KR100656888B1

KR100656888B1 - 뇌 선조체 병소 유발물질로부터 뇌 선조체 보호효과를 갖는 진세노사이드 함유 조성물

Info

Publication number: KR100656888B1
Application number: KR1020040042590A
Authority: KR
Inventors: 나승열
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2004-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2006-12-13
Also published as: KR20050117313A

Abstract

본 발명은 홍삼 사포닌 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 홍삼 사포닌 혼합물은 헌팅톤병(Huntington's disease)과 유사한 임상적 증상을 유발시키는 것으로 알려진 3-NP에 의해 유도되는 선조체 신경독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아 손상을 유의적으로 억제하므로 인지장애, 운동장애, 성격장애 및 헌팅톤병에 유용한 치료제로 사용될 수 있다.

홍삼 추출물, 진세노사이드, 3-니트로프로피온산, 선조체, 신경독성

Description

뇌 선조체 병소 유발물질로부터 뇌 선조체 보호효과를 갖는 진세노사이드 함유 조성물{Composition Comprising Ginsenosides Having Neuroprotective Effects against Brain Striatum Neurotoxicity}

도 1은 본 발명의 대표적인 8개의 진세노사이드의 화학구조를 나타낸 것이다.

도 2는 3-NP의 복강내 투여에 의해 유도된 선조체 병변에 대한 홍삼 추출물(GE) 및 GTS[(홍삼(Red Ginseng) 전체 사포닌 혼합물]의 신경세포 보호효과를 나타낸 것이다.

도 3은 또 다른 선조체 병변 유발 물질인 말론산의 선조체내 투여에 의해 유도된 선조체 병변에 대한 GTS의 신경세포 보호효과를 나타낸 것이다.

도 4는 식염수 투여군(대조군), 3-NP 투여군 및 GTS +3-NP 투여군에서 실험동물의 관상절편을 크레실 바이올렛(CV), GFAP 및 NADPH-다이포라아제로 염색한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 3-NP에 의해 유도된 운동능력 상실에 대한 GTS의 운동력 증진 효과를 나타낸 것이다( ^* P<0.05, GTS +3-NP 투여군과 비교; ^** P <0.001, 대조군 또는 GTS +3-NP 투여군과 비교).

도 6은 3-NP에 의해 유도된 실험동물의 사망률에 대한 GTS의 사망률 억제 및 수명 연장 효과를 나타낸 것이다.

도 7은 3-NP에 의해 유도된 세포내 칼슘이온 농도증가에 대한 GTS의 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 3-NP에 의해 유도된 뇌 선조체 세포들의 미토콘드리아 세포막의 포텐셜 (mitocondrial membrane potential)변화에 대한 GTS의 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 3-NP에 의해 유도된 배양된 뇌 선조체 세포들의 사멸에 대한 GTS의 방어 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 3-NP에 의해 유도된 배양된 뇌 선조체 세포들의 손상에 의하여 유발된 DNA 절단 현상에 대한 GTS의 방어 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 홍삼 추출물 또는 진세노사이드를 함유하는 3-니트로프로피온 산(3-nitropropionic acid; 3-NP)에 의한 신경세포의 손상 및 사멸로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

파낙스 진셍(Panax ginseng C.A. Meyer (Araliaceae))의 뿌리인 인삼은 아시아뿐만 아니라 세계적으로 가장 많이 사용되는 생약 중의 하나이다. 이러한 인삼의 생물학적 효능을 갖는 성분은 진세노사이드(ginsenoside) 또는 인삼 사포닌(ginseng saponins)으로 알려진 화합물로 30종 이상의 진세노사이드가 인삼에서 분리되어 그 구조가 알려져 있다(Liu, C.X. et al., J. Ethnopharmacol. 36:27-38, 1996; Baek, N.I. et al., Planta Med., 62:86-87, 1996). 그 대표적 예로 진세노사이드-Ra, -Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, Rf, -Rg1, -Rg2, -Rg3, -Rh1, -Rh2 등이 있다.

최근에는 생체내의 진세노사이드의 다양한 효능 중 중추신경에 대한 효능들이 보고되고 있다. 학습과 기억력에 대한 동물모델에서 인삼의 학습 및 기억력에 대한 효과가 밝혀지고 있으며, 특히 스코폴아민(scopolamine)으로 손상된 동물모델이나 나이에 따라 약해지는 기억력, 기억형성에 가장 중요한 부위로 알려진 해마(hippocampus) 신경세포의 손상에 의한 기억력 감퇴를 인삼이 완화시키는 것으로 알려지고 있다(Hsieh, M.T. et al., Phytother. Res., 14:375-377, 2000; Wesnes, K.A., Ward et al., Psychopharmacology(Berl), 152:353-361, 2000). 인삼의 이러한 기억력에 대한 효과는 인삼 추출물을 포함하는 기억력 증진제로 출원된 바 있다(한국 특허 출원 제2000-4715호). 또한, 다양한 형태의 이온 채널을 조절함에 의해 중추신경 세포의 흥분도를 조절하는 진세노사이드의 효과에 대하여도 보고된 바 있다.

헌팅턴병은 신경퇴행성 유전질환으로 가장 흔히 관찰되는 유전성 신경계 질 환 형태들 중의 하나이다. 증상의 특징은 1) 성격변화, 우울증 등의 정신장애와 2) 운동 이상으로 나타난다. 발병률은 대체로 백만명당 4-5명으로 대체적인 발병 연령은 30-40대이지만 15세 이전, 심지어는 소아기에 시작되는 경우도 있다. 헌팅턴병은 뇌의 선조체(striatum) 및 기저핵(basal ganglia)과 대뇌피질의 신경세포의 선택적인 소실로 발병된다. 특히 미상핵(caudate nucleus)과 피각(putamen)의 두부에서 현저한 위축이 발견되며, 흔히 전두엽과 측두엽에서 중등도의 뇌회위축도 동반된다. 1993년 헌팅턴병의 원인유전자가 클로닝되었으며, 그 유전자 산물은 헌팅틴(huntingtin)이라는 단백질이다. 헌팅틴에 돌연변이가 일어났을 때 어떠한 기전으로 신경세포사가 일어나는가에 대한 메커니즘은 정확히 알려져있지 않으나 현재 활발한 연구가 진행중이다. 현재까지 알려진 바로는 캐스페이즈(caspase)라는 효소가 중요한 역할을 한다는점, 그리고 세포사를 일으킬 때 산화 스트레스가 중요한 역할을 할 것이라는 점이 있다(Gutekunst C.A., Norflus F., Curr. Opin. Neurol., 13:445-450, 2000). 현재 헌팅턴병에 대한 뚜렷한 치료법은 없는 실정이다. 환자의 운동 장애를 억제하기 위해 도파민 길항제인 할로페리돌(haloperidol)이 가장 널리 사용되고 있다. 기타 레세르핀(reserpine), 클로자핀(clozapine), 테트라바나진(tetrabanazine)과 같은 도파민 길항제는 헌팅턴병을 억제하는 효과가 있으나 졸음, 정좌 불능증, 만발성 운동이상증 등의 부작용이 크다. 할로페리돌을 비롯한 이러한 약들은 행동의 이상, 감정이 쉽게 변하는 등의 증상은 경감시킬 수 있으나 질환의 진행은 막지 못한다.

한편, 3-니트로프로피온 산(3-nitropropionic acid; 3-NP)은 진균류에 오염 된 사탕수수 및 옥수수에서 발견된 화합물로, 동물 및 인간 모두에서 신경세포독성(neurotoxicity)을 나타내는 것으로 알려져 있다(Ming, Clin. Toxicol, 33:363-367, 1995; James L.F. et al., Am J. Vet. Res., 41:377-382, 1980). 만성적인 3-NP의 투여는 인간의 퇴행성 뇌질환의 일종인 헌팅톤병(Huntington's disease)과 유사한 임상적 증상을 유발시키는 것으로 알려져 있어, 3-NP는 헌팅톤병 연구를 위한 동물 모델에서 광범위하게 사용된다(Beal M.F. et al., J. Neurosci., 13:4181-4192, 1993).

그러나, 아직까지 만성적인 신경독성 손상에 의해 유도되는 점진적인 선조체의 변성(degeneration)에 대한 진세노사이드의 생체내 신경세포 보호효과에 대해서는 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 3-NP에 의해 유도되는 선조체 신경독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아 손상을 홍삼 사포닌 혼합물이 유의적으로 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 홍삼 사포닌 혼합물을 함유하는 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Ro 및 Ra를 필수적으로 함유하는 홍삼 사포닌 혼합물을 0.25~1.0 중량% 함유하는 3-NP(3-nitropropionic acid)에 의해 유발되는 선조체 신경 독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아의 손상에 의해 발생하는 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

삭제

본 발명의 홍삼 진세노사이드는 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 그리고, 홍삼은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여 왔던 약재로서 이들로부터 추출 및 분리된 본 발명의 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

삭제

본 발명의 홍삼 추출물 또는 진세노사이드 화합물들을 함유하는 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 본 발명에 의한 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 홍삼 추출물 또는 진세노사이드는 1일 12.5~250 mg/kg으로, 바람직하게는 12.5~200 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 홍삼 추출물 또는 진세노사이드와 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는, 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 효과를 나타내는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 홍삼 사포닌 혼합물은 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 홍삼 사포닌 혼합물의 양은 전체 식품 중량의 0.25~1.0중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02~5 g, 바람직하게는 0.3~1 g의 비율로 가할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 실험재료 및 실험동물

<1-1> 약물

하기 도 1에 본 발명의 대표적인 8개의 진세노사이드를 나타내었으며, 홍삼(Red ginseng) 전체 사포닌 혼합물(이하 'GTS'라 칭함)은 한국인삼공사(Korea Ginseng Corporation, Taejon, Korea)으로부터 분양 받았고, GTS 성분 중에는 Rb1(17.1%), Rb2(9.07%), Rc(9.65%), Rd(8.26%), Re(9%), Rf(3%), Rg1(6.4%), Rg2(4.2%), Rg3(3.8%), Ro(3.8%), Ra(2.91%) 및 다른 소수의 진세노사이드가 포함되어 있다. GTS는 사용하기 전에 bath medium 또는 식염수로 희석하여 사용하였으며, 3-NP(3-nitropropionic acid) 및 다른 시약들은 분석등급이며, 시그마사(St. Louis, MO)로부터 구입하여 사용하였다.

<1-2> 약물 투여 및 TTC 염색

수컷 스프라구-도울리계 랫트(300-350 g)를 사용하였으며, 온도, 습도 및 12시간 명암주기(AM. 7:00에 점등)가 조절되는 사육실에서 케이지 당 네 그룹으로 나누어 사육하였다. 45 마리의 랫트들을 임으로 식염수 투여군, 3-NP 단독 투여군 또는 GTS + 3-NP 투여군으로 나누었으며, 식이와 물은 자유로이 공급되도록 하였다. 대조군은 식염수만 투여하였으며, 식염수에 녹인 GTS는 27일 동안 12시간 간격으로 하루에 2번 50 ㎎/㎏의 투여량으로 랫트에 투여하였다. GTS는 3-NP를 투여(27일 동안 3일에 한번, 10 ㎎/㎏의 투여량)하기 전, 3일 동안 미리 투여하였으며, 3-NP 분말은 식염수에 녹여 사용하였고, pH는 수산화나트륨으로 7.4로 조정하였다. 3-NP를 3~4회 투여 후, 실험동물들은 급성적인 증상(ill)을 보였다. 투여횟수의 변화에 따라 실험동물들은 매츄(Mattews) 등의 연구에서 보인 바와 같은 증상을 나타내었다(Mattews et al., J. Neurosci., 18:156-163, 1998). 3-NP 투여 후, 실험동물을 3~4시간 동안 임상적으로 관찰하였으며, 급성적으로 증상을 보인 실험동물을 대조군 또는 홍삼 사포닌 혼합물-투여군에 상관없이 각 군으로부터 한 마리를 희생시켰다. 실험동물의 뇌를 신속히 제거한 다음 차가운 식염수 용액에 담가두었다가 랫트 뇌 매트릭스를 이용하여 2 ㎜ 간격으로 절개하였다. 절개된 절편은 37℃, 어두운 곳에서 5분동안 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC) 용액으로 처리한 다음, TTC 용액을 제거하고 4% 파라포름알데히드(pH 7.4 in phosphate buffer)에 두었다. 컴퓨터에 기초한 이미지 분석(Image, NIH)을 이용하여, 병변(lesion)의 횡단면적을 합산하고 이 값에 절편 사이의 거리를 곱하여 병변 부피를 계산하였다.

실험결과, 홍삼 사포닌 혼합물은 3-NP로 유도된 선조체의 병변 부피를 용량-의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 홍삼 추출물(GE) 또한 3-NP 단독 투여군과 비교하여 선조체 병변 부피를 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 2).

<1-3> 선조체에 직접 투여한 말론산으로 유도된 선조체 병변에 대한 홍삼 사포닌 혼합물의 신경세포 보호효과

40 마리의 랫트를 임의로 식염수 투여군 및 GTS 투여군으로 나눈 다음, GTS는 12시간 간격으로 하루에 두 번, 50 ㎎/㎏의 투여량으로 말론산 투여 전, 3일 동안 미리 투여하였으며, GTS는 희생 전 일주일 동안 더 투여하였다. 0.01 M 농도의 말론산은 0.1 M PBS(pH 7.4)에 녹여 사용하였다. 실험동물은 마취 후 정위의 프 레임(stereotaxic frame)에 머리를 고정한 다음, 말론산을 다음의 정위와 대응되는 곳의 오른쪽 선조체에 주입하였다 : 브레그마 전방. 양귀간 선(interaural line) 2.3 ㎜ 아래의 노이즈 바 셋을 가진 A=0.8 ㎜; 중간선으로부터 측면, L=-2.8 ㎜; 및 정점의 아래 경막(dura), V=-6.0 mm.

전체 1 ㎕를 주입 펌프가 설치된 10 ㎕의 하밀톤 실린지로 폴리에틸렌 튜브가 연결된 스테인레스 강철 캐뉼러를 통하여 0.25 ㎕/min의 속도로 주입하였다. 뇌를 제거한 후, 선조체의 병변 부피(striatal lesion volume)는 상기와 같이 TTC 염색으로 결정하였다.

실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 홍삼 사포닌 혼합물의 복강내 투여(100 ㎎/㎏)는 3-NP 단독 투여군과 비교하여 말론산으로 유도된 병변부피를 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 홍삼 사포닌 혼합물의 신경세포 보호 효과

<2-1> 조직학적 관찰

홍삼 사포닌 혼합물의 신경세포보호 효과를 관상 절편의 크레실 바이올렛 염색을 통하여 확인하였다.

랫트들은 펜토발비탈(50 ㎖/㎏, i.p.)로 마취시킨 다음, 헤파린으로 응혈이 방지된 차가운 식염수(250 ㎖)를 이용하여 심장을 통하여 관류(perfusion)하였다. 식염수를 관류시킨 뒤 4% 파라포름알데히드(in 0.1M 인산염 완충액) 300 ㎖로 고정하였다. 뇌를 제거한 뒤 같은 고정액에서 하룻밤동안 전(前)고정한 다음, 30% 수크 로오스 용액으로 2일 동안 동결 방지하였다(cryoprotect). 뇌는 2-메틸부탄(이소펜탄)에서 동결하였으며, 조직화학적(histochemical) 및 면역조직화학적(immunohistochemical) 실험에 사용하기 위하여 -80℃에서 저장하였다. 브레그마 전방의 0-1.2 ㎜ 수준의 관상절편(40 ㎛ 두께)을 냉동미세절단기(cryostat, Leica, 1800, UK)로 잘라내었다. 크레실 바이올렛 염색을 하기 위하여 절편을 젤라틴-코팅된 슬라이드에 올려놓은 뒤 1% 크레실 바이올렛 아세테이트(시그마사, 미국) 용액을 이용하여 염색하였다. MADPH 다이포라아제 염색을 0.02M 인산염 완충액, 10 ㎎/㎖ NADPH(환원된 형태, 시그마) 및 1 ㎎/㎖ 니트로블루 테트라졸리움(시그마사, 미국)이 포함된 반응 혼합액으로 37℃, 어두운 곳에서 60분 동안 배양한 자유-부유하는 냉동미세절단된 절편에 수행하였다.

실험결과, 3-NP 단독 투여된 동물은 좌우대칭의 선조체 병변을 보인 반면, 홍삼 사포닌 혼합물과 3-NP를 함께 투여한 군에서는 선조체 양쪽 부분에서 약간의 병변만을 확인할 수 있었다(도 4). 또한, 홍삼 사포닌 혼합물은 3-NP 유도된 세포 손실을 유의적으로 감소시켰으며, 홍삼 사포닌 혼합물 + 3-NP 투여군에서는 긴 경로의 신경세포간 신경전달 형태를 갖는 NADPH 다이포라아제를 관찰할 수 있었다(도 4의 A 내지 F).

<2-2> 면역조직화학적 관찰

면역조직화학적 실험을 위하여, 관상절편을 마우스 GFAP(glial fibrially acidic protein- 이 단백질은 신경세포가 아닌 glia 세포에만 존재함) 단일세포 항체(시그마사, 1:1000 희석), 0.3% 트리톤 X-100, 0.5 ㎎/㎖ BSA(bovine serun albumin) 및 1.5% 정상 염소 혈청이 포함된 PBS로 4℃에서 하룻밤동안 배양한 다음, PBS 용액으로 각각 5분동안 세차례 세척하고 염소 항-마우스 Ig G(벡터, 1:200)로 1시간동안 배양한 후, 아비딘-바이오틴-퍼옥시다아제(avidin-biotin-peroxidase) 착물(벡터, 1:200)로 실온에서 1시간동안 배양하였다. 관상절편을 0.005% 3,3′-디아미노벤지딘-4HCl(DAB) 및 0.01% H₂O₂로 10분동안 발색시킨 다음, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하였다.

실험결과, 3-NP는 병변 코어(core)에서 GFAP 면역반응의 결여를 야기하였으며(도 4의 H), 홍삼 사포닌 혼합물은 대조군과 마찬가지로 3-NP에 의해 야기된 GFAP 양성 세포의 손실을 즉 성상글리아세포(astrocytes)와 같은 글리아(glia) 세포들을 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 4의 G 및 I).

실시예 3: 행동 테스트 및 생존

45 마리의 실험동물을 임으로 대조군, 3-NP 단독 또는 GTS 투여군, 및 3-NP 투여군으로 나누었으며, 약물 투여 순서는 실시예 1-2와 같은 방법으로 수행하였다. 각 군의 실험동물들은 식염수 또는 3-NP를 3일에 한번씩 투여(Keene et al., Exp. Neurol., 171:351-360, 2002)한 후, 지각 능력을 3-4시간동안 관찰하였다. 실험동물을 각 실험군으로 분리하기 전에, 50 ㎝ 디스크에 의해 네부분으로 분획된 6.0 ㎝ 직경(Ugo Basile, Italy)의 바(bar)로 구성된 장치에서 3일동안 최대 180초동안 연속적으로 매일 세 차례 훈련시켰으며, 성공하지 못한 동물들은 다음 실험에 서 배제하였다. 바는 가속도에 따라 5회전/분에서 25회전/분으로 회전하고, 각각의 시도에서 실험동물이 하강 전 장치에서 소비할 수 있는 시간을 시도 최대 레턴시(latency) 180초로 결정하여 측정하였다. 세 번의 결과를 평균으로 하여 기록하였다. 약물 투여후, 생존 실험에서 임의적으로 60마리의 실험동물을 대조군, 3-NP 단독 투여군 또는 GTS + 3NP 투여군으로 나누었으며, 약물 투여 순서는 상기 실시예 1-2와 같이 수행하였다. 각 군의 동물은 이른 아침 및 늦은 오후, 하루에 2회 관찰하였다. 실험동물의 행동 및 먹이를 섭취하는 능력을 면밀히 모니터링하였으며, 이를 동물을 안락사시키는 시기를 결정하는 자료로 채택하였다. 희생을 위한 기준은 실험동물이 사지 마비되어 등을 곧추 세우지 못하는 시점으로 하였다.

실험결과, 3-NP 단독 처리군은 세 차례의 3-NP 투여 후, 행동 장애(rota-rod로 측정)를 보이기 시작하였으며, 3-NP의 투여 횟수가 증가할 수록 행동적 기능장애가 악화되었다(도 5). 반면, 홍삼 사포닌 혼합물 처리군은 향상된 로타-로드 수행능력을 보였으며 3-NP 단독 처리군과 비교하여 향상된 지각능력을 나타내었다(도 5). 또한, 홍삼 사포닌 혼합물 처리군이 3-NP 단독 처리군에 비하여 높은 생존율을 나타내었다(도 6).

실시예 4: 홍삼 사포닌 혼합물의 신경보호 효과의 메카니즘 규명

생체내(in vivo) 3-NP 투여에 의하여 유도된 뇌 선조체 독성에 대한 홍삼 사포닌 혼합물의 신경보호 효과의 메카니즘을 규명하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 3-NP의 처리는 배양된 뇌 선조체의 신경세포(neurons) 및 성상글리아세포(astrocytes)에서 서서히 세포내 Ca²⁺ 농도를 증가시키며, 최종적으로 세포사를 유발한다고 보고되었다(Fukuda et al., Neuroscience, 81:141-149, 1998). 본 발명의 홍삼 사포닌 혼합물이 배양된 선조체 세포들(neurons 및 astrocytes)에서 3-NP에 의해 유도된 Ca²⁺ 농도의 증가를 저해할 수 있는지를 실험하였다.

<4-1> 랫트 선조체 세포(striatal cell)의 배양 준비

선조체 신경세포(strial neurons) 및 신경아교세포(glial cell)의 공배양은 크니(Keene) 등의 방법(Keene et al., Exp. Neurol., 171:351-360, 2001)을 변형하여 수행하였다.

즉, 선조체를 16~18 일령의 암컷 스프라구-도울리계 랫트에서 분리한 다음, 0.25% 트립신(in HBSS) 용액으로 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포는 fire-polished 파스퇴르 피펫으로 분쇄(trituration)하여 기계적으로 분리하였으며, 35㎜ 배양접시 또는 6-웰 플레이트의 폴리-L-리신-코팅된 커버슬립에서 배양하였다. 세포는 37℃의 95%의 습한 공기 및 5% 이산화탄소에서 10% FBS, 2% B-27 서플러먼트(supplement), 20 mM 글루코오스, 26.2 mM 소디움 바이카보네이트, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dullbecco's modified Eagle's medium; Life Technologies, Inc. Grand Island, NY, USA) 배지에서 유지하였다. 실험은 시험관내에서 7-15일 배양된 세포를 이용하여 수행하였다. 3-NP는 식염수에서 100 × stocks 으로 준비하였으며, NaOH로 pH 7.4가 되도록 중화하였다. 사용된 3-NP의 최종 농도는 5 mM 이었다.

<4-2> 세포내 Ca ²⁺ 농도 측정

아세톡시메틸-에스테르 형태의 푸라-2(fura-2/AM; Molecular probes, Eugene, OR)를 형광성 Ca²⁺표지물로 사용하였으며, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES 및 10 mM 글루코오스로 구성된 HEPES 완충용액(pH 7.4)에서 5 μM 푸라-2/AM와 0.001% 플루로닉(Pluronic) F-127와 함께 신경세포를 실온에서 40 ~ 60분 동안 배양하여 표지한 후, HEPES 완충용액으로 세척한 다음 도립 현미경(inverted microscope, Olympus, Japan)을 사용하여 세포내 칼슘 이온 농도 변화를 측정하였다.

구체적으로, 크세논 아크 램프를 비추어 컴퓨터 제어 필터 휠(Sutter Instruments, CA)에 의해 여기 파장(340 및 380nm)을 선택적으로 세포에 노출시켰다. 매 2-5초간격으로 데이터를 얻었으며, 빛이 노출되는 사이에 셔터를 설치하여 세포에 주는 광독성(phototoxicity)을 방지하였다. 515 nm의 고대역 통과 여과기(long-pass filter)를 통과하여 들어온 방출 형광(emitter fluorescence light)은 냉각 CCD 카메라를 지나 디지털 형광 분석기에 의해 비율값과 세포내 유리 Ca²⁺농도([Ca²⁺]_i) 값으로 전환하였다. 모든 영상 데이터와 분석은 유니버셜 이미지 소프트웨어(West Chester, PA)를 이용하여 분석하였다(Kim et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 296, 247-254, 2002).

실험결과, 홍삼 사포닌 혼합물은 3-NP에 의해 유도된 Ca²⁺ 농도의 증가를 유의적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다 ( ^*P < 0.001, 도 7).

<3-3> 미토콘드리아 막포텐셜의 측정

3-NP에 의해 유도된 Ca²⁺ 농도의 증가는 미토콘드리아의 기능장애를 유발할 수 있으므로, 하기와 같이 홍삼 사포닌 혼합물의 존재 및 부존재 하에서 3-NP 유도된 미토콘드리아막의 포텐셜 변화를 측정하였다.

미토콘드리아막의 포텐셜(△Ψ_m)은 △Ψ_m-감각 염색법, 로드아민123(Rh123; Molecular probes, Eugene, OR)(Kannurpatti et al., Neurochem. Int., 44:361-369, 2004)을 이용하여 모니터링하였다.

즉, 세포를 실온에서 5 ㎍/㎖의 염색제로 15분 동안 어두운 곳에서 배양하고 로딩(loading)한 다음, HEPES 완충용액으로 세 차례 세척하였다. 홍삼 사포닌 혼합물 + 3-NP 투여군은 홍삼 사포닌 혼합물(100 ㎍/㎖)을 홍삼 사포닌 혼합물과 3-NP를 함께 처리하기 전 1분 동안 미리 처리하였다. 크세논 아크 램프를 비추어 컴퓨터 제어 필터 휠(Sutter Instruments, CA)에 의해 여기 파장(490 nm)을 선택적으로 세포에 노출시켰다. 방출 형광(emitter fluorescence light)은 537 nm의 고대역 통과 여과기(long-pass filter)를 통과하여 플레임 변형 냉각 CCD(frame transfer cooled CCD) 카메라에 반사되었다. 매 2-5초 간격으로 데이터를 얻었으며, 빛이 노출되는 사이에 셔터를 설치하여 세포에 주는 광독성(phototoxicity)을 방지하였다. 모든 영상 데이터와 분석은 유니버셜 이미지 소프트웨어(West Chester, PA)를 이용하여 분석하였다. 시작점의 형광강도(fluorescent intensity)는 1로 나타내었다.

실험결과, 3-NP로 인한 미토콘드리아막의 포텐셜의 감소(0.86 ± 0.01)를 홍삼 사포닌 혼합물이 존재할 경우에는 0.92 ± 0.01로 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다( ^*P < 0.001, 도 8).

실시예 4: 3-NP 유도된 선조체 세포독성에 대한 홍삼 사포닌 혼합물의 저해효과

<4-1> MTT 테스트법

신진대사 저해 또는 미토콘드리아 기능장애로 인한 세포사는 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)법을 이용하여 결정하였다(Mosmann, J. Immunol Methods, 16:55-63, 1983).

구체적으로, 세포를 혈청-유리 배지(serum-free medium)로 세척한 다음, 5 mM 3-NP 단독 또는 다양한 농도의 GTS의 존재하에 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 세포를 3-NP로 처리하기 전에 GTS로 5분 동안 전처리한 다음 혈청-유리 배양 배지에서 24시간동안 배양한 후, 배양액은 세포 생존(cell viability) 기간(extent)동안 공급하였다. 세포 생존율은 MTT 테스트(test) 법을 이용하여 살아있는 세포에 존재하는 디히드로게나제 활성을 검출하여 측정하였다. PBS에서 MTT 용 액(1 ㎎/㎖)의 표준용액(aliquot) 50 ㎕를 세포에 직접적으로 첨가한 다음, 포르마잔에 신진대사시키기 위하여 MTT 용액으로 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상청액은 흡출시키고 포르마잔을 용해시키기 위하여 100 ㎕ DMSO를 가하였다. OD(optical density)를 560 nm 파장에서 automated spectrophotometric plate reader로 측정하였으며, 대조군과 비교한 상대적인 세포 생존율을 결정하였다.

실험결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 3-NP 처리에 의해 세포 생존율이 51 ± 2%까지 감소하였으나, 홍삼 사포닌 혼합물을 전(前)처리한 경우 용량-의존적으로 세포 생존율이 유의적으로 증가됨을 관찰할 수 있었다. 세포 생존율은 홍삼 사포닌 혼합물 3, 10, 30 및 100㎍/㎖에 대하여 각각 68.7 ± 1.6, 77.8 ± 1.9, 84.4 ± 2.0 및 92.1 ± 2.1%로 증가하였으며, 홍삼 사포닌 혼합물 1 ㎍/㎖에서는 유의적인 효과가 관찰되지 않았다.

<4-2> DNA 래더링(laddering) 측정

DNA 래더(ladder)를 측정하기 위하여, PBS(pH 7.4)에서 배양된 세포를 수확한 다음 4℃, 12000 × g에서 5분 동안 원심 분리하였다. 키트(GeneAll^TM)를 이용하여 대조군, 3-NP 단독 또는 GTS군 및 3-NP 투여군에서 배양된 세포로부터 DNA를 추출하였다. DNA 단편은 50V에서 1시간동안 1.4% 아가로스 겔 전기이동법으로 측정하였으며, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색시켰다.

실험결과, 홍삼 사포닌 혼합물은 3-NP에 의해 유도된 핵의 DNA 절편화를 저해시킴을 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 5: 데이터 분석

모든 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 나타내었으며, 통계분석을 위하여 다중분석에 사용되는 Tukey' test 및 스튜던트 T 테스트에 의한 ANOVA 분석법을 사용하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 홍삼 사포닌 혼합물은 헌팅톤병(Huntington's disease)과 유사한 임상적 증상을 유발시키는 것으로 알려진 3-NP에 의해 유도되는 선조체 신경독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아 손상을 유의적으로 억제시키므로, 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품을 제공하는 효과가 있다.

Claims

진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Ro 및 Ra를 필수적으로 함유하는 홍삼 사포닌 혼합물을 0.25~1.0 중량% 함유하는 3-NP(3-nitropropionic acid)에 의해 유발되는 선조체 신경 독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아의 손상에 의해 발생하는 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 또는 치료용 조성물.
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진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Ro 및 Ra를 필수적으로 함유하는 홍삼 사포닌 혼합물을 0.25~1.0 중량% 함유하는 3-NP(3-nitropropionic acid)에 의해 유발되는 선조체 신경 독성, 운동신경 손상, 세포내 칼슘이온 농도 증가 및 미토콘드리아의 손상에 의해 발생하는 인지장애, 운동장애, 성격장애 또는 헌팅톤병의 예방 또는 개선효과를 나타내는 건강기능식품.
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