JP2000191539A - ジンセノサイドＲｂ１からなる脳細胞又は神経細胞保護剤 - Google Patents

ジンセノサイドＲｂ１からなる脳細胞又は神経細胞保護剤

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雅広 阪中
Junya Tanaka
潤也 田中
Koji Sato
康二 佐藤
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、細胞保護剤として有用なジンセノ
サイドＲｂ１又はその塩の有効な投与用製剤を提供す
る。より詳細には、ジンセノサイドＲｂ１若しくはその
塩を含有してなるアポトーシス又はアポトーシス様細胞
死抑止用医薬組成物、又は、細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃ
ｌ−ｘＬの発現を促進させるための医薬組成物を提供す
るものである。また、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１
又はその塩を含有してなる静脈内投与用製剤を提供する
ものである。 【解決手段】 本発明は、低濃度、好ましくは１ｎｇ／
ｍｌ以下、より好ましくは１〜１００ｆｇ／ｍｌのジン
セノサイドＲｂ１又はその塩を含有してなる医薬組成物
に関し、本発明の医薬組成物は細胞死抑制遺伝子産物Ｂ
ｃｌ−ｘＬの発現を促進させ、また、アポトーシス又は
アポトーシス様細胞死を抑止する作用を有する。さら
に、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を含有
してなる静脈内投与用製剤に関し、特に脳・神経疾患の
治療、予防又は処置のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞保護剤として
有用なジンセノサイドＲｂ１又はその塩に関する。より
詳細には、ジンセノサイドＲｂ１若しくはその塩を含有
してなるアポトーシス又はアポトーシス様細胞死抑止用
医薬組成物、又は、ジンセノサイドＲｂ１若しくはその
塩を含有してなる細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの
発現を促進させるための医薬組成物に関し、さらに詳細
には、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を含有してなる
静脈内投与用製剤である医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】元来脳卒中（脳血管障害）の治療法は、
脳梗塞・脳塞栓・脳出血・一過性脳虚血発作・クモ膜下
出血で異なっており、厳密には脳のＣＴ検査を実施しな
ければ有効な対策が立てられないのが現状である。たと
えば血栓溶解剤などは脳梗塞・脳塞栓にのみ使用され、
脳出血には禁忌とされている。しかし、脳卒中は可及的
すみやかに病巣部位の神経細胞を保護する処置がとられ
なければ、以後永久に高次機能障害をもたらすかあるい
は生命予後に影響を与える重篤な疾患であるので、一刻
も早く治療を開始すべき疾患である。極論を言えば、脳
のＣＴ検査を実施している時間すら、脳卒中患者にとっ
て回復する可能性を少なくする要因になるのである。ま
さに急性期脳卒中の治療は、脳卒中病変のみならず発症
後の時間との戦いと言っても過言ではない。ただ残念な
がら、目下の所、脳卒中の病型（脳梗塞・脳出血・脳塞
栓・クモ膜下出血・一過性脳虚血発作）のいかんを問わ
ず、脳卒中を発症したと思われる患者に速やかに投与
し、著効を示す薬物がほとんど存在しないのが実情であ
る。
【０００３】一方、ジンセノサイドＲｂ１は、下記構造
式
【０００４】
【化１】
【０００５】で示される化合物であり、ジンセノサイド
Ｒｂ１は柴田ら（Shibata S.,et al.,Economic and med
icinal plant research, World Scientific,Philadelph
ia,pp217-284,1985）などにより公知の物質である。ジ
ンセノサイドＲｂ１は、向神経作用としてその腹腔内投
与によりこれまで静穏作用のみが報告されてきたが（Yo
shimura H.et al.,Eur.J.Pharmacol.,146,291-297,198
8）、その作用機序についてはまったく解明されていな
い。また、中枢神経系においては、ジンセノサイドＲｂ
１とジンセノサイドＲｇ１の混合物がアセチルコリン含
有神経細胞を活性化し、アルツハイマー病に効能を示す
可能性があることが報告されているが（米国特許：US,
A,5,137,878: Composition and method for treatment
of senile dementia）、アセチルコリン細胞の機能障害
がアルツハイマー病の主要所見であるとは言い難いの
で、この仮説には解決すべき問題が山積みしている。
【０００６】しかも、ジンセノサイドＲｂ１単独の神経
細胞保護作用については、本発明者らがジンセノサイド
Ｒｂ１の研究を手掛けるまではほとんど解明されていな
かった。本発明者らはこれまでジンセノサイドＲｂ１が
アセチルコリン含有神経細胞以外にも保護効果を発揮す
るかどうかを、スナネズミの一過性前脳虚血モデルを用
いてしらべてきた。この脳虚血モデル動物では、脳温を
３７℃に維持した状態で３分間から５分間、総頸動脈血
流を遮断すると、血流遮断時間に応じて虚血後一週間以
内に海馬ＣＡ１錐体神経細胞（アセチルコリン非含有）
が変性脱落し（これを遅発性神経細胞死という）、同動
物の学習行動機能も低下することが証明されている（We
n T.-C.et al., Acta Neuropathol.,91,15-22,1996）。
すなわち、スナネズミの一過性前脳虚血モデルはヒトの
一過性脳虚血発作の病態を反映すると言える。
【０００７】本発明者らは、スナネズミの腹腔内にあら
かじめジンセノサイドＲｂ１（１０ｍｇ／ｋｇまたは２
０ｍｇ／ｋｇ）を１日単回１週間注入しておくと、５分
間の総頸動脈血流遮断による遅発性神経細胞死と学習行
動障害が有意に軽減されることを証明した（Wen T.-C.e
t al., Acta Neuropathol.,91,15-22,1996）。しかしな
がら、５分間あるいは３分間の総額動脈血流遮断直後
に、ジンセノサイドＲｂ １を腹腔内に注入しても効果は
みられなかった（Wen T.-C.et al., Acta Neuropatho
l.,91,15-22,1996；Lim J.-H.et al.,Neurosci.Res.,2
8,191-200,1997）、従って、この時点で末梢（腹腔内）
投与されたジンセノサイドＲｂ１の脳内移行率および移
行速度は非常に低いことが予想されたため、ジンセノサ
イドＲｂ１は海馬ＣＡ１錐体神経細胞の保護という観点
からは、臨床応用の可能性は皆無と考えられた。
【０００８】前記のような末梢（腹腔内）投与に代え
て、ジンセノサイドＲｂ１を３分間あるいは３．５分間
の総頸動脈血流遮断の直後に、直接脳室内に持続注入す
ると遅発性神経細胞死と学習行動障害が抑止されること
が報告されている（Lim J.-H.et al.,Neurosci.Res.,2
8,191-200,1997）。さらに、脳卒中易発症高血圧自然発
症（ＳＨ−ＳＰ）ラットの中大脳動脈皮質枝（ＭＣＡ）
永久閉塞モデル（脳梗塞ラット）においても、ジンセノ
サイドＲｂ１をＭＣＡ永久閉塞直後より脳室内へ持続注
入すると、大脳皮質梗塞巣が有意に縮小し、同動物の場
所学習障害も軽減されることが判明した（Zhang B.et a
l.,J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1998）。
【０００９】しかしながら、他のべプチド性成長因子と
同様に（Sakanaka M.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
95,4635-4640,1998; Wen T.-C.et al.,J.Exp.Med.,188,
635-649, 1998）、たとえジンセノサイドＲｂ１が脳室
内直接投与で効果を示しても投与経路の問題からやはり
ヒトの一過性脳虚血発作や脳梗塞症例にジンセノサイド
Ｒｂ１を応用することは不可能と考えられた。
【００１０】また、ジンセノサイドＲｂ１の末梢（腹腔
内）投与による神経細胞保護作用のメカニズムについ
て、本発明者らはこれまでに低濃度（１〜１００ｆｇ／
ｍｌ）の同薬物をあらかじめ培養液に混入しておくと、
ヒドロキシルラジカル誘発剤（硫酸第一鉄）による神経
細胞の壊死（ネクローシス）が軽減されることを報告し
ている（Lim J.-H.et al.,Neurosci.Res.,28,191-200,1
997;Zhang B.,et al.,J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-
9,1998）。本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ １がヒド
ロキシルラジカルを消去することにより、細胞膜の過酸
化脂質を減少せしめ、培養神経細胞を保護するものと推
測してきたが、これまでにこの仮説を証明した報告はみ
られない。
【００１１】また、高濃度（０．１１〜１１μｇ／ｍ
ｌ）のジンセノサイドＲｂ１が、グルタミン酸の神経毒
性を軽減して神経細胞死を予防すること（Kim Y.-C.,et
al.,J. Neurosci.Res.,53,426-432,1998）、あるいは
５００μＭ（５５０μｇ／ｍｌ）という高濃度のジンセ
ノサイドＲｂ１がアポトーシス様神経細胞死を予防する
可能性があること（田中知明ら，The Ginseng Review,2
4,61-65,1998）が培養実験で報告されているが、高濃度
のジンセノサイドＲｂ１は本発明者らの培養実験によれ
ばかえって神経毒性を示すことが判明している（Lim J.
-H.,et al.,Neurosci.Res.,28,191-200,1997;Zhang B.,
et al., J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1998）。
【００１２】しかも、このように高濃度のジンセノサイ
ドＲｂ１を生体内の細胞外液で再現することは極めて困
難であるのみならず、コスト面や副作用出現の可能性を
考えても大量のジンセノサイドＲｂ１を生体に投与する
ことは不可能である。実際、これまでの本発明者らの実
験結果からも、高用量のジンセノサイドＲｂ１は生体に
とって必ずしも好ましい効果・効能をもたらさないこと
が判明している（Zhang B., et al., J. Stroke Cerebr
ovasc.Dis.,7,1-9, 1998）。すなわち、ジンセノサイド
Ｒｂ１による神経細胞保護作用のメカニズムはいまだ充
分に解明されていないというのが現状である。もし、ジ
ンセノサイドＲｂ１の作用機構解明がなされれば、同薬
物の新たな効能・利用可能性が発掘されることが期待さ
れる。また、ジンセノサイドＲｂ１が生体でアポトーシ
ス様細胞死を実際に抑止するかどうかも明らかにされて
いない。
【００１３】本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１が１
ｆｇ／ｍｌから１００ｆｇ／ｍｌという世界に類をみな
い低濃度域で、細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの発
現増加を促すことによりアポトーシス様神経細胞死を抑
止することを見出した。すなわち、本発明でジンセノサ
イドＲｂ１は世界で唯一の非べプチド性のＢｃｌ−ｘ Ｌ
発現増加剤であることが見出された。また、１００ｆｇ
／ｍｌの濃度ではわずかにジンセノサイドＲｂ１の過酸
化脂質生成抑制効果はみられたが、それよりも低い濃度
域ではそのような効果はみられなかった。従って、ジン
セノサイドＲｂ １の作用機構に関する従来の仮説は妥当
でないことが判明した。さらに、生体内においても、ジ
ンセノサイドＲｂ１がアポトーシス様神経細胞死を抑止
することを見出し本発明を完成した。我々はジンセノサ
イドＲｂ１が静脈内投与により、これまでまったく予想
すらされなかった優れた脳梗塞抑止作用ならびに場所学
習障害改善作用を示す、ことを見出し本発明を完成し
た。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は静脈内
投与により優れた脳梗塞治療効果ならびに脳血管性痴呆
抑止作用を示し、かつ細胞死抑制遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬの
発現を促すことにより細胞を保護する薬物を提供するこ
とである。また、本発明は、細胞保護剤として有用なジ
ンセノサイドＲｂ１又はその塩の有効な投与用製剤を提
供する。より詳細には、ジンセノサイドＲｂ１若しくは
その塩を含有してなるアポトーシス又はアポトーシス様
細胞死抑止用医薬組成物、又は、ジンセノサイドＲｂ１
若しくはその塩を含有してなる細胞死抑制遺伝子産物Ｂ
ｃｌ−ｘＬの発現を促進させるための医薬組成物を提供
するものである。また、本発明は、ジンセノサイドＲｂ
１又はその塩を含有してなる脳・神経疾患の治療、予防
又は処置などのために有用な静脈内投与用製剤を提供す
るものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、低濃度のジン
セノサイドＲｂ１又はその塩を含有してなるアポトーシ
ス又はアポトーシス様細胞死抑止用医薬組成物に関す
る。また、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩
を含有してなる細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの発
現を促進させるための医薬組成物に関する。これらの本
発明の医薬組成物は、静脈内投与用製剤が好ましい。さ
らに、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を、
好ましくは低濃度で含有してなる脳・神経疾患の治療、
予防又は処置などのための静脈内投与用製剤に関する。
また、本発明は、前記の静脈内投与用製剤からなる脳・
神経疾患の治療、予防若しくは処置剤、又は、脳細胞若
しくは神経細胞保護剤に関する。
【００１６】本発明のジンセノサイドＲｂ１は、前記し
た構造式で示されるものであり、ジンセノサイドＲｂ１
は、例えば、柴田らの方法（Shibata S.et al Economic
andmedicinal plant research, World Scientific,Phi
ladelphia,pp 217-284,1985）の方法に準じて分離・精
製することができる。このような方法により精製された
ものは、その純度が９８％以上であることが、薄層クロ
マトグラフィーならびに核磁気共鳴スペクトルにより確
認されている（Kawashima Y.and Samukawa K., J.Med.P
harmacol.Soc.Wakan-Yaku,3,235-236,1986）。
【００１７】本発明のジンセノサイドＲｂ１は、遊離の
もを使用することもできるが、それを適当な塩として使
用することもできる。また、それらの水和物のような溶
媒和物として使用することもできる。本発明で使用され
るジンセノサイドＲｂ１の濃度は、低濃度が好ましく、
より具体的には、細胞外液濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下、好
ましくは１ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｆｇ
／ｍｌ以下となる濃度である。本発明のジンセノサイド
Ｒｂ１を、静脈内投与用製剤として使用する場合にも、
患者の患部における細胞外液濃度が前記の濃度になるよ
うに製剤を調製することが好ましい。本発明の医薬組成
物や製剤は、患部の細胞外液濃度が１〜１００ｆｇ／ｍ
ｌ程度の濃度であっても充分な効果が得られる。低濃度
でのジンセノサイドＲｂ１の使用が好ましい点が本発明
の特徴のひとつである。
【００１８】本発明の別の特徴は、ジンセノサイドＲｂ
１を静脈内投与用製剤として使用する点である。驚くべ
きことに、静脈内投与されたジンセノサイドＲｂ１は、
従来の末梢（腹腔内）投与によるものとは異なり、脳・
神経系に速やかに伝達されることを見出したことであ
る。本発明の静脈内投与用製剤は、血管内、好ましくは
静脈に直接投与できるものであればよく、単回静脈内注
入用製剤であっても、静脈内持続投与用製剤であっても
よい。また、点滴用組成物などの静脈投与製剤に添加し
て使用できる剤型であってもよい。
【００１９】本発明のジンセノサイドＲｂ１は、静脈内
投与で脳梗塞巣を非投与群の１／４程度にまで縮小さ
せ、しかも細胞死抑制因子Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強という
ユニークな作用機序を有し、脳の神経細胞を保護するも
のであり、急性期・慢性期の脳梗塞のみならず脳出血・
クモ膜下出血・脳塞栓の急性期や慢性期あるいは一過性
脳虚血発作に対しても、神経保護薬として利用すること
ができる。すなわち、本発明のジンセノサイドＲｂ１は
脳卒中が疑われる患者に対して救急車の中でも点滴静注
が可能な薬物である。脳虚血という病態は脳梗塞のみな
らず、心不全、重症貧血、呼吸障害、心停止、心室細動
に伴って生じることが知られている。これらの疾患から
脳を守り患者の予後を改善するためにも、本発明のジン
セノサイドＲｂ１からなる医薬組成物は極めて有効なも
のである。
【００２０】また、本発明のジンセノサイドＲｂ１から
なる医薬組成物は、アポトーシス様神経細胞死を伴うそ
の他の一次性および二次性神経変性疾患（アルツハイマ
ー病、ピック病、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、舞
踏病、筋萎縮性側索硬化症、エイズ脳症、肝性脳症、脳
炎、脳性マヒ、頭部外傷、脊髄損傷、一酸化炭素中毒、
新生児仮死、末梢神経障害、等）などにも、Ｂｃｌ−ｘ
Ｌ蛋白質発現増強を介して効能を示すことが期待され
る。
【００２１】さらに、本発明のジンセノサイドＲｂ１の
薬剤としての特徴で、今一つ見逃せないのが、これと言
った副作用を示さない点である。たとえば、一酸化窒素
供与体であるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）処
理をしていない通常の培養神経細胞にジンセノサイドＲ
ｂ１を添加しても代謝活性にまったく影響を与えず、Ｓ
ＮＰ処理をして傷害を受けた神経細胞のみを低濃度（１
〜１００ｆｇ／ｍｌ）のジンセノサイドＲｂ１が保護す
るので（実施例３参照）、ジンセノサイドＲｂ １は正常
な神経組織の機能にはあまり影響を与えず、病変部にの
み好ましい効果を発揮することができる。この点は、神
経保護薬として開発途上にあるグルタミン酸受容体拮抗
薬よりもはるかに優れた特性といえる。
【００２２】また、ジンセノサイドＲｂ１の脳室内投与
により脳温、脳血流、血圧にも影響が及ばないこともす
でに報告されている（Lim J.-H.et al Neurosci.Res.,2
8,191-200,1997;Zhang B.et al J.Stroke Cerebrovasc.
Dis.,7,1-9,1998）。もちろん、本発明者らが、今回の
各実験例において、本発明のジンセノサイドＲｂ１を投
与した動物を注意深く観察した範囲内でも、副作用は検
出されなかった。
【００２３】本発明のジンセノサイドＲｂ１はＭＣＡ永
久閉塞ラット（体重約３００ｇ）において、１日量６μ
ｇおよび６０μｇの投与で脳梗塞巣を縮小せしめ、場所
学習障害（脳血管性痴呆）を改善するという実験結果に
基づけば、体重６０ｋｇのヒト脳卒中患者に投与する量
は、体重あたりで計算すると１日当たり１．２ｍｇから
１２ｍｇということになる。しかし、一般に動物の体重
が増加するにつれて体重当たりの必要薬物投与量が減少
することから、１．２ｍｇ以下の用量でも充分効能を示
すと考えられる。本発明の医薬組成物のヒト脳卒中患者
での１日当たりの投与量としては、患者の個人差や病状
にもよるが、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、
より好ましくは１０ｍｇ以上である。本発明の医薬組成
物は副作用が少なく、投与量の上限としてはかなり多量
にすることもできるが、１日当たり１ｇ以下、好ましく
は０．１ｇ以下である。
【００２４】本発明の医薬組成物の投与方法としては、
静脈投与が好ましく、前記した投与量を断続的又は連続
的に投与することができる。本発明の有効成分であるジ
ンセノサイドＲｂ１はサポニンの１種であり、通常の方
法により製剤化することができる。例えば、本発明の水
溶性医薬組成物は、凍結乾燥結晶を生理食塩水、蒸留
水、リン酸緩衝液、ブドウ糖等に溶解することにより静
脈投与製剤とすることができる。脂肪乳剤、リポソーム
製剤としても使用可能である。静脈投与するときの製剤
の濃度としては余り高濃度でない限り任意の濃度に調整
することができ、例えば、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、
好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌ程度にして投与するこ
とができる。
【００２５】また、本発明における動物実験において
は、左中大脳動脈皮質枝（ＭＣＡ）永久閉塞後、２８日
間にわたって、ジンセノサイドＲｂ１を静脈内へ持続注
入したが、実際の急性期脳卒中症例では、発症後２週間
以内に病変が進行することが多いので、この期間だけで
もジンセノサイドＲｂ１を投与すれば充分効果が期待で
きる。また、ジンセノサイドＲｂ１の実用化により、脳
卒中患者の脳血管再建術・再濯流術の適応も広がるもの
と考えられる。
【００２６】本発明は、過去に類を見ない低濃度でジン
セノサイドＲｂ１が、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の増加を促す
ことによりアボトーシスあるいはアボトーシス様細胞死
を抑止することを世界に先がけて報告するものである。
低濃度でジンセノサイドＲｂ １が、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質
の増加を促すことによりアボトーシスあるいはアボトー
シス様細胞死を抑止するということは、ジンセノサイド
Ｒｂ１が単に中枢神経疾患のみならずアポトーシスを伴
う末梢組織の疾患（たとえば、臓器移植後の拒絶反応、
心筋・肝臓・腎臓の虚血再潅流障害、心筋梗塞、末梢動
脈閉塞症、末梢循環不全、褥創、自己免疫病、免疫不全
病）にも有効であることを物語っている。しかも、これ
ら末梢組織の疾患に対しては、神経疾患に使用される用
量よりも少ない量のジンセノサイドＲｂ１で充分な効果
・効能が発揮される。
【００２７】次に本発明の低濃度でのジンセノサイドＲ
ｂ１の作用について詳細に説明する。 まず、本発明者
らは、ジンセノサイドＲｂ１の静脈内注入による作用を
検討した。このために、例えば、１２〜１３週齢の雄性
ＳＨ−ＳＰラット（体重２５０〜３００ｇ）を使用し
た。同動物は１２時間ごとの明暗サイクル室で飼育し、
水ならびに餌は自由摂取とした。同動物の左中大脳動脈
皮質枝（ＭＣＡ）を凝固・切離した。ジンセノサイドＲ
ｂ１をＭＣＡ永久閉塞直後に単回静脈内注入し（６μｇ
または６０μｇ）、その後アルザミニ浸透圧ポンプを用
いて２８日間静脈内へ持続注入（６μｇ／日または６０
μｇ／日）した。なお、ＭＣＡを閉塞した対照動物（虚
血コントロール動物）と、偽手術をした動物には同量の
生理食塩水のみを投与した。
【００２８】ＭＣＡ永久閉塞後、常法に従って（Zhang
B.,et al., J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1998）
２週目と４週目にそれぞれ４日間水迷路テストを実施
し、ＳＨ−ＳＰラットの場所学習能力を判定した。その
結果を図１に示す。図１の左側は２週目の結果であり、
同右側は４週目の結果である。また、図１中の黒丸印は
偽手術をしたラットのものであり、白丸印は手術後、生
理食塩水のみを投与したものであり、黒四角印はジンセ
ノサイドＲｂ１を６μｇ／日投与したものであり、白四
角印はジンセノサイドＲｂ１を６０μｇ／日投与したも
のである。図１のごとくＭＣＡ永久閉塞後（脳梗塞後）
の場所学習障害が、生理食塩水注入脳梗塞群に比べて有
意に改善された。特に、ＭＣＡ閉塞後２週目と４週目の
水迷路テストで、ジンセノサイドＲｂ１の使用量では各
々３日目と４日目の試行において、ジンセノサイドＲｂ
１の高用量では２週目の４日目および４週目の３日目、
４日目に有意な学習能力改善効果を示した。また、４週
目の初日にも高用量・低用量とも有意な効果が確認され
た。なお、ＳＨ−ＳＰラットの水泳速度には各群で有意
差はみられなかった。
【００２９】４週目の水迷路テスト終了後に、ＳＨ−Ｓ
Ｐラットを抱水クロラールにて麻酔し、４％パラホルム
アルデヒドを含有する０．１モルリン酸緩衝液で経心的
に潅流固定した。その後、同動物の脳を摘出し大脳皮質
梗塞巣の写真を撮影した。左大脳半球面積と左大脳皮質
梗塞面積を、写真上で画像解析装置を用いて計測し、左
大脳皮質梗塞面積を左大脳半球面積で除することにより
大脳皮質梗塞比率（％）を算出した。その結果を図２に
示す。図２に示されるごとく、ジンセノサイドＲｂ１静
脈内投与脳梗塞群で生理食塩水投与脳梗塞群に比して、
大脳皮質梗塞比率も有意に減少していた。この大脳皮質
梗塞比率は梗塞面積をもとに算出したものであるが、そ
の比率の平均値がジンセノサイドＲｂ１静脈内投与群で
生理食塩水投与群の５０％程度に低下していることか
ら、実際の梗塞体積は、ジンセノサイドＲｂ１の静脈内
投与により４分の１に縮小したことになる。
【００３０】図３Ａに生理食塩水投与脳梗塞巣、図３Ｂ
にジンセノサイドＲｂ１（６μｇ／日）投与脳梗塞巣の
実例を示す。また、図４に本実験結果をまとめた横式図
を示す。生理食塩水投与群では脳梗塞病巣部の大きさが
大きいままであり、水迷路テストにおいては目的のプラ
ットホームに到達するまでに時間を要しているのに対し
て、本発明のジンセノサイドＲｂ１投与群においては病
巣部が回復、縮小されており、この結果水迷路テストに
おいては目的のプラットホームに短時間で到達してい
る。
【００３１】スナネズミの一過性前脳虚血モデルを用い
た従来の論文（Wen T.-C.,et al.,Acta Neuropathol.,9
1,15-22, 1996）では、ジンセノサイドＲｂ１の腹腔内
投与（１０ｍｇ／ｋｇ／日または２０ｍｇ／ｋｇ／日）
を虚血負荷前に実施しても、約３０％の海馬ＣＡ１錐体
神経細胞しか救うことができなかった。もちろん、ジン
セノサイドＲｂ１をスナネズミ腹腔内に虚血後に投与し
てもまったく効果はなかった。しかも、腹腔内投与され
たジンセノサイドＲｂ１の一日量は、スナネズミの体重
（７０ｇ前後）から判断すると、０．７ｍｇから１．４
ｍｇという高用量であるので、ジンセノサイドＲｂ１の
投与効率・効能という観点から判断しても、ジンセノサ
イドＲｂ１の静脈内投与は腹腔内投与よりもはるかに優
れた投与方法であり、ヒトへの応用が容易である。周知
のごとく、ヒトで薬物を腹腔内に投与する方法はごく一
部の例外（腹膜潅流等）を除いてはほとんど実施されて
いない。
【００３２】また、本実施例に用いたＭＣＡ永久閉塞動
物（脳梗塞ラット）は明らかに、スナネズミの一過性前
脳虚血モデルよりも重篤でありかつヒトの病態に近いモ
デルである。従って、このＭＣＡ永久閉塞動物におい
て、ジンセノサイドＲｂ１を脳血管閉塞後に静脈内投与
して著効を示したということは、ジンセノサイドＲｂ１
少量静脈内注入の有用性、利便性、経済性を明らかにし
ている。
【００３３】一方、ＭＣＡ永久閉塞動物の脳室内に直接
ジンセノサイドＲｂ１を注入してその効果をしらべた従
来の論文では（Zhang B.,et al., J.Stroke Cerebrovas
c.Dis.,7,1-9,1998）、ＭＣＡ閉塞後に０．６μｇ／ｄ
ａｙの用量でジンセノサイドＲｂ１を脳室内へ持続注入
したときのみに有意な脳梗塞抑止効果がみられたが、そ
の効果は本実施例で示したジンセノサイドＲｂ１静脈内
投与の効果と同等ないしそれより少し劣るものであっ
た。また、ジンセノサイドＲｂ１脳室内投与についての
前掲の論文において、その他の用量（６μｇ／ｄａｙ、
０．０６μｇ／ｄａｙ）でＭＣＡ永久閉塞後にジンセノ
サイドＲｂ１を脳室内へ持続注入してもまったく脳梗塞
抑止効果はみられなかったので、ジンセノサイドＲｂ１
脳室内投与の有効濃度城は極めて狭く、実用化は困難と
考えられた。しかも、ヒトへの応用を考慮したとき、ジ
ンセノサイドＲｂ１の脳室内注入はその危険性と効能を
斟酌した場合、現実的に実施することは不可能と判断さ
れる。
【００３４】一般に、神経保護因子は脳室内あるいは脳
実質内に直接投与した場合にもっとも大きな効果を発揮
し、静脈内投与や腹腔内投与をした場合には、脳血液関
門に遮断されてその効果・効能が激減あるいは消失する
と考えられる。従って、ジンセノサイドＲｂ１に関して
も、その腹腔内投与や脳室内投与実験結果から判断し
て、静脈内投与の効果・効能はまったく予想されていな
かった。しかし、本実験例であきらかにされたごとく、
ジンセノサイドＲｂ１の静脈内投与は脳室内投与の場合
よりも広い濃度域でＭＣＡ永久閉塞ラットの脳梗塞巣を
より効果的に縮小せしめ、同動物の学習能力を改善する
ことが発明された。また、ジンセノサイドＲｂ１は薬用
人蔘中に含有される精製サボニンであるが、経口投与に
より血中ではまったく検出されないため事実上ジンセノ
サイドＲｂ１自体の薬理作用は否定されてきた。従っ
て、本実施例により静脈内投与されたジンセノサイドＲ
ｂ１が薬用人蔘とは独立した効果・効能・用途をもつこ
とが明らかにされた。
【００３５】次に、本発明者らはジンセノサイドＲｂ１
による神経細胞膜脂質の過酸化防止効果判定の実験を行
った。Ｐｅｎｇら（Peng H.et al., J.Cereb.Blood Flo
w Metab.,18, 349-360,1998）の方法にしたがって、胎
生１７日目ラット大脳皮質神経細胞を、無血清培養液中
で３日間維持した後、ジンセノサイドＲｂ１を含むまた
は含まない新鮮な培養液に交換しさらに、４８時間培養
した。その後、硫酸第一鉄とアスコルビン酸を含みジン
セノサイドＲｂ１を含まない新鮮な培養液に交換して２
時間維持し、ヒドロキシルラジカルを発生させ神経細胞
膜に酸化傷害を与えた。産生した神経細胞膜過酸化脂質
は、ドデシル硫酸ナトリウムにより細胞を溶かしたの
ち、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）の固定量を吸光度測
定することにより求められた。本実験の目的は、ジンセ
ノサイドＲｂ１が硫酸第一鉄による神経細胞壊死（ネク
ローシス）を抑止する濃度域（０．１−１００ｆｇ／ｍ
ｌ）で細胞膜脂質の過酸化を防止するかどうか検討する
ことである。
【００３６】結果を図５に示す。この実験結果から、ジ
ンセノサイドＲｂ１による神経細胞膜脂質過酸化防止効
果は１００ｆｇ／ｍｌの濃度でのみわずかに認められた
が、硫酸第一鉄のフリーラジカル障害を軽減する０．１
−１０ｆｇ／ｍｌの濃度域では、脂質過酸化防止効果は
認められなかった。従って、ジンセノサイドＲｂ１は従
来の論文（Lim J.-H.,et al., Neurosci.Res.,28,191-2
00,1997; Zhang B.,etal., J.Stroke Cerebrovasc.Di
s.,7,1-9,1998）のごとく０．１〜１００ｆｇ／ｍｌの
濃度域でフリーラジカルの神経毒性を軽減することは間
違いないが、それに続いて過酸化脂質産生をも抑制する
という従来の仮説は正しくないということが判明した。
従って、ジンセノサイドＲｂ１の新たな作用機構の解析
が必要とされることを本実験は明らかにするものであ
る。
【００３７】このために、本発明者らは、ジンセノサイ
ドＲｂ１による神経細胞死（アボトーシス）の抑止作用
を判定するための実験を行った。細胞死はその形態学的
特徴よりネクローシスとアポトーシスに大別されてい
る。ただ、神経細胞死に関しては、ネクローシスという
概念は定着しているものの、一方のアポトーシスについ
ては、病的成熟脳で類似の現象は観察されるがリンパ球
にみられるような典型的特徴を示すものが非常に少な
い。従って、本明細書ではネクローシスとは異なり緩徐
に進行する神経細胞の死を“神経細胞のアボトーシス”
あるいは“アボトーシス様神経細胞死”と定義すること
にする。
【００３８】本発明者らは、最近培養神経細胞を一酸化
窒素供与体ニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）に短
時間暴露すると神経細胞のアポトーシスが誘導されるこ
とを見出した（Toku K.,et al., J.Neurosci.Res.,53,4
15-425,1998）。この培養実験では典型的なアボトーシ
スの特徴が観察されたので、本実験系を用いてジンセノ
サイドＲｂ１のアポトーシス抑止効果を判定することに
した。胎生１７日目ラット大脳皮質神経細胞を無血清培
地中で４日間ないし５日間維持した後、ジンセノサイド
Ｒｂ１を含むまたは含まない新鮮な培地に交換し、２４
時間培養した。その後、ＳＮＰを１００μＭの濃度で培
地中に１０分間添加した。その後、さらにジンセノサイ
ドＲｂ１を含む培養液中で１６時間神経細胞を維持し、
細胞生存率を酸化還元色素のアラマーブルーを用いて測
定した。
【００３９】前述の硫酸第一鉄負荷実験ではジンセノサ
イドＲｂ１をあらかじめ培地中に投与しておいてからそ
の結果を判定したが、本実験ではＳＮＰ負荷前後および
負荷後にジンセノサイドＲｂ１を培地中に添加し、その
効果をしらべた。結果を図６に示す。図６の右側はＳＮ
Ｐ処理を行った場合のものであり、黒く塗りつぶされて
いるものはＳＮＰ処理の前後にジンセノサイドＲｂ１が
添加されたものであり、斜線が引かれているものは、Ｓ
ＮＰ処理後にジンセノサイドＲｂ １が添加されたもので
ある。図６に示されるごとく、一酸化窒素供用体ニトロ
ブルシッドナトリウム（ＳＮＰ）の処理がないときに
は、ジンセノサイドＲｂ１は、培養神経細胞の代謝活性
に有意な影響を与えない。ＳＮＰ処理を行うと、神経細
胞死（アボトーシス）が起こるが、ジンセノサイドＲｂ
１は１−１００ｆｇ／ｍｌの濃度域でＳＮＰ処理前後お
よび処理後に投与した場合でも神経細胞のアボトーシス
を有意に抑止することが判明した。
【００４０】ジンセノサイドＲｂ１が、細胞外液濃度で
１−１００ｆｇ／ｍｌという過去に類をみない低濃度で
神経細胞のアポトーシスを抑止することを証明した本実
験結果は、ジンセノサイドＲｂ１を病的なアポトーシス
様神経細胞死の治療に利用しうることを世界に先がけて
実証したものである。
【００４１】次に、ジンセノサイドＲｂ１のＢｃｌ−ｘ
Ｌ発現に対する作用を解析するための実験を行った。Ｂ
ｃｌ−ｘＬ遺伝子は成熟脳、免疫組織、循環系組織を始
めとする多くの組織に発現しており、細胞が生存する上
で重要な役割を果たしていることが証明されている（Ad
ams J.M.and Cory S., Science,281,1322-1326,1998; B
oise,L.H.,etal.,Cell,74,597-608,1993; Gottschalk
A.R.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,7350-7354,1
994; Gonzalez-Garcia M.,et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,92,4304-4308,1995）。
【００４２】そこで、本発明のジンセノサイドＲｂ１が
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を増加させるかどうかをしら
べた。実験手技は温らの論文（Wen T.-C.,et al., J.Ex
p.Med.,188,635-649,1998）に準じた。０ｆｇ／ｍｌ、
１ｆｇ／ｍｌ、及び、１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイ
ドＲｂ１で、４８時間前処理された培養神経細胞から総
ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理済の総ＲＮＡ ３μ
ｇから、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素（Moloney
murine leukemia virus reverse transcriptase）を用
いてｃＤＮＡを生成した。遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）は
Ｔａｑポリメラーゼを用いて以下の条件で行った。すな
わち、（１）９４℃、２分間、（２）９４℃、１．５分
間；５５℃、１．５分間；７２℃、２分間を１サイクル
とし、Ｂｃｌ−ｘＬに関しては２５サイクル、β−アク
チンに関しては２０サイクル、（３）７２℃、２分間で
ある。
【００４３】ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルにて泳
動し、エチジュウムブロマイド染色によって可視化し
た。なお、内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡの発
現を用いた。結果を図７に示す。
【００４４】また、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の神経細胞での
発現をジンセノサイドＲｂ１が増強するかどうか調べる
ため、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質抗体を用いてウエスタンプ
ロット法を実施した。ジンセノサイドＲｂ１存在下また
は非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を４８時間培養
後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電気泳
動を実施した。その後泳動物をニトロセルロース膜に転
写しウエスタンプロットを行った。結果を図８に示す。
さらに、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質抗体と反応するバンドを
画像解析装置で定量化した。結果を図９に示す。
【００４５】図７に示すごとく、１ｆｇ／ｍｌあるいは
１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１で処理された
培養神経細胞では、Ｂｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡの発現がコ
ントロールに比べて増加していた。一方、ジンセノサイ
ドＲｂ１は神経細胞死抑止効果を発揮する１〜１００ｆ
ｇ／ｍｌの濃度域で、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白質発
現量を約５０％有意に増加せしめた（図８，９）。
【００４６】Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の発現増強を促す生理
活性物質としてこれまで０．６−１５．０ｎｇ／ｍｌの
濃度域のインターロイキン３が報告されているが（Wen
T.-C.,et al., J.Exp.Med.,188,635-649,1998）、ジン
セノサイドＲｂ１のＢｃｌ−ｘＬ蛋白質の発現促進作用
は、インターロイキン３よりもはるかに低濃度で発揮さ
れ、しかもＢｃｌ−ｘＬ蛋白質の発現をわずか１０％前
後増加させるインターロイキン３よりもはるかに強力で
あった。また、インターロイキン３は脳室内に直接投与
しなければ神経細胞保護作用を示さないが、ジンセノサ
イドＲｂ１は静脈内投与で脳の神経細胞を保護すること
が前記した静脈投与の実験（実施例１）で証明されてい
るので、ジンセノサイドＲｂ１は末梢投与可能な非べプ
チド性向神経薬物の中で目下の所、世界で唯一のＢｃｌ
−ｘＬ蛋白質の発現増強剤である。これまで非べプチド
性薬物がべブチド性因子（インターロイキン３）よりも
強力なＢｃｌ−ｘＬ蛋白質の発現増強を示すことは予想
だにされなかった。ちなみに、Ｂｃｌ−ｘＬの発現をわ
ずかながらも増強させるべプチド性因子は、本発明者ら
の知るかぎりインターロイキン３だけである。
【００４７】ミトコンドリア関連蛋白であるＢｃｌ−ｘ
ＬはＡｐａｆ１と結合することにより、Ａｐａｆ１とプ
ロカスパーゼ９（procaspase 9）との結合を阻害すると
言われている（Adams J.M.and Cory S.,Science, 281,1
322-1326,1998）。Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白の減少あるいは機
能低下が起きると、Ａｐａｆ１がＢｃｌ−ｘＬ蛋白から
解離し、ミトコンドリアからのチトクロームＣの漏出と
あいまって、プロカスパーゼ９が活性化されると考えら
れている（Adams J.M.and Cory S.,Science, 281,1322-
1326,1998）。ひとたび細胞質内のプロカスパーゼ９が
活性化されると引き続いてカスパーゼ９（caspase 9）
ならびにカスパーゼ３（caspase 3）が活性化され、こ
れらの蛋白分解酵素により細胞は自己融解し死（アポト
ーシス）に至る過程が加速される。おそらく、プロカス
パーゼ９が活性化された段階で、細胞が死に至る運命が
決定される可能性が高いので、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白の発現
増加剤（ジンセノサイドＲｂ１）によりプロカスパーゼ
９の活性化をくい止めることが、細胞死を防ぐための得
策と考えられる。
【００４８】さらに、ジンセノサイドＲｂ１による脳内
のアポトーシス様神経細胞死の抑止効果を解析するため
に、実際に成熟脳で起こる病的なアポートシス様神経細
胞死がジンセノサイドＲｂ１の投与により軽減されるか
どうかをしらべた。モデル動物としてスナネズミの３分
間前脳虚血モデルを用いた。同動物は、３分虚血負荷後
１週間を経過すると海馬ＣＡ１領域錐体神経細胞が約半
数変性脱落することが報告されている（Sakanaka M.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,4635-4640,1998）。
しかし、この時点で残った神経細胞でアポトーシス様細
胞死の指標である核の断片化がさらに進行中であること
が、ＴＵＮＥＬ染色法により確認されている（ Wen T.
-C.,et al., J.Exp.Med.,188,635-649,1998; Peng H.,e
t al., J.Cereb. Blood Flow Metab.,18,349-360,199
8）。そこでこのモデル動物を用いて、３分虚血後７日
目のアポトーシス様神経細胞死がジンセノサイドＲｂ１
の脳室内投与により抑止されるかどうかをＴＵＮＥＬ染
色法を用いて検討した。
【００４９】吸入麻酔下でスナネズミに３分間の前脳虚
血を負荷した直後に、脳室内へジンセノサイドＲｂ１を
２．５ｎｇまたは２５ｎｇ単回注入し、その後ジンセノ
サイドＲｂ１（６０ｎｇ／日または６００ｎｇ／日）を
ミニ浸透圧ポンプを用いて１週間脳室内へ持続注入し
た。３分虚血後１週間目にスナネズミをペントバルビタ
ール麻酔下で４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝
液を用いて経心的に潅流固定し、脳を摘出した。摘出脳
をパラフィンに包埋したのちに、５μｍの厚みのパラフ
ィン切片を作成し常法に従って、ＴＵＮＥＬ染色を実施
した。対照動物には同量の生理食塩水を投与した。
【００５０】結果を図１０に示す。図１０の（Ａ）は対
照動物を示し、（Ｂ）はジンセノサイドＲｂ１を６０ｎ
ｇ／日投与したものを示し、（Ｃ）はジンセノサイドＲ
ｂ１を６００ｎｇ／日投与したものを示す。図１０
（Ａ）に示すごとく、３分間の前脳虚血を負荷されたス
ナネズミの海馬ＣＡ１領域では１週間目に多くのＴＵＮ
ＥＬ陽性神経細胞が出現し、同細胞がアポトーシス様細
胞死の過程にあることがわかった。ジンセノサイドＲｂ
１を３分間前脳虚血を負荷した直後から脳室内へ注入す
ると、６０ｎｇ／日（図１０（Ｂ））、６００ｎｇ／日
（図１０（Ｃ））と注入用量に依存してＴＵＮＥＬ陽性
神経細胞が有意に減少した（図１０（Ｄ））。このこと
は、実施例３、４での培養実験結果が成熟脳において
も、あてはまることを示している。なお、ジンセノサイ
ドＲｂ１は脳血流や脳温にはさしたる影響を与えないこ
とがすでに報告されている（ Lim J.-H.,et al.,Neuros
ci.Res.,28,191-200,1997; Zhang B.,et al.,J.Stroke
Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1998）。
【００５１】以上の実験結果から、ジンセノサイドＲｂ
１又はその塩を含有してなる静脈内投与用製剤が極めて
低濃度で、脳血管性痴呆、脳梗塞、脳卒中、一過性脳虚
血発作などの脳・神経疾患の治療、予防又は処置に有効
であることが明らかにされた。また、低濃度、細胞外液
濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下、より詳細には１ｐｇ／ｍｌ以
下、さらには１〜１００ｆｇ／ｍｌという低濃度のジン
セノサイドＲｂ１又はその塩がアポトーシス又はアポト
ーシス様細胞死を抑止する作用を有することが明らかに
なった。さらには、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩が
細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの発現を促進させる
作用を有することもわかった。一方、本発明で使用され
るジンセノサイドＲｂ１又はその塩は、薬用人参の成分
として知られており、副作用の極めて少ない物質であ
る。
【００５２】したがって、本発明は、臨床上有効な脳・
神経疾患の治療、予防又は処置剤を提供するものであ
る。本発明の脳・神経疾患の治療、予防又は処置剤は、
ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の細胞外液濃度が１ｎ
ｇ／ｍｌ以下、より詳細には１ｐｇ／ｍｌ以下、更に詳
細には１〜１００ｆｇ／ｍｌになるように調製される静
脈内投与用製剤が、特に好ましい。さらに具体的には、
本発明は、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の細胞外液
濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下、より詳細には１ｐｇ／ｍｌ以
下、更に詳細には１〜１００ｆｇ／ｍｌになるように調
製される静脈内投与用製剤からなる脳・神経疾患の治
療、予防又は処置剤、及び、脳細胞又は神経細胞保護剤
を提供するものである。
【００５３】
【実施例】次に、具体的な試験例により本発明を詳細に
説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるもの
ではない。
【００５４】実施例１（ジンセノサイドＲｂ１静脈内注
入実験） １２〜１３週齢の雄性ＳＨ−ＳＰラット（体重２５０〜
３００ｇ）を使用した。同動物は１２時間ごとの明暗サ
イクル室で飼育し、水ならびに餌は自由摂取とした。同
動物の血圧は２０３．１±６．９ｍｍＨｇであり、以下
の実験は愛媛大学医学部附属動物実験施設の動物実験指
針に則ってなされた。吸入麻酔下で直腸温を３７±０．
２℃に維持したＳＨ−ＳＰラットの左中大脳動脈皮質枝
（ＭＣＡ）を凝固・切離した。
【００５５】ＭＣＡ永久閉塞の直後に左大腿静脈からジ
ンセノサイドＲｂ１の生理食塩水溶解液（１μｇ／μｌ
または０．１μｇ／μｌ）を６０μｌ（ジンセノサイド
Ｒｂ １として６０μｇまたは６μｇ）単回注入した。そ
の後、背部皮下に埋めたアルザミニ浸透圧ポンプと連結
するカテーテルを、ジンセノサイドＲｂ１単回注入部位
から左大腿静脈に挿入・留置した。あらかじめ、同ミニ
浸透圧ポンプには、ジンセノサイドＲｂ１の生理食塩水
溶解液を満たしておき、ジンセノサイドＲｂ１６０μｇ
／日または６μｇ／日の用量で左大腿静脈から２８日間
持続注入した。なお、ジンセノサイドＲｂ１溶解液の流
量は０．２５μｌ／時であった。ＭＣＡを永久閉塞した
対照動物（虚血コントロール動物）と偽手術動物には同
量の生理食塩水のみを投与した。
【００５６】ＭＣＡ永久閉塞後、常法に従って（Zhang
B.,et al., J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1998）
２週目と４週目にそれぞれ４日間水迷路テストを実施
し、ＳＨ−ＳＰラットの場所学習能力を判定した。その
結果を図１に示す。図１の左側は２週目の結果であり、
同右側は４週目の結果である。また、図１中の黒丸印は
偽手術をしたラットのものであり、白丸印は手術後、生
理食塩水のみを投与したものであり、黒四角印はジンセ
ノサイドＲｂ１を６μｇ／日投与したものであり、白四
角印はジンセノサイドＲｂ１を６０μｇ／日投与したも
のである。データは平均値±標準誤差で示されており、
統計解析法はＡＮＯＶＡ＋ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤによ
っている。なお、ＳＨ−ＳＰラットの水泳速度には各群
で有意差はみられなかった。
【００５７】４週目の水迷路テスト終了後に、ＳＨ−Ｓ
Ｐラットを抱水クロラールにて麻酔し、４％パラホルム
アルデヒドを含有する０．１モルリン酸緩衝液で経心的
に潅流固定した。その後、同動物の脳を摘出し大脳皮質
梗塞巣の写真を撮影した。左大脳半球面積と左大脳皮質
梗塞面積を、写真上で画像解析装置を用いて計測し、左
大脳皮質梗塞面積を左大脳半球面積で除することにより
大脳皮質梗塞比率（％）を算出した。その結果を図２に
示す。データは平均値±標準誤差で示されており、統計
解析法はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストによって
いる。図３Ａに生理食塩水投与脳梗塞巣、図３Ｂにジン
セノサイドＲｂ１（６μｇ／日）投与脳梗塞巣の実例を
示す。また、図４に本実験結果をまとめた模式図を示
す。生理食塩水投与群では脳梗塞病巣部の大きさが大き
いままであり、水迷路テストにおいては目的のプラット
ホームに到達するまでに時間を要しているのに対して、
本発明のジンセノサイドＲｂ１投与群においては病巣部
が回復、縮小されており、この結果水迷路テストにおい
ては目的のプラットホームに短時間で到達している。
【００５８】実施例２（ジンセノサイドＲｂ１による神
経細胞膜脂質の過酸化防止効果判定実験）：胎生１７日
目ラット大脳皮質神経細胞を、無血清培養液中で３日間
維持した後、ジンセノサイドＲｂ１を０．１ｆｇ／ｍ
ｌ、１ｆｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍ
ｌ、及び１０００ｆｇ／ｍｌ含むかまたは含まない（０
ｆｇ／ｍｌ）新鮮な培養液に交換しさらに、４８時間培
養した。その後、硫酸第一鉄とアスコルビン酸を含みジ
ンセノサイドＲｂ１を含まない新鮮な培養液に交換して
２時間維持し、ヒドロキシルラジカルを発生させ神経細
胞膜に酸化傷害を与えた。産生した神経細胞膜過酸化脂
質は、ドデシル硫酸ナトリウムにより細胞を溶かしたの
ち、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）の固定量を吸光度測
定することにより求められた。結果を図５に示す。この
結果、ジンセノサイドＲｂ１による神経細胞膜脂質過酸
化防止効果は１００ｆｇ／ｍｌの濃度でのみわずかに認
められたが、硫酸第一鉄によるフリーラジカル傷害を軽
減する０．１〜１０ｆｇ／ｍｌの濃度域では、脂質過酸
化防止効果は認められなかった。
【００５９】実施例３（ジンセノサイドＲｂ１による神
経細胞死（アポトーシス）抑止作用判定実験）：胎生１
７日目ラット大脳皮質神経細胞を無血清培地中で４日間
ないし５日間維持した後、ジンセノサイドＲｂ１を１ｆ
ｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌ、及び、１００ｐｇ／ｍｌ
含むか、または含まない（０ｆｇ／ｍｌ）新鮮な培地に
交換し、２４時間培養した。その後、一酸化窒素供用体
ニトロブルシッドナトリウム（ＳＮＰ）を１００μＭの
濃度で培地中に１０分間添加した。その後、さらにジン
セノサイドＲｂ１を含む培養液中で１６時間神経細胞を
維持し、細胞生存率を酸化還元色素のアラマーブルーを
用いて測定した。
【００６０】結果を図６に示す。図６の左側は、ＳＮＰ
処理のない場合の結果を示し、この結果、ジンセノサイ
ドＲｂ１は神経細胞の活性に大きな影響を与えないこと
がわかる。図６の右側はＳＮＰ処理を行った場合のもの
であり、黒く塗りつぶされているものはＳＮＰ処理の前
後にジンセノサイドＲｂ１が添加されたものであり、斜
線が引かれているものは、ＳＮＰ処理後にジンセノサイ
ドＲｂ１が添加されたものである。データは平均値±標
準誤差で示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｆｉ
ｓｈｅｒのＰＬＳＤによっている。アステリスクは、ジ
ンセノサイドＲｂ１が添加されないときに対する有意差
（＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１）を示す。
【００６１】図６に示されるごとく、一酸化窒素供与体
ニトロブルシッドナトリウム（ＳＮＰ）の処理がないと
きには、ジンセノサイドＲｂ１は、培養神経細胞の代謝
活性に有意な影響を与えない。ＳＮＰ処理を行うと、神
経細胞死（アボトーシス）が起こるが、ジンセノサイド
Ｒｂ１は１−１００ｆｇ／ｍｌの濃度域でＳＮＰ処理前
後および処理後に投与した場合でも神経細胞のアボトー
シスを有意に抑止したことがわかる。
【００６２】実施例４（ジンセノサイドＲｂ１のＢｃｌ
−ｘＬ発現作用解析実験）：ジンセノサイドＲｂ１がＢ
ｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を増加させるかどうかをしらべ
るために、温らの論文（Wen T.-C.,et al., J.Exp.Me
d.,188,635-649,1998）に記載の方法に準じて、０ｆｇ
／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、及び、１００ｆｇ／ｍｌのジン
セノサイドＲｂ１で、４８時間前処理された培養神経細
胞から総ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理済の総ＲＮ
Ａ ３μｇから、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素
（Moloney murine leukemia virus reverse transcript
ase）を用いてｃＤＮＡを生成した。遺伝子増幅反応
（ＰＣＲ）によりこれを増幅した。このＰＣＲはＴａｑ
ポリメラーゼを用いて以下の条件で行った。すなわち、
（１）９４℃、２分間、（２）９４℃、１．５分間；５
５℃、１．５分間；７２℃、２分間を１サイクルとし、
Ｂｃｌ−ｘＬに関しては２５サイクル、β−アクチンに
関しては２０サイクル、（３）７２℃、２分間である。
【００６３】ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルにて泳
動し、エチジュウムブロマイド染色によって可視化し
た。なお、内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡの発
現を用いた。結果を図７に示す。
【００６４】また、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の神経細胞での
発現をジンセノサイドＲｂ１が増強するかどうか調べる
ため、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質抗体を用いてウエスタンプ
ロット法を実施した。ジンセノサイドＲｂ１存在下また
は非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を４８時間培養
後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電気泳
動を実施した。その後泳動物をニトロセルロース膜に転
写しウエスタンプロットを行った。結果を図８に示す。
さらに、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質抗体と反応するバンドを
画像解析装置で定量化した。結果を図９に示す。統計解
析法はＡＮＯＶＡ＋ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤによってい
る。図中のアスタリスクは、ジンセノサイドＲｂ１が添
加されないときに対する有意差（＊＊はＰ＜０．０１）
を示す。
【００６５】図７に示すごとく、１ｆｇ／ｍｌあるいは
１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１で処理された
培養神経細胞では、Ｂｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡの発現がコ
ントロールに比べて増加していた。一方、ジンセノサイ
ドＲｂ１は神経細胞死抑止効果を発揮する１〜１００ｆ
ｇ／ｍｌの濃度域で、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白質発
現量を約５０％有意に増加せしめた（図９参照）。
【００６６】実施例５（ジンセノサイドＲｂ１による脳
内アポトーシス様神経細胞死抑止効果の解析） 吸入麻酔下でスナネズミに３分間の前脳虚血を負荷した
直後に、脳室内へジンセノサイドＲｂ１を２．５ｎｇま
たは２５ｎｇ単回注入し、その後ジンセノサイドＲｂ１
（６０ｎｇ／日または６００ｎｇ／日）をミニ浸透圧ポ
ンプを用いて１週間脳室内へ持続注入した。３分虚血後
１週間目にスナネズミをペントバルビタール麻酔下で４
％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いて経心
的に潅流固定し、脳を摘出した。摘出脳をパラフィンに
包埋したのちに、５μｍの厚みのパラフィン切片を作成
し常法に従って、ＴＵＮＥＬ染色を実施した。対照動物
には同量の生理食塩水を投与した。結果を図１０に示
す。図１０（Ｄ）の統計解析法はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎ
ｅｙＵテストによっている。図１０の（Ａ）は対照象動
物を示し、（Ｂ）はジンセノサイドＲｂ１を６０ｎｇ／
日投与したものを示し、（Ｃ）はジンセノサイドＲｂ １
を６００ｎｇ／日投与したものを示す。
【００６７】図１０（Ａ）に示すごとく、３分間の前脳
虚血を負荷されたスナネズミの海馬ＣＡ１領域では１週
間目に多くのＴＵＮＥＬ陽性神経細胞が出現し、同細胞
がアポトーシス様細胞死の過程にあることがわかった。
ジンセノサイドＲｂ１を３分間前脳虚血を負荷した直後
から脳室内へ注入すると、６０ｎｇ／日（図１０
（Ｂ））、６００ｎｇ／日（図１０（Ｃ））と注入用量
に依存してＴＵＮＥＬ陽性神経細胞が有意に減少した
（図１０（Ｄ））。このことは、実施例３、４での培養
実験結果が成熟脳においても、あてはまることを示して
いる。なお、ジンセノサイドＲｂ１は脳血流や脳温には
さしたる影響を与えないことがすでに報告されている
（ Lim J.-H.,et al.,Neurosci.Res.,28,191-200,1997;
Zhang B.,et al.,J.Stroke Cerebrovasc.Dis.,7,1-9,1
998）。
【００６８】
【発明の効果】本発明は、低濃度のジンセノサイドＲｂ
１の静脈内投与用製剤からなる極めて有効な、急性期・
慢性期の脳梗塞のみならず脳出血・クモ膜下出血・脳塞
栓の急性期や慢性期あるいは一過性脳虚血発作などに対
する、脳・神経疾患の治療、予防剤、及び、神経保護薬
を提供する。すなわち、ジンセノサイドＲｂ１に関する
本発明は、脳卒中が疑われる患者に対して救急車の中で
も点滴静注が可能な薬物を提供するものである。実際の
急性期脳卒中症例では、発症後２週間以内に病変が進行
することが多いので、この期間だけでも本発明のジンセ
ノサイドＲｂ１を投与すれば充分効果が期待できる。ま
た、ジンセノサイドＲｂ１の実用化により、脳卒中患者
の脳血管再建術・再潅流術への適応も広がる。さらに、
本発明の医薬組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の発現増強
作用を有し、アポトーシス様神経細胞死を伴うその他の
一次性および二次性神経変性疾患（アルツハイマー病、
ピック病、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、舞踏病、
筋萎縮性側索硬化症、エイズ脳症、肝性脳症、脳炎、脳
性マヒ、頭部外傷、脊髄損傷、新生児仮死、末梢神経障
害、等）などにも有効であるとされる。また、本発明の
医薬組成物は副作用がほとんど無く、安全性の高い薬物
を提供するものである。本発明は、過去に類を見ない低
濃度でジンセノサイドＲｂ１がＢｃｌ−ｘＬ蛋白質の増
加を促すことによりアボトーシスあるいはアボトーシス
様細胞死を抑止する作用を有することを見出したもので
あり、このことはジンセノサイドＲｂ１が単に中枢神経
疾患のみならずアポトーシスを伴う末梢組織の疾患（た
とえば、臓器移植後の拒絶反応、心筋・肝臓・腎臓の虚
血再潅流障害、心筋梗塞、末梢動脈閉塞症、末梢循環不
全、褥創、自己免疫病、免疫不全病）にも有効であるこ
とを示唆している。これら末梢組織の疾患に対しては、
神経疾患に使用される用量よりも少ない量のジンセノサ
イドＲｂ１で充分な効果・効能が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、水迷路テストの結果を示す図である。
図１の左側は２週目の結果であり、同右側は４週目の結
果である。また、図１中の黒丸印は偽手術をしたラット
のものであり、白丸印は手術後、生理食塩水のみを投与
したものであり、黒四角印はジンセノサイドＲｂ１を６
μｇ／日投与したものであり、白四角印はジンセノサイ
ドＲｂ１を６０μｇ／日投与したものである。
【図２】図２は、大脳皮質梗塞比率を示す図である。
【図３】図３は、大脳皮質梗塞巣の写真である。Ａが生
理食塩水投与例ＢがジンセノサイドＲｂ１投与例であ
る。
【図４】図４は、実施例１の結果をまとめた模式図であ
る。
【図５】図５は、ジンセノサイドＲｂ１の膜脂質過酸化
防止効果が非常に弱いことを示す図である。
【図６】図６は、ジンセノサイドＲｂ１がＳＮＰによる
神経細胞死（アボトーシス）を抑止することを示すグラ
フである。図６の左側は、ＳＮＰ処理のない場合の結果
を示し、右側はＳＮＰ処理を行った場合のものであり、
黒く塗りつぶされているものはＳＮＰ処理の前後にジン
セノサイドＲｂ１が添加されたものであり、斜線が引か
れているものは、ＳＮＰ処理後にジンセノサイドＲｂ１
が添加されたものである。
【図７】図７は、ジンセノサイドＲｂ１によるＢｃｌ−
ｘＬのｍＲＮＡの発現増強効果を示す、図面に代わる写
真である。
【図８】図８は、ジンセノサイドＲｂ１によるＢｃｌ−
ｘＬの蛋白質に対するウエスタンブロッティングの結果
を示す、図面に代わる写真である。
【図９】図９は、ジンセノサイドＲｂ１によるＢｃｌ−
ｘＬの蛋白質に対するウエスタンブロッティングの結果
を定量化したグラフである。
【図１０】図１０の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、ジン
セノサイドＲｂ１が成熟脳において病的なアポトーシス
様神経細胞死を抑止することを示す、図面に代わる写真
である。図１０の（Ｄ）は、その結果を定量化したグラ
フである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６Ｎ 25/16 ６２６Ｆ 37/00 ６３７ // Ｃ０７Ｊ 13/00 Ｃ０７Ｊ 13/00 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA19 MA01 MA04 MA17 MA66 NA12 NA14 ZA01 ZA02 ZA15 ZA20 ZA36 ZA75 ZA81 ZB02 ZC55 4C091 AA01 BB01 CC01 DD01 EE06 FF01 GG03 GG05 HH01 JJ03 KK01 LL02 LL09 MM01 NN01 PA02 PA07 PB05 QQ01

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を含有し
    てなる細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの発現を促進
    させるための医薬組成物。
  2. 【請求項２】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を含有し
    てなるアポトーシス又はアポトーシス様細胞死抑止用医
    薬組成物。
  3. 【請求項３】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の患部に
    おける細胞外液濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下となる請求項１
    又は２に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩のその濃
    度が１〜１００ｆｇ／ｍｌである請求項３に記載の医薬
    組成物。
  5. 【請求項５】細胞が、脳細胞又は神経細胞である請求項
    ２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】静脈内投与用製剤である請求項１〜５のい
    ずれかに記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩を含有し
    てなる静脈内投与用製剤。
  8. 【請求項８】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の濃度が
    低濃度である請求項７に記載の静脈内投与用製剤。
  9. 【請求項９】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の患部に
    おける細胞外液濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下となるように調
    整されている請求項８に記載の静脈内投与用製剤。
  10. 【請求項１０】ジンセノサイドＲｂ１又はその塩の細胞
    外液濃度が１〜１００ｆｇ／ｍｌである請求項９に記載
    の静脈内投与用製剤。
  11. 【請求項１１】脳・神経疾患の治療、予防又は処置のた
    めの請求項７〜１０のいずれかに記載の静脈内投与用製
    剤。
  12. 【請求項１２】脳・神経疾患が、脳血管性痴呆、脳梗
    塞、脳卒中又は一過性脳虚皿発作である請求項１１に記
    載の静脈内投与用製剤。
  13. 【請求項１３】単回静脈内注入用製剤又は静脈内持続投
    与用製剤である請求項７〜１２のいずれかに記載の静脈
    内投与用製剤。
  14. 【請求項１４】請求項７〜１３のいずれかに記載の静脈
    内投与用製剤からなる脳・神経疾患の治療、予防又は処
    置剤。
  15. 【請求項１５】請求項７〜１３のいずれかに記載の静脈
    内投与用製剤からなる脳細胞又は神経細胞保護剤。
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