CN103282371A - 纯化的心肌生成素异构体及相关方法 - Google Patents

Abstract

一种心肌生成素主要异构体从柔毛水杨梅的甲醇萃取物获得、并且从其次要异构体分离出来。所述两种异构体的分离可通过手性相色谱完成，例如，使用

IC^TM柱。所述分离的心肌生成素主要异构体的纯度可通过结晶进一步增加，从而产生分离的心肌生成素主要异构体，其在210nm下的HPLC纯度高达98.97%(a/a)并且具有95.50%(w/w)的效力。

Description

纯化的心肌生成素异构体及相关方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2010年12月23日提交的美国临时申请号61/426,929的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。

发明背景

柔毛水杨梅(Geum japonicum)的甲醇萃取物(表示为“EGJ”)已被证实在促进心肌再生中具有活性。Cheng等，PLoS One4(2):e4461(2009)。那种活性归因于EGJ组分，即被称为“心肌生成素”(C₃₆H₅₈O₁₁)的强心苷，其为(2α,3β,4α)-2,3,19,23-四羟基-乌苏-12-烯-28-酸β-D-吡喃葡萄糖基酯。心肌生成素所赋予的化学结构拥有16个手性中心，从而产生了拥有许多立体异构体的理论可能性。

关于这点，Cheng等以暗示获得心肌生成素的单一立体异构体的方式描述了一种工序。然而，对切实可行地分离特征为至少90%纯度的心肌生成素组合物的所提供的细节是不足够的，并且Cheng等本身没有描述所“分离”的心肌生成素的纯度。因此，依据Cheng的方法论，所得组合物中是否存在杂质以及所述杂质存在的程度都是未知的。

发明概述

在这种常规技术的背景下，本发明者们使用Cheng等(2009)所描述的方法，发现从EGJ中萃取并纯化的“心肌生成素”实际上包含两种相同质量的紧密洗脱的异构体。相应地，本发明者们开发了用于将先前未被确认的心肌生成素主要异构体(发现其是活性的)从次要异构体(发现其是非活性的)中分离出来的方法。经由这种方法，本发明者们成功从EGJ中萃取出大致上不含次要异构体的心肌生成素主要异构体组合物(以下称“分离的心肌生成素主要异构体”)。

因此，本发明的方法论提供了在210nm下HPLC纯度为至少98%(a/a)(以下称“实质纯度”)的分离的心肌生成素主要异构体。实质纯度可通过使所述分离的心肌生成素主要异构体结晶来分离杂质而实现。在这点上，“a/a”表示在特定波长下，色谱中目标峰的百分比面积与色谱中所有其它峰的总面积之比。a/a值在此起着心肌生成素异构体光学纯度单位量度的作用。

本发明涵盖心肌生成素主要和次要异构体、其相应的糖苷配基以及相关组合物，也涵盖了制备及使用它们的方法论。因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了分离的心肌生成素主要异构体，例如，可通过下式进行描述：

根据本发明的另一个方面，本发明提供了所述分离的心肌生成素主要异构体的糖苷配基，其中HPLC纯度为至少92%。所述糖苷配基(例如)可通过下式进行描述：

所述心肌生成素主要异构体优选以实质纯度存在。这种状态下的说明性实施方案为210nm下HPLC纯度为98.97%(a/a)的化合物。在另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，所述组合物包含分离的心肌生成素主要异构体和/或其相应的糖苷配基以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了用于分离所述心肌生成素主要异构体的方法论。本发明的方法论包括：(A)从柔毛水杨梅的甲醇萃取物中获得萃取物，和(B)使所述萃取物经受手性相色谱或超临界流体色谱，借此可获得所述主要异构体的分离形式。涉及手性相色谱的实施方案可需要(例如)使用IC^TM柱，其为Chiral Technologies,Inc.(WestChester,PA)的产品。用于分离所述心肌生成素主要异构体的本发明的方法论还可包括使组合物结晶。

另一个方面，本发明涉及一种对Cheng等(2009)的色谱工序的改进，所述改进包括：(A)沉淀并过滤柔毛水杨梅的甲醇/水溶液以除去多余固体，(B)使用二氯甲烷和叔丁基甲基醚(TBME)来相分离萃取甲醇/水溶液，并且然后(C)使用正丁醇进行萃取。本发明所述改进的色谱工序还可包括使由心肌生成素主要异构体构成的组合物经受使用树脂相对于材料负荷最佳质量比(典型地，约15:1)和甲醇/水的分级梯度的低压吸附色谱(Diaion HP-20和硅胶)，接着是使用树脂相对于材料负荷最佳质量比(约20:1)和二氯甲烷/甲醇的分级梯度的低压硅胶色谱。在另一个实施方案中，所述对Cheng等(2009)的改进进一步包括使含有主要异构体的组合物经受采用水性缓冲液和甲醇流动相梯度程序的高压反相色谱(HPRC)。在这点上，所述HPRC可涉及使用

C18(2)柱，其为Phenomenex,Inc.(Torrance,CA)的产品。

附图简述

图1示出了经由Cheng等(2009)的方法获取半纯化的心肌生成素组合物的结果，所述方法中没有使由本发明者们确认的心肌生成素非对映异构体彼此拆分。

图2描绘了依据本发明，对使用Cheng等(2009)的方法产生的半纯化心肌生成素材料进行HPLC与LC-MS分析的数据。有关彼此拆分的两个峰，所述分析确认了两种心肌生成素异构体的存在。在HPLC色谱中显而易见的这些接近的洗脱峰显示了相同分子离子乙酸和三氟乙酰(TFA)加合物，从而指示它们为结构异构体。

图3呈现了上述的半纯化的心肌生成素参考材料的¹H-NMR谱。所述谱确认了两种心肌生成素异构体的存在。

图4示出了通过萃取、用Diaion HP-20接着用硅胶进一步分离、并且最终使用反相色谱产生的心肌生成素组合物的结果。如图所示，所述组合物包含两种心肌生成素异构体，经由优化纯度的HPLC法被全部拆分，而210nm下合并(预分离)的HPLC纯度为92.6%(a/a)。

图5示出了根据本发明的用于分离所述心肌生成素主要异构体的方法论的示意性概述。

图6描绘了HPLC纯度报告的结果，所述结果显示了所述分离的心肌生成素主要异构体在完成最终结晶后210nm下的纯度可达98.97%(a/a)。

图7呈现了确认分离的心肌生成素主要异构体身份的¹H-NMR谱，同时去除在2.3PPM和5.375PPM附近的次要异构体共振(参见图3)。

图8描绘了所述心肌生成素主要异构体的X-射线晶体学数据的三维骨架模型(a)。也描述了二维再现(a)的骨架式(b)。表现图(a)显示了心肌生成素规定的氧原子和结晶水的氢之间的分子间的氢键(虚线)。

图9示出了根据本发明进行分离的心肌生成素主要异构体(“HUYA-1”)的C18反相色谱曲线图。(我们如何描述24.254小峰？)

图10示出了根据本发明进行分离的心肌生成素次要异构体(“HUYA-2”)的C18反相色谱曲线图。HUYA-1与HUYA-2显示了类似的保留时间。

图11示出了根据本发明获得的心肌生成素次要异构体(“HUYA-3”)的糖苷配基的C18反相色谱曲线图。

图12示出了根据本发明获得的心肌生成素主要异构体(“HUYA-4”)的糖苷配基的C18反相色谱曲线图。HUYA-3与HUYA-4显示了类似的保留时间。

图13示出了根据Cheng等(2009)的方法分离的心肌生成素组合物(“Car”)的C18反相色谱曲线图。Car的保留时间分别与HUYA-1和HUYA-2的保留时间类似。

图14呈现了示出各自10μg/ml的Car、HUYA-1和HUYA-2在诱导间充质干细胞(MSC)的心肌形态转变中的活性的显微照片。D0，在任何处理前建立了MSC的培养。MSC的形态特征为平坦、不规则、低折光以及良好的伸展形状(圆形)。D3，培养的MSC样本经由分别标记的化合物进行了3天的处理。观察到经过Car和HUYA-1处理的一些MSC(约31%)经受变窄并变得更具折光性(椭圆)。相比之下，经过HUYA-2处理的MSC未显示明确的形态变化(圆形)。D7，培养的MSC样本经由分别标记的化合物进行了7天的处理。经过Car和HUYA-1处理的培养物中的更多MSC(约48%)经受变窄并变得更具折光性(圆形)。此外，经过HUYA-2处理的MSC未显示显著的形态变化(圆形)。

图15经由显微照片提供了HUYA-3(10μg/ml)与HUYA-4(10μg/ml)在诱导MSC的心肌形态转变中的对比。Ctrl指经过媒介物(相等体积的10%DMSO)处理的MSC。D0，在任何处理前建立了MSC的培养。MSC的形态特征为平坦、不规则、低折光以及良好的伸展形状(圆形)。D3，培养的MSC样本经由分别标记的化合物进行了3天的处理。经过HUYA-4处理的一些MSC(约20%)显示了变窄以及更具折光性的表型(椭圆)。然而，经过HUYA-3和媒介物处理的MSC未显示显著的形态变化(圆形)。D7，培养的MSC样本经由分别标记的化合物进行了7天的处理。在经过HUYA-4处理的培养物中，相似数量的MSC(约22%)变窄并且更具折光性(椭圆)。相比之下，经过HUYA-3和媒介物处理的MSC未显示显著的形态变化(圆形)。

图16描绘了通过免疫荧光染色来表达的心肌分化标记物，Mef2a(D3的荧光)及β、MHCβ(D7的荧光)。D3与D7，培养的MSC样本用标记的化合物分别进行了3天和7天的处理。Neg为MSC培养的阴性对照，其中未使用针对Mef2a或MHCβ的第一抗体，从而显示了Mef2a(D3)与MHC(D7)染色的阴性信号。Ctrl代表经过相等体积的10%DMSO处理的培养的MSC，其中几乎未观察到Mef2a(D3)和MHCβ(D7)的阳性信号。Car是经过心肌生成素处理的MSC培养物，示出了大概13%的经处理的细胞显示Mef2a阳性染色，由荧光(D3)来指示，并且当所述细胞经过7天处理(D7)时，17%的经处理的细胞显示MHC阳性信号(荧光)。

图17描绘了通过免疫荧光染色来表达的早期心肌分化标记，Mef2a(在D3进行荧光)与心脏特异性肌球蛋白重链β、MHC(在D7进行荧光)。D3与D7，培养的MSC样本经由标记的化合物分别进行了3天和7天的处理。HUYA-1代表经过HUYA-1处理的MSC培养物，所述培养物示出大概15%的经处理的细胞显示Mef2a阳性染色，由红信号(D3)来指示，并且当所述细胞经过7天处理(D7)时，20%的经处理的细胞显示MHC阳性信号(荧光)。HUYA-2为经过HUYA-2处理的MSC培养物，所述培养物显示几乎无Mef2a阳性信号(D3)，和MHCβ的约3%阳性信号(D7)。HUYA-3代表经过HUYA-3处理的MSC培养物，观察到所述培养物几乎没有Mef2a(D3)和MHCβ(D7)的阳性信号。HUYA-4指经过HUYA-4处理的MSC培养物，所述培养物示出大概约6%经过处理的细胞显示Mef2a阳性信号(D3)，并且约8%经过处理的细胞显示MHCβ阳性信号(D7)。

图18描绘了在共培养系统中，由HUY A-1诱导的GFP-MSC分化为跳动的心肌细胞。这个屏幕截图是来自显示GFP-MSC分化的跳动的GFP阳性肌细胞(封闭区域)的影像，其中GFP-MSC与大鼠心肌细胞和成纤维细胞一同培养，并且然后用HUYA-1进行处理。由于所述培养物包含非GFP肌细胞与成纤维细胞和GFP-MSC，那么识别的任何具有GFP阳性信号的跳动细胞必然是GFP-MSC分化而来。这显示HUYA-1可增强MSC心肌分化为跳动的心肌细胞。

图19提出了一种根据本发明用于转化所述分离的心肌生成素主要异构体为其相应的糖苷配基的方法。

详述

归因于冠状动脉疾病的心肌梗塞是过早死亡的主要原因之一。一种解决方案是用来自内源性祖细胞库(endogenous progenitor pool)或外源引入的干细胞的再生心肌来代替梗死的心脏组织。Cheng等提出的柔毛水杨梅的甲醇萃取物有这种潜能。

如上所述，虽然Cheng等以暗示获得心肌生成素的单一立体异构体的方式描述了一种工序，但是所提供的细节对于切实可行的心肌生成素组合物的分离是不足够的，所述组合物的特征是210nm下HPLC纯度为至少95%至98%(a/a)、现代小分子药物典型的监管预期。而且，Cheng等未描述“分离的”心肌生成素的纯度。依据程的方法论，所得组合物中是否存在杂质，并且如果确实存在其存在程度是未知的。

在评价用于从EGJ萃取心肌生成素的这种常规方法期间，开发了HPLC测定来分析萃取的心肌生成素的纯度，同时预期的是所述萃取的组合物将包含心肌生成素单一立体异构体。令人意外的是，通过使用对Cheng等所用方法改进的HPLC测定，本发明者们观察到萃取心肌生成素的常规方法反而产生了两个相同质量的接近的洗脱的异构体混合物。接着，执行LC-MS和¹H-NMR谱分析，每种方法独立地确认了经由程的方法产生的“心肌生成素”实际上包含两种心肌生成素异构体的发现。图2示出了LC-MS结果，并且图3示出了¹H-NMR谱。

本发明者还发现，遵循程的方法论，所分离的心肌生成素主要异构体210nm下HPLC纯度只有约75.73%(a/a)，其中有归因于次要异构体的约16.87%的HPLC杂质。此外，发现所述分离的心肌生成素主要异构体具有生物活性，所述杂质不具有生物活性。

分离心肌生成素主要异构体

为了获得实质纯度的分离的心肌生成素主要异构体，开发了一种用以去除杂质、包括去除先前未确认的心肌生成素次要异构体的方法。Cheng等(2009)教导的萃取工序使用了氯仿、乙酸乙酯以及最后用正丁醇从水中相分离的萃取。然后保留正丁醇相以进一步纯化并且丢弃其它有机相。已发现在乙酸乙酯萃取时发生相当大的心肌生成素的损失，并且本发明者已确定由于氯仿有毒性风险，所以无法在工业制造规模上使用。

相应地，进行了一种对萃取方法的优化。首先，通过引入EGJ的甲醇再浆改进所述EGJ萃取方法，接着过滤、浓缩并用水来稀释，然后进行硅藻土辅助二次过滤。这些步骤从EGJ萃取物中除去了大概50%的不需要的材料的固体，并且帮助减少随后在接下来的有机相分离中乳液的形成。当对过滤固体进行分析时，发现滤饼中不含心肌生成素。以二氯甲烷代替接下来的氯仿萃取水/甲醇滤液，以避免使用对操作员存在安全风险和存在环境风险的高毒性的氯仿溶剂。增加了用TBME进行萃取，因为这种萃取已显示可去除在HPLC纯化期间洗脱的保留时间与心肌生成素接近的杂质，而不会明显将心肌生成素从甲醇/水滤液中除去。将所述甲醇水相转化为饱和氯化钠溶液，并且用正丁醇进行萃取，所述萃取从水/甲醇相中去除了心肌生成素，得到总体上良好回收的心肌生成素。

Cheng等(2009)教导的色谱分离已被并入，包括低压Diaion HP-20吸附色谱、接着是低压正相硅胶以及最终高压反相色谱来增加异构体混合物总体上的纯度。大体上，按Cheng等所教导的来引导所述Diaion与正相硅胶色谱，虽然对条件进行了优化。特别是，通过以下方法对Diaion色谱进行优化：定义树脂相对于材料负荷的最佳质量比(15:1)，并且使用分级梯度，以20%MEOH/水起始、以10%的增量增至80%MEOH/水。通过以下方法对硅胶色谱进行优化：定义树脂相对于材料负荷的最佳质量比(20:1)，其中出于上述的操作员和环境安全考虑，在流动相中以二氯甲烷代替了氯仿，并且使用阶式梯度的二氯甲烷/甲醇，范围从二氯甲烷/甲醇90%:10%至二氯甲烷/甲醇80%:20%。

在完成高压反相色谱后，通过引入手性相色谱或超临界流体色谱来进一步改进所述方法，以允许所述两种接近洗脱的心肌生成素对映体的分离。最终，将所述分离的心肌生成素主要异构体在甲醇/水中结晶，以便增加其纯度，从而除去在HPLC纯度法洗脱图看到的低水平杂质。依据所述方法，本发明提供了HPLC纯度为至少98%的心肌生成素主要异构体，其从EGJ到心肌生成素的总产率超过了Cheng等报告的总产率。

在这点上，合适的反相色谱技术的类目包括任何使用非极性固定相的色谱法。首先洗脱极性化合物，而保留非极性化合物。这种柱可为十八碳链(C18)键合硅。这种洗脱液可为ACN与20mM NH₄OAc的混合物(pH=7)。然后将样本在47g/L MeOH:缓冲液=50:50(v:v)中溶解。洗脱的温度可为室温。将流动相梯度以线性方式从80%的20mM的乙酸铵/乙腈过渡至65%的20mM的乙酸铵/乙腈。在一个ID=2cm柱下，所述柱的流速可为15mL/min.。通过HPLC在210nm处可检测到心肌生成素的存在。正如可从图4示出的数据计算出，在将两种心肌生成素异构体分离开来之前，主要异构体与次要异构体的吸收单位峰比率粗略为4.5:1。

通过手性相色谱对所述两种心肌生成素异构体进行分离。在这点上，手性相色谱技术的类目可包含任何柱色谱法，其中固定相含有手性、而不是非手性的化合物的单一对映体。手性固定相的选择对实现足够的分离是至关重要的。在不同时间从柱中洗脱所述两种心肌生成素异构体，因为当与手性色谱柱固定相结合时，其瞬时溶解度特性不同。所述柱可为

IC^TM柱。这种洗脱液可为IPA:MTBE=50:50(v:v)的混合物。将这种样本在IPA/MTBA=50:50(v:v)或纯IPA中进行溶解。洗脱的温度可为室温。使用IPA：MTBE=50:50(v:v)的等度流动相，色谱柱的流速可为在分析柱上1mL/min，或在半制备柱上可为更高的流速。通过HPLC在210nm处可检测到心肌生成素的存在。

也可如例如Anton&Berger,SUPERCRITICAL FLUIDCHROMATOGRAPHY WITH PACKED COLUMNS(具有填充柱的超临界流体色谱)(1997年第1版)描述的那样，通过超临界流体色谱来分离所述两个心肌生成素异构体。在这点上，合适的超临界流体色谱技术包括用于分离手性化合物的正常固定相。因此，所述柱可为

IC^TM柱、其它的

固定相柱或Cl8柱，但优选的是

IC^TM柱。所述梯度洗脱液可为CO₂/MeOH或CO₂/ACN。通过HPLC在210nm处可检测到心肌生成素的存在。

通过结晶可进一步增加分离的心肌生成素主要异构体的纯度。在这方面，“结晶”类目包括用于形成固态晶体的心肌生成素主要异构体的任何方法，典型地为通过从溶液，熔化物或气体中进行沉淀。在一个优选的实施方案中，将所述心肌生成素主要异构体在10体积的甲醇在40℃下进行溶解。然后在相同温度下，在约50分钟的时期内缓慢添加40体积的水，在所述期间内出现心肌生成素主要异构体的结晶。

依据上述方法论，可将心肌生成素主要异构体从EGJ中分离出来，在210nm下具有98.97%(a/a)的HPLC纯度，并且通过NMR测定95.50%(w/w)的效力。所当在MTBE/IPA=50:50中或作为固体贮藏时，所述分离的心肌生成素主要异构体为稳定的化合物。它还是耐40℃热应力的。

对所述心肌生成素主要异构体的结构描述如下：

心肌生成素主要异构体的糖苷配基

通过连接糖部分至多环分子核心的酯键水解可将相应的糖苷配基从分离的心肌生成素主要异构体、多环苷中转化出来。这种水解可通过如下两种方法之一来完成：

(a)酸催化水解，其涉及无机酸稀水溶液的使用来实现酯的裂解。所得产物为糖与心肌生成素的游离羧酸形式。

(b)碱催化水解(皂化)，其中使用如氢氧化钠或氢氧化钾的碱来水解酯。典型地，这种水解在水介质中进行，或采用为水和适当的醇的混合物的溶剂系统。从碱催化水解得到的产物是心肌生成素的羧酸基团的盐的形式。可通过使用无机酸很容易地将这种盐转换为游离酸。

图19示出了所述心肌生成素主要异构体至相应的糖苷配基的转化。由此获得的所述糖苷配基的结构如下所示：

诱导或增强心肌分化

所述心肌生成素主要异构体和相应的糖苷配基可用于在体外和体内两方面诱导或增强心肌分化。这种效用已被事实证明，即在存在包含心肌生成素主要异构体或其糖苷配基的组合物下培养的MSC实质地展示了至心肌细胞的增强的分化。此外，当在心肌生成素主要异构体或其糖苷配基存在下将MSC与心肌细胞共同培养时，跳动的心肌细胞从MSC分化出来。

药物成分和剂量

可将所述分离的心肌生成素主要异构体和/或其相应的糖苷配基单独或与其它有类似或不同的生物活性的化合物一同进行施用。例如，本发明的化合物和药物组合物可以联合治疗进行施用，即，以单个或独立的剂型同时进行，或以独立剂型彼此在数小时或数天内进行。这种联合治疗的实例包括将心肌生成素主要异构体和/或其相应的糖苷配基的化合物与其它用于治疗中风、骨骼肌变性、伤口愈合、或心脏问题的药剂一同施用。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含心肌生成素主要异构体化合物、其水解游离酸产物(即，糖苷配基)、或游离酸的药学上可接受的盐，以及溶剂合物、互变异构体、多晶型物、水合物、结构衍生物或其前药，将它们与药学上可接受的载体进行混合。在一些实施方案中，根据药物配制的常例，所述组合物进一步包含一种或多种其它的治疗剂、药学上可接受的赋形剂、稀释剂、佐剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、缓冲剂、风味赋予剂、吸收促进剂、配位剂、增溶剂、润湿剂和表面活性剂。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含心肌生成素主要异构体的化合物或药学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体、多晶型物、水合物、结构衍生物或其前药，以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，所述药物组合物包含心肌生成素主要异构体的糖苷配基或药学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体、多晶型物、水合物、结构衍生物或其前药，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可通过口服、胃肠外、吸入或喷雾、经皮肤、阴道内或直肠以剂量单位制剂给药。本文所用的术语“胃肠外”包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、鞘内、心室内、腹膜内、心脏内注射或输注技术，以及经由直接注射至其它众多的任何其它组织或器官。

根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法，可制备适于口服使用的本发明的组合物。例如，本发明的化合物的液体制剂中含有选自下组的一种或多种试剂，所述组由以下各项组成：甜味剂、增溶剂、分散剂、调味剂、着色剂和保存剂，以便提供所述异构体药学上雅致的与合乎口味的制剂。

对于片剂组合物，使用活性成分与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物来制备所述片剂。这种赋形剂的实例包括但不限于：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甘露糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂与崩解剂，如玉米淀粉、或藻酸；结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。所述片剂可不包衣，或可通过公知的包衣技术对其进行包衣，以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，从而在所希望的时间内提供持续的治疗作用。例如，可使用时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。可使用提供活性成分缓慢浸出的其它的片剂制剂，以提供持续释放，包括使用水凝胶、渗透泵片和蜡基质。

用于口服使用的制剂也可呈现为硬胶或软胶胶囊，其中将活性成分与惰性固体稀释剂进行混合，所述固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙、乳糖、甘露糖醇、甲基纤维素或其衍生物或高岭土，或者呈现为软胶胶囊，其中将活性成分与水或油介质进行混合，所述油为如花生油、液体石蜡或橄榄油。

关于水悬浮液，将本发明的化合物与适合于维持稳定的悬浮液的赋形剂进行混合。所述赋形剂的实例包括但不限于：羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶。

所述口服悬浮液还可含有分散剂或润湿剂，如卵磷脂、或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂族醇的产物(如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、或化合物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或聚山梨糖醇酐单油酸酯)。所述水悬浮液也可包含一种或多种防腐剂(如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯)，以及一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂(如蔗糖或糖精)。

可添加如上述的甜味剂以及调味剂以提供合乎口味的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂，如抗坏血酸进行保存。

适用于通过加入水来制备含水悬浮液的可分散的粉末和颗粒剂提供掺有分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂的活性成分。适合的分散剂或润湿剂以及悬浮剂的实例已在上面提到。也可提供其它的赋形剂，如甜味剂、调味剂以及着色剂。

本发明的药物组合物也可为水包油型乳液形式。所述油相可为植物油(如橄榄油、芝麻油、花生或花生油)、或矿物油(如液体石蜡)、或它们的混合物。合适的乳化剂包括但不限于：天然存在的树胶(如阿拉伯胶或黄蓍胶)、其它天然存在的化合物(如大豆，卵磷脂，吐温类(Tween))以及由脂肪酸和己糖醇、酐、山梨糖醇酐单油酸酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯衍生的酯或偏酯。所述乳剂还可含有甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖来配制。这种制剂还可含有缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。所述药物组合物可为无菌注射药、水性悬浮液，或油性悬浮液的形式。可根据已知技术，使用上述那些适合的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来配制所述悬浮液。所述无菌可注射制剂也可为肠胃外可接受的无毒的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，如1,3-丁二醇溶液。在所述可接受的媒介物和溶剂中，可采用水、林格氏溶液(Ringer’s solution)以及等渗氯化钠溶液。此外，通常将无菌的固定油用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用包括合成甘油单酯或甘油二酯的任何温和的固定油。此外，可将脂肪酸如油酸用于注射药的制备。

操作实施例-心肌生成素主要异构体与相应糖苷配基的分离与活 性

1.萃取

图5示出了从EGJ纯化心肌生成素主要异构体方法的示意性综述。制备EGJ甲醇萃取物的标准植物是采集自中国贵州省。所述植物也被称原产于日本、韩国以及北美地区，并且同样预期的是从这些区域采集的材料包含适合于EGJ来源的不同含量的心肌生成素，其经由本说明的纯化方法可提供高纯度心肌生成素。

将所采集的材料进行干燥，并在室温下用甲醇过滤三次，每次6天。将EGJ甲醇萃取物在减压下使用喷雾干燥工序进行干燥，以便产生粉状残余物。在Ti=41℃下，将500g EGJ萃取物在2.5L的甲醇中进行1h的搅拌。在缓慢冷却至室温后，将悬浮液滤出，并且用200ml甲醇冲洗。在Ti=41℃下，将滤饼在1.5L的甲醇中重悬1小时，并在室温下进行其它的20小时的搅拌。在过滤后，将所述滤饼用750ml的甲醇冲洗。将合并的甲醇滤液浓缩以产生280g粗品＃1。

在1L的TBME加1.2L的水中搅拌粗品＃1，从而得到稠的乳液。将所述稠的乳液用0.5L的甲醇稀释，并且过滤，将滤饼用0.5L甲醇仔细冲洗，并且将这种合并的滤液(3.2L)浓缩至最终体积为2L。此时，已经形成了精细的甲醇水性悬浮溶液，可将其轻易通过纸滤器进行过滤来提供清澈深色的均相溶液。将水性甲醇溶液用0.3L二氯甲烷萃取3次。将水性甲醇溶液用分批0.3L TBME萃取5次。将余下的水性甲醇溶液层用0.9L的正丁醇进行稀释，接着是0.8L的水，以便产生良好的相分离。¹然后，将所述水层用0.3L正丁醇洗涤三次。将合并的正丁醇层(大概3.5L)用0.5L盐水进行洗涤，从而

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¹替代地，在已洗涤滤饼下，所述水性甲醇悬浮液可借助硅藻土进行过滤。接下来，所述甲醇水相用0.3L至0.6L二氯甲烷萃取3次，并且用分批0.3L至0.6L的TBME萃取5次。甲醇水相呈现为氯化钠饱和溶液，并且最后用正丁醇萃取。此过程可降低DCM萃取期间的乳液形成，并且避免浓缩甲醇水相以试图除去甲醇的需要，从而避免严重的发泡。提供1.4L水层和2.5L正丁醇层。将正丁醇在旋转蒸发器中进行浓缩，从而除去大约0.5L溶剂。将其余的正丁醇层(大约2L)用0.3L盐水萃取两次。完全浓缩的正丁醇层最终提供了36.4g粗品＃2。

2.HP-20吸附色谱

将545g干HP-20树脂(大约每粗品＃215质量当量干树脂)在甲醇中进行浆化，然后将其转移至柱(7.5cm×21cm=927ml柱体积)，并且交换成20%甲醇/水。将粗品＃2再悬于大约1至1.5体积的20%的甲醇/水中，并且应用在所述柱上。将其随着水中甲醇浓缩的增加进行洗脱(10%级)。对于20%至30%的甲醇/水级，得到了两个2L的馏分，对于40%至70%的甲醇/水级，得到了四个1L馏分。

使用HPLC对馏分进行分析。大部分心肌生成素含量在馏分9-17中。将馏分9和10汇集在一起作为池-1；馏分11至17为池-2；并且丢弃馏分1至8以及馏分18至20。在浓缩至干燥后，池-1产生了含有大约370mg心肌生成素的3.17g的固体，而池-2产生了含有大约1.2g心肌生成素的5.48g的固体。

3.正相快速色谱

将池-2的固体(5.4g)在30ml起始洗脱液DCM/甲醇90:10中进行浆化以制备给料。在用DCM/甲醇90:10(v:v)平衡的100g硅胶(大约20质量当量)上执行分离。在允许150ml的初馏之后，馏分为50ml等分直到馏分32，然后将洗脱液换为DC/甲醇85:15，并且获得100ml大小的馏分。在馏分42，将洗脱液换为DCM/甲醇80:20。

将馏分38和39汇集在一起作为池-11；将馏分40至44汇集在一起作为池-22；将馏分45至51汇集在一起作为池-33。在浓缩至干燥后，池-11产生了含有大约21mg心肌生成素(18.9%w/w)的0.11g的固体；池-22产生了含有约391mg心肌生成素(58.4%w/w)的0.67g的固体；并且池-33产生了含有约775mg心肌生成素(57.0%w/w)1.36g的固体。

4.反相色谱

为了增加心肌生成素的总体纯度，使用如下参数执行反相分离：

分离工序由在旋转蒸发器中在40℃和减压下蒸发ACN，以及随后冷冻干燥剩余的溶液组成。将分离的泡沫状物重新溶解在约1:2(v:v)的ACN/水中，并且再次冷冻干燥，以便除去残留微量的NH₄OAC。将池-22与池-33进行合并并且分离，循环60次，并且产生了1.29g白色泡沫状物。如图4所示，所述1.29g混合物包含合并的HPLC纯度为92.6%(a/a)的两种异构体。

5.手性相色谱

为了分离所述1.29g混合物中的两种异构体，使用如下参数执行手性相分离：

馏分3和4主要包含心肌生成素主要异构体，而馏分1和2主要包含心肌生成素次要异构体。将馏分2和3蒸发至干燥，并且用同样的方法再加工，以便确保最高产率。将馏分1和2以及馏分3和4分别相合并，并且进行操作。所述操作再次包括蒸发至干燥，然后在溶解于水:ACN=75:25(v:v)后进行冷冻干燥步骤。所述操作得到为主要异构体(96.49%a/a)的900mg白色粉末，以及180mg为次要异构体的白色粉末。

6.应力测试

执行应力测试以确定彼此分离的两种心肌生成素异构体是否是稳定、且不转换为彼此的。特别地，在40℃下，将所述两种心肌生成素异构体在MTBE/IPA=50:50中或为固态(所述主要异构体在溶液中以及为固态；所述次要异构体仅在溶液中)贮藏24小时。

心肌生成素主要异构体所有单个杂质峰，以及所述两种异构体的比率在测量准确度内是相同的。对于心肌生成素次要异构体，获得了相同的图片。在本方法的准确度内，在组合物中没有发现任何变化。由此可得出结论，所述心肌生成素的两个异构体是稳定的化合物，其可良好地抵抗热应力。

7.结晶

在To=40℃下，将为白色粉末(900mg)的分离的心肌生成素主要异构体在10倍体积的甲醇中进行搅拌，直至获得澄清的溶液。在To=40℃下，在50分钟内将水(40体积)缓慢加入。在约6滴水后，开始结晶。在添加完成后，将白色稠的悬浮液冷却至室温并过滤，并且将残余的固体用少量的母液从烧瓶中冲洗掉。将滤饼用甲醇/水(1:4)进行洗涤并在旋转蒸发器中进行干燥，以便提供为白色固体晶体的756mg心肌生成素。

结晶后的分离的心肌生成素主要异构体的纯度为98.97%a/a，如HPLC在210nm处所示(参见图6)，并且通过¹H-NMR谱分析确认了其身份(参见图7)。通过X-射线晶体学确认了纯化的心肌生成素主要异构体的结构，并且如图8所示。此外，¹H-NMR测定显示纯化的心肌生成素主要异构体的效力可达95.50%w/w。

8.皂化

如图19所示，用过量的NaOH，使所述分离的心肌生成素主要异构体在MeOH:H₂O1:1中经受皂化。所得的心肌生成素主要异构体的糖苷配基的HPLC纯度为至少92%。

9.生物活性

测试如下五种化合物在诱导MSC心肌分化中的活性：分离的心肌生成素主要异构体(HUYA-1)、分离的心肌生成素次要异构体(HUYA-2)、心肌生成素次要异构体的糖苷配基(HUYA-3)、心肌生成素主要异构体的糖苷配基(HUYA-4)以及根据Cheng等(2009)制备的心肌生成素组合物(Car)。在图9至13中分别示出了这些化合物的C18反相色谱曲线图。

根据如下描述的步骤执行测试：将大鼠的胫骨/股骨移去，并且用阿尔法IMDM培养基将BM从骨头中冲出。将所述BM良好混合，并且在1,500rpm下离心5分钟。将细胞沉淀用3ml培养基悬浮，并且将形成的细胞悬浮液小心地放在4ml聚蔗糖(Ficoll)溶液上，以尽量减少干扰，然后以200rpm的转速离心30分钟。将第二层转移至管中，并用PBS洗涤两次，以除去聚蔗糖(1200rpm，5分钟)。将所得的细胞沉淀再悬于含有10%热灭活的FBS(GIBCO)和1%青霉素/链霉素抗生素混合物的IMDM培养基中，并且这是用于测试的。在培养24小时后弃去非贴壁细胞。通过每3天更换一次培养基来培养贴壁细胞。在细胞培养14天后变得几乎汇合。为了激活心肌形态转变，将MSC分别在存在HUYA-1、HUYA-2、HUYA-3、HUYA-4或Car(10μg/ml的IMDM培养基)下培养7天。通过相衬显微镜在时间推移基础上对依赖治疗期的形态转变进行评估。

在对分别与HUYA-1、HUYA-2、HUYA-3、HUYA-4或Car(10μg/ml的IMDM培养基)一同培养的MSC进行3天或7天的处理后，执行荧光免疫细胞化学：在治疗后第3天使用针对早期心肌分化因子2(MEF2a)的抗体，并且在治疗后第7天使用收缩蛋白肌球蛋白重链β(MHCβ)，以便证明处理过的MSC的体外心肌分化。将荧光免疫染色的方法简要地概述如下：将所培养的细胞用4%多聚甲醛在PBS中固定15分钟，并且用0.5%的Triton X-100透化15分钟。如下为抗体稀释：对于大鼠MEF2a具有特异性的兔多克隆抗体(1:500)，以及对于MHC具有特异性的小鼠单克隆抗体(1:500)(两种抗体都来自

)。二级抗体为与荧光团(FITC495/528和Cy5650/667,

的产品)分别结合的山羊抗小鼠的抗体和兔抗IgG抗体。将细胞核用DAPI进行染色。通过荧光显微镜检查到的是与心肌分化相关的形态转变和培养的MSC的特异性标志物蛋白表达。

将骨髓GFP-MSC从GFP转基因小鼠的胫骨/股骨中分离出来。将所述的GFP-MSC与从新生SD大鼠分离的心肌细胞在存在HUYA-1下一起培养(10μg/ml的IMDM培养基)，以模拟心脏微环境。将培养物在荧光显微镜下每日进行研究，以便确定跳动的GFP阳性细胞，并度量培养的GFP-MSC形态转变。

正如在图14和15所示，所分离的心肌生成素主要异构体(HUYA-1)是最具有活性的化合物，从而诱导超过20%的培养的MSC在细胞培养物中进行心肌分化。HUYA-1比依据Cheng等(2009)制备的心肌生成素组合物(Car)更具有活性。所述心肌生成素主要异构体的糖苷配基(HUYA-4)也诱导MSC进行心肌分化。与HUYA-1相比，其活性较小，其可归因于HUYA-4在细胞培养基中的溶解度较低。将DMSO的浓度从5%提高至10%以便增加HUYA-4中的溶解度。相比之下，分离的心肌生成素次要异构体(HUYA-2)和其糖苷配基(HUYA-3)基本上没有活性，而只观察到MSC心肌分化的最低诱导。

图18示出了HUYA-1诱导了GFP-MSC的心肌分化，以在共培养系统中形成跳动的心肌细胞。

Claims (16)

1.一种具有下式并且在210nm下HPLC纯度为至少98%(a/a)的分离的化合物：

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物在210nm下的HPLC纯度至少为98.97%(a/a)。

3.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

4.一种从柔毛水杨梅萃取根据权利要求1所述的化合物的改进的方法，其包括以下步骤：(A)沉淀并过滤柔毛水杨梅的甲醇/水溶液以便除去不需要的固体，(B)使用二氯甲烷和叔丁基甲基醚(TBME)来相分离萃取所述甲醇/水溶液，并且(C)使用正丁醇萃取。

5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括使包含根据权利要求1所述的化合物的组合物经受使用树脂相对于材料负荷的最佳质量比(15:1)和甲醇/水的分级梯度的低压Diaion HP-20吸附色谱，接着是使用树脂相对于材料负荷最佳质量比(20:1)和二氯甲烷/甲醇的分级梯度的低压硅胶色谱。

6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括使包含根据权利要求1所述的化合物的组合物经受使用水性缓冲液和甲醇流动相梯度程序的高压反相色谱。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述高压反相色谱包括使用

C18(2)柱。

8.一种分离根据权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：(A)从柔毛水杨梅的甲醇萃取物中获得萃取物，和(B)使所述萃取物经受手性相色谱或超临界流体色谱，由此获得所述化合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述手性相色谱包括使用Chiralpak IC柱。

10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括(C)使所述化合物结晶。

11.一种分离的糖苷配基，其通过使如权利要求1所述的化合物水解来获得。

12.一种具有下式的分离的糖苷配基：

，其具有至少92%的纯度。

13.一种药物组合物，其包含如权利要求12所述的糖苷配基和药学上可接受的载体。

14.一种用于使心肌再生的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求3所述的药物组合物。

15.一种用于使心肌再生的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求13所述的药物组合物。

16.一种用于诱导或增强心肌分化的方法，所述方法包括使间充质干细胞与包含根据权利要求1或权利要求12所述的化合物的组合物相接触。

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