CN114028459A - 预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物和制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物和制备方法及应用。从新鲜植物蓝布正和委陵菜的去除了有肝毒性部分，并且显著增加了活性化合物有效含量的药物组合，因此可以更显著地增加预防或治疗哺乳动物包括人缺血性心脏病（IHD）效果的方法。所述IHD或疾病状态，例如：慢性冠心病、急性心肌梗塞、以及急性心肌梗塞导致的心力衰竭疾病。发明提供的活性部位可配制为用于所公开的方法的药物组合物和药物。还提供了所述活性部位在制备药物制剂和药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药
物和制备方法及应用。
背景技术
心脏是一个重要的内脏器官,也是单位耗氧量最大的器官，大约每100g心肌血流量60～80ml/分，如果成人心脏300克（约体重的0.5%）的话，整体心肌血流量约180～240ml/分。对比之下，全身组织平均每100g血流量7ml/分，心脏大约多10倍。心肌摄氧能力很强，能从毛细血管中摄取约65～75％的氧，在正常情况下，每100g心肌组织摄氧8～10ml/分，而其它全身器官组织仅能从血液中摄取25％的氧，每100g其它组织仅平均摄氧约0.3ml/分。运动时，心排血量需要显著增多，心脏工作量成比例增大，心肌需氧量也成比例增加。由于从血液中进一步提高摄氧量的余地已经不多，所以必需通过冠状动脉管腔的扩大，增加冠
脉循环血流量以适应耗氧量增加的需求。
IHD是由于冠状动脉能够供应的血流量显著小于心肌的需求，而导致的心肌缺血性损伤。IHD包括由于冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓形成或栓塞、以及冠状动脉发生痉挛等、引致的冠状动脉狭窄或闭塞，血液通过受阻，进而使下游灌注区的心肌得不到充分的血液灌注，由此导致出现心肌缺血的表现，甚至导致心肌细胞的损伤或死亡。尽管治疗IHD的药物和方法不断发展，IHD仍然是西方国家高发病率和死亡率的最主要原因。亚洲的发达地区也出现了相似的趋势。
IHD的病理学原因是部分冠状动脉的狭窄或完全阻断，从而导致狭窄或阻断的动脉的灌注区的心肌缺血性损伤或心肌梗死。尽管目前的治疗方法能延缓IHD的进程，但针对IHD病理变化的治疗还是空白。而心脏冠状动脉的代偿性新生血管又微乎其微，很难满足缺血心肌细胞对耗氧量和营养物的需求。因此，挽救有缺血风险心肌细胞的最有效方法是在心肌缺血区域及时建立新的侧枝循环以满足缺血心肌的供血需求，从而允许充足的氧、营养物质、循环干细胞、以及必需的生长因子被运送到心肌缺血或梗塞区进行修复。因此，通过在心肌的缺血区诱导快速再生冠状血管侧枝循环，恢复冠状动脉对缺血区的血液灌注，就能为IHD提供病理修饰性、最有效的治愈性治疗。目前，还没有任何药物或者方法能够促进在心肌的缺血区再生冠状侧枝循环来重建受损冠状动脉血管系统。而对已经梗死的心肌缺血区域除了需要重建冠状动脉循环以外，还需要促进有正确超微结构的和功能的心肌细胞的再生，重建新再生心肌细胞之间和重建新再生心肌细胞与存留心肌细胞间的微结构（如闰盘）。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种预防和治疗哺
乳动物缺血性心脏病的药物和制备方法及应用。
本发明一方面公开了预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，该药物为蓝布正活性成分和委陵菜活性成分组合而成药物组合物，该药物组合物是从蓝布正和委陵菜中萃取分离得到的多酚类、类黄酮和/或五环三萜类化合物。
进一步地，药物组合物为去除了潜在肝毒性化合物的成分。
进一步地，蓝布正活性成分是从蓝布正全草中萃取分离得到，委陵菜活性成分是从委陵菜全草中萃取分离得到，其中蓝布正全草与委陵菜全草的重量比为4:1。
进一步地，多酚类化合物包括Gemin A、没食子酸、鞣花酸中的一种或多种；类黄酮为槲皮素；五环三萜类化合物包括苦莓苷F1、苦莓苷F1甙元、熊果酸、翻白叶苷A、委陵菜酸中的一种或多种。
进一步地，缺血性心脏病或疾病状态包括慢性冠心病、急性心肌梗塞以及由心肌梗塞导致的心力衰竭。
进一步地，该药物还包括药学上可接受的载体，药物组合物与药学上可接受的载体制成口服制剂、舌下含服或注射制剂。
进一步地，注射制剂为皮下注射、肌肉注射或静脉注射。
更具体地，去除潜在肝毒性部分，并且显著增加活性部位中有效成分含量的药物组合可以通过任何合适的途径进行给药，包括口服、鼻内、舌下含服、胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠或局部。
进一步地，所给予的活性组合的量能产生所需的效果。在一些实施方案中，所述有效量包括能在哺乳动物个体中预防或治疗IHD、促进梗死或受损心脏组织中有功能的血管再生和心肌再生，或上调血管生成因子或者心肌再生相关因子表达的量。在一些实施方案中，所给予的组合物的量为0.002-5g/kg/天。在一些实施方案中，所述有效量的药物组合是包含所述组合物和药学可接受的载体的药物制剂的形式。
本发明另一方面还公开了预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物的制备方法，包括以下步骤：
1）分别采集新鲜蓝布正和委陵菜全草、洗净、分为两部分，一部分阴干、切成碎片；另一部分新鲜状态下，洗净，切成碎片，冷冻干燥；
2）分别将两部分蓝布正全草碎片和两部分委陵菜全草碎片混合，在真空状态下用5倍的石油醚或三氯甲烷中回流提取6小时，或者用二氧化碳超临界萃取方法，去除脂溶性的叶绿素和肝毒性成分；
3）将步骤2）提取过的植物原料在真空条件下用6倍浓度为55%的乙醇回流提取，将乙醇的提取液浓缩并喷雾干燥成固体粉末，得到乙醇提取物；
4）将乙醇提取物粉末溶混悬于水中，用乙酸乙酯进行萃取；
5）将用乙酸乙酯提取过的，去除肝毒性化合物的乙醇萃取液
浓缩、4℃温度条件下放置24小时、过滤、浓缩、减压干燥得到药物组合物。
进一步地，该方法还包括将步骤5）得到得药物组合物粉末溶于纯水中，用C1-C4的正丁醇进一步提取，正丁醇提取物在4℃下静置24小时，将不溶性沉淀物过滤去除后，于59℃下减压干燥，得到药物组合物干粉。
进一步地，该方法还包括后续通过反向柱层析的方法分离出的单体多酚类化合物、类黄酮和五环三萜类化合物的步骤。
本发明第三个方面还公开了该药物在制备预防和治疗缺血性心脏病药物中的应用。
进一步地，药物组合物在心脏缺血区促进侧枝循环建立和再生新的冠状血管，诱导有正确超微结构及有功能的心肌细胞再生上的应用。具体地，再生有功能的并且具有正确超微结构的心肌细胞来取代梗死的心肌组织。新再生的有功能的冠状动脉侧支可有效地向心肌缺血区恢复供血以提供氧、营养物、干细胞、以及生长因子，新再生的有正确超微结构的有功能的心肌可以补偿由于心肌梗死而受损的心脏功能。因此，该药物组合物可针对IHD病理变化进行实质性、治愈性治疗。
本发明中的哺乳动物可以是需要再生血管治疗的任何哺乳动物，例如人、狗、猫、牛、羊、猪、马、猴、大鼠、小鼠、兔和豚鼠。
本发明药物组合物主要通过在心肌受损部位提高组织细胞的生存能力、抗炎、促进缺血部位组织中的侧枝循环和新生血管生成、诱导有正确超微结构、有功能的心肌再生来取代梗死的心肌细胞来进行病理修饰性治疗IHD。该药物组合物具有靶向性促进心肌缺血区有功能的血管再生和靶向性在心肌梗死区诱导有正确超微结构的有功能的心肌细胞再生的双重功效。从而对慢性冠心病、急性心肌梗塞、以及相关的心力衰竭进行治愈性治疗。甚至老龄引起的心肌细胞退行性变的过程中，该药物组合物也可以有效地保护心肌组织结构的完整性和促进缺血心肌的侧枝循环形成。从而极大改善了心肌组织生存的微环境，心肌血液灌注，维持和恢复有效的心功能，避免再生不具有正确超微结构的心肌细胞导致的致命性心律失常。
附图说明
图1为药物组合物的制备流程图；
图2为石油醚和乙酸乙酯提取部分的潜在肝毒性处理图；
图3为试验动物的外观表现；
图4为石油醚提取部分的潜在心脏毒性显微图；
图5为aCGJ治疗大鼠急性心肌梗塞模型，心肌再生图；
图6心肌梗塞大鼠口服aCGJ三周后的新生心肌的完整性的超微结构；
图7为实验动物心脏功能的超声心电图评价。
具体实施方式
以下结合说明书附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。
实施例1：药物组合物制备
采集贵州海拔1000-1400米的蓝布正和委陵菜全草，洗净、阴干；或者采集贵州海拔1000-1400米的新鲜蓝布正和委陵菜全草，洗净。将上述新鲜草冷冻干燥/自然阴干的植物原材料分别剪成碎块,并将80%的蓝布正和20%委陵菜混合。试验中发现了蓝布正的乙醇/水提取物不仅含有诱导在心脏缺血区冠状血管再生重建心脏血管网的成分，同时还含有损害肝的成分。并且发现该损害肝脏的成分也抑制该活性部位在心脏损伤部位再生有正确超微结构的心肌组织。为了去除蓝布正活性提取物中对肝脏有害的成分，也为了增加该活性部位促进在心肌损伤部位再生有正确超微结构（有闰盘互相连接的新再生的心肌细胞，和有闰盘连接新再生的心肌细胞和健康存在的原有的心肌细胞）的心肌组织，首先根据蓝布正活性提取物所含化合物极性的不同，将其根据极性的大小分馏成四个组分，如用石油醚,氯仿，乙酸乙酯, 正丁醇分区萃取，得出四部分提取液。然后在59摄氏度下分别减压干燥，得到四种粉末。然后将得到的四种粉末分别在不同的动物模型里测试每一种粉末的促进在心脏缺血区促进冠状血管再生的功能和对肝脏的毒性作用。结果发现石油醚和氯仿的萃取部分，对实验动物不但有显著的肝毒性，也未发现有诱导冠状血管再生，或者心肌再生的作用。乙酸乙酯部分虽然在动物模型的心肌梗死区有一定的诱导心肌细胞再生的作用，但是考虑到其对肝脏也有轻度的肝毒性，所以也被视为有肝毒性去除。
如图2所示，石油醚与乙酸乙酯提取部分的潜在刚毒性，从图2可以看出，石油醚提取物处理的实验大鼠的肝细胞脂肪样变性非常严重，肝细胞结构和细胞界限完全消失。肝小叶、汇管区、中央静脉等微结构严重破坏。而对照组大鼠的肝纤维化较重，胶原纤维呈索状密集分布于小叶间，并切割肝小叶形成假小叶，而肝细胞脂肪样变性和空泡变相对比较轻。而aCGJ治疗组代表性显微镜图像。可见显著少的纤维组织呈细条穿插于小叶间，肝细胞结构清晰，排列整齐，大部分肝小叶结构基本清晰。可见较多的中央静脉和结构完整的肝小叶，并且与所有其他组的肝脏相比，纤维组织沉积也显著较少，较少见形成的假小叶。与EGJ治疗组（没有去除肝毒性成分）相比，对照组实验动物的肝脏纤维化程度显著较重，石油醚处理组的肝脏细胞损坏最为严重。而aCGJ治疗组肝脏细胞的损害最轻，比EGJ治疗组更好，而EGJ治疗组可见比aCGJ治疗组较多的纤维化索条和肝细胞的空泡化，但是比石油醚处理组损害轻。
对比之下，正丁醇萃取的部分不但没有发现任何的肝毒性，并且在心肌的缺血区有显著地诱导冠状血管再生的作用，同时在心肌梗塞动物模型中有诱导有正确超微结构的心肌细胞再生的作用。因此, 经过以上系列分区萃取，将正丁醇萃取部分在59摄氏度下，减压浓缩、喷雾干燥成干粉。将干燥干粉输入超微机进行超微细化粉碎，粉末细磨后过筛，将未达到微纳米级细粉即定标准的不良粉末重新送回超微机中再进行粉碎，然后将加工后的微细粉（aCGJ）用超微包装机包装，作为活性部位用于所有后续实验。其后发现用二氧化碳超临界萃取的方法也可以显著去除脂溶性叶绿素和肝毒性化合物。
该活性aCGJ可以接受进一步色谱纯化过程，制备出总多酚，类黄酮或者总三萜，使活性部位的主要成分的含量大于总成分的50％或以上,具体的制备流程图如图1所示。本发明去除肝毒性部位的活性部位是从80%蓝布正和20%委陵菜提取和分离的。本发明用生物活性和肝毒性追踪的方法来分离活性部位。
实施例2:促进血管内皮细胞在3D细胞培养中血管样管腔的形成
Ham's F-12三维血管内皮细胞培养基制作简要如下：用α-凝血酶(2.5单位/毫升)，和纤维蛋白原溶液(5毫克纤维蛋白原/毫升无血清培养基)的聚合来制备纤维蛋白基质。聚合后，将凝胶浸在含有10%小牛血清的Ham's F-12培养基中在37ºC 水浴下培育3小时，使α-凝血酶失活。在三维血管内皮细胞培养基中测定该活性部位组合物促进人冠状动脉内皮细胞（HCAEC)在培养基中血管样管腔结构的形成。将 HCAEC 接种在96孔培养皿中的三维培养基质表面，分别加入不同浓度（5-30µg／ml）的活性部位组合物处理目的培养细胞，未加药物的对照组则添加了等量的培养基。然后将培养皿放入 37ºC、5%CO2平衡的培养箱中培养24小时后，将培养的细胞在倒置显微镜下显微照像，并计算形成的管腔的总数来定量分析活性部位组合物促血管样管腔生成的效果。结果表明，用aCGJ处理的细胞形成的毛细血管样管腔网络显著多于介质处理的细胞。在低浓度范围时(5-30μg/ml)，随着加入的aCGJ浓度的逐渐增加，形成的毛细血管样管腔的总长度也呈依赖性显著增加。在所有测试浓度中，在aCGJ浓度为30μg/ml时，达到最大的管腔长度 (p<0.05) ，如表1所示，高于30μg/ml的aCGJ（30-50μg/ml）并不能相应增加形成的毛细血管样管腔的总长度。
表1
实施例3：心肌梗塞动物模型评价活性部位组合物即药物组合物
的治疗效果
用大鼠通过完全结扎心脏冠状动脉前降支的方法制作心肌梗塞动物模型。雄性300-350克体重Sprague-Dawley大鼠30只，室温下腹膜内注射戊巴比妥(50毫克/公斤体重)来麻醉实验动物，进行气管插管并用小动物呼吸机进行人工呼吸条件下，手术开胸、永久性完全结扎实验动物心脏的左前降支(LAD)动脉，关胸，放置动物于温暖的区域苏醒复苏，产生左心室前壁心肌梗塞动物模型。LAD结扎后３天，将溶解于１.0毫升水中的aCGJ (250毫克/公斤体重)灌胃给予心肌梗死（MI）实验大鼠 (n=15)，每天给药持续３周，将等量的水给予对照介质处理的MI大鼠 (n=10)，持续３周。对于假手术的大鼠 (n=5)，进行开胸术而不进行LAD结扎，灌胃给予等量的水，持续３周。以上分别处理三周后，在做最后一次超声
心动图测量后，处死动物。
超声心动图测定心脏功能来评价aCGJ的治疗效果
在任何实验操作之前，所有实验SD大鼠都接受了基线超声心动图。利用配备了PLT-1202S线性阵列换能器S10-MHz相阵换能器的东芝Aplio XG超声心动仪，在受控的麻醉下记录实验动物的超声心动图。从胸骨旁心脏长轴和短轴分别记录M模式轨迹和二维(2D)超声心动图图像。短轴视图位于心脏乳头肌水平。通过使用美国超声心动描记术学会的规定惯例，从M模式轨迹测量左心室收缩末期和舒张末期容积以及收缩末期和舒张末期心室壁的厚度。对于每个M模式测量，采集至少3个连续心动周期。在结扎后第2天、第7天和第14天，两个组的所有大鼠都接受超声心动图测量。如图7所示，A：显示了aCGJ治疗开始前的梗塞心脏的收缩和舒张末期的代表性图像。从M型超声可见心梗后左心室的前壁失去了随心动周期的收缩能力（0），左心室收缩和舒张末期的容量变大，而aCGJ治疗2周后，可见左心室的前壁一定程度地恢复了随心动周期收缩的能力（2），而治疗4周后，左心室的前壁更好地恢复了随心动周期收缩的能力（4），左心室收缩和舒张末期的容量也随之恢复变为正常大小。B：显示了代表性对照组动物介质处理前的心脏超声心动图图像。从M型超声可见心梗手术后左心室的前壁失去了随心动周期收缩能力（0），左心室收缩和舒张末期的容量变大，而介质对照处理2周后，可见左心室的前壁完全没有恢复随心动周期收缩的能力（2），左心室容积进一步变大。而介质对照处理4周后，左心室的前壁不但没有恢复任何随心动周期收缩的能力，还出现了反向搏动（4），左心室收缩和舒张末期的容量进一步变大。C：提示了aCGJ治疗的和介质对照处理的心脏左室射血分数（LVEF）水平(p<0.001)。aCGJ治疗可以显著改善由于心肌梗塞引起的心功能不全。
为了证明应用aCGJ治疗缺血心脏，诱导心脏中的缺血区域新生冠状侧枝循环的建立，并伴随着逐渐改善的心脏功能表现，在治疗的不同期间使用超声心动图来测定实验大鼠的心脏功能表现。我们发现，治疗组和对照组的实验动物，由于心脏LAD的结扎造成的灌注区域的心肌血液供应的中断，进而相应区域的心肌梗死，从而导致左心室射血分数(LVEF) 和左心室短轴缩短率 (LVFS)显著降低，然而，随aCGJ治疗，治疗组实验动物的LVEF和LVFS逐渐恢复，相比之下，对照组介质处理的大鼠中的LVEF和LVFS却逐渐更加降低，而假手术组的实验动物，虽然在开胸手术后经历了短暂的LVEF和LVFS降低，手术后5天左右LVEF和LVFS恢复正常，如图7所示。
从图5可知：aCGJ治疗(150mg/kg/天)大鼠急性心肌梗塞模型三周，可诱导心肌缺血区的冠状动脉侧枝血管生成和在心肌梗塞区促进心肌再生。T1 20 X：LAD结扎后，口服aCGJ治疗三周的心脏梗塞区。发现很多新再生的并且管腔内充满了红细胞的有功能的冠状动脉，并发现有许多新再生的心肌细胞样细胞取代了梗死的心肌，从而使梗塞面积显著减小。T1-2 20 X：同一组织切片在紫外光显微镜观察，发现梗塞区的纤维瘢痕（在紫外光观察下呈现高光部分）较少，许多新生的，体积尚比较小的心肌细胞样细胞取代了梗死的心肌。T1-3 20 X：为了证实这些在心肌梗塞区新生的心肌细胞样细胞是否是心肌细胞，用心肌细胞特异性肌球蛋白重链抗体对同一切片上的这些心肌细胞样细胞进行免疫组化染色，发现这些体积较小的心肌细胞样细胞被阳性染色（棕色），证明这些在心肌梗塞中心区新生的心肌细胞样细胞是新再生的心肌细胞。C1 20 X：对比之下，对照组心肌的梗塞区基本是不规则结构的纤维瘢痕组织修复梗死区，几乎见不到新生的心肌细胞样细胞。C1-2 20 X：同一组织切片在紫外光显微镜观察，发现纤维瘢痕中的胶原纤维（在紫外光观察下呈现高光部分）充斥整个梗塞区。C1-3 20 X：用纤维瘢痕特异性Masson 三色染色同一切片结果显示，对照组的心肌梗塞区主要是纤维瘢痕修复，基本很少发现新生的心肌细胞样细胞。
aCGJ促进缺血心肌区冠状血管再生侧枝循环重建的评价
分别在实验动物灌胃给药后1周、2周、和3周记录超声心动图。实验动物处死后开胸，将大鼠心脏取出，用PBS冲洗干净。用刀片切除其它部分留取左心室，并从心尖至心底方向横切成3个组织块，包埋在石蜡中。然后修整腊块进行切片，H&E染色。选适当的完整切片在显微镜高倍视野下(HPF，40倍)观察，在左心室包含梗死区在内的区域内随机选择５个不同的高倍镜视野，进行血管计数。由两名研究人员以双盲法的方式对每组间隔30微米的５个切片进行血管计数。结果表示为平均值±标准差血管数/HPF。结果表明：在梗塞治疗后3周的对照组介质处理的心脏中，结扎点远端区域 (直径～３mm) 心室壁变薄变灰。对比之下aCGJ治疗的心脏的对应区域表现为灰红色，室壁的厚度也大于介质处理的室壁厚度。组织学血管计数检查表明：aCGJ治疗组的血管密度平均为14.8 ± 7.6/HPF，而介质处理的对照组相应区域的血管密度为8.2 ± 6.4/HPF。而假手术组的心脏未发现梗塞区，血管密度平均为16.1 ± 5.1/HPF。
心肌梗塞大鼠口服aCGJ（150/mg/kg/天）三周，可诱导有完整超微结构的有功能的心肌再生，治疗效果见图6所示，Treated：LAD结扎后，口服aCGJ治疗三周的心脏的梗塞区。发现有许多新生的、心肌细胞特异性肌球蛋白重链抗体免疫组化染色阳性的心肌细胞取代了梗死的心肌，并桥接梗塞中心区新生的心肌细胞和两侧的未被累及的正常心肌细胞。a:将Treated切片中的a标记区域（正常未累及心肌和梗塞区边界新再生的心肌区域）放大，并用Desmin抗体免疫染色，发现该区域的心肌细胞之间都具有正常心肌细胞间的闰盘链接，这就保证了心肌细胞间的化学信息交换，和传递电冲动，由此保证心肌细胞的同步收缩和心脏功能，也就避免了致命性的心率失常。b: 将Treated切片中的b标记心肌梗死中心区放大，经Desmin染色后发现该区域也有新再生的心肌细胞特征性横纹结构，提示在梗死的中心区也有心肌细胞再生。b-M:将b图中蓝色框中区域放大，可以清晰地观察到具有心肌细胞特征性横纹结构的心肌。c:将Treated切片中的c标记心肌梗死中心边缘区放大，经Desmin染色后发现该区域有新再生的，并具有完整超微结构，完美闰盘连接的心肌细胞，和特征性横纹结构，提示在该区域有完整的心肌细胞再生。 d: 更重要的是，将Treated切片中的d标记的跨越梗死中心区和梗死区两侧的未累及正常心肌区域放大，经Desmin染色后发现该区域的新生的心肌细胞和两侧的未累及的正常心肌细胞，通过闰盘连接为有功能的整体，这样就保证了原有心肌组织和新再生的心肌细胞超微结构的完整性，从而保证了心肌收缩作为功能整体的完整性。从而避免了由于再生没有超微结构连接的心肌细胞导致的致命性心律失常。Control: LAD结扎后，介质（对照）治疗三周的心脏的梗塞区，主要特征为纤维瘢痕修复梗死区。Normal: 是未被累及的正常心肌细胞，可见正常的心肌细胞的横纹和闰盘结构。但是与新再生的心肌细胞相比较，其体积大约是新再生的心肌细胞的3倍左右。
实施例4：潜在肝肾毒性的测定
应用四氯化碳 (用植物油溶解四氯化碳成50%浓度, 3毫升/公斤体重/次) 腹腔注射Wistar鼠 (150-200g) 诱导肝纤维化和肝硬化动物模型。四氯化碳腹腔注射频度为每周两次，共注射15周。为了辅助肝硬化的发病进程, 在不注射四氯化碳的天里，每周5次静脉给予每只实验动物1毫升30%的乙醇，共给4周。注射四氯化碳9周后，实验动物被随机分为80%乙醇提取物（EGJ） (n = 15) 治疗, aCGJ治疗组 (n = 15), 石油醚提取组分（PEXP）处理组 (n = 15), 和介质处理的对照组 (n = 15)。从第10周的开始, EGJ(450毫克/公斤/天)、aCGJ (200毫克/公斤/天), PEXP (即石油醚和乙酸乙酯萃取部分的合，70毫克/公斤/天), 分别给相应的各组实验动物灌胃给药，共给药12周。相同体积的水灌胃给介质处理的对照组实验动物，同样给12周。
实验过程中,尤其是到实验最后四周，PEXP和介质处理的对照组实验动物经历了渐进性和进行性脱毛，对比之下,aCGJ治疗动物组的毛发则表现接近正常,几乎没有观察到脱毛。而EGJ治疗组动物显示有轻中等程度的脱毛。具体如图3所示，腹腔注射四氯化碳15周，诱导肝损伤和门脉高压。aCGJ处理、介质处理对照组，从四氯化碳诱导肝损伤第10周开始，分别给予aCGJ处理、介质处理两组实验动物12周后，发现介质处理的对照组的实验动物出现严重脱毛和毛外观干枯无光泽（V1和V2)。对比之下,aCGJ治疗动物组实验动物的毛发(T1和T2) 几乎是正常的, 很少有脱毛现象，并且毛的外观健康和有光泽(图3）。除此以外，介质处理对照组动物的死亡率是26.7%，远远高于aCGJ治疗组动物的6.7%。而介质处理对照组由于肝硬化和门脉高压导致的腹水比率为82%(Ascites),对比之下，aCGJ治疗组的腹水率只有7.1%。以上结果提示蓝布正的脂溶性成分中含有肝毒性物质，其可以用石油醚和乙酸乙酯去除。
使用二氧化碳吸入致死法将各组的所有实验动物在相应的方法治疗4周后处死，将动物置于封闭室内，慢慢从压缩二氧化碳汽缸放入70%的CO2。气体流量保持至少1.5分钟后出现明显临床死亡症状。该方法符合AVMA协会小组执行的安乐死原则。
打开处死后实验动物的腹部时, 发现安慰剂治疗组有82%的动物出现中度到重度腹水，脾脏的大小显著增大。肝脏的体积明显缩小，肝表面呈现粗颗粒状。相比之下, aCGJ治疗组大鼠中仅观察到有7.1% 轻到中度的腹水。肝脏的大小和外观几乎和正常的一样。aCGJ治疗组大鼠很少观察到脾肿大。
PEXP治疗组动物的腹水、脾大和肝硬化的发生率比安慰剂治疗组似乎更严重。同样该俩组动物的脱毛程度也与腹水、脾大、肝硬化的程度相呼应。
而乙醇提取物治疗组动物的腹水、脾大和肝硬化的发生率虽然与aCGJ治疗组相比较略差，但是明显好于PEXP和介质处理的对照组。从肉眼观察到的指标（大鼠的状态、脱毛、腹水、脾大、肝缩小变硬）来看，治疗的效果依次为： aCGJ，乙醇提取物，安慰剂，和PEXP部分。这个结果提示，aCGJ含有治疗肝纤维化，肝硬化的活性成分。由于PEXP部分的效果比对照组还显著差，这就提示该部分不但不含有有效的活性成分，还含有对肝脏有害的成分。由于提取工艺决定，乙醇提取物不仅含有aCGJ, 也含有PEXP部分，也就是即含有对肝脏有治疗活性的成分，也含有对肝脏有害的成分。aCGJ是去除了肝毒性成分，主要含有多酚、多糖，类黄酮和五环三萜。
摘取肝脏和肾脏,用PBS冲洗。这些标本切片用于组织学和免疫组织化学分析或用于DNA微阵列研究。切成合适的大小并用石蜡包埋。切片厚度为 (5µm)。根据Masson’s试剂盒说明书染色,纤维胶原蓝染和肝细胞红染。蓝染色区域用数字化定量化分析。
为了减少形态学分析的偏见,我们给出肝脏的整体图像,这是集成来自30多个10倍视野的照片合成的，所以整个肝脏图像可以被显示，并且有较高的解像度。显微镜观察发现，对照组动物的整个肝脏遍布蓝染的纤维索条，这些纤维索条在汇管区之间 (p p)，或汇管区和中央静脉之间 (p-c) 形成明显的桥接的网状间隔 (图2)。此外，在整个肝脏区域遍布被蓝染的胶原纤维缠绕的肝细胞结节（肝硬化）(图2)。相比之下,aCGJ治疗组实验动物肝脏的胶原纤维沉积的量显著少，形成的索条也细得多, 在汇管区之间 (p p)，或汇管区和中央静脉之间 (p-c) 形成的桥接也显著少，蓝染的纤维网状间隔也不完整 (图2)。没有观察到明显的肝细胞结节形成，虽然偶尔看到少量的肝细胞结节。更显著的是aCGJ治疗组大鼠肝脏的大小大约是正常的，与显著缩小的、硬化的，遍布肝细胞结节的对照组的肝脏形成鲜明对比。更重要的是,aCGJ治疗组动物肝脏多数的汇管区、中央静脉和肝小叶被完整保留，而这些微细结构在对照组的动物肝脏中大多都被破坏，被纤维组织取代 (图2)。PEXP治疗的肝脏显示了严重的肝脏毒性反应，许多肝细胞死亡，肝脏的微结构消失，混乱，几乎所有的肝细胞均严重空泡化，细胞界限消失，提示该组分不但没有治疗作用，还有肝毒性。
70%乙醇水的蓝布正提取物（EGJ）的化合物成分既包含了aCGJ，也包含了乙酸乙酯/石油醚萃取的较脂溶性化合物。实验证明aCGJ是保护肝细胞，帮助重建肝脏微结构，抑制肝纤维化等的有效成分，而乙酸乙酯/石油醚部分是对肝脏非但没有保护作用，并且对肝细胞还相对有毒。因此EGJ虽然对治疗肝纤维化、肝硬化、脂肪肝和门脉高压有效，但是去除较脂溶性的肝毒性化合物的aCGJ的疗效比EGJ更好。EGJ治疗的动物的肝脏的大部分肝细胞结构和边界完整清晰，可见较多的中央静脉和结构完整的肝小叶，并且与对照组的肝脏相比，纤维组织沉积也显著较少，较少见形成的假小叶，如图2所示。
PEXP部分含有EGJ中较脂溶性的成分，实验结果证明PEXP对肝脏非但没有保护作用，并且对肝细胞还有损害作用。该组动物除了有较高的致死率以外，存活的动物大多数都表现为毛发干枯，显著脱毛，有中到大量腹水。显微镜下肝脏的整个视野中的大部分肝细胞都遭到重度破坏，肝细胞结构消失，细胞形态和界限消失。绝大多数肝细胞严重空泡化，中重度肝脂肪样变性（图2）。大鼠心肌梗塞模型（完全结扎大鼠冠状动脉的前降支）一周。石油醚提取部分灌胃给与(150 mg/kg/天)大鼠。灌胃处理2周后处死实验动物，取心脏，并做石蜡包埋和经过梗塞区组织学切片，显微镜检查。发现：对照 20 X：LAD结扎后，介质（对照）治疗二周的心脏的梗塞区，主要特征为纤维瘢痕修复梗死区。石油醚 20 X：LAD结扎后，口服石油醚提取部分二周的心脏的梗塞区，观察到心脏的梗死区主要是纤维瘢痕修复，梗塞区及梗塞区周围的细胞变得肿胀、形状扭曲、细胞完整性较差（图4）。而介质处理的对照组大鼠心脏相应的区域的细胞空泡化显著轻，并且空泡化和细胞完整性差涉及的面积显著较小。EGJ 20 X：EGJ处理的实验动物的心肌梗塞区发现纤维化程度较轻，可发现有心肌细胞再生，梗塞区周围的细胞可见细胞肿胀和轻度空泡化（图4）。aCGJ 20 X：aCGJ处理的实验动物的心肌梗塞区发现纤维化程度较轻，可发现有心肌细胞再生, 与EGJ处理的实验动物的心肌相应区域相比，纤维化的程度更小，再生的心肌细胞量更多，排列更完整，纤维化的面积更小，如图4所示。
比较之下，雌性大鼠（图2）的肝细胞脂肪样变性，空泡化非常严重，肝细胞结构和细胞界限完全消失。肝小叶、汇管区、中央静脉等微结构严重破坏，但是纤维化程度较雄性的轻。而雄性大鼠（图2）的肝纤维化较重，胶原纤维呈索状密集分布于小叶间，并切割肝小叶形成假小叶，而肝细胞脂肪样变性相对比雌性的轻。
实验证明aCGJ是保护肝细胞，帮助重建肝脏微结构，抑制肝纤维化和肝硬化等的有效成分。并且不含有对肝脏有害的成分（PEXP），因此aCGJ组动物模型的治疗效果最为显著。该组动物除了有最低的死亡率以外，存活的动物的毛发基本正常，未见或罕见脱毛，仅有少量动物有小量腹水。大多数肝脏的外观基本正常，显微镜下可见显著少的、和纤细的纤维组织穿插于小叶间，绝大度数的肝细胞结构清晰，排列整齐，大部分肝小叶结构基本清晰（图2）。仅有小部分肝细胞有着色变浅，并有轻度空泡化倾向，大部分肝细胞结构和边界完整清晰。可见较多的中央静脉和结构完整的肝小叶，并且与所有其他组的肝脏相比，纤维组织沉积也显著较少，较少见形成的假小叶（图2）。
Claims (13)
1.预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于该药物为蓝布正活性成分和委陵菜活性成分组合而成药物组合物，该药物组合物是从蓝布正和委陵菜中萃取分离得到的多酚类、类黄酮和/或五环三萜类。
2.如权利要求1所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于所述药物组合物为去除了潜在肝毒性化合物的成分。
3.如权利要求1所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于所述蓝布正活性成分是从蓝布正全草中萃取分离得到，所述委陵菜活性成分是从委陵菜全草中萃取分离得到，其中蓝布正全草与委陵菜全草的重量比为4:1。
4.如权利要求1所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于所述多酚类化合物包括Gemin A、没食子酸、鞣花酸中的一种或多种；类黄酮为槲皮素；五环三萜类化合物包括苦莓苷F1、苦莓苷F1甙元、熊果酸、翻白叶苷A、委陵菜酸中的一种或多种。
5.如权利要求1-4任一所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于该缺血性心脏病包括慢性冠心病、急性心肌梗塞以及由心肌梗塞导致的心力衰竭。
6.如权利要求1-4任一所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于该药物还包括药学上可接受的载体，药物组合物与药学上可接受的载体制成口服制剂、舌下含服或注射制剂。
7.如权利要求6所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于所述注射制剂为皮下注射、肌肉注射或静脉注射。
8.如权利要求1-4任一所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物，其特征在于该药物组合物的施用量为0.002-5g/千克体重/天。
9.预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）分别采集新鲜蓝布正和委陵菜全草、洗净、分为两部分，一部分阴干、切成碎片；另一部分新鲜状态下，洗净，切成碎片，冷冻干燥；
2）分别将两部分蓝布正全草碎片和两部分委陵菜全草碎片混合，在真空状态下用5倍的石油醚或三氯甲烷中回流提取6小时，或者用二氧化碳超临界萃取方法，去除脂溶性的叶绿素和肝毒性成分；
3）将步骤2）提取过的植物原料在真空条件下用6倍浓度为55%的乙醇回流提取，将乙醇的提取液浓缩并喷雾干燥成固体粉末，得到乙醇提取物；
4）将乙醇提取物粉末溶混悬于水中，用乙酸乙酯进行萃取；
5）将用乙酸乙酯提取过的，去除肝毒性化合物的乙醇萃取液
浓缩、4℃温度条件下放置24小时、过滤、浓缩、减压干燥得到药物组合物。
10.如权利要求9所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物的制备方法，其特征在于该方法还包括将步骤5）得到得药物组合物粉末溶于纯水中，用C1-C4的正丁醇进一步提取，正丁醇提取物在4℃下静置24小时，将不溶性沉淀物过滤去除后，于59℃下减压干燥，得到药物组合物干粉。
11.如权利要求9所述的预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物的制备方法，其特征在于该方法还包括后续通过反向柱层析的方法分离出的单体多酚类化合物、类黄酮和五环三萜类化合物的步骤。
12.蓝布正活性成分和委陵菜活性成分组合而成药物组合物在制备预防和治疗缺血性心脏病药物中的应用。
13.如权利要求11所述的应用，其特征在于该药物组合物在心脏缺血区促进侧枝循环建立和再生新的冠状血管，诱导有正确超微结构及有功能的心肌细胞再生上的应用。
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