiline)，维生素E，褪黑素，银杏提取物(gingkobilobi)，吡拉西坦(piracetam脑复康)、茴拉西坦(aniracetam阿尼西坦，三乐喜)、萘非西坦等。

本发明经过研究，意外的发现养血清脑制剂具有治疗阿尔茨海默症的作用。

发明内容：

本发明提供一种中药组合物的新用途，特别涉及养血清脑制剂的新的医药用途。具体的，本发明提供一种中药组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。所述应用在于中药组合物可以用于清除阿尔茨海默脑内老年斑。

本发明所述中药组合物是由如下重量百分的药材制备而成：当归6.75％、川芎6.75％、白芍5.4％、钩藤13.5％、鸡血藤13.5％、熟地黄5.4％、决明子13.5％、夏枯草13.5％、细辛1.34％、延胡索6.75％和珍珠母13.5％。

制备工艺为：药材经前序处理→水提→浓缩→乙醇沉淀→回收乙醇→浓缩成膏→混合制剂。

所述制剂包括任何一种可服用的剂型，优选口服制剂，如：颗粒剂，丸剂，片剂，胶囊，口服液。

本发明所述的应用，在于该中药组合物使记忆认知能力显著提高。

本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马组织中脑源性神经生长因子、神经生长因子及其受体TrkA的表达，改善海马神经元超微结构的异常。

本发明所述的应用，在于该中药组合物能够增加大脑皮层总抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH‐px活性，减少MDA含量。

本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马突触素及突触后致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。

本发明所述的应用，在于该中药组合物能够提高大脑皮层及海马组织中乙酰胆碱的表达，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮质M1胆碱受体的表达。

本发明所述的应用，在于该中药组合物用于清除阿尔茨海默脑内老年斑。

本发明所述的应用，在于该中药组合物能够清除脑内Aβ蛋白，降低脑内Aβ蛋白的生成。

本发明所述的应用，在于所述应用在于该中药组合物能够抑制致病性γ分泌酶早老素PS1的表达水平抑制APP的病理性切割，促进APP发生生理性α剪切的作用。

本发明所述该中药组合物的优选提取方法为：

取权利要求1中所述的中药组合物处方量的各药材备用：

(1)提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加乙醇加热回流提取，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩，备用；

(2)提取物2的制备：白芍加乙醇加热回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，备用；

(3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加水煎煮，滤过，浓缩，加乙醇静置，滤过，回收乙醇并浓缩，备用；

(4)制剂的制备：取以上3种提取物，加入适量辅料，制剂，即得。

另一优选的制备方法为：

(1)提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入3～6倍量50～80％乙醇加热回流提取2～3次，第一次0.5～2.5小时，第二、三次0.5～2小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.250～1.350(70～80℃)，备用；

(2)提取物2的制备：白芍加入3～6倍量50～80％乙醇，浸渍，加热回流提取2～3次，第一次0.5～2.5小时，第二、三次0.5～2小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.35(55～65℃)，备用；

(3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入4～10倍量水煎煮2～3次，第一次0.5～3小时，第二、三次1～3小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(75～85℃)，加乙醇使含醇量为60～85％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.270～1.350(75～85℃)，备用；

(4)制剂的制备：取以上提取物，加入适量辅料，制剂，即得。

最优选的制备方法为：

(1)提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.300～1.310(74～76℃)，备用；

(2)提取物2的制备：白芍加入4倍量60％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.23～1.33(65℃)，备用；

(3)提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～70％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.320～1.325(79～81℃)，备用；

本发明所述应用是经过实验观察获得的，其使用了该中药组合物制剂中的一种，即天士力制药股份有限公司生产的“养血清脑颗粒”作为实验药品，任何与养血清脑颗粒具有相同处方经提取得到的提取物均具有与养血清脑颗粒相同的用途。

实验结果如下：

实验一、养血清脑颗粒对轻中度阿尔茨海默症模型鼠脑内β-淀粉样斑块的清除作用和记忆认知能力改善作用研究

摘要APPswe/PSldE9双转基因小鼠是国际公认的阿尔茨海默症(Alzheimer’sDisease，AD)模型鼠，6月龄APPswe/PSldE9转基因脑内开始出现了老年斑，模拟人类中轻度阿尔茨海默症。4月龄APPswe/PSldE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠连续60天，口服养血清脑颗粒48g生药/kg(高剂量)和16g生药/kg(低剂量)，或对照药物安理申1.03mg/kg至小鼠6月龄，发现口服养血清脑颗粒一个月和二个月后，小鼠记忆认知能力显著提高，且作用效果优于阳性药物安理申组。通过脑组织切片的刚果红染色和免疫组织化学染色实验证明养血清脑颗粒清除早中期阿尔茨海默症模型鼠大脑β-淀粉样斑块(老年斑)的显著作用，从小鼠大脑海马区和皮质区β-淀粉样斑块(老年斑)的个数、覆盖面积和着色程度方面，养血清脑颗粒对脑内老年斑的清除率达60-90％，显著高于阳性药物安理申组。人淀粉样蛋白前体APP(β-amyloid precursor protein)的异常剪切是阿尔茨海默症发病的关键，进一步通过转基因小鼠脑内APP的关键剪切酶和剪切产物的检测，证明养血清脑颗粒通过提高脑内APP的生理性切割途径并抑制APP病理性切割途径，从而降低了β-淀粉样斑块在脑内的形成和沉积。本研究充分证明养血清脑颗粒对轻中度阿尔茨海默症有很好的治疗效果。

1实验目的

养血清脑颗粒是天士力集团有限公司生产的中药复方制剂，临床上主要用于治疗头痛，改善慢性脑缺血。在长期临床观察中，发现该药还有一定的改善阿尔茨海默症的作用。本实验室进行了该药对早中期APPswe/PSldE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠记忆、认知能力影响，特别是针对阿尔茨海默症特征性病变–β淀粉样蛋白Aβ在脑内的沉积，利用不溶性Aβ的特异染色、淀粉蛋白识别的刚果红染色等手段，研究了养血清脑颗粒对早中期APPswe/PSldE9双转基因阿尔茨海默症模型小鼠脑内Aβ老年斑的清除作用，并通过蛋白剪切途径的研究揭示其作用靶点和机制，为养血清脑颗粒用于治疗轻中度阿尔茨海默症提供实验依据。

2实验材料

2.1受试药品及配制

2.1.1受试药物：养血清脑颗粒浸膏(简称养血清脑)，黑褐色浸膏，由天士力药业集团提供，批号：20120514，出膏率13％，相当于每克浸膏含7.7g生药，用生理盐水配制成2.4g、0.8g生药/ml浓度的溶液，供小鼠灌胃给药用(文中剂量按生药量计)，给药体积为20ml/kg。小鼠用药剂量为高浓度48g生药/kg，低浓度16g生药/kg。

阳性对照安理申，市售，每片5mg，卫材(中国)有限公司，批号：111030A，临用时用生理盐水按0.0515mg/ml制成混悬液，供小鼠灌胃给药用，给药体积为20ml/kg。小鼠用药剂量为安理申1.03mg/kg。

2.2实验动物与基因型鉴定

实验动物APPswe/PSldE9双转基因AD小鼠购自南京大学模式动物研究所。APPswe/PSldE9双转基因小鼠是国际公认的阿尔茨海默症模型鼠。如图1所示，APPswe/PSldE9双转基因小鼠转入了人的瑞典型突变APPswe和第9外显子缺失突变的PSldE92个基因，可表达人的突变型APP分子，异常剪切产生过量的Aβ42多肽，在脑内形成Aβ斑块及其他AD病变过程中的组织病理变化，出现AD相应的行为学异常改变。据报道该品系4-5月龄小鼠时开始在杏仁体和海马出现一些嗜刚果红的斑块(老年斑初期)，6月龄开始在大脑皮质、海马和杏仁体形成大量淀粉样斑块，模拟人类中轻度阿尔茨海默症。

我们对用于药物测试的APPswe/PSldE9双转基因AD小鼠进行了基因型鉴定。取鼠尾尾尖，加入裂解液和蛋白激酶K10mg/ml，56℃隔夜消化鼠尾。加入酚氯仿去除蛋白,异丙醇沉淀DNA,70％冰乙醇洗涤干燥获得鼠尾DNA。采用APPswe引物：5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’和5’-CTGACTGGTGAGCTGGTCCAAGAC-3’进行鉴定APPswe基因的PCR反应。反应条件：94℃30sec，69℃60sec，72℃60sec，30循环。经PCR扩增，转基因鼠中出现APP基因特异条带，大小为350bp，而背景鼠无条带产生。利用PCR方法对所有实验鼠进行了基因型鉴定，保证了所有实验鼠为阳性纯合子的转基因鼠，如图1-1所示。

图1-1APPswe/PSldE9转基因鼠的基因型鉴定

2.3实验试剂及配制

2.3.1试剂

多聚甲醛(Sigma)、戊巴比妥钠(Genview)、刚果红、苏木精、氧化汞(Sigma)、DAB显色试剂盒(北京鼎国)、鼠兔通用型免疫二抗(Proteintech)，浓氨水、无水乙醇、浓盐酸、甘油、甲醇、柠檬酸、柠檬酸三钠、二甲苯(北京化工)。TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、Gly、考马斯亮蓝R250、BSA(Sigma)、Triton X-100(Genview)、蛋白质标准分子量(北京全式金)、Tween-20(BBI)，兔抗鼠β-Actin抗体(武汉博士德)、HRP标记山羊抗兔IgG(北京全式金)、ECL光化学试剂盒(碧云天)。

刚果红染色液与苏木精染色液：取0.5g刚果红粉末和20ml甘油加至80ml甲醇中，配制成0.2％刚果红染色液。取20g硫酸铝钾溶于200ml蒸馏水，100℃溶解。取苏木精1g溶于10ml无水乙醇，加至硫酸铝钾水溶液中煮沸，加入0.5g氧化汞，继续加热并搅拌至溶液为深紫色，立即冷却过滤，配制成苏木精染色液。

2.4实验主要仪器

Y型迷宫系统(RD1102-YM)，垂直电泳仪和电源系统(北京六一厂)，半干转膜仪(BIO-RAD)。DP70正置显微镜和摄影系统(OLYMPUS)，应用显微镜图像处理软件DP Controller采集图片。

3实验方法

3.1实验分组及给药

实验动物APPswe/PSldE9双转基因AD小鼠随机分为生理盐水对照组、养血低浓度组、养血高浓度组和安理申组，雌雄各半，各组16只，在实验过程中，生理盐水组和安理申组各有2只死亡，每组14-16只，体重20-40g。常规饲养，自由饮水，4月龄APPswe/PSldE9转基因鼠连续灌胃给药，给药容积每25g体重灌胃0.5ml。灌胃给药至6月龄。

表1 试验分组及给药量

组别	给药量	各组只数
			生理盐水组	－	14
养血低浓度组	16g生药/kg/d	16
			养血高浓度组	48g生药/kg/d	16
安理申组	1.03mg/kg/d	14

3.2Y迷宫实验检测小鼠记忆认知行为：

Y迷宫仪器包括3个等长的臂，各夹角120°，呈Y字形。小鼠在封闭的空间内(Y迷宫)会本能的寻找出路，认知和空间记忆能力正常的小鼠会在寻找过程中探寻每一条路径，而非总是重复已经探寻过的路径。具体为将小鼠自Y迷宫的带有小门的臂放入迷宫，将三个臂任意编号为A臂、B臂和C臂，小鼠在其内自由活动8分钟，记录小鼠的路线，如小鼠的路径能够依次循环(三个路径中无重复)则记为正确，如出现错误路径，则记为错误，并以该处为起点重新计路径。最终计算公式中：正确率Alteration(％)＝n of alteration/总进臂次数totalarm entries-2*100％，n是指正确的路径数。例如：小鼠活动路线为ABCABCBACBACACBABCA，其中红色即为错误的路径，n＝16，总的进入臂身的次数即为19，正确率＝16/19-2*100％＝94.11％。

3.3小鼠心脏灌流固定及包埋切片

小鼠通过戊巴比妥钠深度麻醉,麻醉后剪开小鼠的胸腔,将灌流针插入小鼠左心室内,同时剪开右心耳,灌入0.01M PBS(pH7.4)50-100ml,直到灌流液清亮为止。同时再灌入4％的多聚甲醛50-100ml。灌流完成后，取脑，在4％多聚甲醛溶液中浸泡固定过夜。自动包埋机包埋后进行石蜡切片。片厚1.5μm。

3.4刚果红染色检测大脑内淀粉样物质

石蜡片子取出后，在60-65℃烤片机上烤片30min。片子从烤片机上取下后浸泡于二甲苯中30min。按照无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，水，蒸馏水的顺序依次脱水。苏木精染色1min，氨水蓝化。刚果红染色1h后，碱性分化液分化，按照80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，无水乙醇顺序脱水。二甲苯浸泡1min，风干后，树胶封片。脑内Aβ老年斑为淀粉样物质，刚果红染色后呈红色。每张切片对皮质和海马的红色Aβ淀粉样斑块数量和面积进行测量和计算，取其平均值进行分析。

3.5免疫组织化学染色

1石蜡切片浸泡于二甲苯中30min。然后按照无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，水，蒸馏水的顺序依次脱水。pH6.0柠檬酸高压120℃修复2-2.5min，3％医用消毒H₂O₂去除内源活性物质。加入APPβα抗体4h，鼠兔通用型即用二抗室温孵育50min。DAB染色3min。苏木精复染，氨水蓝化，脱水。二甲苯浸泡1min，风干后，树胶封片。

3.6β-淀粉样斑块计数

每张免疫组织化学染色切片对皮质和海马随机观察3个视野进行测量，计数每个视野下强阳性与弱阳性β-淀粉样斑块数量，取其平均值进行分析。

3.7Western Bloting方法检测小鼠大脑组织内αAPPs、ADAM10和PS1的蛋白水平。

剖离小鼠大脑组织，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至PVDF膜上。以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加各种一抗αAPPs、ADAM10或PS1，室温2h，PBS洗3次。山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h，PBS洗涤3次。后用ECL光化学试剂盒(碧云天)检测信号，X光片曝光显影。

抗体：ADAM10、PS1、β-actin抗体购自博奥森公司。APPβα段抗体自主研发，选择APPβ切割与α切割之间的16氨基酸短肽DAEFRHDSGYEVHHQK(此肽段为纤维状不溶性肽，是决定Aβ42脑不溶性的关键区域)作为抗原，通过基因重组、测序，蛋白表达与纯化，动物免疫和ProteinA/G纯化获得高效价的APPβα抗体。

3.8统计

将数据应用SPSS Statistics 17.0进行统计学分析。结果用散点图结合平均值和平均值±标准误表示，数据采用单因素方差分析结合LSD法进行组间比较。

4实验结果

4.1一般观察

转基因小鼠4月龄时，已经出现精神损伤症状，与背景鼠相比进食量减少、自主活动减少，行动迟缓，精神萎靡，皮毛欠光泽等。给药后，养血清脑组转基因小鼠均有不同程度的改善，食量增加，精神好转。

4.2Y迷宫实验证明血清养血清脑颗粒具有显著改善早中期阿尔茨海默症动物模型小鼠记忆、认知能力的作用

Y迷宫实验是用于检测小鼠空间认知能力和短期记忆能力的一种操作简单、应用广泛的行为学手段。如表2和图1-2所示，Y迷宫实验证明养血清脑颗粒具有显著改善早中期阿尔茨海默症动物模型小鼠记忆、认知能力的作用。如给药中期一个月的检测结果，生理盐水正确率最低为79.59％，养血低浓度组和高浓度组的小鼠Y迷宫正确率平均值分别为86.10％和87.12％，安理申阳性对照组为80.67％。养血低浓度组和高浓度组都与对照组有显著差别。给药末期两个月的行为学检测结果，生理盐水正确率最低为77.52％，养血低浓度组和高浓度组的小鼠Y迷宫正确率平均值分别为83.86％和85.64％，安理申阳性对照组为82.19％。养血高浓度组和养血低浓度组改善认知能力的作用效果显著高于对照组。

所以我们的结果证明，给药一个月和给药两个月，养血低浓度组和高浓度组的小鼠Y迷宫正确率与对照相比提高了近10％，具有显著性；安理申阳性对照组虽然给药两个月时Y迷宫正确率有所提高，但未达到统计学差别。所以结果证明血清脑颗粒具有显著改善早中期阿尔茨海默症动物模型小鼠记忆、认知能力的显著作用。

表2 Y迷宫实验检测连续给药2个月对AD模型小鼠记忆、认知能力的影响

注：与生理盐水组比较*P<0.05，**P<0.01

图1-2Y迷宫实验证明养血具有显著改善早中期阿尔茨海默症动物模型小鼠记忆、认知能力的作用

注：与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01

4.3特异识别淀粉样斑块的刚果红染色证明养血清脑颗粒具有显著清除早中期小鼠脑内老年斑的作用

AD患者表现为额颞叶和海马区等部位的中枢神经系统退行性的病变，Aβ淀粉样斑块是阿尔茨海默症特征性的病变。Aβ的凝集和聚积是AD病理发生、发展的起始因素，而其他的病理改变如脑内神经纤维缠结、神经元的功能紊乱和丢失等，均被认为是由于Aβ的解离与凝聚、清除与产生的失衡所引发的。

阿尔茨海默症的特征性病变是Aβ淀粉样蛋白在脑内的沉积。甲醇刚果红染色用于显示淀粉样物质，可以很好识别脑内淀粉样Aβ蛋白的沉积。我们发现通过2个月口服养血清脑颗粒小鼠的大脑皮层中Aβ淀粉样斑块个数和面积显著减少，并且存在剂量相关性，养血高浓度组较低浓度组治疗效果更加明显(图1-3-1-7)。

如图1-3-1-5显示对照组和实验组大脑皮质区淀粉样斑块的刚果红染色情况。生理盐水组和安理申组脑内Aβ淀粉样斑块数目多，养血清脑颗粒高浓度和低浓度组淀粉样斑块数目少。在雄性(图1-4)小鼠和雌性小鼠(图1-5)的大脑额叶皮质区，生理盐水组和安理申组可以检测到一定数目的嗜刚果红染色的细胞外红色的菊花样斑块，为AD特征性淀粉斑块，而养血清脑颗粒高浓度和低浓度组淀粉样斑块数目少，斑块面积小。可见养血低浓度组和高浓度组具有显著清除额叶皮质区淀粉样斑块沉积的作用，而对照药物安理申对淀粉样斑块清除作用不显著。

大脑海马区是存储短期记忆关键部位，也是人类处理长期学习与记忆空间定位的大脑区域。图1-6是各组小鼠大脑海马区的刚果红染色，生理盐水组和安理申组可检测到淀粉样斑块的沉积，而养血清脑颗粒高浓度和低浓度组清脑颗粒海马区周围检测不到淀粉样斑块的沉积。

我们对全大脑的嗜刚果红染色淀粉样斑块的数目进行了量化。如表3和图1-7所示，从老年斑的个数来看，6月龄APPswePSEN1dE9转基因鼠生理盐水对照组脑内出现了显著的老年斑，与之比较，阳性对照安理申组老年斑个数下降了37.5％，但是无显著差别。非常显著的是，与生理盐水对照组比较，养血清脑颗粒低浓度组脑内老年斑减少了62.2％(p<0.05)，养血清脑颗粒高浓度组脑内老年斑减少了70.1％(p<0.01)。提示养血清脑颗粒具有显著清除早中期小鼠大脑皮质区老年斑的个数的作用。

我们对全大脑的嗜刚果红染色淀粉样斑块的面积进行了量化。如表3和图1-8所示，从老年斑的面积来看，安理申，作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂发挥疗效，因而降低大脑或海马区β-淀粉样斑块沉积的作用不明显。阳性对照安理申组老年斑面积比对照组下降了17.8％，但是无显著差别。而与对照组比较，养血低浓度组脑内老年斑面积减少了61.4％(p<0.01)，养血高浓度组脑内老年斑面积减少了72.4％(p<0.01)。

以上结果证明，养血清脑颗粒具有显著清除早中期小鼠脑内淀粉样老年斑的作用，清除率达60-70％以上，高剂量养血清脑颗粒的作用更为显著。市售的治疗阿尔茨海默症的阳性药物安理申，作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂发挥疗效，因而降低大脑或海马区β-淀粉样斑块沉积的作用不明显。养血清脑颗粒对淀粉样老年斑清除的治疗效果明显强于阳性药物安理申。

图1-3各药物组小鼠大脑额叶皮质区的刚果红染色

图1-4各药物组雄性转基因小鼠的大脑额叶皮质区的刚果红染色

(箭头所指粉红色β-淀粉样斑块)

图1-5各药物组雌性转基因小鼠的大脑额叶皮质区的刚果红染色

(箭头所指粉红色β-淀粉样斑块)

图1-6各药物组转基因小鼠海马区的刚果红染色

(箭头所指粉红色β-淀粉样斑块)

表3 连续给药2个月后不同给药组AD模型小鼠大脑组织β-淀粉样斑块的个数和覆盖面积

组别	剂量	n	β-淀粉样斑块个数(个)	β-淀粉样斑块覆盖面积(μm²)
					生理盐水组	-	14	40.14±5.77	598.83±70.08
养血低浓度组	16g/kg	16	15.19±1.33**	231.02±17.59**
					养血高浓度组	48g/kg	16	12.00±1.96**	165.17±24.82**
安理申组	1.03mg/kg	14	25.07±3.06**	492.15±68.52

注：与生理盐水组比较**P<0.01

图1-7各药物组转基因小鼠的大脑组织β-淀粉样斑块个数

与生理盐水组比较，*p<0.05；**p<0.01.

图1-8各药物组转基因小鼠的大脑组织β-淀粉样斑块覆盖面积

与生理盐水组比较，**p<0.01.

4.4利用识别脑内不溶Aβ蛋白的APPβα特异抗体的免疫组化染色，证明养血清脑颗粒显著清除早中期AD小鼠脑内Aβ老年斑的作用

人淀粉样蛋白前体APP是一种阿尔茨海默症发病的关键蛋白质，其发生β剪切形成的淀粉样蛋白Aβ在脑内的沉积是阿尔茨海默症的主要病理特征之一。APP正常情况下发生α分泌酶剪切途径，产生胞外可溶性sAPPα蛋白。而在阿尔茨海默症的发生过程中APP在两种蛋白酶即β-分泌酶和γ-分泌酶的先后作用下被切割而产生42个氨基酸的Aβ肽，是AD的主要毒性物，至脑组织中神经元之间及突触部位大量聚集，形成淀粉样老年斑,可使大脑功能受损，导致记忆和认知障碍。目前的抗体多为Aβ段(β切割与γ切割的42肽)的抗体，无法识别特异性β切割(检测C段蛋白中同时包含β切割蛋白和α切割蛋白)，特别是对脑内可溶肽(生理)和不溶肽(病理)区分困难。

我们选择了Aβ42肽中的N段β切割与α切割之间的16肽作为抗原，在检测阿尔茨海默症病理剪切具有独特的优势。如图1-9所示，首先Aβ42肽的脑不溶解肽段发生由此16肽组成，所以此16肽抗体显著提高识别脑内不溶蛋白(Aβ)的特异性检测效率，将脑内不溶肽的检测研究手段提高到新阶段。抗体的制备和纯化见方法部分，我们应用此抗体检测了养血清脑颗粒清除阿尔茨海默症转基因鼠脑内Aβ肽沉积作用。

图1-9针对APPβα段(Aβ42的1-16aa)特异抗体的设计

利用识别不溶性蛋白的APPβα特异抗体的免疫组化染色证明养血清脑颗粒具有清除小鼠脑内Aβ蛋白的显著作用。如图1-10-1-12所示，生理盐水对照组和安理申组大脑内有Aβ不溶性蛋白的沉积，可被识别不溶性蛋白的APP特异抗体所识别。养血低浓度组和养血高浓度组都少见Aβ不溶性蛋白的沉积。雄性AD模型鼠(图1-11)和雌性AD模型鼠(图1-12)在不同药物作用2个月后，海马区的Aβ蛋白的免疫染色出现显著差别。对照组与安理申组海马区能够检测到深染的不溶性Aβ老年斑，而养血低浓度组和养血高浓度组难以检测到Aβ沉积。

我们对各实验组大脑皮层β-淀粉样斑块总的数量统计分析，如表4和图1-13所示，从小鼠大脑强阳性Aβ老年斑数目来看，各实验组与生理盐水对照组比较都有显著性差别，强阳性对照安理申组老年斑个数比对照组下降了67.7％，相对于生理盐水对照组，养血低浓度组脑内老年斑减少了81.4％，养血高浓度组脑内老年斑减少了87.5％。相对于安理申组，养血清脑颗粒的治疗效果更明显，提示了高剂量养血清脑颗粒具有显著清除早中期小鼠脑内Aβ蛋白的显著作用，并优于安理申组。

图1-10各药物组转基因小鼠大脑皮层中β-淀粉样斑块数量及形态

图中箭头所指即为APP染色阳性的β-淀粉样斑块，呈深褐色。

图1-11各药物组雄性转基因小鼠海马区Aβ-淀粉样斑块数量及形态

图中箭头所指即为APP染色阳性的β-淀粉样斑块，呈深褐色。

图1-12各药物组雌性转基因小鼠海马区Aβ-淀粉样斑块数量及形态

图中箭头所指即为APP染色阳性的β-淀粉样斑块，呈深褐色。

表4 各药物组早中期AD模型小鼠脑组织中强阳性Aβ-淀粉样斑块的个数

注：与生理盐水组比较，**P<0.01

图1-13各药物组转基因小鼠脑组织中强阳性Aβ-淀粉样斑块数量

注：与生理盐水组比较，**P<0.01

4.5养血清脑颗粒具有显著促进早中期阿尔茨海默症动物模型脑内APP的生理性α切割，并促进了的可溶性神经营养性sAPPα蛋白的生成

人淀粉样蛋白前体APP是一种阿尔茨海默症发病的关键蛋白质，APP的剪切机制分为两种。正常机体APP发生生理性非淀粉样的α分泌酶阿达姆0剪切，并产生具有神经营养作用的sAPPα蛋白。而在阿尔茨海默病发生中，由β-和γ分泌酶介导，APP发生淀粉样的病理性剪切。APP发生β和γ剪切形成的淀粉样蛋白Aβ在脑内的沉积是阿尔茨海默症的主要病理特征之一和最重要的分子机制。

APP的生理性α切割的裂解产物sAPPα，不仅具有重要的神经营养作用，而且可阻碍Aβ的生成，对AD的治疗具有重要意义。首先，通过抗体识别可溶性生理sAPPα的Western blot检测证明了养血清脑颗粒具有显著促进了生理性α切割，并促进可溶性和神经营养性sAPPα蛋白的作用。APP发生α剪切产生的胞外可溶片段sAPPα,大小为66kD，如图1-14所示，AD模型鼠脑内在生理盐水条件下很少出现生理性剪切，sAPPα水平很低，与生理盐水组相比，安理申组的sAPPα有所增加。养血低浓度、特别是养血高浓度组的sAPPα增加显著。且高剂量养血显著高于阳性安理申对照组。APP正常情况下发生α分泌酶剪切途径产生胞外可溶性APP肽具有神经营养作用，同时生理性α切割产生的sAPPα与病理性β切割具有显著的拮抗作用。

α分泌酶ADAM10是执行APP生理切割的关键酶。我们检测了各药物组大脑内ADAM10的表达水平。6月龄AD转基因模型鼠在生理盐水条件下大脑内ADAM10表达水平很低，说明很少出现生理性剪切。与对照组相比，安理申组ADAM10的表达变化不显著。养血低浓度、特别是养血高浓度的ADAM10表达水平显著增高(图1-14)。

所以我们发现了养血清脑颗粒具有促进APP发生生理性α剪切的作用，养血清脑颗粒显著提高鼠脑内α分泌剪切酶ADAM10的表达水平和脑内可溶性神经营养性sAPPα蛋白的生成，通过显著提高了脑内APP的生理性α切割，拮抗了病理性剪切途径，其作用效果较阳性药物安理申更为显著。

养血清脑颗粒清除脑内老年斑的作用是通过抑制致病性γ分泌酶早老素PS1来实现的。转基因鼠是PS1第9外显子缺失突变的PSldE9基因，早老素PS1基因突变是Aβ形成和AD治病的关键环节。如图1-14所示，6月龄AD转基因模型鼠在生理盐水条件下大脑内早老素PSldE9表达水平很高，而与对照组相比，安理申组PSldE9表达变化不显著。而养血低浓度、养血高浓度的早老素PSldE9表达水平显著下降，难以被检测到。说明养血清脑颗粒通过抑制脑内致病性γ分泌酶早老素PS1的表达水平抑制APP的病理性切割，从而减少脑内Aβ老年斑的沉积。

所以，我们证明养血清脑颗粒具有显著清除早中期阿尔茨海默症动物模型脑内老年斑的作用。这种分子机制主要通过双方面来实现，如图1-15所示。一方面，养血清脑颗粒通过抑制致病性γ分泌酶早老素PS1-dE9，从而抑制APP的病理切割Aβ过程，使脑内老年斑减少。另一方面，养血清脑颗粒通过促进生理性分泌酶α分泌剪切酶ADAM10的水平，促进了神经营养性sAPPα的生成，从而促进了APP的生理性切割，拮抗了脑内Aβ的生成，使脑内老年斑进一步减少。

图1-14各药物组对转基因小鼠脑内APP的关键剪切酶和剪切产物的影响

图1-15养血清脑颗粒显著清除早中期阿尔茨海默症动物模型脑内老年斑的作用的分子机制

5小结

由上述结果，我们证明了养血清脑颗粒具有显著地治疗轻中度阿尔茨海默症的作用。体现为两个方面：

首先，行为学上Y迷宫实验结果表明，口服高浓度养血清脑颗粒(48g生药/kg)和低浓度养血清脑颗粒(16g生药/kg)一个月和二个月后，小鼠记忆、认知能力均较生理盐水对照组有明显提高，且作用效果优于阳性药物安理申。即养血清脑颗粒具有显著地改善早中期AD模型小鼠的记忆、认知能力的作用。

更重要的是针对阿尔茨海默症的特征性病变—Aβ蛋白沉积形成β-淀粉样斑块，养血清脑颗粒发挥了极其显著的治疗作用。将给药2个月的早中期阿尔茨海默症模型小鼠脑组织制成切片，应用刚果红染色和免疫组织化学染色实验均证明了口服养血的小鼠大脑海马区和皮质区β-淀粉样斑块(老年斑)从个数、覆盖面积和着色程度上都显著降低(清除率达到60-90％)，效果远远高于安理申组。同时，提取小鼠脑组织的蛋白进行Western blot分析，证明养血清脑颗粒能够促进β-淀粉样蛋白前体APP的生理性α剪切，并抑制APP病理性切割，从而降低脑内Aβ的生成，从而发挥清除脑内Aβ-淀粉样斑块的显著作用。

综上，本研究充分说明了养血清脑颗粒对轻中度阿尔茨海默症具有很好的治疗效果。

实验二、养血清脑颗粒治疗阿尔茨海默氏痴呆药效学研究

本实验采用Y迷宫、新物体辨别、Morris水迷宫及避暗等行为学实验方法，考察了养血清脑颗粒对SAMP8快速老化小鼠及喹啉酸损毁Meyert基底核(NBM核)致痴呆大鼠学习记忆障碍的改善作用；并从大脑皮层及海马神经细胞及突触的形态学、胆碱能神经系统功能、神经营养因子、自由基氧化损伤等方面探讨了其改善学习记忆障碍的可能机制。

研究发现，养血清脑颗粒在小鼠935-3740mg/kg剂量、大鼠647-2588mg/kg(1-4倍人治疗头痛等症的临床等效量)范围内能够剂量依赖性地增加痴呆模型小鼠及大鼠自发交替反应率、新物体辨别实验中优先指数及辨别系数，缩短水迷宫实验中到达安全台的时间及路程，延长水迷宫空间探索实验中在原平台所在象限的游泳时间和路程百分比，延长避暗实验中逃避潜伏期，减少电击次数。以上行为学结果表明，养血清脑颗粒能够显著改善痴呆模型动物工作记忆障碍、空间学习记忆障碍以及视觉辨别记忆能力等非空间学习记忆障碍，其高剂量组的作用与临床等效量的盐酸多奈哌齐相近；HE染色结果表明，养血清脑颗粒能改善模型小鼠及大鼠神经元的病理改变；透射电镜观察发现，养血清脑颗粒能够改善大脑海马神经元超微结构的异常及突触结构的异常；Western blot实验结果显示，养血清脑颗粒能够显著提高痴呆模型小鼠及大鼠大脑皮层及海马组织中SYP及PSD-95的表达，对大脑皮层及海马突触新生标志物GAP-43的表达未见显著影响；免疫组化实验结果表明，养血清脑颗粒能够剂量依赖性地提高SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织中BDNF、NGF及其受体TrkA的表达；生化检测结果表明，养血清脑颗粒能够剂量依赖性地提高总抗氧化能力及SOD、GSH-px活性，增加GSH含量，减少脂质过氧化产物MDA含量。显著提高喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层及海马组织中乙酰胆碱的含量，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮层M1胆碱受体的表达。

综上所述，养血清脑颗粒可能通过改善神经营养因子表达，对抗自由基损伤、抑制脂质过氧化反应等，保护神经元及突触结构，提高脑内Ach、ChAT，改善中枢胆碱能神经系统功能，进而改善学习记忆障碍。

第一部分：养血清脑颗粒对SAMP8小鼠学习记忆障碍的改善作用及机制探讨

摘要：本实验采用Y迷宫、新物体辨别、Morris水迷宫及避暗等行为学实验方法，考察了养血清脑颗粒对SAMP8快速老化小鼠学习记忆障碍的改善作用；用HE染色方法观察小鼠大脑海马组织结构的改变；采用透射电镜观察海马神经细胞和突触超微结构的变化；用免疫组化方法考察养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)及其受体TrkA表达的影响；用免疫印迹(Western blot)方法考察养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织中突触生长相关蛋白43(GAP-43)、突触素(SYP)及突触后致密物95(PSD-95)表达的影响；用生化方法检测大脑皮层组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量、总抗氧化的能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性。

研究发现，养血清脑颗粒在935-3740mg/kg剂量(1-4倍人治疗头痛等症的临床等效量)范围内能够剂量依赖性地增加SAMP8小鼠自发交替反应率、新物体辨别实验中优先指数及辨别系数，缩短SAMP8小鼠水迷宫实验中到达安全台的时间及路程，延长水迷宫空间探索实验中在原平台所在象限的游泳时间和路程百分比，延长避暗实验中逃避潜伏期，减少电击次数。以上行为学结果表明，养血清脑颗粒能够显著改善SAMP8小鼠工作记忆障碍、空间学习记忆障碍以及视觉辨别记忆能力等非空间学习记忆障碍，其高剂量组的作用与临床等效量的盐酸多奈哌齐相近；HE染色结果表明，养血清脑颗粒能改善SAMP8小鼠神经元的病理改变；透射电镜观察发现，养血清脑颗粒能够改善大脑海马神经元超微结构的异常及突触结构的异常；免疫组化实验结果表明，养血清脑颗粒能够剂量依赖性地提高SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织中BDNF、NGF及其受体TrkA的表达；Western blot实验结果显示，养血清脑颗粒3740mg/kg组能够显著提高SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织中SYP及PSD-95的表达，对大脑皮层及海马突触新生标志物GAP-43的表达未见显著影响；生化检测结果表明，养血清脑颗粒能够剂量依赖性地提高总抗氧化能力及SOD、GSH-px活性，增加GSH含量，减少脂质过氧化产物MDA含量。

综上所述，养血清脑颗粒可能通过改善神经营养因子表达，对抗自由基损伤、抑制脂质过氧化反应等，保护神经元及突触结构，进而改善学习记忆障碍。

一.实验材料

1.实验动物

7月龄雄性SAMP8小鼠，150只，同龄空白对照鼠SAMR1小鼠25只，清洁级，由天津中医药大学第一附属医院动物中心提供，合格证号：scxk(津)2008-0001，饲养于沈阳药科大学SPF级实验动物中心，自由饮水摄食，12h循环光照。

2.药物及配制

养血清脑颗粒：浸膏状，由天津天士力制药集团股份有限公司提供，批号20120502W，4℃-8℃保存。人的日服生药量为45g，每一克浸膏相当于6.26g药材，换算成小鼠的临床等效量为935m g(浸膏)/kg。配制：精密称取养血清脑颗粒浸膏，加入蒸馏水，分别配成93.5mg/ml，187mg/ml及374mg/ml的溶液，为养血清脑颗粒的低、中、高剂量组药物浓度。

盐酸多奈哌齐片：卫材(中国)药业有限公司，批号110707A，保存，30℃以下室温环境贮存。临床推荐最大剂量为10mg/d/人，换算成小鼠的临床等效量约为1.3mg/kg。配制：取盐酸多奈哌齐片，加入蒸馏水，配成0.13mg/ml的溶液。

3.试剂

氯化钠：天津博迪化工股份有限公司，批号20120221；

磷酸氢二钠：汕头市西陇化工厂有限公司，批号100802；

无水乙醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20100327；

多聚甲醛：天津市博迪化工股份有限公司，批号20111028；

戊二醛：天津市博迪化工股份有限公司，批号20110906；

二甲苯：天津市博迪化工有限公司，批号：20100505；

柠檬酸：天津市博迪化工有限公司，批号：20100321；

柠檬酸钠：天津市博迪化工有限公司，批号：20100719；

氢氧化钠：天津市博迪化工有限公司，批号：20111102；

盐酸：沈阳经济技术开发区试剂厂，批号：20110612；

中性树胶：中国上海标本模型厂，批号：20101201；

甲醇：天津市富宇精细化工有限公司，批号：120306；

BCA蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术研究所；

细胞裂解液：碧云天生物技术研究所；

PMSF：碧云天生物技术研究所；

PVDF膜：美国Pall公司；

显影粉、定影粉：碧云天生物技术研究所；

鼠抗SYP(D-4)：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-17750；

鼠抗GAP-43：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-17790

兔抗PSD-95：Abcam(Hong Kong)Ltd LOT:GR76077-1

鼠抗β-actin：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-41478；

兔抗BDNF:北京中杉金桥生物技术有限公司,LOT:E0112

兔抗NGF-β：Boster Biological Technology CO.,Ltd LOT NO:3574102

兔抗TrkA：Boster Biological Technology CO.,Ltd LOT NO:9H121C

SP免疫组化染色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；

ZLI-9018浓缩型DAB试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；

Tris-base：BIOSHARP Amresco 0497；

Glycine：BIOSHARP Amresco 0617；

SDS：BIOSHARP Sigma L-5750LOT 2012/09；

Acrylamide：BIOSHARP Amresco 0341LOT 2011/11；

亚甲双丙烯酰胺：BIOSHARP Amresco；

辣根酶标记山羊抗小鼠IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司；

脱脂奶粉：黑龙江省完达山乳业股份有限公司；

高灵敏度化学发光检测试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；

显影定影试剂盒：碧云天生物技术研究所；

T-AOC总抗氧化能力试剂盒南京建成生物工程研究所批号：20121220

SOD试剂盒南京建成生物工程研究所批号：20121217

GSH-px测试盒南京建成生物工程研究所批号：20121220

微量丙二醛测试盒南京建成生物工程研究所批号：20121212

GSH测试盒南京建成生物工程研究所批号：20121212

4.实验仪器

Morris水迷宫视频分析系统：中国医学科学研究院药物研究所；

自发活动视频分析系统：上海吉量软件科技有限公司；

其他行为学实验装置：小鼠Y迷宫、新物体辨别、避暗装置均为沈阳药科大学研制；

石蜡包埋切片机：德国莱卡公司；

光学显微镜：OLYMPUS公司；

DP72-Color Video Camera：OLYMPUS公司；

U-PMTVC 7C06559：OLYMPUS公司；

Image-pro6.3图像分析系统：OLYMPUS公司；

超声波清洗器：KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司；

超声波细胞粉碎机：JY92-Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司；

TECAN酶标定量测试仪：SPECTRA CLASSIC；

-80℃低温冰箱：中科美菱；

万分之一天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

电子天平：常州市双杰测试仪器厂；

恒温水浴装置：BCFCO长风电子科技有限公司；

H-1微型漩涡混合器：上海精科实业有限公司；

电热恒温培养箱：DNP-9272，上海精密实验设备有限公司；

立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40AI，上海申安医疗器械厂；

高速冷冻离心机：HC-3018R，科大创新股份有限公司；

微波炉：格兰仕公司；

二、实验方法

1.动物分组及给药

将SAMP8小鼠随机分为模型组、养血清脑颗粒935mg/kg(人临床等效量)、1870mg/kg(2倍临床等效量)、3740mg/kg(4倍临床等效量)剂量组及盐酸多奈哌齐1.3mg/kg组，每组30只，另设SAMR1空白对照组25只。各组小鼠灌胃给药2个月后开始进行Y迷宫及新物体辨别实验，给药2个半月后进行Morris水迷宫及避暗实验。进行行为学实验时继续给药，每天一次，直至实验结束。

2.行为学实验

2.1小鼠自发活动实验

实验装置为四个长方形活动箱，内置红外线探头及摄像头，自发活动视频分析系统由上海吉量软件科技有限公司提供。实验时，将动物分别面壁放入四个活动箱中，每箱一只。设置采集时间5分钟，记录动物活动总路程、活动时间以及平均速度等指标。

2.2小鼠Y迷宫实验

装置由三个成120°夹角的等长木制支臂组成，即迷宫的A、B、C三臂。每臂长40cm，高12cm，上宽10cm，下宽5cm。实验时将小鼠放入A臂末端，让其自由出入三个臂，记录5min内每只小鼠进入三个臂的顺序及总次数(number ofarm entries)，以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应(successivealternation)，记录正确交替反应次数(number of alternation)。用自发交替反应率(alternation behavior；％)反映空间工作记忆能力。Alternation behavior(％)＝number of alternation/(N-2)×100(例如动物5min内进入三个臂的顺序依次为ABCACBACCAB，则N为11，successive alternation为：ABC、BCA、ACB、CBA、BAC、CAB。Alternation behavior(％)＝[6/(11-2)]×100＝66.7％)

2.3小鼠新物体辨别实验

实验装置为一木制的正方形开放场，实验分为适应阶段和测试阶段。将2-3只小鼠放入开放场中自由探索3min以适应环境，每天两次，进行2天。测试当天，先将动物放入实验场中自由探索3min以再次适应环境后，取出动物，将动物未曾见过的两个完全相同的物体(A1、A2)置于装置内距边缘等距离的位置上，将小鼠置于距两物体相等的位置，记录5min内探索两物体的时间(tA1、tA2)，之后，将小鼠取出放回鼠笼1h后，将装置中一个物体换成一个在颜色、形状及材质方面均不相同的新物体(B)，将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间(tA1、tB)，将小鼠取出放回鼠笼。24h后，将物体B换成一个新物体(C)，将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间(tA1、tC)。计算各组对新物体的优先指数及辨别系数，计算公式如下：

优先指数计算公式如下：

Preferential index(1h)＝tB/(tA1+tB)

Preferential index(24h)＝tC/(tA1+tC)

辨别系数计算公式如下：

Discrimination index(1h)＝(tB-tA1)/(tA1+tB)

Discrimination index(24h)＝(tC-tA1)/(tA1+tC)

2.4小鼠Morris水迷宫实验

(1)定位航行实验：每天上下午各进行1次Morris水迷宫训练，连续5天。平台置于第四象限中点，在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，采集60s，记录小鼠从入水至找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)及游泳路程，然后，让小鼠在平台上休息10s。如果60s未找到平台，潜伏期记为60s，并将小鼠置于平台上休息10s。每天在2个入水点各进行1次，以两次潜伏期的算术均值作为这1天的成绩进行统计分析。

(2)空间探索实验：定位航行实验后，撤除平台，将小鼠放入原平台对侧象限中点的水中，自由游泳60s。迷宫系统自动记录小鼠在原平台象限停留的时间及平台象限路程百分比等参数。

2.5小鼠避暗实验

实验装置分明、暗两室。两室大小均为15cm×10cm×11cm，两室之间有一直径为3cm大小的半圆形门。两室底部均铺以铜栅，暗室底部由第四根铜栅起可以通电，电压强度由一稳压器控制。此法系利用鼠类的嗜暗习性，将小鼠面部背向门口放入明室，适应环境3min，然后通以30V电压。小鼠进入暗室立即遭到电击，然后从门口逃回明室，如此训练5min，并记录小鼠受到电击的次数即错误次数，以此作为学习成绩。24h后测验，记录第一次进入暗室的潜伏期、5min内的错误次数，以此作为记忆成绩。

3.Western blotting方法

3.1组织蛋白质的提取

小鼠大脑皮层及海马组织样本放于-80℃冰箱储存备用。按1：10比例加入蛋白裂解液，每1ml蛋白裂解液加5μlPMSF。用超声细胞粉碎机匀浆后，冰浴中静置30min，12000×g，4℃离心20min，取上清液，分装，于-80℃冰箱储存备用。取少部分上清液用于蛋白定量。

3.2蛋白浓度的测定-BCA法

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制BCA工作液，充分混匀。①蛋白标准品为5mg/ml BSA，完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/ml，用PBS稀释标准品。②将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液(PBS)补足到20μl，每个浓度重复三次。③上述蛋白提取液用PBS稀释10倍后，将20μl蛋白稀释液加到96孔板的样品孔中，每个样品重复三次。④各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。⑤用酶标仪测定样品在波长540nm处的吸光度。⑥根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

3.3蛋白印迹分析

①SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制：组装制胶玻璃板。配制分离胶液，充分混匀后，立即注入制胶玻璃板间隙，灌注至离玻璃板顶端3cm左右，用去离子水封胶，室温大约聚合30～60min分离胶凝固，倒掉去离子水，尽可能吸干分离胶表面的水。配制5％浓缩胶液，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，插入梳子，避免混入气泡，放置，室温下聚合约60min。浓缩胶聚合后，拔除梳子，用去离子水冲洗梳孔，直接电泳或放入4℃冰箱备用。

②电泳：将样品中的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳分离。根据BCA法蛋白定量的结果，上样前调整样品的蛋白浓度使其一致，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热5min，使蛋白充分变性。将凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，每孔分别加入30μg总蛋白。电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，增加到180V，染料抵达分离胶底部时断电。

③转膜：在转膜缓冲液中将蛋白质转移至PVDF膜上。活化PVDF膜，将剪好的膜依次序浸入100％甲醇(10s)→去离子水(5min)→转移缓冲液(大于10min)，同时滤纸和海绵垫浸入转移缓冲液中(大于10min)。将结束电泳的浓缩胶除去。安装转膜装置，从正极(红色)→负极(黑色)依次为白色边盒→多孔垫片→(2张)滤纸→PVDF膜→凝胶→(2张)滤纸→多孔垫片→黑色边盒，扣上吊扣放进转膜槽中。转膜槽内两侧加冰盒，防止转膜时过热。接通电流(凝胶一边接负极，PVDF膜一边接正极)，恒流电转移2h，电流为100mA。转膜结束后，关闭电源，将膜取出。

④封闭和免疫反应：将膜放入封闭液中(用PBS缓冲液配置5％脱脂奶粉)，室温轻摇2h，用封闭液配制一抗(SYP、GAP-43、PSD-95、β-actin)，放入冰箱4℃过夜。用PBS室温洗膜三次，Tris-Nacl室温洗膜一次，每次10min。加上用封闭液配制辣根过氧化酶标记的二抗(1：3000)，室温孵育2h。用Tris-Nacl室温洗膜三次，每次10min。

⑤显影：用ECL超敏发光液显示免疫反应得到的条带。显影后用一抗二抗去除液进行膜再生，重新封闭，加一抗、二抗，显影。

⑥图像扫描及定量分析：对X胶片进行灰度扫描，用Quantity One 4.6.2图像分析软件进行分析，对样品中目标蛋白进行定量。以β-actin作为内参来确定组间目标蛋白表达的差异和变化。

①生化指标检测

各组小鼠于末次给药2h后断头处死，快速剥离大脑皮层组织，用预冷生理盐水冲洗，除去血迹，滤纸拭干，称重后，将脑组织迅速浸入冷生理盐水中(盐水质量为脑组织质量的9倍)，在超声波细胞粉碎机中制成10％的脑匀浆，以3000-4000r/min离心20min，取上清液，按照试剂盒说明进行生化检测。

②病理组织学观察

5.1取材

小鼠行为学实验结束后，腹腔注射3.5％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，仰位固定于手术台上，开胸暴露心脏。将灌流穿刺针从心尖部位插入左心室，同时右心耳剪一小口，先用约200-300ml生理盐水灌流，待右心耳流出的液体变得无色澄清，剪尾无血时，换用300-400ml 4℃4％多聚甲醛缓冲液(0.1mol/L)灌流，直至躯体僵硬。断头取出整脑，置于4℃4％的多聚甲醛中固定。24h后，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度5μm，用于常规HE染色及免疫组织化学染色。每组另取4只小鼠，4％多聚甲醛与2.5％戊二醛1:1混合液心脏灌流后，取1mm³海马CA1区组织，2.5％戊二醛固定，供透射电镜观察神经细胞超微结构。

5.2免疫组织化学染色

用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)连接法进行免疫组化免疫组化检测。原理：使用SP免疫组化染色试剂盒，用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化酶及基质色素混合液测定组织中的抗原。具体实验步骤如下：组织切片脱蜡至水；微波抗原修复：切片置于盛有抗原修复液的容器中，抗原修复液为枸橼酸盐缓冲液(0.01M，pH 6.0)，置微波炉中高火加热至沸腾，自然冷却后，蒸馏水洗涤3min×3；3％H₂O₂37℃孵育20min。PBS洗3min×3；滴加山羊血清封闭液37℃封闭30min，吸去多余血清，滴加一抗(BDNF、NGF、TrkA)4℃孵育过夜，阴性对照以0.01M PBS缓冲液代替一抗；PBS洗5min×3；滴加生物素化二抗工作液(羊抗兔IgG-HRP)，37℃孵育15min，PBS洗5min×3；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS洗5min×3；DAB显色，显微镜下观察染色强度以控制反应时间，见切片中出现棕黄色显色，立即自来水冲洗，终止染色；苏木素复染3min；自来水洗；盐酸酒精分化数秒，自来水充分水洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用光学显微镜观察每个视野中阳性蛋白表达，用计算机图像分析系统分别测定各组小鼠每张切片内表达阳性蛋白神经元的整合光密度值(intergrated opticaldensity,IOD)，以反应神经元内阳性蛋白表达的相对含量。

5.3HE染色

将石蜡切片进行常规HE染色，程序如下：石蜡切片常规脱蜡至水；蒸馏水洗2min，苏木素染色3min，水洗5min，1％盐酸酒精分化30s，自来水返蓝8min，伊红染色1min，自来水水洗3min；梯度酒精脱水，二甲苯透明2×5min，中性树胶封片。光学显微镜下观察组织病理学变化。

6.统计学方法

实验数据以均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件进行相关统计学分析。组间差异用单因素或双因素方差分析(Morris水迷宫实验)和Dunnett’s t-test进行比较。P<0.05则认为差异存在显著性差别。

三.实验结果

1养血清脑颗粒对SAMP8小鼠学习记忆障碍的改善作用

1.1自发活动实验

实验结果显示，在自发活动实验中，各组小鼠的活动总路程、活动总时间以及平均速度未见显著差异，提示养血清脑颗粒不会通过影响中枢神经系统兴奋性而干扰后续的行为学实验(见表2-1、图2-1-1)。

图2-1-1.SAMP8小鼠自发活动轨迹图。A：空白对照组，B：模型组，C：盐酸多奈哌齐组，D：养血清脑颗粒935mg/kg，E：养血清脑颗粒1870mg/kg，F:养血清脑颗粒3740mg/kg

表2-1养血清脑颗粒对SAMP8小鼠自发活动的影响(n＝18-26，mean±SD)

1.2Y迷宫实验

实验结果表明：各组小鼠进入Y迷宫三个臂的总次数之间未见显著性差异(见图2-1-2、表2-2)，提示养血清脑颗粒未对小鼠自发活动产生明显影响。与空白对照组相比，模型组小鼠Y迷宫自发交替反应率显著下降；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加了小鼠Y迷宫自发交替反应率(见图2-1-3)，提示养血清脑颗粒可改善小鼠工作记忆障碍。

图2-1-2养血清脑颗粒对SAMP8小鼠Y迷宫进臂总次数的影响(n＝23-28，mean±SD)

图2-1-3养血清脑颗粒对SAMP8小鼠Y迷宫自发交替反应率的影响(n＝23-28,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001。

表2-2养血清脑颗粒对SAMP8小鼠Y迷宫进臂总次数及自发交替反应率的影响(n＝23-28,mean±SD)。

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001。

1.3新物体辨别实验

实验结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠1h及24h测试阶段对新物体的优先指数和辨别系数显著降低；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加了模型小鼠1h及24h测试阶段对新物体的优先指数和辨别系数(见图2-1-4、图2-1-5、表2-3、表2-4)。

图2-1-4养血清脑颗粒对SAMP8小鼠新物体辨别1h优先指数的影响(n＝22-28，mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

图2-1-5养血清脑颗粒对SAMP8小鼠新物体辨别24h优先指数的影响(n＝22-28，mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比***p<0.001或**p<0.01。

表2-3养血清脑颗粒对SAMP8小鼠新物体辨别1h及24h优先指数的影响(n＝22-28，mean±SD)。

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。

表2-4养血清脑颗粒对SAMP8小鼠新物体辨别系数的影响(n＝22-28,mean±SD)

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001，^**p<0.01

1.4Morris水迷宫实验

1.4.1定向航行实验

实验结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠在水迷宫实验中到达平台的游泳时间及路程显著延长；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地缩短了小鼠到达平台的游泳时间及路程(见图2-1-6、图2-1-7、表2-5、表2-6、)。

图2-1-6养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(n＝18-26,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05；图2-1-7养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫游泳路程的影响(n＝18-26,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01。

表2-5养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(n＝18-26,mean±SD)。

注A:空白对照组 B:模型组 C:盐酸多奈哌齐组 D:养血清脑颗粒组

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。

表2-6养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫游泳路程的影响(n＝18-26,mean±SD)

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001，^**p<0.01。

1.4.2空间探索实验

实验结果表明，与空白对照组相比，模型组小鼠在原平台所在象限(第四象限)的游泳时间和第四象限路程百分比显著下降；与模型组相比，养血清脑颗粒3740、1870mg/kg剂量组可显著延长小鼠第四游泳时间和第四象限路程百分比(见图2-1-9，图2-1-10，表2-7)，各组小鼠空间探索实验轨迹图(见图2-1-8)。

图2-1-8养血清脑颗粒对SAMP8小鼠空间探索实验游泳轨迹的影响

图2-1-9养血清脑颗粒对SAMP8小鼠空间探索实验目标象限游泳时间的影响(n＝18-26,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

图2-1-10养血清脑颗粒对SAMP8小鼠空间探索实验目标象限路程百分比的影响(n＝18-26，mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01。

表2-7养血清脑颗粒对SAMP8小鼠空间探索实验目标象限游泳时间及目标象限路程百分比的影响(n＝18-26，mean±SD)。

1.5避暗实验结果

实验结果表明，与空白对照组相比，模型组测试阶段潜伏期显著缩短，错误次数显著增加；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地延长了潜伏期，并减少了错误次数。见表3。

表2-8养血清脑颗粒对SAMP8小鼠长期记忆的影响(n＝18-25,mean±SD)

与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或*p<0.05。

2HE染色观察海马神经细胞病理变化

HE染色结果可见，空白对照组小鼠海马CA1区神经元细胞结构清楚，排列紧密。模型组小鼠神经元排列疏松、染色质减少。养血清脑颗粒1870mg/kg组、3740mg/kg组及盐酸多奈哌齐组小鼠神经元排列紧密，未见水肿及核固缩(见图2-1-11)。

图2-1-11养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马神经细胞病理变化的影响(×40)

3电镜观察海马CA1区神经元及突触超微结构变化

3.1电镜观察神经元胞体超微结构

电镜观察可见，空白对照组神经元细胞轮廓清晰，核呈椭圆形，核内染色质分布较均匀，核膜、核仁清楚，胞质内有丰富的核糖体、粗面内质网、线粒体及溶酶体等细胞器，超微结构正常；模型组神经元细胞核形不规则，有切迹，见核仁，核膜部分模糊，核内异染色质有边集，胞质内粗面内质网及高尔基复合体轻度扩张，线粒体外膜部分破损；多奈哌齐组神经元细胞核膜清楚，核内染色质分布均匀，胞质内有丰富的核糖体、线粒体、粗面内质网、高尔基复合体及溶酶体等；养血清脑颗粒3740mg/kg组神经元细胞核呈椭圆形，核膜轮廓清楚，核仁清晰，核内染色质分布均匀，胞质内有丰富的核糖体、粗面内质网、线粒体、高尔基复合体及溶酶体等细胞器，但粗面内质网有水肿，个别线粒体外膜破损；养血清脑颗粒1870mg/kg组神经元细胞轮廓清楚，核内有部分异染色质凝聚，胞质内有丰富的核糖体及线粒体，粗面内质网部分轻度扩张；养血清脑颗粒935mg/kg组神经元细胞核膜模糊，核内异染色质有部分边集，胞质内有核糖体、粗面内质网、线粒体、溶酶体及高尔基复合体等细胞器，部分线粒体嵴减少或外膜破损，粗面内质网扩张(见图2-1-12)。

图2-1-12养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区神经元超微结构的影响(n＝4，×6000)

3.2电镜观察海马CA1区神经元突触超微结构

空白对照组可见多个突触，结构正常，可见清晰的突触前膜、突触间隙及突触后膜，前膜可见较多的突触小泡；模型组多个突触前后膜融合，间隙消失，部分后膜增厚，少量可见突触间隙；多奈哌齐组突触近乎正常，可见清晰的突触前后膜，前膜内有较多的突触小泡；养血清脑颗粒3740mg/kg组突触近乎正常，可见清晰的前后膜，前膜内有较多的突触小泡，个别前后膜有部分融合；养血清脑颗粒1870mg/kg组可见多数突触后膜致密物较厚，突触间隙宽窄不一，有的已融合；养血清脑颗粒935mg/kg组部分突触前后膜融合或突触间隙变窄(见图2-1-13)。

图2-1-13养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区突触超微结构的影响(n＝4，×10000)

4神经营养相关蛋白表达

4.1养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层及海马BDNF表达的影响

BDNF能促进多种神经元的存活和生长发育，可提高神经元的生物活性，增加突触终末的密度和促进树突和轴突的生长^[1]。BDNF免疫组化阳性结果为神经元胞浆内出现棕黄色颗粒。结果显示，空白对照组小鼠在海马CA1区和皮层神经元胞浆着色较深；模型组小鼠神经元胞浆着色显著变浅，多奈哌齐组、养血清脑颗粒1870mg/kg组及3740mg/kg组神经元着色较模型组显著加深(见图2-1-14-图2-1-18、表2-9)。

图2-1-14养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马组织中脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(×4)。

图2-1-15养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(×40)。

图2-1-16养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(n＝6,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001，**p<0.01或*p<0.05。

养血清脑颗粒935mg/kg组养血清脑颗粒1870mg/kg组养血清脑颗粒3740mg/kg组

图2-1-17养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(×40)

图2-1-18养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(n＝6,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，**p<0.01或*p<0.05。

表2-9养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区及大脑皮层脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响(n＝6,mean±SD)。

4.2养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层及海马NGF表达的影响

神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是一种经典的神经生长因子家族的神经营养因子，具有神经元营养和促进神经元突起生长双重生物学功能^[2]。NGF免疫组化阳性结果为神经元胞浆内出现棕黄色颗粒。结果显示，空白对照组小鼠在大脑海马CA1区及皮质神经元胞浆着色较深；模型组小鼠神经元胞浆中着色显著变浅，多奈哌齐组、养血清脑颗粒1870mg/kg组、3740mg/kg组神经元着色较模型组显著加深(见图2-1-19-图2-1-23，表2-10)。

图2-1-19养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马神经生长因子(NGF)表达的影响(×4)

图2-1-20养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区神经生长因子(NGF)表达的影响(×40)

图2-1-21养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区神经生长因子(NGF)表达的影响(n＝6,mean±SD)与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

图2-1-22养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层神经生长因子(NGF)表达的影响(×40)

图2-1-23养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层神经生长因子(NGF)表达的影响(n＝6,mean±SD)。与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01。表2-10养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区及大脑皮层神经生长因子(NGF)表达的影响(n＝6,mean±SD)

与空白对照组相比，^##p<0.01，^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001，^**p<0.01，^*p<0.05。

4.3养血清脑颗粒对SAMP8小鼠脑内TrkA受体表达的影响

TrkA是一种分子量为140kD的跨膜蛋白质。当NGF与TrkA结合后，诱导细胞的增殖、分化和存活，抑制凋亡，增加神经元的兴奋性并诱导表达TrkA的细胞释放介质^[2]。TrkA受体免疫组化阳性结果为神经元胞浆内出现棕黄色颗粒。结果显示，空白对照组小鼠在海马CA1区及大脑皮质神经元胞浆着色较深；模型组小鼠神经元胞浆中着色显著变浅，多奈哌齐组、养血清脑颗粒1870mg/kg组、3740mg/kg组神经元着色较模型组显著加深(见图2-1-24、2-1-28、表2-11)。

图2-1-24养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区TrkA表达的影响(×4)

图2-1-25养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区TrkA表达的影响(×40)

图2-1-26养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区TrkA表达的影响(n＝6,mean±SD)与空白对照组相比,^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

图2-1-27养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层TrkA表达的影响(×40)

图2-1-28养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层TrkA表达的影响(n＝6,mean±SD)与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01。表2-11养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区及大脑皮层TrkA表达的影响(n＝6,mean±SD)

与空白对照组相比,^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001或^**p<0.01或^*p<0.05。

5养血清脑颗粒对SAMP8小鼠抗氧化能力的影响

实验结果如表2-12所示，与空白对照组相比，模型组小鼠大脑皮层脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量显著增多，还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著减少，总抗氧化能力(T-AOC)显著降低，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性显著降低，与模型组相比，养血清脑颗粒能够剂量依赖性地增加T-AOC能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，减少MDA含量。

表2-12养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层抗氧化能力的影响(n＝7-8，mean±SD)

与空白对照组相比，^###p<0.001,^##p<0.01或^#p<0.05；与模型组相比，^***p<0.001,^**p<0.01或^*p<0.05

6养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层及海马突触新生蛋白、突触素及突触后致密物表达的影响

突触体素，又称突触素(synaptophysin，SYP)是一种与突触结构和功能密切相关的囊泡吸附蛋白，通过其磷酸化与去磷酸化作用调节神经递质释放、参与突触发育，从而在突触可塑性中发挥作用，是学习记忆过程中的重要分子。突触素因其特异性定位于轴突终末的突触囊泡膜上，故可用于标记突触结构，反应轴突终末结构的分布^[3]。突触后致密物^[4](postsynaptic density,PSD)是指位于突触后膜胞浆面电子密度较大的半圆形带状区域，是突触部位非常敏感易变的结构，是神经元与神经元之间进行信息传递的结构基础，在突触的可塑性中发挥了重要作用，PSD-95又称SAP90，是最先被鉴定出的PSD中含量丰富的骨架蛋白，属于膜相关鸟苷酸激酶蛋白超家族的成员。GAP-43(Growth associated protein-43)是一个轴突膜蛋白，是一种神经特异性的蛋白质，参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生^[5]。Western blot结果表明，与空白对照组相比，模型组动物海马及大脑皮层组织突触素(SYP)及突触后致密物(PSD-95)的表达显著减少；而与模型组相比，多奈哌齐组、养血清脑颗粒3740mg/kg组海马及大脑皮层组织SYP及PSD-95的表达显著增加，各组之间GAP-43的表达均未见显著差异(见图2-1-29～34、表2-13、2-14)。

图2-1-29养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马突触素(SYP)表达的影响(n＝3，mean±SD)。与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，*p<0.05。

图2-1-30养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3，mean±SD)。

图2-1-31养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，mean±SD),与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01。

图2-1-32养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层突触素(SYP)表达的影响(n＝3，mean±SD)。与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01

图2-1-33养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3，mean±SD)。

图2-1-34养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或*p<0.05。

表2-13养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马突触素(SYP)、突触生长相关蛋白(GAP-43)及突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，mean±SD)

与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，^**p<0.01，^*p<0.05。

表2-14养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层组织突触素(SYP)、突触生长相关蛋白(GAP-43)及突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，mean±SD)

与空白对照组相比，^##p<0.01或^###p<0.001；与模型组相比，^***p<0.001，^**p<0.01，*p<0.05。

四小结

1)Y迷宫、新物体辨别、Morris水迷宫及避暗等行为学实验结果显示，养血清脑颗粒在935-3740mg/kg(临床治疗头痛等症的1-4倍等效量)剂量范围内能够剂量依赖性地改善SAMP8小鼠工作记忆障碍、空间学习记忆障碍以及视觉辨别能力等非空间学习记忆障碍，其高剂量组的作用与盐酸多奈哌齐相近。

2)养血清脑颗粒能够提高SAMP8小鼠大脑皮层及海马组织中脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)及其受体TrkA的表达，改善海马神经元超微结构的异常。

3)养血清脑颗粒能够剂量依赖性地增加SAMP8小鼠大脑皮层总抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，减少MDA含量。

4)养血清脑颗粒能够提高SAMP8小鼠大脑皮层及海马突触素及突触后致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。

第二部分养血清脑颗粒对喹啉酸毁损基底前脑Meyert基底核致痴呆大鼠学习记忆障碍的改善作用及机制研究

摘要：本实验采用Y迷宫、新物体辨别、Morris水迷宫及避暗等行为学实验方法，考察了养血清脑颗粒对喹啉酸损毁Meyert基底核(NBM核)致痴呆大鼠学习记忆障碍的改善作用；用HE染色方法观察大鼠海马组织结构的改变；采用透射电镜观察大鼠海马神经细胞及突触超微结构的变化；用免疫印迹(Western blot)方法考察养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马及大脑皮层突触素(SYP)、突触生长相关蛋白43(GAP-43)、突触后致密物95(PSD-95)及海马毒蕈碱型乙酰胆碱受体(CHRM1)表达的影响；用酶联免疫(ELISA)方法考察对海马及大脑皮层乙酰胆碱(Ach)含量，海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量及活性以及大脑皮层CHRM1含量的影响。

实验结果表明，养血清脑颗粒在647-2588mg/kg剂量范围内能够剂量依赖性地增加喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠自发交替反应率，增加新物体辨别实验中对新物体的优先指数及辨别系数，缩短水迷宫实验中痴呆模型大鼠到达安全台的时间及路程，延长空间探索实验中痴呆模型大鼠在原平台所在象限的游泳时间和路程百分比，减少避暗实验被电击次数。以上行为学结果表明，养血清脑颗粒能够显著改善喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠工作记忆障碍、空间学习记忆障碍以及视觉辨别能力等非空间学习记忆障碍，其高剂量组的作用与盐酸多奈哌齐相近。养血清脑颗粒能够改善海马神经元超微结构的异常及突触结构的异常；改善痴呆模型大鼠神经元的病理改变；剂量依赖性地提高海马及大脑皮层SYP、PSD-95的表达，而对大脑皮层及海马GAP-43表达未见显著影响。提高大脑皮层及海马Ach的含量及海马ChAT的含量，但对海马ChAT活性及CHRM1的表达未见显著影响。综上所述，养血清脑颗粒可能通过提高脑内SYP、PSD-95的表达，改善突触结构的异常，提高脑内Ach及其合成酶ChAT含量，改善中枢胆碱能神经系统功能，进而改善喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠学习记忆障碍。

一、实验材料

1、实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，120只，雌雄各半，体重180-220g，购于辽宁长生生物技术有限公司合格证号：scxk2010-0001；饲养于沈阳药科大学SPF级实验动物中心，自由饮水进食，12h循环光照。

2、药物及配制

养血清脑颗粒：浸膏状，由天津天士力制药集团股份有限公司提供，批号20120502W，4℃-8℃保存。人的日服生药量为45g，每1g浸膏相当于6.26g药材，换算成大鼠的临床等效量为647mg(浸膏)/kg。配制：精密称取养血清脑颗粒浸膏，加入蒸馏水，分别配成64.7mg/ml，129.4mg/ml及258.8mg/ml的溶液。

盐酸多奈哌齐片：卫材(中国)药业有限公司，批号110707A，保存，30℃以下室温环境贮存。临床推荐最大剂量为10mg/d/人，换算成大鼠的临床等效量约为0.95mg/kg。配制：取盐酸多奈哌齐片，加入蒸馏水，配成0.095mg/ml的溶液。

3、实验试剂

喹啉酸：SIGMA公司，批号：STBB0947V；

水合氯醛：天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20101124；

火棉胶：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20110421；

氯化钠：天津博迪化工股份有限公司，批号：20130221；

磷酸氢二钠：汕头市西陇化工厂有限公司，批号：110802；

磷酸二氢钠：汕头市西陇化工厂有限公司，批号：110223；

无水乙醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20130327；

多聚甲醛：天津市博迪化工股份有限公司，批号：20121028；

戊二醛：天津市博迪化工股份有限公司，批号：20110906；

二甲苯：天津市博迪化工有限公司，批号：20121205；

柠檬酸：天津市博迪化工有限公司，批号：20100321；

柠檬酸钠：天津市博迪化工有限公司，批号：20100719；

盐酸：沈阳经济技术开发区试剂厂，批号：20120304；

苏木色精：国药集团化学试剂有限公司，批号：20081215；

中性树胶：中国上海标本模型厂，批号：20101201；

切片石蜡：上海华灵康复器械厂，批号：20120206；

多聚赖氨酸：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：050M4339；

甲醇：天津市富宇精细化工有限公司，批号：20130306；

BCA蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术研究所；

细胞裂解液：碧云天生物技术研究所；

PMSF：碧云天生物技术研究所；

PVDF膜：美国Pall公司，LOT：K1BA3015GK；

显影粉、定影粉：碧云天生物技术研究所，产品编号：P0019-4；

鼠抗SYP(D-4)：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-17750；

鼠抗β-actin：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-41478；

鼠抗GAP-43：Santa Cruz Biotechnology，产品编号：sc-17790；

兔抗PSD-95：Abcam(Hong Kong)Ltd LOT:GR76077-1；

兔抗CHRM1：博士德生物科技有限公司，产品编号：BA1544；

大鼠乙酰胆碱酶联免疫分析试剂盒：上海活乐生物科技有限公司，LOT：201301，4-8℃保存；

大鼠胆碱乙酰转移酶含量酶联免疫分析试剂盒：上海活乐生物科技有限公司，LOT：201303，4-8℃保存；

大鼠胆碱乙酰转移酶活性酶联免疫分析试剂盒：上海活乐生物科技有限公司，LOT：201301，4-8℃保存；

大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱M1酶联免疫分析试剂盒：上海活乐生物科技有限公司，LOT：201304，4-8℃保存；

BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所；

蛋白marker：Thermo scitific26616，Exp：2014/02；

Tris-base：BIOSHARP Amresco 0497，LOT：2012/10；

Glycine：BIOSHARP Amresco 0617，LOT：2012/11；

SDS：BIOSHARP Sigma L-5750Exp：2014/08；

Acrylamide：BIOSHARP Amresco 0341，LOT：2011/11；

亚甲双丙烯酰胺：BIOSHARP Amresco，Exp：2014/08；

辣根酶标记山羊抗小鼠IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：107724；

辣根酶标记山羊抗兔IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：101964；

脱脂奶粉：伊利，批号：66196131T；

高灵敏度化学发光检测试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司，LOT：22912；

Western一抗二抗去除液：Beyotime P0025；

医用X射线胶片：富士胶片株式会社，EXP：2015-07。

4实验仪器

大鼠脑立体定位仪：NARISHIGE SR-5N,日本东京；

自发活动视频分析系统：上海吉量软件科技有限公司；

Morris水迷宫及视频采集分析系统:：中国医学科学研究院药物研究所；

行为学装置：大鼠Y迷宫、新物体辨别、避暗装置均为沈阳药科大学制作；

石蜡切片机：德国莱卡公司。

光学显微镜：OLYMPUS公司；

Image-pro6.3图像分析系统：OLYMPUS公司；

超声波清洗器：KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司；

TECAN酶标定量测试仪：SPECTRA CLASSIC；

-80℃低温冰箱：中科美菱；

万分之一天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

电子天平：常州市双杰测试仪器厂；

恒温水浴装置：BCFCO长风电子科技有限公司；

H-1微型漩涡混合器：上海精科实业有限公司；

电热恒温培养箱：DNP-9272，上海精密实验设备有限公司；

高速冷冻离心机：HC-3018R，科大创新股份有限公司；

二、实验方法

1、喹啉酸损毁双侧基底前脑NBM核大鼠模型的建立

大鼠腹腔注射3.5％水合氯醛(350mg/kg体重)麻醉。剪去颅顶切口区毛,碘伏消毒后，固定在脑立体定位仪上。根据大鼠的脑立体定位图谱确定大鼠NBM核位置(AP:B-1.4mm、ML:±2.4mm、DV:-7.5mm)，用牙科钻钻开颅骨，用微量注射器垂直进针，将2μl(含120nmol)喹啉酸(用0.1mol/L，pH 7.4PBS缓冲液溶解)缓慢注入左侧NBM核，留针5min，右侧注射与左侧保持一致。假手术组注入等量的PBS缓冲液。

2、分组与给药

将SD大鼠随机分为假手术组(阴性对照组)、模型组、盐酸多奈哌齐0.95mg/kg组、清脑养血颗粒647mg/kg组(人临床等效量)、1294mg/kg组(2倍人临床等效量)、2588mg/kg组(4倍人临床等效量)，每组17--21只。各组均于造模后次日开始灌胃给药，每天一次至行为学实验全部结束。

3、行为学实验方法

3.1大鼠Y迷宫实验

大鼠Y迷宫实验旨在通过自发交替反应的指标，考察受试药物对大鼠工作记忆的影响。装置由三个夹角为120°的木制支臂组成，分别为A、B、C三臂。实验时将大鼠放入A臂末端，让其自由出入三个臂，记录8min内每只大鼠进入三个臂的总次数number of arm entries(N)及进臂顺序，以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应successive alternation，记录正确交替反应次数number ofalternation。用自发交替反应率Alternation behavior(％)＝number of alternation/(N-2)*100。

3.2大鼠新物体辨别实验

实验装置由直径为1.5米的黑色塑料制成。测试前两日，将2-3只大鼠面向装置壁放入实验装置中适应5min，每日两次。测试当天，先将大鼠放入实验装置中并允许自由探索3min以适应环境后，取出。将2个完全相同的物体(A1、A2)置于距装置壁等距离处，将大鼠再次放入装置中，分别记录5min内探索两物体的时间(tA1、tA2)，每组另一半大鼠测试时改变物体A1、A2的颜色，以排除大鼠对颜色偏好。1h后，将其中一物体换成一个新物体(B)，将大鼠再次放入，分别记录探索两物体所用时间(tA1、tB)。24h后，将物体B换成一个新物体(C)，将大鼠再次放入，分别记录探索两物体所用时间(tA1、tC)。计算对新物体的优先指数及辨别系数。

优先指数计算公式如下：

Preferential index(1h)＝tB/(tA1+tB)公式(1)

Preferential index(24h)＝tC/(tA1+tC)公式(2)

辨别系数计算公式如下：

Discrimination index(1h)＝(tB-tA1/(tA1+tB)公式(3)

Discrimination index(24h)＝(tC-tA1/(tA1+tC)公式(4)

3.3大鼠自发活动实验

大鼠自发活动实验旨在考察受试药物对大鼠大脑皮层兴奋性的影响。实验装置为四个长方形活动箱(45×45×13cm)，内置红外线探头及摄像头，自发活动视频分析系统由上海吉量软件科技有限公司提供。实验时，将动物分别面壁放入四个活动箱中，每箱一只。设置采集时间15分钟，记录动物活动总路程、活动时间以及平均速度等指标。

3.4大鼠Morris水迷宫实验

大鼠Morris水迷宫实验旨在考察受试药物对大鼠空间学习记忆能力的影响。

(1)定位航行实验:每天上下午各进行1次Morris水迷宫训练，连续4天。平台置于第四象限中点，在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，采集90s，记录大鼠从入水至找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)，然后让大鼠在平台上休息10s。如果90s未找到平台,潜伏期记为90s，并将大鼠置于平台上休息10s。每天在不同的入水点进行训练。

(2)空间探索实验:定位航行实验结束后24h，撤除平台，将大鼠放入原平台对侧象限中点的水中，自由游泳90s。水迷宫系统自动记录大鼠在原平台象限停留的时间及路程等参数。

3.5大鼠被动回避反应实验(避暗实验)

大鼠避暗实验旨在考察受试药物对大鼠长期记忆的影响。装置为避暗箱(分为明室和暗室，明室上方以钨灯照明，暗室中后部铜栅可以通交流电，两室间有一直径为6cm×4cm的门洞)。实验分为训练和测试两部分。此法系利用鼠类的嗜暗习性，训练阶段将大鼠背对门口放入明室，自由活动适应3分钟后，待动物进入暗室，将洞门关上后通电。电击大鼠5秒钟后将洞门打开，动物会因为电击疼痛而进入明室。若其再进入暗室，则继续电击，直到大鼠在明室的时间达到2分钟，如此训练5min。24h后进行测试，将大鼠放入避暗箱明室内，记录5分钟内其进入暗室的次数作为错误次数，以及大鼠自放入避暗箱明室至第一次进入暗室的时间作为潜伏期(s)，以此作为记忆成绩。

4Western blotting方法

4.1组织蛋白质的提取

大鼠海马及皮层组织样本放于-80℃冰箱储存备用。按1：10比例加入蛋白裂解液，每1ml蛋白裂解液加5μlPMSF。用超声细胞粉碎机匀浆后，冰浴中静置30min。14000×g，4℃离心20min，取上清液，分装，于-80℃冰箱储存备用。取少部分上清液用于蛋白定量。

4.2蛋白浓度的测定—BCA法

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制BCA工作液，充分混匀。①蛋白标准品为5mg/ml BSA，完全溶解蛋白标准品，取20μL稀释至100μL，使终浓度为1mg/ml。用PBS稀释标准品。②将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl分别加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液(PBS)补足到20μl，每个浓度重复三次。③上述蛋白提取液用PBS稀释10倍后，将20μl蛋白稀释液加到96孔板的样品孔中，每个样品重复三次。④各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。⑤用酶标仪测定样品在波长540nm处的吸光度。⑥根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

4.3蛋白印迹分析

①SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制：组装制胶玻璃板。配制12％分离胶液，充分混匀后，立即注入制胶玻璃板间隙，灌注至离玻璃板顶端3cm左右，用去离子水封胶，室温大约聚合30～60min分离胶凝固，倒掉去离子水，尽可能吸干分离胶表面的水。配制5％浓缩胶液，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，插入梳子，避免混入气泡，放置，室温下聚合约60min。浓缩胶聚合后，拔除梳子，用去离子水冲洗梳孔，直接电泳或放入4℃冰箱备用。

②电泳：将样品中的蛋白在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳分离。根据BCA法蛋白定量的结果，上样前调整样品的蛋白浓度使其一致，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热5min，使蛋白充分变性。将凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液。每孔分别加入30μg总蛋白。电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，增加到180V，染料抵达分离胶底部时断电。

③转膜：在转膜缓冲液中将蛋白质转移至PVDF膜上。活化PVDF膜，将剪好的膜依次序浸入100％甲醇(10s)→去离子水(5min)→转移缓冲液(大于10min)。同时滤纸和海绵垫浸入转移缓冲液中(大于10min)。将结束电泳的浓缩胶除去。安装转膜装置，从正极(红色)→负极(黑色)依次为→白色边盒→多孔垫片→(2张)滤纸→PVDF膜→凝胶→(2张)滤纸→多孔垫片→黑色边盒扣上吊扣放进转膜槽中。转膜槽内两侧加冰盒，防止转膜时过热。接通电流(凝胶一边接负极，PVDF膜一边接正极)，恒流电转移2h，电流为100mA。转膜结束后，关闭电源，将膜取出。

④封闭和免疫反应：将膜放入封闭液中(用PBS缓冲液配置5％脱脂奶粉)，室温轻摇2h。用封闭液配制一抗(SYP，GAP-43，PSD-95，CHMR1)，放入冰箱4℃过夜。用PBS室温洗膜三次，Tris-Nacl室温洗膜一次，每次10min。加上用封闭液配制辣根过氧化酶标记的二抗(1：3000)，室温孵育2h。用Tris-Nacl室温洗膜三次，每次10min。

5病理组织学观察

5.1取材

大鼠行为学实验结束后，腹腔注射3.5％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，仰位固定于手术台上，开胸暴露心脏。将灌流穿刺针从心尖部位插入左心室，同时右心耳剪一小口，先用约200-300ml生理盐水灌流，待右心耳流出的液体变得无色澄清，剪尾无血时，换用300-400ml 4℃4％多聚甲醛缓冲液(0.1mol/L)灌流，直至躯体僵硬。断头取出整脑，置于4℃4％的多聚甲醛中固定。24h后，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度5μm，用于常规HE染色。每组另取4只大鼠，4％多聚甲醛与2.5％戊二醛1:1混合液心脏灌流后，取海马CA1区组织，2.5％戊二醛固定，供透射电镜观察神经细胞超微结构。

5.2HE染色

6统计学方法

三、实验结果

1行为学测试结果

1.1自发活动实验

实验结果表明，在自发活动实验中，各组大鼠的活动总路程、活动总时间以及平均速度未见显著差异，提示养血清脑颗粒不会通过影响中枢神经系统兴奋性而干扰后续的行为学实验(见表2-15)。各组大鼠自发活动轨迹图见图2-2-1。

图2-2-1各组大鼠自发活动轨迹代表图。

表2-15养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠自发活动的影响(n＝9-10，)

1.2Y迷宫实验

实验结果表明，各组大鼠进入Y迷宫三个臂的总次数之间未见显著性差异(见图2-2-2)，提示养血清脑颗粒未对大鼠自发活动产生明显影响。与假手术组相比，模型组大鼠自发交替反应率显著下降；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加了大鼠Y迷宫自发交替反应率，盐酸多奈哌齐组也显著增加自发交替反应率(见图2-2-3、表2-16)，提示养血清脑颗粒可显著改善痴呆大鼠的工作记忆障碍。

图2-2-2Y迷宫实验中养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠进臂总次数的影响(n＝16-18，)。

图2-2-3养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠自发交替反应率的影响(n＝16-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

表2-16Y迷宫实验中养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠进臂总次数及自发交替反应率的影响(n＝16-18，)。

与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

1.3新物体辨别实验

实验结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠1h及24h优先指数和辨别系数显著降低；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地提高1h及24h优先指数和辨别系数，盐酸多奈哌齐组也显著增加优先指数及辨别系数(见图2-2-4、图2-2-5，表2-17、2-18)。

图2-2-4养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠新物体辨别1h优先指数的影响(n＝16-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01，^***P<0.001。

图2-2-5养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠新物体辨别24h优先指数的影响(n＝16-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

表2-17养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆模型大鼠新物体辨别1h及24h优先指数的影响(n＝16-18，)

与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

表2-18养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆模型大鼠新物体辨别1h及24h辨别系数的影响(n＝16-18，)

1.4Morris水迷宫实验

(1)定向导航实验

实验结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠在水迷宫实验中到达平台的游泳时间及路程显著延长；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地缩短了大鼠到达平台的游泳时间及路程，盐酸多奈哌齐组也显著缩短游泳时间及路程(见图2-2-6，图2-2-7、表2-19、表2-20)。

图2-2-6养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠水迷宫训练期间游泳时间的影响(n＝15-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

图2-2-7养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠水迷宫训练期间游泳路程的影响(n＝15-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

表2-19养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠水迷宫训练期间游泳时间的影响(n＝15-18，)。

注A:空白对照组B:模型组C:盐酸多奈哌齐组D:养血清脑颗粒组

表2-20养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠水迷宫训练期间游泳路程的影响(n＝15-18，)。

注A:空白对照组B:模型组C:盐酸多奈哌齐组D:养血清脑颗粒组

(2)空间探索实验

实验结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠在原平台所在象限(第四象限)的游泳时间和第四象限路程百分比显著下降；与模型组相比，养血清脑颗粒2588、1294mg/kg剂量组可显著延长大鼠第四象限游泳时间和第四象限路程百分比，盐酸多奈哌齐组也显著延长第四象限游泳时间及路程百分比(见图2-2-8、图2-2-9，图2-2-10、表2-21)。

图2-2-8各组大鼠空间探索实验游泳轨迹图。

图2-2-9养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠在第四象限游泳时间的影响(n＝15-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

图2-2-10养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠在第四象限游泳路程百分比的影响(n＝15-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

表2-21养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠第四象限游泳时间及第四象限游泳路程百分比的影响(n＝15-18，)。

1.5被动回避反应实验

实验结果表明，与假手术组相比，模型组被电击次数显著增加；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地减少了被电击次数，盐酸多奈哌齐组也显著减少了被电击次数(图2-2-11、表2-22)。

图2-2-11养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠避暗实验被电击次数的影响(n＝15-18，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01，^***P<0.001。

表2-22养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠避暗实验被电击次数的影响(n＝15-18，)。

与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01，^***P<0.001。

2HE染色观察海马神经细胞病理变化

结果可见，假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞结构清楚，排列紧密。模型组大鼠神经元排列疏松、水肿，染色质减少，核固缩。养血清脑颗粒2588mg/kg组及盐酸多奈哌齐组大鼠海马神经元排列紧密，未见水肿及核固缩，养血清脑颗粒1294mg/kg组大鼠神经元排列较紧密，有轻微水肿及核固缩(见图2-2-12)。

图2-2-12养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆模型大鼠海马神经细胞病理变化的影响(×40)

3电镜观察海马CA1区神经元及突触超微结构变化

3.1电镜观察神经元胞体超微结构与本次提供的不同，用哪个？

电镜观察可见，假手术组神经元细胞轮廓清晰，核呈椭圆形，核内染色质分布较均匀，核膜、核仁清楚，胞质内有丰富的核糖体、粗面内质网、较多的线粒体及溶酶体等细胞器；模型组神经元细胞核形不规则，核内异染色质有明显的凝聚、边集，胞质部分溶解，尚存的线粒体外膜模糊；多奈哌齐组及养血清脑颗粒2588mg/kg组神经元细胞核近圆形，核内染色质分布均匀，核膜轮廓清楚，胞质内有丰富的核糖体、线粒体、粗面内质网和溶酶体等细胞器；养血清脑颗粒1294mg/kg组神经元细胞核圆形，核膜及核仁清楚，核内染色质分布均匀，胞质内有较多的核糖体，粗面内质网多扩张、线粒体嵴或外膜部分缺失，还见溶酶体等细胞器；养血清脑颗粒647mg/kg组神经元细胞核近圆形，核内染色质分布均匀，胞质内有较多的核糖体、线粒体、溶酶体和轻度扩张的粗面内质网等细胞器(见图2-2-13)。

图2-2-13养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马CA1区神经元胞体超微结构的影响(n＝4，×6000)。

3.2电镜观察神经元突触超微结构

神经元突触超微结构可见，假手术组突触结构清楚，可见明显的突触前膜、后膜及间隙。突触前膜内有较多的突触小泡，突触后膜内致密物厚度较均匀；模型组部分突触结构紊乱，突触前膜、后膜融合；部分可见突触前膜、后膜及间隙；多奈哌齐组及养血清脑颗粒2588mg/kg组轴-树突触前膜、后膜清楚，结构清晰，前膜内有小泡，后膜致密斑较厚；养血清脑颗粒1294mg/kg组部分突触前膜、后膜融合，突触间隙宽窄不一，部分突触近于正常，可见明显的突触前、后膜及间隙。突触前膜内有较多的突触小泡，突触后膜内致密物厚度较均匀；养血清脑颗粒647mg/kg组突触前后膜融合，后膜深染物质较少，突触数量较少。(见图2-2-14)图2-2-14养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马CA1区突触超微结构的影响(n＝4，×10000)。

4突触相关蛋白表达

4.1养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马组织SYP，PSD-95及GAP-43表达的影响

Western blot结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠海马组织的SYP、PSD-95及GAP-43表达显著减少；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加海马组织中SYP、PSD-95的表达，对GAP-43的表达未见显著影响，盐酸多奈哌齐组能显著增加这些突触相关蛋白的表达(见图2-2-15、2-2-16、2-2-17、表2-23)。

图2-2-15养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马组织突触素(SYP)表达的影响(n＝3，)。与假手术组相比，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图2-2-16养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马组织突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，)。与假手术组相比，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图2-2-17养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马组织突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3，)。与假手术组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05。

表2-23养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马组织突触素(SYP)、突触后致密物(PSD-95)及突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3， )。

与假手术组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01

4.2养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织SYP、PSD-95及GAP-43表达的影响

Western blot结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮层组织SYP、PSD-95的表达显著减少；与模型组相比，盐酸多奈哌齐组及养血清脑颗粒2588mg/kg组大脑皮层组织SYP的表达显著增加；盐酸多奈哌齐组、养血清脑颗粒2588mg/kg及1294mg/kg组PSD-95的表达均显著增加；各组之间GAP-43的表达均未见显著差异(见图2-2-18、2-2-19、2-2-20、表2-24)。

图2-2-18养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织突触素(SYP)表达的影响(n＝3，)。与假手术组相比，^##P<0.01；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

图2-2-19养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织突触后致密物(PSD-95)表达的影响(n＝3，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01。

图2-2-20养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠大脑皮层突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3，)。

表2-24养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠大脑皮层突触素(SYP)、突触后致密物(PSD-95)及突触生长相关蛋白(GAP-43)表达的影响(n＝3， )。

与假手术组相比，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01

5中枢胆碱能神经系统功能检测

5.1养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层及海马组织Ach含量的影响

乙酰胆碱(Ach)是最早发现的与学习记忆密切相关的神经递质，胆碱乙酰转移酶(ChAT)催化乙酰辅酶A的乙酰基与胆碱在胞浆结合生成Ach。Ach合成后由突触小泡载体转运进入囊泡贮存，当有信号激活时，Ach扩散至突触后膜并与突触后膜受体结合，发挥其生物学作用。乙酰胆碱受体分为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)与毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)。mAChR属G蛋白偶联的神经递质，有5种亚型：M1-M5，大脑中主要存在位于突触后膜的M1受体^[6]。ELISA结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮层及海马组织Ach的表达显著减少；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加Ach的表达，盐酸多奈哌齐组也显著增加Ach表达(见图2-2-21及图2-2-22、表2-25)。

图2-2-21养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马组织乙酰胆碱(Ach)含量的影响(n＝6，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

图2-2-22养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织乙酰胆碱(Ach)含量的影响(n＝6，)。与假手术组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05

表2-25养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马组织及大脑皮层组织乙酰胆碱(Ach)含量的影响(n＝6，)。

与假手术组相比，^#P<0.05，^###P<0.001；与模型组相比，^*P<0.05，^***P<0.001

5.2养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马ChAT含量及活性的影响

ELIA结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠海马组织中ChAT含量显著减少；与模型组相比，养血清脑颗粒剂量依赖性地增加ChAT的含量，盐酸多奈哌齐组也显著增加其表达；ChAT的活性在各组之间未见显著性差异(见图2-2-23及图2-2-24)

图2-2-23养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量的影响(n＝6，)。与假手术组相比，^###P<0.001；与模型组相比，^**P<0.01，^***P<0.001。

图2-2-24养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性的影响(n＝6，)。

表2-26养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量及活性的影响(n＝6，)。

5.3养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层及海马组织CHRM1表达的影响

Western blot结果表明，大鼠海马组织CHRM1表达在各组之间未见显著差异；ELISA结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮层组织中CHRM1的表达显著减少；与模型组相比，养血清脑颗粒2588mg/kg组及盐酸多奈哌齐组均显著增加其表达(见图2-2-25及图2-2-26)。

图2-2-25养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马组织M1受体(CHRM1)表达的影响(n＝3，)。

图2-2-26养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织M1受体(CHRM1)表达的影响(n＝6，)。与假手术组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05。

表2-27养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠海马组织M₁受体(CHRM1)表达的影响(n＝3，)

表2-28养血清脑颗粒对喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层组织M₁受体(CHRM1)表达的影响(n＝6，)。

与假手术组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05

四、小结

1)Y迷宫、新物体辨别、Morris水迷宫及避暗等行为学实验结果显示，养血清脑颗粒在647-2588mg/kg剂量范围内能够剂量依赖性地改善喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠工作记忆障碍、空间学习记忆障碍以及物体辨别能力等非空间学习记忆障碍，其高剂量组的作用与盐酸多奈哌齐相近。

2)养血清脑颗粒能够显著提高喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层及海马组织中突触素、突触后致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。

3)养血清脑颗粒能够显著提高喹啉酸损毁NBM核致痴呆大鼠大脑皮层及海马组织中乙酰胆碱的表达，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮质M1胆碱受体的表达。

附图说明：

图1-1APPswe/PSldE9转基因鼠的基因型鉴定

注：与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01

图1-3各药物组小鼠大脑额叶皮质区的刚果红染色

(箭头所指粉红色β-淀粉样斑块)

图1-6各药物组转基因小鼠海马区的刚果红染色

(箭头所指粉红色β-淀粉样斑块)

图1-7各药物组转基因小鼠的大脑组织β-淀粉样斑块个数

与生理盐水组比较，*p<0.05；**p<0.01.

图1-8各药物组转基因小鼠的大脑组织β-淀粉样斑块覆盖面积

与生理盐水组比较，**p<0.01.

图1-9针对APPβα段(Aβ42的1-16aa)特异抗体的设计

利用识别不溶性蛋白的APPβα特异抗体的免疫组化染色证明养血清脑颗粒

图中箭头所指即为APP染色阳性的β-淀粉样斑块，呈深褐色。

注：与生理盐水组比较，**P<0.01

图2-1-6养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(n＝18-26,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05图2-1-7养血清脑颗粒对SAMP8小鼠水迷宫游泳路程的影响(n＝18-26,mean±SD)。与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01。

图2-1-8养血清脑颗粒对SAMP8小鼠空间探索实验游泳轨迹的影响

图2-1-23养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层神经生长因子(NGF)表达的影响(n＝6,mean±SD)。与空白对照组相比，^##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01。

图2-1-24养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区TrkA表达的影响(×4)

图2-1-25养血清脑颗粒对SAMP8小鼠海马CA1区TrkA表达的影响(×40)

图2-1-27养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层TrkA表达的影响(×40)

图2-1-28养血清脑颗粒对SAMP8小鼠大脑皮层TrkA表达的影响(n＝6,mean±SD)与空白对照组相比，^###p<0.001；与模型组相比，***p<0.001或**p<0.01。

图2-2-1各组大鼠自发活动轨迹代表图。

图2-2-8各组大鼠空间探索实验游泳轨迹图。

图2-2-14养血清脑颗粒对喹啉酸毁损NBM核致痴呆大鼠海马CA1区突触超微结构的影响(n＝4，×10000)。

具体实施方式：

实施例1

原料重量配比：当归6.75％、川芎6.75％、白芍5.4％、钩藤13.5％、鸡血藤13.5％、熟地黄5.4％、决明子13.5％、夏枯草13.5％、细辛1.34％、延胡索6.75％和珍珠母13.5％。

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.300～1.310(74～76℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入4倍量60％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.23～1.33(65℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～70％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.320～1.325(79～81℃)，得浸膏，备用。

取糊精300g，用纯化水化开，加入甜菊素3.0g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的糊精250.0g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至80～90℃充分干燥。

整粒过筛，总混，制成颗粒剂，铝塑复合膜枕形袋包装，规格4克/袋。

实施例2

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～72％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.320～1.325(79～81℃)，得浸膏，备用。

将上述备好的浸膏用常规制备方法制备得到养血清脑丸。

实施例3

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入5倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2.5小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.250～1.310(70～74℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入4倍量80％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次2小时，第二次2小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.15～1.25(65℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为60～65％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.27～1.320(75～80℃)，得浸膏，备用。

将上述备好的浸膏用常规制备方法制备得到养血清脑滴丸。

实施例4

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量80％乙醇加热回流提取2次，第一次2.5小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.30～1.350(75～80℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入6倍量60％乙醇，浸渍，加热回流提取3次，第一次2小时，第二次1小时，第三次0.5小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.20～1.35(60℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入8倍量水煎煮2次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为80～85％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.30～1.350(80～85℃)，得浸膏，备用。

将上述备好的浸膏用常规制备方法制备得到养血清脑滴口服液。

实施例5

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量50％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次2小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.300～1.350(73～78℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入5倍量70％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次1小时，第二次1小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.23～1.35(65℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入10倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次2小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为63～70％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.290～1.330(78～83℃)，得浸膏，备用。

将上述备好的浸膏用常规制备方法制备得到养血清脑胶囊。

实施例6

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入3倍量60％乙醇加热回流提取3次，第一次2小时，第二次1小时，第三次0.5小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.29～1.340(73～78℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入4倍量80％乙醇，浸渍，加热回流提取3次，第一次2小时，第二次1小时，第三次1小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.18～1.33(65℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入7倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为70～75％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.310～1.330(77～82℃)，得浸膏，备用。

取糊精84g，用纯化水化开，加入甜菊素3g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏共780g分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的糊精336g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

整粒过筛，总混，制成颗粒剂，铝塑复合膜枕形袋包装，规格3克/袋。

实施例7

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入6倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次0.5小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.260～1.310(74～76℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入6倍量60％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次2小时，第二次2小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.21～1.34(55℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入6倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～75％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.300～1.300(79～81℃)，得浸膏，备用。

取糊精40g，用纯化水化开，加入甜菊素3g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏共794g分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的糊精163g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

实施例8

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入6倍量80％乙醇加热回流提取2次，第一次1小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.29～1.340(73～78℃)，得浸膏，备用。

提取物2的制备：白芍加入3倍量60％乙醇，浸渍，加热回流提取2次，第一次2.5小时，第二次2小时，滤过，回收乙醇并浓缩至相对密度1.17～1.33(65℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入9倍量水煎煮2次，第一次3小时，第二次3小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.08(80℃)，加乙醇使含醇量为65～75％，静置12～22小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.310～1.330(77～82℃)，得浸膏，备用。

取糊精110g，用纯化水化开，加入甜菊素3g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏共840g分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的糊精256g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

实施例9

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至至相对密度1.250～1.310(70～74℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～75％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.27～1.320(75～80℃)，得浸膏，备用。

取可溶性淀粉300g，用纯化水化开，加入甜菊素3.0g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏共分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的可溶性淀粉250.0g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至80～90℃充分干燥。

实施例10

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.280～1.320(75～80℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为60～65％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.315～1.320(76～79℃)，得浸，备用。

取微晶纤维素80g，用纯化水化开，加入阿司帕坦3.0g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的微晶纤维素320g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

实施例11

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入5倍量70％乙醇加热回流提取2次，第一次2.5小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.290～1.300(75～77℃)，得浸膏，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为65～70％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.310～1.315(79～82℃)，得浸膏，备用。

取乳糖231g，用纯化水化开，加入阿司帕坦3.0g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的乳糖151g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

实施例12

提取物1的制备：当归、川芎、延胡索、决明子加入4倍量80％乙醇加热回流提取2次，第一次2.5小时，第二次1小时，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至相对密度1.280～1.300(75～77℃)，得浸，备用。

提取物3的制备：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加入8倍量水煎煮2次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，浓缩至相对密度1.06～1.10(80℃)，加乙醇使含醇量为80～85％，静置12～24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.280～1.330(75～80℃)，得浸膏，备用。

取糊精80g，用纯化水化开，加入阿司帕坦3g，充分搅拌使溶化，将上述备好的浸膏分步加入上述浆料中，搅拌。调整浆料比重在1.12～1.23(42～50℃)之间。60目～100目在线过滤。

将剩余的糊精330g投入制粒机，调节风机频率、进风温度、输液频率和雾化压力等制粒参数，使床内物料处于良好的流化状态。喷雾制粒，制粒过程控制物料温度在30～60℃之间。干燥，使物料温度升至70～90℃充分干燥。

实施例13

养血清脑制剂配方：

原料重量配比为：当归6.75％、川芎6.75％、白芍5.4％、钩藤13.5％、鸡血藤13.5％、熟地黄5.4％、决明子13.5％、夏枯草13.5％、细辛1.34％、延胡索6.75％和珍珠母13.5％

制备方法：

药材经前序处理→水提→浓缩→乙醇沉淀→回收乙醇→浓缩成膏→混合制粒→成品包装。即按比例取上述各药，加水煮三次，每次1小时，合并煎液，浓缩适量，加2倍量的乙醇，静置24小时沉淀，取上清液浓缩成膏，相对密度为1.3～1.4，出膏率10％，按常规的工艺方法作成其它适当的剂型。

Claims

1.一种中药组合物在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，其中所述中药组合物由如下重量配比的药物制备而成：当归6.75％、川芎6.75％、白芍5.4％、钩藤13.5％、鸡血藤13.5％、熟地黄5.4％、决明子13.5％、夏枯草13.5％、细辛1.34％、延胡索6.75％和珍珠母13.5％。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物用于清除阿尔茨海默脑内老年斑。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够清除脑内Aβ蛋白，降低脑内Aβ蛋白的生成。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够抑制致病性γ分泌酶早老素PS1的表达水平抑制APP的病理性切割，促进APP发生生理性α剪切的作用。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物使记忆认知能力显著提高。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及海马组织中脑源性神经生长因子、神经生长因子及其受体TrkA的表达，改善海马神经元超微结构的异常。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及海马突触素及突触后致密物95的表达，改善海马突触结构的异常。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够增加大脑皮层总抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，减少MDA含量。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用在于该组合物能够提高大脑皮层及海马组织中乙酰胆碱的表达，提高海马胆碱乙酰转移酶及大脑皮质M1胆碱受体的表达。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述该组合物选自：颗粒剂，丸剂，片剂，胶囊，口服液。