CN102497873A - 用于增加生存年限和健康年限的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了植物柔毛水杨梅(Geum japonicum)的化合物、提取物和活性部位以及增加寿命和存活能力或预防或治疗各种医学疾病状态的方法，所述医学疾病状态包括糖尿病、炎症、创伤愈合、褥疮和眼部病症。本文提供的化合物可配制为可用于所公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述化合物和提取物在制备药物制剂和药物中的用途。

Description

用于增加生存年限和健康年限的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年6月12日提交的美国临时申请第61/186,709号和于2009年6月17日提交的美国临时申请第61/187,905号的优先权，通过引用将上述申请的全部内容并入本文。

发明背景

提供以下描述是为了有助于阅读者的理解，并不是承认提供的信息或引用的文献是本发明的现有技术。

长寿一直是最热门的科学领域之一，但在研究领域中仍然对其知之甚少。严格和科学地讲，人们不知道如何衡量衰老。衰老并不仅是年龄的问题。某些人在晚年时仍活跃并且敏捷，而其他人在中年时就受到衰老疾病的折磨(心脏病、高血压、中风、糖尿病、癌症、阿尔茨海默病和痴呆等)。

公认的是几乎世界各地的人群都在快速老龄化。65岁及以上的人口比例正在从2005年的7％增加至2050年的16％。老年人口数已经是1950年时的3倍，并且到2050年将是现在的3倍，即15亿人会超过65岁。然而有关寻找对生存年限/健康年限具有显性正性作用的单基因突变的衰老研究还未获得成功。衰老是全身性的退行性变，并且可能不是由于单个基因或系统的改变。

Leonard Hayflick首次观察到细胞分裂的有限性现象，现在被称为Hayflick极限。在细胞分裂时，DNA的复制不能一直进行到染色体的末端。端粒是位于染色体末端的重复性DNA区，用于保护染色体末端免于退化。没有端粒，细胞在复制时会失去其染色体末端和其中含有的必要信息。端粒作为封闭染色体末端的可丢弃的缓冲区，在细胞分裂时被消耗，但能通过端粒酶补充。端粒酶能通过添加TTAGGG重复序列来补充染色体的3′末端(Autexier C et al.2006，Collins K et al.2006)。

因此通过暂时活化端粒酶或用基因疗法来延长某些重要细胞中的端粒很久以来一直被认为是延长生命的方法。利用线虫类中的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)进行的研究表明延长端粒和增长的生存时间之间存在关联性。端粒较长的蠕虫平均存活24天，比正常蠕虫长约20％(Artandi SE et al.2000)。

发明概述

本发明涉及柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物(OEGJ)，及其提高细胞培养体系中细胞寿命的作用。本发明人意外地发现，经OEGJ处理的培养细胞以及经OEGJ治疗的实验动物组织细胞中呈现出显著增加的端粒酶活性。OEGJ在动物模型中的研究进一步证实了OEGJ能延长生存年限，并上调诸如Atk1、Bcl2、VEGF和NFκB的存活增强基因和端粒酶的活性。这些被OEGJ诱导上调的基因表达可能是实验动物存活和寿命提高的内在机制。

在一些实施方案中，本发明涉及药物组合物的应用和提高寿命和生活质量的方法。具体而言，本发明涉及用于在哺乳动物个体中增强活力和刺激端粒酶活性的药物组合物和方法，因此所述药物组合物和方法可用于抗衰老以及显著提高健康生存年限和寿命。

一方面，本公开提供了提高有需要的个体的寿命和生活质量的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的OEGJ。在一个实施方案中，所述提取物的给药能刺激端粒酶和一种或多种选自Akt1、Bcl2、EGF、VEGF和NFκB的细胞存活因子的表达。在一个实施方案中，与未给予所述提取物的个体相比，所述提取物的给药提高生存年限或生活质量。在一个实施方案中，所述个体是人。

在一个实施方案中，所述有机提取物是乙醇提取物。在一个实施方案中，所述有机提取物是甲醇提取物。在一个实施方案中，所述提取物通过口服给药。在一个实施方案中，所述提取物通过皮下注射、肌内注射或静脉输注进行给药。在一个实施方案中，所给予的提取物的量为0.01mg/kg/天至10000mg/kg/天。在一个实施方案中，所述有效量的提取物是包含所述提取物和合适的载体或赋形剂的药物制剂的形式。

另一方面，本公开提供用于提高个体的寿命和生活质量的药物组合物，其包含有效量的OEGJ和药学可接受的载体。

另一方面，本公开提供预防或治疗有需要的个体中的糖尿病的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的OEGJ。

另一方面，本公开提供预防或治疗有需要的个体中的眼部疾病或疾病状态的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的OEGJ。

另一方面，本公开提供治疗有需要的个体中的炎症的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的OEGJ。

另一方面，本公开提供增强具有创伤的个体的创伤愈合的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的OEGJ。在一个实施方案中，所述创伤是褥疮。

附图简要描述

图1显示OEGJ提高秀丽隐杆线虫的存活能力或预期寿命。野生型N2秀丽隐杆线虫生长在用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株OP50划线的NGM琼脂板上，在通风培养箱中进行培养。用OEGJ(150μg/ml)处理受试组中位于L1期的N2蠕虫，用等量溶剂处理对照组的蠕虫。为了测试OEGJ处理的蠕虫的存活能力，将培养温度增加至27℃。Ct-7：27℃下保持7天的未处理对照组的N2蠕虫，部分蠕虫死亡，部分蠕虫仍然存活，但未观察到幼体蠕虫。OEGJ-7：相同状态下保持7天的OEGJ治疗的蠕虫，几乎没有蠕虫死亡，并且有趣的是，观察到很多幼体蠕虫。Ct-14：27℃下孵育14天后，未处理对照组的所有N2蠕虫都死亡。OEGJ-14：在27℃下孵育14天后，尽管OEGJ处理的样品中大部分成体蠕虫死亡，但观察到很多幼体蠕虫仍然存活。

图2：OEGJ处理对N2秀丽隐杆线虫的生存时间/健康时间的影响。Ct：未处理的对照N2蠕虫。Tr：OEGJ处理的蠕虫。结果表明，几乎在所有检查点，OEGJ处理组中观察到的活的蠕虫都多于未处理组。到第38天为止，未处理组的所有蠕虫都死亡。然而，OEGJ处理组中约5％的蠕虫仍然存活。OEGJ处理组中剩余的蠕虫在第42天死亡，比未处理的对照蠕虫长约10％。

图3：OEGJ处理对daf-2秀丽隐杆线虫的生存时间/健康时间的影响。Ct：未处理的对照daf-2蠕虫。Tr：OEGJ处理的蠕虫。我们发现，几乎在所有观察点，OEGJ处理组中观察到的活的蠕虫都多于未处理组。在第56天，未处理的对照组中约5％的蠕虫存活；然而，OEGJ处理组中仍然有约10％的蠕虫存活。

图4：OEGJ处理对daf-16秀丽隐杆线虫的生存时间/健康时间的影响。Ct：未处理的对照daf-16蠕虫。Tr：OEGJ处理的daf-16蠕虫。到第12天为止，未处理的对照组中约77％的蠕虫死亡。相比之下，OEGJ处理组中约50％的蠕虫在第12天时仍然存活。也就是说，未处理组中死亡的蠕虫比OEGJ治疗组多约27％，这表明OEGJ处理显著增加健康时间。

图5：OEGJ处理对daf-2秀丽隐杆线虫的生存时间/健康时间的影响，该daf-2秀丽隐杆线虫在20℃下同步化为L1并在20℃下继续培养。Ct：未处理的对照daf-2蠕虫。Tr：OEGJ处理的蠕虫。OEGJ处理组中约58％的蠕虫在第21天仍然存活。相比之下，到第21天为止，未处理的对照组中约58％的蠕虫已经死亡。在所有检查点，OEGJ处理组中存活的蠕虫比未处理的对照蠕虫多约5-15％，提示OEGJ处理能增加蠕虫的健康时间和存活时间。

图6：OEGJ处理诱导心脏中mTERT表达的上调。Ctr：来自未处理的对照小鼠心脏的mTERT信号。OEGJ-1～4代表来自OEGJ处理的小鼠心脏的mTERT信号。在所有4个OEGJ处理的心脏样品中都观察到mTERT的阳性信号，表现出的mTERT表达比未处理的对照样品(Ctr)高约2^4.8-13.27倍。

图7：OEGJ诱导SAMP10小鼠脑中的新血管生成。a：在OEGJ治疗小鼠的海马区周围观察到显著增多(15-25％)的血管(圆圈)；b：相比之下，在未治疗的对照小鼠的海马区周围发现较少的血管(圆圈)；c：在OEGJ治疗小鼠的额叶皮质区中观察到增多(15-25％)的血管(圆圈)；d：在未治疗的对照动物的相同区域发现较少的血管(圆圈)。

图8：OEGJ诱导SAMP10小鼠脑中的神经元再生。a：在未治疗的对照小鼠的海马区中几乎未观察到阳性Ki67信号；b：在OEGJ治疗的动物的海马DG区的内缘中发现具有颗粒细胞核形状的一些暗棕色Ki67阳性信号(圆圈)，提示有神经元再生；c：在未治疗的对照小鼠的额叶皮质区几乎未发现Ki67阳性信号；d：在OEGJ治疗的小鼠的额叶皮质区鉴定出一些Ki67阳性的具有神经元形状的细胞(红色圆圈)。

发明详细描述

在各个方面，本发明提供用于增加寿命和预防或治疗各种医学疾病状态的化合物、提取物和方法。本文提供的化合物可以配制为可用于公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述化合物和提取物在制备药物制剂和药物中的用途。

应当理解，为了提供对本发明的实质性理解，下文以不同详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方案、变化和特征。以下术语在全文中按下文所述使用，除非上下文明确指明另外情况。

本文中，试剂或药物对个体的“给药”包括将化合物引入或递送至个体以行使化合物预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行给药，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠或局部给药。给药包括自给药和由他人给药。还应当理解，所描述的治疗或预防医学疾病状态的各种模式意图表示“实质性的”，其不仅包括完全的治疗或预防，还包括未达到完全的治疗或预防，但实现了一些生物学或医学相关的结果。

本文所用的术语组合物的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”是足以实现所需治疗和/或预防效果的量，例如，实现了所治疗疾病相关的症状的预防或减少的量。给予个体的本发明组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。其还取决于疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员根据这些因素以及其它因素能确定合适的剂量。本发明的组合物也可以与一种或多种其它治疗化合物联合给药。

在没有特别指明的情况下，本发明所用的缩写“OEGJ”表示下文所述的植物柔毛水杨梅的有机溶剂提取物。

本文所用的术语“寿命”是指动物的生存年限。因此，寿命是指动物生存年限的年数。在一些实施方案中，当术语“增加的寿命”涉及给予了本发明组合物的个体时，表示给予了所述组合物的未患病动物的生存年限相对于未给予所述组合物的另一未患病动物有所增加。在一些实施方案中，与未给予所述组合物的未患病动物相比，动物的寿命增加至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少10年。在一些实施方案中，与未给予所述组合物的未患病动物相比，动物寿命增加至少1年，但不多于10年、不多于5年或不多于4年。

本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指治疗性处理和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其目的是预防或延缓(减轻)所针对的病理疾病状态或病症。如果个体接受了本发明方法的治疗剂后，该个体表现出可观察到的和/或可测定的具体疾病或疾病状态的一种或多种指征和症状的减少或缺失，则认为该个体被成功“治疗”了病症。

本文所用的病症或疾病状态的“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指在统计学样品中，相对于未处理的对照样品，化合物能减少处理的样品中病症或疾病状态的发生，或者相对于未处理的对照样品，化合物能延缓病症或疾病状态的一种或多种症状的发作或降低其严重程度。

本文所用的术语“个体”是指哺乳动物，例如人，但也可以是动物，例如，家畜(例如，狗、猫等)，农畜(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。

本发明的组合物

本发明提供利用来自多种植物的提取物和化合物以及所述化合物的衍生物增加个体寿命的方法，所述植物包括柔毛水杨梅和仙鹤草(Xian hecao)(也称为龙牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.))。

在一些实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅或仙鹤草的全植物、提取物，例如有机提取物。在具体实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。在一些实施方案中，所述化合物是柔毛水杨梅提取物的部分。

本发明提供利用来自多种植物的试剂和/或提取物和化合物以及该化合物的衍生物来增加个体寿命的方法，所述植物包括柔毛水杨梅。在一些实施方案中，所述试剂是柔毛水杨梅的提取物，例如柔毛水杨梅的有机提取物。在具体实施方案中，所述试剂是柔毛水杨梅的甲醇/乙醇提取物或其活性部位。

柔毛水杨梅有机提取物的制备

提供了制备柔毛水杨梅有机提取物的方法。该方法包括以下步骤：(a)用醇提取柔毛水杨梅植物，所述醇选自C1-C4醇。该步骤可以室温下重复3-6次，通常5次。在进行步骤(a)之前，可以将植物材料制成粉末或切成小块。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。通常，添加的醇的重量是待提取的柔毛水杨梅重量的1-10倍。

所述方法还可以包括以下步骤：(b)将获自步骤(a)的提取物干燥为干燥粉末；和(c)用C6烷、EtOAc和选自C1-C4醇的醇相继提取获自步骤(b)的粉末。C6烷包括具有6个碳原子的环状和非环状烷，包括，例如，环己烷、正己烷和新己烷等。C1-C4醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。所用的有机溶剂的重量通常是待进一步提取的粉末重量的1-10倍。

上文所述的方法还可以包括过滤提取物来去除其中的任何不溶性粉末。可以在高于室温的温度下(例如50℃)的减压条件下完成干燥步骤。

为了纯化OEGJ，所述方法可以还包括以下步骤：将粉末施加到色谱柱；并用含有渐增浓度的选自C1-C4醇的醇的水性溶液洗脱柱。例如，可以使用Sephadex或反相柱。所用的醇可以是选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇的任何一种。

通过NMR分析，我们发现OEGJ通常主要含有单宁类和三萜类，所述单宁类包括gemin A、B、C、D、E和F，所述三萜类包括2-羟基齐墩果酸、2-羟基熊果酸、2，19-二羟基-熊果酸、2-α，19-α-二羟基-3-氧代-12-乌索烯-28-酸、熊果酸、epimolic acid、山楂酸、野鸭椿酸、委陵菜酸，委陵菜酸的28-β-D-葡糖苷。

在一个实施方案中，本发明的提取物、活性部位和化合物是利用水和/或有机溶剂从植物原材料提取得到的，包括以下过程：

1.将水和/或有机溶剂添加到植物材料，将整体进行诸如浸泡/浸滤、超声或微波的处理而进行提取；

2.在提取过程之前或之后，利用石油醚、己烷或氯仿类型的溶剂进行脱脂；

3.任选地，利用乙酸乙酯或乙醚类型的有机溶剂对回收的提取物进行进一步提取；

4.任选地，将获得的粗提取物浓缩，并如果需要将其冻干。

一方面，考虑到允许获得的富集，粗提取物可以接受色谱纯化过程。在一个实施方案中，使用离心分配色谱(CPC)。该技术具体描述于A。P。FOUCAULT，Ed。，Centrifugal Partition Chromatography(离心分配色谱)，Chromatographic Science Series，Marcel Dekker Inc。，1995，68或W。D。CONWAY，Ed。，Countercurrent Chromatography apparatus theory和applications(逆流色谱装置理论和应用)，VCH Publishers Inc。，1990.CPC是基于通过混合两种或更多种溶剂或溶液而制备的两种不混溶液相之间的溶质分配。所述两种相中的一种通过离心力保持静止。溶剂、它们的比例和流速的选择与CPC柱中静止相的稳定性和实际压力密切相关。

因此，本领域技术人员能根据所需纯化的提取物的性质选择最合适的溶剂。因此，粗提取物和富集的部分能含有任何从OEGJ鉴定出的化合物，并且所述化合物作为主要成分。这些不同的提取物，即粗提取物或富集的提取物，也在本发明的范围内。实施其它分离过程允许分离这些富集了一种或多种化合物的提取物。使用合适溶剂的按照适合于所选择的分离的比例的混合物，可以对从粗提取物富集的部分或对粗提取物自身进行这些分离。

用于增加生存年限或健康年限的方法和组合物

本发明是基于下述发现：OEGJ不仅能通过保护细胞免受缺血和应激的影响来增强重要细胞(例如神经元和心肌细胞)的存活能力，还能上调细胞存活因子和端粒酶的表达，所述细胞存活因子包括Akt1、Bcl2、EGF、VEGF和NFκB等。此外，本发明人发现，OEGJ能促进重要缺血器官(例如心脏和脑部)中的新血管形成，并且能诱导受损心脏的心肌细胞和脑中的神经元再生。这些实验结果显示：OEGJ能有效地在一定程度上预防衰老，甚至逆转衰老，并提高生存年限或生活质量。

通常，本发明涉及改善年龄相关的生理学病症和延长哺乳动物的生存年限以及改善老龄哺乳动物的生活质量的方法。一方面，本发明提供增加有需要的个体寿命和/或增强有需要的个体活力的方法，其包括给予所述个体有效量的本文所述的化合物、组合物、活性部位或提取物。在一些实施方案中，柔毛水杨梅的甲醇/乙醇提取物、其活性部位和分离的化合物能显著增加被处理的细胞/组织中的端粒酶活性并显著增加哺乳动物个体的生存年限。本文所述的试剂能显著增加新生哺乳动物个体的活力和存活能力。接受处理的哺乳动物个体更具活力并且表现明显更为健康。与未处理的对照个体相比，接受处理的哺乳动物个体的承受危及生命的应激的能力也显著增加。

一方面，增加寿命和/或增强生活质量的方法包括给予有需要的哺乳动物来自多种植物的试剂、和活性部位和/或提取物和化合物以及所述化合物的衍生物，所述植物包括柔毛水杨梅和仙鹤草。

另一方面，用于增加寿命和/或改善生活质量的试剂是含有一种或多种赋形剂、载体或填充剂的药物组合物的一部分。在一个实施方案中，所述药物组合物以单位剂量形式包装。所述单位剂量形式能有效诱导增加个体的寿命和/或增强个体的活力和存活能力。

在本发明的各个实施方案中，进行合适的体外或体内测定来确定本发明试剂(提取物、活性部位部分和化合物)的效果，以及所述试剂的给药是否适用于增加哺乳动物个体的寿命和/或提高哺乳动物个体的生活质量。在一些实施方案中，使用体外模型来评价试剂对个体的影响。合适的模型包括但不限于应激抗性测定，其中将秀丽隐杆线虫暴露于27℃的致死温度和受试试剂。研究了试剂在调节有机体中抵抗应激的效果，并与合适的对照进行比较。

在一些实施方案中，使用长寿的体内模型来评价试剂对个体的效果。合适的模型包括生存年限测定，其中准备年龄同步化的秀丽隐杆线虫蠕虫，并使其生活在添加了受试试剂的琼脂上。另一模型是短生存年限小鼠，其中单一klotho基因突变导致多种年龄相关病症。研究了试剂在调节有机体个体中的年龄相关病症的效果，并与合适的对照进行比较。

在一个实施方案中，本发明提供通过将细胞与本发明的植物提取物、活性部位和/或化合物接触而增加细胞对应激的抗性或预防细胞凋亡的方法。

本文所述的方法可以用于增加细胞、特别是原代细胞(即，获自诸如人的生物体的细胞)在细胞培养物中存活的时间。还可以用本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物处理胚胎干细胞(ES)和多能细胞以及从它们分化而来的细胞，从而使培养物中的细胞或其后代存活更长的时间。例如在离体修饰之后，这些细胞还可以用于移植入个体。

糖尿病

另一方面，本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可以用于治疗或预防代谢性病症，例如胰岛素抵抗、前糖尿病状态，I型和II型糖尿病和/或其并发症。

糖尿病是指人具有高血糖水平的代谢性病症，其原因是机体不能产生足够的胰岛素或利用胰岛素的能力下降。胰岛素在胰腺中产生，它是在细胞水平将葡萄糖转化为能量的激素。葡萄糖对我们的健康至关重要，因为它是肌肉和其它组织中的细胞的主要能量形式。然而，血液中异常高水平的葡萄糖，也称为高血糖症的疾病状态，会导致急性和慢性血管疾病并发症，例如失明、肾衰、冠心病、中风和截肢(Pankaj，2007)。

I型和II型糖尿病是两种最常见的糖尿病形式。I型糖尿病最常见于儿童期或青春期，其主要是由于胰腺中朗格汉斯氏岛中的产胰岛素β细胞的丧失，随之导致胰岛素缺乏。T细胞介导的针对β细胞的自身免疫应答是I型糖尿病的主要内在机制。II型糖尿病占所有糖尿病病例的90％，其主要是由于胰岛素抵抗和β细胞功能紊乱(Lin & Sun，2010)。与I型糖尿病相反，II型糖尿病患者的胰岛素水平，特别是在早期时，非常高，因为机体试图对胰岛素抵抗进行补偿。然而，随着疾病的发展，由于胰岛素抵抗和增加的肝葡萄糖产生，即使高于正常的胰岛素水平也不能将血浆葡萄糖保持在正常水平。随着疾病的进程，很可能由于β细胞功能的进行性恶化和加速的β细胞凋亡导致胰岛素下降，从而进一步加重疾病状态(Wajchenberg BL，2007)。

我们最近的研究表明，OEGJ能显著促进肌肉、心脏和脑部中新的血管的生长。OEGJ诱导的血管生成和肌肉再生都会增强体内葡萄糖的利用和消耗，导致糖尿病患者血糖水平降低。此外，如果在心脏、脑部和肌肉中发现的OEGJ诱导的细胞再生也存在于胰腺，则OEGJ治疗能补偿β细胞的丧失。因此，本文所述的植物、提取物，活性部位和/或化合物的给药可以为糖尿病患者提供有效治疗。

在示例性的实施方案中，本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物的给药可以作为治疗或预防糖尿病的联合治疗的一部分。例如，一种或多种本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可以与一种或多种抗糖尿病药联合给药。示例性的抗糖尿病药包括，例如醛糖还原酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、山梨醇脱氢酶抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶1B酶抑制、二肽基蛋白酶抑制剂、胰岛素(包括口服生物可利用胰岛素制剂)、胰岛素模拟物、二甲双胍、阿卡波糖、过氧化物酶体增殖活化受体-γ(PPAR-γ)的配体(例如曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮或GW-1929)、磺酰脲类、格列吡嗪、格列本脲或氯磺丙脲，其中第一和第二化合物的量产生治疗效果。其它抗糖尿病药包括葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰岛素、PPAR-α/γ双激动剂、美格替耐和αP2抑制剂。在示例性的实施方案中，抗糖尿病药可以是二肽基肽酶IV(DP-IV或DPP-IV)抑制剂，例如诺华公司的LAF237(NVP DPP728；1-[[[2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯-啶)或默克公司的MK-04301(参见例如，Hughes et al.，Biochemistry 38：1 1597-603(1999))。

炎性疾病、创伤愈合和褥疮

在其它方面，本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可用于治疗或预防炎症相关疾病或病症。可以在炎症发生之前、发生时或发生之后给予本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物。当预防性使用时，优选在任何炎症反应或症状之前提供所述化合物。所述化合物的给药可以预防或减轻炎症反应或症状。

炎症是复杂的生物学过程，机体通过炎症对感染、损伤或刺激作出反应(Medzhitov，2008)。炎症是保护机体免受诸如细菌、病毒和寄生虫的各种致病外来物的影响的防御机制。尽管急性炎症是治愈创伤和感染的先决条件，但是由于免疫系统不能清除外来物而造成的长期炎症(也称为慢性炎症)会导致许多疾病，包括风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘和炎性肠病(Ku et al.，2009；Hamid & Tulic，2009；Kaser et al.，2010)。最近，慢性炎症和中枢神经系统疾病、癌症和心脏病发作之间的联系已被提出(Kang & McGavern，2009；Grivennikov et al.，2010)。慢性炎性疾病困扰世界数以百万计的人并且难以治疗，目前还没有治愈性药物。很多用于治疗慢性炎性疾病的药物具有严重的副作用，包括胃出血、糖尿病和高血压。

在某些实施方案中，一种或多种本发明的植物、提取物、活性部位和/或化合物可以单独给药或与用于治疗或预防炎症的其它化合物联合给药。示例性的抗炎药包括，例如类固醇(例如皮质醇、可的松、氟氢可的松、强的松、6α-甲基强的松、去炎松、倍他米松或地塞米松)、非甾体类抗炎药(NSAIDS，例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、托美丁、布洛芬、甲灭酸、吡罗昔康、萘丁美酮、罗非昔布、塞来昔布、依托度酸或尼美舒利)。在另一个实施方案中，其它治疗剂是抗生素(例如万古霉素、青霉素、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、头孢克肟、利福平、甲硝唑、强力霉素或链霉素)。在另一个实施方案中，其它治疗剂是PDE4抑制剂(例如罗氟司特或咯利普兰)。在另一个实施方案中，其它治疗剂是抗组胺剂(例如赛克利嗪、羟嗪、异丙嗪或苯海拉明)。在另一个实施方案中，其它治疗剂是抗疟药(例如青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯、磷酸氯喹、盐酸甲氟喹、盐酸强力霉素、盐酸氯胍、阿托伐醌或卤泛群)。在一个实施方案中，其它治疗剂是drotrecogin alfa。

创伤愈合是意外损伤或手术介入后的复杂并且动态的过程，其中机体自我修复并恢复细胞结构和组织层。正常创伤愈合分为三个阶段：炎症期、增生期和重建期(Stadelmann et al.，1998)。增生期中的血管生成对于创伤愈合至关重要。在血管生成的过程中，血管内皮细胞形成新的血管。

褥疮也称为压疮或压力性溃疡，大部分情况下是由于未减轻的压力而造成的病变(Bluestein D & Javaheri A，2008)。虽然褥疮可以影响身体的任何部位，但褥疮最常见的身体部分是骨或软骨区，例如膝、踝和肘，特别是臀部、胯部和脚跟的皮肤。发展为褥疮的高风险人群是瘫痪的人或无人帮助的情况下不能改变体位的人。如果不能早期发现，褥疮可致命，并且是发达国家中主要医源性死因之一。当持续的压力切断易受伤害的身体部位的循环时，就发展为褥疮。受累的组织最终由于供血不足而死亡。因此，能改善血供的试剂可用于治疗褥疮。

眼部病症

本发明的一方面是通过给予患者治疗剂量的本发明的植物、提取物、活性部位或化合物或其药学可接受的盐、前药或代谢衍生物来抑制、减少或治疗包括白内障和老视在内的眼部病症的方法。

在一些实施方案中，OEGJ能有效治疗某些眼部病症，特别是年龄相关的和退行性眼部病症，例如白内障和老视。白内障是眼睛晶状体中不透明的或混浊的区域。根据所述区域的大小和位置，白内障对正常视力的影响从轻微不透明至完全失明。年龄相关的白内障是最常见的白内障类型，并且影响60％的65-74岁人群和91％的75-85岁人群。根据世界卫生组织，年龄相关的白内障是世界范围内约50％的失明原因，并且是超过55岁人群中丧失视力的首要原因(Asbell et al.，2005)。晶状体蛋白的变性和聚集被认为是白内障的内在原因。另一方面，老视也是年龄相关的眼部疾病状态，其中眼部的晶状体逐渐丧失弹性，从而随着衰老而难以对近距离物体聚焦(Charman，2008)。

本发明的另一方面是通过给予有需要的个体治疗剂量的本发明植物、提取物、活性部位或化合物来治疗(包括抑制和预防性治疗)包括白内障、老视等在内的年龄相关的眼部疾病。

在一个实施方案中，联合药物方案可以包括用于治疗或预防眼部病症或与这些疾病状态相关的继发疾病状态的药物或化合物。因此，联合药物方案可以包括一种或多种本发明的植物、提取物、活性部位或化合物和一种或多种用于治疗眼部病症的治疗利。例如，一种或多种本发明的植物、提取物、活性部位或化合物可以与有效量的一种或多种试剂联合。

药物组合物的制剂和剂量

在本发明的各个实施方案中，进行的体外或体内分析来确定本发明试剂(提取物、活性部位和化合物)的效果以及所述试剂的给药是否适用于治疗个体所患疾病或医学疾病状态。这些分析的实例在上文中结合具体疾病或医学治疗进行了描述。

通常，足以实现治疗或预防效果的本发明组合物的有效量为约0.000001mg/千克体重/天至约10,000mg/千克体重/天。合适的情况下，剂量为约0.0001mg/千克体重/天至约2000mg/千克体重/天。示例性的治疗方案为每天一次或每周一次或每月一次给药。通常多次给予所述试剂。单次剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。或者，可以以缓释制剂的形式给予所述试剂，在这种情况下，需要给药的频率减少。剂量和频率根据试剂在个体中的半衰期而不同。给药的剂量和频率可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，在长期以相对低频率的间隔给予相对低的剂量。某些个体持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直至疾病的进展降低或停止，并优选地直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善。在此之后，可以给予患者预防方案。

毒性

合适的情况下，本文所述的试剂的有效量(例如，剂量)能提供治疗益处，而不会产生对个体的明显毒性。可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定本文所述的试剂的毒性，例如，通过测定LD₅₀(半数致死量)或LD₁₀₀(绝对致死量)。毒性效应和治疗效果的剂量比是治疗指数。获自这些细胞培养物分析和动物研究的数据可以参考用于制定人类中使用无毒性的剂量范围。本文所述的试剂的剂量优选处于包括有效剂量且仅具有很小的毒性或无毒性的血循环浓度的范围内。根据所用剂型和给药途径，剂量可以在该范围内变化。确切的制剂、给药途径和剂量可以由医师根据个体的疾病状态来选择。参见，例如，Fingl et al，In：The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ch.1(治疗的药理学基础，第一章)(1975)。

根据本发明的方法，可以将所述试剂合并到适于给药的药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物可以包含适于对个体进行给药的形式的纯化的或基本纯化的柔毛水杨梅提取物和药学可接受的载体。在其它实施方案中，所述药物组合物所包含的药学可接受的载体在一定程度上由所给予的具体组合物以及用于给予组合物的具体方法决定。因此，适于给予组合物的药物组合物制剂有很多种(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，Mack Publishing Co。，Easton，PA 18^th ed。，1990)。通常将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品与药品管理局的所有良好生产规范(GMP)规程。

当形容组合物、载体、稀释剂和试剂时，术语“药学可接受的”、“生理学容许的”以及其语法变体可交换使用，并且表示该材料能够给予个体，并且不会产生需要禁止组合物给药的程度的不希望的生理学影响。例如，“药学可接受的赋形剂”表示该赋形剂可用于制备通常是安全的，无毒性的且满足需要的药物组合物，并且还包括兽医用途以及人类制药用途能接受的赋形剂。这些赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者对于喷雾剂组合物来说，可以是气体。“药学可接受的盐和酯”是指药学可接受的并具有所需药学性质的盐和酯。这类盐包括试剂中存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应的情况下形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属形成的盐，所述碱金属例如钠和钾、镁、钙和铝。合适的有机盐包括与有机碱形成的盐，所述有机碱例如胺类碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。这类盐还包括与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸，马来酸和烷基磺酸和芳基磺酸，例如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学可接受的酯包括与试剂中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基形成的酯，例如，C_1-6烷基酯。当存在两种酸性基团时，药学可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；同样，当存在多于两种酸性基团时，部分的或所有的这些基团可以被盐化或酯化。本发明中命名的试剂可以以非盐化或非酯化的形式或盐化和/或酯化的形式存在，并且这些试剂的命名意图包括原始(非盐化的和非酯化的)化合物及其药学可接受的盐和酯。此外，本发明所述的某些试剂可以以多种立体异构体的形式存在，涉及该试剂时意图包括所有单种立体异构体和这些立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其它)。本领域技术人员可容易地确定本发明的具体药物和组合物的合适的给药时机、顺序和剂量。

这些载体或稀释剂的合适的实例包括但不限于，水、盐溶液、林格氏液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和诸如不挥发性油的非水性载体。这些介质和化合物在药学活性物质中的使用是本领域公知的。除了与所述试剂不相容的任何常规介质或化合物之外，其它介质或化合物可用于组合物中。还可以将补充性活性化合物合并到组合物中。

本发明的药物组合物的配制符合其预期的给药途径。本发明的组合物可以通过以下途径给药：胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂。所述试剂可以任选地与在治疗各种疾病中至少有一定效果的其它试剂联合给药。

胃肠外、真皮内或皮下施用的溶液或悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的化合物，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以装入安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在可溶于水的情况下)或用于临时制备无菌注射液或分散液的分散剂和无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。无论在什么情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动性应当易于注射。其在生产和贮存条件下必须稳定，并且必须能抵抗诸如细菌和真菌的微生物的污染活动。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包被、保持需要的颗粒尺寸(在分散液的情况下)和施用表面活性剂来保持合适的流动性。可以利用各种抗菌和抗真菌化合物实现微生物活动的预防，所述抗菌和抗真菌化合物例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸，硫柳汞等。在很多情况下，优选在组合物中包含等渗化合物，例如糖，诸如甘露醇、山梨醇的多元醇，氯化钠。可以通过在组合物中包含延缓吸收的化合物实现注射组合物的持续吸收，所述化合物例如单硬脂酸铝和明胶。

可以通过将所需量的试剂合并入含有一种上文所列成分或上文所列成分的组合的合适的溶剂中然后视情况进行过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将结合剂合并到含有基本分散介质和上文所列的所需其它成分的无菌介质中来制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而从之前过滤灭菌的溶液得到活性成分和任何其它所需成分的粉末。可以以积存注射(depot injection)或植入制剂的形式给予本发明的试剂，植入制剂的制备形式能允许活性成分的持续释放或脉冲释放。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将口服组合物封装在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药，结合剂可以与赋形剂合并，并用于片剂、锭剂或胶囊的形式。还可以使用用于漱口水的流体载体来制备口服组合物，其中流体载体中化合物是经口施用、漱口和吐出或吞下。药学相容的结合化合物和/或辅助材料可以作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下述成分或具有相似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解化合物，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂化合物，例如蔗糖或糖精；或调味剂化合物，例如薄荷油、水杨酸甲酯或桔子香精。

在一个实施方案中，所述试剂与能保护所述试剂免于从体内快速清除的载体一起进行制备，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送体系。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法对于本领域技术人员是显而易见的。还可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc购买所述材料。脂质体悬液(包括靶向于感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可用作药学可接受的载体。可以根据本领域已知的方法进行制备，例如，美国专利第4,522,811号中的描述。

实施例

通过以下实施例进一步阐述本技术，但这些实施例不应解释为以任何方式进行限制。

实施例1.用于增强存活能力和端粒酶活性的由天然化合物组成的组合物的鉴定

使用由生物活性导向技术来筛选植物成分，从而鉴定增强端粒酶活性的化合物的组合物。在筛选植物提取物时，鉴定出柔毛水杨梅的有机提取物(OEGJ)能显著增强细胞的存活能力和端粒酶活性。简而言之，将从安徽省采集的10kg干燥的柔毛水杨梅切成小块，在室温下用90％甲醇/乙醇(10倍体积)渗滤6天。将提取物进行电喷雾，得到棕色粉末。

将提取物(150μg/ml)施加到间充质干细胞培养物后，发现OEGJ能提高细胞对抗诸如缺氧等应激的存活能力。RT-PCR分析表明，某些与细胞存活的相关基因上调，例如Akt1、Bcl2、VEGF、EGF和NFκB等。因此，我们在以下研究中进一步测试OEGJ的作用。

实施例2.增强培养的心肌细胞的存活能力

大量的细胞信号传导通路控制细胞功能，包括细胞分裂、分化、衰老和死亡等。某些疾病的发展也取决于这些细胞功能，特别是取决于细胞衰老和细胞死亡，而且这种影响随着年龄而增加。例如，由凋亡造成的心肌细胞损失导致心衰，抗凋亡(存活)信号的下调或促凋亡信号的过表达与这一疾病发展密切相关。

首先，我们测试了OEGJ是否能增强培养的心肌细胞的存活能力或防止细胞死亡。通过在缺氧环境室中培养心肌细胞造成缺氧。所述室的氧浓度保持为10mmHg，持续24小时。结果表明，与未处理的对照心肌细胞相比，从缺氧开始至缺氧结束的OEGJ处理显著增加了诸如Akt1、Bcl2、EGF、VEGF、NFκB的某些存活因子的表达，并显著防止细胞由于缺氧死亡。在未处理的对照心肌细胞中，随着缺氧时间延长，凋亡细胞数增加。相比之下，OEGJ处理增加细胞存活能力并减少凋亡细胞数(P＜0.01)。

实施例3.OEGJ增加秀丽隐杆线虫的存活

为了测试OEGJ是否能增强秀丽隐杆线虫的存活能力或预期寿命，使用了野生型N2秀丽隐杆线虫。通过漂白(bleaching)将秀丽隐杆线虫同步化，并分两组种到琼脂板上。平板为60mm的表面包被皿(约10ml固体形式的培养基)。蠕虫生活在强制通风的培养箱中的用大肠杆菌菌株OP50划线的NGM琼脂板上，培养箱温度保持为±0.5℃。用OEGJ(150μg/ml，每一个皿加上600μl药物溶液，每个皿都遮挡风干)处理约500个蠕虫/皿，用等量溶剂处理对照组蠕虫。在野生型秀丽隐杆线虫株中，秀丽隐杆线虫N2株在20℃-25℃下能诱导dauer幼虫形成。高于25℃-26℃对于秀丽隐杆线虫是致死温度。为了测试OEGJ处理的蠕虫的存活能力，将培养温度提高至27℃。图像采集于第7天和第14天(采集图像时，蠕虫暴露于20℃)。

我们发现，未处理的对照组的N2蠕虫在27℃下孵育7天后，部分蠕虫死亡，同时部分仍然存活，但是未观察到幼体蠕虫(图1：Ct-7)。相比之下，OEGJ处理的蠕虫在相同状态下孵育7天后，几乎没有蠕虫死亡，并且更有趣的是观察到很多幼体蠕虫(图1：OEGJ-7)。此外，27℃下孵育14天后，未处理的对照组中所有N2蠕虫死亡(图1：Ct-14)。形成鲜明对比的是，尽管OEGJ处理组中很多成体蠕虫死亡，但观察到相当多的幼体蠕虫仍然存活(图1：OEGJ-14)。这些结果表明：过高和致死的温度环境不仅使N2蠕虫绝育，还能在2周内杀死所有蠕虫。相比之下，OEGJ处理不仅增强蠕虫在致死温度环境下的存活能力，还能保持它们产生后代的能力。

OEGJ增加秀丽隐杆线虫的平均健康时间

为了测试OEGJ是否能刺激蠕虫中与细胞存活相关基因的上调并增强蠕虫的存活能力，通过漂白(bleaching)处理将野生型N2、daf-2和daf-16突变体秀丽隐杆线虫分别同步化并分为两组种到琼脂板上。daf-2基因编码秀丽隐杆线虫中的胰岛素样受体。daf-2的突变已被证实能使蠕虫生存时间加倍(Jennie B.et al.，1995；J.Apfeld & C.Kenyon，1998)。该基因已知能调节生殖发育、衰老、氧化应激抗性、耐热性、缺氧抗性以及细菌病原体抗性(M.S Garni & CA.Wolkow，2006)。daf-2是蠕虫中唯一的胰岛素/IGF-1样受体。胰岛素/IGF-1样信号转导从蠕虫到人都保守。daf-2的作用是通过磷酸化作用级联来负调节叉头状转录因子daf-16。研究表明，daf-16是daf-2依赖性生存时间延长和dauer形成所必需的。当非磷酸化时，daf-16是有活性的并存在于细胞核中。daf-16在决定秀丽隐杆线虫及其进化近亲的衰老速度和平均生存时间中起重要作用(S.T.Henderson & T.E.Johnson，2001)。在很多其它动物中也发现daf-16，包括人。daf-16是驱动衰老、免疫和应激响应中涉及的生物学过程的基因组中的一员。

在15℃下同步化的L1期N2、daf-2和daf-16蠕虫(约500个蠕虫/皿)生长在20℃强制通风的培养箱中用大肠杆菌株OP50划线的NG琼脂板上，培养箱的温度保持为±0.5℃。用OEGJ(150μg/ml，每一个皿加上600μl药物溶液，每个皿都遮挡风干)处理受试组的蠕虫，用等量溶剂处理对照组的蠕虫。另一例外实验是在20℃下同步化L1期的daf-2并使其在20℃下生长。

如图2所示，几乎在所有检查点，OEGJ处理组中观察到的活的蠕虫都多于未处理组。到第38天为止，所有未处理组的蠕虫死亡。然而，OEGJ处理组中约5％的蠕虫仍然存活(图2)。OEGJ处理组中剩余的蠕虫第42天才全部死亡，平均生存时间比未处理的对照蠕虫长约10％。

为了测试OEGJ处理对daf-2突变体秀丽隐杆线虫(其生存时间已经是野生型蠕虫的2倍)的生存时间的影响，我们用OEGJ测试daf-2蠕虫。结果表明，几乎在所有观察点，OEGJ处理组中发现的活的蠕虫都多于未处理组(图3)。未处理的对照中约5％的蠕虫在第56天存活，而OEGJ处理组中约10％的蠕虫仍然存活(图3)。

为了进一步测试OEGJ处理对具有显著较短生存时间的蠕虫的影响，使用了daf-16突变体秀丽隐杆线虫。我们发现，到第12天为止，未处理的对照组中约77％的蠕虫死亡(图4)。相比之下，OEGJ处理组中约50％的蠕虫在第12天仍然存活。(图4)。未处理组中死亡的蠕虫比OEGJ治疗多约27％，这表明OEGJ处理能显著增加健康时间。

为了更进一步测试OEGJ处理对不同状态下的daf-2秀丽隐杆线虫的生存时间的效果，daf-2蠕虫的同步化和生长都在20℃下进行。我们发现，OEGJ处理组中约58％的蠕虫在第21天仍然存活(图5)。相比之下，到第21天，未处理的对照组中约58％的蠕虫已经死亡(图5)。在所有检查点，OEGJ处理组中仍然存活的蠕虫比未处理组多约5-15％，提示OEGJ处理增加了健康时间和生存时间。

实施例4.OEGJ处理诱导小鼠长寿和增加的端粒酶活性

昆明(KM)小鼠在正常饲养下的生存时间通常是582.5±177.73天。将KM小鼠(n＝16)随机分为两组。给予受试组小鼠(n＝9，6月龄)2个月的OEGJ(200mg/kg/天，添加于食物中)。在相同时间给予6月龄对照组小鼠(n＝7)蔗糖(200mg/kg/天，添加于食物中)。然后，在12小时光照/黑暗周期的环境受控条件下饲养小鼠。所有动物自由摄取标准鼠颗粒料和水。

TERT(端粒酶逆转录酶)是端粒酶的催化亚基。使用基于TaqMan

荧光方法的RT-PCR对全范围的mTERT(小鼠TERT)mRNA拷贝数进行定量。在PCR的延伸期中，探针与靶序列杂交，然后由于Taq聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性而被切割。报告子荧光信号的增加与特定PCR产物的量成比例，这提供了高度精确并且可重复的定量。达到荧光阈值的PCR循环数是循环阈值(Ct)。每个样品的Ct值与输入cDNA的初始量的对数成比例。通过将未知样品的Ct值绘制在标准曲线上，可以计算样品中靶序列的量。为了将mTERT mRNA表达相对于样品与样品在输入RNA、RNA质量和逆转录酶效率中的差异进行标准化，扩增管家基因GAPDH。根据每条标准曲线，分别测定GAPDH和mTERT的拷贝数。mTERT和GAPDH的拷贝数之比代表每个样品的标准化的mTERT，并且可以与其它样品的标准化的mTERT进行比较(Artandi SE et al.2000)。

OEGJ给药2个月后，将来自OEGJ处理组的4只小鼠和来自未处理对照组的2只小鼠处死。利用Trizol(Invitrogen)，分别从心脏制备总RNA。GC1细胞系用作实验的阳性对照。利用Superscript II(Invitrogen)，按照厂商说明书，使用随机引物进行逆转录。在BioRad MJ Mini实时PCR上，对两个稀释液以双平行样品进行实时PCR。对于每个mRNA样品，用GAPDH mRNA含量校正Tert表达。程序为在50℃下初始孵育2分钟，然后是95℃持续10分钟和40个循环，每个循环为95℃持续15秒、68℃持续2分15秒、95℃持续15秒、63℃持续20秒、95℃持续15秒。在每个循环，测定产物的熔解点。PCR利用对Tert基因特异的一组引物。

结果表明：在所有样品中观察到18s和GAPDH内参的阳性信号。在所有4个OEGJ处理的心脏样品和GC1细胞中观察到mTERT的阳性信号。未处理对照心脏样品中仅有非常低的或几乎没有mTERT表达。所有4个处理的样品表现出的mTERT表达比未处理对照样品高约2^4.8-13.27倍(图6)。此结果为OEGJ处理能控制诱导TERT表达的假说提供了可能性。

为了测试细胞存活基因和TERT的增强表达能否转化为延长的生存时间，我们利用上述OEGJ处理的小鼠继续进行实验。我们发现，处理的小鼠的活动更具活力并且明显表现出更健康。与未处理的对照动物相比，处理的小鼠的承受危及生命的应激能力也显著增强。因此，剩余的5只OEGJ处理的小鼠的平均生存时间为763±108天。相比之下，剩余的5只未处理的小鼠的平均生存时间为610±158天。综上所述，OEGJ处理的小鼠享有的生存时间比未处理的对照长17-25％(图6)。

实施例5.OEGJ引起衰老加速小鼠中年龄相关病症的改善

衰老加速小鼠(SAM)系由日本京都大学衰老生物学部建立，其作为衰老加速和年龄相关病症的新的鼠模型。在本研究中，使用短寿小鼠(SAMP10)。SAMP10小鼠表现出加速的衰老。SAMP10中最典型的年龄相关改变是脑萎缩，特别是大脑的额部，额部脑皮质、顶部脑皮质、颞部脑皮质和枕部脑皮质。在衰老的SAMP10中，这些区域中的大神经元通常收缩和/或消失(Shimada et al，1992)。所有这些典型病理学表型与老年人中通常观察到的年龄相关病症相似。SAMP10小鼠存活时间的中位数为333天(Takeda et al，1991)。

当SAMP10小鼠4月龄时，用OEGJ(400mg/kg/天，配制于H₂O悬液)通过灌胃给药每天治疗受试组小鼠(n＝16)，持续4周。给予未治疗对照组小鼠(n＝16)等量的水。停止治疗后1个月，即小鼠约为6月龄时，使用Morris水迷宫(1.8M)来评价两个组的所有小鼠的空间学习和记忆能力。每天训练动物5次，训练4天。通常，将找到平台的耗时用于评价小鼠对于平台位置的学习能力和记忆的强度。记录找到隐藏平台之前的耗时(也称为逃避潜伏期)。结果表明，OEGJ治疗的SAMP10小鼠表现出的逃避潜伏期显著短于未治疗的小鼠(P＜0.001)。

在4周的OEGJ治疗后，利用东芝超声扫描仪的12-MHz线性探针研究实验小鼠的脑血流(CBF)。为了排除OEGJ的血管扩张效应的可能性，4周OEGJ治疗之后2周再次测定CBF。3次重复测量的平均值作为CBF。我们发现，OEGJ治疗的小鼠的CBF比未治疗的对照小鼠平均高15％。有趣的是，当在水迷宫测试之后处死小鼠时，OEGJ治疗小鼠的脑部净重量平均比未治疗的小鼠重约15％。此外，未治疗的小鼠的血压为约135mmHg，比正常小鼠的血压高约13％。相比之下，OEGJ治疗的SAMP10小鼠的血压比未治疗的对应者的血压低约10％。这些结果提示，OEGJ治疗诱导了小鼠脑中新的侧支血管形成，从而减少小动脉或微血管的外周阻力，从而能够显著增加脑部血流。

为了证实OEGJ治疗的动物中增加的CBF的物理基础，从CBF测量之后处死的实验小鼠中取出脑部，福尔马林固定，石蜡包埋，组织切片(5μm)，H&E染色。通过对额叶皮质内和海马区周围的血管进行计数来确定组织学切片的血管密度。将额叶或海马内的6个随机且非重叠高倍镜视野(HPF)(40倍)用于对每个切片的所有血管进行计数。取每个HPF中的血管数的平均值，并将其表示为每个HPF的血管数。由2个研究人员以盲法的方式进行血管计数。

血管计数的结果表明：在未治疗的对照小鼠中，额叶皮质区的血管数为约68.6±16.3/HPF，海马区周围的血管数为46.8±13.2/HPF(图7)。相比之下，在OEGJ治疗的小鼠中，额叶皮质区的血管数为约83.8±12.9/HPF，海马区周围的血管数为61.7±11.2/HPF(图7)。

为了研究OEGJ治疗诱导的脑部微循环的改善是否能引起神经元再生从而取代受损的或死亡的神经元，从获自实验小鼠脑部的每一块切下的薄切片(5μm)，并用抗Ki67的特异性抗体进行免疫组化染色。通过对切片的显微镜检查，我们发现OEGJ治疗不仅增强脑皮质区和海马区中新血管的生长，还能在这些区域诱导神经元再生(图8)。相比之下，在未治疗的对照脑中，既未鉴定到脑部显著的新侧支血管的生长，也未发现神经元的再生(图8)。新再生的神经元样细胞能被对Ki67特异的抗体阳性染色(图8)，这表明它们是新再生的神经元细胞。

综上所述，这些观察结果提示，OEGJ不仅能明显刺激SAM小鼠脑部中新的侧支血管的生长，从而改善CBF，还能诱导负责学习和认知能力的额叶皮质和海马区中的神经元再生，这可能是水迷宫探索试验中明显改善的行为表现的物理基础。综上所述，以上结果提示，OEGJ能通过刺激细胞生存和功能性脑部微循环的重建以及取代受损的或死亡的重要细胞(例如用新再生的神经元或心肌细胞取代受损的或死亡的神经元或心肌细胞)来降低衰老过程的进展，或甚至逆转衰老。因此，本发明的组合物可以用于提高寿命和生活质量。

实施例6.糖尿病

基于上述证据，在人道治疗的基础上，在糖尿病患者中测试了OEGJ用于治疗糖尿病的可能性。在治疗之前1年，1名59男性在进行痔疮手术之前被首次诊断有糖尿病。当时，他的血糖水平为24.0mmol/L。他接受了1周的胰岛素治疗，并开始服用糖尿病药物(达美康80mg，每早空腹2片)。服药的6个月中，他的平均血糖水平为9.97mmol/L。他开始口服OEGJ(1.8g/天)并联合达美康，在2个月的OEGJ治疗期中，他的平均血糖水平降低至7.90mmol/L。即使在中断OEGJ治疗之后，他的平均血糖水平在相似水平(8.06mmol/L)保持了2个月。

实施例7.炎性疾病、创伤愈合和褥疮

根据上述治疗效果，OEGJ应当可用于治疗慢性炎性疾病、创伤和褥疮。因此，在人道治疗的基础上，我们测试了使用OEGJ治疗慢性炎性疾病、创伤和褥疮的可能性。

约2年前，来自上海的1名女性患者发生多次脑部发作(中风)。在约8个月前她发生另一次脑部发作之后，她完全丧失语言和所有体力活动能力。她丧失了对任何事件的任何前摄反应，并且表现为完全的植物人患者，伴有肌肉僵硬。数月后，在检查时她的臀部发生深度褥疮(直径16-18cm，深度10-12cm)。使情况更糟的是患者还感染了多药耐药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。人们担心如此严重的褥疮和感染会夺去她的生命。对坏死和腐烂组织进行手术清创之后，给予她OEGJ(口服给药，2g/天)。OEGJ给药1周后，她的褥疮开始快速愈合。开放的创伤变得更小并逐渐变浅。2个月的OEGJ治疗使她的深度褥疮完全愈合。当患者停止服用药物时，褥疮的愈合速度下降。在患者恢复OEGJ治疗之后，褥疮的愈合速度提高。

实施例8.眼部病症

基于上述证据，在人道治疗的基础上，在患者中测试了OEGJ可用于治疗年龄相关的眼部病症和退行性眼部病症的可能性。

1名80岁的女性在4年前开始表现出白内障的症状。她的视力逐渐恶化，即使佩戴眼镜也不能看清电视上的画面。她接受了OEGJ(2g/天)口服给药1个月。3个月后，她诉说甚至可以不佩戴眼镜就能轻松地看电视。她还能很好地阅读杂志和书籍。

1名78岁的男性被诊断为重度白内障超过1年，他视力模糊并最终失明。白内障手术后，他的视力恢复一些。然而，2周后，他再次完全丧失了视力。白内障手术后3个月，他接受了OEGJ(1.5g/d天)口服治疗2个月。OEGJ治疗后，他能清楚地辨认个人并且在行走时能够寻路。他甚至能辨认菜地中的小物体(3cm长，直径0.3cm)。

1名48岁的女性由于老视而佩戴老花镜超过8年。8个月前，她必须佩戴度数更高的老花镜才能看清电脑上的内容。1个月的OEGJ口服给药(0.5g/天)之后，她甚至能够不佩戴眼镜阅读电脑上的文章。

1名48岁的男性在约4年前由于老视而开始主诉视力问题。不佩戴老花镜的情况下，他不能看清身份证上的详细内容。OEGJ(2g/天)口服给药2个月后，他甚至可以不佩戴老花镜而容易地读出身份证。

根据上述OEGJ的多种治疗效果和OEGJ在治疗眼部病症患者中的有前景的效果，我们提出OEGJ可以通过显著促进由于衰老造成的供血不足的物理重建，从而明显改善眼中组织和细胞的生存微环境来发挥其作用。对于白内障，通过增加眼中的血流，OEGJ可以有助于预防和/或延缓蛋白聚集在晶状体上，并且还能有助于溶解晶状体上先前存在的蛋白聚集体。对于老视，OEGJ诱导的微环境的改善可以有利于保持晶状体的弹性和增强负责弯曲和拉直晶状体的睫状肌的强度。按照该发现，OEGJ还可以用于治疗其它眼部病症，例如糖尿病性视网膜病、色素性视网膜炎和眼缺血综合征。

尽管已经展示并描述了某些实施方案，但是应当理解，在不脱离权利要求书所限定的较宽范围中的技术的情况下，本领域技术人员可以在其中做出改变和改动。

本公开不应局限于本申请所述的具体实施方案。在不脱离其实质和范围的情况下，可以进行很多改动和变化，这对于本领域技术人员是显而易见的。本公开范围内除本文所列之外的功能上等同的方法和装置对于阅读了上述描述的本领域技术人员是显而易见的。这些改动和变化意图包括在附加权利要求书的范围内。本公开仅受附加权利要求书的内容以及这些权利要求赋予权力的等同物的全部范围的限制。应当理解，本公开不局限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物体系，上述是必然能够变化的。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案，而并非意图进行限制。

此外，当以马库什组的方式描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员应当认识到，还从任何个体成员或马库什组成员的亚组的方式描述了本公开。

本领域技术人员应当理解，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面的目的，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围以及子范围的组合。任何列出的范围能容易地被认为充分描述和赋予了同一范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的情况。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围能容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还应当理解，诸如“多至”、“至少”、“大于”、“少于”等的所有语言包括所记载的数值，并且是指能如上文所讨论随后分解成子范围的范围。最后，本领域技术人员应当理解，一个范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。同样，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，以此类推。

尽管本文中公开了各个方面和实施方案，其他方面和实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案仅是说明目的，而不是意图进行限制，附加权利要求书表明真正的范围和实质。

参考文献

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Claims (18)

1.提高有需要的个体的寿命、存活能力和生活质量的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物(OEGJ)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物刺激端粒酶和一种或多种选自Akt1、Bcl2、EGF、VEGF和NFκB的细胞存活因子的表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中与未给予所述提取物的个体相比，所述提取物增加生存年限或生活质量。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物是乙醇提取物。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物是甲醇提取物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述提取物通过口服给药。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述提取物通过皮下注射、肌内注射或静脉输注进行给药。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所给予的提取物的量为0.01mg/kg/天至2000mg/kg/天。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述有效量的提取物是包含所述提取物和药学可接受的载体的制剂。

11.用于提高个体寿命、存活能力和生活质量的药物组合物，包含有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物和药学可接受的载体。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述有机提取物是乙醇提取物。

13.如权利要求11所述的组合物，其中所述有机提取物是甲醇提取物。

14.预防或治疗有需要的个体中的糖尿病的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物。

15.预防或治疗有需要的个体中的眼部疾病或疾病状态的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物。

16.治疗有需要的个体中的炎症的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物。

17.增强具有创伤的个体的创伤愈合的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的柔毛水杨梅(Geum japonicum)有机提取物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述创伤是褥疮。

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