TWI715521B - 中藥組合物在製備藥物中的應用 - Google Patents

Abstract

一種中藥組合物用於製備治療阿爾茨海默症(老年癡呆症)的藥物中的應用，該中藥組合物由當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%的重量配比的藥物製備而成。

Description

中藥組合物在製備藥物中的應用

本發明係關於一種中藥組合物製劑的新用途，特別係關於養血清腦製劑在製備治療阿爾茨海默症(老年癡呆症)的藥物中的應用。

養血清腦顆粒是天津天士力製藥股份有限公司研製的現代中藥製劑，並於1996年獲得國家新藥證書，並於1999年被列入國家基本藥物目錄，2000年被列入國家醫保藥品目錄。養血清腦顆粒是由當歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、熟地黃、決明子、夏枯草、細辛、延胡索和珍珠母11味中藥，經現代高科技手段提取後，加入適當輔料，經混合製粒等製劑過程製成的一種顆粒劑。該製劑具有有效成分溶出快、生物利用度高等優點。養血清腦顆粒具有養血平肝，活血通絡的功效，可用於血虛肝亢所致的頭痛、眩暈眼花、心煩易怒、失眠多夢等病症，在臨床上具有顯著的療效。

養血清腦製劑為現有技術，中國專利93100050.5描述了其配方及製備方法，該專利描述的配方還可以根據製劑學常規技術製備成不同的劑型，如片劑、膠囊、口服液等。

阿爾茨海默症(Alzheimer disease，AD)，也稱為老年癡呆症，是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性 疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特徵，病因迄今未明。65歲以前發病者，稱早老性癡呆；65歲以後發病者稱老年性癡呆。

目前治療阿爾茨海默症的藥物包括：多奈呱齊(donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加蘭他敏(Galantamine)、石杉堿甲(HuperzineA)、美金剛(Memantine)、司來吉蘭(Selegiline)、維生素E、褪黑素、銀杏提取物(gingko bilobi)、吡拉西坦(piracetam腦複康)、茴拉西坦(aniracetam阿尼西坦，三樂喜)、萘非西坦等。

本發明人經過研究，意外地發現養血清腦製劑具有治療阿爾茨海默症的作用。

本發明提供一種中藥組合物的新用途，特別涉及養血清腦製劑的新的醫藥用途。

具體而言，本發明提供一種中藥組合物在製備治療阿爾茨海默症的藥物中的應用。該應用在於該中藥組合物可以用於清除阿爾茨海默症患者腦內的老年斑。

本發明該中藥組合物是由如下重量百分比的藥材製備而成：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。

製備過程為：藥材經前序處理→水提→濃縮→乙醇沉 澱→回收乙醇→濃縮成膏→混合製成製劑。

該製劑包括任何一種可服用的劑型，較佳為口服製劑，如：顆粒劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液。

本發明所述的應用在於該中藥組合物使記憶認知能力顯著提高。

本發明所述的應用在於該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬組織中腦源性神經生長因子、神經生長因子及其受體TrkA的表達，改善海馬神經元超微結構的異常。

本發明所述的應用在於該中藥組合物能夠增加大腦皮層總抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，減少MDA含量。

本發明所述的應用在於該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬突觸素及突觸後緻密物95的表達，改善海馬突觸結構的異常。

本發明所述的應用在於該中藥組合物能夠提高大腦皮層及海馬組織中乙醯膽鹼的表達，提高海馬膽鹼乙醯轉移酶及大腦皮質M1膽鹼受體的表達。

本發明所述的應用在於該中藥組合物用於清除阿爾茨海默患者腦內的老年斑。

本發明所述的應用在於該中藥組合物能夠清除腦內A β蛋白，降低腦內A β蛋白的生成。

本發明所述的應用在於該應用在於該中藥組合物能夠抑制致病性γ分泌酶早老素PS1的表達水平抑制APP的病理性剪切，促進APP發生生理性α剪切的作用。

圖1是APPswe/PS1dE9轉基因鼠的基因型鑒定。

圖2是Y迷宮實驗證明養血清腦顆粒具有顯著改善早中期阿爾茨海默症動物模型小鼠記憶、認知能力的作用(與生理鹽水組比較*p<0.05,** p<0.01)。

圖3是各藥物組小鼠大腦額葉皮質區的剛果紅染色。

圖4是各藥物組雄性轉基因小鼠的大腦額葉皮質區的剛果紅染色(箭頭所指粉紅色是β-澱粉樣斑塊)。

圖5是各藥物組雌性轉基因小鼠的大腦額葉皮質區的剛果紅染色(箭頭所指粉紅色是β-澱粉樣斑塊)。

圖6是各藥物組轉基因小鼠海馬區的剛果紅染色(箭頭所指粉紅色是β-澱粉樣斑塊)。

圖7是各藥物組轉基因小鼠的大腦組織β-澱粉樣斑塊個數(與生理鹽水組比較，* p<0.05；** p<0.01)。

圖8是各藥物組轉基因小鼠的大腦組織β-澱粉樣斑塊覆蓋面積(與生理鹽水組比較，** p<0.01)。

圖9是針對APP β α段(A β 42的1-16aa)特異抗體的設計(利用識別不溶性蛋白的APP β α特異抗體的免疫組化染色證明養血清腦顆粒)。

圖10是各藥物組轉基因小鼠大腦皮層中β-澱粉樣斑塊數量及形態，圖中箭頭所指即為APP染色陽性的β-澱粉樣斑塊，呈深褐色。

圖11是各藥物組雄性轉基因小鼠海馬區A β-澱粉樣斑塊數量及形態，圖中箭頭所指即為APP染色陽性的β- 澱粉樣斑塊，呈深褐色。

圖12是各藥物組雌性轉基因小鼠海馬區A β-澱粉樣斑塊數量及形態，圖中箭頭所指即為APP染色陽性的β-澱粉樣斑塊，呈深褐色。

圖13是各藥物組轉基因小鼠腦組織中強陽性A β-澱粉樣斑塊數量，與生理鹽水組比較，**p<0.01。

圖14是各藥物組對轉基因小鼠腦內APP的關鍵剪切酶和剪切產物的影響。

圖15是養血清腦顆粒顯著清除早中期阿爾茨海默症動物模型腦內老年斑的作用的分子機制。

圖16是SAMP8小鼠自發活動軌跡圖。A：空白對照組，B：模型組，C：鹽酸多奈呱齊組，D：養血清腦顆粒935mg/kg組，E：養血清腦顆粒1870mg/kg組，F：養血清腦顆粒3740mg/kg組。

圖17是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠Y迷宮進臂總次數的影響(n=23-28，平均值±SD)。

圖18是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠Y迷宮自發交替反應率的影響(n=23-28，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001。

圖19是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠新物體辨別1h優先指數的影響(n=22-28，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

圖20是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠新物體辨別24h 優先指數的影響(n=22-28，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比***p<0.001或**p<0.01。

圖21是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠水迷宮逃避潛伏期的影響(n=18-26，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05

圖22是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠水迷宮游泳路程的影響(n=18-26，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01。

圖23是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠空間探索實驗游泳軌跡的影響。

圖24是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠空間探索實驗目標象限游泳時間的影響(n=18-26，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

圖25是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠空間探索實驗目標象限路程百分比的影響(n=18-26，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01。

圖26是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬神經細胞病理變化的影響(×40)。

圖27是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區神經元超微結構的影響(n=4，×6000)。

圖28是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區突觸 超微結構的影響(n=4，×10000)。

圖29是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬組織中腦源性神經生長因子(BDNF)表達的影響(×4)。

圖30是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區腦源性神經生長因子(BDNF)表達的影響(×40)。

圖31是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區腦源性神經生長因子(BDNF)表達的影響(n=6，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01或*p<0.05。

圖32是清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層腦源性神經生長因子(BDNF)表達的影響(×40)。

圖33是清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層腦源性神經生長因子(BDNF)表達的影響(n=6，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01或*p<0.05。

圖34是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬神經生長因子(NGF)表達的影響(×4)。

圖35是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區神經生長因子(NGF)表達的影響(×40)。

圖36是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區神經生長因子(NGF)表達的影響(n=6，平均值±SD)與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

圖37是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層神經生 長因子(NGF)表達的影響(×40)。

圖38是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層神經生長因子(NGF)表達的影響(n=6，平均值±SD)。與空白對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

圖39是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區TrkA表達的影響(×4)。

圖40是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區TrkA表達的影響(×40)。

圖41是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬CA1區TrkA表達的影響(n=6，平均值±SD)與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01或*p<0.05。

圖42是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層TrkA表達的影響(×40)。

圖43是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層TrkA表達的影響(n=6，平均值±SD)與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01。

圖44是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬突觸素(SYP)表達的影響(n=3，平均值±SD)。與空白對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05。

圖45是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬突觸生長相關蛋白(GAP-43)表達的影響(n=3，平均值±SD)。

圖46是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠海馬突觸後緻密物(PSD-95)表達的影響(n=3，平均值±SD)。與空白對照組 相比，##p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

圖47是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層突觸素(SYP)表達的影響(n=3，平均值±SD)。與空白對照組相比，##p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

圖48是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層突觸生長相關蛋白(GAP-43)表達的影響(n=3，平均值±SD)。

圖49是養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層突觸後緻密物(PSD-95)表達的影響(n=3，平均值±SD)。與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或*p<0.05。

圖50是各組大鼠自發活動軌跡代表圖。

圖51是Y迷宮實驗中養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠進臂總次數的影響(n=16-18，

±SD)。

圖52是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠自發交替反應率的影響(n=16-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。

圖53是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠新物體辨別1h優先指數的影響(n=16-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01，***p<0.001。

圖54是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠新物體辨別24h優先指數的影響(n=16-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。

圖55是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠水迷宮訓練期間游泳時間的影響(n=15-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖56是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠水迷宮訓練期間游泳路程的影響(n=15-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖57是各組大鼠空間探索實驗游泳軌跡圖。

圖58是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠在第四象限游泳時間的影響(n=15-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。

圖59是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠在第四象限游泳路程百分比的影響(n=15-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。

圖60是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠避暗實驗被電擊次數的影響(n=15-18，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01，*** p<0.001。

圖61是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆模型大鼠海馬神經細胞病理變化的影響((×40)。

圖62是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大 鼠海馬CA1區神經元胞體超微結構的影響(n=4，×6000)。

圖63是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠海馬CA1區突觸超微結構的影響(n=4，×10000)。

圖64是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠海馬組織突觸素(SYP)表達的影響(n=3，

±SD)。與假手術組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。

圖65是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠海馬組織突觸後緻密物(PSD-95)表達的影響(n=3，

±SD)。與假手術組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。

圖66是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠海馬組織突觸生長相關蛋白(GAP-43)表達的影響(n=3，

±SD)。與假手術組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。

圖67是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠大腦皮層組織突觸素(SYP)表達的影響(n=3，

±SD)。與假手術組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。

圖68是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠大腦皮層組織突觸後緻密物(PSD-95)表達的影響(n=3，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01。

圖69是養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠大腦皮層突觸生長相關蛋白(GAP-43)表達的影響 (n=3，

±SD)。

圖70是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬組織乙醯膽鹼(Ach)含量的影響(n=6，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。

圖71是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層組織乙醯膽鹼(Ach)含量的影響(n=6，

±SD)。與假手術組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05

圖72是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)含量的影響(n=6，

±SD)。與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01，***p<0.001。

圖73是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)活性的影響(n=6，

±SD)。

圖74是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬組織M1受體(CHRM1)表達的影響(n=3，

±SD)。

圖75是養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層組織M1受體(CHRM1)表達的影響(n=6，

±SD)。與假手術組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。

本發明所述該中藥組合物的較佳提取方法為：按照上文所述的重量百分比，取中藥組合物處方量的各藥材備用：(1)提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子 加乙醇加熱回流提取，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮，備用；(2)提取物2的製備：白芍加乙醇加熱回流提取，濾過，回收乙醇並濃縮，備用；(3)提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加水煎煮，濾過，濃縮，加乙醇靜置，濾過，回收乙醇並濃縮，備用；(4)製劑的製備：取以上3種提取物，加入適量輔料，製劑，即得。

另一較佳的製備方法為：(1)提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入3至6倍量50至80%乙醇加熱回流提取2至3次，第一次0.5至2.5小時，第二、三次各0.5至2小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.250-1.350(70至80℃)，備用；(2)提取物2的製備：白芍加入3至6倍量50至80%乙醇，浸漬，加熱回流提取2至3次，第一次0.5至2.5小時，第二、三次各0.5至2小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.10-1.35(55至65℃)，備用；(3)提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入4至10倍量水煎煮2至3次，第一次0.5至3小時，第二、三次各1至3小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(75至85℃)，加乙醇使含醇量為60至85%，靜置12至24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相 對密度1.270-1.350(75至85℃)，備用；(4)製劑的製備：取以上提取物，加入適量輔料，製劑，即得。

最佳的製備方法為：(1)提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.300-1.310(74至76℃)，備用；(2)提取物2的製備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.33(65℃)，備用；(3)提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65至70%，靜置12至24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.320-1.325(79至81℃)，備用；(4)製劑的製備：取以上提取物，加入適量輔料，製劑，即得。

本發明在描述乙醇的百分比濃度時，是指乙醇水溶液的體積比濃度。本發明所稱的含醇量為乙醇含量(v/v)。

實施例

實施例1

原料重量配比：取當歸253.5g、川芎253.5g、白芍 202.7g、熟地黃202.7g、鉤藤506.8g、雞血藤506.8、夏枯草506.8g、決明子506.8g、珍珠母506.8g、延胡索253.5g、細辛50.5g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.300-1.310(74至76℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65-70%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.320-1.325(79至81℃)，得浸膏，備用。

取糊精300g，用純化水化開，加入甜菊素3.0g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的糊精250.0g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在 30-60℃之間。乾燥，使物料溫度升至80至90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格4克/袋。

實施例2

原料重量配比：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.300-1.310(74至76℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65至72%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.320-1.325(79至81℃)，得浸膏，備用。

將上述備好的浸膏用常規製備方法製備得到養血清腦丸。

實施例3

原料重量配比：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入5倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2.5小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.250-1.310(70至74℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量80%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次2小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.15-1.25(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為60至65%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.27-1.320(75至80℃)，得浸膏，備用。

將上述備好的浸膏用常規製備方法製備得到養血清腦滴丸。

實施例4

原料重量配比：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入 4倍量80%乙醇加熱回流提取2次，第一次2.5小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.30-1.350(75至80℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入6倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取3次，第一次2小時，第二次1小時，第三次0.5小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.20-1.35(60℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入8倍量水煎煮2次，第一次3小時，第二次2小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為80-85%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.30-1.350(80至85℃)，得浸膏，備用。

將上述備好的浸膏用常規製備方法製備得到養血清腦滴口服液。

實施例5

原料重量配比：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量50%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次2小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.300-1.350(73至78℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入5倍量70%乙醇，浸漬， 加熱回流提取2次，第一次1小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.35(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入10倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次2小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為63-70%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.290-1.330(78至83℃)，得浸膏，備用。

將上述備好的浸膏用常規製備方法製備得到養血清腦膠囊。

實施例6

原料重量配比：取當歸300g、川芎300g、白芍400g、熟地黃400g、鉤藤650g、雞血藤650g、夏枯草650g、決明子650g、珍珠母650g、延胡索300g、細辛50g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入3倍量60%乙醇加熱回流提取3次，第一次2小時，第二次1小時，第三次0.5小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.29-1.340(73至78℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量80%乙醇，浸漬，加熱回流提取3次，第一次2小時，第二次1小時，第三次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.18-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、 珍珠母、細辛加入7倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為70至75%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.310-1.330(77至82℃)，得浸膏，備用。

取糊精84g，用純化水化開，加入甜菊素3g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏共780g分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的糊精336g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30-60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70-90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格3克/袋。

實施例7

原料重量配比：取當歸338g、川芎338g、白芍300g、熟地黃300g、鉤藤413g、雞血藤413g、夏枯草413g、決明子413g、珍珠母413g、延胡索337g、細辛75g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入6倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次0.5小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.260-1.310(74至76℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入6倍量60%乙醇，浸漬， 加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次2小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.21-1.34(55℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入6倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65-75%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.300-1.300(79至81℃)，得浸膏，備用。

取糊精40g，用純化水化開，加入甜菊素3g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏共794g分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的糊精163g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30-60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70至90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格4克/袋。

實施例8

原料重量配比：取當歸450g、川芎450g、白芍350g、熟地黃350g、鉤藤570g、雞血藤570g、夏枯草570g、決明子570g、珍珠母570g、延胡索450g、細辛100g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入 6倍量80%乙醇加熱回流提取2次，第一次1小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.29-1.340(73至78℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入3倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2.5小時，第二次2小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.17-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入9倍量水煎煮2次，第一次3小時，第二次3小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.08(80℃)，加乙醇使含醇量為65至75%，靜置12-22小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.310-1.330(77至82℃)，得浸膏，備用。

取糊精110g，用純化水化開，加入甜菊素3g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏共840g分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的糊精256g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30-60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70-90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格3克/袋。

實施例9

原料重量配比：取當歸253.5g、川芎253.5g、白芍202.7g、熟地黃202.7g、鉤藤506.8g、雞血藤506.8、夏枯草506.8g、決明子506.8g、珍珠母506.8g、延胡索253.5g、細辛50.5g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至至相對密度1.250-1.310(70至74℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65-75%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.27-1.320(75至80℃)，得浸膏，備用。

取可溶性澱粉300g，用純化水化開，加入甜菊素3.0g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏共分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的可溶性澱粉250.0g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內 物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30至60℃之間。乾燥，使物料溫度升至80至90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格4克/袋。

實施例10

原料重量配比：取當歸338g、川芎338g、白芍270.3g、熟地黃270.3g、鉤藤675.7g、雞血藤675.7g、夏枯草675.7g、決明子675.7g、珍珠母675.7g、延胡索338g、細辛67.3g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.280-1.320(75至80℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量60%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.23-1.33(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為60至65%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.315-1.320(76至79℃)，得浸，備用。

取微晶纖維素80g，用純化水化開，加入阿司帕坦3.0g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的微晶纖維素320g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30至60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70至90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格3克/袋。

實施例11

原料重量配比：取當歸150g、川芎150g、白芍225g、熟地黃225g、鉤藤551g、雞血藤551g、夏枯草551g、決明子551g、珍珠母551g、延胡索225g、細辛19g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入5倍量70%乙醇加熱回流提取2次，第一次2.5小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.290-1.300(75至77℃)，得浸膏，備用。

提取物2的製備：白芍加入4倍量80%乙醇，浸漬，加熱回流提取2次，第一次2小時，第二次2小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.15-1.25(65℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、 珍珠母、細辛加入5倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為65至70%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.310-1.315(79至82℃)，得浸膏，備用。

取乳糖231g，用純化水化開，加入阿司帕坦3.0g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的乳糖151g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30至60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70-90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格4克/袋。

實施例12

原料重量配比：取當歸250g、川芎250g、白芍250g、熟地黃250g、鉤藤740g、雞血藤740g、夏枯草740g、決明子740g、珍珠母740g、延胡索250g、細辛50g。

提取物1的製備：當歸、川芎、延胡索、決明子加入4倍量80%乙醇加熱回流提取2次，第一次2.5小時，第二次1小時，濾過，除雜，回收乙醇並濃縮至相對密度1.280-1.300(75至77℃)，得浸，備用。

提取物2的製備：白芍加入6倍量60%乙醇，浸漬， 加熱回流提取3次，第一次2小時，第二次1小時，第三次0.5小時，濾過，回收乙醇並濃縮至相對密度1.20-1.35(60℃)，得浸膏，備用。

提取物3的製備：熟地黃、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細辛加入8倍量水煎煮2次，第一次3小時，第二次2小時，濾過，濃縮至相對密度1.06-1.10(80℃)，加乙醇使含醇量為80至85%，靜置12-24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.280-1.330(75至80℃)，得浸膏，備用。

取糊精80g，用純化水化開，加入阿司帕坦3g，充分攪拌使溶化，將上述備好的浸膏分步加入上述漿料中，攪拌。調整漿料比重在1.12-1.23(42至50℃)之間。60目至100目線上過濾。

將剩餘的糊精330g投入製粒機，調節風機頻率、進風溫度、輸液頻率和霧化壓力等製粒參數，使床內物料處於良好的流化狀態。噴霧製粒，製粒程序控制物料溫度在30至60℃之間。乾燥，使物料溫度升至70至90℃充分乾燥。

整粒過篩，總混，製成顆粒劑，鋁塑複合膜枕形袋包裝，規格3克/袋。

實施例13

養血清腦製劑配方：原料重量配比為：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠 母13.5%

製備方法：藥材經前序處理→水提→濃縮→乙醇沉澱→回收乙醇→濃縮成膏→混合製粒→成品包裝。即按比例取上述各藥，加水煮三次，每次1小時，合併煎液，濃縮適量，加2倍量的乙醇，靜置24小時沉澱，取上清液濃縮成膏，相對密度為1.3-1.4，出膏率10%，按常規的工藝方法作成其它適當的劑型。

本發明所述應用是經過實驗觀察獲得的，其使用了該中藥組合物製劑中的一種，即天士力製藥股份有限公司生產的“養血清腦顆粒”作為實驗藥品，任何與養血清腦顆粒具有相同處方經提取得到的提取物均具有與養血清腦顆粒相同的用途。實驗結果如下：

效果實驗一、養血清腦顆粒對輕中度阿爾茨海默症模型鼠腦內β-澱粉樣斑塊的清除作用和記憶認知能力改善作用研究

APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠是國際公認的阿爾茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)模型鼠，6月齡APPswe/PS1dE9轉基因腦內開始出現了老年斑，模擬人類中輕度阿爾茨海默症。4月齡APPswe/PS1dE9雙轉基因阿爾茨海默症模型小鼠連續60天，口服養血清腦顆粒48g生藥/kg(高劑量)和16g生藥/kg(低劑量)，或對照藥物安理 申1.03mg/kg至小鼠6月齡，發現口服養血清腦顆粒一個月和二個月後，小鼠記憶認知能力顯著提高，且作用效果優於陽性藥物安理申組。通過腦組織切片的剛果紅染色和免疫組織化學染色實驗，證明養血清腦顆粒清除早中期阿爾茨海默症模型鼠大腦β-澱粉樣斑塊(老年斑)的顯著作用，從小鼠大腦海馬區和皮質區β-澱粉樣斑塊(老年斑)的個數、覆蓋面積和著色程度方面，養血清腦顆粒對腦內老年斑的清除率達60至90%，顯著高於陽性藥物安理申組。人澱粉樣蛋白前體APP(β-amyloid precursor protein)的異常剪切是阿爾茨海默症發病的關鍵，進一步通過轉基因小鼠腦內APP的關鍵剪切酶和剪切產物的檢測，證明養血清腦顆粒通過提高腦內APP的生理性剪切途徑並抑制APP病理性剪切途徑，從而降低了β-澱粉樣斑塊在腦內的形成和沉積。本研究充分證明養血清腦顆粒對輕中度阿爾茨海默症有很好的治療效果。

1實驗目的

養血清腦顆粒是天士力集團有限公司生產的中藥複方製劑，臨床上主要用於治療頭痛，改善慢性腦缺血。在長期臨床觀察中，發現該藥還有一定的改善阿爾茨海默症的作用。本實驗室進行了該藥對早中期APPswe/PS1dE9雙轉基因阿爾茨海默症模型小鼠記憶、認知能力影響，特別是針對阿爾茨海默症特徵性病變-β澱粉樣蛋白A β在腦內的沉積，利用不溶性A β的特異染色、澱粉蛋白識別的剛果紅染色等手段，研究了養血清腦顆粒對早中期 APPswe/PS1dE9雙轉基因阿爾茨海默症模型小鼠腦內A β老年斑的清除作用，並通過蛋白剪切途徑的研究揭示其作用靶點和機制，為養血清腦顆粒用於治療輕中度阿爾茨海默症提供實驗依據。

2實驗材料 2.1受試藥品及配製

2.1.1受試藥物：養血清腦顆粒浸膏(簡稱養血清腦)，黑褐色浸膏，由天士力藥業集團提供，批號：20120514，出膏率13%，相當於每克浸膏含7.7g生藥，用生理鹽水配製成2.4g、0.8g生藥/ml濃度的溶液，供小鼠灌胃給藥用(文中劑量按生藥量計)，給藥體積為20ml/kg。小鼠用藥劑量為高濃度48g生藥/kg，低濃度16g生藥/kg。

陽性對照安理申，市售，每片5mg，衛材(中國)有限公司，批號：111030A，臨用時用生理鹽水按0.0515mg/ml製成混懸液，供小鼠灌胃給藥用，給藥體積為20ml/kg。小鼠用藥劑量為安理申1.03mg/kg。

2.2實驗動物與基因型鑒定

實驗動物APPswe/PS1dE9雙轉基因AD小鼠購自南京大學模式動物研究所。APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠是國際公認的阿爾茨海默症模型鼠。如圖1所示，APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠轉入了人的瑞典型突變APPswe和第9外顯子缺失突變的PS1dE9 2個基因，可表達人的突變型APP分子，異常剪切產生過量的A β 42多肽，在腦內形成A β斑塊及其他AD病變過程中的組織病 理變化，出現AD相應的行為學異常改變。據報導該品系4至5月齡小鼠時開始在杏仁體和海馬出現一些嗜剛果紅的斑塊(老年斑初期)，6月齡開始在大腦皮質、海馬和杏仁體形成大量澱粉樣斑塊，模擬人類中輕度阿爾茨海默症。

發明人對用於藥物測試的APPswe/PS1dE9雙轉基因AD小鼠進行了基因型鑒定。取鼠尾尾尖，加入裂解液和蛋白激酶K10mg/ml，56℃隔夜消化鼠尾。加入酚氯仿去除蛋白，異丙醇沉澱DNA,70%冰乙醇洗滌乾燥獲得鼠尾DNA。採用APPswe引物：5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’和5’-CTGACTGGTGAGCTGGTCCAAGAC-3’進行鑒定APPswe基因的PCR反應。反應條件：94℃ 30sec，69℃ 60sec，72℃ 60sec，30個循環。經PCR擴增，轉基因鼠中出現APP基因特異條帶，大小為350bp，而背景鼠無條帶產生。利用PCR方法對所有實驗鼠進行了基因型鑒定，保證了所有實驗鼠為陽性純合子的轉基因鼠，如圖1所示。

2.3實驗試劑及配製 2.3.1試劑

多聚甲醛(Sigma)、戊巴比妥鈉(Genview)、剛果紅、蘇木精、氧化汞(Sigma)、DAB顯色試劑盒(北京鼎國)、鼠兔通用型免疫二抗(Proteintech)、濃氨水、無水乙醇、濃鹽酸、甘油、甲醇、檸檬酸、檸檬酸三鈉、二甲苯(北京化工)。TEMED、丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺、Tris、Gly、考馬斯亮藍R250、BSA(Sigma)、Triton X-100(Genview)、蛋白質 標準分子量(北京全式金)、Tween-20(BBI)、兔抗鼠β-肌動蛋白抗體(武漢博士德)、HRP標記山羊抗兔IgG(北京全式金)、ECL光化學試劑盒(碧雲天)。

剛果紅染色液與蘇木精染色液：取0.5g剛果紅粉末和20ml甘油加至80ml甲醇中，配製成0.2%剛果紅染色液。取20g硫酸鋁鉀溶於200ml蒸餾水，100℃溶解。取蘇木精1g溶於10ml無水乙醇，加至硫酸鋁鉀水溶液中煮沸，加入0.5g氧化汞，繼續加熱並攪拌至溶液為深紫色，立即冷卻過濾，配製成蘇木精染色液。

2.4實驗主要儀器

Y型迷宮系統(RD1102-YM)，垂直電泳儀和電源系統(北京六一廠)，半乾轉膜儀(BIO-RAD)。DP70正置顯微鏡和攝影系統(OLYMPUS)，應用顯微鏡影像處理軟體DP Controller採集圖片。

3實驗方法 3.1實驗分組及給藥

實驗動物APPswe/PS1dE9雙轉基因AD小鼠隨機分為生理鹽水對照組、養血清腦顆粒低濃度組(本文有時簡稱養血低濃度組或養血低劑量組)、養血清腦顆粒高濃度組(本文有時簡稱養血高濃度組或養血高劑量組)和安理申組，雌雄各半，各組16隻，在實驗過程中，生理鹽水組和安理申組各有2隻死亡，每組14至16隻，體重20至40g。常規飼養，自由飲水，4月齡APPswe/PS1dE9轉基因鼠連續灌胃給藥，給藥容積每25g體重灌胃0.5ml。灌胃給藥至6 月齡。

3.2 Y迷宮實驗檢測小鼠記憶認知行為

Y迷宮儀器包括3個等長的臂，各夾角120°，呈Y字形。小鼠在封閉的空間內(Y迷宮)會本能的尋找出路，認知和空間記憶能力正常的小鼠會在尋找過程中探尋每一條路徑，而非總是重複已經探尋過的路徑。具體為將小鼠自Y迷宮的帶有小門的臂放入迷宮，將三個臂任意編號為A臂、B臂和C臂，小鼠在其內自由活動8分鐘，記錄小鼠的路線，如小鼠的路徑能夠依次循環(三個路徑中無重複)則記為正確，如出現錯誤路徑，則記為錯誤，並以該處為起點重新計路徑。最終計算公式中：正確率(%)=n/(總進臂次數-2)×100%，n是指正確的路徑數。例如：小鼠活動路線為ABCABCBACBACACBABCA，其中底線即為錯誤的路徑，n=16，總進臂次數為19，正確率(%)=16/(19-2)×100%=94.11%。

3.3小鼠心臟灌流固定及包埋切片

小鼠通過戊巴比妥鈉深度麻醉，麻醉後剪開小鼠的胸腔，將灌流針插入小鼠左心室內，同時剪開右心耳，灌入0.01M PBS(pH7.4)50-100ml，直到灌流液清亮為止。同時 再灌入4%的多聚甲醛50-100ml。灌流完成後，取腦，在4%多聚甲醛溶液中浸泡固定過夜。自動包埋機包埋後進行石蠟切片。片厚1.5μm。

3.4剛果紅染色檢測大腦內澱粉樣物質

石蠟片子取出後，在60至65℃烤片機上烤片30min。片子從烤片機上取下後浸泡於二甲苯中30min。按照無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、水、蒸餾水的順序依次脫水。蘇木精染色1min，氨水藍化。剛果紅染色1h後，鹼性分化液分化，按照80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇的順序脫水。二甲苯浸泡1min，風乾後，樹膠封片。腦內A β老年斑為澱粉樣物質，剛果紅染色後呈紅色。每張切片對皮質和海馬的紅色A β澱粉樣斑塊數量和面積進行測量和計算，取其平均值進行分析。

3.5免疫組織化學染色

1石蠟切片浸泡於二甲苯中30min。然後按照無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、水、蒸餾水的順序依次脫水。pH6.0檸檬酸高壓120℃修復2-2.5min，3%醫用消毒H2O2去除內源活性物質。加入APP β α抗體4h，鼠兔通用型即用二抗室溫孵育50min。DAB染色3min。蘇木精複染，氨水藍化，脫水。二甲苯浸泡1min，風乾後，樹膠封片。

3.6 β-澱粉樣斑塊計數

每張免疫組織化學染色切片對皮質和海馬隨機觀察3 個視野進行測量，計數每個視野下強陽性與弱陽性β-澱粉樣斑塊數量，取其平均值進行分析。

3.7 Western Bloting方法檢測小鼠大腦組織內α APPs、ADAM10和PS1的蛋白水平

剖離小鼠大腦組織，裂解超聲後用BCA蛋白定量試劑盒對其進行蛋白定量，之後將樣品等蛋白量進行SDS-PAGE，再電轉移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1h，依次滴加各種一抗α APPs、ADAM10或PS1，室溫2h，PBS洗3次。山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應1h，PBS洗滌3次。後用ECL光化學試劑盒(碧雲天)檢測信號，X光片曝光顯影。

抗體：ADAM10、PS1、β-肌動蛋白抗體購自博奧森公司。APP β α段抗體自主研發，選擇APP β剪切與α剪切之間的16胺基酸短肽DAEFRHDSGYEVHHQK(此肽段為纖維狀不溶性肽，是決定A β 42腦不溶性的關鍵區域)作為抗原，通過基因重組、測序，蛋白表達與純化，動物免疫和ProteinA/G純化獲得高效價的APP β α抗體。

3.8統計

將資料應用SPSS Statistics 17.0進行統計學分析。結果用散點圖結合平均值和平均值±標準誤表示，資料採用單因素方差分析結合LSD法進行組間比較。

4實驗結果 4.1一般觀察

轉基因小鼠4月齡時，已經出現精神損傷症狀，與背 景鼠相比進食量減少、自主活動減少，行動遲緩，精神萎靡，皮毛欠光澤等。給藥後，養血清腦顆粒組轉基因小鼠均有不同程度的改善，食量增加，精神好轉。

4.2 Y迷宮實驗證明養血清腦顆粒具有顯著改善早中期阿爾茨海默症動物模型小鼠記憶、認知能力的作用

Y迷宮實驗是用於檢測小鼠空間認知能力和短期記憶能力的一種操作簡單、應用廣泛的行為學手段。如表2和圖2所示，Y迷宮實驗證明養血清腦顆粒具有顯著改善早中期阿爾茨海默症動物模型小鼠記憶、認知能力的作用。如給藥中期一個月的檢測結果，生理鹽水正確率最低為79.59%，養血低濃度組和高濃度組的小鼠Y迷宮正確率平均值分別為86.10%和87.12%，安理申陽性對照組為80.67%。養血低濃度組和高濃度組都與對照組有顯著差別。給藥末期兩個月的行為學檢測結果，生理鹽水正確率最低為77.52%，養血低濃度組和高濃度組的小鼠Y迷宮正確率平均值分別為83.86%和85.64%，安理申陽性對照組為82.19%。養血高濃度組和養血低濃度組改善認知能力的作用效果顯著高於對照組。

所以，發明人的結果證明，給藥一個月和給藥兩個月，養血低濃度組和高濃度組的小鼠Y迷宮正確率與對照相比提高了近10%，具有顯著性；安理申陽性對照組雖然給藥兩個月時Y迷宮正確率有所提高，但未達到統計學差別。所以，結果證明養血清腦顆粒具有顯著改善早中期阿爾茨海默症動物模型小鼠記憶、認知能力的顯著作用。

註：與生理鹽水組比較*p<0.05，**p<0.01

4.3特異識別澱粉樣斑塊的剛果紅染色證明養血清腦顆粒具有顯著清除早中期小鼠腦內老年斑的作用

AD患者表現為額顳葉和海馬區等部位的中樞神經系統退行性的病變，A β澱粉樣斑塊是阿爾茨海默症特徵性的病變。A β的凝集和聚積是AD病理發生、發展的起始因素，而其他的病理改變如腦內神經纖維纏結、神經元的功能紊亂和丟失等，均被認為是由於A β的解離與凝聚、清除與產生的失衡所引發的。

阿爾茨海默症的特徵性病變是A β澱粉樣蛋白在腦內的沉積。甲醇剛果紅染色用於顯示澱粉樣物質，可以很好識別腦內澱粉樣A β蛋白的沉積。發明人發現通過2個月口服養血清腦顆粒小鼠的大腦皮層中A β澱粉樣斑塊個數和面積顯著減少，並且存在劑量相關性，養血高濃度組較低濃度組治療效果更加明顯(圖3至圖7)。

如圖3至圖5顯示對照組和實驗組大腦皮質區澱粉樣斑塊的剛果紅染色情況。生理鹽水組和安理申組腦內A β 澱粉樣斑塊數目多，養血清腦顆粒高濃度和低濃度組澱粉樣斑塊數目少。在雄性小鼠(圖4)和雌性小鼠(圖5)的大腦額葉皮質區，生理鹽水組和安理申組可以檢測到一定數目的嗜剛果紅染色的細胞外紅色的菊花樣斑塊，為AD特徵性澱粉斑塊，而養血清腦顆粒高濃度和低濃度組澱粉樣斑塊數目少，斑塊面積小。可見養血低濃度組和高濃度組具有顯著清除額葉皮質區澱粉樣斑塊沉積的作用，而對照藥物安理申對澱粉樣斑塊清除作用不顯著。

大腦海馬區是存儲短期記憶關鍵部位，也是人類處理長期學習與記憶空間定位的大腦區域。圖6是各組小鼠大腦海馬區的剛果紅染色，生理鹽水組和安理申組可檢測到澱粉樣斑塊的沉積，而養血清腦顆粒高濃度和低濃度組清腦顆粒海馬區周圍檢測不到澱粉樣斑塊的沉積。

發明人對全大腦的嗜剛果紅染色澱粉樣斑塊的數目進行了量化。如表3和圖7所示，從老年斑的個數來看，6月齡APPswePSEN1dE9轉基因鼠生理鹽水對照組腦內出現了顯著的老年斑，與之比較，陽性對照安理申組老年斑個數下降了37.5%，但是無顯著差別。非常顯著的是，與生理鹽水對照組比較，養血清腦顆粒低濃度組腦內老年斑減少了62.2%(p<0.05)，養血清腦顆粒高濃度組腦內老年斑減少了70.1%(p<0.01)。提示養血清腦顆粒具有顯著清除早中期小鼠大腦皮質區老年斑的個數的作用。

發明人對全大腦的嗜剛果紅染色澱粉樣斑塊的面積進行了量化。如表3和圖8所示，從老年斑的面積來看，安 理申作為一種乙醯膽鹼酯酶抑制劑發揮療效，因而降低大腦或海馬區β-澱粉樣斑塊沉積的作用不明顯。陽性對照安理申組老年斑面積比對照組下降了17.8%，但是無顯著差別。而與對照組比較，養血低濃度組腦內老年斑面積減少了61.4%(p<0.01)，養血高濃度組腦內老年斑面積減少了72.4%(p<0.01)。

以上結果證明，養血清腦顆粒具有顯著清除早中期小鼠腦內澱粉樣老年斑的作用，清除率達60至70%以上，高劑量養血清腦顆粒的作用更為顯著。市售的治療阿爾茨海默症的陽性藥物安理申作為一種乙醯膽鹼酯酶抑制劑發揮療效，因而降低大腦或海馬區β-澱粉樣斑塊沉積的作用不明顯。養血清腦顆粒對澱粉樣老年斑清除的治療效果明顯強於陽性藥物安理申。

註：與生理鹽水組比較，**p<0.01

4.4利用識別腦內不溶A β蛋白的APP β α特異抗體的免疫組化染色，證明養血清腦顆粒具有顯著清除早中期AD小鼠腦內A β老年斑的作用

人澱粉樣蛋白前體APP是一種阿爾茨海默症發病的關 鍵蛋白質，其發生β剪切形成的澱粉樣蛋白A β在腦內的沉積是阿爾茨海默症的主要病理特徵之一。APP正常情況下發生α分泌酶剪切途徑，產生胞外可溶性sAPP α蛋白。而在阿爾茨海默症的發生過程中APP在兩種蛋白酶即β-分泌酶和γ-分泌酶的先後作用下被剪切而產生42個胺基酸的A β肽，是AD的主要毒性物，至腦組織中神經元之間及突觸部位大量聚集，形成澱粉樣老年斑，可使大腦功能受損，導致記憶和認知障礙。目前的抗體多為A β段(β剪切與γ剪切的42肽)的抗體，無法識別特異性β剪切(檢測C段蛋白中同時包含β剪切蛋白和α剪切蛋白)，特別是對腦內可溶肽(生理)和不溶肽(病理)區分困難。

發明人選擇了A β 42肽中的N段β剪切與α剪切之間的16肽作為抗原，在檢測阿爾茨海默症病理剪切具有獨特的優勢。如圖9所示，首先A β 42肽的腦不溶解肽段發生由此16肽組成，所以此16肽抗體顯著提高識別腦內不溶蛋白(A β)的特異性檢測效率，將腦內不溶肽的檢測研究手段提高到新階段。抗體的製備和純化見方法部分，發明人應用此抗體檢測了養血清腦顆粒清除阿爾茨海默症轉基因鼠腦內A β肽沉積作用。

利用識別不溶性蛋白的APP β α特異抗體的免疫組化染色證明養血清腦顆粒具有清除小鼠腦內A β蛋白的顯著作用。如圖10至圖12所示，生理鹽水對照組和安理申組大腦內有A β不溶性蛋白的沉積，可被識別不溶性蛋白的APP特異抗體所識別。養血低濃度組和養血高濃度組都少 見A β不溶性蛋白的沉積。雄性AD模型鼠(圖11)和雌性AD模型鼠(圖12)在不同藥物作用2個月後，海馬區的A β蛋白的免疫染色出現顯著差別。對照組與安理申組海馬區能夠檢測到深染的不溶性A β老年斑，而養血低濃度組和養血高濃度組難以檢測到A β沉積。

發明人對各實驗組大腦皮層β-澱粉樣斑塊總的數量統計分析，如表4和圖13所示，從小鼠大腦強陽性A β老年斑數目來看，各實驗組與生理鹽水對照組比較都有顯著性差別，強陽性對照安理申組老年斑個數比對照組下降了67.7%，相對於生理鹽水對照組，養血低濃度組腦內老年斑減少了81.4%，養血高濃度組腦內老年斑減少了87.5%。相對於安理申組，養血清腦顆粒的治療效果更明顯，提示了高劑量養血清腦顆粒具有顯著清除早中期小鼠腦內A β蛋白的作用，並優於安理申組。

註：與生理鹽水組比較，**p<0.01

4.5養血清腦顆粒具有顯著促進早中期阿爾茨海默症動物模型腦內APP的生理性α剪切，並促進了可溶性神經營養性sAPP α蛋白的生成

人澱粉樣蛋白前體APP是一種阿爾茨海默症發病的關鍵蛋白質，APP的剪切機制分為兩種。正常機體APP發生生理性非澱粉樣的α分泌酶ADAM10剪切，並產生具有神經營養作用的sAPP α蛋白。而在阿爾茨海默病發生中，由β-和γ分泌酶介導，APP發生澱粉樣的病理性剪切。APP發生β和γ剪切形成的澱粉樣蛋白A β在腦內的沉積是阿爾茨海默症的主要病理特徵之一和最重要的分子機制。

APP的生理性α剪切的裂解產物sAPP α，不僅具有重要的神經營養作用，而且可阻礙A β的生成，對AD的治療具有重要意義。首先，通過抗體識別可溶性生理sAPP α的Western blot檢測證明了養血清腦顆粒具有顯著促進了生理性α剪切，並促進可溶性和神經營養性sAPP α蛋白的作用。APP發生α剪切產生的胞外可溶片段sAPP α，大小為66kD，如圖14所示，AD模型鼠腦內在生理鹽水條件下很少出現生理性剪切，sAPP α水平很低，與生理鹽水組相比，安理申組的sAPP α有所增加。養血低濃度、特別是養血高濃度組的sAPP α增加顯著。且養血高劑量組顯著高於陽性安理申對照組。APP正常情況下發生α分泌酶剪切途徑產生胞外可溶性APP肽具有神經營養作用，同時生理性α剪切產生的sAPP α與病理性β剪切具有顯著的拮抗作用。

α分泌酶ADAM10是執行APP生理剪切的關鍵酶。發明人檢測了各藥物組大腦內ADAM10的表達水平。6月 齡AD轉基因模型鼠在生理鹽水條件下大腦內ADAM10表達水平很低，說明很少出現生理性剪切。與對照組相比，安理申組ADAM10的表達變化不顯著。養血低濃度組、特別是養血高濃度組的ADAM10表達水平顯著增高(圖14)。

所以，發明人發現了養血清腦顆粒具有促進APP發生生理性α剪切的作用，養血清腦顆粒顯著提高鼠腦內α分泌剪切酶ADAM10的表達水平和腦內可溶性神經營養性sAPP α蛋白的生成，通過顯著提高了腦內APP的生理性α剪切，拮抗了病理性剪切途徑，其作用效果較陽性藥物安理申更為顯著。

養血清腦顆粒清除腦內老年斑的作用是通過抑制致病性γ分泌酶早老素PS1來實現的。轉基因鼠是PS1第9外顯子缺失突變的PS1dE9基因，早老素PS1基因突變是A β形成和AD治病的關鍵環節。如圖14所示，6月齡AD轉基因模型鼠在生理鹽水條件下大腦內早老素PS1dE9表達水平很高，而與對照組相比，安理申組PS1dE9表達變化不顯著。而養血低濃度、養血高濃度的早老素PS1dE9表達水平顯著下降，難以被檢測到。說明養血清腦顆粒通過抑制腦內致病性γ分泌酶早老素PS1的表達水平抑制APP的病理性剪切，從而減少腦內A β老年斑的沉積。

所以，發明人證明養血清腦顆粒具有顯著清除早中期阿爾茨海默症動物模型腦內老年斑的作用。這種分子機制主要通過雙方面來實現，如圖15所示。一方面，養血清腦顆粒通過抑制致病性γ分泌酶早老素PS1-dE9，從而抑制 APP的病理剪切A β過程，使腦內老年斑減少。另一方面，養血清腦顆粒通過促進生理性分泌酶α分泌剪切酶ADAM10的水平，促進了神經營養性sAPP α的生成，從而促進了APP的生理性剪切，拮抗了腦內A β的生成，使腦內老年斑進一步減少。

5小結

由上述結果，發明人證明瞭養血清腦顆粒具有顯著地治療輕中度阿爾茨海默症的作用。體現為兩個方面：首先，行為學上Y迷宮實驗結果表明，口服高濃度養血清腦顆粒(48g生藥/kg)和低濃度養血清腦顆粒(16g生藥/kg)一個月和二個月後，小鼠記憶、認知能力均較生理鹽水對照組有明顯提高，且作用效果優於陽性藥物安理申。即，養血清腦顆粒具有顯著地改善早中期AD模型小鼠的記憶、認知能力的作用。

更重要的是針對阿爾茨海默症的特徵性病變-A β蛋白沉積形成β-澱粉樣斑塊，養血清腦顆粒發揮了極其顯著的治療作用。將給藥2個月的早中期阿爾茨海默症模型小鼠腦組織製成切片，應用剛果紅染色和免疫組織化學染色實驗均證明了口服養血清腦顆粒的小鼠大腦海馬區和皮質區β-澱粉樣斑塊(老年斑)從個數、覆蓋面積和著色程度上都顯著降低(清除率達到60至90%)，效果遠遠高於安理申組。同時，提取小鼠腦組織的蛋白進行Western blot分析，證明養血清腦顆粒能夠促進β-澱粉樣蛋白前體APP的生理性α剪切，並抑制APP病理性剪切，從而降低腦 內A β的生成，從而發揮清除腦內A β-澱粉樣斑塊的顯著作用。

綜上，本研究充分說明了養血清腦顆粒對輕中度阿爾茨海默症具有很好的治療效果。

效果實驗二、養血清腦顆粒治療阿爾茨海默氏癡呆藥效學研究

本實驗採用Y迷宮、新物體辨別、Morris水迷宮及避暗等行為學實驗方法，考察了養血清腦顆粒對SAMP8快速老化小鼠及喹啉酸損毀Meyert基底核(NBM核)致癡呆大鼠學習記憶障礙的改善作用；並從大腦皮層及海馬神經細胞及突觸的形態學、膽鹼能神經系統功能、神經營養因子、自由基氧化損傷等方面探討了其改善學習記憶障礙的可能機制。

研究發現，養血清腦顆粒在小鼠935-3740mg/kg劑量、大鼠647-2588mg/kg(1至4倍人治療頭痛等症的臨床等效量)範圍內能夠劑量依賴性地增加癡呆模型小鼠及大鼠自發交替反應率、新物體辨別實驗中優先指數及辨別係數，縮短水迷宮實驗中到達安全台的時間及路程，延長水迷宮空間探索實驗中在原平臺所在象限的游泳時間和路程百分比，延長避暗實驗中逃避潛伏期，減少電擊次數。以上行為學結果表明，養血清腦顆粒能夠顯著改善癡呆模型動物工作記憶障礙、空間學習記憶障礙以及視覺辨別記憶能力等非空間學習記憶障礙，其高劑量組的作用與臨床等 效量的鹽酸多奈呱齊相近；HE染色結果表明，養血清腦顆粒能改善模型小鼠及大鼠神經元的病理改變；透射電鏡觀察發現，養血清腦顆粒能夠改善大腦海馬神經元超微結構的異常及突觸結構的異常；Western blot實驗結果顯示，養血清腦顆粒能夠顯著提高癡呆模型小鼠及大鼠大腦皮層及海馬組織中SYP及PSD-95的表達，對大腦皮層及海馬突觸新生標誌物GAP-43的表達未見顯著影響；免疫組化實驗結果表明，養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地提高SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中BDNF、NGF及其受體TrkA的表達；生化檢測結果表明，養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地提高總抗氧化能力及SOD、GSH-px活性，增加GSH含量，減少脂質過氧化產物MDA含量。顯著提高喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層及海馬組織中乙醯膽鹼的含量，提高海馬膽鹼乙醯轉移酶及大腦皮層M1膽鹼受體的表達。

綜上所述，養血清腦顆粒可能通過改善神經營養因子表達，對抗自由基損傷、抑制脂質過氧化反應等，保護神經元及突觸結構，提高腦內Ach、ChAT，改善中樞膽鹼能神經系統功能，進而改善學習記憶障礙。

第一部分：養血清腦顆粒對SAMP8小鼠學習記憶障礙的改善作用及機制探討

本實驗採用Y迷宮、新物體辨別、Morris水迷宮及避暗等行為學實驗方法，考察了養血清腦顆粒對SAMP8快速老化小鼠學習記憶障礙的改善作用；用HE染色方法觀 察小鼠大腦海馬組織結構的改變；採用透射電鏡觀察海馬神經細胞和突觸超微結構的變化；用免疫組化方法考察養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)及其受體TrkA表達的影響；用免疫印跡(Western blot)方法考察養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中突觸生長相關蛋白43(GAP-43)、突觸素(SYP)及突觸後緻密物95(PSD-95)表達的影響；用生化方法檢測大腦皮層組織中脂質過氧化產物丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量、總抗氧化的能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)的活性。

研究發現，養血清腦顆粒在935-3740mg/kg劑量(1至4倍人治療頭痛等症的臨床等效量)範圍內能夠劑量依賴性地增加SAMP8小鼠自發交替反應率、新物體辨別實驗中優先指數及辨別係數，縮短SAMP8小鼠水迷宮實驗中到達安全台的時間及路程，延長水迷宮空間探索實驗中在原平臺所在象限的游泳時間和路程百分比，延長避暗實驗中逃避潛伏期，減少電擊次數。以上行為學結果表明，養血清腦顆粒能夠顯著改善SAMP8小鼠工作記憶障礙、空間學習記憶障礙以及視覺辨別記憶能力等非空間學習記憶障礙，其高劑量組的作用與臨床等效量的鹽酸多奈呱齊相近；HE染色結果表明，養血清腦顆粒能改善SAMP8小鼠神經元的病理改變；透射電鏡觀察發現，養血清腦顆粒能夠改善大腦海馬神經元超微結構的異常及突觸結構的異 常；免疫組化實驗結果表明，養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地提高SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中BDNF、NGF及其受體TrkA的表達；Western blot實驗結果顯示，養血清腦顆粒3740mg/kg組能夠顯著提高SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中SYP及PSD-95的表達，對大腦皮層及海馬突觸新生標誌物GAP-43的表達未見顯著影響；生化檢測結果表明，養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地提高總抗氧化能力及SOD、GSH-px活性，增加GSH含量，減少脂質過氧化產物MDA含量。

綜上所述，養血清腦顆粒可能通過改善神經營養因子表達，對抗自由基損傷、抑制脂質過氧化反應等，保護神經元及突觸結構，進而改善學習記憶障礙。

一．實驗材料 1.實驗動物

7月齡雄性SAMP8小鼠，150隻，同齡空白對照鼠SAMR1小鼠25隻，清潔級，由天津中醫藥大學第一附屬醫院動物中心提供，合格證號：scxk(津)2008-0001，飼養於瀋陽藥科大學SPF級實驗動物中心，自由飲水攝食，12h循環光照。

2.藥物及配製

養血清腦顆粒：浸膏狀，由天津天士力製藥集團股份有限公司提供，批號20120502W，4℃至8℃保存。人的日服生藥量為45g，每一克浸膏相當於6.26g藥材，換算成小鼠的臨床等效量為935mg(浸膏)/kg。配製：精密稱取養 血清腦顆粒浸膏，加入蒸餾水，分別配成93.5mg/ml、187mg/ml及374mg/ml的溶液，為養血清腦顆粒的低、中、高劑量組藥物濃度。

鹽酸多奈呱齊片：衛材(中國)藥業有限公司，批號110707A，保存，30℃以下室溫環境貯存。臨床推薦最大劑量為10mg/d/人，換算成小鼠的臨床等效量約為1.3mg/kg。配製：取鹽酸多奈呱齊片，加入蒸餾水，配成0.13mg/ml的溶液。

3.試劑

氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司，批號20120221；磷酸氫二鈉：汕頭市西隴化工廠有限公司，批號100802；無水乙醇：天津市恒興化學試劑製造有限公司，批號20100327；多聚甲醛：天津市博迪化工股份有限公司，批號20111028；戊二醛：天津市博迪化工股份有限公司，批號20110906；二甲苯：天津市博迪化工有限公司，批號：20100505；檸檬酸：天津市博迪化工有限公司，批號：20100321；檸檬酸鈉：天津市博迪化工有限公司，批號：20100719；氫氧化鈉：天津市博迪化工有限公司，批號：20111102；鹽酸：瀋陽經濟技術開發區試劑廠，批號：20110612；中性樹膠：中國上海標本模型廠，批號：20101201；甲醇：天津市富宇精細化工有限公司，批號：120306；BCA蛋白定量試劑盒：碧雲天生物技術研究所；細胞裂解液：碧雲天生物技術研究所； PMSF：碧雲天生物技術研究所；PVDF膜：美國Pall公司；顯影粉、定影粉：碧雲天生物技術研究所；鼠抗SYP(D-4)：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-17750；鼠抗GAP-43：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-17790兔抗PSD-95：Abcam(Hong Kong)Ltd LOT：GR76077-1鼠抗β-肌動蛋白：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-41478；兔抗BDNF：北京中杉金橋生物技術有限公司，產品編號：E0112；兔抗NGF-β：Boster Biological Technology CO.,Ltd產品編號：3574102；兔抗TrkA：Boster Biological Technology CO.,Ltd，產品編號：9H121C；SP免疫組化染色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司；ZLI-9018濃縮型DAB試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司；Tris-base：BIOSHARP Amresco 0497；Glycine：BIOSHARP Amresco 0617；SDS：BIOSHARP Sigma L-5750 LOT 2012/09；Acrylamide：BIOSHARP Amresco 0341 LOT 2011/11； 亞甲雙丙烯醯胺：BIOSHARP Amresco；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物技術有限公司；脫脂奶粉：黑龍江省完達山乳業股份有限公司；高靈敏度化學發光檢測試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司；顯影定影試劑盒：碧雲天生物技術研究所；T-AOC總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所批號：20121220；SOD試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20121217GSH-px測試盒：南京建成生物工程研究所，批號：20121220；微量丙二醛測試盒：南京建成生物工程研究所，批號：20121212；GSH測試盒：南京建成生物工程研究所，批號：20121212。

4.實驗儀器

Morris水迷宮視頻分析系統：中國醫學科學研究院藥物研究所；自發活動視頻分析系統：上海吉量軟體科技有限公司；其他行為學實驗裝置：小鼠Y迷宮、新物體辨別、避暗裝置均為瀋陽藥科大學研製；石蠟包埋切片機：德國萊卡公司；光學顯微鏡：OLYMPUS公司；DP72-Color Video Camera：OLYMPUS公司； U-PMTVC 7C06559：OLYMPUS公司；Image-pro6.3圖像分析系統：OLYMPUS公司；超聲波清洗器：KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機：JY92-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司；TECAN酶標定量測試儀：SPECTRA CLASSIC；-80℃低溫冰箱：中科美菱；萬分之一天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；電子天平：常州市雙傑測試儀器廠；恒溫水浴裝置：BCFCO長風電子科技有限公司；H-1微型漩渦混合器：上海精科實業有限公司；電熱恒溫培養箱：DNP-9272，上海精密實驗設備有限公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：LDZX-40AI，上海申安醫療器械廠；高速冷凍離心機：HC-3018R，科大創新股份有限公司；微波爐：格蘭仕公司。

二、實驗方法 1．動物分組及給藥

將SAMP8小鼠隨機分為模型組、養血清腦顆粒935mg/kg(人臨床等效量)、1870mg/kg(2倍臨床等效量)、3740mg/kg(4倍臨床等效量)劑量組及鹽酸多奈呱齊1.3mg/kg組，每組30隻，另設SAMR1空白對照組25隻。各組小鼠灌胃給藥2個月後開始進行Y迷宮及新物體辨別實驗，給藥2個半月後進行Morris水迷宮及避暗實驗。進 行行為學實驗時繼續給藥，每天一次，直至實驗結束。

2.行為學實驗 2.1小鼠自發活動實驗

實驗裝置為四個長方形活動箱，內置紅外線探頭及攝像頭，自發活動視頻分析系統由上海吉量軟體科技有限公司提供。實驗時，將動物分別面壁放入四個活動箱中，每箱一隻。設置採集時間5分鐘，記錄動物活動總路程、活動時間以及平均速度等指標。

2.2小鼠Y迷宮實驗

裝置由三個成120°夾角的等長木製支臂組成，即迷宮的A、B、C三臂。每臂長40cm，高12cm，上寬10cm，下寬5cm。實驗時將小鼠放入A臂末端，讓其自由出入三個臂，記錄5min內每隻小鼠進入三個臂的順序及總次數(number of arm entries)，以連續進入三個不同的臂為一次正確交替反應(successive alternation)，記錄正確交替反應次數(number of alternation)。用自發交替反應率(alternation behavior；%)反映空間工作記憶能力。自發交替反應率(%)=交替反應次數/(N-2)×100(例如動物5min內進入三個臂的順序依次為ABCACBACCAB，則N為11，一次正確交替反應為：ABC、BCA、ACB、CBA、BAC、CAB。自發交替反應率(%)=[6/(11-2)]×100=66.7%)

2.3小鼠新物體辨別實驗

實驗裝置為一木製的正方形開放場，實驗分為適應階段和測試階段。將2-3隻小鼠放入開放場中自由探索3min 以適應環境，每天兩次，進行2天。測試當天，先將動物放入實驗場中自由探索3min以再次適應環境後，取出動物，將動物未曾見過的兩個完全相同的物體(A1、A2)置於裝置內距邊緣等距離的位置上，將小鼠置於距兩物體相等的位置，記錄5min內探索兩物體的時間(tA1、tA2)，之後，將小鼠取出放回鼠籠1h後，將裝置中一個物體換成一個在顏色、形狀及材質方面均不相同的新物體(B)，將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時間(tA1、tB)，將小鼠取出放回鼠籠。24h後，將物體B換成一個新物體(C)，將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時間(tA1、tC)。計算各組對新物體的優先指數及辨別係數，計算公式如下：優先指數計算公式如下：優先指數(1h)=tB/(tA1+tB)

優先指數(24h)=tC/(tA1+tC)

辨別係數計算公式如下：

辨別係數(1h)=(tB-tA1)/(tA1+tB)

辨別係數(24h)=(tC-tA1)/(tA1+tC)

2.4小鼠Morris水迷宮實驗

(1)定位航行實驗：每天上下午各進行1次Morris水迷宮訓練，連續5天。平臺置於第四象限中點，在平臺對側選兩個與之距離相等的點作為入水點，將小鼠面向池壁放入水中，採集60s，記錄小鼠從入水至找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)及游泳路程，然後，讓小鼠在平臺上休息10s。如果60s未找到平臺，潛伏期記為60s，並 將小鼠置於平臺上休息10s。每天在2個入水點各進行1次，以兩次潛伏期的算術均值作為這1天的成績進行統計分析。

(2)空間探索實驗：定位航行實驗後，撤除平臺，將小鼠放入原平臺對側象限中點的水中，自由游泳60s。迷宮系統自動記錄小鼠在原平臺象限停留的時間及平臺象限路程百分比等參數。

2.5小鼠避暗實驗

實驗裝置分明、暗兩室。兩室大小均為15cm×10cm×11cm，兩室之間有一直徑為3cm大小的半圓形門。兩室底部均鋪以銅柵，暗室底部由第四根銅柵起可以通電，電壓強度由一穩壓器控制。此法系利用鼠類的嗜暗習性，將小鼠面部背向門口放入明室，適應環境3min，然後通以30V電壓。小鼠進入暗室立即遭到電擊，然後從門口逃回明室，如此訓練5min，並記錄小鼠受到電擊的次數即錯誤次數，以此作為學習成績。24h後測驗，記錄第一次進入暗室的潛伏期、5min內的錯誤次數，以此作為記憶成績。

3. Western blotting方法 3.1組織蛋白質的提取

小鼠大腦皮層及海馬組織樣本放於-80℃冰箱儲存備用。按1：10比例加入蛋白裂解液，每1ml蛋白裂解液加5μl PMSF。用超聲細胞粉碎機勻漿後，冰浴中靜置30min，12000×g，4℃離心20min，取上清液，分裝，於-80℃冰箱儲存備用。取少部分上清液用於蛋白定量。

3.2蛋白濃度的測定-BCA法

根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50：1)配製BCA工作液，充分混勻。①蛋白標準品為5mg/ml BSA，完全溶解蛋白標準品，取10μL稀釋至100μL，使終濃度為0.5mg/ml，用PBS稀釋標準品。②將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl分別加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液(PBS)補足到20μl，每個濃度重複三次。③上述蛋白提取液用PBS稀釋10倍後，將20μl蛋白稀釋液加到96孔板的樣品孔中，每個樣品重複三次。④各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。⑤用酶標儀測定樣品在波長540nm處的吸光度。⑥根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

3.3蛋白印跡分析

①SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)的配製：組裝製膠玻璃板。配製分離膠液，充分混勻後，立即注入製膠玻璃板間隙，灌注至離玻璃板頂端3cm左右，用去離子水封膠，室溫大約聚合30至60min分離膠凝固，倒掉去離子水，盡可能吸乾分離膠表面的水。配製5%濃縮膠液，充分混勻，立即注入玻璃板間隙，插入梳子，避免混入氣泡，放置，室溫下聚合約60min。濃縮膠聚合後，拔除梳子，用去離子水沖洗梳孔，直接電泳或放入4℃冰箱備用。

②電泳：將樣品中的蛋白在SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳分離。根據BCA法蛋白定量的結果，上樣前調整樣品的蛋白濃度使其一致，加入 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液，100℃或沸水浴加熱5min，使蛋白充分變性。將凝膠放入電泳槽中，加入1×電泳緩衝液，每孔分別加入30μg總蛋白。電泳開始時電壓為80V，染料進入分離膠後，增加到180V，染料抵達分離膠底部時斷電。

③轉膜：在轉膜緩衝液中將蛋白質轉移至PVDF膜上。活化PVDF膜，將剪好的膜依次序浸入100%甲醇(10s)→去離子水(5min)→轉移緩衝液(大於10min)，同時濾紙和海綿墊浸入轉移緩衝液中(大於10min)。將結束電泳的濃縮膠除去。安裝轉膜裝置，從正極(紅色)→負極(黑色)依次為白色邊盒→多孔墊片→(2張)濾紙→PVDF膜→凝膠→(2張)濾紙→多孔墊片→黑色邊盒，扣上吊扣放進轉膜槽中。轉膜槽內兩側加冰盒，防止轉膜時過熱。接通電流(凝膠一邊接負極，PVDF膜一邊接正極)，恒流電轉移2h，電流為100mA。轉膜結束後，關閉電源，將膜取出。

④封閉和免疫反應：將膜放入封閉液中(用PBS緩衝液配置5%脫脂奶粉)，室溫輕搖2h，用封閉液配製一抗(SYP、GAP-43、PSD-95、β-肌動蛋白)，放入冰箱4℃過夜。用PBS室溫洗膜三次，Tris-Nacl室溫洗膜一次，每次10min。加上用封閉液配製辣根過氧化酶標記的二抗(1：3000)，室溫孵育2h。用Tris-Nacl室溫洗膜三次，每次10min。

⑤顯影：用ECL超敏發光液顯示免疫反應得到的條帶。顯影後用一抗二抗去除液進行膜再生，重新封閉，加 一抗、二抗，顯影。

⑥圖像掃描及定量分析：對X膠片進行灰度掃描，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟體進行分析，對樣品中目標蛋白進行定量。以β-肌動蛋白作為內參來確定組間目標蛋白表達的差異和變化。

①生化指標檢測

各組小鼠於末次給藥2h後斷頭處死，快速剝離大腦皮層組織，用預冷生理鹽水沖洗，除去血跡，濾紙拭乾，稱重後，將腦組織迅速浸入冷生理鹽水中(鹽水品質為腦組織品質的9倍)，在超聲波細胞粉碎機中製成10%的腦勻漿，以3000至4000r/min離心20min，取上清液，按照試劑盒說明進行生化檢測。

②病理組織學觀察 5.1取材

小鼠行為學實驗結束後，腹腔注射3.5%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，仰位固定於手術臺上，開胸暴露心臟。將灌流穿刺針從心尖部位插入左心室，同時右心耳剪一小口，先用約200-300ml生理鹽水灌流，待右心耳流出的液體變得無色澄清，剪尾無血時，換用300-400ml 4℃ 4%多聚甲醛緩衝液(0.1mol/L)灌流，直至軀體僵硬。斷頭取出整腦，置於4℃ 4%的多聚甲醛中固定。24h後，常規石蠟包埋，冠狀切片，厚度5μm，用於常規HE染色及免疫組織化學染色。每組另取4隻小鼠，4%多聚甲醛與2.5%戊二醛1：1混合液心臟灌流後，取1mm3海馬CA1區 組織，2.5%戊二醛固定，供透射電鏡觀察神經細胞超微結構。

5.2免疫組織化學染色

用鏈黴素抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)連接法進行免疫組化免疫組化檢測。原理：使用SP免疫組化染色試劑盒，用生物素標記的第二抗體與鏈黴素抗生物素蛋白連接的過氧化酶及基質色素混合液測定組織中的抗原。具體實驗步驟如下：組織切片脫蠟至水；微波抗原修復：切片置於盛有抗原修復液的容器中，抗原修復液為枸櫞酸鹽緩衝液(0.01M，pH 6.0)，置微波爐中高火加熱至沸騰，自然冷卻後，蒸餾水洗滌3min×3；3% H2O2 37℃孵育20min。PBS洗3min×3；滴加山羊血清封閉液37℃封閉30min，吸去多餘血清，滴加一抗(BDNF、NGF、TrkA)4℃孵育過夜，陰性對照以0.01M PBS緩衝液代替一抗；PBS洗5min×3；滴加生物素化二抗工作液(羊抗兔IgG-HRP)，37℃孵育15min，PBS洗5min×3；滴加辣根酶標記鏈黴卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS洗5min×3；DAB顯色，顯微鏡下觀察染色強度以控制反應時間，見切片中出現棕黃色顯色，立即自來水沖洗，終止染色；蘇木素複染3min；自來水洗；鹽酸酒精分化數秒，自來水充分水洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用光學顯微鏡觀察每個視野中陽性蛋白表達，用電腦圖像分析系統分別測定各組小鼠每張切片內表達陽性蛋白神經元的整合光密度值(intergrated opticaldensity,IOD)，以反應神經元內 陽性蛋白表達的相對含量。

5.3 HE染色

將石蠟切片進行常規HE染色，程式如下：石蠟切片常規脫蠟至水；蒸餾水洗2min，蘇木素染色3min，水洗5min，1%鹽酸酒精分化30s，自來水返藍8min，伊紅染色1min，自來水水洗3min；梯度酒精脫水，二甲苯透明2×5min，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

6.統計學方法

實驗資料以均數±標準差(

±SD)表示。採用SPSS17.0統計軟體進行相關統計學分析。組間差異用單因素或雙因素方差分析(Morris水迷宮實驗)和Dunnett’s t-test進行比較。p<0.05則認為差異存在顯著性差別三、實驗結果1養血清腦顆粒對SAMP8小鼠學習記憶障礙的改善作用1.1自發活動實驗

實驗結果顯示，在自發活動實驗中，各組小鼠的活動總路程、活動總時間以及平均速度未見顯著差異，提示養血清腦顆粒不會通過影響中樞神經系統興奮性而干擾後續的行為學實驗(見表5、圖16)。

1.2 Y迷宮實驗

實驗結果表明：各組小鼠進入Y迷宮三個臂的總次數之間未見顯著性差異(見圖17、表6)，提示養血清腦顆粒未對小鼠自發活動產生明顯影響。與空白對照組相比，模型組小鼠Y迷宮自發交替反應率顯著下降；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加了小鼠Y迷宮自發交替反應率(見圖18、表6)，提示養血清腦顆粒可改善小鼠工作記憶障礙。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001。

1.3新物體辨別實驗

實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠1h 及24h測試階段對新物體的優先指數和辨別係數顯著降低；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加了模型小鼠1h及24h測試階段對新物體的優先指數和辨別係數(見圖19、圖20、表7、表8)。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或**p<0.01。

1.4 Morris水迷宮實驗 1.4.1定向航行實驗

實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠在水迷宮實驗中到達平臺的游泳時間及路程顯著延長；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地縮短了小鼠到達平臺的游泳時間及路程(見圖21、圖22、表9、表10)。

註：A：空白對照組B：模型組C：鹽酸多奈呱齊組D：養血清腦顆粒組

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。。

註：A：空白對照組B：模型組C：鹽酸多奈呱齊組D：養血清腦顆粒組

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01。

1.4.2空間探索實驗

實驗結果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠在原平臺所在象限(第四象限)的游泳時間和第四象限路程百分比顯著下降；與模型組相比，養血清腦顆粒3740、1870mg/kg劑量組可顯著延長小鼠第四游泳時間和第四象限路程百分比(見圖24、圖25、表11)，各組小鼠空間探索實驗軌跡圖(見圖23)。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，*p<0.05。

1.5避暗實驗結果

實驗結果表明，與空白對照組相比，模型組測試階段 潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增加；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地延長了潛伏期，並減少了錯誤次數。見表12。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001或*p<0.05。

2 HE染色觀察海馬神經細胞病理變化

HE染色結果可見，空白對照組小鼠海馬CA1區神經元細胞結構清楚，排列緊密。模型組小鼠神經元排列疏鬆、染色質減少。養血清腦顆粒1870mg/kg組、3740mg/kg組及鹽酸多奈呱齊組小鼠神經元排列緊密，未見水腫及核固縮(見圖26)。

3電鏡觀察海馬CA1區神經元及突觸超微結構變化 3.1電鏡觀察神經元胞體超微結構

電鏡觀察可見，空白對照組神經元細胞輪廓清晰，核呈橢圓形，核內染色質分佈較均勻，核膜、核仁清楚，胞質內有豐富的核糖體、粗面內質網、線粒體及溶酶體等細胞器，超微結構正常；模型組神經元細胞核形不規則，有 切跡，見核仁，核膜部分模糊，核內異染色質有邊集，胞質內粗面內質網及高爾基複合體輕度擴張，線粒體外膜部分破損；多奈呱齊組神經元細胞核膜清楚，核內染色質分佈均勻，胞質內有豐富的核糖體、線粒體、粗面內質網、高爾基複合體及溶酶體等；養血清腦顆粒3740mg/kg組神經元細胞核呈橢圓形，核膜輪廓清楚，核仁清晰，核內染色質分佈均勻，胞質內有豐富的核糖體、粗面內質網、線粒體、高爾基複合體及溶酶體等細胞器，但粗面內質網有水腫，個別線粒體外膜破損；養血清腦顆粒1870mg/kg組神經元細胞輪廓清楚，核內有部分異染色質凝聚，胞質內有豐富的核糖體及線粒體，粗面內質網部分輕度擴張；養血清腦顆粒935mg/kg組神經元細胞核膜模糊，核內異染色質有部分邊集，胞質內有核糖體、粗面內質網、線粒體、溶酶體及高爾基複合體等細胞器，部分線粒體脊減少或外膜破損，粗面內質網擴張(見圖27)。

3.2電鏡觀察海馬CA1區神經元突觸超微結構

空白對照組可見多個突觸，結構正常，可見清晰的突觸前膜、突觸間隙及突觸後膜，前膜可見較多的突觸小泡；模型組多個突觸前後膜融合，間隙消失，部分後膜增厚，少量可見突觸間隙；多奈呱齊組突觸近乎正常，可見清晰的突觸前後膜，前膜內有較多的突觸小泡；養血清腦顆粒3740mg/kg組突觸近乎正常，可見清晰的前後膜，前膜內有較多的突觸小泡，個別前後膜有部分融合；養血清腦顆粒1870mg/kg組可見多數突觸後膜緻密物較厚，突觸間隙 寬窄不一，有的已融合；養血清腦顆粒935mg/kg組部分突觸前後膜融合或突觸間隙變窄(見圖28)。

4神經營養相關蛋白表達 4.1養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層及海馬BDNF表達的影響

BDNF能促進多種神經元的存活和生長發育，可提高神經元的生物活性，增加突觸終末的密度和促進樹突和軸突的生長。BDNF免疫組化陽性結果為神經元胞漿內出現棕黄色顆粒。結果顯示，空白對照組小鼠在海馬CA1區和皮層神經元胞漿着色較深；模型組小鼠神經元胞漿著色顯著變淺，多奈呱齊組、養血清腦顆粒1870mg/kg組及3740mg/kg組神經元著色較模型組顯著加深(見圖29至圖33、表13)。

與空白對照組相比，###p<0.001；與模型組相比， ***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

4.2養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層及海馬NGF表達的影響

神經生長因子(nervegrowthfactor，NGF)是一種經典的神經生長因子家族的神經營養因子，具有神經元營養和促進神經元突起生長雙重生物學功能。NGF免疫組化陽性結果為神經元胞漿內出現棕黄色顆粒。結果顯示，空白對照組小鼠在大腦海馬CA1區及皮質神經元胞漿着色較深；模型組小鼠神經元胞漿中著色顯著變淺，多奈呱齊組、養血清腦顆粒1870mg/kg組、3740mg/kg組神經元著色較模型組顯著加深(見圖34至圖38、表14)。

與空白對照組相比，##p<0.01，###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

4.3養血清腦顆粒對SAMP8小鼠腦內TrkA受體表達的影響

TrkA是一種分子量為140kD的跨膜蛋白質。當NGF與TrkA結合後，誘導細胞的增殖、分化和存活，抑制凋亡，增加神經元的興奮性並誘導表達TrkA的細胞釋放介質。TrkA受體免疫組化陽性結果為神經元胞漿內出現棕黄色顆粒。結果顯示，空白對照組小鼠在海馬CA1區及大腦皮質神經元胞漿着色較深；模型組小鼠神經元胞漿中著色顯著變淺，多奈呱齊組、養血清腦顆粒1870mg/kg組、3740mg/kg組神經元著色較模型組顯著加深(見圖39至圖43、表15)。

與空白對照組相比，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

5養血清腦顆粒對SAMP8小鼠抗氧化能力的影響

實驗結果如表16所示，與空白對照組相比，模型組小鼠大腦皮層脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的含量顯著增多，還原型谷胱甘肽(GSH)含量顯著減少，總抗氧化能力 (T-AOC)顯著降低，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)的活性顯著降低，與模型組相比，養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地增加T-AOC能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，減少MDA含量。

與空白對照組相比，###p<0.001,##p<0.01或#p<0.05；與模型組相比，***p<0.001,**p<0.01或*p<0.05。

6養血清腦顆粒對SAMP8小鼠大腦皮層及海馬突觸新生蛋白、突觸素及突觸後緻密物表達的影響

突觸體素，又稱突觸素(synaptophysin，SYP)是一種與突觸結構和功能密切相關的囊泡吸附蛋白，通過其磷酸化與去磷酸化作用調節神經遞質釋放、參與突觸發育，從而在突觸可塑性中發揮作用，是學習記憶過程中的重要分子。突觸素因其特異性定位於軸突終末的突觸囊泡膜上，故可用於標記突觸結構，反應軸突終末結構的分佈。突觸後緻密物(postsynaptic density,PSD)是指位於突觸後膜胞漿面電子密度較大的半圓形帶狀區域，是突觸部位非常敏 感易變的結構，是神經元與神經元之間進行資訊傳遞的結構基礎，在突觸的可塑性中發揮了重要作用，PSD-95又稱SAP90，是最先被鑒定出的PSD中含量豐富的骨架蛋白，屬於膜相關鳥苷酸激酶蛋白超家族的成員。 GAP-43(Growth associated protein-43)是一個軸突膜蛋白，是一種神經特異性的蛋白質，參與神經細胞外生長及突觸發育形成和神經細胞再生。Western blot結果表明，與空白對照組相比，模型組動物海馬及大腦皮層組織突觸素(SYP)及突觸後緻密物(PSD-95)的表達顯著減少；而與模型組相比，多奈呱齊組、養血清腦顆粒3740mg/kg組海馬及大腦皮層組織SYP及PSD-95的表達顯著增加，各組之間GAP-43的表達均未見顯著差異(見圖44至圖49，表17、表18)。

與空白對照組相比，###p<0.01；與模型組相比，**p<0.01，*p<0.05。

與空白對照組相比，###p<0.01或###p<0.001；與模型組相比，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

四 小結

1)Y迷宮、新物體辨別、Morris水迷宮及避暗等行為學實驗結果顯示，養血清腦顆粒在935-3740mg/kg(臨床治療頭痛等症的1-4倍等效量)劑量範圍內能夠劑量依賴性地改善SAMP8小鼠工作記憶障礙、空間學習記憶障礙以及視覺辨別能力等非空間學習記憶障礙，其高劑量組的作用與鹽酸多奈呱齊相近。

2)養血清腦顆粒能夠提高SAMP8小鼠大腦皮層及海馬組織中腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)及其受體TrkA的表達，改善海馬神經元超微結構的異常。

3)養血清腦顆粒能夠劑量依賴性地增加SAMP8小鼠大腦皮層總抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px 活性，減少MDA含量。

4)養血清腦顆粒能夠提高SAMP8小鼠大腦皮層及海馬突觸素及突觸後緻密物95的表達，改善海馬突觸結構的異常。

第二部分 養血清腦顆粒對喹啉酸毀損基底前腦Meyert基底核致癡呆大鼠學習記憶障礙的改善作用及機制研究

本實驗採用Y迷宮、新物體辨別、Morris水迷宮及避暗等行為學實驗方法，考察了養血清腦顆粒對喹啉酸損毀Meyert基底核(NBM核)致癡呆大鼠學習記憶障礙的改善作用；用HE染色方法觀察大鼠海馬組織結構的改變；採用透射電鏡觀察大鼠海馬神經細胞及突觸超微結構的變化；用免疫印跡(Western blot)方法考察養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬及大腦皮層突觸素(SYP)、突觸生長相關蛋白43(GAP-43)、突觸後緻密物95(PSD-95)及海馬毒蕈堿型乙醯膽鹼受體(CHRM1)表達的影響；用酶聯免疫(ELISA)方法考察對海馬及大腦皮層乙醯膽鹼(Ach)含量，海馬膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)含量及活性以及大腦皮層CHRM1含量的影響。

實驗結果表明，養血清腦顆粒在647-2588mg/kg劑量範圍內能夠劑量依賴性地增加喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠自發交替反應率，增加新物體辨別實驗中對新物體的優先指數及辨別係數，縮短水迷宮實驗中癡呆模型大鼠到達安全台的時間及路程，延長空間探索實驗中癡呆模型大 鼠在原平臺所在象限的游泳時間和路程百分比，減少避暗實驗被電擊次數。以上行為學結果表明，養血清腦顆粒能夠顯著改善喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠工作記憶障礙、空間學習記憶障礙以及視覺辨別能力等非空間學習記憶障礙，其高劑量組的作用與鹽酸多奈呱齊相近。養血清腦顆粒能夠改善海馬神經元超微結構的異常及突觸結構的異常；改善癡呆模型大鼠神經元的病理改變；劑量依賴性地提高海馬及大腦皮層SYP、PSD-95的表達，而對大腦皮層及海馬GAP-43表達未見顯著影響。提高大腦皮層及海馬Ach的含量及海馬ChAT的含量，但對海馬ChAT活性及CHRM1的表達未見顯著影響。綜上所述，養血清腦顆粒可能通過提高腦內SYP、PSD-95的表達，改善突觸結構的異常，提高腦內Ach及其合成酶ChAT含量，改善中樞膽鹼能神經系統功能，進而改善喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠學習記憶障礙。

一、實驗材料 1、實驗動物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，120隻，雌雄各半，體重180-220g，購於遼寧長生生物技術有限公司合格證號：scxk2010-0001；飼養於瀋陽藥科大學SPF級實驗動物中心，自由飲水進食，12h循環光照。

2、藥物及配製

養血清腦顆粒：浸膏狀，由天津天士力製藥集團股份有限公司提供，批號20120502W，4℃-8℃保存。人的日服 生藥量為45g，每1g浸膏相當於6.26g藥材，換算成大鼠的臨床等效量為647mg(浸膏)/kg。配製：精密稱取養血清腦顆粒浸膏，加入蒸餾水，分別配成64.7mg/ml，129.4mg/ml及258.8mg/ml的溶液。

鹽酸多奈呱齊片：衛材(中國)藥業有限公司，批號110707A，保存，30℃以下室溫環境貯存。臨床推薦最大劑量為10mg/d/人，換算成大鼠的臨床等效量約為0.95mg/kg。配製：取鹽酸多奈呱齊片，加入蒸餾水，配成0.095mg/ml的溶液。

3、實驗試劑

喹啉酸：SIGMA公司，批號：STBB0947V；水合氯醛：天津市瑞金特化學品有限公司，批號：20101124；火棉膠：天津市恒興化學試劑製造有限公司，批號：20110421；氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司，批號：20130221；磷酸氫二鈉：汕頭市西隴化工廠有限公司，批號：110802；磷酸二氫鈉：汕頭市西隴化工廠有限公司，批號：110223；無水乙醇：天津市恒興化學試劑製造有限公司，批號：20130327；多聚甲醛：天津市博迪化工股份有限公司，批號：20121028；戊二醛：天津市博迪化工股份有限公司，批號：20110906；二甲苯：天津市博迪化工有限公司，批號：20121205； 檸檬酸：天津市博迪化工有限公司，批號：20100321；檸檬酸鈉：天津市博迪化工有限公司，批號：20100719；鹽酸：瀋陽經濟技術開發區試劑廠，批號：20120304；蘇木色精：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20081215；中性樹膠：中國上海標本模型廠，批號：20101201；切片石蠟：上海華靈康復器械廠，批號：20120206；多聚賴胺酸：北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：050M4339；甲醇：天津市富宇精細化工有限公司，批號：20130306；BCA蛋白定量試劑盒：碧雲天生物技術研究所；細胞裂解液：碧雲天生物技術研究所；PMSF：碧雲天生物技術研究所；PVDF膜：美國Pall公司，LOT：K1BA3015GK；顯影粉、定影粉：碧雲天生物技術研究所，產品編號：P0019-4；鼠抗SYP(D-4)：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-17750；鼠抗β-肌動蛋白：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-41478；鼠抗GAP-43：Santa Cruz Biotechnology，產品編號：sc-17790；兔抗PSD-95：Abcam(Hong Kong)Ltd LOT：GR76077-1；兔抗CHRM1：博士德生物科技有限公司，產品編號：BA1544； 大鼠乙醯膽鹼酶聯免疫分析試劑盒：上海活樂生物科技有限公司，LOT：201301，4-8℃保存；大鼠膽堿乙醯轉移酶含量酶聯免疫分析試劑盒：上海活樂生物科技有限公司，LOT：201303，4-8℃保存；大鼠膽堿乙醯轉移酶活性酶聯免疫分析試劑盒：上海活樂生物科技有限公司，LOT：201301，4-8℃保存；大鼠毒蕈堿型乙醯膽鹼M1酶聯免疫分析試劑盒：上海活樂生物科技有限公司，LOT：201304，4-8℃保存；BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧雲天生物技術研究所；蛋白marker：Thermo scitific26616，Exp：2014/02；Tris-base：BIOSHARP Amresco 0497，LOT：2012/10；Glycine：BIOSHARP Amresco 0617，LOT：2012/11；SDS：BIOSHARP Sigma L-5750 Exp：2014/08；Acrylamide：BIOSHARP Amresco 0341，LOT：2011/11；亞甲雙丙烯醯胺：BIOSHARP Amresco，Exp：2014/08；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：107724；辣根酶標記山羊抗兔IgG：北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：101964；脫脂奶粉：伊利，批號：66196131T；高靈敏度化學發光檢測試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司，LOT：22912；Western一抗二抗去除液：Beyotime P0025；醫用X射線膠片：富士膠片株式會社，EXP：2015-07。

4實驗儀器

大鼠腦立體定位儀：NARISHIGE SR-5N，日本東京；自發活動視頻分析系統：上海吉量軟體科技有限公司；Morris水迷宮及視頻採集分析系統：：中國醫學科學研究院藥物研究所；行為學裝置：大鼠Y迷宮、新物體辨別、避暗裝置均為瀋陽藥科大學製作；石蠟切片機：德國萊卡公司。

光學顯微鏡：OLYMPUS公司；Image-pro6.3圖像分析系統：OLYMPUS公司；超聲波清洗器：KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機：JY92-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司；TECAN酶標定量測試儀：SPECTRA CLASSIC；-80℃低溫冰箱：中科美菱；萬分之一天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；電子天平：常州市雙傑測試儀器廠；恒溫水浴裝置：BCFCO長風電子科技有限公司；H-1微型漩渦混合器：上海精科實業有限公司；電熱恒溫培養箱：DNP-9272，上海精密實驗設備有限公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：LDZX-40AI，上海申安醫療器械廠；高速冷凍離心機：HC-3018R，科大創新股份有限公司；

二、實驗方法 1、喹啉酸損毀雙側基底前腦NBM核大鼠模型的建立

大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(350mg/kg體重)麻醉。剪去顱頂切口區毛，碘伏消毒後，固定在腦立體定位儀上。根據大鼠的腦立體定位圖譜確定大鼠NBM核位置(AP：B-1.4mm、ML：±2.4mm、DV：-7.5mm)，用牙科鑽鑽開顱骨，用微量注射器垂直進針，將2μl(含120nmol)喹啉酸(用0.1mol/L，pH 7.4 PBS緩衝液溶解)緩慢注入左側NBM核，留針5min，右側注射與左側保持一致。假手術組注入等量的PBS緩衝液。

2、分組與給藥

將SD大鼠隨機分為假手術組(陰性對照組)、模型組、鹽酸多奈呱齊0.95mg/kg組、清腦養血顆粒647mg/kg組(人臨床等效量)、1294mg/kg組(2倍人臨床等效量)、2588mg/kg組(4倍人臨床等效量)，每組17-21隻。各組均於造模後次日開始灌胃給藥，每天一次至行為學實驗全部結束。

3、行為學實驗方法 3.1大鼠Y迷宮實驗

大鼠Y迷宮實驗旨在通過自發交替反應的指標，考察受試藥物對大鼠工作記憶的影響。裝置由三個夾角為120°的木製支臂組成，分別為A、B、C三臂。實驗時將大鼠放入A臂末端，讓其自由出入三個臂，記錄8min內每隻大鼠進入三個臂的總次數number of arm entries(N)及進臂順序，以連續進入三個不同的臂為一次正確交替反應(successive alternation)，記錄正確交替反應次數(number of alternation)N。用自發交替反應率Alternation behavior(%)=number of alternation/(N-2)×100。

3.2大鼠新物體辨別實驗

實驗裝置由直徑為1.5米的黑色塑膠製成。測試前兩日，將2-3隻大鼠面向裝置壁放入實驗裝置中適應5min，每日兩次。測試當天，先將大鼠放入實驗裝置中並允許自由探索3min以適應環境後，取出。將2個完全相同的物體(A1、A2)置於距裝置壁等距離處，將大鼠再次放入裝置中，分別記錄5min內探索兩物體的時間(tA1、tA2)，每組另一半大鼠測試時改變物體A1、A2的顏色，以排除大鼠對顏色偏好。1h後，將其中一物體換成一個新物體(B)，將大鼠再次放入，分別記錄探索兩物體所用時間(tA1、tB)。24h後，將物體B換成一個新物體(C)，將大鼠再次放入，分別記錄探索兩物體所用時間(tA1、tC)。計算對新物體的優先指數及辨別係數。

優先指數計算公式如下：優先指數(1h)=tB/(tA1+tB) 公式(1)

優先指數(24h)=tC/(tA1+tC) 公式(2)

辨別係數計算公式如下：辨別係數(1h)=(tB-tA1/(tA1+tB) 公式(3)

辨別係數(24h)=(tC-tA1/(tA1+tC) 公式(4)

3.3大鼠自發活動實驗

大鼠自發活動實驗旨在考察受試藥物對大鼠大腦皮層興奮性的影響。實驗裝置為四個長方形活動箱 (45×45×13cm)，內置紅外線探頭及攝像頭，自發活動視頻分析系統由上海吉量軟體科技有限公司提供。實驗時，將動物分別面壁放入四個活動箱中，每箱一隻。設置採集時間15分鐘，記錄動物活動總路程、活動時間以及平均速度等指標。

3.4大鼠Morris水迷宮實驗

大鼠Morris水迷宮實驗旨在考察受試藥物對大鼠空間學習記憶能力的影響。

(1)定位航行實驗：每天上下午各進行1次Morris水迷宮訓練，連續4天。平臺置於第四象限中點，在平臺對側選兩個與之距離相等的點作為入水點，將大鼠面向池壁放入水中，採集90s，記錄大鼠從入水至找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)，然後讓大鼠在平臺上休息10s。如果90s未找到平臺，潛伏期記為90s，並將大鼠置於平臺上休息10s。每天在不同的入水點進行訓練。

(2)空間探索實驗：定位航行實驗結束後24h，撤除平臺，將大鼠放入原平臺對側象限中點的水中，自由游泳90s。水迷宮系統自動記錄大鼠在原平臺象限停留的時間及路程等參數。

3.5大鼠被動回避反應實驗(避暗實驗)

大鼠避暗實驗旨在考察受試藥物對大鼠長期記憶的影響。裝置為避暗箱(分為明室和暗室，明室上方以鎢燈照明，暗室中後部銅柵可以通交流電，兩室間有一直徑為6cm×4cm的門洞)。實驗分為訓練和測試兩部分。此法系利 用鼠類的嗜暗習性，訓練階段將大鼠背對門口放入明室，自由活動適應3分鐘後，待動物進入暗室，將洞門關上後通電。電擊大鼠5秒鐘後將洞門打開，動物會因為電擊疼痛而進入明室。若其再進入暗室，則繼續電擊，直到大鼠在明室的時間達到2分鐘，如此訓練5min。24h後進行測試，將大鼠放入避暗箱明室內，記錄5分鐘內其進入暗室的次數作為錯誤次數，以及大鼠自放入避暗箱明室至第一次進入暗室的時間作為潛伏期(s)，以此作為記憶成績。

4 Western blotting方法 4.1組織蛋白質的提取

大鼠海馬及皮層組織樣本放於-80℃冰箱儲存備用。按1：10比例加入蛋白裂解液，每1ml蛋白裂解液加5μlPMSF。用超聲細胞粉碎機勻漿後，冰浴中靜置30min。14000×g，4℃離心20min，取上清液，分裝，於-80℃冰箱儲存備用。取少部分上清液用於蛋白定量。

4.2蛋白濃度的測定-BCA法

根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50：1)配製BCA工作液，充分混勻。①蛋白標準品為5mg/ml BSA，完全溶解蛋白標準品，取20μL稀釋至100μL，使終濃度為1mg/ml。用PBS稀釋標準品。②將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl分別加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液(PBS)補足到20μl，每個濃度重複三次。③上述蛋白提取液用PBS稀釋10倍後，將20μl蛋白稀釋液加到96孔板的樣品孔中， 每個樣品重複三次。④各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。⑤用酶標儀測定樣品在波長540nm處的吸光度。⑥根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

4.3蛋白印跡分析

①SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)的配製：組裝製膠玻璃板。配製12%分離膠液，充分混勻後，立即注入製膠玻璃板間隙，灌注至離玻璃板頂端3cm左右，用去離子水封膠，室溫大約聚合30-60min分離膠凝固，倒掉去離子水，盡可能吸乾分離膠表面的水。配製5%濃縮膠液，充分混勻，立即注入玻璃板間隙，插入梳子，避免混入氣泡，放置，室溫下聚合約60min。濃縮膠聚合後，拔除梳子，用去離子水沖洗梳孔，直接電泳或放入4℃冰箱備用。

②電泳：將樣品中的蛋白在12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳分離。根據BCA法蛋白定量的結果，上樣前調整樣品的蛋白濃度使其一致，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液，100℃或沸水浴加熱5min，使蛋白充分變性。將凝膠放入電泳槽中，加入1×電泳緩衝液。每孔分別加入30μg總蛋白。電泳開始時電壓為80V，染料進入分離膠後，增加到180V，染料抵達分離膠底部時斷電。

③轉膜：在轉膜緩衝液中將蛋白質轉移至PVDF膜上。活化PVDF膜，將剪好的膜依次序浸入100%甲醇(10s)→去離子水(5min)→轉移緩衝液(大於10min)。同時濾紙和海綿墊浸入轉移緩衝液中(大於10min)。將 結束電泳的濃縮膠除去。安裝轉膜裝置，從正極(紅色)→負極(黑色)依次為→白色邊盒→多孔墊片→(2張)濾紙→PVDF膜→凝膠→(2張)濾紙→多孔墊片→黑色邊盒扣上吊扣放進轉膜槽中。轉膜槽內兩側加冰盒，防止轉膜時過熱。接通電流(凝膠一邊接負極，PVDF膜一邊接正極)，恒流電轉移2h，電流為100mA。轉膜結束後，關閉電源，將膜取出。

④封閉和免疫反應：將膜放入封閉液中(用PBS緩衝液配置5%脫脂奶粉)，室溫輕搖2h。用封閉液配製一抗(SYP，GAP-43，PSD-95，CHMR1)，放入冰箱4℃過夜。用PBS室溫洗膜三次，Tris-Nacl室溫洗膜一次，每次10min。加上用封閉液配製辣根過氧化酶標記的二抗(1：3000)，室溫孵育2h。用Tris-Nacl室溫洗膜三次，每次10min。

⑤顯影：用ECL超敏發光液顯示免疫反應得到的條帶。顯影後用一抗二抗去除液進行膜再生，重新封閉，加一抗、二抗，顯影。

⑥圖像掃描及定量分析：對X膠片進行灰度掃描，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟體進行分析，對樣品中目標蛋白進行定量。以β-肌動蛋白作為內參來確定組間目標蛋白表達的差異和變化。

5病理組織學觀察 5.1取材

大鼠行為學實驗結束後，腹腔注射3.5%水合氯醛 (350mg/kg)麻醉，仰位固定於手術臺上，開胸暴露心臟。將灌流穿刺針從心尖部位插入左心室，同時右心耳剪一小口，先用約200-300ml生理鹽水灌流，待右心耳流出的液體變得無色澄清，剪尾無血時，換用300-400ml 4℃ 4%多聚甲醛緩衝液(0.1mol/L)灌流，直至軀體僵硬。斷頭取出整腦，置於4℃ 4%的多聚甲醛中固定。24h後，常規石蠟包埋，冠狀切片，厚度5μm，用於常規HE染色。每組另取4隻大鼠，4%多聚甲醛與2.5%戊二醛1：1混合液心臟灌流後，取海馬CA1區組織，2.5%戊二醛固定，供透射電鏡觀察神經細胞超微結構。

5.2 HE染色

將石蠟切片進行常規HE染色，程式如下：石蠟切片常規脫蠟至水；蒸餾水洗2min，蘇木素染色3min，水洗5min，1%鹽酸酒精分化30s，自來水返藍8min，伊紅染色1min，自來水水洗3min；梯度酒精脫水，二甲苯透明2×5min，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

6統計學方法

實驗資料以均數±標準差(

±SD)表示。採用SPSS17.0統計軟體進行相關統計學分析。組間差異用單因素或雙因素方差分析(Morris水迷宮實驗)和Dunnett’s t-test進行比較。P<0.05則認為差異存在顯著性差別。

三、實驗結果 1行為學測試結果 1.1自發活動實驗

實驗結果表明，在自發活動實驗中，各組大鼠的活動總路程、活動總時間以及平均速度未見顯著差異，提示養血清腦顆粒不會通過影響中樞神經系統興奮性而干擾後續的行為學實驗(見表19)。各組大鼠自發活動軌跡圖見圖50。

1.2 Y迷宮實驗

實驗結果表明，各組大鼠進入Y迷宮三個臂的總次數之間未見顯著性差異(見圖51、表20)，提示養血清腦顆粒未對大鼠自發活動產生明顯影響。與假手術組相比，模型組大鼠自發交替反應率顯著下降；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加了大鼠Y迷宮自發交替反應率，鹽酸多奈呱齊組也顯著增加自發交替反應率(見圖52、表20)，提示養血清腦顆粒可顯著改善癡呆大鼠的工作記憶障礙。

表20 Y迷宮實驗中養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致

與假手術組相比，###p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。

1.3新物體辨別實驗

實驗結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠1h及24h優先指數和辨別係數顯著降低；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地提高1h及24h優先指數和辨別係數，鹽酸多奈呱齊組也顯著增加優先指數及辨別係數(見圖53、圖54，表21、表22)。

與假手術組相比，###p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

1.4 Morris水迷宮實驗 (1)定向導航實驗

實驗結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠在水迷宮實驗中到達平臺的游泳時間及路程顯著延長；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地縮短了大鼠到達平臺的游泳時間及路程，鹽酸多奈呱齊組也顯著縮短游泳時間及路程(見圖55、圖56、表23、表24)。

註：A：空白對照組B：模型組C：鹽酸多奈呱齊組D：養血清腦顆粒組

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

註：A：空白對照組B：模型組C：鹽酸多奈呱齊組D：養血清腦顆粒組

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

(2)空間探索實驗

實驗結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠在原平臺所在象限(第四象限)的游泳時間和第四象限路程百分比顯著下降；與模型組相比，養血清腦顆粒2588、1294mg/kg劑量組可顯著延長大鼠第四象限游泳時間和第四象限路程百分比，鹽酸多奈呱齊組也顯著延長第四象限游泳時間及路程百分比(見圖58、圖59、表25)，各組大鼠空間探索實驗軌跡圖見圖57。

1.5被動回避反應實驗

實驗結果表明，與假手術組相比，模型組被電擊次數顯著增加；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地減少了被電擊次數，鹽酸多奈呱齊組也顯著減少了被電擊次數(圖60、表26)。

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01，***p<0.001。

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01，***p<0.001。

2 HE染色觀察海馬神經細胞病理變化

結果可見，假手術組大鼠海馬CA1區神經元細胞結構清楚，排列緊密。模型組大鼠神經元排列疏鬆、水腫，染色質減少，核固縮。養血清腦顆粒2588mg/kg組及鹽酸多奈呱齊組大鼠海馬神經元排列緊密，未見水腫及核固縮，養血清腦顆粒1294mg/kg組大鼠神經元排列較緊密，有輕微水腫及核固縮(見圖61)。

3電鏡觀察海馬CA1區神經元及突觸超微結構變化 3.1電鏡觀察神經元胞體超微結構

電鏡觀察可見，假手術組神經元細胞輪廓清晰，核呈橢圓形，核內染色質分佈較均勻，核膜、核仁清楚，胞質內有豐富的核糖體、粗面內質網、較多的線粒體及溶酶體等細胞器；模型組神經元細胞核形不規則，核內異染色質有明顯的凝聚、邊集，胞質部分溶解，尚存的線粒體外膜模糊；多奈呱齊組及養血清腦顆粒2588mg/kg組神經元細胞核近圓形，核內染色質分佈均勻，核膜輪廓清楚，胞質內有豐富的核糖體、線粒體、粗面內質網和溶酶體等細胞器；養血清腦顆粒1294mg/kg組神經元細胞核圓形，核膜及核仁清楚，核內染色質分佈均勻，胞質內有較多的核糖體，粗面內質網多擴張、線粒體脊或外膜部分缺失，還見溶酶體等細胞器；養血清腦顆粒647mg/kg組神經元細胞核近圓形，核內染色質分佈均勻，胞質內有較多的核糖 體、線粒體、溶酶體和輕度擴張的粗面內質網等細胞器(見圖62)。

3.2電鏡觀察神經元突觸超微結構

神經元突觸超微結構可見，假手術組突觸結構清楚，可見明顯的突觸前膜、後膜及間隙。突觸前膜內有較多的突觸小泡，突觸後膜內緻密物厚度較均勻；模型組部分突觸結構紊亂，突觸前膜、後膜融合；部分可見突觸前膜、後膜及間隙；多奈呱齊組及養血清腦顆粒2588mg/kg組軸-樹突觸前膜、後膜清楚，結構清晰，前膜內有小泡，後膜緻密斑較厚；養血清腦顆粒1294mg/kg組部分突觸前膜、後膜融合，突觸間隙寬窄不一，部分突觸近於正常，可見明顯的突觸前、後膜及間隙。突觸前膜內有較多的突觸小泡，突觸後膜內緻密物厚度較均勻；養血清腦顆粒647mg/kg組突觸前後膜融合，後膜深染物質較少，突觸數量較少(見圖63)。

4突觸相關蛋白表達 4.1養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠海馬組織SYP，PSD-95及GAP-43表達的影響

Western blot結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織的SYP、PSD-95及GAP-43表達顯著減少；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加海馬組織中SYP、PSD-95的表達，對GAP-43的表達未見顯著影響，鹽酸多奈呱齊組能顯著增加這些突觸相關蛋白的表達(見圖64、圖65、圖66、表27)。

與假手術組相比，#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01

4.2養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠大腦皮層組織SYP、PSD-95及GAP-43表達的影響

Western blot結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠大腦皮層組織SYP、PSD-95的表達顯著減少；與模型組相比，鹽酸多奈呱齊組及養血清腦顆粒2588mg/kg組大腦皮層組織SYP的表達顯著增加；鹽酸多奈呱齊組、養血清腦顆粒2588mg/kg及1294mg/kg組PSD-95的表達均顯著增加；各組之間GAP-43的表達均未見顯著差異(見圖67、圖68、圖69以及表28)。

表28養血清腦顆粒對喹啉酸毀損NBM核致癡呆大鼠大腦皮層突觸素(SYP)、突觸後緻密物(PSD-95)及突觸生長相關蛋白(GAP-43)表達的影響(n=3，

±SD)。

與假手術組相比，##p<0.01，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01

5中樞膽鹼能神經系統功能檢測 5.1養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層及海馬組織Ach含量的影響

乙醯膽鹼(Ach)是最早發現的與學習記憶密切相關的神經遞質，膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)催化乙醯輔酶A的乙醯基與膽鹼在胞漿結合生成Ach。Ach合成後由突觸小泡載體轉運進入囊泡貯存，當有信號啟動時，Ach擴散至突觸後膜並與突觸後膜受體結合，發揮其生物學作用。乙醯膽鹼受體分為煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)與毒蕈堿型乙醯膽鹼受體(mAChR)。mAChR屬G蛋白偶聯的神經遞質，有5種亞型：M1-M5，大腦中主要存在位於突觸後膜的M1受體。ELISA結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠大腦皮層及海馬組織Ach的表達顯著減少；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加Ach的表達，鹽酸多奈呱齊組也顯著增加Ach表達(見圖70、圖71以及表29)。

表29養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬

與假手術組相比，#p<0.05，###p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。

5.2養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠海馬ChAT含量及活性的影響

ELIA結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中ChAT含量顯著減少；與模型組相比，養血清腦顆粒劑量依賴性地增加ChAT的含量，鹽酸多奈呱齊組也顯著增加其表達；ChAT的活性在各組之間未見顯著性差異(見圖72、圖73以及表30)。

與假手術組相比，###p<0.001；與模型組相比，**p<0.01， ***p<0.001。

5.3養血清腦顆粒對喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層及海馬組織CHRM1表達的影響

Western blot結果表明，大鼠海馬組織CHRM1表達在各組之間未見顯著差異；ELISA結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠大腦皮層組織中CHRM1的表達顯著減少；與模型組相比，養血清腦顆粒2588mg/kg組及鹽酸多奈呱齊組均顯著增加其表達(見圖74、圖75以及表31、表32)。

與假手術組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。

四、小結

1)Y迷宮、新物體辨別、Morris水迷宮及避暗等行為學實驗結果顯示，養血清腦顆粒在647-2588mg/kg劑量範圍內能夠劑量依賴性地改善喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠工作記憶障礙、空間學習記憶障礙以及物體辨別能力等非空間學習記憶障礙，其高劑量組的作用與鹽酸多奈呱齊相近。

2)養血清腦顆粒能夠顯著提高喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層及海馬組織中突觸素、突觸後緻密物95的表達，改善海馬突觸結構的異常。

3)養血清腦顆粒能夠顯著提高喹啉酸損毀NBM核致癡呆大鼠大腦皮層及海馬組織中乙醯膽鹼的表達，提高海馬膽鹼乙醯轉移酶及大腦皮質M1膽鹼受體的表達。

Claims (4)

1. 一種中藥組合物在製備用於清除腦內A β蛋白、降低腦內A β蛋白的生成的藥物中的應用，其中該中藥組合物係由以下重量配比的藥物製備而成：當歸6.75%、川芎6.75%、白芍5.4%、鉤藤13.5%、雞血藤13.5%、熟地黃5.4%、決明子13.5%、夏枯草13.5%、細辛1.34%、延胡索6.75%和珍珠母13.5%。
2. 如請求項1所記載的應用，其中，該藥物進一步用於增加大腦皮層總抗氧化能力及GSH含量，提高SOD、GSH-px活性，減少MDA含量。
3. 如請求項1所記載的應用，其中，該藥物進一步用於提高大腦皮層及海馬組織中乙醯膽鹼的表達，提高海馬膽鹼乙醯轉移酶及大腦皮質膽鹼受體的表達。
4. 如請求項1所記載的應用，其中，該中藥組合物係選自顆粒劑、丸劑、片劑、膠囊及口服液中的一種。

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