CN101141965A - 用于在肌肉损伤治疗中使肌纤维再生的药物组合物和方法 - Google Patents

Abstract

用于在治疗或修复由缺血性疾病引起的心肌损害或损伤中使心肌细胞再生的药物组合物和方法。该药物组合物含有具有式(I)所示主链结构的活性成分化合物。该活性成分化合物能够：(a)增加生肌性前体细胞的存活力以使所述前体细胞能够在经过绝对缺血时期后依然存活；(b)在所述受损肌肉所处的所述心脏区域中重建已破坏的血液供应网络；和(c)增强所述前体细胞沿心脏谱系的生心肌性分化效率，所述步骤同时进行或以任何特定顺序进行。

Description

用于在肌肉损伤治疗中使肌纤维再生的药物组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2006年4月13日提交的U.S.临时申请No.60/791,462的优先权，其内容在此引入作为参考。本申请进一步要求2005年11月8日提交的PCT申请Nos.PCT/TB2005/003202和PCT/IB2005/003191的优先权，其内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及一种使肌细胞和心肌再生的药物组合物和方法，其用于治疗肌损伤。特别是，涉及一种用于在治疗或修复由缺血性疾病引起的心肌损害或损伤中使心肌细胞再生的药物组合物和方法。

发明背景

心肌梗塞(MI)或心脏病发作，是因部分心脏的血流供应中断而引起心肌细胞损伤或死亡而导致的疾病。该疾病是导致全世界男性和女性死亡的主要原因。心肌梗塞发生后，似乎没有任何自然的修复过程能产生新的心肌细胞来替代损耗的肌细胞，相反地，瘢痕组织可能会替代坏死的心肌而导致心脏功能的进一步衰退。

用新生的再生功能性心肌细胞来替换坏死的心脏组织的治疗性替换是理想化的治疗手段，直到最近仍是不切实际的，因为心肌细胞被认为是末端分化的，或换句话说，心脏是有丝分裂后非再生型器官(postmitotic nonregenerating organ)。然而，最近Beltrami等和其他人对该观点提出了异议，他们报告了当梗塞后，在心肌中固有的一些肌细胞能够并且的确进行复制。为了促进和提高梗塞心肌的修复，试图进行心肌细胞或骨骼成肌细胞的移植，但是在重构功能性心肌和冠状血管方面不是很成功。心肌梗塞后用于心脏修复的成人骨髓衍生的间质干细胞(MSC)的移植，使得某些血管发生和肌形成，但是新生的再生心肌细胞大多数出现在沿边缘带的位置，这里的血液供应相对受影响较少。

由于急性心肌梗塞(MI)会迅速导致心室的供血区域中的肌细胞(心肌细胞)、血管结构和非血管部件的损害或死亡，因此如果没有局部血液系统的重建而单靠通过心肌细胞亚群的生长^4-8或MSC^1-3的移植使新的心肌细胞再生来替代中央梗塞区(绝对缺血区)中的梗塞的心肌(心肌组织)看来是不可能的。这也许可以说明为什么在仅MSC移植后心肌细胞的再生大部分是沿着保持大量血流供应的梗塞的邻近边缘带发生^1-11。因此，在梗塞中心区的心肌、小动脉和毛细血管的损失看来是不可逆的，最终会导致瘢痕的形成。

更近期的研究¹²显示，用外源性Akt预修饰的MSC的体外心脏移植有更好的结果。但是，再生的心肌细胞仅能从边缘带进入瘢痕组织，表明外源性Akt的过表达尽管能增加移植的MSC的存活能力但不足以使它们在中心缺血区存活。而且，甚至在缺血程度较低的边缘带，人们注意到MSC衍生的再生心肌细胞是分散的而且看起来难以群聚并形成再生的心肌。这可能应归咎于由于存活的移植MSC的成心肌性分化效率(cardiomyogenic differentiation efficiency)较低。心肌细胞的自然再生，包括居留祖肌细胞或其他来源的(如内皮细胞或骨髓中的生态位)干细胞的分化，不足以平衡发生在受急性或慢性损害的心脏中的心肌细胞死亡，这个认识挫伤了那些认为心肌再生将成为一种有前途的治疗心脏疾病的方法的研究者的热情。

现有技术显示，在梗塞心肌的全部区域再生功能肌细胞方面，有三个关键的需求：1)增强的移植细胞的存活能力，从而使其经历绝对缺血期而依然存活，所述绝对缺血期即从注入供体细胞至新生血管形成的时期；2)梗塞的心肌中受损的血流供应网络的早期重建，以维持移植细胞的存活和有效的运输并维持氧合作用及养分的输送；和3)增强的移植细胞的生心肌性分化的效率(cardiomyogenic differentiation efficiency)，以使更多的存活的供体细胞分化成心脏谱系。

因此，为实现用新的再生功能的心肌细胞替代坏死心脏组织的治疗目标，需要新的治疗途径以适合心肌梗塞治疗的需要，例如，使用具有充分满足上述三方面需求的生物学特性的化合物。

发明概述

本发明的一个目的是提供包含化合物的药物组合物，所述化合物选自共同具有通式(I)所示主链结构的一类化合物。该化合物对体外MSC的存活潜能和生心肌性分化的效率，以及体内MI修复都具有有力的治疗效果。这些化合物自身在本领域是已知的，但其具有的上述生物活性和疗效是不为人知的。它们可从自然资源，特别是从植物中分离，或者也可用目前的或将来发展的合成技术通过完全或半化学合成来获得。主链结构自身具有上述的生肌(myogenic)效应，通过在主链结构不同位置的一个或多个氢原子的取代可以形成多种变体。这些变体具有共同的主链结构和生肌效应。当然，它们的生肌能力可能不同。

式(I)

式(I)的主链结构可具有一个或多个连接的取代基。取代基是代替氢原子位置的取代原子或原子基团。可通过有机化学领域已知的方法实现取代。例如，通过适宜的设计，采用高通量组合合成方法能生产一大批在主链结构的不同位置连接有多种取代基的变体或衍生物。这些分子式(I)的变体或衍生物的选择是基于间质干细胞(MSC)的活性实验，该实验可迅速地确定一种特定的变体是否可促进培养的MSC的增殖和生心肌性分化。本申请中使用的术语“分子式(I)的化合物”包括主链化合物本身和具有相似生物活性的其取代的变体。下面给出了这些变体的例子，所有的变体在再生功能性肌细胞方面都具有与主链结构(即主链化合物本身)相似的效果：

                                                       4野蔷薇甙

2α，3β，19α，23-tetrahydroxy

urs-12-en-28-oic acid                                          5悬钩子皂苷R1

3委陵菜酸                                   6蔷薇酸

而且，作为一种治疗药剂，化学式(I)的化合物可为下述定义的“功能衍生物”的形式。

本领域的普通技术人员已知，上述化合物可制成各种外消旋异构体、对映异构体、或非对映

异构体形式，可与无机和有机酸形成盐，也可形成衍生物，例如N-氧化物，前药，生物电子等排体。“前药(prodrug)”指化合物的一种非活性形式，这是由于其连接了以瞬时方式使用的一个或多个特定的保护基以改变或消除母体分子的不良性质，前药在给药后能在身体内部(体内)代谢或转化为活性化合物。“生物电子等排体”指将原子或原子团与另一大致相似的原子或原子团交换而生成的化合物。生物电子等排基团替换的目的是创造与母体化合物具有相似生物学性质的新化合物。生物电子等排基团置换可以是基于物理化学或拓扑的。由已知化合物(例如在本说明书中公开的那些化合物)制备适合的前药、生物电子等排体、N-氧化物、药学可接受的盐或各种异构体是本领域技术人员的常识。因此，本发明涉及上述公开化合物的所有适宜的异构体形式、盐和衍生物。

本申请中所用术语“功能衍生物”指上述公开的特定化合物的前药、生物电子等排体、N-氧化物、药学可接受的盐或各种异构体，它们与母体化合物比较，可能在一个或多个方面有优势。制备功能衍生物可能是很困难，但某些相关的技术是本领域技术人员所熟知的。可使用多种高通量化学合成方法。例如，组合化学已导致化合物文库的迅速扩大，当其与多种高效生物筛分技术结合时，能够有效地发现和分离有用的功能衍生物。

本发明的药物组合物通过再生心脏组织用于治疗由疾病、特别是MI引起的心肌损伤或坏死。该药物组合物可经本领域技术人员所知的常规方法制备为合适的剂型，例如片剂、胶囊、注射剂、溶液、混悬液、粉剂、糖浆剂等，并给药至患有心肌损伤或坏死的哺乳动物对象。制剂技术不属于本发明的内容，因此不限制本发明的范围。

本发明的药物组合物可配制成适合口服给药、全身注射、和心脏内直接局部注射或用于长期缓释的身体局部植入物的形式。

另一方面，本发明提供一种治疗或改善哺乳动物病理状态的方法，其中的病理状态，如医学领域普通技术人员所判断，可以通过再生功能心肌来减轻、治疗或治愈，该方法包括向有病理状态的哺乳动物给以有效量的化学式(I)化合物或其功能衍生物。

另一方面，本发明提供一种在需要替换由心脏病例如心肌梗塞(MI)引起的死亡或损伤的心脏组织的哺乳动物中再生功能性心肌的方法。这是一种基于细胞移植的治疗方式，包括以下步骤：(a)获得干细胞，例如MSC；(b)使干细胞与化学式(I)的化合物或其功能衍生物接触，以激活移植前的心原的分化途径，以及(c)然后将激活细胞植入哺乳动物梗塞的心脏组织中。该治疗方式能够达到以下目标：1)增强植入细胞的存活潜能；2)血液供应网络的早期重建，和3)通过在移植前离体激活形成MSC的生心肌性祖细胞(MSCs formingcardiogenic progenitor)，增强移植细胞的生心肌分化的效率。

另一方面，本发明提供一种治疗哺乳动物缺血性心脏病、特别是MI的方法，包括以下步骤：(a)用化学式(I)化合物或其功能衍生物培养MSC或内皮细胞，(b)收集经处理的细胞的条件培养基，其含有具有促使心肌梗塞修复或MSC生心肌性分化活性的促分泌蛋白，和(c)将该条件培养基给药或输送至梗塞区域的心脏组织。

另一方面，本发明提供一种用于干细胞(如MSC)的生心肌性转分化(cardiogenic transdifferentiation)研究的研究试剂。该试剂含有一种或多种化学式(I)化合物或其功能衍生物。其可以是固体或液体形式。例如，可以是二甲基亚砜的溶液。

表征本发明的新颖性的各种特征，通过所附的构成本发明公开部分的权利要求中的特征来指出。为了更好的理解本发明、其操作优势及其使用获得的特定目的，需要参考附图和下面的描述，其中有本发明的附图说明和描述的优选的实施方式。

附图简述

图1概述由植物日本路边青(Geum Japonicum)中分离Niga-ichigoside Fl(称为“CMF”)的方法，作为制备本发明化合物的实施例。

图2显示CMF对MSC的生心肌性分化的作用和离体phospho-Akt1的上调。

图3显示基于CMF预处理的MSC移植的治疗的疗效。

图4显示三组大鼠在细胞移植2天和2周后的分布射血分数和缩短分数(A：正常组；B：移植CMF处理的MSC的MI组；C：移植未经CMF处理的MSC的MI组)。

图5显示CMF在心肌梗塞动物模型中的疗效。

图6显示条件培养基诱导的增强的MSC培养物的增殖和心肌再生。

图7显示用于动物MI模型中CMF诱导的心肌再生的细胞来源。

具体实施方案的详述

I.实验步骤

用于本发明的所有的实验设计符合美国国立卫生研究院公布的实验动物管理和使用指南，并通过中国香港大学动物实验伦理委员会的批准。

对于下述讨论，CMF指本发明的基础化合物(或主链化合物)。它的化学结构由上述化学式(I)描述。

本发明化合物的获得：所述化合物可从植物制备，也可通过化学合成制备。

作为说明由天然来源制备化合物的方法的一个例子，下面提供了从一种植物日本路边青(Geum Japonicum)中分离和提纯CMF所涉及的细节。可能含有CMF或其变体的其它植物包括，例如，Acaena pinnatifida R.et P.、龙芽草(Agrimonia pilosa Ledeb)、羊齿天门冬(Asparagus filicinus)、紫金牛(Ardisiajaponica)、凌霄花(Campsis grandiflora)、毛杭子梢(Campylotropis hirtella(Franch.Schindl.))、大血藤(Caulis Sargentodoxae)、香椿(Cedrela sinensis)、木瓜(Chaenomeles sinensis KOEHNE)、柳叶水麻(Debregeasia salicifolia)、Eriobotryajaponica calli、枇杷(Eriobotrya japonica LINDL.)(蔷薇科)、Goreishi、Leucoseptrumstellipillum、水丁香(Ludwigia octovalvis)、紫苏(Perilla frutescens、Perilla frutescens(L.)Britt.)(唇形科))、Physocarpus intermedius Potentilla multifida L.、Poteriumancistroides、Pourouma guianensis(桑科)、祁州漏芦(Rhaponticum uniflorum)、美蔷薇(Rosa bella Rehd.et WiIs.)、金樱子(Rosa laevigata Michx)、玫瑰(Rosarugosa)、粗叶悬钩子(Rubus alceaefolius Poir)、美洲黑莓(Rubus allegheniensis)、插田泡(Rubus coreanus)、Rubus imperialis、Rubus imperialis Chum.Schl.(蔷薇科)、Rubus sieboldii、羊蹄(Rumex japonicus)、三叶鼠尾草(Salvia trijuga Diels)、Strasburgeria robusta、Strawberry cv.Houkouwase、黄水枝(Tiarella polyphylla)、Vochysia pacifica Cuatrec、花椒(Zanthoxylum piperitum)等。

日本路边青中生心肌因子(CMF)的分离：参考图1，将八月从中国贵州省采集的日本路边青进行干燥(10kg)并在室温下用70％乙醇(100L)渗滤两次，每次三天。合并提取物并喷雾干燥得到固体残渣(1kg)。固体残渣在10升H2O中混悬，并依次用氯仿(10L)萃取两次，正丁醇(10L)萃取两次，得到相应的部分。过滤正丁醇(GJ-B)可溶性部分并通过喷雾干燥得到粉末部分，该部分在细胞培养中刺激MSC生心肌性分化的特异性能力通过下述方法得到了证实。已显示在细胞培养体系中正丁醇可溶性部分(GJ-B)能增强培养的MSC的增殖和生心肌性分化。然后将GJ-B部分上样于用10％甲醇平衡过的SephadexLH-20柱，并用浓度递增的甲醇水溶液洗脱，溶解GJ-B-1至GJ-B-7七个级分。用MSC培养体系检验了所有洗脱级分的活性。活性检测显示出级分6在增强培养的MSC的生心肌性分化中是最具活性的。从GJ-B-6中进一步分离出纯的活性物质，该物质在本申请中被称为CMF。CMF的结构由NMR分析确定，并与文献对照，显示为化学式(I)。

用于移植的MSC的制备：MSC用CMF(在生长培养基中，10μg/ml)培养6天。同时，对照MSC在含有等量体积的5％DMSO的生长培养基中培养。在第2天，通过免疫细胞化学和Western印迹评价内源性磷酸-Akt1的表达。在第4天，通过抗MEF2的免疫细胞化学和Western印迹评价生肌的分化，并在第6天用MHC的特异性抗体通过免疫细胞化学和Western印迹进一步确定。在第3天，在培养物中用CM-DiI标记CMF预处理的MSC和对照MSC，并准备移植。

骨髓间质干细胞的制备：从Sprague-Dawley(SD)大鼠中取出胫骨/股骨，并用含有10％热灭活的FBS(GIBCO)和1％青霉素/链霉素的IMDM培养基从骨骼中将骨髓(BM)冲洗出来。充分混合BM并在1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀悬浮于5ml生长培养基中。将细胞悬液小心地置于5ml Ficoll溶液中并在200rpm离心30分钟。将含有骨髓细胞的第二层转移至试管中并用PBS冲洗两次以除去Ficoll(1200rpm，5分钟)。将细胞沉淀重新混悬于含有10％热灭活的FBS(GIBCO)和1％青霉素/链霉素抗生素混合物的IMDM培养基中。在37℃保温箱用5％CO₂培养24小时后，弃去非粘附细胞并通过每3天一次更换培养基培养粘附细胞，培养14天后细胞变得几乎满底。这就是下面称为MSC的骨髓细胞，其用于本申请中的体外和体内试验。

Western印迹分析：CMF处理的细胞或对照细胞的全细胞提取物通过将细胞用3倍压紧细胞体积的溶解缓冲液(50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl、1mMEDTA、1mM EGTA、1％Nonidet P-40、10％丙三醇、200mM NaF、20mM焦磷酸钠、10mg/ml亮肽素、10mg/ml抑酞酶、200mM苯甲磺酰氟和1mM原钒酸钠)于冰上溶解30分钟来制备。蛋白质的产量由Bio-Rad DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)定量。等量(30μg)的总蛋白通过SDS-PAGE进行大小分级并被转移至PVDM膜(Millipore)。用磷酸盐缓冲的生理盐水加上含有5％(wt/vol)奶粉(PBSTM)的0.1％(vol/vol)吐温20(PBST)，在室温封闭印迹30分钟，并用抗大鼠磷酸-Akt1(小鼠)或大鼠MHC(小鼠，Sigma-Aldrich)的特异性一级抗体(在PBSTM中稀释1∶1000)探查60分钟。在PBST中充分洗涤后，通过辣根过氧化物酶偶联的抗鼠IgG(Amersham Bioscience)(在PBSTM中1/1000稀释，60min)探查印迹，用PBST充分洗涤，并通过化学发光显影。

CMF预处理的MSC移植至心脏组织：使用Sprague-Dawley(SD)大鼠，且所有动物操作均由University Animal Committee on Animal Welfare批准。用戊巴比妥腹膜内注射(50mg/kg)麻醉每只大鼠，插管，并使用Harvard通风机(683型)用室内空气机械通风。左侧胸廓切开术后，通过左前降支(LAD)冠状动脉的持久结扎来诱发心肌梗塞。悬浮于盐水中的5×10⁵DiI标记的经CMF预处理的MSC在结扎后立即被分别注入结扎动脉的末端心肌(缺血区)的三个部位(32只大鼠，试验组)。用悬浮于盐水的等量DiI标记的未处理的对照MSC，在相同的部位和时间对对照组大鼠(32只大鼠)进行注射，对伪缺血组(32只大鼠)进行胸廓切开术而没有进行LAD结扎。16只未处理的大鼠设为正常对照组。

在通过超声心动图测量法评价心功能后，根据试验计划在梗塞后第7天和第14天，处死不同组的半数实验大鼠。取出被处死大鼠的心脏用PBS洗涤并分别照相。将收获的所有样品包埋在石蜡中并切片，用于追踪DiI的信号和血管再形成、梗塞面积和心肌再生的检查。如果再生细胞是DiI阳性，则进一步进行MHC免疫组织化学染色以确定其成心肌性分化。

用共焦显微镜(ZEISS，LSM 510META)检测DiI标记和心脏特异性标记表达的共定位。简而言之，切片用大鼠特异性肌钙蛋白I抗体进行免疫组织化学染色。证实DiI标记的移植MSC的生心肌性分化(所述生心肌性分化形成再生心肌)通过如下方法进行：合并DiI阳性细胞，显示其供体细胞起源，使用共焦显微镜检测心脏终末分化标记物肌钙蛋白I的特异性阳性染色，暗示这些移植细胞的生心肌性分化。

MI模型中的CMF直接处理：将32只SD大鼠随机分成四组：正常组、伪缺血组、CMF处理组和未处理的对照组(每组8只)。用腹膜内注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉大鼠，插管，并使用Harvard通风机(683型)用室内空气进行机械通风。左侧胸廓切开后，通过左前降支(LAD)冠状动脉的持久结扎诱发心肌梗塞。其中8只大鼠(CMF处理组)结扎后，立即将5％DMSO溶液中的CMF(0.1ml，含有0.1mg CMF)注入结扎动脉末端心肌(缺血区)。另8只大鼠在相同的部位和时间注射等量的5％DMSO作为非处理的对照组。伪缺血组的8只大鼠进行胸廓切开术但不结扎LAD。另外8只没有任何处理的大鼠设为正常组。

含有由CMF诱导的源自MSC或其他细胞的分泌蛋白质的条件培养基：MSC用10μg/mlCMF处理24小时以激活/上调基因表达，然后彻底冲洗以除去CMF残渣。然后将5ml的新鲜生长培养基加至培养物中，并在培养3天后收集。收集到的培养基称为条件培养基。将5ml的调节培养基浓缩至1ml的体积，并作为治疗剂用于上述心肌梗塞动物模型。简而言之，左侧胸廓切开术和LAD结扎后，立即将0.2ml调节培养基注入结扎的末端部分。新鲜生长培养基作为对照使用。

用DiI标记的MSC置换骨髓：16只五周大的SD大鼠用于骨髓移植。在1.140Gy/min剂量下，用137Cs源(Elite Grammacell 1000)的9.5Gyγ辐照刺激受体大鼠以完全破坏大鼠的骨髓来源的干细胞。当使用27号针刺激后2小时内，通过尾部静脉注射DiI标记的MSC(2×10⁸细胞悬浮于0.3ml PBS中)。刺激和移植后一星期，将具有DiI标记的骨髓的大鼠分成两组：一组用CMF直接处理而另一组不进行处理作为对照。心肌梗塞外科手术和处理方案如上述进行。为了进一步评定，在外科手术和处理后的第14天终止试验。获得被处死的大鼠的心脏样品。通过用心脏型肌钙蛋白I(Santa Cruz)和PCNA(Dako)的特异性抗体进行免疫组织化学染色以追踪所有的样品的DiI阳性细胞和其生心肌性分化。与碱性磷酸酶(Santa Cruz)结合的特异性第二抗体用于显现阳性染色的细胞。DiI阳性信号用荧光显微镜(Laica)观察。

梗塞面积的评价：取出在第14天处死的试验大鼠的左心室，并从尖部至底部分成3横切片。切片用福尔马林固定并包埋入石蜡中。左心室的切片(20μm厚)用Masson氏三色(Masson′s trichrome)染色，其将胶原标记为蓝色并将心肌标记为红。将这些切片数字化并且根据形态测定对所有蓝色的着色定量。基于切片的厚度，计算具体的切片的梗塞体积(mm³)。所有切片梗塞组织的体积相加得到每一特定心脏梗塞的总体积。所有的研究由病理学家以盲法方式进行。

梗塞部位中的血管生成评定：在梗塞后第7天根据组织学切片测定血管密度，测定通过使用光学显微镜在高倍视野下(HPF)(×400)对梗塞区域内的血管数计数进行。在梗塞域内的六个随机的无重叠的HPF用于对在所有试验心脏的每一切片中新形成的所有血管进行计数。对每个HPF中的血管数求平均值并表示为每HPF的血管数。

再生心肌细胞和心肌的评定：将CMF预处理过的MSC移植的切片和未处理的MSC移植的切片于结扎后第7天用Ki67或肌球蛋白重链(MHC)抗体染色以鉴定再生的心肌。用与碱性磷酸酶(Santa Cruz)结合的特异性第二抗体显现阳性的染色。简单地说，在0.1M EDTA缓冲液中微波处理石蜡包埋的切片，并用1∶3,000稀释的抗大鼠Ki67的特异性多克隆兔抗体(Sant CruzBiotechnology)染色，并在4℃下温育保温一整夜。洗涤切片后，用1∶200稀释的与碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG第二抗体(Sigma)温育30分钟，且用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐-对甲苯胺-氮蓝四唑底物试剂盒(Dako)显色，阳性细胞核显示为深蓝色。与相应石蜡组织块的紧靠的切片，在1∶50稀释的兔抗大鼠的MHC(MF20，Developmental Hybridoma Bank，Iowa大学)抗体中于4℃过夜保温，并在1∶100稀释的过氧化物酶结合的羊抗兔IgG(Sigma)中于在室温进一步温育30分钟。用1mg/ml 3，3′-二氨基联苯胺(DAB；加0.02％H₂O₂)温育后，通过显微镜分析观察载玻片。再生心肌区域在投影视野中通过含有42个取样点的格子来描绘。近似地，在每一切片中沿着特定再生心肌边缘选择30-60个计算点。该格子界定62,500μm²的未压缩的组织面积，其用于测量在每一切片中选择的30-60个计算点。通过测量将近70个切片的每一切片(相隔50μm)的形状和再生心肌占有的面积和切片厚度来测定梗塞中心区的再生心肌的形状和体积。利用这些变量的积分和计算可产生立体结构并得到在每一切片中梗塞中心区的特定再生心肌的体积。将特定组织块的所有切片的值和立体结构相加并计算以获得再生心肌的总体积和整个立体结构。

心肌功能的超声心动图评价：使用具有15-MHz线阵式传感器的SequoiaC256系统(Siemens Medical)进行超声心动图的研究。打开试验大鼠的胸腔，在热垫上使动物处于仰卧位，放置ECG肢体电极，并在控制麻醉下记录超声心动图。在试验操作前，测量每一试验大鼠的超声心动图基线。由胸骨旁的长轴和短轴视图记录二维引导的M型和二维(2D)超声心动图影象。通过使用美国超声心动图学会的前沿会议协定(the leading-edge convention of the Americansociety of Echocardiography)，由M型轨迹测量左心室(LV)在收缩末期和舒张末期的大小，以及收缩和舒张时的壁厚。由胸骨旁长轴测定左心室在舒张末期(LVDA)和收缩末期(LVSA)的面积，并通过M型方法计算左心室在舒张末期和收缩末期的容量(LVEDV和LVESV)。左心室射血分数(LVEF)和缩短分数(FS)由左心室在2D短轴视图中的横截面积得出：EF＝[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100％及FS＝[(LVDA-LVSA)/LVDA]×100％。标准公式用于超声心动图计算。在研究的结尾阶段，用超声系统内带的软件脱机分析所有的数据。所有测量值和计算出的指标都取连续的三至五次测量结果的平均值。

统计学：盲法收集所有的形态测定数据，并在实验结束阶段揭盲。结果用从每一心脏获得的平均测量值计算出的平均值±SD表示。使用非配对双尾Student’s t检验确定两个测量值之间比较的统计学意义。P＜0.05的值被认为是显著的。

II.离体MSC的因CMF诱导增加的存活潜能和生心肌性分化

参考附图2，用磷酸-Akt1特异性抗体对细胞进行的免疫细胞化学染色显示出，在培养物中用CMF(10μg/ml)处理两天之后，磷酸-Akt1的表达与未处理的对照组相比显著上调，被染为红色的阳性细胞主要在细胞质中(附图2a：1)。Westem印迹证实，增加的磷酸-Akt1的表达超过未经处理细胞的3-4倍(附图2b：5A)。在磷酸-Akt1上调的MSC中，当再培养2天后，它们之中的90％以上用肌细胞增强因子(MEF2)特异性抗体染色成为阳性，所述抗体是生心肌谱系(cardiogenic lineage)的早期标记物之一，在细胞核中阳性细胞染色为橙色(附图2a：2)，并由蛋白质印迹证实(附图2b：6A)，显示其生心肌性分化的定型。注意到，培养的MSC用抗MEF2抗体染色时不都是阳性染色(附图2a：2)，如通过蓝色细胞核显示的，可能因为并非所有培养的MSC通过生心肌性分化途径被CMF转换，或因为在MSC的制备中存在少量的某些杂质。类似地，大多数培养的MSC在用心脏型肌球蛋白重链特异性抗体染色时呈阳性，在CMF存在下培养6天，在细胞质中阳性细胞染色为红色(附图2a：3)，并由蛋白质印迹证实(附图2b：7A)，然而对照细胞用全部三种特异性抗体染色时呈阴性(附图2a：4&2b：Bs)。MEF2连续诱导和MHC表达证实了离体MSC的CMF诱导的生心肌性分化发展。在附图2b中，A表示CMF处理的样品而B表示未处理的对照品。

III.经CMF预处理的MSC移植的疗效

为了确定在移植前用CMF处理的MSC在体外显示出的增加的存活潜能和生心肌性分化效率是否能带来体内MI修复的显著提高，或换句话说，离体CMF效应是否具有任何治疗价值，用MI动物模型进行了细胞移植试验，将用CMF预处理过的MSC植入梗塞区域。移植细胞的归巢、存活、增殖、生心肌性分化和成熟通过对来自梗塞和细胞移植后第7天和第14天的心脏的切片中的任一DiI荧光阳性信号及Ki67和MHC的免疫组织化学染色来追踪。如附图3所示，在第7天，在试验心肌组的整个梗塞的区域中观察到了具有心肌细胞特征表型的DiI阳性细胞(附图3：1)，显示其供体细胞来源和整个梗塞区分布。在对照组(未用CMF处理)，仅仅在梗塞边缘周围可以见到分散的DiI信号(附图3：2)。使用共焦显微镜在整个梗塞区观察到了DiI信号(红色)和心脏特异性肌钙蛋白I表达(绿色)的位置重叠(附图3：3-5)。DiI阳性(红色)和心脏特异性标记肌钙蛋白I表达(绿色)的重叠图像，导致了在相同细胞中黄-红-绿重叠的颜色，因此证实了移植的经CMF离体预处理的MSC在体内的生心肌性分化和成熟。还注意到，少数肌钙蛋白I阳性细胞(绿色)不是DiI阳性(附图3：3&5)，这可能是因为一些再生肌细胞不是由移植的DiI标记的MSC产生。类似地，少数在浅蓝色圈中显示出DiI阳性的细胞在肌钙蛋白I免疫染色中是阴性，表明一小部分移植细胞在体内不进行生心肌性分化，或在MSC的制备中存在杂质。

在实验组中，早在移植后的12个小时即可检测到新生血管的形成，且在梗塞后24小时内(在可见到任何再生心肌细胞以前)和梗塞后7天(附图3：1，黄色圈)可以在整个梗塞区观察到许多充满血细胞的新形成的血管和毛细血管。在第7天，CMF预处理的MSC移植的心肌的梗塞区域中新形成血管的密度为平均每高倍视野(40×)(HPF)8±2。然而，新生血管不是DiI阳性的，表明血管的细胞源可能并非来自供体细胞。估计，供体MSC可能通过CMF预处理激活以刺激并上调诱导某些血管生成因子的表达的血管发生的特异性信号通路，其在梗塞心肌中直接增强早期血管再形成的过程。对照地，在第7天，在移植未预处理的MSC的对照组的梗塞心肌中观察到每HPF大约3±2血管(附图3：2，黄色圈)。

如附图3所示，大量由供体细胞产生的肌细胞在梗塞区是聚簇的并组成心肌样组织，其通过MHC(附图3：6，蓝色圈)和Ki67(附图3：7，蓝色圈)特异性抗体染色为阳性，表明这些移植的经CMF预处理的MSC在体内移植后保持分裂能力并可进行生心肌性分化。在高倍视野下，除了大小小于未损伤的已存在的肌细胞以外，这些心肌样组织显示出典型的心肌形态学(附图3：9，蓝色圈)。在试验心肌组中，在梗塞后第7天，这些高度组织的再生心肌样组织平均占总梗塞体积的70±8％，且在梗塞后第14天，替换的梗塞心肌面积平均为总梗塞体积的80±8.5％(附图3：8，R，再生心肌细胞；N，先前存在的正常心肌细胞)。如超声心动图测量所示(附图4及表1)，随着梗塞心脏组织的置换，功能显著提高。在梗塞后第2天和第14天，与移植未经预处理的MSC的MI组比较，移植了经预处理的MSC的MI心脏的射血分数(EF)在第2天显著地高(59.79±2.33对比52.1±2.54，P＝0.03)，且在第14天显著增加(67.13±2.53对比53.3±2.31，P＝0.001)。类似地，在第2天，经移植的MI心脏的缩短分数(FS)显著地高(29.43±1.35对比24.07+1.47，P＝0.01)，且在第14天显著增加(31.72±2.57 vs 23.49±1.99，P＝0.002)。EP和FS的显著提高是心肌细胞功能恢复的有力的反映(表1)。

表1：射血分数(EF)和缩短分数(FS)的分布。(平均值±SE)：

	EF(％)		FS(％)
					2天§	14天∮	2天§	14天∮
	正常(16)	71.03±4.05	68.24±4.79	35.65±3.99					34.02±3.27
伪缺血(32)					70.45±2.67	71.34±2.77	36.03±2.76	35.86±2.13
	CMF预处理(32)	59.79±2.33*	67.13±2.53*	29.43±1.35*					31.72±2.57*
MSC对照(32)					52.1±2.54	53.3±2.31	24.07±1.47	23.49±1.99

§，正常组16只大鼠，伪缺血组、CMF预处理组和MSC对照组各32只大鼠。

∮，正常组8只大鼠，伪缺血组、CMF预处理组和MSC对照组各16只大鼠。

^*，EF，在第2天P＝0.03；在第14天P＝0.001，及FS，在第2天P＝0.01，第14天P＝0.002。

IV.不使用预处理的MSC和移植的情况下MI模型中的直接疗效

参考附图5，在MI模型中直接局部注射CMF后，发现梗塞发生2周后对照组(没有CMF处理)在结扎部位的末端心肌因为缺血性坏死，在视觉检查中基本上变成白色(附图5：2)。相对照地，CMF处理的心脏的同一部分外观上相对较红，这可能因为新生血管形成(附图5：1)，其与心脏的非局部缺血部分相似，且梗塞区尺寸显著小于对照组的心脏(附图5：2)。而且，在梗塞区的横切面，CMF处理过的心脏的左心室壁(附图5：3)显著厚于对照组心脏(附图5：4)。组织学观察显示，CMF处理过的心脏(n＝8)的梗塞面积比对照组心脏(n＝8)平均小约1/3-1/2倍，其通过测量结扎后第14天在左心室游离壁的梗塞体积计算。通过Masson′s三色染色法，发现在CMF处理的心脏中，肌细胞样细胞群集，与梗塞的心肌或附近存活的心肌排列成几乎相同的方向，分布在整个梗塞区域的大部分部位(附图5：5)。相反，对照组心脏的梗塞区域几乎完全由纤维组织替代物占据，而没有为任何可能的心肌细胞再生留下位置(附图5：6)。在高倍视野下，与对照组中全部蓝染的纤维性瘢痕(附图5：8)形成鲜明对比，在CMF处理组中的整个梗塞区域都充满了再生肌细胞簇，成形良好，形成具有几乎没有纤维组织在其中的心肌形态(附图5：7)，尽管这些再生肌细胞的尺寸小于邻近的已存在的肌细胞，可能因为其正在成熟。

而且，超声心动图显示，与对照组心脏相比，CMF处理的心脏的功能在梗塞的第二天随着结构整合的再生心肌和再造脉管系统取代梗塞的心脏组织而显著提高，并在第14天进一步提高，这可能是由于再生心肌和脉管系统的生长和成熟修复了梗塞。

由CMF处理的MSC诱导的条件培养基的疗效

为确定含有由CMF激活的MSC分泌的某些经诱导产生的蛋白的条件培养基是否会产生与直接使用CMF或移植CMF预处理的MSC至梗塞区域相似的效果，用MSC培养物和心脏梗塞动物模型测试了该条件培养基。参考附图6a，用条件培养基处理24小时后，与对照培养基(新鲜的生长培养基)相比，MSC的增殖率增加至120％。参考附图6b，将条件培养基局部注射于MI模型的缺血区域，可观察到心肌再生。简要地说，与对照组中的纤维化替代相比(附图6b：1)，在整个梗塞区域都可以看到许多再生心肌和新形成的充满血细胞的血管(附图6b：2)。

V.直接CMF处理后，再生心肌的细胞起源

参考附图7，对由DiI标记的MSC替代骨髓的MI模型研究为再生心肌的细胞起源是源于骨髓MSC提供了直接的证据。骨髓替代一周后，进行上述心肌梗塞手术。梗塞后14天，发现CMF处理的心脏的整个梗塞区域由DiI标记的细胞充分占据，这些细胞大多不存在于任何具有先前存在的活性心肌细胞的非梗塞区域。这些DiI阳性细胞簇生在一起具有心肌样形态，但是与先前存在的心肌相比尺寸较小(附图7：1)。相反，在对照的梗塞心脏中沿着梗塞边缘带仅观察到少数分散的DiI阳性细胞(附图7：2)。为证实这些组织良好的DiI阳性细胞正在再生心肌，使用肌钙蛋白I和PCNA的特异性抗体进行了免疫组织化学试验。发现，分布于整个梗塞区域的大量的DiI阳性细胞被肌钙蛋白I(附图7：3)或PCNA(附图7：4)的特异性抗体阳性染色。在CMF处理的心脏中，这些DiI和肌钙蛋白I或PCNA阳性染色细胞在整个梗塞区域中组织为心肌样组织。(附图7：3&4)。在更高倍视野下，这些再生心肌样组织显示出典型的心肌形态，在再生心肌之间具有明显的心肌闰盘连接，表明了单个再生心肌转变为整体化心肌的超结构成熟(附图7：5)。没有再生心肌之间以及再生心肌和先前存在的活性心肌之间的结构整合，将不能保证功能整合和同步的机械活动。在梗塞后14天，这些再生心肌平均占总梗塞体积的69.3％。相反地，在六个对照的心脏中，仅有少数细胞为肌钙蛋白I及DiI均为阳性并分散在血管周围，而梗塞区域大部分被纤维性瘢痕占据(附图7：6)。这些结果证明，CMF诱导的再生心肌是有作用的并且由骨髓MSC产生。

IV制备药物组合物及其在治疗哺乳动物缺血性心脏病中的用途

一旦有效的化学物质被鉴定并且该化合物的部分或基本纯的制剂由天然来源(例如植物)中分离或经化学合成得到，则各种药物组合物或制剂就可以通过使用工业上现有的方法或未来开发的方法由部分或基本纯的化合物来制备。由化合物制备药物制剂和剂型(包括，但不限于片剂、胶囊、注射液、糖浆剂)的特定方法不是本发明的一部分，制药工业领域的普通技术人员能应用工业上已建立的一种或多种方法来实施本发明。换句话说，本领域中的普通技术人员可以修改现有的常规方法以使其更适合本发明的化合物。例如，由USPTO官方网站提供的专利或专利申请数据库中含有关于由有效化合物制备药物制剂和产品的丰富资源。另一个有用的信息资源是由Sarfaraz K.Niazi编辑并由Culinary&Hospitality Industry Publications Services销售的Handbook of PharmaceuticalManufacturing Formulations。

本发明说明书和权利要求使用的术语“植物提取物”指从植物部分中获得的天然存在化合物的混合物，其中占全部干燥质量至少10％的化合物是未鉴定的化合物。换句话说，植物提取物不包括来自植物的已确定的基本纯的化合物。

术语“药物赋形剂”是指在药物制剂中包含的非药物活性成分。术语“有效量”是指足以在被治疗对象上产生治疗效果的量。如本领域技术人员所知，有效剂量是可以根据所治疗疾病的类型，给药途径，赋形剂的使用和与其他治疗处理联用的可能性而改变的。本领域技术人员可以决定特定情况下的有效量。

尽管已经描述和指出应用于优选实施方案的本发明主要的新颖性特征，但应理解在不脱离本发明的精神情况下本领域技术人员可在所描述的实施方案解释的形式和内容上进行各种省略、替换以及改变。本发明并不限于以实施例描述的上述实施方案，但可以在附加的专利权利要求保护的范围内进行各种方式的修改。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1、在遭受心肌损伤的哺乳动物对象的心脏中再生肌细胞或心肌的方法，包括给予有效量的具有式(I)所示主链结构的化合物或所述化合物的功能衍生物的步骤。

式(I)

2、权利要求1的方法，其中所述的化合物是未经任何取代的主链结构本身。

3、权利要求1的方法，其中所述化合物选自以下物质组成的组：

                                           4野蔷薇甙

2α，3β，19α，23-tetrahydroxy

urs-12-en-28-oic acid                          5悬钩子皂苷

3委陵菜酸                                   6蔷薇酸

4、权利要求3的方法，其中所述化合物为：

5、权利要求4的方法，其中所述受损心肌是由缺血事件引起。

6、权利要求5的方法，其中所述缺血事件是心肌梗塞。

7、权利要求1的方法，其中所述肌细胞或心肌通过包括以下一个或多个步骤的方法再生：(a)增加生肌性前体细胞的存活能力以使所述前体细胞能够经过绝对缺血时期而仍然存活；(b)在所述受损肌肉所在的所述心脏区域中重建被破坏的血液供应网络；和(c)增强所述前体细胞沿心脏谱系的生心肌性分化的效率，所述步骤同时进行或以任何特定顺序进行。

8、权利要求7的方法，其中所述生肌性前体细胞是通过血液循环来自骨髓的间质干细胞。

9、权利要求1的方法，其中进一步含有以下步骤：(a)获得多个干细胞；(b)将所述干细胞与所述化合物或所述功能衍生物接触一段时间；以及(c)将所述细胞植入所述哺乳动物对象的梗塞或受损的心脏组织。

10、权利要求1的方法，其中进一步含有以下步骤：(a)将所述化合物或所述功能衍生物制备为一种剂型，和(b)将所述化合物或所述功能衍生物以所述的剂型系统地给药至所述哺乳动物对象。

11、权利要求10的方法，其中所述的剂型选自片剂、胶囊、注射液、糖浆剂、悬浮液、和粉末组成的组。

12、权利要求1的方法，进一步含有以下步骤：(a)在含有所述化合物或所述功能衍生物的培养基中培养多个MSC或内皮细胞一段时间；(b)收集所述培养基，其含有来自所述MSC或内皮细胞的分泌蛋白，和(c)给药或输送所述培养基至梗塞区域中的心脏组织。

13、权利要求1的方法，其中所述组合物中至少95重量％是已鉴定的化合物。

14、权利要求1的方法，进一步包括加入一张关于所述化合物有用性的说明，其中所述说明指出所述化合物对患有有或曾经患有心脏病的人有益。

15、权利要求1的方法，进一步包括加入所述化合物有用性的说明，其中所述说明指出所述化合物对在所述哺乳动物对象的心脏中再生肌细胞或心肌有益。

Claims (23)

1.药物组合物，其含有药学上可接受的赋形剂和有效量的具有式(I)所示主链结构的化合物或其功能衍生物，且不含有任何植物提取物，所述组合物被用于治疗心脏组织损伤引起的心脏病：

式(I)

2.权利要求1的药物组合物，其中伴有一张说明书，说明所述组合物用于治疗由心脏组织损伤引起的心脏病。

3.权利要求2的药物组合物，其中所述心脏组织损伤由缺血生心脏病引起。

4.权利要求3的药物组合物，该组合物被配制成药物剂型并包装在容器中，所述说明书显示在所述容器上或显示在所述容器中包含的插页或小册子中。

5.权利要求4的药物组合物，其中所述剂型选自片剂、胶囊、注射液、悬浮液、溶液、粉末和糖浆剂组成的组。

6.在心肌受损的哺乳动物对象的心脏中再生肌细胞或心肌的方法，包括使用权利要求1定义的包含式(I)的主链结构的化合物或所述化合物的功能衍生物的步骤。

7.权利要求6的方法，其中所述的化合物是未经任何取代的主链结构本身。

8.权利要求6的方法，其中，所述化合物选自以下物质组成的组：

2μ，3β，19α，23-tetrahydroxy

urs-12-en-28-oic acid                         5悬钩子皂苷  R1

3委陵菜酸                                  蔷薇酸

9.权利要求8的方法，其中所述化合物为：

10.权利要求9的方法，其中所述受损心肌是由缺血事件引起。

11.权利要求10的方法，其中所述缺血事件是心肌梗塞。

12.权利要求6所述的方法，其中所述肌细胞或心肌是在包括以下述一个或多个步骤的方法中再生：(a)增加生肌性前体细胞的存活力以使所述前体细胞能够经过绝对缺血时期而依然存活；(b)在所述受损肌肉所在的所述心脏区域中重建已破坏的血液供应网络；和(c)增强所述前体细胞沿心脏谱系的生心肌性分化效率，所述步骤同时进行或以任何特定顺序进行。

13.权利要求12的方法，其中所述的生肌性前体细胞是经血液循环来自骨髓的间质干细胞。

14.权利要求2的药物组合物，其中所述化合物是未经任何取代的主链结构本身。

15.权利要求2所述的药物组合物，其中，所述化合物选自以下物质组成的组：

2μ，3β，19α，23-tetrahydroxy

urs-12-en-28-oic acid5悬钩子皂苷    R1

3委陵菜酸                                   6蔷薇酸

16.权利要求15的药物组合物，其中所述化合物为：

17.药物产品，含有权利要求1的药物组合物，容器和一张关于使用所述药物组合物的说明书。

18.药物产品，其中所述说明书显示在容器的外表面上。

19.药物产品，其中所述说明书显示在容器内的小册子或插页中。

20.权利要求6的方法，进一步含有以下步骤：(a)获得多个干细胞；(b)将所述化合物或其功能衍生物与干细胞接触一段时间；以及(c)将所述细胞植入所述哺乳动物对象的梗塞的心脏组织中。

21.权利要求6的方法，进一步含有以下步骤：(a)将所述化合物或所述功能衍生物制备为一种剂型，和(b)将所述化合物或所述功能衍生物以所述的剂型系统地给药至所述哺乳动物对象。

22.权利要求21的方法，其中所述剂型选自片剂、胶囊、注射液、糖浆剂、悬浮液和粉末组成的组。

23.权利要求6的方法，进一步含有以下步骤：(a)在含有所述化合物或所述功能衍生物的培养基中培养多个MSC或内皮细胞一段时间；(b)收集所述培养基，其含有来自所述MSC或内皮细胞的分泌蛋白，和(c)给药或输送所述培养基至梗塞区域中的心脏组织。

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