CN102548571A - 用于预防和治疗脑部疾病和疾病状态的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物柔毛水杨梅(Geum japonicum)的化合物、提取物和活性部位，以及预防或治疗脑部疾病或疾病状态的方法，所述脑部疾病或疾病状态例如缺血性中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知障碍(MCI)、慢性脑缺血和帕金森氏病。本发明提供的化合物，提取物和活性部位可配制为可用于所公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述化合物，提取物和活性部位在制备药物制剂和药物中的用途。

Description

用于预防和治疗脑部疾病和疾病状态的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年6月12日提交的美国临时申请第61/186,709号和于2009年6月17日提交的美国临时申请第61/187,905号的优先权，通过引用将上述申请的全部内容并入本文。

发明概述

本发明涉及治疗哺乳动物中的中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病的药物组合物和方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过促进生长新的侧支血管和诱导神经元再生来明显改善缺血脑部的脑血流的药物组合物和方法。恢复供血能改善缺血部位的微环境，增强神经再生能力可以诱导神经元的再生和替换死亡的神经元。因此，本组合物和方法可用于治疗人类的中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病，并可以恢复由于这些神经元退行性疾病而丧失的机体功能中的一部分。

一方面，本发明涉及柔毛水杨梅(Geum japonicum)的有机提取物(OEGJ)，其用于治疗中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病。本发明人已经发现OEGJ能发挥多种功能：(1)显著促进血管内皮细胞的管腔形成并能诱导脑缺血部位的血管重建，从而明显调整脑缺血并改善神经元生存的微环境；(2)增强神经细胞存活能力，从而保护有风险的神经元免于缺血和应激的伤害；(3)体外能诱导干细胞向神经细胞分化，体内能诱导神经元再生，以替换受损的或丧失的神经元。

中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病是严重的与脑血管相关并且与年龄相关的退行性疾病。解决这些疾病的根本病理变化的有效治疗应当包括两个目标：(i)通过诱导使脑中新的侧支血管生长，来重建缺血脑部的血流，和(ii)通过神经元再生以替代缺失的神经元。因此，按照一个实施方案，OEGJ能有效治疗中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病，并帮助受损脑部恢复部分丧失的功能，例如，语言能力、体力活动、记忆以及认知和学习能力。在另一个实施方案中，OEGJ能增强神经元应对风险或应激时的存活能力。在另一个实施方案中，OEGJ能延缓中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病的进展。在另一个实施方案中，OEGJ能预防高风险人群中的中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、慢性脑缺血和帕金森氏病。

一方面，本公开提供预防或治疗哺乳动物个体中的退行性神经元疾病或疾病状态的方法，所述方法包括：给予有需要的个体有效量的柔毛水杨梅有机提取物。在一个实施方案中，所述退行性神经元疾病或疾病状态包括缺血性中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知障碍(MCI)、慢性脑缺血和帕金森氏病。在一个实施方案中，与未给予所述柔毛水杨梅提取物的对照个体相比，所述给药增强患有缺血性中风的个体中脑血液灌注或诱导神经元再生。在一个实施方案中，所述柔毛水杨梅提取物诱导缺血脑部的血管生成，从而增强血液灌注。在一个实施方案中，所述柔毛水杨梅提取物诱导神经元再生。在一个实施方案中，与未用柔毛水杨梅提取物治疗的个体相比，所述柔毛水杨梅提取物使脑部缺血梗塞区域缩小。

在一个实施方案中，给予的所述柔毛水杨梅提取物的量为约0.001mg-1000mg提取物/千克个体体重/天。在一个实施方案中，所述柔毛水杨梅提取物是以包含药学可接受的载体的单位剂量形式进行给药。在一个实施方案中，所述柔毛水杨梅提取物是口服给药。在一个实施方案中，所述柔毛水杨梅提取物是通过皮下注射、肌内注射或静脉输注进行给药。

在一个实施方案中，所述提取物是柔毛水杨梅的低级烷基醇提取物。在一个实施方案中，所述低级烷基醇具有1-6个碳原子。在一个实施方案中，所述低级烷基醇是乙醇。在一个实施方案中，所述个体是人。

一方面，本公开提供用于治疗哺乳动物个体中退行性神经元疾病或疾病状态的药物组合物，其包含有效量的柔毛水杨梅有机提取物和药学可接受的载体。

附图简要描述

图1.OEGJ诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分化。(a)介质处理的细胞未表现出分化；(b)OEGJ(50μg/ml)处理的细胞表现出促进增殖的效应；(c)OEGJ(100μg/ml)处理的细胞呈现出细长的表型。部分细胞形成管样结构；以及(d)OEGJ(200μg/ml)处理的细胞。所有细胞都很好地分化为细长的管样结构。

图2.诱导干细胞向神经元分化。在体外，OEGJ或分离自OEGJ的活性部位能诱导间充质干细胞(MSC)向神经元分化。(a)显微镜照片显示出用所述OEGJ或分离自OEGJ的活性部位处理两天后未分化的MSC形态，其表现为扁平的、不规则的和非对称的细胞；(b)在相差显微镜下，细胞更加缩聚、折光性变强、形似星星并具有分枝；(c)对MSC处理4-6天后，MSC分化为神经元样细胞，具有小细胞体和发芽状轴突样突出；和(d)放大的显微镜照片显示MSC向神经元分化。

图3.多普勒超声检测显示OEGJ治疗增加了脑的血流灌注.(a)BCAL后5周，介质处理的大鼠的脑血流速度；和(b)BCAL后5周，OEGJ治疗的大鼠的脑血流速度，结果证实OEGJ治疗的大鼠的脑血流量显著增高。

图4.OEGJ治疗能诱导缺血性中风脑部的血管生成/新血管化。(sht)在OEGJ治疗动物脑的海马区周围观察到显著较多的血管(圈住的)；(shc)相比之下，在介质处理大鼠的海马区周围血管较少(圈住的)；(sct)在OEGJ治疗大鼠的额叶皮质区观察到较多的血管(圈住的)；以及(scc)在介质处理动物的相同区域观察到较少的血管(圈住的)。

图5.OEGJ在缺血性中风脑中诱导神经元再生。(对照-h)在介质处理大鼠的海马区几乎未观察到阳性绿色荧光信号(巢蛋白免疫组化染色)；(治疗-h)在OEGJ治疗动物的海马区检测到一些具有神经元形状和核负染的巢蛋白阳性绿色荧光信号(圆圈)，这表明神经元再生；(对照-c)在介质处理大鼠的额叶皮质区几乎未观察到巢蛋白阳性绿色荧光信号；以及(治疗-c)，在OEGJ治疗大鼠的额叶皮质区中发现一些巢蛋白阳性绿色荧光信号(圆圈)。

图6.利用多普勒超声对脑血流量的测定。(A)2VO后30天，介质处理的大鼠的脑血流速度；和(B)2VO后30天，OEGJ治疗的大鼠的脑血流速度。结果表明OEGJ治疗的大鼠的脑血流量显著较高。

图7.SAMP10小鼠的空间学习和记忆能力的水迷宫评价。SAMP10小鼠经一个月OEGJ治疗，停药30天后进行训练试验。图中的每个点代表4次训练的平均值。每天训练动物4次，训练5天。我们发现与介质处理的小鼠相比，OEGJ治疗的小鼠表现出显著较短的逃避潜伏期，P＜0.001。在寻找隐藏平台的耗时中与对照组相比集体存在显著的差异。各个柱形图表明平均值±标准差(n＝30)。

图8.SAMP10小鼠的额叶皮质区和海马中血管密度的测定。(a)具有代表性的OEGJ治疗的小鼠海马区显示出的血管显著多于(b)中介质处理的小鼠(P＜0.01)；(c)OEGJ治疗的小鼠的额叶皮质区中观察到的血管(圈住的)显著多于介质处理的小鼠(d)(P＜0.05)；(e)OEGJ治疗的小鼠中海马区的结构显示出相对完整、致密且较厚的颗粒细胞层；相比之下，(f)介质处理的小鼠中颗粒细胞层疏松且多孔。

图9.OEGJ能诱导SAMP10小鼠脑神经元再生。(sath)用Ki67特异性抗体免疫组化的方法，将小鼠的脑部切片进行染色，发现OEGJ治疗小鼠脑的海马区中存在Ki67阳性染色的颗粒神经元(圆圈)；(sach)介质处理的小鼠的海马区几乎未发现Ki67阳性染色的颗粒神经元；(sate)在OEGJ治疗的小鼠的额叶皮质区观察到一些Ki67阳性染色的神经元(圆圈)；相比之下，(sacc)在介质处理的小鼠的额叶皮质区很少发现Ki67阳性染色的神经元。

图10.APP小鼠的空间学习和记忆能力的水迷宫评价。每天训练动物3次，训练4天。在第五天，对小鼠进行空间探索试验。(对照)表示介质处理的小鼠。(治疗)表示OEGJ治疗。(a)介质处理的动物(对照)在发现隐藏平台中表现出的潜伏期显著长于OEGJ治疗的小鼠(治疗)(P＜0.01)。OEGJ口服给药(480mg/kg/天，持续1个月)显著缩短了治疗动物的逃避潜伏期(P＜0.01)；(b)最后一次训练试验后的第5天进行空间探索试验。两组动物在训练试验中平台所位于的目标象限中耗费的时间存在显著的差异。OEGJ治疗的小鼠(治疗)穿过平台的次数显著高于介质处理的(对照)(P＜0.01)；和(c)OEGJ治疗的小鼠(治疗)在受训的平台象限中耗费的游泳时间约占总游泳时间的40％。相比之下，个质处理组(对照)的小鼠在受训的平台象限中耗费的游泳时间的约占总游泳时间的26％，显著短于OEGJ治疗的小鼠(P＜0.01)。

图11.APP小鼠中新生血管的测定。(act)代表性的OEGJ治疗的小鼠的额叶皮质图像检测出的血管数(约78.5±19/HPF)显著多于介质处理的小鼠(41.7±8/HPF)(ace)(圆圈)；(aht)代表性的OEGJ治疗小鼠的海马区的图像显示出较多的血管(79.8±23/HPF)；相比之下，(ahc)在介质处理的对照小鼠的海马区观察到较少的血管(39.7±8.2/HPF)(圆圈)。

图12.APP小鼠的海马区的组织学评价。(a)和(b)OEGJ治疗的APP小鼠的两个半球的海马的水平截面；(c)和(d)介质处理的动物的两个半球的海马的水平截面。介质处理的小鼠的海马的所有CA区的锥形细胞层(箭头)(c和d)显著薄于OEGJ治疗的动物(a和b中的箭头)。介质处理的小鼠的DG颗粒细胞层内缘周围的很多齿状回(DG)颗粒神经元(箭头)(c和d)变形和死亡。相比之下，OEGJ治疗的小鼠的DG颗粒细胞层(a和b)保持完整；和(d)在某些介质处理的动物中，海马萎缩并且DG区部分地丧失。

图13.APP小鼠的脑神经元再生。(acc)用Ki67特异性抗体进行免疫组化染色的方法处理小鼠的脑部切片，结果显示介质处理的小鼠脑额叶皮质区中很少观察到Ki67阳性染色的神经元(圆圈)；(atc)而在OEGJ治疗小鼠的额叶皮质区中发现较多的Ki67阳性染色的神经元(圆圈)；(ach)在介质处理的小鼠海马区中很少观察到Ki67阳性染色的颗粒神经元(圆圈)；相比之下，(ath)在OEGJ治疗小鼠的海马区发现较多Ki67阳性染色的颗粒神经元(圆圈)。

图14.2VO大鼠的慢性缺血脑部的脑血流的多普勒超声评价。横轴表示时间，纵轴表示血液流速，。每个信号对应于一个心动周期。(A)实时二维图像显示OEGJ治疗动物的基底动脉(上图)和从基底动脉记录的多普勒血流信号(下图)；和(B)实时二维图像显示介质处理动物的基底动脉(上图)和从基底动脉记录的多普勒血流信号(下图)。

图15.OEGJ能在2VO大鼠的慢性缺血脑中诱导新血管生成。2VO后6周和OEGJ治疗后2周的额叶(a)和海马(c)的水平截面。2VO后6周和介质处理后2周的额叶(b)和海马(d)的截面。我们发现在OEGJ治疗动物的额叶皮质区(a)和海马周围(c)观察到的血管(圆圈)显著较多。相比之下，在介质处理的动物相似的区域内(b和d)观察到较少的血管(圆圈)。

图16.OEGJ在2VO大鼠的慢性缺血脑部中诱导神经元再生。(ich)介质处理大鼠的海马区的颗粒细胞层没有Ki67阳性染色的颗粒神经元；(ith)在OEGJ治疗的大鼠的海马区的颗粒细胞层中观察到数个Ki67阳性染色的颗粒神经元的核(圆圈)，这表明OEGJ诱导海马区神经元再生；(icc)介质处理大鼠的额叶皮质区未显示出Ki67阳性染色的神经元样细胞；和(itc)在OEGJ治疗大鼠的额叶皮质中观察到圈住的Ki67阳性染色的神经元样细胞的核，这表明OEGJ诱导皮质中的神经元再生。

发明详细描述

本公开通常涉及来自柔毛水杨梅的生物活性物质。具体而言，本公开涉及用于预防或治疗退行性神经元疾病状态的药物制剂和饮食补充剂，所述退行性神经元疾病状态包括中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知障碍、慢性脑缺血和帕金森氏病。本文提供的化合物可以配制为可用于公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述化合物和提取物在制备药物制剂和药物中的用途。

应当理解，为了提供对本发明的实质性理解，下文以不同详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方案、变化和特征。以下术语在全文中按下文所述使用，除非上下文明确指明另外情况。

本文中，试剂或药物对个体的“给药”包括将化合物引入或递送至个体以行使化合物预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行给药，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠或局部给药。给药包括自给药和由他人给药。还应当理解，所描述的治疗或预防医学疾病状态的各种模式意图表示“实质性的”，其不仅包括完全的治疗或预防，还包括未达到完全的治疗或预防，但实现了一些生物学或医学相关的结果。

本文所用的术语组合物的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”是足以实现所需治疗和/或预防效果的量，例如，实现了所治疗疾病相关的症状的预防或减少的量。给予个体的本发明组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。其还取决于疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员根据这些因素以及其它因素能确定合适的剂量。本发明的组合物也可以与一种或多种其它治疗化合物联合给药。

在没有特别指明的情况下，本发明所用的缩写“OEGJ”表示下文所述的植物柔毛水杨梅的有机溶剂提取物。

本文所用的术语“疾病”或“医学疾病状态”可交换使用，并且包括但不限于表现为一种或多种需要治疗和/或预防的身体和/或心理症状的任何疾病状态或疾病，并且包括之前鉴定出的和新近鉴定出的疾病和其它病症。例如，医学疾病状态可以是中风、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森氏病或慢性脑缺血。

本文所用的术语“个体”是指哺乳动物，例如人，但也可以是动物，例如，家畜(例如，狗、猫等)，农畜(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。

本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指治疗性处理以及预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其目的是预防或延缓(减轻)所针对的病理疾病状态或病症。如果个体按照本发明的方法接受治疗剂后，该个体具体疾病或疾病状态的一种或多种指征和症状表现出可观察到的和/或可测定的减少或缺失，则认为该个体被成功“治疗”了病症。

本文所用的病症或疾病状态的“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指在统计学样品中，相对于未处理的对照样品，化合物能减少处理的样品中病症或疾病状态的发生，或者相对于未处理的对照样品，化合物能延缓病症或疾病状态的一种或多种症状的发作或降低其严重程度。

本发明的组合物

本发明提供利用来自多种植物的提取物和化合物以及该化合物的衍生物治疗或预防多种疾病或医学疾病状态的方法，所述植物包括柔毛水杨梅；仙鹤草(Xian he cao)(也称为龙牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.)(蔷薇科(Rosaceae))；和野百里香(Thymus mongolicus Ronn)(唇形科(Lamiaceae))，地椒(Herba Thymi)或百里香(Mongolian Thyme Herb)。在一些实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅、仙鹤草、龙牙草(蔷薇科)、野百里香(唇形科)的全植物、提取物，所述提取物例如有机提取物。在具体实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。在一些实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅提取物的一个组分。

本发明提供利用来自多种植物的试剂和/或提取物和化合物以及该化合物的衍生物治疗或预防多种疾病或医学疾病状态的方法，所述植物包括柔毛水杨梅。在一些实施方案中，所述试剂是柔毛水杨梅的提取物，例如柔毛水杨梅的有机提取物。在具体实施方案中，所述试剂是柔毛水杨梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。

提供了制备柔毛水杨梅有机提取物的方法。该方法包括以下步骤：(a)用醇提取干燥的柔毛水杨梅全植物，所述醇选自C1-C4醇。该步骤可以室温下重复3-6次，通常5次。在进行步骤(a)之前，可以将植物材料制成粉末或切成小块。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。通常，添加的醇的重量是待提取的干燥柔毛水杨梅重量的1-10倍。

所述方法还可以包括以下步骤：(b)将获自步骤(a)的提取物干燥为干燥粉末；和(c)用C6烷、EtOAc和选自C1-C4醇的醇相继提取获自步骤(b)的粉末。C6烷包括具有6个碳原子的环状和非环状烷，包括，例如，环己烷、正己烷和新己烷等。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。所用的有机溶剂的重量通常是待进一步提取的粉末或小块重量的1-10倍。

上文所述的方法还可以包括过滤提取物以去除其中的任何不溶性粉末。可以在高于室温的温度下(例如50℃)的减压条件下完成干燥步骤或可以通过电喷雾完成干燥步骤。

为了纯化OEGJ，所述方法可以还包括以下步骤：将粉末施加到色谱柱；并用含有渐增浓度的选自C1-C4醇的醇的水性溶液洗脱柱。例如，可以使用Sephadex或反相柱。所用的醇可以是选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇的任何一种。

通过NMR分析，我们发现OEGJ通常主要含有单宁类和三萜类，所述单宁类包括gemin A、B、C、D、E和F，所述三萜类包括2-羟基齐墩果酸、2-羟基熊果酸、2，19-二羟基-熊果酸、2-α，19-α-二羟基-3-氧代-12-乌索烯-28-酸、熊果酸、epimolic acid、山楂酸、蔷薇酸、委陵菜酸，委陵菜酸的28-β-D-葡糖苷。

在一个实施方案中，本发明的化合物，提取物和活性部位是利用水和/或有机溶剂从植物原材料提取得到的，包括以下过程：

1.将水和/或有机溶剂添加到植物材料，将整体进行诸如浸泡/浸滤、超声或微波的处理而进行提取；

2.在提取过程之前或之后，利用石油醚、己烷或氯仿类型的溶剂进行脱脂；

3.任选地，利用乙酸乙酯或乙醚类型的有机溶剂对回收的提取物进行进一步提取；

4.任选地，将获得的粗提取物浓缩，并如果需要将其冻干。

一方面，考虑到允许获得的富集，粗提取物可以接受色谱纯化过程。在一个实施方案中，使用离心分配色谱(CPC)。该技术具体描述于A.P.FOUCAULT，Ed.，Centrifugal Partition Chromatography(离心分配色谱)，Chromatographic Science Series，Marcel Dekker Inc.，1995，68或W.D.CONWAY，Ed.，Countercurrent Chromatography apparatus theory andapplications(逆流色谱装置理论和应用)，VCH Publishers Inc.，1990。CPC是基于通过混合两种或更多种溶剂或溶液而制备的两种不混溶液相之间的溶质分配。所述两相中的一种通过离心力保持静止。溶剂、它们的比例和流速的选择与CPC柱中静止相的稳定性和实际压力密切相关。

因此，本领域技术人员能根据所需纯化的提取物的性质选择最合适的溶剂。这些不同的提取物，即粗提取物或富集的提取物，也在本发明的范围内。实施其它分离过程允许分离这些富集了一种或多种化合物的提取物。使用合适溶剂的按照适合于所选择的分离的比例的混合物，可以对从粗提取物富集的部分或对粗提取物自身进行这些分离。

用于预防或治疗中风的方法和组合物

当将氧和营养物运至脑部的血管被血块或某些其它物质堵塞(缺血性中风)或爆裂(出血性中风)时，就会导致中风。当发生缺血性中风时，脑部供血中断，脑细胞缺少它们存活和发挥功能所需的葡萄糖和氧。因此，受损区的脑细胞不能正常工作，这意味着它们所控制的身体部分也不能工作。所导致的损伤取决于脑细胞缺血的时间。如果脑细胞缺血时间较长，则脑细胞死亡，并且某些功能可能会不可逆地丧失。严重中风的破坏影响通常是永久的，因为死亡的脑细胞不能自然再生。

缺血性中风是最常见的中风类型，其占所有中风的约85％。当血块(血栓)形成并阻断将血运至部分脑部的动脉中的血流时，就会发生缺血性中风。缺血性中风还分为血栓性中风和栓塞性中风。当血块在脑部动脉内形成时，称为血栓性中风。其通常在夜晚或凌晨发生。另一区别特征是血栓性中风之前通常有暂时性脑缺血发作(TIA)或“中风前兆”。TIA的症状与中风相同，但在一小时以内就缓解了，而中风症状持续时间长得多。栓塞性中风是指脑动脉被动脉血流中来源于其它位置的血栓、运动颗粒或碎片所阻断。栓塞最常来源于心脏，特别是房颤，但是可以来源于动脉树的其它位置。

中风的特异性治疗可以包括破碎血块的药物(溶栓药物)、使血液不易凝固的药物(抗血小板药物和抗凝剂)以及手术。在很多基层中风处理中心中，组织纤溶酶原激活因子(tPA)药物用于溶栓和打通动脉。然而，在急性中风中使用tPA是有争议的。因为tPA能导致脑部和其它部位的出血，所以不应将tPA给予有出血倾向的人。为了能够有效并且安全，必须在缺血性中风发生的3小时内给予tPA。3小时以后，脑部的大部分伤害已不能逆转，出血的风险超过药物的可能益处。然而，准确查明中风开始的时间可能是比较困难的。因此，tPA仅可以用于少数已患有中风的人。如果不能使用溶栓药物，则大部分人都给予阿司匹林(抗血小板药物)，阿司匹林能减低再发生缺血性中风的风险。抗血小板药物使血小板不易聚集并形成凝块，因为血小板聚集并形成凝块是缺血性中风的常见原因。然而，抗血小板药物也有增加出血的风险。

中风后，脑部神经元可以分为以下3组：死亡神经元、存活神经元和休眠神经元，休眠神经元在较长的时间中缓慢收缩并退化。神经元不能再生是公认的，因此，在永久性组织损伤或神经元死亡发生之前挽救休眠神经元是至关重要的。但问题是神经元退化和死亡的病理学原因还不清楚现在有越来越多的证据表明：中风患者中神经元活性下降的原因可能是由于脑血流的减少，足够的脑血流是脑每个个体神经元持续发挥功能和存活所必需的。然而，有趣的是，已经观察到当供给脑部血液供应的大血管被阻断时，某些人没有症状或仅发生轻度中风，而其他人却发生严重缺血性中风。一种可能的解释是负责给脑供血的动脉之间存在额外连接的副动脉。某些人生来就具有较多的副动脉，当一条动脉被阻断时，这样的副动脉的存在就可以保护他们免于发生中风。而另一些人生来具有较少的副动脉，所以当一条脑动脉被阻断时，受损的区域可能就得不到足够的血供。因此，能促进脑新的副动脉或侧支血管的生长和增加血液灌注的补救措施预期能为缺血性中风提供有效治疗。

本发明人发现，OEGJ不仅能恢复缺血脑部的血液灌注，还能提高受应激压力的神经元的存活能力。所述组合物还能诱导间充质干细胞向神经元分化和诱导神经元再生。在一些实施方案中，一个或两个月的OEGJ治疗在缺血性中风的动物模型和人类中风患者中产生明显的治疗效果。因此，OEGJ可用于有效治疗和预防缺血性中风的方法，并且可用于中风后遗症的复原。

一方面，提供了用于治疗缺血性中风的药物组合物，其包含一系列来自OEGJ的天然化合物。OEGJ通过促进新的侧支血管的生长、保护神经元对抗凋亡、挽救受风险的神经元、促进神经元再生和促进缺血脑部的血液灌注，从而在治疗缺血性中风中表现出有效的治疗效果。

本发明人还发现，所述提取物不仅能通过增强神经元存活能力而保护神经元幸免于缺血和应激对其的伤害，还能在体外促进血管内皮细胞的增殖和分化(图1)，并且帮助恢复缺血脑部的血液灌注。此外，本发明人发现，该提取物的活性部位还能在体外诱导间充质干细胞(MSC)向神经元分化(图2)。

一方面，本发明提供治疗或预防有需要的个体中的中风或中风并发症的方法，包括给予所述个体有效量的本文所述的化合物、组合物、活性部位或提取物。所述提取物所改善的中风或中风并发症的效果可以是增加微循环、微血栓消失和改善的脑部血液灌注中的一种或多种。在一个实施方案中，预防或治疗中风的方法包括给予有需要的哺乳动物来自多种植物的试剂、活性部位和/或提取物和化合物以及所述化合物的衍生物，所述植物包括柔毛水杨梅。

另一方面，用于治疗或预防中风的试剂是含有一种或多种赋形剂、载体或填充剂的药物组合物的一部分。在一个实施方案中，所述药物组合物以单位剂量形式包装。当给予有需要的个体时，所述单位剂量形式能有效改善脑部微循环(例如，增加的微循环、微血栓消失和改善的血液灌注)。

在本发明的各个实施方案中，进行合适的体外或体内分析来确定本发明试剂(提取物、部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗或预防个体的中风。在一些实施方案中，使用中风的体内模型来评价试剂对个体的作用。

用于预防或治疗痴呆的方法和组合物

痴呆是一种进行性的且不可逆的脑部疾病，其中脑细胞的退行性病变导致思考能力和记忆力退化。最常见类型的痴呆包括阿尔茨海默病(AD)、血管性痴呆(VD)、路易体痴呆、额颞叶痴呆和轻度认知障碍(MCI)。AD是最常见的痴呆类型，在所有痴呆病例中占60-80％。淀粉样斑块在AD脑部中清晰可见(Selkoe，1991)。神经元外部和周围发现的淀粉样斑块通常是由淀粉样β(Aβ)蛋白的不溶性沉积物形成，淀粉样β(Aβ)蛋白是称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大蛋白的片段，对神经元生长、存活和损伤后修复至关重要(Glenner GG & Wong CW，1984)。AD的特征是脑皮质和海马区中神经元和突触的大量丧失。与正常脑相比，AD脑部表现出脑皮质和海马的萎缩。支配脑皮质和海马的基底前脑胆碱能神经元在认知和记忆中发挥重要作用。在AD的早期阶段，普遍公认的症状是记忆丧失，特别是短期记忆丧失。已有提示：这两个区中胆碱能神经元的初期萎缩导致轻度认知障碍(MCI)，并且其后续的退变导致AD。MCI是介于由于衰老的正常健忘和发展成为痴呆之间的阶段。

血管性痴呆(VD)通常由脑部特定部分的供血中断造成。当脑部血管变窄而使所支配的脑组织的血流量减少时，也能发生血管性痴呆。称为血管系统的血管网络向脑部提供氧。如果血管系统中存在堵塞或如果血管系统患病，血液就会被阻止到达脑部。由此引发脑部的细胞死亡，这会导致痴呆的症状，根据受损脑部的区域，症状在个体之间是不同的。继AD之后，血管性痴呆是痴呆的第二主要形式，在所有病例中占高达20％。

痴呆症状包括心智功能很多方面的障碍，包括语言、记忆、感知、情绪性行为或性格以及认知技能(例如计算、抽象思维或判断)。痴呆的早期症状可以包括语言问题，例如难以给出熟悉物体的名称、忘记东西所放的位置、在熟悉的路中迷路、性格改变和社交技能丧失、对之前喜爱的事物丧失兴趣等。随着痴呆恶化，症状更加明显并妨碍自理能力。

研究指出脑血管的病理改变是AD发展的重要因素(de la Torre，2004；Bell & Zlokovic，2009)。不同流行病学研究所报道的AD的危险因素包括充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律失常、高血压、心房颤动、动脉粥样硬化、衰老、缺血性中风、头部损伤和暂时性脑缺血发作，以上所有危险因素都与血管以及减少脑灌注相关。已有提示：慢性脑灌注不足(CBH)是AD的危险因素。已经发现CBH是MCI的促进因素并且是AD后续发展的最有效的预测因素(de la Torre，2006)。在抵抗力低下或年老的个体中，CBH导致特定脑区中亚细胞水平的进行性代谢改变，这会导致神经退行性状态并引起痴呆，所述特定脑区例如海马区和脑皮质。有证据支持AD主要是血管性疾病的观点，据报道直接对AD患者脑部进行的大网膜移位术能提供主观和客观的改善，特别是患者的功能状态(Goldsmithet al，2003)。之前的研究表明：直接将完整网膜置于动物和人的脑部后，两个脑半球的脑血流显著增加(Goldsmith et al，1990)。多个血管生长穿过网膜-脑界面，然后这些血管垂直地和深入地穿透入脑部，从而来自网膜的血流通过所述血管灌注到脑中(Goldsmith，2001)。因此，大网膜移位术后在AD患者中观察到的改善可能就是由于脑血流增加。

本发明人发现，包含OEGJ的本发明组合物能显著促进脑供血不足区域的血管物理重建，这会明显改善神经元的生存微环境；所述组合物能增强细胞存活能力，保护神经元免于缺血性和应激损伤；并且所述组合物还能在体外诱导间充质干细胞(MSC)向神经元分化，即可理解为神经元再生。基于OEGJ的对血管和神经元有益效果和痴呆的病理生理学，OEGJ能增加脑部供血、增强神经元存活和神经元再生，并因此改善AD和VD个体的学习和记忆能力。

一方面，本发明提供治疗或预防有需要的个体中的包括阿尔茨海默病在内的痴呆的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本文所述的化合物、组合物、活性部位或提取物。阿尔茨海默病或其症状的待改善的效果可以是以下中的一种或多种：海马和新皮质区的APP阳性染色；皮质、胼胝体和海马中增加的tau-2染色；胼胝体、扣带回、丘脑和皮质中的活性小胶质细胞和星形胶质细胞；皮质和胼胝体中TNF-α和NF-κB增加的表达；侧脑室周围和胼胝体内小胶质细胞的增加或增殖；侧脑室和CA1海马的壁中嗜刚果红A的沉积；穹窿、前海马和CA1海马的病变；以及记忆缺损。这些病理学和炎症指征和症状是人类中阿尔茨海默病的特征。一方面，所述预防或治疗阿尔茨海默病的方法包括给予有需要的哺乳动物来自多种植物的试剂、活性部位和/或提取物和化合物以及该化合物的衍生物，所述植物包括柔毛水杨梅。

在本发明的各个实施方案中，进行合适的体外或体内测试来确定本发明试剂(提取物、部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗或预防个体中的阿尔茨海默病。

用于预防或治疗帕金森氏病的方法和组合物

帕金森氏病(PD)是神经退行性病症，其影响中枢神经系统的基底神经节，主要是称为黑质的区域(Lees et al，2009)。黑质中的神经元通常产生神经递质多巴胺并投射到基底神经节的最大组成部分纹状体。黑质中多巴胺能神经元的丧失是PD的标志，其导致纹状体中多巴胺供给不足，这会导致协调肌肉运动的基底神经节中神经回路活性的改变。因此，PD患者的运动受到影响。PD患者的典型症状包括四肢无意识震颤、肌肉僵直、无法运动或开始和保持运动的迟缓以及姿态不稳。PD是进行性疾病，所以症状随时间恶化(Halliday & McCann，2010)。

诸如认知障碍、行为和语言问题的次要症状也可以发生在PD患者中，特别是晚期PD患者。随着疾病的进展，诸如痴呆的认知障碍会折磨大多数患者(Leverenz et al，2009)。PD的认知缺陷从疾病早期的细微执行功能障碍变化成晚期的痴呆。PD患者发展为痴呆的风险增加6倍。许多研究证实，PD患者中痴呆的患病率能达到28％-44％(Mayeux et al，1992；Aarsland et al，1996；Hobson & Meara，2004)。由于年龄、中风和动脉硬化造成的黑质供血中断会使该区域的多巴胺能神经元失去足够的氧和营养物供给，这最终会导致这些多巴胺神经元死亡。

一方面，本发明提供治疗或预防有需要的个体中的帕金森氏病的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本文所述的化合物、组合物、活性部位或提取物。帕金森氏病或其症状的待改善的效果可以是僵直、颤抖、运动迟缓、平衡障碍和多巴胺能神经元丧失中的一种或多种。一方面，所述预防或治疗帕金森氏病的方法包括给予有需要的哺乳动物来自多种植物的试剂、活性部位和/或提取物和化合物以及该化合物的衍生物，所述植物包括柔毛水杨梅。另一方面，用于治疗或预防帕金森氏病的试剂是含有一种或多种赋形剂、载体或填充剂的药物组合物的一部分。在一个实施方案中，所述药物组合物以单位剂量形式进行包装。当给予有需要的个体时，所述单位剂量形式能有效改善僵直、颤抖、运动迟缓、平衡障碍和多巴胺能神经元丧失。

在本发明的各个实施方案中，进行合适的体外或体内测试来确定本发明试剂(提取物，部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗或预防个体中的帕金森氏病。在一些实施方案中，使用帕金森氏病的体外模型来评价试剂对个体的效果。

用于预防或治疗慢性脑缺血的方法和组合物

脑血流是指在任何给定时间的脑部供血。脑部供血的突然破坏会导致中风。另一方面，慢性脑灌注不足的慢性脑缺血是指脑血流的下降缓和而持久并且下降得太低而不能满足脑组织的正常代谢需要的疾病状态。一旦脑组织开始缺血，称为缺血级联反应的生物化学级联反应被触发，这会造成脑组织的损伤以及最终的脑细胞死亡。

衰老被认为是导致慢性脑缺血的常见因素。随着年龄增大，人的血管系统中发生显著的功能和结构异常。最常见与衰老相关的血管变化是血管壁逐渐变厚和变硬以及血管腔变窄。总的结果的是受损脑区的血流进行性减少或甚至完全中断。据报道，脑血流随年龄表现出显著的逐年减少(Frackowiak et al，1980；Buijs et al，1998)。根据最近的研究，老年个体中的平均总脑血流比健康年轻个体低约1/3(Spilt et al，2005)。慢性脑缺血还与很多病理生理学因素相关。脑缺血的一些可能原因包括心衰、动脉硬化相关的或淀粉样斑块相关的脑动脉狭窄、内皮依赖性血管舒张障碍和脑部小血管病(Spilt et al，2005)。慢性脑缺血的症状包括头痛、头晕、高血压、癫痫和神经障碍。

除神经退行性病症之外，脑缺血还被鉴定为在大部分神经病理学中造成新生儿中脑缺氧缺血的首要发病机制。脑缺氧缺血最可能是由于胎盘血流和气体交换的中断。围产期发生的缺氧缺血性脑损伤是儿童中严重长期神经缺陷的最通常公认的原因之一(Perlman，1997)。因为脑缺血已被鉴定为神经退行性病症的重要触发因素，因此预计改善脑血流能减轻症状并延缓相关病症的开始。

本发明人发现，OEGJ治疗能明显改善脑部缺血区的供血和神经元的生存微环境。更重要的是，本发明人已进一步证实了OEGJ在治疗人类慢性脑缺血中的卓越功效。在一个实施方案中，2-4周OEGJ治疗(2-3g/天)几乎能治愈患者的临床表现。

药物组合物的制剂和剂量

在本发明的各个实施方案中，进行体外或体内测试来确定本发明试剂(提取物、部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗个体所患疾病或医学疾病状态。这些分析的实例在上文中结合具体疾病或医学治疗进行了描述。

通常，足以实现治疗或预防效果的本发明组合物的有效量为约0.000001mg/千克体重/天至10,000mg/千克体重/天。合适的情况下，剂量为约0.0001mg/千克体重/天至2000mg/千克体重/天。示例性的治疗方案为每天一次或每周一次或每月一次给药。通常多次给予所述试剂。单次剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。或者，可以以缓释制剂的形式给予所述试剂，在这种情况下，需要给药的频率减少。剂量和频率根据试剂在个体中的半寿期而不同。给药的剂量和频率可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，在长期以相对低频率的间隔给予相对低的剂量。某些个体在余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直至疾病的进展降低或停止，并优选地直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善。在此之后，可以给予患者预防方案。

毒性

合适的情况下，本文所述的试剂的有效量(例如，剂量)能提供治疗益处，而不会产生对个体的明显毒性。可以通过标准药学程序在细胞培养或实验动物中确定本文所述的试剂的毒性，例如，通过测定LD₅₀(半数致死量)或LD₁₀₀(绝对致死量)。治疗指数(半数致死量与半数有效量的比值)。获自这些细胞培养测试和动物研究的数据可以用于参考制定人类中使用无毒性的剂量范围。合适的情况下，本文所述试剂的剂量处于包括有效剂量且仅具有很小的毒性或无毒性的血液循环浓度的范围内。根据所用剂型和给药途径，剂量可以在该范围内变化。确切的制剂、给药途径和剂量可以由医师根据个体的疾病状态来选择。参见，例如，Fingl et al，In：The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ch.1(治疗的药理学基础，第一章)(1975)。

根据本发明的方法，可以将所述试剂合并到适于给药的药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物可以包含适于对个体进行给药的形式的纯化的或基本纯化的柔毛水杨梅提取物和药学可接受的载体。在其它实施方案中，所述药物组合物所包含的药学可接受的载体在一定程度上由所给予的具体组合物以及用于给予组合物的具体方法决定。因此，适于给予组合物的药物组合物制剂有很多种(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18^th ed.，1990)。通常将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品与药品管理局的所有良好生产规范(GMP)规程。

当形容组合物、载体、稀释剂和试剂时，术语“药学可接受的”、“生理学容许的”以及其语法变体可交换使用，并且表示该材料能够给予个体，并且不会产生需要禁止组合物给药的程度的不希望的生理学影响。例如，“药学可接受的赋形剂”表示该赋形剂可用于制备通常是安全的，无毒性的且满足需要的药物组合物，并且还包括兽医用途以及人类制药用途能接受的赋形剂。这些赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者对于喷雾剂组合物来说，可以是气体。本领域技术人员可容易地确定本发明的具体药物和组合物的合适的给药时机、顺序和剂量。

这些载体或稀释剂的合适的实例包括但不限于，水、盐溶液、林格氏液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和诸如不挥发性油的非水性载体。这些介质和化合物在药学活性物质中的使用是本领域公知的。除了与所述试剂不相容的任何常规介质或化合物之外，其它介质或化合物可用于组合物中。还可以将补充性活性化合物合并到组合物中。

本发明的药物组合物的配制符合其预期的给药途径。本发明的组合物可以通过以下途径给药：胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂。所述试剂可以任选地与在治疗各种疾病中至少有一定效果的其它试剂联合给药。

胃肠外、真皮内或皮下施用的溶液或悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的化合物，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以装入安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在可溶于水的情况下)或用于临时制备无菌注射液或分散液的分散剂和无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。无论在什么情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动性应当易于注射。其在生产和贮存条件下必须稳定，并且必须能抵抗诸如细菌和真菌的微生物的污染活动。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包被、保持需要的颗粒尺寸(在分散液的情况下)和施用表面活性剂来保持合适的流动性。可以利用各种抗菌和抗真菌化合物实现微生物活动的预防，所述抗菌和抗真菌化合物例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸，硫柳汞等。在很多情况下，优选在组合物中包含等渗化合物，例如糖，诸如甘露醇、山梨醇的多元醇，氯化钠。可以通过在组合物中包含延缓吸收的化合物实现注射组合物的持续吸收，所述化合物例如单硬脂酸铝和明胶。

可以通过将所需量的试剂合并入含有一种上文所列成分或上文所列成分的组合的合适的溶剂中然后视情况进行过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将结合剂合并到含有基本分散介质和上文所列的所需其它成分的无菌介质中来制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而从之前过滤灭菌的溶液得到活性成分和任何其它所需成分的粉末。可以以积存注射(depot injection)或植入制剂的形式给予本发明的试剂，植入制剂的制备形式能允许活性成分的持续释放或脉冲释放。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将口服组合物封装在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药，结合剂可以与赋形剂合并，并用于片剂、锭剂或胶囊的形式。还可以使用用于漱口水的流体载体来制备口服组合物，其中流体载体中化合物是经口施用、漱口和吐出或吞下。药学相容的结合化合物和/或辅助材料可以作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下述成分或具有相似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解化合物，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂化合物，例如蔗糖或糖精；或调味剂化合物，例如薄荷油、水杨酸甲酯或桔子香精。

在一个实施方案中，所述试剂与能保护所述试剂免于从体内快速清除的载体一起进行制备，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送体系。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法对于本领域技术人员是显而易见的。还可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc购买所述材料。脂质体悬液(包括靶向于感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可用作药学可接受的载体。可以根据本领域已知的方法进行制备，例如，美国专利第4,522,811号中的描述。

实施例

通过以下实施例进一步阐述本技术，但这些实施例不应解释为以任何方式进行限制。

实施例1.从柔毛水杨梅分离活性提取物

在以下实施例公开的实验中，提取物获自植物柔毛水杨梅。该植物是在7月份从中国江西省庐山采集的，进行干燥(50kg)，并用80％乙醇(500L)在室温下浸泡3天，共进行两次。将提取物汇合在一起，并进行喷雾干燥，从而得到固体残留物(5kg)。将固体残留物悬浮于10倍体积的H2O中，并用10倍体积的己烷和氯仿相继萃取两次。然后，使用70％乙醇(10倍体积)回收残余物两次。将溶于乙醇的部分过滤，并进行喷雾干燥，得到固体粉末部分。

间充质干细胞(MSC)的向神经元分化

使用生物活性导向技术来筛选植物活性成分，从而鉴定出表现出促进血管生成和诱导干细胞向神经元分化的双重作用的化合物的组成。在筛选植物提取物预期的诱导双重作用的过程中，鉴定出柔毛水杨梅有机提取物(OEGJ)。我们发现OEGJ能在低浓度下显著促进血管内皮细胞增殖。较高浓度时，该提取物在体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分化(图1)和间充质干细胞向神经元分化(图2)。当将提取物(200μg/ml)作用于间充质干细胞时，在提取物处理后3天，我们发现扁平的、形状非对称且不规则的大鼠骨髓来源的MSC中约10％被诱导分化成收缩的、折光性好并且分枝的细胞。此外，在提取物处理后8天，这些折光性好并且分枝的细胞进一步分化为具有小的致密细胞体和多个长的树突样延伸的神经元样细胞。因此，OEGJ具有使MSC沿着神经生成分化谱系开始分化的能力。因此，OEGJ可以促进神经元再生，从而取代中风、阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病和血管性痴呆中受损的神经元。

生物统计学

所有形态测量数据都是通过盲法收集的。结果表示为平均值±标准差。使用非配对双尾Student t检验确定两组测量结果之间比较的统计学显著性。P值＜0.05认为具有显著性。

实施例2.OEGJ在治疗缺血性中风的疗效

实施例中使用动物的的所有操作规程符合美国国家卫生研究院颁布的实验室动物饲养和使用指导，并得到张江高科技园区的动物实验伦理委员会的批准。

缺血性中风的动物模型和治疗方案

按照之前使用的方法(Mayzel-Oreg et al，2004；Steiner et al，1980)，通过手术在SD大鼠中引发缺血性中风。简而言之，通过颈部右侧的正中切口暴露颈动脉分叉周围的颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。在颈动脉分叉近端结扎CCA。利用注射器将含有约1000个微球(80-150μM)的盐溶液(0.5ml)朝向颈动脉分叉注射入ECA。在注射位点的远端结扎ECA并解除CCA的结扎之后，注射的微球进入ICA，从而导致脑中的多发性梗塞缺血性中风。手术后1天，按照Benderson et al.开发的神经学分级系统(Benderson et al.，1986)评估动物的神经状态。然后，按照所分配的级别将大鼠分为2组，使得每组中的大鼠具有大体上相似的等级。用OEGJ治疗受试组(n＝12)4周(口服给药，480mg OEGJ/千克体重，用水配制OEGJ)。将等量的水口服给予介质处理组(n＝16)中等同数量的动物。介质处理对照组中大鼠较多的原因是介质处理对照组中的死亡率较高。

在手术引发中风后，评估了介质处理对照大鼠和接受OEGJ治疗的大鼠的运动和神经学表现。例如，在经历手术引发的中风之后，测试了成年动物的一系列标准任务。OEGJ治疗的动物的改善指标包括检测受试动物的力量、平衡性、灵活性和精细动作技巧等一系列指标在内的改善，并且OEGJ治疗的动物的改善还包括受损组织的较好修复。

基底动脉血流的多普勒超声评价

在结扎后实验中，利用多普勒超声测量了目标动脉的血流速度(BFV)。脑部血流动速度的超声测量有助于提供中风发生后关于脑供血重新分配的信息。我们发现手术栓塞后6小时右侧CCA中BFV降低的百分比为正常对照的20-53％。手术后1周，除神经元损伤表现的症状外，BFV有恢复的趋势。这些结果表明：神经元损伤与脑血流速不相关。因为通过诱导新的侧支血管生长而增加缺血脑部的血流是中风实质性治疗的最关键步骤之一，因此，在本研究中，我们也使用了通过永久结扎双侧颈总动脉产生的脑缺血大鼠模型。我们结扎了SD大鼠中双侧颈动脉(BCAL)，并以此为模型进行研究。手术操作在1周内的死亡率为约20％。将12只存活动物分为受试组(n＝6)和对照组(n＝6)。将OEGJ(480mg/kg)口服给予受试组大鼠5周，给予介质处理对照组大鼠等量的水。

我们研究了实验大鼠基底动脉的BFV。仅关注基底动脉的BFV测量的理由是该血管对双侧颈动脉闭塞性疾病的侧支通路的贡献最大。在OEGJ治疗的第5周，用东芝超声扫描仪的12-MHz线性探针测量基底动脉的BFV。取3次重复测量结果的平均值作为动脉的BFV。通过组织病理学研究证实颅内侧支循环的存在。通过多普勒超声测定，我们发现为了代偿由于BCAL而降低的血流量(通常贡献脑部60％的血流量)，对照组大鼠血压比正常血压显著增加了25％，从而能泵出比基底动脉正常基础血量多约30％的血液(图3)。相比之下，在OEGJ治疗组的大鼠中，不仅血压保持正常，而且血流量比基底动脉正常基础血量增加了约90％，占脑部正常总血量的76％(图3)。为了排除OEGJ具有血管扩张效应的可能性，在OEGJ治疗5周后，停止OEGJ给药。在停止OEGJ治疗后2周再次测定血流量。所获得的结果与OEGJ治疗的第5周时获得的结果相似，这表明OEGJ治疗诱导脑部新的侧支血管生长，这会降低小动脉或微血管的外周阻力，从而实现显著更多的脑部血流量，并且不会升高血压。

OEGJ诱导的中风脑部中的新血管化

从手术后7周处死的中风大鼠取出脑部，在福尔马林中固定，石蜡包埋。组织切片(5μm厚)用H&E染色。在光学显微镜高倍镜视野(HPF)(40倍)下，对额叶皮质内和海马区周围的血管进行计数，从而确定组织切片样品的血管密度。观察了额叶内或海马区周围的6个随机且非重叠HPF，对每个切片的所有血管进行计数。取每个HPF的血管数的平均值，并将其表示为每个HPF的血管数。由2个研究人员以双盲法的方式进行血管计数。我们发现在OEGJ治疗的大鼠中，额叶皮质区内的血管数为约51.16±16/HPF，海马区周围的血管数为61.66±21/HPF(图4)。相比之下，在介质处理的大鼠中，额叶皮质区内的血管数为约34.2±12/HPF，海马区周围的血管数为38.5±7.5/HPF(图4)。

神经元再生

从每一组织块切下薄切片(5μm厚)，并用抗Ki67和巢蛋白的特异性抗体进行免疫组化染色。Ki-67蛋白是细胞增殖的标志物，其与细胞增殖严格相关。在分裂间期，Ki-67抗原仅能在细胞核内检测到，而在有丝分裂期，大部分蛋白迁移到染色体表面。Ki-67蛋白在细胞周期的所有活动期(G₁、S、G₂和有丝分裂期)都存在，而在静止细胞(G₀)中缺失。巢蛋白为200-220kDa，其是胚胎中枢神经系统祖细胞的主要中间丝状体(IF)蛋白。巢蛋白是快速生长过程中神经上皮干细胞的标志物。在某些神经元的轴突延伸的过程中，巢蛋白集中在生长锥，并且可以在生长锥引导中发挥作用。因此，我们使用Ki67和巢蛋白作为脑部神经元再生的标记物。通过对切片的显微镜检查，在整个脑部各处发现多发性梗塞区，例如在额叶、海马、颞叶和顶叶。还发现OEGJ治疗不仅能刺激脑新的侧支血管的生长(图4)，还能诱导额叶和顶叶的皮质中和海马中的神经元再生，就如阳性Ki67和巢蛋白免疫组化染色所示(图5)。相比之下，在未治疗的对照脑部中，既未鉴定到显著的脑部新侧支血管的生长(图4)，也未发现新的神经元细胞的显著再生(图5)。总之，这些观察结果提示OEGJ不仅能刺激缺血脑中新的侧支血管的生成，还能诱导受累脑部的很多区域中的神经元再生，从而代替死亡的神经元。

缺血性中风的实质性治疗的最关键步骤是重建供血来恢复神经元生存和发挥功能的微环境，以及使神经元再生来代替死亡的神经元。这些结果表明，OEGJ满足这两个要求；因此，OEGJ可用于治疗缺血性中风。

实施例3.用OEGJ治疗重度人缺血性中风患者

基于上文中从OEGJ增强血管内皮细胞分化和缺血脑中新的侧支血管的生成以及OEGJ在体外诱导MSC向神经元分化和动物模型中的明显治疗效果中所得到的非常具有前景的结果，对于中风动物模型中观察到的OEGJ介导的明显治疗效果是否能成功用于临床应用中的可能性，在人道同情治疗的基础上在中风患者中进行了测试。我们的初步临床试验在缺血性中风患者(2名女性患者和2名男性患者)中进行，已完全告知患者的家庭成员并获得了书面同意。

来自台湾的1名女性患者在治疗前约2年发生了重度缺血性中风，其表现出语言能力完全丧失，无法行走或站立，丧失几乎所有其它体力活动的能力，例如自我进食、移动手臂或腿。认知障碍严重，使得她不能理解非常简单的语言或手势，并且不能认出家庭成员或熟悉的事物，因此她的表现几乎类似植物人患者。然而，通过2个月的OEGJ治疗(口服给药，2g/天)，她的语言能力、记起家庭成员姓名和身份的能力以及部分的体力活动能力逐渐恢复。此外，该治疗还显著改善她的视力并恢复部分的认知能力，例如学习玩麻将电子游戏和打电话。

来自上海的另一名女性患者在治疗前约2年发生了首次脑中风，其具有显著的认知障碍，例如，难以记起自己和家庭成员的身份。她还表现出无法控制的活动或多动症。她似乎不能集中注意力，并且容易分神。在OEGJ治疗前约8个月她又发生了第二次脑中风，从此她完全丧失了语言能力和所有体力活动能力。在检查时，她丧失了对几乎所有事件的反应，并且表现为完全的植物人患者，肌肉僵硬并且具有深度大面积褥疮性溃疡(直径16cm、深度10cm)和严重失眠。有趣的是，2个月的OEGJ治疗(口服给药，2g/天)完全治愈了她的深度褥疮，基本上把她从失眠恢复到正常睡眠模式，显著恢复了她的正常和复杂交谈的语言能力和记起她家庭成员姓名和身份的能力。同时她的体力活动能力和视力也得到显著改善。

来自北京的另一位男性患者在治疗前约6个月发生了脑中风。发生脑中风前的约6个月，他已经具有脑缺血的前兆症状，例如，头痛、头晕和下午无法集中精力工作或写作。中风后，他从脑中风急性期恢复，但是主诉语言表达困难、头痛和部分脑部梗塞区域酸痛。在体力活动方面，他无法快速行走，否则就丧失身体稳定性。他不再能集中精力工作或写作。2个月的OEGJ治疗后(2g/天，口服给药)，他的血压恢复正常，部分脑部梗塞的不适感或酸痛感缓解，并且面部肤色看起来更健康。最重要的是，他又能全天集中精力工作或写作，甚至比脑中风前还要好。在体力活动方面，他能够快速行走同时保持良好的身体稳定性和平衡。他的表现完全正常。

实施例4.OEGJ促进脑部血液流动

我们的初步研究和其他研究人员的研究(Farkas et al.，2007)提示，前脑的慢性缺血可能是人类AD、VD和其它认知病症的主要原因之一。为了探索OEGJ在促进CBF中可能的有益作用，我们在大鼠进行了永久性双侧颈总动脉闭塞(2VO)，从而使受试大鼠的前脑、海马和其它脑叶中慢性缺血，这个模型用来模拟具有学习和记忆缺陷和认知障碍症状的人类脑缺血。

使用体重250-300g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。本研究根据国家实验动物管理条例进行，并且所有动物实验得到张江高科技园区的实验动物管理委员会的批准。对于慢性双侧闭塞(n＝12)，在麻醉下通过正中颈部切口暴露左侧和右侧颈总动脉，然后用6-0尼龙缝线分别结扎，并用手术剪切断。然后用缝线缝合伤口。从麻醉苏醒后，允许实验动物自由进食和饮水。

对于OEGJ治疗组大鼠(n＝6)，从结扎后第1天至第30天每天灌胃给予OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)。对于介质处理组动物(n＝6)，在相同的时间段内每天给予等量的水。治疗1个月后，对大鼠进行分析。通过东芝Aplio XG超声仪测量脑部血流的改变。

通过利用配备PLT-1202S线性阵列换能器的东芝Aplio XG超声仪，测量实验动物基底动脉的血流来评价脑血流量。测量了角度校正时间平均流速和血管横截面面积。对大鼠进行2VO后，脑部供血主要依赖于基底动脉，其通常提供脑部总供血的约40％。结果表明：假手术大鼠中基底动脉血流量(BFV)为约13.81±4.21ml/min，而介质处理大鼠由于对2VO的代偿机制而达到了16.23±4.17ml/min(图6)。有趣的是，OEGJ治疗的动物中的BFV增加至高达26.60±11.10ml/min，这相当于总脑血流量正常水平的约85％(图6)。此外，介质处理的动物的血压平均为约154mmHg，高于假手术动物的血压(约125mmHg)。相比之下，OEGJ治疗的动物的血压平均为135mmHg，显著低于介质处理大鼠的血压，而稍高于假手术组大鼠的水平，这表明由于OEGJ治疗而使脑部侧支血管形成，从而降低脑部小动脉或血管扩张的外周阻力。为了排除OEGJ具有血管扩张效应的可能性，我们在OEGJ治疗之后2周再次测量了这些实验动物的BFV。获得相似结果。即，OEGJ治疗停止后2周，BFV仍然与OEGJ治疗的大鼠的最后一次测量值相似，血压为约128mmHg。而介质处理的大鼠，BFV和血压与两周前的最后一次测量值大致相同。综上所述，OEGJ治疗恢复了大脑由于2VO而造成的脑部缺血的血供。不希望被理论束缚，其可能的机制是由于OEGJ治疗促进缺血脑部中侧支血管形成，从而降低脑部小动脉的阻力，进而增加了脑部的血供。我们通过对相同动物脑部样品进行组织学研究(血管计数)的结果进一步证实了这个观点。

实施例5.阿尔茨海默病动物模型中OEGJ的治疗效果

在本实施例中测试了OEGJ对两种广泛使用的AD动物模型的治疗效果：携带淀粉样前体蛋白突变基因的转基因模型(APP)和衰老加速小鼠(SAM)。APP小鼠发展出纤维状淀粉样斑块和AD样脑部病理学特征，这提供了用于研究AD的有价值的动物模型。随着APP小鼠年龄增大，它们表现出空间学习和记忆障碍。由Takeda及其同事(Takeda et al.，1991)研发出的SAM小鼠表现出快速衰老的特征。它们发展出早期学习和记忆异常。这些与海马功能异常有关。SAM小鼠似乎是研究AD中观察到的早期缺陷的病理生理学的极好的模型。

所有研究根据国家实验动物管理条例进行，并且所有动物实验得到张江高科技园区的实验动物管理委员会的批准。将APP和SAM小鼠(6月龄)随机分为OEGJ治疗组(APP，n＝15和SAM，n＝15)和介质处理组(APP，n＝14和SAM，n＝14)。对于OEGJ治疗组的小鼠，每天灌胃给予OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)，给予30天。对于介质处理组动物，每天给予等量的水。

SAMP10小鼠中OEGJ治疗引起的学习和记忆功能改善

1个月OEGJ或介质处理后，在OEGJ治疗组和介质处理组中使用Morris水迷宫(1.8M)来评价空间学习和记忆能力。每天训练动物5次，训练4天。记录找到隐藏平台前的耗时(也称为逃避潜伏期)。第5天，对小鼠进行空间探索试验，其中移除平台并评价它们对平台位置的记忆。通常，将靶象限(之前放置平台的位置)中的耗时用于评价小鼠对平台位置的记忆强度。记录了在之前平台位置象限的平均游泳距离和穿过前平台准确位置的次数。我们发现OEGJ治疗的SAM小鼠表现出显著短于介质处理的小鼠的逃避潜伏期(图7，P＜0.001)。

脑血流(CBF)的多普勒超声评价

在OEGJ治疗4周后，利用东芝超声扫描仪的12-MHz线性探针研究实验小鼠的CBF。为了排除OEGJ具有血管扩张效应的可能性，在4周的OEGJ治疗之后2周，测定了CBF。取3次重复测量结果的平均值作为CBF。通过组织病理学研究证实颅内侧支循环的存在。我们发现OEGJ治疗的小鼠的CBF平均高于介质处理的对照小鼠15％。该结果提示：OEGJ治疗可能诱导小鼠脑部中新的侧支血管的生成，从而降低小动脉或微血管的外周阻力，从而使脑部血流显著增加，我们通过组织学血管定量研究进一步证实了这点。

SAMP10小鼠脑部中新血管化的测定

组织学研究表明：OEGJ治疗的小鼠的脑平均重量高于介质处理的对照小鼠14.6±4.8％(P＜0.01)。从CBF测量后处死的SAM小鼠取出脑部，在福尔马林中固定，并包埋在石蜡中。进行组织切片(5μm)，H&E染色。在光学显微镜高倍镜视野(HPF)(40倍)下，对额叶皮质内和海马区周围的血管数进行计数，从而确定组织切片样品的血管密度。将额叶或海马内的6个随机且非重叠HPF用于对每个切片的所有血管进行计数。取每个HPF中血管数的平均值，并将其表示为每个HPF的血管数。由2个研究人员以盲法的方式进行血管计数。

我们发现，在介质处理的SAMP10小鼠(图8)中，额叶皮质区的血管数为82.3±15.6/HPF，海马区周围的血管数为52.0±21/HPF。相比之下，在OEGJ治疗的小鼠中，额叶皮质区的血管数为约91.0±16.3/HPF，海马区周围的血管数为72.0±15.6/HPF(图8)。OEGJ治疗的小鼠的海马中颗粒细胞层表现为相对完整、致密和厚实。相比之下，介质处理的小鼠中的颗粒细胞层松散且多孔(图8)。

神经元再生

从每一块石蜡包埋的组织块切下薄切片(5μm)，并用抗Ki67特异性抗体进行免疫组化染色。通过对切片的显微镜检查，我们发现OEGJ治疗不仅能增强皮质区和海马区新血管的生成，还能诱导这些区域中的神经元再生(图9)。相比之下，在未治疗的对照脑部中，既未鉴定出脑部新的侧支血管的显著生长，也未鉴定出新的神经元再生(图9)。新再生的神经元样细胞被抗Ki67的特异性抗体阳性染色(图9)，这表明它们是新近再生的神经元。

综上所述，这些观察结果表明OEGJ不仅能诱导SAM小鼠脑中新的侧支血管的生成，从而改善CBF，还能诱导负责学习和认知能力的额叶皮质和海马区中的神经元再生，这可能有助于明显提高水迷宫探查测试中的表现。

OEGJ引起的APP小鼠学习和记忆的改善

利用Morris水迷宫(1.8M)在OEGJ治疗组和介质处理组中评价空间学习和记忆能力。在治疗前的水迷宫测试中，两组的到达隐藏平台的逃避潜伏时间未检出差异。将6月龄APP小鼠随机分为OEGJ治疗组(n＝15)和介质处理组(n＝14)。对于OEGJ治疗组小鼠，每天灌胃给予OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)，给药30天。对于介质处理组动物，每天给予等量的水。治疗后4周，每天用水迷宫训练APP小鼠3次，训练4天。记录找到隐藏平台前的耗时(也称为逃避潜伏期)。完成训练后1天，对小鼠进行空间探索试验，其中移除平台并评价它们对平台位置的记忆。通常，将靶象限(之前放置平台的象限)中的耗时用于评价小鼠对平台位置的记忆强度。记录了在前平台象限的平均游泳距离和穿过前平台准确位置的次数。我们发现介质处理组的动物表现出的寻找隐藏平台的潜伏期显著长于OEGJ治疗的小鼠的表现(图10)(P＜0.01)。OEGJ(480mg/kg/天，给药1个月)治疗能显著降低介质处理对照小鼠中延长的逃避潜伏期(P＜0.01)。在最后一次训练试验之后的第5天，进行空间探索试验。我们发现两组动物在训练试验中曾被放置平台的靶象限中的耗时集体存在显著的差异(图10)，即，OEGJ治疗的APP小鼠表现出的穿过平台的次数显著高于介质处理的小鼠(图10)(P＜0.01)。OEGJ治疗的小鼠在受训过的平台象限耗费的游泳时间约40％，显著高于随机概率机会(25％)(图10)。相比之下，介质处理组小鼠在受训过的平台象限耗费的游泳时间的约26％，与概率机会(25％)相似，并显著少于OEGJ治疗的小鼠(图10)(P＜0.01)。

脑血流(CBF)的超声评价`

在OEGJ治疗后2周，利用东芝超声扫描仪的12-MHz线性探针研究APP小鼠的CBF。我们发现OEGJ治疗的APP小鼠中的CBF平均高于介质处理的对照小鼠14.8％，这就提示OEGJ治疗诱导APP小鼠脑中新的侧支血管的生成，从而降低小动脉或微血管的外周阻力，使脑部获得更多血流。

脑中新生血管的测定

从CBF测量后处死的APP小鼠取出脑并称重。我们发现，OEGJ治疗的小鼠的脑平均重量高于介质处理的对照小鼠15.3±3.93％(P＜0.01)。将脑在福尔马林中固定，石蜡包埋，并进行组织切片(5μm厚)，H&E染色。在光学显微镜高倍镜视野(HPF)(40倍)下，对额叶皮质内和海马区周围的血管进行计数，从而确定不同组织切片样品中的血管密度。将额叶或海马区域内的6个随机且非重叠HPF用于对每个切片的所有血管进行计数。取每个HPF中的血管数的平均值，并将其表示为每个HPF的血管数。由2个研究人员以双盲法的方式进行血管计数。

结果表明，在OEGJ治疗小鼠脑的(图11)额叶皮质区的血管数为78.5±19/HPF，海马区周围的血管数为79.8±23/HPF。相比之下，在介质处理小鼠的(图11)额叶皮质区的血管数为41.7±8/HPF，海马区周围的血管数为39.7±8.2/HPF。

神经元再生

显微镜观察记录还证明了介质处理的对照APP小鼠中海马的所有CA区的锥体细胞层比OEGJ治疗的动物薄得多(图12)。我们发现，介质处理的对照小鼠中DG颗粒细胞层内缘周围的很多齿状回(DG)颗粒神经元变形和死亡(图11和12)。相比之下，OEGJ治疗的小鼠中的DG颗粒细胞层保持完整，并且DG颗粒细胞层内缘周围的DG颗粒神经元只有非常少量死亡(图11和12)。此外，介质处理的APP小鼠的海马萎缩，并且部分介质处理的对照动物中丧失了部分DG区(图12)。相比之下，OEGJ治疗的动物中未发现DG区丧失(图12)。

用抗Ki67特异性抗体对组织切片进行免疫组化染色。结果表明：OEGJ治疗不仅能增强皮质区和海马区中新的侧支血管的形成，还能诱导皮质和海马中神经元再生(图13)。相比之下，在介质处理的对照脑中，既未鉴定出新的侧支血管的显著生成，也未鉴定出新的神经元的再生(图13)。新再生的神经元样细胞被抗Ki67特异性抗体阳性染色(图13)，这表明它们是新再生的神经元。

天门冬氨酰蛋白酶β位淀粉样前体蛋白切割酶1(BACE1)启动将淀粉样前体蛋白(APP)加工成淀粉样β(Aβ)肽，淀粉样β(Aβ)肽是AD斑块的主要成分。RT-PCR分析表明：介质处理的小鼠中的BACE1mRNA水平高于OEGJ治疗的动物(P＜0.01)。介质处理的动物中Aβ蛋白表达高于OEGJ治疗的小鼠(P＜0.01)。OEGJ治疗能降低APP小鼠的海马中BACE1mRNA水平和Aβ。我们的组织学研究还表明：OEGJ治疗的SAM和APP小鼠中利用刚果红染色观察到的淀粉样斑块少于介质处理的动物(P＜0.05)。上述结果提示：对APP小鼠脑中BACE1表达和Aβ生成的抑制可能是OEGJ改善APP小鼠认知障碍的效果的基础。

综上所述，这些结果提示：OEGJ不仅能刺激SAM和APP小鼠脑中新的侧支血管的生成，从而显著改善CBF，还能诱导负责学习和认知能力的皮质和海马区中的神经元再生，从而显著改善水迷宫探查实验中的表现。因此，本发明的组合物可用于治疗AD。

实施例6.对血管性痴呆的治疗效果

血管性痴呆(VD)老年痴呆的主要类型之一。近期研究提示，前脑和海马中的慢性缺血可能是VD的主要原因之一。因此，我们使用通过永久性双侧颈总动脉闭塞(2VO)导致脑慢性缺血的动物模型，这与患有学习和记忆缺陷的人类VD相似。使用体重300-350g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。2VO的步骤如上文所述。将OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)灌胃给予受试组大鼠(n＝6)，给药4周。在相同的时间段内，每天给予介质处理组动物(n＝6)等量的水。

我们发现，OEGJ治疗的大鼠的脑部平均重量高于介质处理大鼠的脑重9.3±2.3％(P＜0.05)。为了评价2VO模型的形态学结果和OEGJ的治疗效果，在2VO之后6周进行组织学分析。在永久性2VO后的早期，大鼠表现为运动减少、后肢鸭行步态、行走共济失调或爬行和转动。然而，手术后1周，实验大鼠的上述异常症状几乎全部恢复，未发现明显的运送障碍。前脑切片的组织学检查表明，脑部慢性缺血之后，引起了多发性脑缺血病变、海马和皮质区中神经元的进行性变形。相应地，测量了额叶皮质和海马中的血管密度。为了对血管的平均数目进行定量，分析了从石蜡包埋的组织包块分别以50μm的间隔切下的6个切片(5μm)。我们发现，OEGJ治疗的脑中的平均血管密度显著高于介质处理的(P＜0.005)。

综上所述，由永久性2VO引起的慢性脑缺血导致脑部的进行性和持续性损伤，并伴随学习和记忆能力障碍，这可以模拟人类血管性痴呆的病理过程。本发明的组合物能通过侧支血管形成来恢复对缺血脑的供血和刺激神经元再生，从而替换受损的神经元，并因此提供由痴呆动物模型和人类中有效治疗效果所证实的对血管性痴呆的有益治疗效果。

实施例7.OEGJ对人类AD和血管性痴呆患者的治疗效果

在临床环境中测试了本发明组合物对痴呆患者的治疗效果。我们的初步临床测试在2名AD患者中进行，完全告知患者的家庭成员并获得书面同意。一名患者(82岁)在治疗前约1年开始表现出心智功能很多方面的困难，包括短期记忆丧失、感知障碍、情绪性行为、难以记起自己和家庭成员或熟悉事物的姓名和身份、在熟悉的路中迷路、晕厥发作(1-2次/月)、妄想症和认知障碍(例如计算、抽象思维和判断)(表1)。另一名患者(78岁)在治疗前约6个月开始表现出语言障碍、情绪抑郁和视力恶化。他的症状还包括在检查时语言能力丧失、视力完全丧失、行走能力丧失、大小便失禁、不能自理和深度抑郁(表2)。然而，OEGJ治疗1周后(口服给药，2g/天)，两位患者都报告了症状的显著改善。该治疗恢复了他们记起自己和家庭成员的姓名和身份的能力，并显著改善他们的认知能力(表1和2)。此外，1个月的治疗后，82岁患者的晕厥发作和妄想症完全康复(表1)。治疗后4天，76岁患者的大小便失禁完全康复。1个月的治疗后，视力、语言能力、与人交流的能力、行走能力和情绪抑郁的丧失都逐渐恢复到正常或相对正常。治疗后2个月，该76岁患者表现完全正常(表2)。

检测了OEGJ对人类血管性痴呆(VD)患者的治疗效果。我们的初步临床测试是在2名女性血管性痴呆患者上进行，完全告知患者的家庭成员并获得书面同意。一名患者(86岁)在治疗前约1年半发生严重脑中风之后，表现出心智和体力功能的很多方面的困难。她完全丧失语言能力和几乎所有的体力活动能力，例如自我进食、行走、站立甚至微笑。她的表现为植物人患者(表3)。另一名患者(82岁)在发生两次中风后也完全丧失语言能力和所有的体力活动能力。在检查时，她的表现为完全的植物人患者，具有高血压和深度褥疮性溃疡(表4)。

然而，2个月的OEGJ提取物治疗(口服给药，2g/天)恢复了两位患者的语言能力、记起家庭成员的姓名和身份的能力以及部分的体力活动能力(表3和4)。此外，该治疗还恢复了86岁患者的部分认知能力，例如玩麻将、打电脑游戏和打电话(表3)。治疗后1周，82岁患者的高血压和失眠都得到显著改善(表4)。

表1.提取物对82岁AD男性患者的治疗效果

症状和检查	治疗前	治疗后
			记忆混乱	5	4
感知障碍	5	3
			混淆	4	3
难以记起身份	5	2
			突然跌倒	1-2次/月	未发生
妄想症	4	1
			认知障碍	5	3
脑发作史	无	无

1＝完全不；2＝轻微；3＝中等；4＝较重；5＝极重。

表2.提取物对76岁AD男性患者的治疗效果

症状和检查	治疗前	治疗后
			语言能力丧失	4	1
视力丧失	5	2
			行走能力丧失	4	2
大小便失禁	5	1
			情绪抑郁	5	1
认知障碍	4	2
			脑发作史	无	无

1＝完全不；2＝轻微；3＝中等；4＝较重；5＝极重。

表3.提取物对86岁VD患者的治疗效果

1＝完全不；2＝轻微；3＝中等；4＝较重；5＝极重。

表4.提取物对82岁VD患者的治疗效果

1＝完全不；2＝轻微；3＝中等；4＝较重；5＝极重。

实施例8.OEGJ治疗引起的大鼠模型中慢性脑缺血的改善

大鼠慢性脑缺血模型和治疗方案

我们的初步研究提示，前脑的慢性但持续性脑缺血可能是人类神经退行性病症和其它认知能力的主要原因之一。为了探索OEGJ在治疗慢性脑缺血中的有益效果，我们使用通过进行永久性双侧颈总动脉闭塞(2VO)而致前脑、海马和其它脑叶中慢性缺血的大鼠模型，其类似于患有头痛和学习与记忆障碍症状的人类中的慢性脑缺血。

使用体重250-300g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。本研究根据国家实验动物管理条例进行，并且所有动物实验得到张江高科技园区的实验动物管理委员会的批准。对于慢性2VO(n＝11)，在麻醉下通过正中颈部切口暴露左侧和右侧颈总动脉，然后用6-0尼龙缝线将它们结扎，并用手术剪切断。然后用缝线缝合伤口。进行手术但未进行2VO的大鼠(n＝5)作为假手术对照。从麻醉苏醒后，允许实验动物自由进食和饮水。

对于OEGJ治疗组大鼠(n＝5)，每天灌胃给予OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)，给药4周。对于介质处理组动物(n＝6)，每天给予等量的水。治疗后4周，对大鼠进行分析。

脑部血流的多普勒超声评价

通过利用配备PLT-1202S线性阵列换能器的东芝Aplio XG超声仪，测量实验动物的颅外基底动脉来评价总脑血流量。永久性2VO之后，大鼠脑部供血主要依赖于双侧总椎动脉-基底动脉，其通常提供脑部总血量的约40％。结果表明：假手术大鼠中基底动脉血流量为12.4±3.5ml/min，而介质处理的对照中由于对2VO的代偿机制而达到了16.04±6.4ml/min，占正常脑部总血量的52％。有趣的是，OEGJ治疗的动物中的基底动脉血流量增加至高达26.8±12.80ml/min，这相当于总脑血流量正常水平的约86％(图14)。

慢性缺血脑中新生血管和神经元再生的测定

当测定脑血流后处死大鼠时，我们发现，OEGJ治疗的大鼠的脑部重量高于介质处理的对照大鼠8.3-11.2％(P＜0.01)。从每一块石蜡包埋的组织块切下薄切片(5μm)，H&E染色，在光学显微镜高倍镜视野(HPF)(40倍)下，对额叶皮质内和海马区周围的血管进行计数，从而确定它们的血管密度。分析了从石蜡包埋的组织包块分别以30μm的间隔切下的6个切片(5μm)。由2个研究人员以双盲法的方式检查每个切片额叶或海马内的6个随机且非重叠HPF。

我们发现，在OEGJ治疗的大鼠中，额叶皮质区中平均血管密度为63.3±21.1/HPF(图15)，海马区周围的平均血管密度为53.6±15.2/HPF。相比之下，在介质处理的大鼠中，额叶皮质区中血管数为47.7±11.8/HPF(图15)，海马区周围的血管数为39.5±12.3/HPF。综上所述，OEGJ治疗引起的缺血脑中的新血管生长多于介质处理25-35％(P＜0.005)。

使用免疫组化来观察慢性缺血脑中OEGJ诱导的神经元再生。结果表明：在介质处理大鼠的海马区的颗粒细胞层中，几乎未检测到Ki67阳性染色的颗粒神经元(图16)。相比之下，在OEGJ治疗的大鼠的海马区的颗粒细胞层中，观察到很多Ki67阳性染色的颗粒神经元的细胞核，这表明OEGJ治疗能诱导海马区的神经元再生。此外，在介质处理的大鼠的额叶皮质区中，很少观察到Ki67阳性染色的神经元样细胞。然而，在OEGJ治疗的大鼠的额叶皮质中，检测到很多Ki67阳性染色的神经元样细胞的细胞核，这表明OEGJ诱导的皮质中神经元再生(图16)。

综上所述，由永久性2VO引起的大鼠中慢性脑缺血导致脑部的进行性脑缺血和持续性损伤，其可用于模拟人类慢性脑缺血的病理过程。本发明的组合物能通过诱导侧支血管形成来恢复对缺血脑的供血，并因此提供对慢性脑缺血的有益治疗。

实施例9.OEGJ对右侧颈动脉部分结扎引起慢性脑缺血的大鼠模型的治疗效果

使用体重250-300g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。本研究根据国家实验动物管理条例进行，并且所有动物实验得到张江高科技园区的实验动物管理委员会的批准。对于建立慢性轻度脑缺血，在麻醉下通过正中颈部切口暴露右侧颈总动脉，然后用6-0尼龙缝线部分结扎该动脉(60％)，并用手术剪切断。然后用缝线缝合伤口。进行手术但未进行2VO的大鼠(n＝6)作为假手术对照。从麻醉苏醒后，允许实验动物自由进食和饮水。

对于OEGJ治疗组大鼠(n＝6)，灌胃给予OEGJ悬液(480mg/kg/天，配制于水中)，给药4周。对于介质处理组动物(n＝6)，每天给予等量的水。治疗后4周，对大鼠进行分析。右侧颈动脉的部分结扎(60％)后，介质处理的大鼠的平均血压增加至约140mmHg，总脑血流量为约37ml/min。1个月OEGJ治疗后(480mg/kg)，OEGJ治疗的动物的平均血压下降了约13％，与正常血压水平(121mmHg)相似，而总脑血流量显著增加(50-60ml/min)，从而保持对缺血脑部的足够的供血。相比之下，在介质处理的动物中，脑血流较低，大约35-40ml/min，而血压仍然较高，大约130-150mmHg。综上所述，OEGJ治疗能改善慢性脑缺血，这可能是通过促进轻度慢性缺血脑中新的侧支血管的生成。

实施例10.慢性脑缺血患者中OEGJ的有效治疗

基于上述结果，即动物模型中OEGJ诱导血管内皮细胞体外分化为微血管样管状结构(图1)和恢复缺血脑部的供血(图14，15)，在知情同意的情况下和人道治疗的基础上，在临床应用中测试了慢性脑缺血患者中OEGJ的治疗效果。

一名加拿大男性患者(66岁)在检查时已患有轻度脑缺血多年。常常困扰他的是严重头痛、虚弱和头晕，特别是在游泳或向后仰头时。吸氧治疗可以缓解症状。然后，他接受3周的OEGJ治疗(3g/天，口服给药)。我们发现，他多年来忍受的所有慢性脑缺血的症状完全消失。诸如头痛、虚弱和头晕的慢性脑缺血症状在治疗后3年内未复发。自从接受OEGJ治疗以来，他不再需要吸氧治疗。

另一名马来西亚女性患者已患有慢性脑缺血多年，并且疾病症状快速并严重地发展。她多年来表现出的症状是头痛、头晕和虚弱，记忆力衰退、判断力差、注意力松散和运动协调性降低。医院治疗多年后，她的状态没有改善并快速恶化，并伴有晕厥发作、语言困难或讲话发音含糊、幻听和幻视以及性格改变。她最初接受了2周的OEGJ治疗(2g/天)，观察到了显著的改善，特别是讲话、头痛和头晕的改善。她继续接受了4周的治疗，包括语言困难、晕厥发作、幻听和幻视、动作协调障碍和头痛在内的大部分症状得到显著改善。在体力活动方面，她能快速行走，同时保持良好的身体稳定性和平衡性。她表现完全正常。

实施例11.OEGJ对治疗帕金森氏病(PD)的效果

基于从OEGJ在增强血管内皮细胞分化(图1)、脑血液灌注(图3、6、14)和新血管生成(图4、8、11、15)方面以及在诱导间充质干细胞的体外向神经元分化(图2)和在中风、AD和慢性脑缺血的动物模型中诱导神经元再生(图5，9，12，16)的方面获得的相当有前景的结果，在人道治疗的基础上在PD患者中测试了OEGJ。我们的初步临床试验两名男性PD患者上进行，已完全告知患者的家庭成员并获得了书面同意。

1名来自香港的56岁男性在治疗前3年被诊断为PD。在早期阶段，他具有运动障碍，例如四肢震颤、肌肉僵硬、体力运动迟缓、姿态不稳以及甚至丧失某些体力运动。在治疗前，该患者的症状发展为认知障碍和轻微言语问题。他多年来服用左旋多巴和多巴脱羧酶抑制剂，这些药物仅能短期缓解震颤。当药物的作用消失后，他全身的肌肉(特别是腹部)变得十分僵硬，以至于不能直立并强迫弯曲背部。他还主诉肌肉疼痛、腹部疼痛性痉挛、难以起始运动以及行走时突然停住。有时，他在1小时内不能行走超过1.5米。同时还伴有严重便秘和胃瘫。然而，OEGJ治疗后，即使忘记了服用日常处方药物(针对难以起始运动)，他还是能正常来回走动。服用OEGJ后，他还会感觉到饥饿和欲睡。他的便秘和胃瘫也得到改善，每天或每两天排便。治疗前他还主诉恐慌发作和短期记忆丧失以及不愿前往公共场所，这是称为帕金森氏痴呆的疾病状态，表明疾病达到晚期。OEGJ治疗2周后(2g/天)，他在外出旅途中都感觉舒适并且自信。

另一名来自北京的78岁患者已被诊断为PD超过20年，并且上臂震颤超过30年。他与上述56岁的患者有相似的症状和治疗，但是更为严重。接受OEGJ治疗后，他的肌肉疼痛明显缓解，并且腹部不再痉挛。OEGJ治疗后1周(口服给药，2g/天)，两位患者在包括肌肉僵直和胃瘫在内的症状都有了显著改善。该治疗恢复他们的消化道功能，使得能更快消化食物，并且他们恢复了食欲。该治疗还缓解了他们的便秘和腹痛，并且他们的认知能力逐渐恢复。56岁患者的语言能力也得到显著改善。

尽管已经展示并描述了某些实施方案，但是应当理解，在不脱离权利要求书所限定的较宽范围中的技术的情况下，本领域技术人员可以在其中做出改变和改动。

本公开不应局限于本申请所述的具体实施方案。在不脱离其实质和范围的情况下，可以进行很多改动和变化，这对于本领域技术人员是显而易见的。本公开范围内除本文所列之外的功能上等同的方法和装置对于阅读了上述描述的本领域技术人员是显而易见的。这些改动和变化意图包括在附加权利要求书的范围内。本公开仅受附加权利要求书的内容以及这些权利要求赋予权力的等同物的全部范围的限制。应当理解，本公开不局限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物体系，上述是必然能够变化的。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案，而并非意图进行限制。

此外，当以马库什组的方式描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员应当认识到，还从任何个体成员或马库什组成员的亚组的方式描述了本公开。

本领域技术人员应当理解，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面的目的，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围以及子范围的组合。任何列出的范围能容易地被认为充分描述和赋予了同一范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的情况。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围能容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还应当理解，诸如“多至”、“至少”、“大于”、“少于”等的所有语言包括所记载的数值，并且是指能如上文所讨论随后分解成子范围的范围。最后，本领域技术人员应当理解，一个范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。同样，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，以此类推。

尽管本文中公开了各个方面和实施方案，其他方面和实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案仅是说明目的，而不是意图进行限制，附加权利要求书表明真正的范围和实质。

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Claims (15)

1.预防或治疗哺乳动物个体中退行性神经元疾病或疾病状态的方法，所述方法包括：给予有需要的个体有效量的柔毛水杨梅(Geumjaponicum)有机提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述退行性神经元疾病或疾病状态包括缺血性中风、阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知障碍(MCI)、慢性脑缺血和帕金森氏病。

3.如权利要求1所述的方法，其中与未给予所述柔毛水杨梅提取物的对照个体相比，所述给药增强患缺血性中风的个体中的脑部血液灌注或神经元再生。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述柔毛水杨梅提取物诱导缺血脑部的血管生成，从而增强血液灌注。

5.如权利要求1所述的方法，其中给予的所述柔毛水杨梅提取物的量为约0.001mg-10g提取物/千克个体体重/天。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述柔毛水杨梅提取物以包含药学可接受的载体的单位剂量形式进行给药。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述柔毛水杨梅提取物诱导神经元再生。

8.如权利要求1所述的方法，其中与未给予所述柔毛水杨梅提取物的对照个体相比，所述柔毛水杨梅提取物使脑部缺血梗塞区域缩小。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述柔毛水杨梅提取物通过口服给药。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述柔毛水杨梅提取物通过皮下注射、肌内注射或静脉输注给药。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物是柔毛水杨梅的低级烷基醇提取物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述低级烷基醇具有1-6个碳原子。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述低级烷基醇是乙醇。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是人。

15.用于治疗哺乳动物个体中的退行性神经元疾病或疾病状态的药物组合物，其包含有效量的柔毛水杨梅有机提取物和药学可接受的载体。

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