CN105884845A - 吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属药学领域，涉及式Ⅰ结构的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物及其在制备抗氧化应激，治疗心血管疾病药物中的新用途，同时还涉及所述化合物的提取和制备方法。本发明的化合物可从中药乌灵菌粉中提取分离得到或化学合成获得，经试验结果表明，本发明的化合物对氧化应激所产生的细胞损伤具有保护作用，可用于制备治疗心血管等疾病的药物；所述化合物可进一步制备抗氧化药物和制剂，包括注射、口服药物和外用药物等剂型的抗氧化药物。
Description
技术领域
本发明属药学领域，具体涉及吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
研究公开了氧化应激(oxidative stress,OS)是指由于氧自由基过量生成和/或细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。近年来研究表明，氧化应激是导致心血管系统结构、功能异常的重要原因之一，氧化应激以及在氧化应激过程中产生的活性氧与多种心血管疾病的发生发展有着密切关系。
活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是氧分子经细胞代谢的产物，分为2类：(1)不稳定的自由基，如超氧化物阴离子、羟基自由基、次氯酸根及过氧亚硝基等；(2)稳定的氧代谢物，如过氧化氢。组织中的ROS通过酶类或非酶类的抗氧化物质被清除；其中酶类抗氧化物主要包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)，此外还有血红素加氧酶一1、氧化还原蛋白质(如硫氧还蛋白TRXs、抗氧化蛋白PRXs及谷氧还蛋白)等；非酶类抗氧化物包括维生素A、维生素C、维生素E、B胡萝卜素、谷胱甘肽和胆红素等。研究显示，在正常情况下，自由基的产生和清除存在着动态平衡，但在某些病理情况下，机体的氧自由基过量生成和(或)抗氧化防御系统受损,氧自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏，当活性氧产生的速率大于被清除的速率时，就会造成活性氧的蓄积，导致氧化应激的出现。
有研究表明，氧化应激与多种心血管疾病有密切关系：1.通过氧化作用、促进局部炎症反应、诱导血管基因的改变和参与影响信号转导途径等多方面参与动脉粥样硬化的发生发展过程；2.参与了心肌细胞的凋亡，引起心力衰竭；3.在高血压发生发展的病理生理过程中发挥重要作用；4.氧化应激还与心肌肥厚，多种心律失常、心肌缺血等关系密切；研究还表明，抗氧化治疗能使血压降低、减轻血管重构、改善内皮功能、缓解炎症等。
乌灵菌(Xylaria nigripes)为黑柄炭角菌的菌核，属于真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Ascomycotina)，炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)，是一种名贵的中药，具有除湿、镇静安神、造血以及提高机体免疫功能等功效。乌灵菌粉作为已经上市的药物乌灵胶囊的主要成分，是由天然黑柄炭角菌中分离纯化出的菌种经生物技术发酵而成，具有补肾健脑、养心安神的功效。研究表明，乌灵菌的发酵物中发现的化合物1-(2,6-二羟基苯)-3-羟基-丁酮具有较强的DPPH自由基清除能力和还原能力；有研究通过测定水溶性黑柄炭角菌肽对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子、Fenton反应产生的羟基自由基、DPPH自由基的清除率、还原能力及抑制脂质体过氧化，发现水溶性黑柄炭角菌肽在体外具有明显的抗氧化作用；另有研究对黑柄炭角菌深层发酵制品中的DPPH自由基捕捉成分进行研究，发现20个自由基捕捉物质，且DPPH自由基捕捉活性优于维生素C、维生素E；Ma,Y.P.等运用正交矩阵的方法研究发现乌灵菌的胞外多糖具有很高的抗氧化活性。
基于此，本申请的发明人期待从乌灵菌粉中寻找新的天然或合成类的抗氧化药物。
于本发明相关的现有技术有：
[1]Taniyama Y,Griendling KK.Reactive oxygen species in the vas-culaturemolecular and cellular mechanisms[J].Hypertension,2003,42(6):1075
[2]Bassenge E,Schneider HT,Daiber A.Oxidative stress and cardiovasculardiseases[J].Dtsch Med Wochenschr,2005,130(50):2904-2909
[3]Heistad DD.Oxidative stress and vascular disease[J].Arterioscler Thromb VascBiol,2005,12:104
[4]龚庆芳,武守华,谭宁华,陈作红.黑柄炭角菌发酵菌丝中抗氧化及抗肿瘤活性的有效成分研究[J].食品科技,2008,33:28–31
[5]翁榕安,胡劲松,翁诗玉.水溶性黑柄炭角菌肽的体外抗氧化活性[J].湖南中医药大学学报,2012,32:10–13
[6]吴根福.黑柄炭角菌产生的DPPH自由基捕捉成分[J].微生物学报,2001,41:363–366
[7]Ma,Y.P.；Mao,D.B.；Geng,L.J.；Zhang,W.Y.；Wang,Z.；Xu,C.P..Production optimization,molecular characterization and biological activities ofexopolysaccharides from Xylaria nigripes.Chemical and BiochemicalEngineering Quarterly,2013,27:177–184。
发明内容
本发明的目的旨在提供新的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物及其在制备抗氧化应激，治疗心血管疾病药物中的新用途，同时还涉及所述化合物的提取和制备方法。
本发明所涉及化合物为式Ⅰ结构的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物：
其中，9位和11位构型为R或者S。
更具体的，本发明提供了基本结构如式Ⅱ所示的化合物1，2，3，4，5，6；
其中的化合物1，2，3可从中药乌灵菌粉中提取分离得到，化合物4，5，6为化学合成物；
本发明所述化合物通过下述方法制备，
从中药材中通过提取分离制备化合物1，2，3：
乌灵菌粉(Xylaria nigripes)用75％乙醇提取3次，每次提取36小时，得到的浸膏合并在65℃下减压浓缩，得到的浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取。减压浓缩后得到的浸膏经正相硅胶柱层析后，再经半制备HPLC制得化合物1，2，3；
本发明通过化学合成方法(Scheme 1)制备所述化合物1，2，3，4，5，6：
以(R)-(+)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醛(7)为起始原料，经格式反应，羟基叔丁基二甲基硅基保护，末端双键环氧化得到中间体化合物10，再与另一中间体5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛(13)在碱性条件下缩合，羟基氧化及酸性条件下脱保护同时环合，经HPLC纯化，最后合成目标产物。
其中：
步骤1：市售原料(R)-(+)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醛(7)在一种醚类溶剂中与一种烯丙基金属试剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物8；所说的烯丙基金属试剂是指烯丙基溴化镁、烯丙基氯化镁，特别是烯丙基溴化镁；所说的醚类溶剂选自C2～C4的脂肪醚或脂环醚，特别是乙醚或四氢呋喃；
步骤2：化合物8在一种卤代烃或醚类溶剂中与一种保护剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物9；所说的保护剂选自一种有机硅烷和一种碱；所说的醚类溶剂选自C2～C4的脂肪醚或脂环醚，特别是乙醚或四氢呋喃；所说的卤代烃溶剂选自C1～C4的卤代烃，特别选自二氯甲烷或三氯甲烷；所说的有机硅烷选自叔丁基二甲基氯硅烷，叔丁基二苯基氯硅烷或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯；所说的碱是叔胺，特别是2,6-二甲基吡啶，咪唑或三乙胺；
步骤3：化合物9在一种卤代烃或醚类溶剂中与间氯过氧苯甲酸反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物10；所说的醚类溶剂选自C2～C4的脂肪醚或脂环醚，特别是乙醚或四氢呋喃；所说的卤代烃溶剂选自C1～C4的卤代烃，特别选自二氯甲烷或三氯甲烷；
步骤4：化合物10和化合物13在一种有机溶剂中和一种碱存在的条件下反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物11；一种有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、甲醇或乙醇，特别N，N-二甲基甲酰胺或甲醇；所说的碱是氢化钠，氢化钾，氢氧化钾，氢氧化锂，或氢氧化钠，特别是氢化钠或氢氧化钾；
步骤5：化合物11在一种卤代烃溶剂中，与一种氧化剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物12；所说的卤代烃溶剂选自C1～C4的卤代烃，特别选自二氯甲烷或三氯甲烷；所说的氧化剂是是过钌酸四丙胺盐或(1,1,1-三乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯-马丁氧化剂)；
步骤6：化合物12在一种卤代烃溶剂或醚类溶剂中与一种酸反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到目标产物；所说的醚类溶剂选自C2～C4的脂肪醚或脂环醚，特别是乙醚或四氢呋喃；所说的卤代烃溶剂选自C1～C4的卤代烃，特别选自二氯甲烷或三氯甲烷；所说的酸是盐酸，硫酸，磷酸，对甲苯磺酸，樟脑磺酸，对甲苯磺酸吡啶盐，特别是盐酸。
上述化合物11根据文献方法(Org.Lett.2011,13,5452–5455)制备。
本发明制得的化合物其化学结构通过物理常数的测定和波谱数据的分析得以确定；所述化合物的物理性质和波谱数据如下：
化合物1：无色晶体，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D-189(c 0.1,MeOH)；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ9.39(s,1H),7.04(d,J＝4.1Hz,1H),6.09(d,J＝4.1Hz,1H),4.85(d,J＝15.8Hz,1H),4.77(d,J＝15.8Hz,1H),4.62(d,J＝13.9Hz,1H),4.10(ddd,J＝11.5,5.3,2.8Hz,1H),4.00(d,J＝14.0Hz,1H),3.80–3.90(m,3H),2.02(dd,J＝12.8,11.6Hz,1H),1.92(dd,J＝12.8,5.3Hz,1H)；HR-EIMS m/z 253.0952[M]+(calcd for C12H15NO5,253.0950,Δ＝0.8ppm).
化合物2：无色稠状物，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D-187(c 0.1,MeOH)；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ9.39(s,1H),7.04(d,J＝4.1Hz,1H),6.08(d,J＝4.1Hz,1H),5.11(d,J＝15.7Hz,1H),4.83(d,J＝15.7Hz,1H),4.69(d,J＝13.9Hz,1H),4.40(dt,J＝12.1,6.1Hz,1H),4.24(d,J＝13.9Hz,1H),4.03(dt,J＝6.7,4.8Hz,1H),3.72(dd,J＝11.7,4.4Hz,1H),3.62(dd,J＝11.7,6.8Hz,1H),2.52(dd,J＝13.3,6.9Hz,1H),2.11(dd,J＝13.3,7.0Hz,1H)；(+)ESIMSm/z 254[M+H]+；HR-EIMS m/z 253.0951[M]+(calcd for C12H15NO5,253.0950,Δ＝0.4ppm).
化合物3：白色粉末，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D+255(c 0.1,MeOH)；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ9.38(s,1H),7.04(d,J＝4.1Hz,1H),6.10(d,J＝4.1Hz,1H),5.03(d,J＝15.8Hz,1H),4.87(d,J＝15.8Hz,1H),4.61(d,J＝14.0Hz,1H),4.31(ddd,J＝8.2,4.5,2.6Hz,1H),4.25(d,J＝14.0Hz,1H),4.08(ddd,J＝4.8,4.4Hz,3.2,1H),3.73(dd,J＝12.1,3.2Hz,1H),3.62(dd,J＝4.8,1.8Hz,1H),2.37(dd,J＝14.0,8.3Hz,1H),2.16(dd,J＝14.0,2.6Hz,1H)；(+)ESIMSm/z 254[M+H]+；HR-EIMS m/z 253.0949[M]+(calcd for C12H15NO5,253.0950,Δ＝-0.4ppm).
化合物4：无色晶体，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D+132.4(c 0.1,MeOH)；1H NMR data(400MHz,CDCl3):δ9.43(s,H-7),6.90(d,J＝4.0Hz,H-3),5.99(d,J＝4.0Hz,H-4),4.79(d,J＝15.6Hz,H-6a),4.74(d,J＝15.6Hz,H-6b),4.59(d,J＝14.4Hz,H-8a),4.03(d,J＝14.0Hz,H-8b),4.00(ddd,overlapped,H-11),3.80(dd,J＝10.8,5.2Hz,H-13a),3.62(ddd,J＝10.4,8.8,5.2Hz,H-12),3.43(t-like,J＝10.4Hz,H-13b),2.24(dd,J＝12.8,5.2Hz,H-10a),1.70(dd,J＝12.8,11.2Hz,H-10b)；(+)ESIMS m/z 254[M+H]+；HR-EIMS m/z 253.0949[M]+(calcd forC12H15NO5,253.0950,Δ＝-0.4ppm).
化合物5：白色粉末，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D-240.8(c 0.1,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.41(s,H-7),6.90(d,J＝4.0Hz,H-3),6.00(d,J＝4.0Hz,H-4),4.87(d,J＝15.6Hz,H-6a),4.82(d,J＝15.6Hz,H-6b),4.66(d,J＝14.0Hz,H-8a),4.14(br d,J＝11.6Hz,H-13a),3.99(d,J＝14.0Hz,H-8b),3.95(m,H-11),3.70(br d,J＝11.6Hz,H-13b),3.72(m,H-12),2.27(dd,J＝14.8,4.0Hz,H-10a),1.94(dd,J＝14.8,2.4Hz,H-10b)；(+)ESIMS m/z 254[M+H]+；HR-EIMS m/z 253.0952[M]+(calcd for C12H15NO5,253.0950,Δ＝0.8ppm).
化合物6：无色稠状物，易溶于丙酮，甲醇，氯仿。分子式C12H15NO5；[α]22 D+225(c 0.1,MeOH)；1H NMR(600MHz,CD3OD):δ9.39(s,H-7),7.04(d,J＝4.1Hz,H-3),6.08(d,J＝4.1Hz,H-4),5.00(d,J＝15.6Hz,H-6a),4.83(d,J＝15.6Hz,H-6b),4.75(d,J＝14.0Hz,H-8a),4.53(ddd,J＝6.9,4.2,2.9Hz,H-11),4.27(d,J＝14.0Hz,H-8b),4.14(ddd,J＝6.8,4.4,4.2Hz,H-12),3.83(dd,J＝12.0,4.4Hz,H-13a),3.78(dd,J＝12.0,6.6Hz,H-13b),2.56(dd,J＝14.5,6.8Hz,H-10a),2.08(dd,J＝14.5,2.9Hz,H-10b)；(+)ESIMS m/z 254[M+H]+；HR-EIMS m/z 253.0951[M]+(calcd for C12H15NO5,253.0950,Δ＝0.4ppm).
本发明通过对氧化应激引起的A7r5鼠血管平滑肌细胞损伤的抑制作用实验测试所述化合物的活性；其中，tBHP是用做产生氧化应激的活性氧自由基，(+)-水合儿茶素((+)-Catechin hydrate)为阳性对照化合物；实验显示(如图1所示)，所述化合物均有一定的抗氧化应激活性，其中化合物3和5抗氧化应激活性最强；
结果表明，本发明的化合物对氧化应激所产生的细胞损伤具有保护作用，可用于制备治疗心血管等疾病的药物；所述化合物可进一步制备抗氧化药物和制剂，包括注射、口服药物和外用药物等剂型的抗氧化药物。
附图说明
图1显示所述化合物对tBHP损伤的A7r5细胞存活率的作用，
图中纵坐标数值为细胞存活率，正常对照组存活率设为100％，#p<0.05相比于正常细胞，*p<0.05相比于tBHP损伤组，(+)-水合儿茶素((+)-Catechinhydrate)为阳性对照。
具体实施方式
下面实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1由乌灵菌粉提取分离化合物1，2，3
乌灵菌粉20kg(Xylaria nigripes)用75％乙醇20L依次提取3次，每次提取36小时，得到的浸膏合并在65℃下减压浓缩，得到浸膏1.3kg，用1L水分散，依次用石油醚(3×1L)和乙酸乙酯(4×2L)萃取；减压浓缩后分别得到各部分浸膏石油醚部份浸膏70.5g，乙酸乙酯部份浸膏281.6g，使用硅胶柱层析对乙酸乙酯部位经正相硅胶柱洗脱，依次采用PE：EA(20:1-2:1)、CH2Cl2：MeOH(50:0–0:1)梯度洗脱，得到15个组分(Fr.1-Fr.15)。Fr.11f(300.0mg)经过硅胶柱色谱以CH2Cl2：MeOH(50:1))洗脱之后经Sephadex LH-20(MeOH，CH2Cl2：MeOH,2:1)纯化得到化合物3(5.0mg)；Fr.11g(140.0mg依次分别经过ODS[MeOH：H2O(9:1-1:0,v/v)]梯度洗脱、硅胶柱色谱[CH2Cl2：MeOH(50:1)]，最后用Sephadex LH-20(MeOH)纯化得到化合物1(4.0mg)；Fr.11h(550.1mg)经过多次硅胶柱和Sephadex LH-20(MeOH)得到化合物2(21.7mg)。
实施例2
步骤1，合成(S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)丁-3-烯-1-醇
取5g(38.5mmol)化合物7溶解在干燥的四氢呋喃(35ml)中，降温至-78℃,缓慢滴加1.7M烯丙基氯化镁34ml(57.8mmol),滴加过程中保持温度在-70℃以下，加料完毕继续在此温度下反应2h，在低温下缓慢加入30ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，加水稀释后水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相后用饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到无色液体(8)5.7g，收率86.0％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8a:5.85(m),5.18(m),5.13(m),4.03(m),3.94(m),3.78(m),2.34(m),2.23(m),1.44(s),1.37(s)；8b:δ5.85(m),5.15(m),4.03(m),3.76(m),3.60(m),2.23(m),2.18(m),1.45(s)；HRMS(EI):calcd for C9H16O3[M]+172.0997,found 172.0970。
步骤2，合成叔丁基(((S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)丁-3-烯-1-基)氧)二甲基硅烷
取1g(5.8mmol)化合物8，溶解在干燥的二氯甲烷(10ml)中，充入氮气保护，冰水浴冷却后，依次加入2,6-二甲基吡啶(1.3ml)和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(2ml)，加毕缓慢升至室温反应3h，加水淬灭反应，用1M硫酸氢钾洗涤一次，水相用二氯甲烷萃取2次，合并有机相用饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(9)1.5g，收率88.0％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):9a:δ5.84(m),5.09(m),5.05(m),3.96(m),3.81(m),2.29(m),1.39(s),1.33(s),0.88(s),0.07(s),0.06(s)；9b:δ5.83(m),5.04(m),4.05(dd,J＝13.1,6.6Hz),3.96(m),3.74(m),2.27(m),2.10(ddd,J＝14.0,7.5.7.0Hz),1.41(s),1.34(s),0.88(s),0.07(s),0.05(s)；HRMS(EI):calcd for C9H16O3[M]+309.1859,found 309.1862。
步骤3，合成叔丁基((1S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)-2-(环氧乙烷-2-基)乙氧基)二甲基硅烷
取2g(7.0mmol)化合物9，溶解在二氯甲烷(20ml)中，充入氮气保护，降温到0-5℃，加入50％间氯过氧苯甲酸2.9g(8.4mmol)，加完后缓慢升至室温搅拌过夜。冰水冷却后，用饱和亚硫酸氢钠淬灭反应，搅拌10min后，水相用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(10)1.5g，收率70.0％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.14–3.69(m,4H),3.15–3.04(m,1H),2.83–2.76(m,1H),2.55–2.46(m,1H),1.84–1.54(m,2H),1.41–1.40(Me,3H),1.35–1.34(Me,3H),0.90[Si-C-(CH3)3,9H],0.12–0.07[Si(CH3)2,6H]；HRMS(EI):calcd for C15H30O4Si[M]+302.1913,found 302.1911。
步骤4，合成1-(4-((叔丁基二甲硅基)氧)-4-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)-2-羟丁基)-5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛
取18mg(0.3mmol)氢氧化钾，氮气保护，加入干燥甲醇(3ml)和0.26g(1.2mmol)化合物13的甲醇溶液，搅拌10min后，加入0.5g(1.6mmol)化合物10，加毕升温至回流40h，加水淬灭反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(11)0.50g，收率60.0％。
δ9.50–9.49(CHO,1H),6.92(d,J＝3.9Hz,1H),6.29(d,J＝3.8Hz,1H),4.91–4.51(m,4H),4.29–3.68(m,6H),3.62–3.06(m,2H),1.88–1.53(m,8H),1.41–1.33(2×CH3,6H),0.87(C(CH3)3,9H),0.14–0.05(Si(CH3)2,6H)；HRMS(EI)calcd forC11H16NO3[M]+511.2965,found 511.2968。
步骤5，合成1-((S)-4-((叔丁基二甲硅基)氧)-4-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-yl)-2-氧代丁基)-5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛
取1g(2.0mmol)化合物11，溶解于二氯甲烷(50ml)中，氮气保护，冰水冷却后缓慢加入3.3g(8mmol)戴斯-马丁氧化剂，缓慢升至室温反应3h，冰水冷却，加入Na2S2O3:NaHCO3＝1:1的混合溶液淬灭反应，直至溶液澄清。水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(12)0.9g，收率92.0％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.46(s,1H),6.91(d,J＝3.9Hz,1H),6.30(d,J＝3.9Hz,1H),5.28(d,J＝11.2Hz,1H,CHaN),4.60(d,J＝11.2Hz,1H,CHbN),4.60–4.32(m,3H),4.24–4.10(m,1H),4.00(m,2H),3.80(m,2H),3.50(m,1H),2.88–2.82(m,1H),2.75–2.60(m,1H),1.83–1.48(m,6H),1.36–1.32(2×CH3,6H),0.85(s,9H；C(CH3)3),0.10–0.09(Si(CH3),3H),0.06–0.04(Si(CH3)2,3H)；HRMS(EI)calcd for C11H16NO3[M]+509.2809,found 509.2811。
步骤6，合成目标化合物
取4.4g(8.62mmol)化合物12，溶解于四氢呋喃(100ml)中，冰水冷却后，加入4ml 4mol/L的盐酸，加毕后升至室温反应5h，冰水冷却后加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，用乙酸乙酯萃取4次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化，HPLC纯化后得到化合物1(200mg)，2(140mg)，3(180mg)，4(150mg)，5(145mg)，6(155mg)。
实施例3
步骤1，合成(S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)丁-3-烯-1-醇化合物8的操作和实施例1的操作相同，反应试剂烯丙基氯化镁改为烯丙基溴化镁，收率为80％
步骤2，合成叔丁基(((S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)丁-3-烯-1-基)氧)二甲基硅烷
取1g(5.8mmol)化合物8，溶解在干燥的二氯甲烷(10ml)中，充入氮气保护，冰水浴冷却后，依次加入三乙胺(1.2g)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.1g)，加毕缓慢升至室温反应16h，加水淬灭反应，用1M硫酸氢钾洗涤一次，水相用二氯甲烷萃取2次，合并有机相用饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(9)0.8g，收率53.3％。
步骤3，合成叔丁基((1S)-1-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)-2-(环氧乙烷-2-基)乙氧基)二甲基硅烷
化合物10的操作与实施例1的操作相同，反应溶剂二氯甲烷改为三氯甲烷，收率为68％。
步骤4，合成1-(4-((叔丁基二甲硅基)氧)-4-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-基)-2-羟丁基)-5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛
取19mg(0.79mmol)氢化钠，氮气保护，冷至0℃，加入干燥N,N-二甲基甲酰胺(5ml)和82m g(39.3mmol)化合物13的N,N-二甲基甲酰胺溶液，搅拌30min后，加入0.1g(0.3mmol)化合物10，加毕升温至55℃反应40h，加水淬灭反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后粗产品经硅胶柱层析纯化得到浅黄色液体(11)84mg，收率50.0％。
步骤5，合成1-((S)-4-((叔丁基二甲硅基)氧)-4-((R)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷-4-yl)-2-氧代丁基)-5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛
化合物12的操作与实施例1的操作相同，反应溶剂二氯甲烷改为三氯甲烷，收率为88％。
步骤6合成目标化合物
目标化合物的操作与实施例1的操作相同，反应试剂4mol/L的盐酸改为1mol/L的硫酸。
实施例3抗氧化实验：
37℃和5％CO2条件下，A7r5细胞(美国标准菌库购买)悬于含10％FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素培养基中，将A7r5细胞接种于96孔培养板上，在给药组中加入相应浓度的待测化合物(25,50and 100μM)以及正常对照组加入相应浓度的(+)-水合儿茶素(50and 100μM)，孵育4小时后，分别加入200μM的tBHP后继续培养12小时，然后加入0.5mg/mL MTT溶液进行活细胞染色，孵育4小时后，弃去培养液，加入DMSO，并在摇板机上振摇使之充分溶解，用酶标仪在490nm的波长下测定各组的细胞存活率，实验结果显示，所述化合物对A7r5细胞氧化应激损伤均有保护作用，其中化合物3和5抗氧化应激活性最强。
Claims (18)
1.式Ⅰ结构的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物：
其中，9位和11位构型为R或者S。
2.根据权利要求1所述吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物，其特征在于，所述化合物为式Ⅱ所示的1，2，3，4，5，6：
3.根据权利要求2所述的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物，其特征在于化合物1，2，3为天然提取产物，通过下述方法从中药乌灵菌粉中分离制得；
乌灵菌粉(Xylaria nigripes)用75％乙醇提取3次，每次提取36小时，得到的浸膏合并在65℃下减压浓缩，得到的浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩后得到的浸膏经正相硅胶柱层析后，再经半制备HPLC制得化合物1，2，3。
4.制备权利要求1或2所述的吡咯并吗啉螺环生物碱类化合物的方法，其特征在于，通过下述路线(Scheme 1)：
以(R)-(+)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醛(5)为起始原料，经格氏反应，羟基叔丁基二甲基硅基保护，末端双键环氧化得到中间体化合物8，再与另一中间体5-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧)甲基)-1H-吡咯-2-甲醛(11)在碱性条件下缩合，羟基氧化及酸性条件下脱保护同时环合，经HPLC纯化，最后合成目标产物，
5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，制备化合物1，2，3，4，5，6的方法中包括从中间体8-12转化，其合成方法包括步骤：
步骤1：市售原料(R)-(+)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醛(7)在一种醚类溶剂中与一种烯丙基金属试剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物8；
步骤2：化合物8在一种卤代烃或醚类溶剂中与一种保护剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物9；所说的保护剂选自一种有机硅烷和一种碱；
步骤3：化合物9在一种卤代烃或醚类溶剂中与间氯过氧苯甲酸反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物10；
步骤4：化合物10和化合物13在一种有机溶剂中和一种碱存在的条件下反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物11；
步骤5：化合物11在一种卤代烃溶剂中，与一种氧化剂反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到化合物12；
步骤6：化合物12在一种卤代烃溶剂或醚类溶剂中与一种酸反应，经过后处理硅胶柱层析纯化后得到目标产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1中所说的烯丙基金属试剂是烯丙基溴化镁或烯丙基氯化镁。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1、步骤2、步骤3和步骤6中所说的醚类溶剂选自C2～C4的脂肪醚或脂环醚。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1、步骤2、步骤3和步骤6中所说的醚类溶剂选自乙醚或四氢呋喃。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2、步骤3、步骤5和步骤6中所说的卤代烃溶剂选自C1～C4的卤代烃。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2、步骤3、步骤5和步骤6中所说的卤代烃溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2中所说的有机硅烷选自叔丁基二甲基氯硅烷，叔丁基二苯基氯硅烷或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2中所说的碱是叔胺。
13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2中所说的碱是2,6-二甲基吡啶，咪唑或三乙胺。
14.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4中的一种有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、甲醇或乙醇。
15.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4中所说的碱是氢化钠，氢化钾，氢氧化钾，氢氧化锂，或氢氧化钠。
16.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5中所说的氧化剂是过钌酸四丙胺盐或(1,1,1-三乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯-马丁氧化剂)。
17.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤6中所说的酸选自盐酸，硫酸，磷酸，对甲苯磺酸，樟脑磺酸，对甲苯磺酸吡啶盐。
18.权利要求1的化合物在制备抗氧化药物或制剂中的用途。
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