CN116077620A - 多肽p144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了多肽P144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病产品中的应用。本发明所述的TGF‑β抑制多肽P144可应用于缺血再灌注损伤引发的慢性肾脏病及终末期肾脏病治疗，开拓了TGF‑β抑制多肽P144的新用途，为慢性肾脏病的治疗药物提供了新选择。TGF‑β抑制多肽P144在使用于本发明涉及的疾病防治时，避免了蛋白质药物制剂难于保存、造价高以及小分子药物疗效持续效果差的缺点，效果确实、机制明确，有望改善慢性肾脏病缺乏有效干预手段的现状。

Description

多肽P144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及多肽P144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病产品中的应用。

背景技术

慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是急性肾损伤(Acute kidneyinjury,AKI)病理性修复的结局，缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion,IR)是最常见的病因。当IR损伤后炎症反应持续、组织损伤无法完全修复时，就会走向CKD，病理表现为细胞外基质(ECM)在肾间质大量沉积，肾单位及周围血管床消失，最终肾功能丧失进展至尿毒症(Mutsaers HA,Olinga P.Editorial:Organ Fibrosis:Triggers,Pathways,and CellularPlasticity.Front Med(Lausanne).2016,3:55.)。临床研究显示，长期随访1-3年，30-50％的AKI患者发生CKD，超过10％的患者接受长期肾脏替代治疗(Renal replacementtherapy，RRT)(See EJ,Jayasinghe K,Glassford N,Bailey M,Johnson DW,PolkinghorneKR,Toussaint ND,Bellomo R.Long-term risk of adverse outcomes after acutekidney injury:a systematic review and meta-analysis of cohort studies usingconsensus definitions of exposure.Kidney Int.2019，95(1):160-172.)，最终将走向终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)及死亡。因此，阻断缺血再灌注损伤引发的AKI走向CKD以及ESRD，是重要的公共卫生问题。

目前，AKI进展至CKD后的治疗仍面临巨大的挑战，临床上除了支持对症治疗及针对并发症的治疗外，没有明确有效的针对机制的治疗药物(US National Library ofScience.Clinical Trials.gov[online],https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01665391.和US National Library of Science.Clinical Trials.gov[online],https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01113801.)。因此，如何针对CKD的进展及调控机制，发现新的治疗药物，是面临的重要挑战。

TGF-β抑制性多肽P144，其氨基酸序列为TSLDASIWAMMQNA(SEQ ID NO.1)，从TGF-β1III型受体的膜近端配体结合结构域筛选出来，可直接结合组织中游离的活化形式TGF-β1，阻断TGF-β1与其I型和II型受体的结合，从而阻断TGF-β1下游信号通路的活化(EzquerroIJ,Lasarte JJ,Dotor J,Castilla-Cortázar I,Bustos M,

I,Blanco G,Rodríguez C,Lechuga Mdel C,Greenwel P,Rojkind M,Prieto J,Borrás-Cuesta F.Asynthetic peptide from transforming growth factor beta type III receptorinhibits liver fibrogenesis in rats with carbon tetrachloride liverinjury.Cytokine.2003Apr；22(1-2):12-20.)。TGF-β抑制性多肽P144在脑胶质瘤中表现出抗肿瘤作用(Gallo-Oller G,Vollmann-Zwerenz A,Meléndez B,Rey JA,Hau P,Dotor J,Castresana JS.P144,a Transforming Growth Factor beta inhibitor peptide,generates antitumoral effects and modifies SMAD7 and SKI levels in humanglioblastoma cell lines.Cancer Lett.2016Oct10；381(1):67-75.)，在肝脏、心脏纤维化中表现出了抗纤维化(Ezquerro IJ,Lasarte JJ,Dotor J,Castilla-Cortázar I,Bustos M,

I,Blanco G,Rodríguez C,Lechuga Mdel C,Greenwel P,Rojkind M,Prieto J,Borrás-Cuesta F.A synthetic peptide from transforming growth factorbeta type III receptor inhibits liver fibrogenesis in rats with carbontetrachloride liver injury.Cytokine.2003Apr；22(1-2):12-20.和Hermida N,LópezB,González A,Dotor J,Lasarte JJ,Sarobe P,Borrás-Cuesta F,Díez J.A syntheticpeptide from transforming growth factor-beta1 type III receptor preventsmyocardial fibrosis in spontaneously hypertensive rats.Cardiovasc Res.2009Feb15；81(3):601-9.)。

但是以往的研究认为从AKI进展至CKD主要由肾小管上皮细胞修复不良、缺氧、慢性炎症等因素导致(He L,Wei Q,Liu J,Yi M,Liu Y,Liu H,Sun L,Peng Y,Liu F,Venkatachalam MA,Dong Z.AKI on CKD:heightened injury,suppressed repair,andthe underlying mechanisms.Kidney Int.2017Nov；92(5):1071-1083.)。其中肾小管上皮细胞的正常修复需要在Wnt、TGF-β1等信号通路的介导下进行，TGF-β信号促进了肾小管上皮细胞的自噬和增殖，促进其在损伤后完成自我修复，从而避免了炎症的持续和肾脏损伤的进一步进展(Ferenbach DA,Bonventre JV.Mechanisms of maladaptive repair afterAKI leading to accelerated kidney ageing and CKD.Nature reviewsNephrology.2015；11:264–276.)。因此，现有技术并未关注过TGF-β抑制性多肽P144对于肾脏缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏损伤的作用。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种多肽P144的新用途。具体提供TGF-β抑制性多肽P144在制备治疗缺血再灌注损伤导致慢性肾脏病的产品中的新用途。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了多肽P144在制备以下产品中的应用：

1、减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病的产品。

2.阻止AKI向CKD发展的产品。

3.降低肾脏缺血再灌注后血清肌酐及尿素氮水平的产品。

4.抑制缺血再灌注损伤后肾脏M2型巨噬细胞的产品。

5.抑制肾脏P-smad3表达的产品。

6.阻断TGF-β依赖的巨噬细胞迁移和/或M2型极化的产品。

本发明通过体内实验评价P144治疗缺血再灌注(Ischemia reperfusion,IR)导致慢性肾脏病的有效性，结合体外实验证明TGF-β抑制肽P144阻断缺血再灌注肾损伤引发的慢性肾脏损伤的机制，为阻断AKI-CKD进展提供新的治疗药物。

本发明中，所述产品为药物，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在。

本发明的活性成分或其可药用的盐还可以依据施用情况的需求，以水合物或其它溶剂的形式使用。

本发明中，所述药物的给药方式为静脉注射和/或腹腔注射。

本发明药物的给药途径可以是静脉或腹腔注射。各剂型中单个剂量所包含的活性成分的单位含量本身不一定需要构成有效量，其可以通过施用多个剂量单位来达到所必需的有效量。

本发明中，所述产品为药物组合物，所述药物组合物的活性成分之一为多肽P144。

本发明的药物组合中还可包括其他活性成分，所用的各活性成分的有效剂量可以根据所用的特定化合物或药物组合物、给药方式、所治疗病症的严重程度而变化。优选的，在该联合制剂中被给药的两种活性成分的总量的比例可以进行变化，例如根据不同需求的单个患者的需要而进行变化。

本发明的有益效果至少在于：

本发明所述的TGF-β抑制多肽P144可应用于缺血再灌注损伤引发的慢性肾脏病治疗，对缺血再灌注损伤引发的慢性肾脏病有明显的阻断作用，开拓了TGF-β抑制多肽P144的新用途，为慢性肾脏病的治疗药物提供了新选择。其还可用于AKI-CKD的治疗，减轻缺血再灌注损伤引发的慢性肾脏损伤，保护肾脏功能。TGF-β抑制多肽P144在使用于本发明涉及的疾病防治时，避免了蛋白质药物制剂难于保存、造价高以及小分子药物疗效持续效果差的缺点，效果确实、机制明确，有望改善慢性肾脏病缺乏有效干预手段的现状。

附图说明

图1为TGF-β抑制多肽P144对缺血再灌注损伤引发的慢性肾脏病模型肾脏重量及肾功能的影响结果。图中，*代表P<0.05，***代表P<0.001。

图2为TGF-β抑制多肽P144对缺血再灌注后慢性期肾脏损伤的影响结果。其中，图的左侧为各实验组肾脏石蜡切片照片及局部放大图，右侧为各实验组肾脏马松(Masson)染色面积统计结果，纵坐标的单位为％，图中***代表P<0.001。

图3和图4为TGF-β抑制多肽P144对缺血再灌注损伤后慢性肾脏损伤标志物表达的影响结果。其中，图3的左侧为各实验组免疫组化染色后的肾脏切片照片及局部放大图，右侧为各实验组的α-SMA阳性面积率统计结果；纵坐标的单位为％，图中**代表P<0.01，***代表P<0.001。图4的左侧为各实验组的α-SMA表达水平结果图，GAPDH为内参，右侧为各实验组的α-SMA蛋白表达量统计结果，图中*代表P<0.05。

图5为TGF-β抑制多肽P144对缺血再灌注损伤后肾脏免疫荧光染色的影响结果。

图6为TGF-β抑制多肽P144对缺血再灌注损伤后肾脏巨噬细胞CD206表达的影响结果。其中，图的左侧为各实验组CD206染色照片及局部放大图，右侧为CD206阳性细胞数统计结果，纵坐标的单位为％，图中，****代表P<0.0001。

图7为TGF-β抑制多肽P144对信号通路TGF-β/SMAD的激活的影响结果。其中，图的左侧为各实验组Western Blot验证结果(GAPDH为内参)，右侧分别为CD206蛋白和P-Smad3蛋白表达量统计结果，图中，****代表P<0.0001，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

图8为TGF-β对巨噬细胞增殖的影响结果。

图9为TGF-β抑制多肽P144对TGF-β依赖的巨噬细胞迁移的影响结果。其中，图的左侧为各实验组巨噬细胞染色结果，右侧为迁移细胞数量统计结果，纵坐标的单位为个，图中，***代表P<0.001。

图10为TGF-β抑制多肽P144对巨噬细胞TGF-β/Smad通路活化及M2极化的影响结果。其中，图的左侧为巨噬细胞细胞裂解液中蛋白的Western Blot检测结果(GAPDH为内参)，右侧分别为CD206蛋白和P-Smad3蛋白表达量统计结果，图中，****代表P<0.0001，*代表P<0.05，***代表P<0.001。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明具体实施方式部分所用的的多肽P144(SEQ ID NO.1)由国家纳米中心李莉莉研究员课题组采用本领域常规方法合成(常规合成方法可参考：Intracellularconstruction of topology-controlled polypeptide nanostructures with diversebiological functions.Nat Commun.2017,8(1):1276.)。

实施例1 TGF-β抑制多肽P144治疗AKI-CKD有效性

构建单侧缺血再灌注损伤并进行对侧肾切除术(Unilateral Ischemia-Reperfusion Injury and Contralateral Nephrectomy,uIRIx)模型：每组实验动物8只，实验动物为8周龄C57雄性小鼠，体重20-22g。1％戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，暴露左侧肾脏，分离肾蒂，动脉夹夹闭肾动脉，肾脏颜色变为黑紫色，同时行右侧肾脏切除，40min后解除夹闭，待肾脏灌注恢复后还纳。于再灌注后第21天开始，尾静脉注射TGF-β抑制多肽P144，剂量为2mg/kg，1次/天，共注射5次，作为P144治疗组。对照组(模型组)于相应时间尾静脉注射生理盐水。另设一组假手术组。

各组于再灌注后第35天评估肾脏一般情况，结果显示，肾脏重量在模型组与P144治疗组之间无显著差异(图1)。

各组于再灌注后第35天取小鼠外周血，测量血清肌酐和尿素氮水平(肌酐、尿素氮试剂盒，QuantiChrom)以评估肾脏功能，结果显示，TGF-β抑制多肽P144具有降低小鼠肾脏缺血再灌注后血清肌酐及尿素氮水平的趋势(图1)，对肾脏功能起到了保护作用。

各组于再灌注后第35天取小鼠肾脏，对肾组织进行脱水、固定、石蜡包埋及切片，Masson染色检测肾脏间质细胞外基质沉积，ImageJ计算肾脏慢性损伤病灶面积，结果显示，TGF-β抑制多肽P144治疗后，肾脏间质细胞外基质沉积面积显著减小(图2)，证明TGF-β抑制多肽P144能够有效降低缺血再灌注后慢性期肾脏损伤程度。

肾脏切片行免疫组化染色，检测肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达水平及组织分布，结果表明，α-SMA主要在肾间质呈现阳性表达，而TGF-β抑制多肽P144治疗组肾组织α-SMA阳性面积率显著降低(图3，P<0.05)，证明TGF-β抑制多肽P144能有效降低缺血再灌注慢性期肾脏损伤程度。

提取肾组织蛋白，Western Blot验证细胞外基质标志物α-SMA的表达水平，与免疫组化结果一致，TGF-β抑制多肽P144治疗组肾组织α-SMA表达水平明显低于疾病模型组(图4，P<0.05)，证明其能有效降低缺血再灌注慢性期肾间质细胞外基质沉积。

实施例2 TGF-β抑制多肽P144阻断AKI-CKD进展的机制

以往研究表明，巨噬细胞是肾脏间质主要的免疫细胞类型，其在CKD进展中起到了重要的促进作用，本发明检测了TGF-β抑制多肽P144对于肾脏巨噬细胞数量和分布的影响。实验组设置同实施例1。于再灌注后第35天取小鼠肾脏，固定、包埋后进行冰冻组织切片，免疫荧光染色检测巨噬细胞(F4/80+，#144801，eBioscience)及M2型巨噬细胞(CD206+，#ab64693，abcam)的数量及分布。结果显示：P144治疗组肾脏浸润的巨噬细胞数量减少，尤其是表面标志物为CD206的M2型巨噬细胞数量显著减少(图5，P<0.05)；对肾组织行免疫组化染色检测CD206表达，可见TGF-β诱导巨噬细胞CD206表达增加，P144可以阻断该过程(图6，P<0.05)，提示P144能够抑制缺血再灌注损伤后肾脏M2型巨噬细胞浸润。

提取肾组织蛋白，Western Blot验证M2巨噬细胞表面标志物CD206(#ab64693，abcam)表达水平以及TGF-β/SMAD通路活化情况。结果显示，TGF-β抑制多肽P144治疗组肾组织CD206表达水平明显低于疾病模型组(图7，P<0.05)，表明P144治疗使得肾脏M2型巨噬细胞浸润减少；同时，P144降低了肾脏P-smad3(ab40854，abcam)的表达(图7，P<0.05)，表明P144治疗抑制了信号通路TGF-β/SMAD的激活，从机制上证实P144具有抗缺血再灌注损伤导致慢性肾脏损伤的作用。

实施例3 TGF-β抑制多肽P144对巨噬细胞功能的调控作用及其机制

基于以上体内实验中观察到的P144给药后AKI-CKD肾脏巨噬细胞数量及表型的变化，本发明进一步在体外验证了P144对于巨噬细胞表型、功能的影响及分子机制。

体外培养RAW264.7巨噬细胞细胞系，上清加入不同浓度的重组TGF-β进行刺激，CCK-8试剂盒检测巨噬细胞增殖，结果显示随着重组TGF-β浓度增加，巨噬细胞的数量没有出现变化(图8，P>0.05)，提示TGF-β不能促进巨噬细胞增殖。

利用Transwell共培养系统，在小室上层接种巨噬细胞系RAW264.7，下层加入含有重组TGF-β(10ng/ml)以及P144(200ug/ml)的培养基；培育24小时后取出小室，擦除上层细胞，对小室下层细胞进行固定、染色及细胞计数。另设对照组(Control)和仅加入含有重组TGF-β(10ng/ml)的培养基的实验组。结果表明，TGF-β能够趋化巨噬细胞从小室上层迁移至下层，而P144有效阻断了TGF-β依赖的巨噬细胞迁移(图9，P<0.05)，提示TGF-β通过趋化作用招募巨噬细胞迁移至肾脏，而TGF-β抑制多肽P144通过阻断TGF-β的作用，从而减少肾脏浸润的巨噬细胞数量。

体外培养RAW264.7巨噬细胞细胞系，上清加入10ng/ml重组TGF-β进行刺激，同时加入P144(200ug/ml)阻断重组TGF-β与受体的结合；24h小时后，收集细胞，用RIPA裂解液提取细胞蛋白，Western Blot检测细胞裂解液中CD206、p-Smad表达。另设对照组(Con/Control)和仅加入含有重组TGF-β(10ng/ml)的实验组。结果表明，TGF-β刺激后，巨噬细胞M2极化的标志物CD206表达水平上调，P144作用后CD206表达水平明显降低(图10，P<0.05)，提示P144可以阻断TGF-β诱导的巨噬细胞M2型极化。通过检测TGF-β/Smad信号通路关键分子p-Smad，证明TGF-β抑制多肽P144能够阻断TGF-β/Smad通路的激活，从而揭示其阻断TGF-β依赖的巨噬细胞M2型极化的分子机制(图10，P<0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第一医学中心

<120> 多肽P144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病产品中的应用

<130> KHP211120016.4

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Trp Ala Met Met Gln Asn Ala

1               5                   10

Claims (10)

1.多肽P144在制备减轻缺血再灌注损伤导致的慢性肾脏病的产品中的应用。

2.多肽P144在制备阻止AKI向CKD发展的产品中的应用。

3.多肽P144在制备降低肾脏缺血再灌注后血清肌酐及尿素氮水平的产品中的应用。

4.多肽P144在制备抑制缺血再灌注损伤后肾脏M2型巨噬细胞的产品中的应用。

5.多肽P144在制备抑制肾脏P-smad3表达的产品中的应用。

6.多肽P144在制备阻断TGF-β依赖的巨噬细胞迁移和/或M2型极化的产品中的应用。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物，所述药物的活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物含有至少一种可药用载体。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为静脉注射和/或腹腔注射。

10.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物组合物，所述药物组合物的活性成分之一为多肽P144。

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