KR100720970B1

KR100720970B1 - 진세노사이드 Ｒｂ₁을 함유하는 뇌세포 또는 신경세포보호제

Info

Publication number: KR100720970B1
Application number: KR1020017007448A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 사카나카; 쥰야 다나카; 코지 사토
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2007-05-22
Also published as: US6579853B2; KR20010101218A; US20020002141A1; EP1142903A9; JP2000191539A; EP1142903A4; WO2000037481A1; CN1331698A; TWI248361B; EP1142903A1

Abstract

본 발명은, 세포 보호제로서 유용한 진세노사이드 Rb₁혹은 그 염의 유효한 투여용 제제를 제공한다. 보다 상세하게는, 진세노사이드 Rb₁혹은 그 염을 함유하는 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사 억제용 의약 조성물, 또는 세포사 억제 유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키기 위한 의약 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염을 함유하는 정맥내 투여용 제제를 제공하는 것이다.

본 발명은, 저농도, 바람직하게는 1 ng/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 1∼100 fg/㎖의 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 의약 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 의약 조성물은, 세포사 억제 유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키며, 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사를 억제하는 작용을 가진다. 게다가, 본 발명은, 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 정맥내 투여용 제제에 관한 것으로서, 특히 뇌ㆍ신경 질환을 치료, 예방 또는 처치하는데 유용하다.

Description

진세노사이드 Ｒｂ₁을 함유하는 뇌세포 또는 신경세포 보호제{Brain cell or nerve cell-protective agents comprising ginsenoside Rb1}

본 발명은, 세포 보호제로서 유용한 진세노사이드 Rb₁또는 그 염에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 진세노사이드 Rb₁혹은 그 염을 함유하는 아포토시스(apoptosis) 또는 아포토시스성 세포사 억제용 의약 조성물, 또는 진세노사이드 Rb₁혹은 그 염을 함유하는 세포사 억제 유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키기 위한 의약 조성물에 관한 것이고, 더욱 상세하게는, 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 정맥내 투여용 제제인 의약 조성물에 관한 것이다.

원래, 뇌졸중(뇌혈관 장해)의 치료법은, 뇌경색ㆍ뇌색전ㆍ뇌출혈ㆍ일과성 뇌허혈 발작ㆍ거미막하출혈에서 각각 다르고, 엄밀하게는 뇌의 CT검사를 실시하지 않으면 효과적인 대책을 세울 수 없는 것이 현실이다. 예를 들면, 혈전 용해제 등은 뇌경색ㆍ뇌색전에만 사용되고, 뇌출혈에는 금기로 되어 있다. 그러나, 뇌졸중은 가급적 신속하게 병소 부위(lesion site)의 신경세포를 보호하는 처치가 행해지지 않으면, 이후 영구적으로 고차 기능장해를 가져오거나 생명 예후에 영향을 주는 중독(重篤)적인 질환이기 때문에, 한시라도 빨리 치료를 개시해야 하는 질환이다. 극단적으로 말하자면, 뇌의 CT 검사를 실시하는 시간조차도, 뇌졸중 환자에게 있어서는 회복할 가능성을 적게 만드는 요인이 되는 것이다. 실로 급성기 뇌졸중의 치료는, 뇌졸중 그 자체의 병변 뿐만 아니라 발증 후에 있어서의 시간과의 싸움이라고 해도 과언이 아니다. 다만 유감스럽게도, 뇌졸중 병태(뇌경색ㆍ뇌출혈ㆍ뇌색전ㆍ거미막하출혈ㆍ일과성 뇌허혈 발작)의 여하를 막론하고, 뇌졸중이 발증되었다고 여겨지는 환자에게 신속히 투여되어, 현저한 효과를 발휘하는 약물이 거의 없는 것이 현재의 실정이다.

한편, 진세노사이드 Rb₁은, 하기 구조식으로 나타내어지는 화합물이고, 진세노사이드 Rb₁은 시바타 등(Shibata S., et al., Economic and medicinal plant research, World Scientific, Philadelphia, pp 217-284, 1985) 등에 의해 공지된 물질이다:

진세노사이드 Rb₁의 복강내 투여에 의해 지금까지 향신경작용인 정온 작용만이 보고되어 있지만(Yoshimura H. et al., Eur. J. Pharmacol., 146, 291-297, 1988), 그 작용 메카니즘에 대해서는 전혀 해명되어 있지 않다. 또, 중추신경계에 있어서는, 진세노사이드 Rb₁과 진세노사이드 Rg₁의 혼합물(혹은 농도가 10^-6M 내지 10^-7M 인 진세노사이드 Rb₁또는 진세노사이드 Rg₁)이, 아세틸콜린 함유 신경세포를 활성화시켜 알츠하이머병에 효능을 나타낼 가능성이 있는 것으로 보고되어 있지만(미국특허 : US, A, 5,137,878 : Composition and method for treatment of senile dementia), 아세틸콜린 세포의 기능장해가 바로 알츠하이머병의 주요 원인이라고 말하기는 어렵기 때문에, 이 가설에는 해결되어야 할 문제가 산적되어 있다.

게다가, 진세노사이드 Rb₁단독에 의한 신경세포 보호작용에 대해서는, 본 발명자들이 진세노사이드 Rb₁에 대한 연구를 착수하기 전까지는 거의 해명되어 있지 않았다. 본 발명자들은 지금까지 진세노사이드 Rb₁이 아세틸콜린 함유 신경세포 이외에 있어서도 보호 효과를 발휘하는지의 여부를 게르빌루스쥐(gerbils)의 일과성 전뇌 허혈 모델을 사용하여 조사하여 왔다. 이 뇌 허혈 모델 동물에서는, 뇌의 온도를 37℃로 유지한 상태에서 3분 내지 5분간 총경동맥 혈류를 차단하면 혈류 차단 시간에 따라 허혈 후 일주일 이내에 해마 CA1 추체 신경세포(아세틸콜린 비함유)가 변성 탈락하고(이것을 지발성 신경세포사라 한다), 이 동물의 학습행동 기능도 저하됨이 증명되었다(Wen T.-C. et al., Acta Neuropathol., 91, 15-22, 1996). 즉, 게르빌루스쥐의 일과성 전뇌 허혈 모델은 인간의 일과성 뇌 허혈 발작의 병태를 반영한다고 말할 수 있다.

본 발명자들은 게르빌루스쥐의 복강내에 미리 진세노사이드 Rb₁(10 ㎎/㎏ 또는 20 ㎎/㎏)을 하루 1회씩 1주일간 주입해 놓으면, 5분간의 총경동맥 혈류 차단에 따른 지발성 신경세포사와 학습행동 장해가 유의적으로 경감된다는 것을 증명하였다(Wen T.-C. et al., Acta Neuropathol., 91, 15-22, 1996). 그러나, 5분간 혹은 3분간의 총경동맥 혈류 차단 직후에 진세노사이드 Rb₁을 복강내에 주입했을 때에는 그러한 효과가 관찰되지 않았다(Wen T.-C. et al., Acta Neuropathol., 91, 15-22, 1996 ; Lim J.-H. et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997). 따라서, 이 시점에서 말초(복강내)에 투여된 진세노사이드 Rb₁의 뇌내 이행율 및 이행 속도는 매우 낮을 것으로 예상되기 때문에, 진세노사이드 Rb₁은 해마 CA1 추체 신경세포의 보호라고 하는 관점에서 본다면, 그 임상응용의 가능성은 전무한 것으로 생각되었다.

상기와 같은 말초(복강내) 투여 대신, 진세노사이드 Rb₁을 3분 혹은 3.5분 동안 총경동맥 혈류를 차단한 직후에 직접 뇌실내로 지속적으로 주입하면 지발성 신경세포사와 학습행동 장해가 억제되는 것으로 보고되어 있다(Lim J.-H. et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997). 또한, 뇌졸중 이발증 고혈압 자연발증(spontaneous hypertensive stroke-prone, SH-SP) 래트의 중대뇌동맥 피질지(MCA) 영구폐색 모델(뇌경색 래트)에 있어서도, 진세노사이드 Rb₁을 MCA의 영구폐색 직후부터 뇌실내로 지속적으로 주입하면, 대뇌피질 경색소가 유의적으로 축소되고 이 동물의 장소학습 장해도 경감한다는 것이 판명되었다(Zhang B. et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998).

그러나, 그 외의 펩티드성 성장 인자와 마찬가지로(Sakanaka M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4635-4640, 1998 ; Wen T.-C. et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998), 가령 진세노사이드 Rb₁이 뇌실내로의 직접 투여에서 효과를 나타낸다고 해도 투여 경로의 문제에서 보면 역시 사람의 일과성 뇌허혈 발작이나 뇌경색 증예에 진세노사이드 Rb₁을 응용한다는 것은 불가능하다고 생각되었다.

또, 진세노사이드 Rb₁의 말초(복강내) 투여에 따른 신경세포 보호작용의 메카니즘에 대해서, 본 발명자들은 지금까지 저농도(1∼100fg/㎖)의 이 약물을 미리 배양액에 혼합해 두면 하이드록시 라디칼 유발제(황산제1철)에 의해서 신경세포의 괴사(네크로시스, necrosis)가 경감됨을 보고하였다(Lim J.-H. et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997 ; Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998). 본 발명자들은, 진세노사이드 Rb₁이 하이드록시 라디칼을 소거함으로써, 세포막의 과산화지질을 감소시키고 배양 신경세포를 보호하는 것으로 추측하였지만, 지금까지 이 가설을 증명했다는 보고는 없다.

또한, 고농도(0.11∼11㎍/㎖)의 진세노사이드 Rb₁이 글루타민산의 신경 독성을 경감시켜 신경세포사를 예방한다는 것(Kim Y.-C., et al., J. Neurosci. Res., 53, 426-432, 1998), 혹은 500μM(550㎍/㎖)이라는 고농도의 진세노사이드 Rb₁이 아포토시스성 신경세포사를 예방할 가능성이 있다는 것(Tanaka T. et al., The Ginseng Review, 24, 61-65, 1998)이 배양 실험을 통해 보고되었지만, 고농도의 진세노사이드 Rb₁은 본 발명자들의 배양 실험에 의하면 오히려 신경 독성을 나타내는 것으로 판명되었다(Lim J.-H. et al., Neurosci. Res, 28, 191-200, 1997 : Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998).

게다가, 이와 같이 고농도의 진세노사이드 Rb₁을 생체내의 세포 외액에서 재현시키는 것은 매우 어려울 뿐만 아니라, 비용 면이나 부작용 출현의 가능성을 고려하는 측면에서도 대량의 진세노사이드 Rb₁을 생체에 투여하는 것은 불가능하다. 실제로, 지금까지의 본 발명자들의 실험 결과에서도 고용량의 진세노사이드 Rb₁이 생체에 있어서 반드시 바람직한 효과 및 효능을 가져오는 것은 아니라는 것이 판명되었다(Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998).

즉, 진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포 보호작용의 메카니즘은 아직까지도 충분히 해명되어 있지 않은 실정이다. 만약, 진세노사이드 Rb₁의 작용 메카니즘이 해명된다면, 이 약물의 새로운 효능ㆍ이용 가능성이 발굴되리라 기대된다. 또한, 진세노사이드 Rb₁이 생체내에서 아포토시스성 세포사를 실제로 억제하고 있는 지에 대해서도 아직 밝혀지지 않았다.

본 발명자들은, 진세노사이드 Rb₁이 1 fg/㎖ 내지 100 fg/㎖ 라고 하는 세계에서 그 유래를 찾아보기 힘든 저농도 범위에서 세포사 억제 유전자 산물 Bcl-x_L의 발현 증가를 촉진함으로써 아포토시스성 신경세포사를 억제한다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명에서 진세노사이드 Rb₁은 세계적으로 유일한 비펩티드성의 Bcl-x_L 발현 증가제이라는 것이 발견되었다. 또한, 농도 100 fg/㎖에서는 진세노사이드 Rb₁의 과산화지질 생성억제 효과가 미미하게 관찰되었지만, 그보다 낮은 농도 범위에서는 그와 같은 효과는 관찰되지 않았다. 따라서, 진세노사이드 Rb₁의 작용 메카니즘에 관한 종래의 가설은 타당하지 않음이 판명되었다. 또한, 생체내에 있어서도 진세노사이드 Rb₁이 아포토시스성 신경세포사를 억제하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은, 진세노사이드 Rb₁이 정맥내에 투여됨으로써, 이제까지 전혀 예상조차 할 수 없었던 우수한 뇌경색 억제 작용 및 장소학습 장해에 대한 개선 작용을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 정맥내 투여에 의해 우수한 뇌경색 치료 효과 및 뇌혈관성 치매 억제 작용을 나타내고, 나아가 세포사 억제 유전자인 Bcl-x_L의 발현을 촉진함으로써 세포를 보호하는 약물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 세포 보호제로서 유용한 진세노사이드 Rb₁또는 그 염의 유효한 투여용 제제를 제공한다. 보다 상세하게는, 진세노사이드 Rb₁ 혹은 그 염을 함유하는 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사 억제용 의약 조성물 또는, 진세노 사이드 Rb₁혹은 그 염을 함유하는 세포사 억제유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키기 위한 의약 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 뇌ㆍ신경 질환의 치료, 예방 또는 처치 등을 위해 유용한 정맥내 투여용 제제를 제공하는 것이다.

본 발명은, 저농도의 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사 억제용 의약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을 함유하는 세포사 억제유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키기 위한 의약 조성물에 관한 것이다.

이들 본 발명의 의약 조성물은, 정맥내 투여용 제제인 것이 바람직하지만, 다른 임의의 투여 경로를 채용할 수도 있다.

게다가, 본 발명은 진세노사이드 Rb₁또는 그 염을, 바람직하게는 저농도로 함유하는 뇌ㆍ신경질환의 치료, 예방 또는 처치 등을 위한 의약물 조성물, 바람직하게는 정맥내 투여용 제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기의 정맥내 투여용 제제를 함유하는 뇌ㆍ신경질환의 치료, 예방 혹은 처치제, 또는 뇌세포 혹은 신경세포 보호제, 이들 질환의 치료, 예방 또는 처치 방법, 및 이들 의약을 제조하기 위한 진세노사이드 Rb₁또는 그 염의 사용에 관한 것이다.

제 1도는, 물속 미로 찾기 테스트의 결과를 나타내는 도면이다. 제 1도의 좌측은 2주 째의 결과이고, 우측은 4주 째의 결과이다. 또 제 1도 중의 검은 동그라미 표시(●)는 모의 수술을 한 래트의 것이고, 흰 동그라미 표시(○)는 수술 후에 생리 식염수만을 투여한 것이며, 검은 네모 표시(■)는 진세노사이드 Rb₁을 6 ㎍/일 투여한 것이고, 흰 네모 표시(□)는 진세노사이드 Rb₁을 60 ㎍/일 투여한 것이다.

제 2도는, 대뇌피질 경색 비율을 나타내는 도면이다.

제 3도는, 대뇌피질 경색소의 사진이고, 그 중 (A)는 생리식염수를 투여한 예이고, (B)는 진세노사이드 Rb₁를 투여한 예이다.

제 4도는, 뒤에 설명하는 실시예 1의 결과를 종합한 모식도이다.

제 5도는, 진세노사이드 Rb₁의 막지질에 대한 과산화 방지 효과가 매우 미약함을 나타내는 도면이다.

제 6도는, 진세노사이드 Rb₁이 니트로플루시드나트륨(SNP)에 의한 신경세포사 (아포토시스)를 억제하는 것을 나타내는 그래프이다. 제 6도의 좌측은, SNP 처리를 하지 않은 경우의 결과를 나타내고, 우측은 SNP 처리를 한 경우의 결과를 나타낸 것이다. 또한, 검게 칠해진 것은 SNP 처리 전후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이고, 사선이 그어져 있는 것은 SNP 처리 후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이 다.

제 7도는, 진세노사이드 Rb₁에 의한 Bcl-x_L mRNA 발현 증강 효과를 나타내는 도면대용 사진이다.

제 8도는, 진세노사이드 Rb₁에 의한 Bcl-x_L 단백질에 대한 웨스턴 블로팅(Western blotting)의 결과를 나타내는 도면대용 사진이다.

제 9도는, 진세노사이드 Rb₁에 의한 Bcl-x_L 단백질에 대한 웨스턴 블로팅의 결과를 정량화한 그래프이다.

제 10도의 (A), (B) 및 (C)는, 진세노사이드 Rb₁이 성숙뇌에 있어서 병적 아포토시스성 신경세포사를 억제하는 것을 나타내는 도면대용 사진이다. 제 10도의 (D)는, 그 결과를 정량화한 그래프이다.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

본 발명의 진세노사이드 Rb₁은 상기 구조식으로 나타내어지며, 이 진세노사이드 Rb₁은 예를 들면, 시바타 등의 방법(Shibata S. et al., Economic and medicinal plant research, world Scientific, philadelphia, pp 217-284, 1985)에 따라 분리ㆍ정제할 수 있다. 이와 같은 방법에 의해 정제된 것은 그 순도가 98% 이상임이 박층크로마토그래피를 비롯한 핵자기공명 스펙트럼에 의해 확인되었다(Kawashima Y. and Samukawa K., J. Med. Pharmacol. Soc. Wakan-Yaku, 3, 235-236, 1986). 본 발명의 진세노사이드 Rb₁은 고순도인 것을 사용하는 것이 바람직하지만, 약용 인삼 등 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 천연물로부터의 추출 혼합물을 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁은 유리된 것을 사용할 수도 있지만, 그것을 적당한 염으로 하여 사용할 수도 있다. 또한 그들의 수화물과 같은 용매화물로서 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 진세노사이드 Rb₁의 농도는, 저농도인 경우가 바람직하고, 보다 구체적으로는, 세포 외액의 농도가 1 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 1 pg/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 100 fg/㎖ 이하인 농도이다. 본 발명의 진세노사이드 Rb₁을 정맥내 투여용 제제로서 사용하는 경우에도, 환자의 환부에 있어서의 세포 외액 농도가 상기의 농도가 되도록 제제를 조제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물이나 제제는, 환부의 세포외액 농도가 1∼100 fg/㎖ 정도이더라도 충분한 효과를 얻을 수 있다. 저농도에서의 진세노사이드 Rb₁의 사용이 바람직하다는 점이 본 발명의 특징 중 하나이다.

본 발명의 또 다른 특징은, 진세노사이드 Rb₁을 정맥내 투여용 제제로서 사용하는 점이다. 놀랍게도, 정맥내에 투여된 진세노사이드 Rb₁은 종래의 말초(복강내) 투여에 의한 것과는 달리, 뇌ㆍ신경계에 신속히 전달된다는 것을 발견한 것이다. 본 발명의 정맥내 투여용 제제는 혈관내, 바람직하게는 정맥에 직접 투여할 수 있는 것이면 되고, 또한 일회 정맥내 주입용 제제, 혹은 정맥내 지속 투여용 제제일 수 있다. 또한, 점적용 조성물 등과 같이 정맥 투여 제제에 첨가하여 사용할 수 있는 제형일 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rb₁은, 정맥내 투여의 경우에서 뇌경색소를 비투여군의 1/4 정도까지 축소시키고, 게다가 세포사 억제 인자인 Bcl-x_L의 발현을 증강시키는 독특한 작용 메카니즘을 가지며 뇌의 신경세포를 보호하는 것으로, 급성기ㆍ만성기의 뇌경색 뿐만 아니라 뇌출혈ㆍ거미막하출혈ㆍ뇌색전의 급성기나 만성기 혹은 일과성의 뇌허혈 발작에 대해서도 신경 보호약으로서 사용할 수 있다.

즉, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁은, 뇌졸중이 의심되는 환자에 대해서 구급차 내에서도 점적 정주(drip infusion)가 가능한 약물이다. 뇌허혈이라는 병태는 뇌경색 이외에, 심부전, 중증 빈혈, 호흡장해, 심정지, 심실세동에 동반하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 질환으로부터 뇌를 지켜 환자의 예후를 개선하기 위해서라도, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 의약 조성물은 매우 유효한 것이다.

또한, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 의약 조성물은, 아포토시스성 신경세포사를 동반하는 그 외의 1차성 및 2차성 신경변성 질환(알츠하이머병, 피크병(Pick's diseases), 척수소뇌 변성증, 파킨슨씨병, 무도병, 녹내장, 노인성 황반 변성증, 근위축성 측삭 경화증, 에이즈 뇌증(AIDS encephalopathy), 간성뇌증, 뇌염, 뇌성마비, 망막색소 변성증, 두부외상, 척수손상, 일산화탄소 중독, 망막박리, 신생아 가사, 당뇨병성 망막증, 말초신경장해 등) 등에도, Bcl-x_L단백질의 발현 증강을 통한 효능의 발휘가 기대된다.

또한, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁의 약제로서의 특징 중, 현재 간과할 수 없는 것은 이렇다 할 부작용이 나타나지 않는다는 점이다. 예를 들면, 일산화질소의 공여체인 니트로플루시드나트륨(SNP, sodium nitroprusside) 처리를 하지 않은 통상의 배양 신경세포에 진세노사이드 Rb₁을 첨가해도 대사 활성에 전혀 영향을 주지 않으며, SNP 처리에 의해 손상된 신경세포만을 저농도(1∼100 fg/㎖)의 진세노사이드 Rb₁이 보호하기 때문에(실시예 3참조), 진세노사이드 Rb₁은 정상 신경조직의 기능에는 그다지 영향을 주지 않고 병변부에만 바람직한 효과를 발휘할 수 있다. 이 점은, 신경 보호약으로서 개발 중에 있는 글루타민산수용체 길항약보다도 훨씬 우수한 특성이라고 할 수 있다.

또한, 진세노사이드 Rb₁을 뇌실내에 투여하더라도 뇌의 온도, 뇌혈류, 혈압 등에는 영향을 미치지 않음이 이미 보고되었다(Lim J.-H. et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997 ; Zhang B. et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998). 물론, 본 발명자들이 이번의 각 실험예에 있어서 본 발명의 진세노사이드 Rb₁을 투여한 동물을 주의 깊게 관찰한 범위 내에서도 부작용은 검출되지 않았다.

본 발명의 진세노사이드 Rb₁가 MCA 영구 폐색 래트(체중 약 300g)에 1일 6 ㎍ 또는 1일 60 ㎍의 투여량으로 투여된 경우, 뇌경색소를 축소시켜 장소학습 장해(뇌혈관성 치매)를 개선한다는 실험 결과를 근거로 한다면, 체중 60 ㎏의 인간 뇌졸중 환자에게 투여되는 양은, 단위 체중으로 환산하면 하루 1.2 ㎎ 내지 12 ㎎이라는 말이 된다. 그러나, 일반적으로 동물의 체중이 증가함에 따라 단위 체중 당 필요한 약물 투여량이 감소한다는 점으로부터, 1.2 ㎎ 이하의 용량으로도 충분히 그 효능을 나타낼 것으로 생각된다. 본 발명의 의약 조성물을 인간 뇌졸중 환자에게 투여할 경우의 하루 투여량으로서는 환자의 개인차나 증상에 따르기도 하지만, 0.1 ㎎ 이상, 바람직하게는 1 ㎎ 이상, 보다 바람직하게는 10 ㎎ 이상이다. 진세노사이드 Rb₁또는 그 염의 환부 조직에 있어서의 세포외액 농도가 1 ng/㎖ 이하로 유지되는 경우, 0.1 ㎎/일 미만의 투여량이 또한 예측된다. 전신적으로 일일 투여하기 위한 진세노사이드 Rb₁또는 그 염의 최소 투여량은 시험관내 진세노사이드 Rb₁또는 그 염의 유효 농도 범위를 기준으로 하여 약 10 fg이다. 본 발명의 의약 조성물은 부작용이 적기 때문에, 투여량의 상한을 상당히 다량으로 할 수도 있지만, 1일 당 1 g 이하, 바람직하게는 0.1 g 이하이다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 방법으로서는 정맥 투여가 바람직하고, 상기한 투여량을 단속적 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 유효 성분인 진세노사이드 Rb₁은 사포닌의 일종으로 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 수용성 의약 조성물은, 동결 건조 결정을 생리 식염수, 증류수, 인산 완충액, 포도당액 등에 용해시킴으로써 정맥 투여 제제로 만들 수 있다. 또한 지방 유제, 리포솜 제제로서도 사용가능하다. 정맥 투여로 할 경우 제제의 농도로서는, 그다지 고농도가 아닌 한 임의의 농도로 조정할 수가 있고, 예를 들면, 0.01∼10 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.1∼1 ㎎/㎖ 정도로 하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 동물 실험에 있어서는, 좌중대뇌동맥 피질지(MCA)의 영구 폐색후 28일 간에 걸쳐서 진세노사이드 Rb₁을 정맥내에 지속적으로 주입했지만, 실제의 급성기 뇌졸중의 증례에서는 발증 후 2주일 이내에 병변이 진행하는 경우가 많기 때문에, 이 기간 만큼이라도 진세노사이드 Rb₁을 투여하면 충분한 효과를 기대할 수 있다. 또, 진세노사이드 Rb₁의 실용화에 따라, 뇌졸중 환자의 뇌혈관 재건술ㆍ재관류술으로의 적용도 확대되고 있는 것으로 생각된다.

본 발명은, 과거에 그 유례가 없는 저농도에서 진세노사이드 Rb₁이 Bcl-x_L단백질의 증가를 촉진시킴으로써 아포토시스 혹은 아포토시스성 세포사를 억제함을 세계 최초로 보고하는 것이다. 저농도에서 진세노사이드 Rb₁이 단백질 Bcl-x_L의 증가를 촉진함으로써 아포토시스 혹은 아포토시스성 세포사를 억제한다고 하는 것은, 진세노사이드 Rb₁이 단순히 중추 신경 질환뿐만 아니라 아포토시스를 동반하는 말초 조직의 질환(예를 들면, 장기 이식후의 거부 반응, 심근ㆍ간장ㆍ신장의 허혈 재관류 장해, 심근경색, 말초동맥 폐색증, 말초순환부전, 욕창, 자기면역병, 면역부전병)에도 유효하다는 것을 말해주는 것이다. 게다가, 이들 말초 조직의 질환에 대해서는, 신경 질환에 사용되는 용량보다도 적은 양의 진세노사이드 Rb₁로 충분히 그 효과ㆍ효능이 발휘된다.

다음은, 본 발명에 따른 저농도에서의 진세노사이드 Rb₁의 작용에 대해서 상세하게 설명한다.

먼저, 본 발명자들은, 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 주입에 따른 작용을 검토했다. 이를 위해서, 예를 들어, 12∼13주령의 수컷 SH-SP 래트(체중 250∼300g)를 사용하였다. 이 동물은 12시간 주기의 명암 사이클실에서 사육하였고, 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 이 동물의 좌중대뇌동맥 피질지(MCA)를 응고ㆍ절리하였다. 진세노사이드 Rb₁을 MCA 영구 폐색 직후 일회 정맥내에 주입하고(6 ㎍ 또는 60 ㎍), 그 후 알자 미니 침투압 펌프(Alza mini osmotic pump)를 사용하여 28일간 정맥내에 지속적으로 주입(6 ㎍/일 또는 60 ㎍/일)하였다.

또한, MCA를 폐색한 대조군 동물(허혈 콘트롤 동물)과, 모의 수술을 한 동물에게는 같은 양의 생리 식염수만을 투여하였다.

MCA 영구 폐색후 통상 방법에 따라(Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998), 2주 째와 4주 째에 각각 4일간 물속 미로 찾기 테스트를 실시하여, SH-SP 래트의 장소학습 능력을 측정하였다.

그 결과를 제 1도에 나타내었다. 제 1도의 좌측은 2주 째의 결과이고, 우측은 4주 째의 결과이다. 또, 제 1도 중의 검은 동그라미 표시(●)는 모의 수술을 한 래트의 것이고, 흰 동그라미 표시 (○)는 수술 후에 생리 식염수만을 투여한 것이며, 검은 네모 표시 (■)는 진세노사이드 Rb₁을 6 ㎍/일 투여한 것이고, 흰 네모 표시 (□)는 진세노사이드 Rb₁을 60 ㎍/일 투여한 것이다.

제 1도와 같이 MCA 영구 폐색 후(뇌경색 후)의 장소학습 장해가, 생리 식염수를 주입한 뇌경색군과 비교했을 때 유의적으로 개선되었다. 특히, MCA 폐색후 2 주 째와 4주 째의 물속 미로 찾기 테스트에서, 저용량의 진세노사이드 Rb₁에서는 각각 3일 째와 4일 째의 시행에서, 고용량의 진세노사이드 Rb₁에서는 2주 째의 4일 째 및 4주 째의 3일 째, 4일 째의 시행에서 유의적인 학습능력 개선효과를 나타내었다. 또한, 4주 째의 첫날에도 고용량ㆍ저용량에서 모두 유의적인 효과가 확인되었다. 또, SH-SP 래트의 수영 속도에는 각각의 군에서 그 유의차는 볼 수 없었다.

4주 째의 물속 미로 찾기 테스트의 종료 후, SH-SP 래트를 포수클로랄로 마취하고, 4%의 파라포름알데히드를 함유하는 0.1몰의 인산 완충액으로 경심적으로 (transcardially) 관류 고정하였다. 그 후, 상기 동물의 뇌를 적출하여 대뇌피질 경색소의 사진을 촬영하였다. 좌대뇌반구 면적과 좌대뇌피질 경색 면적을 사진 상에서 화상해석장치를 사용하여 계측하고, 좌대뇌피질 경색 면적을 좌대뇌반구 면적으로 나눔으로써 대뇌피질 경색 비율(%)을 산출하였다. 그 결과를 제 2도에 나타내었다.

제 2도에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여 뇌경색군에서 생리식염수 투여 뇌경색군에 비해 대뇌피질 경색 비율도 유의적으로 감소하였다. 이 대뇌피질 경색 비율은 경색 면적을 토대로 하여 산출한 것이지만, 그 비율의 평균값이 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여군에서 생리식염수 투여군의 50% 이하로 저하된 것으로부터, 실제의 경색 체적은 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여로 인해 4분의 1 정도로 축소된 셈이 된다.

제 3도의 (A)에 생리식염수 투여 뇌경색소, 제 3도의 (B)에 진세노사이드 Rb₁(6 ㎍/일) 투여 뇌경색소의 실례를 나타내었다.

또, 제 4도에 본 실험 결과를 종합한 모식도를 나타내었다. 생리 식염수 투여군에서는 뇌경색 병소부의 크기가 커진 상태 그대로이고, 물속 미로 찾기 테스트에 있어서는 목적 플랫폼에 도달하기까지 시간을 요하고 있음에 반해, 본 발명에 따른 진세노사이드 Rb₁투여군에 있어서는 병소부가 회복되거나 축소되었고, 이 결과 물속 미로 찾기 테스트에 있어서는 목적 플랫폼에 단시간 내에 도달하였다.

게르빌루스쥐의 일과성 전뇌허혈 모델을 사용한 종래의 논문(Wen T.-C., et al., Acta Neuropathol., 91, 15-22, 1996)에서는, 진세노사이드 Rb₁의 복강내 투여(10 ㎎/㎏/일 또는 20 ㎎/㎏/일)를 허혈 부하 전에 실시해도 약 30%의 해마 CA1 추체 신경세포밖에 구제할 수 없었다. 물론, 진세노사이드 Rb₁을 게르빌루스쥐의 복강 내로 허혈 후에 투여해도 전혀 효과가 없었다. 게다가 복강내에 투여된 진세노사이드 Rb₁의 1일량은, 게르빌루스쥐의 체중(70g 전후)으로부터 판단하면 0.7 ㎎ 내지 1.4 ㎎ 이라는 고용량이 되기 때문에, 진세노사이드 Rb₁의 투여효율ㆍ효능이라는 관점에서 판단하더라도 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여는 복강내 투여보다도 훨씬 우수한 투여 방법이고, 사람에게의 응용이 용이하다. 주지하고 있는 것처럼, 사람에 있어서 약물을 복강내에 투여하는 방법은 극히 일부의 예외(복막관류 등)를 제외하고는 거의 실시되고 있지 않다.

또, 본 실시예에서 사용한 MCA 영구 폐색 동물(뇌경색 래트)은 명백히, 게르빌루스쥐의 일과성 전뇌허혈 모델보다도 중독적이며 게다가 사람의 병태에 가까운 모델이다. 따라서, 이 MCA 영구 폐색 동물에 있어서, 진세노사이드 Rb₁을뇌혈관 폐색 후 정맥 내로 투여하여 현저한 효과를 나타냈다는 것은, 소량의 진세노사이드 Rb₁정맥내 주입의 유용성, 편리성, 경제성을 분명히 하고 있다.

한편, MCA 영구폐색 동물의 뇌실 내에 진세노사이드 Rb₁을 직접 주입하여 그 효과를 조사한 종래의 논문에서는(Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998), MCA 폐색 후에 0.6 ㎍/일의 용량으로 진세노사이드 Rb₁을 뇌실 내에 지속적으로 주입했을 때만 유의적인 뇌경색 억제효과를 나타냈지만, 그 효과는 본 실시예에서 나타낸 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여 효과와 동등 내지는 그것보다 약간 떨어지는 것이었다. 또, 진세노사이드 Rb₁의 뇌실내 투여에 대하여 앞서 게재한 논문에 있어서, 그 외의 용량(6 ㎍/일, 0.06 ㎍/일)으로 MCA 영구 폐색 후에 진세노사이드 Rb₁을 뇌실 내에 지속적으로 주입하더라도 뇌경색 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았기 때문에, 진세노사이드 Rb₁의 뇌실내 투여의 유효 농도 범위는 극히 좁아, 그 실용화는 어렵다고 판단된다. 게다가, 사람으로의 응용을 고려했을 때, 진세노사이드 Rb₁의 뇌실내 주입은 그 위험성과 효능을 참작했을 경우, 현실적으로 그 실시는 불가능하리라 판단된다.

일반적으로, 신경 보호 인자는 뇌실내 혹은 뇌실질내에 직접 투여한 경우에 가장 큰 효과를 발휘하고, 정맥내 투여나 복강내 투여를 실시한 경우에는, 뇌혈액관문에 의해 차단되어 그 효과ㆍ효능이 격감 혹은 소실된다고 여겨진다. 따라서, 진세노사이드 Rb₁에 관해서도, 그 복강내 투여나 뇌실내 투여의 실험 결과로부터 판단하여 정맥내 투여의 효과ㆍ효능은 전혀 예상할 수 없었다.

그러나, 본 실험예에서 명백해진 바와 같이, 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여는 뇌실내 투여한 경우보다도 넓은 농도 범위에서 MCA 영구 폐색 래트의 뇌경색소를 보다 효과적으로 축소시켜 이 동물의 학습능력을 개선하는 것이 발명되었다. 또, 진세노사이드 Rb₁은 약용 인삼 중에 함유되는 정제 사포닌이지만, 경구 투여에 의해 혈중에서는 전혀 검출되지 않기 때문에, 사실상 진세노사이드 Rb₁자체의 약리 작용은 부정되어 왔다. 따라서, 본 실험예에 의해 정맥내에 투여된 진세노사이드 Rb₁이 약용 인삼과는 독립된 효과ㆍ효능을 가지고 있음이 분명해졌다.

다음으로, 본 발명자들은 진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포막 지질의 과산화 방지 효과 판정의 실험을 실시하였다.

펭 등(Peng H. et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 18, 349-360, 1998)의 방법에 따라, 태생 17일 째의 래트 대뇌피질 신경세포를 무혈청 배양액 중에서 3일간 유지시킨 후, 진세노사이드 Rb₁을 함유하거나 또는 함유하지 않은 신선한 배양액으로 교환하여, 추가로 48시간 배양했다. 그 후, 황산제1철과 아스코르빈산을 함유 하나 진세노사이드 Rb₁을 함유하지 않은 신선한 배양액으로 교환하여 2시간 유지시키고, 하이드록시 라디칼을 발생시켜 신경세포막에 산화적 손상을 주었다. 생성된 신경세포막 과산화지질은 도데실황산나트륨으로 세포를 녹인 후, 티오바르비탈산 (TBA) 고정량에 대한 흡광도 측정에 의해 결정하였다.

본 실험의 목적은, 진세노사이드 Rb₁이 황산제1철에 의한 신경세포괴사(네크로시스)를 억제하는 농도 범위(0.1∼100 fg/㎖)에서 세포막 지질의 과산화를 방지하는 지의 여부를 검토하는 것이다.

그 결과를 제 5도에 나타내었다. 이 실험 결과로부터, 진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포막 지질 과산화 방지의 효과는 100 fg/㎖ 의 농도에서만 미약하게 확인되었지만, 황산제1철의 자유라디칼 장해를 경감하는 0.1∼100 fg/㎖의 농도 범위에서는 지질에 대한 과산화 방지 효과는 확인되지 않았다. 따라서, 진세노사이드 Rb₁은 종래의 논문(Lim J.-H. et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997 ; Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998)에서와 마찬가지로, 0.1∼100 fg/㎖의 농도 범위에서 자유라디칼의 신경 독성을 경감한다는 것은 틀림이 없지만, 그것에 이어서 과산화지질의 생성까지도 억제한다고 하는 종래의 가설은 옳지 않다는 것이 판명되었다. 따라서, 진세노사이드 Rb₁에 대한 새로운 작용 메카니즘의 해석이 필요하게 된다는 것을 본 실험은 명백히 한 것이다.

이 때문에, 본 발명자들은, 진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포사(아포토시 스) 억제 작용을 판정하기 위한 실험을 행하였다.

세포사는 그 형태학적 특징으로부터 네크로시스와 아포토시스로 크게 나뉘어 진다. 다만, 신경세포사에 관해서는, 네크로시스라고 하는 개념은 정착되어 있지만, 다른 한 쪽인 아포토시스에 대해서는 병적 성숙뇌에서 유사한 현상이 관찰되지만 임파구에서 보여지는 것과 같은 전형적인 특징을 나타내는 것이 매우 적다. 따라서 본 명세서에서는 네크로시스와는 달리 서서히 진행하는 신경세포의 사멸을 “신경세포의 아포토시스” 혹은 “아포토시스성 신경세포사”라고 정의하기로 한다.

본 발명자들은, 최근 배양 신경세포를 일산화질소의 공여체인 니트로플루시드나트륨(SNP)에 단시간 폭로시키면 신경세포의 아포토시스가 유도된다는 것을 알아내었다(Toku K., et al., J. Neurosci. Res., 53, 415-425, 1998). 이 배양실험에서는 전형적인 아포토시스의 특징이 관찰되었기 때문에, 본 실험계를 사용하여 진세노사이드 Rb₁의 아포토시스 억제 효과를 판정하기로 했다.

태생 17일 째의 래트 대뇌피질 신경세포를 무혈청 배지 중에서 4일 내지 5일간 유지시킨 후, 진세노사이드 Rb₁을 함유하거나 또는 함유하지 않은 신선한 배지로 교환하여 24시간 배양했다. 그 후, SNP를 100μM의 농도로 배지중에 10분간 첨가하였다. 그 후, 추가로 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 배양액 중에서 16시간 신경세포를 유지시키고, 세포 생존율을 산화환원 색소인 알라마 블루(alamar blue)를 사용하여 측정하였다.

앞에서 설명한 황산제1철 부하 실험에서는 진세노사이드 Rb₁을 미리 배지 중 에 투여해 둔 뒤 그 결과를 판정하였지만, 본 실험에서는 SNP 부하 전후 및 부하 후에 진세노사이드 Rb₁을 배지 중에 첨가하여 그 효과를 조사하였다.

그 결과를 제 6도에 나타내었다. 제 6도의 우측은 SNP 처리를 한 경우의 것이고, 검게 칠해져 있는 것은 SNP 처리 전후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이며, 사선이 그어진 것은 SNP 처리 후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이다.

제 6도에 나타낸 것처럼, 일산화질소의 공여체인 니트로플루시드나트륨(SNP)에 의해 처리되지 않은 경우에, 진세노사이드 Rb₁은 배양 신경세포의 대사 활성에 유의적인 영향을 주지 않는다. SNP 처리를 하면 신경세포사(아포토시스)가 일어나지만, 진세노사이드 Rb₁은 1∼100 fg/㎖의 농도 범위에서 SNP 처리 전후 및 처리 후에 투여한 경우에서도 신경세포의 아포토시스를 유의적으로 억제하고 있다는 것이 판명되었다.

진세노사이드 Rb₁이, 세포 외액의 농도가 1∼100 fg/㎖ 이라는 과거에 그 유래가 없는 저농도에서 신경세포의 아포토시스를 억제한다는 것을 증명한 본 실험 결과는, 진세노사이드 Rb₁을 병적인 아포토시스성 신경세포사의 치료에 이용할 수 있음을 세계 최초로 실증한 것이다.

다음은, 진세노사이드 Rb₁이 Bcl-x_L을 발현시키는 작용을 해석하기 위한 실험을 행하였다.

Bcl-x_L 유전자는 성숙뇌, 면역계 조직, 순환계 조직을 비롯한 많은 조직에서 발현되고 있고, 세포가 생존하는 데 있어서 중요한 역할을 수행하고 있다는 것이 증명되어 있다(Adams J. M. and Cory S., Science, 281, 1322-1326, 1998 ; Boise, L. H., et al., Cell, 74, 597-608, 1993 ; Gottschalk A. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7350-7354, 1994 ; Gonzalez-Garcia M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4304-4308, 1995).

따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁이 Bcl-x_L 유전자의 발현을 증가시키는 지를 조사하였다. 실험 기법은 웬 등의 논문(Wen T. -C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998)에 따랐다. 0 fg/㎖, 1 fg/㎖ 및 100 fg/㎖의 진세노사이드 Rb₁으로 24시간 전처리된 배양 신경세포로부터 총 RNA를 추출하였다. DNase 처리된 총 RNA 3㎍으로부터 올리고 dT 프라이머(oligo dT primer)와 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 유전자 증폭 반응(PCR)은 Taq 폴리메라아제를 사용하여 이하의 조건에서 행하였다. 즉, (1) 94℃, 2분간, (2) 94 ℃, 1.5분간 ; 55℃, 1.5분간 ; 72℃, 2분간을 1 사이클로 하여, Bcl-x_L에 대해서는 25사이클, β-악틴에 대해서는 20사이클, (3) 72℃, 2분간이다.

PCR 산물을, 3% 아가로오스 겔에 영동시키고 에티듐브로마이드 염색하여 가시화하였다. 또한, 내부 표준으로서 β-악틴 mRNA의 발현을 사용하였다. 그 결과를 제 7도에 나타내었다.

또한, 진세노사이드 Rb₁이 신경세포에서의 Bcl-x_L 단백질의 발현을 증강시키는 지를 조사하기 위해, 항Bcl-x_L 단백질 항체를 사용하여 웨스턴 블로트법을 실시하였다. 진세노사이드 Rb₁의 존재하 또는 비존재하에서, 래트 대뇌피질 신경세포를 48시간 배양한 후, 전기영동용 샘플 완충액으로 세포를 용해시켜 전기영동을 실시하였다. 그 후 영동된 물질을 니트로셀룰로오스막에 전사시켜 웨스턴 블로트를 행하였다. 그 결과를 제 8도에 나타내었다.

또한, 항Bcl-x_L 단백질 항체와 반응하는 밴드를 화상해석장치로 정량화하였다. 그 결과를 제 9도에 나타내었다.

제 7도에 나타낸 바와 같이, 1 fg/㎖ 혹은 100 fg/㎖의 진세노사이드Rb₁으로 처리된 배양세포에서는, Bcl-x_L mRNA의 발현이 대조군과 비교하여 증가되었다. 한편, 진세노사이드 Rb₁은 신경세포사 억제 효과를 발휘하는 1∼100 fg/㎖의 농도 범위에서, 신경세포의 Bcl-x_L 단백질 발현량을 약 50% 정도 유의적으로 증가시켰다(제 8도, 제 9도).

신경세포에 있어서의 Bcl-x_L 단백질의 발현 증가를 촉진하는 생리활성 물질로서 지금까지 0.6∼15.0 ng/㎖의 농도 범위를 갖는 인터로이킨 3이 보고되어 있지만(Wen T.-C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998), 진세노사이드 Rb₁의 Bcl-x_L 단백질의 발현 촉진 작용은, 인터로이킨 3보다도 훨씬 저농도에서 발휘되며, 게다가 Bcl-x_L단백질의 발현을 불과 10% 전후밖에 증가시키지 않는 인터로이킨 3보다도 휠씬 강력하였다. 또한, 인터로이킨 3은 뇌실내에 직접 투여하지 않으면 신경세포 보호작용을 나타내지 않지만, 진세노사이드 Rb₁은 정맥내 투여로 뇌의 신경세포를 보호함이 상기에서 설명한 정맥투여의 실험(실시예1)에서 증명되었기 때문에, 진세노사이드 Rb₁은 말초 투여가 가능한 비펩티드성 향신경 약물 중에서 현재 세계에서 유일한 Bcl-x_L 단백질 발현 증강제이다. 지금까지 비펩티드성 약물이 펩티드성 인자(인터로이킨 3)보다도 강력한 Bcl-x_L 단백질 발현 증강을 나타낸다는 것은 예상조차도 하지 못했다. 이와 관련하여, 신경세포에서의 Bcl-x_L의 발현을 비록 미약하나마 증강시키는 펩티드성 인자는, 본 발명자들이 아는 한 인터로이킨 3 밖에 없다.

미토콘드리아 관련 단백질인 Bcl-x_L은 Apaf1과 결합함으로써 Apaf1과 프로카스파아제 9(procaspase 9)와의 결합을 저해한다고 한다(Adams J. M. and Cory S., Science, 281, 1322-1326, 1998). Bcl-x_L단백질의 감소 혹은 기능 저하가 발생하면, Apaf1이 Bcl-x_L 단백질로부터 해리하여 미토콘드리아로부터의 사이토크롬 C의 누출과 더불어 프로카스파아제 9가 활성화된다고 여겨진다(Adams J. M. and Cory S., Science, 281, 1322-1326, 1998). 일단 세포질내의 프로카스파아제 9가 활성화되면 뒤이어 카스파아제 9(caspase 9) 및 카스파아제 3(caspase 3)이 활성화되고, 이들 단백질 분해효소에 의해 세포는 자기 융해하여 사멸(아포토시스)에 이르는 과정이 가속된다. 추측컨대 프로카스파아제 9가 활성화되는 단계에서, 세포가 죽음에 이르는 운명이 결정될 가능성이 높기 때문에, Bcl-x_L단백질의 발현 증가제(진세노사이드 Rb₁)에 의해 프로카스파아제 9의 활성화를 중지시키는 것이 세포사를 방지하기 위한 적절한 대책이라고 생각할 수 있다.

게다가, 진세노사이드 Rb₁에 의한 뇌내의 아포토시스성 신경세포사의 억제효과를 해석하기 위해, 실제로 성숙뇌에서 일어나는 병적인 아포토시스성 신경세포사가 진세노사이드 Rb₁의 투여에 의해 경감되는 지의 여부를 조사하였다. 모델 동물로서 게르빌루스쥐의 3분간 전뇌 허혈 모델을 사용하였다. 이 동물은, 3분 허혈 부하 후 1 주 경과하면 해마 CA1 영역 추체 신경세포의 거의 반정도의 수가 변성 탈락된다는 것이 보고되어 있다(Sakanaka M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4635-4640, 1998). 그러나, 본 발명자들은, 이 시점에서 남아있는 신경세포에서 아포토시스성 세포사의 지표인 핵의 단편화(fragmentation)가 더 진행중임을 TUNEL 염색법에 의해 확인하였다(Wen T.-C. et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998 ; Peng H., et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 18 ; 349-360, 1998). 따라서, 이 모델 동물을 사용하여 3분 허혈후 7일째의 아포토시스성 신경세포사가 진세노사이드 Rb₁의 뇌실내 투여에 의해 억제되는 지의 여부를 TUNEL 염색법을 사용하여 검토하였다.

흡입 마취하에서 게르빌루스쥐에 3분간 전뇌 허혈을 부하한 직후, 뇌실내에 진세노사이드 Rb₁을 2.5 ng 또는 25 ng 일회 주입하고, 그 후 진세노사이드 Rb₁(60 ng/일 또는 600 ng/일)을 미니 침투압 펌프를 사용하여 1주일동안 뇌실내에 지속적으로 주입하였다. 3분 허혈후 1주일째에 게르빌루스쥐를 펜토바르비탈 마취하에서 4% 파라포름알데히드가 함유된 인산완충액을 사용하여 경심적으로 관류 고정하고 뇌를 적출하였다. 적출뇌를 파라핀으로 포매한 후에 5 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 작성하여 통상법에 따라 TUNEL 염색을 실시하였다. 대조 동물에는 같은 양의 생리 식염수를 투여하였다.

그 결과를 제 10도에 나타내었다. 제 10도의 (A)는 대조 동물을 나타내고, (B)는 진세노사이드 Rb₁을 60 ng/일 투여한 것을 나타내고, (C)는 진세노사이드 Rb₁을 600 ng/일 투여한 것을 나타낸다.

제 10도의 (A)에 나타낸 바와 같이, 3분간의 전뇌 허혈을 부하시킨 게르빌루스쥐의 해마 CA1 영역에서는, 1주 째에 많은 수의 TUNEL 양성 신경세포가 출현하고, 이 세포가 아포토시스성 세포사의 과정에 있음을 알아내었다. 진세노사이드 Rb₁을 3분간 전뇌 허혈을 부하한 직후부터 뇌실내에 주입하면, 60 ng/일[제 10도의 (B)], 600 ng/일[제10도의 (C)]과 같이 주입용량에 의존하여 TUNEL 양성 신경세포가 유의적으로 감소했다[제10도(D)]. 이 사실은, 실시예 3 및 4에서의 배양 실험 결과가 성숙뇌에 있어서도 적용된다는 것을 나타내고 있다. 또한, 진세노사이드 Rb₁은 뇌혈류나 뇌의 온도에는 이렇다 할 영향을 주지 않음 이미 보고되어 있다(Lim J.-H., et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997 ; Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998).

이상과 같은 실험 결과로부터, 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염을 함유하는 정맥내 투여용 제제가 극히 저농도에서, 뇌혈관성 치매, 뇌경색, 뇌졸중, 일과성 뇌허혈 발작 등의 뇌ㆍ신경질환의 치료, 예방 또는 처치에 유효하다는 것이 명백해졌다.

또한, 저농도, 즉 세포외액 농도가 1 ng/㎖ 이하, 보다 상세하게는 1 pg/㎖ 이하, 더 나아가 1∼100 fg/㎖ 이라는 저농도의 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염이 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사를 억제하는 작용을 가지고 있음이 판명되었다. 게다가, 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염이 세포사 억제 유전자 산물 Bcl-x_L의 발현을 촉진시키는 작용도 가지고 있음을 알게 되었다.

한편, 본 발명에서 사용되는 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염은 약용 인삼의 성분으로서 알려져 있고 부작용이 극히 적은 물질이다.

따라서, 본 발명은 임상상 유효한 뇌ㆍ신경 질환의 치료, 예방 또는 처치제를 제공하는 것이다. 본 발명의 뇌ㆍ신경 질환의 치료, 예방 또는 처치제는, 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염의 환부 조직에 있어서의 세포외액 농도가 1 ng/㎖ 이하, 보다 상세하게는 1 pg/㎖ 이하, 더욱 상세하게는 1∼100 fg/㎖가 되도록 조제되는 정맥내 투여용 제제가 특히 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 진세노사 이드 Rb₁ 또는 그 염의 환부조직에 있어서의 세포 외액 농도가 1 ng/㎖ 이하, 보다 상세하게는 1 pg/㎖ 이하, 더욱 상세하게는 1∼100 fg/㎖가 되도록 조제되는 정맥내 투여용 제제를 함유하는 뇌ㆍ신경 질환의 치료, 예방 또는 처치제, 및 뇌세포 또는 신경세포 보호제를 제공하는 것이다.

다음으로, 구체적인 시험예에 따라 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 구체적인 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (진세노사이드 Rb₁ 정맥내 주입 실험):

12∼13 주령의 수컷 SH-SP 래트(체중 250∼300g)를 사용하였다. 이 동물은 12시간 주기의 명암 사이클실에서 사육하였고, 물이나 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 이 동물의 혈압은 203.1±6.9㎜Hg이고, 이하의 실험은 에히메 대학(Ehime University) 의학부 부속 동물 실험 시설의 동물 실험 지침에 따라서 실시하였다. 흡입 마취하에서 직장의 온도를 37±0.2℃로 유지한 SH-SP 래트의 좌중 대뇌동맥 피질지(MCA)를 응고ㆍ절리하였다.

MCA 영구 폐색의 직후에 좌대퇴정맥으로 진세노사이드 Rb₁의 생리 식염수 용해액(1㎍/㎕ 또는 0.1 ㎍/㎕)을 60 ㎕(진세노사이드 Rb₁으로서 60 ㎍ 또는 6 ㎍) 일회 주입하였다. 그 후, 배부 피하에 매식한 알자 미니 침투압 펌프와 연결되는 카테테르를, 진세노사이드 Rb₁ 일회 주입 부위으로부터 좌대퇴 정맥에 삽입해 두었다. 이 미니 침투압 펌프에는 미리 진세노사이드 Rb₁의 생리 식염수 용해액을 채워 두고, 진세노사이드 Rb₁을 60 ㎍/일 또는 6 ㎍/일의 용량으로 좌대퇴정맥으로 28일간 지속적으로 주입하였다. 또한, 진세노사이드 Rb₁ 용해액의 유량은 시간당 0.25 ㎕/시였다. MCA를 영구 폐색한 대조 동물(허혈 콘트롤 동물)과 모의 수술 동물에게는 같은 양의 생리식염수만을 투여하였다.

MCA 영구 폐색후, 통상법에 따라(Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998) 2주 째와 4주 째에 각각 4일간 물속 미로 찾기 테스트를 실시하여, SH-SP 래트의 장소학습 능력을 판정하였다.

그 결과를 제 1도에 나타내었다. 제 1도의 좌측은 2주 째의 결과이고, 우측은 4주 째의 결과이다. 또한, 제 1도 중의 검은 동그라미 표시(●)는 모의 수술을 한 래트의 것이고, 흰색 동그라미 표시(○)는 수술후 생리 식염수만을 투여한 것이며, 검은 네모 표시(■)는 진세노사이드 Rb₁을 6 ㎍/일 투여한 것이고, 흰색 네모 표시(□)는 진세노사이드 Rb₁을 60 ㎍/일 투여한 것이다. 데이터는 평균값±표준오차로 나타내었고, 통계 해석법은 ANOVA + Fisher의 PLSD에 따른 것이다.

또한, SH-SP 래트의 수영 속도에는 각 군에서 유의차가 관찰되지 않았다.

4주 째의 물속 미로 찾기 테스트의 종료 후에, SH-SP 래트를 포수 클로랄로 마취하고, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 0.1몰 인산 완충액으로 경심적으로 관 류 고정하였다. 그 후, 이 동물의 뇌를 적출하여 대뇌피질 경색소의 사진을 촬영하였다. 좌대뇌반구 면적과 좌대뇌피질 경색 면적을 사진상에서 화상해석장치를 사용하여 계측하고, 좌대뇌피질 경색면적을 좌대뇌반구 면적으로 나눔으로서 대뇌피질 경색 비율(%)을 산출하였다. 그 결과를 제 2도에 나타내었다. 데이터는 평균치±표준오차로 나타내었고, 통계 해석법은 Mann-Whitney U 테스트에 따랐다.

제 3도의 (A)에 생리 식염수 투여 뇌경색소, 제 3도의 (B)에 진세노사이드 Rb₁ (6 ㎍/일) 투여 뇌경색소의 실례를 나타내었다.

또한, 제 4도에 본 실험 결과를 정리한 모식도를 나타내었다. 생리 식염수 투여군에서는 뇌경색의 병소부의 크기가 여전히 컸으며, 물속 미로 찾기 테스트에서는 목적 플랫폼에 도달하기까지 많은 시간을 요했다. 이에 반해, 본 발명의 진세노사이드 Rb₁ 투여군에 있어서는 병소부가 회복되거나 축소되었고, 그 결과 물속 미로 찾기 테스트에서도 목적 플랫폼에 단시간 내에 도달하였다.

실시예 2

(진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포막 지질의 과산화방지 효과 판정 실험):

태생 17일째의 래트 대뇌피질 신경세포를 무혈청 배양액 중에서 3일간 유지시킨 후, 진세노사이드 Rb₁을 0.1 fg/㎖, 1 fg/㎖, 10 fg/㎖, 100 fg/㎖ 및 1000 fg/㎖의 농도로 함유하거나 또는 함유하지 않은(0 fg/㎖) 신선한 배양액으로 교환하고 추가로 48시간 배양하였다. 그 후, 황산제1철과 아스코르빈산을 함유하나 진세노사이드 Rb₁을 함유하지 않은 신선한 배양액으로 교환하여 2시간 유지시키고, 하이드록시 라디칼을 발생시켜 신경세포막에 산화적 손상을 입혔다. 생성된 신경세포막 과산화지질은 도데실황산나트륨으로 세포를 녹인 후 티오바르비탈산(TBA) 고정량에 대한 흡광도 측정에 의해 결정하였다.

그 결과를 제 5도에 나타내었다. 그 결과, 진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포막지질 과산화 방지효과는 100 fg/㎖의 농도에서만 미약하게 확인할 수 있었지만, 황산제1철에 의한 자유라디칼 손상을 경감하는 0.1∼10 fg/㎖의 농도 범위에서는 지질 과산화 방지 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 3

[진세노사이드 Rb₁에 의한 신경세포사(아포토시스) 억제 작용 판정 실험]:

태생 17일째의 래트 대뇌피질 신경세포를 무혈청 배지 중에서 4일 내지 5일간 유지시킨 후, 진세노사이드 Rb₁을 1 fg/㎖, 100 fg/㎖ 및 100 pg/㎖ 의 농도로 함유하거나 또는 함유하지 않은(0 fg/㎖) 신선한 배지로 교환하여, 24시간 배양하였다. 그 후, 일산화질소 공여체인 니트로플루시드나트륨(SNP)을 100μM의 농도로 배지 중에 10분간 첨가하였다. 그 후, 진세노사이드 Rb₁을 함유하는 배양액 중에 신경세포를 추가로 16시간 유지시키고, 산화 환원 색소인 알라마 블루를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과를 제 6도에 나타내었다. 제 6도의 좌측은 SNP 처리를 하지 않은 경우의 결과를 나타낸 것으로, 그 결과 진세노사이드 Rb₁은 신경세포의 활성에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다. 제 6도의 우측은 SNP 처리를 한 경우의 결과를 나타낸 것으로, 검게 칠해 진 것은 SNP 처리 전후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이고, 사선이 그어져 있는 것은 SNP 처리 후에 진세노사이드 Rb₁이 첨가된 것이다. 데이터는 평균값±표준오차로 나타내었으며, 통계 해석법은 ANOVA + Fisher의 PLSD에 따랐다. 별표(＊)는, 진세노사이드 Rb₁이 첨가되지 않은 경우에 대한 유의차(＊는 P<0.05를, ＊＊는 P<0.01)를 나타낸다.

제 6도에 나타낸 바와 같이, 일산화질소 공여체인 니트로플루시드나트륨 (SNP) 처리를 하지 않은 경우에는, 진세노사이드 Rb₁이 배양 신경세포의 대사 활성에 유의적인 영향을 주지 않는다. SNP 처리를 하면 신경세포사(아포토시스)가 일어나지만, 진세노사이드 Rb₁은 1∼100 fg/㎖의 농도 범위에서 SNP 처리 전후 및 처리 후에 투여한 경우에서도 신경세포의 아포토시스를 유의적으로 억제하였음을 알 수 있다.

실시예 4 (진세노사이드 Rb₁의 Bcl-x_L발현 작용의 해석 실험):

진세노사이드 Rb₁이 Bcl-x_L유전자의 발현을 증가시키는 지의 여부를 조사하기 위해, 웬 등의 논문(Wen T.-C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998)에 기재된 방법에 따라, 0 fg/㎖, 1 fg/㎖ 및 100 fg/㎖의 진세노사이드 Rb₁로 24시간 전처리된 배양 신경세포로부터 총 RNA를 추출하였다. DNase 처리된 총 RNA 3㎍으로부터 올리고 dT 프라이머와 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 유전자 증폭 반응(PCR)에 의해 이것을 증폭시켰다. 이 PCR은 Taq 폴리메라아제를 사용하여 이하의 조건에서 행하였다. 즉, (1) 94℃, 2분간, (2) 94 ℃, 1.5분간 ; 55℃, 1.5분간 ; 72℃, 2분간을 1 사이클로 하여, Bcl-x_L에 대해서는 25사이클, β-악틴에 대해서는 20사이클, (3) 72℃, 2분간이다.

또한, 항Bcl-x_L 단백질 항체와 반응하는 밴드를 화상해석장치로 정량화하였다. 그 결과를 제 9도에 나타내었다. 통계 해석법은 ANOVA + Fisher의 PLSD에 따 랐다. 도면 중의 별표는, 진세노사이드 Rb₁이 첨가되지 않은 경우에 대한 유의차(＊＊는 P<0.01)를 나타낸다.

제 7도에 나타낸 바와 같이, 1 fg/㎖ 혹은 100 fg/㎖의 진세노사이드 Rb₁으로 처리된 배양 신경세포에서는 Bcl-x_L mRNA의 발현이 대조군에 비해 증가되었다. 한편, 진세노사이드 Rb₁은 신경세포사 억제 효과를 발휘하는 1∼100 fg/㎖ 의 농도 범위에서 신경세포의 Bcl-x_L단백질 발현량을 거의 50% 정도 유의적으로 증가시켰다(제 9도 참조).

실시예 5

(진세노사이드Rb₁에 의한 뇌내 아포토시스성 신경세포사 억제효과의 해석):

그 결과를 제 10도에 나타내었다. 제 10도 (D)의 통계 해석법은 Mann- Whitney U 테스트에 따랐다. 제 10도의 (A)는 대조 동물을 나타낸 것이고, (B)는 진세노사이드 Rb₁을 60 ng/일 투여한 것을 나타낸 것이며, (C)는 진세노사이드 Rb₁을 600 ng/일 투여한 것을 나타낸 것이다.

제 10도의 (A)에 나타낸 바와 같이, 3분간의 전뇌 허혈을 부하시킨 게르빌루스쥐의 해마 CA1 영역에서는, 1주 째에 많은 수의 TUNEL 양성 신경세포가 출현하였고, 이 세포가 아포토시스성 세포사의 과정에 있음을 알아내었다. 진세노사이드 Rb₁을 3분간 전뇌 허혈을 부하한 직후부터 뇌실내에 주입하면, 60 ng/일[제 10도의 (B)], 600 ng/일[제10도의 (C)]과 같이 주입용량에 의존하여 TUNEL 양성 신경세포가 유의적으로 감소했다[제10도(D)]. 이 사실은, 실시예 3 및 4에서의 배양 실험 결과가 성숙뇌에 있어서도 적용된다는 것을 나타내고 있다. 또한, 진세노사이드 Rb₁은 뇌혈류나 뇌의 온도에는 이렇다 할 영향을 주지 않음 이미 보고되어 있다(Lim J. -H., et al., Neurosci. Res., 28, 191-200, 1997 ; Zhang B., et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis., 7, 1-9, 1998).

본 발명은, 저농도의 진세노사이드 Rb₁의 정맥내 투여용 제제를 함유하는 매우 유효한, 급성기ㆍ만성기의 뇌경색 뿐만 아니라 뇌출혈ㆍ거미막하출혈ㆍ뇌색전의 급성기나 만성기 혹은 일과성의 뇌허혈 발작에 대한, 뇌·신경 질환의 치료, 예방 제 및 신경보호약을 제공한다. 즉, 진세노사이드 Rb₁에 대한 본 발명은, 뇌졸중이 의심되는 환자에 대해서 구급차 내에서도 점적 정주가 가능한 약물을 제공하는 것이다. 실제의 급성기 뇌졸중의 증례에서는 발증 후 2주일 이내에 병변이 진행하는 경우가 많기 때문에, 이 기간(예를 들면 1일간 혹은 14일간) 만큼이라도 진세노사이드 Rb₁을 투여하면 충분한 효과를 기대할 수 있다. 또, 진세노사이드 Rb₁의 실용화에 따라, 뇌졸중 환자의 뇌혈관 재건술ㆍ재관류술으로의 적용도 확대된다.

또한, 본 발명에 따른 의약 조성물은, Bcl-x_L단백질의 발현 증강 작용을 가지며, 아포토시스성 신경세포사를 동반하는 그 외의 1차성 및 2차성 신경변성 질환(알츠하이머병, 피크병, 척수소뇌 변성증, 파킨슨씨병, 무도병, 녹내장, 근위축성 측삭 경화증, 노인성 황반 변성증, 에이즈뇌증, 간성뇌증, 당뇨병성 망막증, 뇌염, 뇌성마비, 망막박리, 두부외상, 척수손상, 탈수질환, 신생아 가사, 말초신경장해, 망막색소 변성증 등) 등에도 효과적이라고 할 수 있다.

또, 본 발명의 의약 조성물은 부작용이 거의 없고 안전성이 높은 약물을 제공하는 것이다.

본 발명은, 과거에 그 유래를 찾아보기 힘든 저농도 범위에서 진세노사이드 Rb₁이 Bcl-x_L의 발현 증가를 촉진함으로써 아포토시스 또는 아포토시스성 신경세포사를 억제하는 작용을 가진다는 것을 알아낸 것이며, 이 사실은 진세노사이드 Rb₁이 단순히 중추 신경 질환뿐만 아니라, 아포토시스 또는 아포토시스성 세포사를 동반 하는 말초 조직의 질환(예를 들면, 장기 이식후의 거부 반응, 심부전, 심근증, 심근ㆍ간장ㆍ신장의 허혈 재관류 장해, 설통증, 심근경색, 방사선 장해, 말초동맥 폐색증, 말초순환부전, 욕창, 각막손상, 자기면역병, 면역부전병) 혹은 이식용 장기ㆍ조직의 보호에도 유효하다는 것을 시사하고 있다. 이들 말초 조직의 질환에 대해서는, 신경질환에 사용되는 용량보다도 적은 양의 진세노사이드 Rb₁으로 충분한 효과ㆍ효능을 기대할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은 정맥내로의 투여 뿐만 아니라, 점비약, 흡입약, 설하정, 좌약, 국소주입제, 피부외용제, 경구투여제, 점안제, 국소도포제, 근육주사제, 피하주사제, 피내주사제로서도 사용가능하다. 게다가, 소화관에서의 분해를 억제하는 담체 혹은 소화관에서의 흡수를 촉진하는 담체에 진세노사이드 Rb₁을 혼입ㆍ봉입 또는 결합시킨 후에, 본 발명의 의약 조성물을 경구 투여제로서 사용할 수도 있다.

Claims

진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염, 및 전신 투여용 담체를 함유하되, 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염의 투여량이 0.167fg/kg/일 내지 1.67mg/kg/일이거나, 진세노사이드 Rb₁ 또는 그 염의 단위 투여량이 60kg인 환자에 대해 10fg 내지 12mg인,

뇌세포 사멸 또는 신경 아포토시스를 동반하는 뇌신경 질환인 뇌경색, 뇌출혈, 거미막하출혈, 뇌색전, 일과성 뇌허혈 발작, 알츠하이머병, 피크병, 척수소뇌 변성증, 파킨슨씨병, 무도병, 녹내장, 근위축성 측삭 경화증, 노인성 황반 변성증, 에이즈 뇌증, 간성뇌증, 당뇨병성 망막증, 뇌염, 뇌마비, 망막박리, 두부외상, 척수손상, 일산화탄소 중독, 탈수질환, 신생아 가사, 말초신경장해 또는 망막색소 변성증을 치료 또는 예방하거나,

아포토시스 또는 아포토시스성 세포사를 동반하는 말초 조직의 질환인 장기 이식후의 거부 반응, 심부전, 심근증, 심근ㆍ간장ㆍ신장의 허혈 재관류 장해, 설통증, 심근경색, 방사선 장해, 말초동맥 폐색증, 말초순환부전, 욕창, 각막손상, 자가면역병 또는 면역부전병을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서, 정맥내 투여용인 의약 조성물.
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제 2 항에 있어서, 일회 정맥내 투여용인 의약 조성물.
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