CN108424405A - 伏立诺他和紫杉醇的共前药及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种伏立诺他和紫杉醇的共前药及其制备方法与应用，其共前药同时包载有伏立诺他和紫杉醇，具有式I结构；制备方法：将伏立诺他和紫杉醇通过一个可裂解片段连接起来。本发明将伏立诺他和紫杉醇连接在一起，在一定条件下能够同时释放两种活性化合物发挥抗肿瘤作用。本发明同时公开了一种伏立诺他和紫杉醇共前药的纳米胶束，可以达到靶向和缓释作用，减少药物的毒副作用，降低肿瘤细胞耐药性，从而提高药物化疗作用。

Description

伏立诺他和紫杉醇的共前药及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物化学的研究技术领域，特别涉及伏立诺他(vorinostat,SAHA)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)的共前药及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病，其发病率呈逐年上升的趋势，严重危害人们的身体健康。当前癌症的治疗主要有手术切除，放射疗法以及化学疗法。化疗是治疗肿瘤的主要手段之一。细胞毒类药物是化疗中的一线药物，它使快速分化的肿瘤细胞凋亡而发挥作用。但目前的抗肿瘤药物存在生物相容性差，高毒性和耐药性等问题，导致很多临床试验不能得到理想的效果。近年来，很多研究表明联合药物治疗可以很好的抑制肿瘤耐药性，不同的药物可以在细胞周期各个阶段通过不同的作用机制阻碍肿瘤细胞生长从而杀死肿瘤细胞。
紫杉醇(PTX)是临床使用最广泛的抗肿瘤药物之一，具有独特抗微管作用机理，广泛应用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、非小细胞性肿瘤以及类风湿性关节炎的治疗。其作用方式是通过微管蛋白稳定化作用抑制微管分解，使细胞分裂阻断在G2期和M期，促进肿瘤细胞死亡，从而抑制肿瘤的生长。然而，长期使用PTX会产生耐药性，限制了其在临床上的应用，这是由于其微管结构的变异改变了细胞内药物水平和信号转导，从而避免了凋亡通道。因此增加药物在肿瘤组织的聚集，逆转其耐药性显得尤为重要。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂是一类能够抑制组蛋白去乙酰化酶活性，使靶蛋白恢复乙酰化的小分子抑制剂，它通过减弱DNA与组蛋白之间的相互作用，使染色质结构疏松，调控特定基因的表达，促进细胞分化，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤目的。伏立诺他(SAHA)是一种应用比较广泛的HDAC抑制剂，已被FDA批准用于加重、持续和复发或用两种全身性药物治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。但SAHA单药治疗实体瘤的疗效不佳，现已有文献报道其与顺铂、紫杉醇和地西他滨等联合应用协同杀伤肿瘤细胞效果良好，因此联合用药将是它用于实体瘤治疗的主要方式。
联合用药是近年来肿瘤化疗领域的热点之一,也是克服肿瘤耐药、降低毒副作用的有效方法之一。已有细胞实验研究表明，SAHA可以增强PTX的抗肿瘤作用，尤其是在乳腺癌，卵巢癌及子宫内膜癌肿瘤细胞中。但若以通常给药方式，SAHA和PTX制剂分别是通过口服和静脉注射的给药方式，这种同时给药的方式因为分子差异及细胞内作用机制不同使其并不能同时到达肿瘤组织发挥协同作用，所以仍需进行进一步研究，希望提供一种更有效的给药方式。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有给药方式的缺陷而提出了一种伏立诺他和紫杉醇的共前药及其制备方法和应用，将其进一步制备成伏立诺他(SAHA)和紫杉醇(PTX)共前药的单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸纳米胶束，共前药可在到达体内后缓慢从胶束中裂解出来并很快释放出PTX和SAHA两种原药从而发挥抗肿瘤作用，实现靶向和缓释作用，延长药物作用时间。
本发明的目的是这样实现的：
一种伏立诺他和紫杉醇的共前药，该共前药具有式I所示结构：
式I中，R为其中m＝1～6；n＝1～10。
一种上述共前药的制备方法，该方法制备反应过程如下式所示：
式中，m＝1～6；
反应步骤包括：
i)取代反应：化合物II在有机溶剂中先与CDI反应活化为一个活性中间体为化合物III，再与氨基酸叔丁酯发生取代反应生成化合物IV；所述化合物II与CDI的摩尔比为1:1，反应时间为1-2h；化合物II与氨基酸叔丁酯的摩尔比为1:1，反应时间为8-10h；反应均要求无水条件；
ii)脱除反应：在强酸作用下，化合物IV脱除一个叔丁基得到化合物V；所述化合物IV需在冰浴条件下加入，后缓慢升至室温，反应时间为1-2h；
iii)缩合反应：在缩合剂的作用下，化合物V与紫杉醇在有机溶剂中发生缩合反应生成化合物I-1；所述化合物V与紫杉醇的摩尔比为1:1，化合物V与缩合剂的摩尔比为1:1，反应时间为12-15h。
其中，步骤i)中，所述有机溶剂为DCM、THF、乙腈中的一种或数种；步骤ii)中，所述强酸为20％～60％浓度的三氟乙酸二氯甲烷溶液；步骤iii)中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N’－二环己基碳二亚胺、N,N’－二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种或数种；所述有机溶剂为DMF、DCM、DMSO、THF、丙酮、乙腈中的一种或数种。
一种上述共前药的制备方法，该方法制备反应过程如下式所示：
式中，n＝1～10；
反应步骤包括：
i)缩合反应：在催化剂和缚酸剂的作用下，紫杉醇与环状酸酐发生缩合反应生成化合物VI；所述紫杉醇与环状酸酐的摩尔比为1:1.4、与催化剂的摩尔比为1:1、与缚酸剂的摩尔比为1:3.7，反应时间为11-13h；
ii)取代反应：化合物II先与CDI反应活化为一个活性中间体为化合物III，再与化合物VI发生取代反应生成化合物I-2；所述化合物II与CDI的摩尔比为1:1；反应时间为1-2h；所述化合物II与化合物VI的摩尔比为1:1，反应时间为8-10h；反应均要求无水条件。
其中，步骤i)中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶或二异丙基乙胺；所述缚酸剂为吡啶或三乙胺。
一种上述共前药的纳米胶束，该纳米胶束是由化合物I与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸制备而成，胶束中，化合物I包封率为95.4-95.8％、载药量为19.0-19.1％；胶束粒径为72.0～73.0nm；PDI为0.29±0.25；zeta电位为-11.5mV。
其中包封率和载药量的计算方式如下：
单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，简称mPEG2000-PLA1750，其结构式为：
式中，x＝40-50，y＝22-27。
一种上述纳米胶束的制备方法，该制备方法包括以下具体步骤：
i)取化合物I与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(mPEG2000-PLA1750)以1:4的质量比，完全溶解于乙腈中，于40℃旋干，形成一层薄膜，抽真空，真空干燥过夜；
ii)在水浴加热50℃下，将薄膜溶解于同温去离子水中，振荡充分至水化完全，用0.22μm的滤膜过滤，冻干即得。
一种上述纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的伏立诺他和紫杉醇的共前药，可实现同时释放两种原药发挥抗肿瘤作用。其中前药是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物，提供这种药物的目的是提高药物生物利用度，增加药物稳定性，减小毒副作用，促使药物长效化等。本发明的共前药可以使两种药物在到达肿瘤以前稳定存在，而在到达肿瘤以后可以同时释放出来发挥作用。
本发明还提供了将SAHA和PTX共前药制备成SAHA和PTX共前药单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸纳米胶束，胶束可在到达体内后缓慢裂解出共前药并很快释放出PTX和SAHA两种原药从而发挥抗肿瘤作用，实现靶向和缓释作用，延长药物作用时间，具备较好的应用前景。
附图说明
图1为化合物I-A和I-B在pH7.4和6.0的PBS中的稳定性和两个原药的释放率曲线图；图中A为化合物的降解图；B为紫杉醇的生成图；C伏立诺他的生成图。
图2为化合物I-A和I-B在小鼠和人血浆中的稳定性和紫杉醇的释放率曲线图；图中A为化合物的降解图；B为紫杉醇的生成图；
图3为化合物I-A和化合物I-B的细胞周期性实验结果图；
图4为化合物I-A和化合物I-B的蛋白质免疫印迹实验图；图中A和B分别为两个化合物在10h和24h时，在不同细胞上的HDAC抑制活性作用结果。
图5为化合物I-A纳米胶束的粒径分布情况示意图；
图6为化合物I-A纳米胶束的粒径稳定性示意图；
图7为化合物I-A纳米胶束的释放稳定性示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
化合物IV的合成
氮气保护下，将1g(3.78mmol)化合物II加入到100mL双颈瓶中，向其中加入20mlDCM，随后加入0.61g(3.78mmol)N,N′-羰基二咪唑，室温下搅拌1h以后加入0.5g(3.78mmol)甘氨酸叔丁酯，继续反应10h。二氯甲烷(20mL)和甲醇(10mL)稀释，0.2M的HCl洗涤(15mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，粗产物经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝50:1→30:1)得化合物IV白色固体1.05g，收率65.90％。m.p.126-128℃；MS(ESI):m/z CalcdforC21H31N3O6[M+H]+:422.2,found:422.1.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.41(s,1H),9.84(s,1H),8.01(t,J＝5.8Hz,1H),7.58(d,J＝7.8Hz,2H),7.27(t,J＝7.9Hz,2H),7.01(t,J＝7.3Hz,1H),3.68(d,J＝6.1Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),2.06(t,J＝7.2Hz,2H),1.54(dd,J＝16.0,6.9Hz,4H),1.41(s,9H),1.29(s,4H)。
实施例2
化合物V的合成
将1.05g(2.49mmol)化合物IV加入到50mL圆底烧瓶中，在冰浴下溶于30％浓度的三氟醋酸DCM溶液(10mL)中，30min后恢复至室温继续搅拌1.5h，减压蒸馏去除溶剂，再用DCM打浆(5mL×3)，得化合物V白色固体0.82g，收率90.08％。m.p.143-145℃；MS(ESI):m/z Calcdfor C17H23N3O6[M+H]+:366.1,found:366.2.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.68(s,1H),11.41(s,1H),9.84(s,1H),7.98(t,J＝5.8Hz,1H),7.58(d,J＝7.8Hz,2H),7.28(t,J＝7.9Hz,2H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),3.71(d,J＝6.0Hz,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.06(t,J＝7.2Hz,2H),1.54(dd,J＝16.6,6.8Hz,4H),1.29(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.12,169.95,155.43,139.31,128.58,122.86,118.99,42.29,36.33,31.86,28.28,24.96,24.63。
实施例3
化合物I-A的合成
将0.213g(0.586mmol)化合物V加入50mL圆底烧瓶中，溶于DCM(10mL)，向其中加入0.112g(0.586mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.079g(0.586mmol)1-羟基苯并三唑，冰浴下搅拌0.5h后加入紫杉醇0.506g(0.586mmol)，室温下继续反应15h。二氯甲烷稀释(10mL)，水洗(7mL×3)，饱和氯化钠溶液(10mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏去除溶剂。粗产物经柱层析(二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇＝50:1→30:1)得化合物I-A白色固体0.132g，收率18％。m.p.147-149℃；HRMS(ESI):m/z Calcd for C64H72N4O19,[M+Na]+:1223.4689,found:1223.4688.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.02(s,1H),9.86(s,1H),8.09(t,J＝15.5Hz,4H),7.76–7.64(m,3H),7.55(dd,J＝16.7,8.0Hz,5H),7.45(d,J＝6.7Hz,3H),7.35(q,J＝7.8Hz,4H),7.28(s,1H),7.24(s,1H),7.13(t,J＝6.8Hz,1H),7.05(t,J＝7.3Hz,2H),6.89(s,1H),6.21(s,1H),5.95(s,1H),5.78(s,1H),5.57(d,J＝6.7Hz,1H),5.35(d,J＝8.0Hz,1H),4.93(d,J＝9.7Hz,1H),4.33(d,J＝16.9Hz,1H),4.24(d,J＝8.5Hz,1H),4.12(t,J＝9.4Hz,1H),3.92(s,1H),3.54(d,J＝5.2Hz,1H),3.14(d,J＝5.8Hz,1H),2.88(s,1H),2.57(s,1H),2.25(s,9H),2.16(s,3H),1.81(d,J＝31.4Hz,6H),1.45(d,J＝14.5Hz,3H),1.38–1.18(m,8H),1.10(d,J＝14.0Hz,7H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ202.42,171.22,171.03,170.76,170.39,167.96,167.58,165.85,154.72,141.04,137.25,135.31,133.16,132.91,131.31,130.91,129.13,128.18,127.86,127.59,127.49,126.69,126.19,123.06,118.95,83.18,80.20,77.74,76.34,76.22,76.02,75.70,75.17,74.60,73.65,71.24,69.81,57.23,53.96,45.26,41.88,36.03,34.80,33.54,31.59,28.68,27.33,27.00,25.52,24.28,21.47,20.61,20.14,13.53,8.64。
实施例4
化合物VI的合成
氮气保护下，将0.1g(0.117mmol)紫杉醇加入25mL双颈瓶中，溶于DCM(5mL)，再依次加入0.044ml(0.433mmol)吡啶，0.016g(0.163mmol)丁二酸酐和0.014g(0.117mmol)4-二甲氨基吡啶。室温下反应13h。加水(20mL)稀释，1M的HCl调至弱酸性，二氯甲烷(8mL×3)萃取，饱和氯化钠溶液(10mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏去除溶剂。粗产物经柱层析(二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇＝100:1→50:1)得化合物VI白色固体0.065g，收率58％。m.p.178-180℃；MS(ESI):m/z Calcd for C51H55NO17[M+H]+:954.3,found:954.4.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝7.6Hz,2H),7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(t,J＝7.2Hz,1H),7.52(d,J＝7.3Hz,3H),7.38(t,J＝15.8Hz,7H),7.05(d,J＝9.2Hz,1H),6.25(dd,J＝18.3,9.3Hz,2H),5.99(d,J＝8.7Hz,1H),5.68(d,J＝6.7Hz,1H),5.53(s,1H),4.97(d,J＝9.3Hz,1H),4.48–4.39(m,1H),4.31(d,J＝8.3Hz,1H),4.19(d,J＝8.3Hz,1H),3.80(d,J＝6.7Hz,1H),2.66(dd,J＝11.7,6.8Hz,2H),2.57(d,J＝6.9Hz,3H),2.44(s,3H),2.36(dd,J＝15.1,9.3Hz,1H),2.18(d,J＝21.7Hz,4H),1.88(d,J＝24.8Hz,5H),1.67(s,3H),1.20(t,J＝25.3Hz,6H)。
实施例5
化合物I-B的合成
氮气保护下，将0.018g(0.068mmol)化合物II加入到25mL双颈瓶中，溶于DCM(5mL)，向其中加入0.011g(0.068mmol)N,N′-羰基二咪唑，室温下搅拌1h以后加入0.065g(0.068mmol)式化合物VI，继续反应10h。加入少量饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，二氯甲烷(5mL×3)萃取，饱和氯化钠溶液(8mL)洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，粗产物经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝100:1→50:1)得化合物I-B白色固体0.046g，收率57％。m.p.144-146℃；HRMS(ESI):m/z Calcd for C64H72N4O19[M+Na]+:1222.4725,found:1222.4724.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.28(s,1H),8.13(d,J＝7.4Hz,2H),7.79(d,J＝7.7Hz,2H),7.62(t,J＝7.1Hz,1H),7.58–7.34(m,12H),7.29(s,3H),7.08(t,J＝7.2Hz,1H),6.27(s,1H),6.16(t,J＝8.5Hz,1H),5.95(s,1H),5.66(d,J＝6.8Hz,1H),5.49(d,J＝4.2Hz,1H),4.96(d,J＝9.4Hz,1H),4.42(s,1H),4.30(d,J＝8.2Hz,1H),4.18(d,J＝8.3Hz,1H),3.78(d,J＝7.0Hz,1H),2.78(dd,J＝23.6,7.2Hz,4H),2.58–2.48(m,2H),2.40(s,3H),2.30(t,J＝7.0Hz,2H),2.22(s,3H),2.12(s,2H),2.06–1.96(m,1H),1.95–1.83(m,4H),1.76(s,1H),1.66(d,J＝3.2Hz,7H),1.59(s,2H),1.34(s,4H),1.16(d,J＝35.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ203.80,171.68,171.28,170.47,170.35,169.94,168.29,167.42,167.00,142.68,137.96,136.84,133.76,133.63,132.79,131.95,130.23,129.22,129.07,128.99,128.72,128.60,127.34,126.96,124.25,119.81,84.43,81.03,79.06,77.35,77.24,77.03,76.72,76.42,75.60,75.04,74.67,72.10,71.93,58.46,53.24,45.61,43.14,37.06,35.55,35.33,32.38,29.71,28.95,28.09,27.93,27.13,26.76,25.05,24.55,22.66,22.06,20.85,14.83,9.62,0.01。
实施例6
化合物I-A和化合物I-B的释放稳定性
以达到分离各种可能生成的中间体为前提，多次对液相条件进行摸索，确定液相条件后为减少流动相对波长的干扰，确定合适的浓度。最后分别对化合物及其代谢产物做出标准曲线，开始稳定性实验并总结药物释放情况，包括PBS(pH7.4/6.0)、小鼠、人血浆稳定性。实验结果见图1和图2。
由图1可知：测定PBS稳定性时，发现两者化合物均在酸性条件较碱性条件稳定。此外，化合物I-B比化合物I-A稳定，因此释放PTX和SAHA也较少。化合物I-A在pH7.4PBS中的半衰期在3h左右，在pH6.0PBS中24h仍有84.6％未降解；化合物I-B在pH7.4PBS中24h后有75.2％未降解，在pH6.0PBS中24h后有91.1％未降解。化合物I-A在pH7.4PBS中PTX释放率在48h达到最高为50.3％，在pH6.0PBS中PTX释放率也在48h达最高17.7％；化合物I-B在pH6.0和pH7.4PBS中基本无PTX释放。
由图2可知：测定人血浆稳定性时，二者半衰期都在0.5h左右，化合物I-A紫杉醇在3h达最高74.1％；测定小鼠血浆稳定性时，二者半衰期都小于0.5h，化合物I-B释放率在24h达最高72.3％；化合物I-A释放率在4h达最高85.8％。(测定血浆稳定性时，SAHA的峰与血浆中有重合，测量不准，故未列出)。
总的说来，化合物I-A的PTX和SAHA释放率在PBS、人和小鼠血浆中均高于化合物I-B。
实施例7
化合物I-A和I-B的细胞毒性实验
为评价化合物对肿瘤细胞增殖能力影响，采用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)蛋白染色法，选取人大肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐药株，作用72h后观察化合物对肿瘤细胞的增殖抑制率并计算IC50。
表1化合物I-A和化合物I-B及关联对照药物的体外细胞毒性评价
从表1细胞实验结果得出化合物I-B对三个癌细胞的抑制活性均较PTX/SAHA下降很多；化合物I-A对HCT-116的抑制活性比PTX降低了2.6倍左右，对MCF-7的抑制活性与PTX相当，对MCF-7/ADR的活性较PTX和SAHA均有提高。以上实验结果说明化合物I-A对人乳腺癌细胞及其耐药株保持了较好的抗肿瘤效果。
实施例8
化合物I-A和I-B细胞周期实验
用流式细胞仪测定了化合物对细胞周期的影响。取对数生长期细胞，接种于6孔培养板(105个细胞/孔)，将化合物配制成一定浓度进行处理。24h后，收集细胞，经碘化丙啶(10μg/mL)染色30min后应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况。实验结果见图3。
结果显示，PTX较SAHA有更强的诱导细胞分裂停留在G2/M期的作用，约为100倍作用效果。化合物I-A效果与PTX接近，化合物I-B也有一定阻断细胞周期作用，但强度明显比化合物I-A弱，与其稳定性试验结果相一致。说明化合物I-A具有与紫杉醇相当或更好的诱导细胞分裂阻断在G2期和M期的能力。
实施例9
化合物I-A和化合物I-B的HDAC抑制活性实验
HDAC抑制剂在微管蛋白的乙酰化作用中扮演着重要角色，一般根据微管蛋白的乙酰化水平评估化合物的胞内HDAC抑制活性。为研究两种化合物在细胞水平上HDAC抑制活性的差异，进行了蛋白质免疫印迹实验，选用SAHA/PTX作为阳性对照，以乙酰化的微管蛋白作为实验对象，实验结果见图4A、B。
结果显示，10h时，对于HCT-116、MCF-7、MCF-7/ADR三种细胞来说，化合物I-A都比化合物I-B的HDAC抑制活性好，化合物I-A的HDAC抑制活性与PTX相当。24h时，去乙酰化作用均有一定程度减弱，可能是由于化合物代谢所致。以上结果说明化合物I-A与PTX的HDAC抑制活性相当，比SAHA单独作用效果好。
实施例10
化合物I-A纳米胶束的制备
将实施例3制备的化合物，采用薄膜水化法制备纳米胶束，取式I-A所示化合物75mg、mPEG2000-PLA1750共聚物300mg溶于12ml乙腈中，在旋转蒸发仪上40℃缓慢蒸干2h，然后继续真空干燥24h，使有机溶剂完全除去。水浴50℃加热，使固体骨架融化，获得透明的凝胶状样品，向其中加入15ml去离子水，振荡充分水化至药膜完全溶解，得淡蓝色乳光溶液，0.22μm微孔滤膜过滤后冻干并于4℃保存。
实施例11
化合物I-A纳米胶束的性质检测
取冻干固体复溶后采用动态光散射(DLS)测量纳米胶束的平均粒径为72.5nm，PDI为0.29；zeta电位为-11.5mV。粒径分布结果见图5。
胶束的载药量(DL)及包封率(EE)测定如下：将4mg样品溶于0.2ml纯水中，再加入3.8ml乙腈，涡旋1min后再用12000rpm离心2min，取上清液经HPLC测得包封率为95.8％，载药量为19.1％。其包封率(EE)与载药量(DL)的算法如下：
实施例12
化合物I-A纳米胶束粒径稳定性
为测定将化合物I-A纳米胶束粒径稳定性，将化合物胶束溶于去离子水中，于25℃放置，分别于一定时间点测定其粒径变化及PDI。粒径稳定性结果见图6。
结果显示，粒径在48h内基本稳定，说明该胶束具有一定的稳定性。
实施例13
化合物I-A纳米胶束释放稳定性
将所制备的化合物I-A纳米胶束溶解于PBS7.4的溶液中，配制成2mg/ml的胶束溶液取1ml加入到MWCO2000的透析袋中，再放在10mlPBS缓冲液中，置于37℃，100r/min的摇床，在一定的时间段取点用HPLC分析释放情况。液相条件采用测定化合物PBS稳定性的液相条件。胶束释放稳定性结果见图7。
从实验结果来看，PBS中纳米胶束相比原化合物来说，比较稳定，紫杉醇和伏立诺他均缓慢释放，释放的紫杉醇和伏立诺他浓度在48h基本达到平衡，最高释放率分别为12.34％和40.42％，而化合物I-A的释放率最高为3％，说明其从胶束中释放出来可很快裂解为原药。该纳米胶束化合物具有明显的缓释作用，可减少紫杉醇药物的耐药性，达到更好的抗肿瘤作用。
实施例14
化合物I-A纳米胶束细胞毒性
为进一步评价化合物I-A纳米胶束对肿瘤细胞增殖能力影响，采用磺酰罗丹明B(sulforhodamineB,SRB)蛋白染色法，选取人大肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐药株，作用72h后观察化合物对肿瘤细胞的增殖抑制率并计算IC50。
表2化合物I-A纳米胶束及关联对照药物的体外细胞毒性评价
从表2细胞实验结果得出化合物I-A纳米胶束对三个癌细胞的抑制活性均较化合物I-A、SAHA、PTX和PTX+SAHA共同给药均有提高，材料mPEG2000-PLA1750基本无细胞毒性。化合物I-A纳米胶束较原化合物I-A来说，对HCT-116的抑制活性提高了5.6倍左右，对MCF-7的抑制活性提高了1.5倍左右，对MCF-7/ADR的活性提高了0.6倍；此外，化合物I-A纳米胶束对MCF-7/ADR的活性较PTX来说提高了4.0倍左右。以上实验结果说明化合物I-A纳米胶束可稳定原化合物I-A，并能较好的释放PTX和SAHA，进一步增强了对人乳腺癌耐药株细胞的抗肿瘤活性。
综上，本发明制备了基于HDAC抑制剂伏立诺他和紫杉醇的共前药，其能在一定条件下很好的释放两种活性原药紫杉醇和伏立诺他，并在细胞毒性和周期性试验中表现了较好的抗肿瘤作用，此外所制备的包含该共前药的纳米胶束相较于未形成胶束的共前药有更好的抗肿瘤作用，尤其体现在对人乳腺癌耐药株细胞的作用结果上，达到了缓释的效果，应用前景优良。

Claims (8)

1.一种伏立诺他和紫杉醇的共前药，其特征在于，该共前药具有式I所示结构：
式I中，R为其中m＝1～6；n＝1～10。
2.一种权利要求1所述共前药的制备方法，其特征在于，该方法制备反应过程如下式所示：
式中，m＝1～6；
反应步骤包括：
i)取代反应：化合物II在有机溶剂中先与CDI反应活化为一个活性中间体为化合物III，再与氨基酸叔丁酯发生取代反应生成化合物IV；所述化合物II与CDI的摩尔比为1:1，反应时间为1-2h；化合物II与氨基酸叔丁酯的摩尔比为1:1，反应时间为8-10h；反应均要求无水条件；
ii)脱除反应：在强酸作用下，化合物IV脱除一个叔丁基得到化合物V；所述化合物IV需在冰浴条件下加入，后缓慢升至室温，反应时间为1-2h；
iii)缩合反应：在缩合剂的作用下，化合物V与紫杉醇在有机溶剂中发生缩合反应生成化合物I-1；所述化合物V与紫杉醇的摩尔比为1:1，化合物V与缩合剂的摩尔比为1:1，反应时间为12-15h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤i)中，所述有机溶剂为DCM、THF、乙腈中的一种或数种；步骤ii)中，所述强酸为20％～60％浓度的三氟乙酸二氯甲烷溶液；步骤iii)中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N’－二环己基碳二亚胺、N,N’－二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种或数种；所述有机溶剂为DMF、DCM、DMSO、THF、丙酮、乙腈中的一种或数种。
4.一种权利要求1所述共前药的制备方法，其特征在于，该方法制备反应过程如下式所示：
式中，n＝1～10；
反应步骤包括：
i)缩合反应：在催化剂和缚酸剂的作用下，紫杉醇与环状酸酐发生缩合反应生成化合物VI；所述紫杉醇与环状酸酐的摩尔比为1:1.4、与催化剂的摩尔比为1:1、与缚酸剂的摩尔比为1:3.7，反应时间为11-13h；
ii)取代反应：化合物II先与CDI反应活化为一个活性中间体为化合物III，再与化合物VI发生取代反应生成化合物I-2；所述化合物II与CDI的摩尔比为1:1；反应时间为1-2h；所述化合物II与化合物VI的摩尔比为1:1，反应时间为8-10h；反应均要求无水条件。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤i)中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶或二异丙基乙胺；所述缚酸剂为吡啶或三乙胺。
6.一种权利要求1所述共前药的纳米胶束，其特征在于，该纳米胶束是由化合物I与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸制备而成，胶束中，化合物I包封率为95.4-95.8％、载药量为19.0-19.1％；胶束粒径为72.0～73.0nm；PDI为0.29±0.25；zeta电位为-11.5mV。
7.一种权利要求6所述纳米胶束的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下具体步骤：
i)取化合物I与单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸以1:4的质量比，完全溶解于乙腈中，于40℃旋干，形成一层薄膜，抽真空，真空干燥过夜；
ii)在水浴加热50℃下，将薄膜溶解于同温去离子水中，振荡充分至水化完全，用0.22μm的滤膜过滤，冻干即得。
8.一种权利要求6所述纳米胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
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