JP2002322068A - 血管再生促進剤 - Google Patents

血管再生促進剤

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JP2002322068A JP2001365282A JP2001365282A JP2002322068A JP 2002322068 A JP2002322068 A JP 2002322068A JP 2001365282 A JP2001365282 A JP 2001365282A JP 2001365282 A JP2001365282 A JP 2001365282A JP 2002322068 A JP2002322068 A JP 2002322068A
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雅広 阪中
Junya Tanaka
潤也 田中
Ryuji Hata
龍二 秦
Hidemitsu Uno
英満 宇野
Makoto Kuramoto
誠 倉本
Koji Hashimoto
公二 橋本
Kensho Mitsuda
憲昭 満田
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、血管の再生・再構築促進もしくは
血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処置、治療のた
めに有用なジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロジン
セノサイドＲｂ１からなる、有効な静脈内投与用製剤、
皮膚外用剤もしくは医薬組成物を提供する。また本発明
は、転写因子ＳＴＡＴ５及び／又は転写因子ＨＩＦ−１
の活性化を介して、血流障害をきたす疾患又は病態の予
防、処置、治療のために有用となるジンセノサイド類特
にはジンセノサイドＲｂ１を提供する。 【解決手段】 本発明は、ジンセノサイド類誘導体特に
はジヒドロジンセノサイドＲｂ１からなる静脈内投与用
製剤、皮膚外用剤もしくは医薬組成物に関し、特に血管
の再生・再構築の促進、もしくは血流障害をきたす疾患
又は病態の予防、処置又は治療のために有用である。ま
た、本発明はジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイ
ド類からなる医薬組成物に関し、特に転写因子ＳＴＡＴ
５及び／又は転写因子ＨＩＦ−１の活性化を介して、血
流障害をきたす疾患又は病態の予防、処置、治療のため
に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血管の新生、再生
又は再構築を促進する主要因子すなわちＶＥＧＦ（vasc
ular endothelial growth factor）の発現を誘導するた
めの医薬組成物に関する。より詳細には、本発明はジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体からなる、脳血管障害、創傷などの血流障害をきたす
疾患又は病態の予防、処置又は治療用医薬組成物又は静
脈内投与用製剤、皮膚外用剤もしくは脳血管を始めとす
る血管の再生・再構築促進剤に関する。また、本発明
は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強及び／又はカスパーゼ３発現
抑制を介して、血流障害をきたす疾患（病態を含む）も
しくはアポトーシス又はアポトーシス様細胞死をきたす
疾患を予防、処置もしくは治療するための前記医薬組成
物にも関する。さらに、本発明は転写因子ＳＴＡＴ５又
はＨＩＦ−１を活性化せしめることにより細胞のＢｃｌ
−ｘＬ発現又はＶＥＧＦ発現を誘導するためのジンセノ
サイド類からなる医薬組成物に関する。本発明は、被検
物質を培養細胞に投与して、Ｂｃｌ−２蛋白群の発現調
節作用を測定することからなる、血流障害をきたす疾患
又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組成物を探索す
る方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの器質的疾患たとえば血流障害をき
たす疾患においては、まず虚血状態に陥った組織の細胞
がアポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死をきたす
にもかかわらず、血流不全が改善されることなくさらに
虚血組織におけるアポトーシスもしくはアポトーシス細
胞死が進行し、生体に非可逆的な高次機能障害が出現す
る。脳血管障害の中でも中大脳動脈皮質枝（ＭＣＡ）が
永久閉塞した脳梗塞病変を例にとって、このことをさら
に詳しく以下に説明する。
【０００３】ＭＣＡが永久閉塞するとＭＣＡだけで栄養
されている部位すなわち虚血中心部（ischemic core）
の神経細胞はＭＣＡが早期に再開通しない限り、すみや
かに壊死に陥り脳梗塞病変が形成されるので、いかなる
薬物といえども虚血中心部の脳組織を救うことはまず出
来ないと考えられる。なお、ＷＯ００／３７４８１号
（ジンセノサイドＲｂ１からなる脳細胞又は神経細胞保
護剤）で記述したごとく、本明細書では、ネクローシス
（壊死）とは異なり緩徐に進行する神経細胞の死を“神
経細胞のアポトーシス"あるいは“アポトーシス様神経
細胞死"と定義することにする。一方、虚血巣周辺部（i
schemic penumbra）ではＭＣＡからの血液供給がまった
くなくなり同部における血管網は著しく少なくなるが、
わずかながらも前大脳動脈（ＡＣＡ）や後大脳動脈（Ｐ
ＣＡ）の皮質枝からの血液供給（おそらくＡＣＡとＭＣ
Ａ間の吻合もしくはＰＣＡとＭＣＡ間の吻合）があるの
で、同部の神経細胞はＭＣＡ閉塞後しばらくは瀕死の状
態で生きていると考えられている。もちろん何の手だて
も施さなければ虚血巣周辺部（ischemic penumbra）で
もやがてアポトーシス様神経細胞死が起こり同部がすべ
て脳梗塞病変に様変わりすることは周知の事実である。
臨床的にはこの虚血巣周辺部（ischemic penumbra）の
神経細胞を救うことがもっとも大切であるが、たとえ強
力な神経細胞保護薬で一時的に同部の神経細胞を生かす
ことができても、その後ＭＣＡ永久閉塞により破綻ある
いは減少した同部の血管網が再生・再構築されない限
り、同部の神経細胞は時間をおいて死に至る可能性が高
い。従って、脳梗塞病巣など血流障害をきたした生体組
織の病理組織学的変化を予防、処置又は治療するために
は、虚血状態に陥った細胞のアポトーシスもしくはアポ
トーシス様細胞死を抑止することに加えて、破綻した虚
血巣周辺部血管網を再生・再構築せしめることが必要で
ある。
【０００４】さて、細胞のアポトーシスもしくはアポト
ーシス様細胞死に関わる分子群については、実験医学
（17巻、13号、1999年；企画、長田重一；羊土社）なら
びに米科学誌サイエンス（281巻5381号、1998）に特集
が組まれているが、本明細書ではその中でもＢｃｌ−２
蛋白群について以下に略記することとする。Ｂｃｌ−２
蛋白群はアポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死に
対して抑制作用を持つもの（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−
ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆ１−１／Ｂｏｄ、
Ｎｒ−１３、ＢＲＡＧ−１、Ｂｏｏ／Ｄｉｖａ、Ｇａｌ
ｅｃｔｉｎ−３）と、アポトーシスもしくはアポトーシ
ス様細胞死に対して促進作用を持つもの（Ｂａｘ、Ｂａ
ｋ、Ｂｃｌ−ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、
Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、ＢＮＩＰ／Ｎｉｘ、
Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｌｋ、ＥＧＬ−１）に大別される
（臓器別アポトーシス証明法；編集、大槻勝紀、小路武
彦、渡辺慶一、南江堂、2000、ｐｐ16-24）。従って、
アポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死を防ぐため
には、前記のアポトーシス抑制因子（Antiapoptotic fa
ctors）の発現を促進せしめるか、アポトーシス促進因
子（proapoptotic factors）の発現を抑制すればよい。
もちろん、前記した複数のアポトーシス関連因子の発現
を同時に調節しても、アポトーシスもしくはアポトーシ
ス用細胞死を抑止できる。
【０００５】前記のＢｃｌ−２蛋白群の中でも特にＢｃ
ｌ−ｘＬは、成熟した脳・神経組織、免疫組織、造血組
織、皮膚組織、心筋組織等のあらゆる生体組織に豊富に
発現しており、細胞が生存する上で必須の働きをしてい
る。ミトコンドリア関連蛋白であるＢｃｌ−ｘＬは、Ａ
ｐａｆ１と結合することにより、Ａｐａｆ１とプロカス
パーゼ９（procaspase９）との結合を阻害すると言われ
ている（Adams J.M. and Cory S., Science, 281, 1322
-1326, 1998）。Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白の減少あるいは機能
低下が起きると、Ａｐａｆ１がＢｃｌ−ｘＬ蛋白から解
離してプロカスパーゼ９と結合し、ミトコンドリアから
のチトクロームＣの漏出とあいまって、プロカスパーゼ
９が活性化されると考えられている（Adams J.M. and C
ory S., Science, 281, 1322-1326, 1998）。ひとたび
細胞質内のプロカスパーゼ９が活性化されると引き続い
てカスパーゼ９（caspase９）ならびに最終的な細胞の
エキセキュショナー（excecutioner）であるカスパーゼ
３（caspase３）が活性化され、これらの蛋白分解酵素
により細胞は自己融解し死（アポトーシス）に至る過程
が加速される。おそらく、プロカスパーゼ９の活性化段
階で、細胞が死に至る運命が決定される可能性が高いの
で、Ｂｃｌ−ｘＬの発現増加剤によりプロカスパーゼ９
の活性化をくい止めることが、細胞死を防ぐための得策
と考えられる。また、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を促進するの
みならず、最終的な細胞のエキセキュショナー（excecu
tioner）であるカスパーゼ３の発現を抑止する化合物が
あれば、さらに抗アポトーシス剤としての利用価値が高
まると考えられる。もちろんＢｃｌ−ｘＬの発現を誘導
する転写因子（たとえばＮＦκＢ，ＳＴＡＴｓ等）を増
加せしめて、細胞死を防いでもよい。
【０００６】血管の新生、再生又は再構築に関する因子
としては、実験医学（17巻、6号、1999年；企画、渋谷
正史；羊土社）に記載の分子群、たとえばＶＥＧＦ、Ｖ
ＥＧＦＲ、アンジオポエチン、Ｔｉｅ、ｅｐｈｒｉｎ−
Ｂ２、ｂＦＧＦ、Ｅｐｈ−４Ｂ、ＣＸＣＲ４、Ｓｈｃ、
ＳＣＬ、ｅｔｓ−１０、Ｅｒｂ−Ｂ３、ＮＤＦ、ＰＤＧ
Ｆ、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦ、ＨＩＦ１などが挙げられる
が、中でもＶＥＧＦ（vascular endothelial growth fa
ctor）は血管の新生、再生又は再構築において中心的な
役割を果たすことが知られている。より詳細には、ＶＥ
ＧＦは、血管内皮細胞増殖、内皮細胞の移動又は遊走、
管腔形成、内皮細胞からの組織因子やプラスミノーゲン
活性化因子（plasminogen activator）等の凝固・線溶
系タンパクの産生、内皮細胞での細胞接着分子の発現、
内皮細胞でのＢｃｌ−２発現、などを促進することによ
り、血管の新生、再生又は再構築に関わる。従って、Ｖ
ＥＧＦの発現を促進せしめる化合物が見出されれば、血
管の再生及び／又は再構築を促進させるための医薬組成
物として利用できると言える。ちなみに、ＶＥＧＦの発
現を誘導する転写因子の１つとしてＨＩＦ−１（hypoxi
a inducible factor-1）が知られている。なお、血管の
再生及び／又は再構築の概略については、特願２０００
−２４８４５８号及びＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号
において本発明者ら（阪中、田中）が創傷治癒現象を例
にとりあげて記載している。
【０００７】一方、ジンセノサイド類誘導体の１つであ
るジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、下記構造式
【０００８】
【化１】
【０００９】で示される化合物であり、本化合物はＰＣ
Ｔ／ＪＰ００／０４１０２号及びＰＣＴ／ＪＰ００／０
５５５４号に記載されたごとく、下記構造式
【００１０】
【化２】
【００１１】で示されるジンセノサイドＲｂ１を原材料
として利用することにより作成することができる。ＰＣ
Ｔ／ＪＰ００／０４１０２号又はＰＣＴ／ＪＰ００／０
５５５４号の実験例において、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体が、優れた脳卒中
治療効果、皮膚組織再生・再構築促進作用、皮膚の開放
創治療効果等を示すことが明らかにされているが、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体が血管の新生、再生又は再構築を促進するかどうかに
ついては分子機構に基づいた具体的な試験例は開示され
ていない。また、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号又は
ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号においては、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は
細胞特には神経細胞のアポトーシスもしくはアポトーシ
ス様神経細胞死を抑止することが開示されているが、そ
の分子機構については開示されていない。
【００１２】本発明者らは、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体を含有してなる医薬
組成物が、低い至適細胞外液濃度域でＶＥＧＦ及びＢｃ
ｌ−ｘＬの発現を上昇せしめ、かつカスパーゼ３の発現
を抑制することを見出し本発明を完成した。すなわち、
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類
誘導体は、ＶＥＧＦ発現増強作用、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増
強作用及び／又はカスパーゼ３発現抑制作用を示すが故
に脳血管障害などの血流障害をきたす疾患又は病態の予
防、処置又は治療用医薬組成物、血管の再生・再構築促
進剤として利用できることが見出された。さらに、本発
明では、血流障害をきたす疾患又は病態（たとえば脳血
管障害、創傷等）に対して、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体が生体内（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）でも効果を示すことが見出された。また、本発
明の医薬組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強及び／又はカ
スパーゼ３発現抑制を介して、血流障害をきたす疾患も
しくはアポトーシス又はアポトーシス様細胞死をきたす
疾患の予防、処置もしくは治療に有用と考えられた。さ
らに本発明者らは、ジンセノサイド類又はジンセノサイ
ド類誘導体が細胞の転写因子ＳＴＡＴ５又はＨＩＦ−１
の活性化を介してＢｃｌ−ｘＬ又はＶＥＧＦの発現を誘
導することを見出し本発明を完成した。なお、ジンセノ
サイド類ならびにジンセノサイド類誘導体の詳細につい
ては後述するが、本発明書では天然のジンセノサイド類
の代表として前記したジンセノサイドＲｂ１をとりあ
げ、ジンセノサイド類誘導体の代表としてジヒドロジン
セノサイドＲｂ１をとりあげることとする。天然のジン
セノサイド類とジンセノサイド類誘導体を総称して、本
明細書ではジンセノサイド類と呼ぶこととする。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血管
の新生、再生又は再構築を促進する主要因子すなわちＶ
ＥＧＦの発現を誘導するための医薬組成物を提供するこ
とである。より詳細には、本発明はジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体からなる、脳
血管障害、創傷などの血流障害をきたす疾患又は病態の
予防、処置又は治療用医薬組成物又は静脈内投与用製
剤、皮膚外用剤もしくは脳血管を始めとする血管の再生
・再構築促進剤を提供するものである。また、本発明
は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強及び／又はカスパーゼ３発現
抑制を介して、血流障害をきたす疾患（病態を含む）も
しくはアポトーシス又はアポトーシス様細胞死をきたす
疾患を予防、処置もしくは治療するための前記医薬組成
物をも提供する。さらに、本発明は細胞の転写因子ＳＴ
ＡＴ５又は転写因子ＨＩＦ−１を活性化することにより
Ｂｃｌ−ｘＬ又はＶＥＧＦの発現を誘導するジンセノサ
イド類からなる医薬組成物を提供する。本発明は、被検
物質を培養細胞に投与して、Ｂｃｌ−２蛋白群の発現調
節作用を測定することからなる、血流障害をきたす疾患
又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組成物を探索す
る方法をも提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、血管の新生、
再生又は再構築を促進する主要因子すなわちＶＥＧＦの
発現を誘導するための医薬組成物に関する。より詳細に
は、本発明はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体からなる、脳血管障害、創傷などの
血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処置又は治療用
医薬組成物、静脈内投与用製剤又は皮膚外用剤、及び脳
血管を始めとする血管の再生・再構築促進剤に関する。
また、本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強及び／又はカス
パーゼ３発現抑制を介して、血流障害をきたす疾患（病
態を含む）もしくはアポトーシス又はアポトーシス様細
胞死をきたす疾患を予防、処置もしくは治療するための
前記医薬組成物にも関する。さらに、本発明は細胞の転
写因子ＳＴＡＴ５又は転写因子ＨＩＦ−１を活性化する
ことによりＢｃｌ−ｘＬ又はＶＥＧＦの発現を誘導する
ジンセノサイド類からなる医薬組成物に関する。本発明
は、被検物質を培養細胞に投与して、Ｂｃｌ−２蛋白群
の発現調節作用を測定することからなる、血流障害をき
たす疾患の予防、処置又は治療用の医薬組成物を探索す
る方法にも関する。
【００１５】本発明のジヒドロジンセノサイドＲｂ１は
前記した構造式で示されるものであり、ジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１は、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号又
はＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号に記載された方法に
準じてジンセノサイドＲｂ１を原材料として作成するこ
とができる。
【００１６】本発明のジヒドロジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類誘導体は遊離のものを使用するこ
ともできるが、それを適当な塩と使用することもでき
る。また、それらの水和物のような溶媒和物として使用
することもできる。本発明のジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体もしくはそれらの代
謝産物の濃度は、低濃度が好ましく、より具体的には、
患部組織の細胞外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μ
Ｍ）以下、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）
以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以
下、さらに好ましくは１００ｆｇ／ｍｌ（約９０ｆＭ）
以下となる濃度である。本発明のジヒドロジンセノサイ
ドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体を、静脈内投与
用製剤又は皮膚外用剤として使用する場合にも、患者の
患部における細胞外液濃度が前記の濃度になるように製
剤を調整することが好ましい。本発明の医薬組成物や製
剤は、患部の細胞外液濃度が０．０００００１〜１００
ｆｇ／ｍｌ程度の濃度であっても充分な効果が得られ
る。なお、天然のジンセノサイド類の細胞外液濃度につ
いてはＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号又はＰＣＴ／Ｊ
Ｐ００／０５５５４号に記述されている。
【００１７】本発明のジンセノサイド類を含有してなる
静脈内投与用製剤は、血管内、好ましくは静脈に直接投
与できるものであればよく、単回静脈内注入用製剤であ
っても、静脈内持続投与用製剤であってもよい。また、
点適用組成物などの静脈投与製剤に添加して使用できる
剤型であってもよい。本発明の医薬組成物は、静脈内投
与製剤、皮膚外用剤、粘膜外用剤が好ましいが病変部局
所外用剤、病変部局所注射剤、経口投与製剤、点鼻薬、
点眼薬、眼軟膏、点耳薬、坐薬（腟坐薬を含む）、皮下
注射薬、皮内注射薬、筋肉注射薬、吸入薬、舌下薬、経
皮吸収薬等、任意の又は公知の投与経路が選択できる。
また徐放剤として使用してもよい。
【００１８】後述の実施例で示すごとく、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１は静脈内投与で脳血管障害特には脳梗
塞病巣面積を非投与群の１／３程度にまで縮小させ、し
かも細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強ならび
にカスパーゼ３の発現抑制というユニークな作用機序を
有し、あらゆる種類の細胞特には脳・神経細胞を保護す
るものであり、急性期・慢性期の脳梗塞のみならず脳出
血・クモ膜下出血・脳塞栓の急性期や慢性期あるいは一
過性脳虚血発作などの脳血管障害に対しても、神経保護
薬として利用することができる。すなわちジヒドロジン
セノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体もしく
はその代謝産物又はそれらの塩は脳卒中などの脳血管障
害が疑われる患者に対して救急車の中でも点滴静注が可
能な物質である。なお、ジンセノサイドＲｂ１などの天
然のジンセノサイド類もＷＯ００／３７４８１に記載の
ごとくジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサ
イド類誘導体と同様の効果・効能・用途を有する。
【００１９】本発明のジヒドロジンセノサイドＲｂ１は
静脈内投与により、脳血管障害特には脳梗塞病巣面積を
コントロールの１／３程度に縮小するのみならず、虚血
巣周辺部（ischemic penumbra）で破綻・減少した血管
網をＶＥＧＦ発現増強を介してほぼ正常状態にまで復す
ることができるとされる。従って、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体の静脈内投与
は脳卒中後に破綻あるいは減少した脳血管網の再生・再
構築を促進することにより、同医薬組成物の静脈内投与
終了後もひとたび救済された脳組織を時間を経過しても
正常に機能させることができる。すなわち、本発明のジ
ヒドロジンセノサイドＲｂ１は、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白の発
現増強、カスパーゼ３発現抑制ならびにアポトーシス様
神経細胞死抑止という神経細胞への直接的な保護効果に
加えて、脳血管網を始めとする血管の再生・再構築とい
うより間接的かつ長期に起きる防御機構を介して、虚血
状態に陥った脳などの生体組織を守ることができる。さ
らに本発明のジンセノサイド類からなる医薬組成物は、
細胞の転写因子ＳＴＡＴ５又は転写因子ＨＩＦ−１を活
性化せしめることによりＢｃｌ−ｘＬ発現又はＶＥＧＦ
発現を誘導する。従って、本発明の医薬組成物は、転写
因子ＳＴＡＴ５を活性化できるサイトカイン類（インタ
ーロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン
５、インターロイキン７、インターロイキン９、インタ
ーロイキン１５、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺
激因子、エリスロポエチン）、成長ホルモン、プロラク
チン等と同様の作用を示すと言える。また、本発明の医
薬組成物は、ＳＴＡＴ５の活性化を介して、β−カゼイ
ン、オンコスタチンM等の転写をも誘導すると考えられ
る。一方、本発明の医薬組成物は転写因子ＨＩＦ−１の
活性化を介して、ＶＥＧＦのみならずエリスロポエチ
ン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＶＥ
ＧＦ受容体（ＦＬＴ−１）、解糖系諸酵素、１型・３型
グルコーストランスポーター、アデニル酸キナーゼ３、
ヘムオキシゲナーゼ又はチロシン脱水素酵素の発現をも
誘導すると言える。
【００２０】一般臨床の場では、脳血管障害後に新たな
発作がないにもかかわらず高次神経機能が持続的に低下
し、いわゆる脳卒中後遺症状が悪化の一途をたどる症例
があとを絶たない。その理由の１つとして脳卒中発作で
破綻もしくは減少した脳血管網の再生又は再構築が時と
して不十分なことが挙げられる。このような脳卒中後遺
症状の改善のために、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類誘導体の静脈内投与、挿肛投与、
挿腟投与又は点眼投与が著効を示すことが期待される。
【００２１】前述のごとく、本発明のジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体はＶＥＧＦ
発現増強を介して血管の新生・再生・再構築という新規
な効果・効能を示す故、血流障害を主症状とする疾病又
は病態（たとえば一過性脳虚血発作、糖尿病、心不全、
心筋症、血栓性静脈炎、骨折、神経変性疾患、膠原病、
脳血管障害、脳出血、クモ膜下出血、脳梗塞、動脈硬化
症、末梢循環不全、免疫不全病、エイズ、骨髄異形成症
候群、骨粗鬆症、変形性膝関節症、変形性脊椎症、狭心
症、心筋梗塞、血管炎、網膜中心動静脈閉塞症、肝・腎
・心・脳虚血再灌流障害、血管損傷、血色不良、冷え
症、ベーチェット病、糖尿病性神経症、肉体疲労、痔
疾、創傷、熱傷、凍傷、電撃症、レーザー傷害、播種性
血管内凝固症候群、二次性貧血、出血性ショック、遺伝
性球状赤血球症、角膜創傷、放射線障害、紫外線障害、
褥創、糖尿病性皮膚潰瘍、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎
症、貧血、腎性貧血、再生不良性貧血、血栓性血小板減
少性紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、大動脈炎症候
群、紫斑病、急性末梢動脈閉塞症、閉塞性血栓血管炎、
閉塞性動脈硬化症、レイノー病、レイノー症候群等）に
効果・効能を示す。たとえば、糖尿病性網膜症の光凝固
療法を実施する際にも、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体を全身投与しておけば、
光凝固後の網膜血管再生・再構築が促進される。もちろ
んこれらの血流障害を主症状とする疾病において、血流
障害にさらされた当該組織における細胞死を、Ｂｃｌ−
ｘＬ発現増強及び／又はカスパーゼ３発現抑制を介し
て、抑止することもジヒドロジンセノサイドＲｂ１の忘
れてはならない効能である。従って、末梢組織の血流障
害においてもジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体は少なくとも２つの作用機構を介し
て、組織障害を軽減することが期待される。なお、ジン
セノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類も同様
の効果・用途・効能を有する。さらに、ＰＣＴ／ＪＰ０
０／０５５５４号に記載のごとく、ジンセノサイド類は
生体組織の再生・再構築促進作用を介して、上記の疾患
の予防、処置又は治療に優れた効果を示す。
【００２２】ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体からなる医薬組成物は、後述の実施
例で示すごとく、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強及び／又はカス
パーゼ３発現抑制を介して細胞特には神経細胞のアポト
ーシスもしくはアポトーシス用神経細胞死を抑止するの
で、アポトーシス、細胞死もしくはアポトーシス様細胞
死をきたすあらゆる疾患（病態を含む）の予防、治療又
は処置に利用できる。ジヒドロジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類誘導体の適応が期待される細胞
死、アポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死をきた
す疾患や病態としては、成書（今日の治療指針；総編
集、多賀須幸男、尾形悦郎；医学書院、2000）に記載さ
れたすべての疾患や病態が考えられるが、以下にそれら
の代表例を記述する。すなわちアポトーシス様神経細胞
死、アポトーシス様細胞死もしくはアポトーシスを伴う
一次性・二次性神経変性疾患（アルツハイマー病、ピッ
ク病、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、脱髄疾患、舞
踏病を始めとするポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化
症、緑内障、老人性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜
中心動静脈閉塞症、網膜剥離、網膜色素変性症、エイズ
脳症、肝性脳症、脳炎、脳性マヒ、頭部外傷、脊髄損
傷、一酸化炭素中毒、新生児仮死、末梢神経障害、痙性
対麻痺、脳腫瘍、脳炎、アルコール中毒、中毒性神経疾
患、スフィンゴリピドーシス、進行性核上性麻痺、脊髄
血管障害、ミトコンドリア脳筋症、髄膜炎等）ならびに
脳卒中、神経外傷、頭部外傷、一過性脳虚血発作、脊髄
損傷、筋・肝臓・腎臓の虚血再灌流障害、心筋症、心不
全、心筋梗塞、狭心症、末梢循環不全、褥創、創傷、自
己免疫病、免疫不全病、臓器移植後の拒絶反応、筋ジス
トロフィー、角膜損傷、放射線障害、紫外線障害、感染
症、膠原病、大動脈炎症候群、急性動脈閉塞症、閉塞性
血栓血管炎、閉塞性動脈硬化症、レイノー病、糖尿病、
エイズ、レイノー症候群、血栓性静脈炎、膵炎、肝炎、
腎炎、糖尿性心筋症、舌痛症、大動脈炎症候群、膠原
病、急性末梢動脈閉塞症、閉塞性血栓血管炎、閉塞性動
脈硬化症、血栓性静脈炎、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎
症、網膜中心動静脈閉塞症、急性末梢循環不全、ショッ
ク、レイノー病、レイノー症候群、痔疾、貧血、再生不
良性貧血、悪性新生物、心筋梗塞、皮膚潰瘍、骨粗鬆
症、末梢循環不全、狭心症、肝・腎・心虚血再灌流障害
などが挙げられるが、これらの疾患や病態に限定される
ものではない。なお、ジンセノサイドＲｂ１などの天然
のジンセノサイド類も同様の効果・用途・効能を有す
る。
【００２３】後述の実施例で示すごとく、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１は中大脳動脈皮質枝（ＭＣＡ）永久閉
塞ラット（体重約３００ｇ）において、１日量６μｇ又
は０．６μｇの静脈内投与で脳梗塞体積を非投与群の３
分の１程度に縮小せしめる。しかも本発明のジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１は、後述の実施例で示すごとく脊髄
損傷ラットに対して、１．２μｇ／日の投与量でも優れ
た効果・効能を示す。すなわち、低用量のジヒドロジン
セノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体はジン
セノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類と同様
に、脊髄損傷や神経外傷に伴う諸症状や病態、たとえば
神経組織の二次変性、浮腫、脳浮腫、神経組織の浮腫、
オリゴデンドロサイトのアポトーシス又はアポトーシス
様細胞死、脱髄、血管の損傷、神経因性膀胱、自律神経
障害、感覚障害、排尿障害、排便障害、性機能障害、皮
膚潰瘍、褥創、神経麻痺、末梢循環不全等の予防、処
置、治療に有用とされる。
【００２４】このような実験結果に基づけば、体重６０
ｋｇの血流障害を有する患者もしくは細胞死をきたす疾
患を有する患者へのジンセノサイド類誘導体の至適静脈
内投与量は、体重当たりで計算すると１日当たり０．１
２ｍｇから１．２ｍｇということになる。従って、本発
明の医薬組成物の体重６０ｋｇのヒト又は脊椎動物に対
する１日当たりの全身投与量（経口投与量を含む）は、
患者の個人差や病状にもよるが、０．００１ｍｇ以上、
好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上で
ある。本発明の医薬組成物は副作用が少なく、前記疾患
又は病態の予防、処置又は治療のための全身投与量（経
口投与量を含む）の上限としてはかなり多量にすること
もできるが、１日当たり２０ｇ以下、好ましくは２ｇ以
下、より好ましくは０．２ｇ以下である。本発明の医薬
組成物を前記疾患の予防、処置又は治療のために全身投
与するときは、投与量の下限は、有効な細胞外液濃度か
ら判断して、１日当たり０．０１ｆｇ前後である。本発
明の医薬組成物を病変部局所に外用投与するときは前記
全身投与量の１０分の１から１００分の１程度にすれば
よい。なお、ジンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセ
ノサイド類の投与量は、ジンセノサイド類の投与量と同
じかそれより１０倍程度多いと考えられる。
【００２５】本発明の医薬組成物の投与方法としては、
静脈内投与が好ましく、前記した投与量を断続的又は連
続的に投与することができる。本発明の有効成分である
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類
誘導体は、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号又はＰＣＴ
／ＪＰ００／０５５５４号に記載のジンセノサイドＲｂ
１と同様に通常の方法により製剤化することができる。
例えば、本発明の水溶性医薬組成物は、凍結乾燥結晶を
生理食塩水、蒸留水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液等の生
物学的（薬学的）に許容できる担体に溶解することによ
り静脈内投与用製剤とすることができる。生物学的又は
薬学的に許容できる担体として、脂肪乳剤、リポソーム
製剤を使用してもよい。静脈内投与するときの製剤の濃
度としてはあまり高濃度でない限り任意の濃度に調整す
ることができ、例えば０．０００００１〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｍｌ程度にして投
与することができる。本発明の医薬組成物を病変部局所
に投与するときは体重６０ｋｇのヒト又は脊椎動物に対
して１日当たり、１ｍｇ以下又は未満、好ましくは１μ
ｇ以下、より好ましくは１ｎｇ以下である。病変部局所
投与量の上限は１日当たり１０ｍｇ程度である。ジンセ
ノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類も同様の
方法により投与することができる。
【００２６】経口投与のためには、固形製剤あるいは液
体製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば
錠剤、丸剤、散剤あるいは顆粒剤がある。このような固
形製剤においては活性物質が薬学的に許容しうる担体、
例えば重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、ばれいしょ
でんぷん、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセ
ルロースなどと混合される。製剤操作は常法に従って行
われるが、上記担体以外の製剤化のための添加剤、例え
ばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム
のような潤滑剤を含有してもよい。
【００２７】上記のような固形製剤に、例えばセルロー
スアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロースフタレート、ポリビニルアルコールフタレー
ト、スチレン無水マレイン酸共重合体あるいはメタクリ
ル酸、メタクリル酸メチル共重合体のような腸溶性物質
の有機溶媒による溶液、あるいは水溶液を噴霧して腸溶
性被覆を施し、腸溶性製剤とすることもできる。散剤、
顆粒剤などの固形製剤は腸溶性カプセルで包むこともで
きる。
【００２８】経口投与のための液体製剤は、例えば乳濁
剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤あるいはエリキシル剤
を含む。これらの製剤は一般的に用いられる薬学的に許
容される担体、例えば水あるいは流動パラフィンを含
む。ココナッツ油、分画ココナッツ油、大豆油、とうも
ろこし油等の油性基剤を担体として用いることもでき
る。
【００２９】薬学的に許容しうる担体には、その他必要
に応じて通常用いられる補助剤、芳香剤、安定化剤、あ
るいは防腐剤を含む。また、液体製剤はゼラチンのよう
な吸収される物質で作られたカプセルに入れて投与して
もよい。腟内投与又は直腸内投与のための固形製剤とし
ては、活性物質を含み、公知の方法により製造される坐
薬が含まれる。このようなジンセノサイド類を含有する
坐薬は、直腸又は肛門局所における痔疾などの血流障害
をきたす疾患の予防、処置もしくは治療のための粘膜外
用剤又は皮膚外用剤として使用してもよいし、血流障害
をきたす疾患又は病態の予防、処置もしくは治療のため
の全身投与剤として使用してもよい。
【００３０】ジンセノサイド類誘導体を含有してなる非
経口投与の製剤は、無菌の水性あるいは非水性液剤、懸
濁剤または乳濁剤として投与される。非水性の溶液また
は懸濁剤は、例えばプロピルグリコール、ポリエチレン
グリコール、オリーブ油または大豆油のような植物油、
オレイン酸エチルのような注射し得る有機エステルを薬
学的に許容し得る担体とする。このような製剤はまた防
腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤のような補助
剤を含むことができる。これらの溶液剤、懸濁剤および
乳濁剤は、例えばバクテリア保留フィルターを通す濾
過、加熱、殺菌剤の配合あるいは紫外線照射等の処理を
適宜行うことによって無菌化できる。また、無菌の固形
製剤を製造し、使用直前に無菌水または無菌の注射用溶
媒に溶解して使用することもできる。また、大豆油等の
植物油と、シチレン等のリン脂質と、本発明で用いるジ
ンセノサイド類誘導体との均一溶液に水を加え、例えば
加圧噴霧射ホモジナイザー、超音波ホモジナイザーなど
のホモジナイザーにより均質化を行った脂肪乳剤なども
注射剤として使用できる。以上と同様の方法で、ＰＣＴ
／ＪＰ００／０５５５４号及びＰＣＴ／ＪＰ００／０４
１０２号に記載の天然のジンセノサイド類、特にジンセ
ノサイドＲｂ１も製剤化することができる。
【００３１】ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体は、ＷＯ００／３７４８１号に記載
のジンセノサイドＲｂ１と同様に、皮膚移植用ケラチノ
サイト培養シートの保護・保存・維持にも有効とされ
る。また、培養皮膚の保存のみならず培養皮膚作成のた
めの細胞の保存・維持・再生、人工臓器作成のための幹
細胞の保存・維持、ならびに移植用臓器・組織又は細胞
（肝臓、腎臓、心臓、膵臓、肺、髄膜、骨、関節、靱
帯、消化管、角膜、皮膚、血管、末梢神経等）の保存・
維持にも有用と考えられる。さらに、ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、特願２
０００−４０３２０３号又は特願２００１−０４９３６
８号に記載されたごとく、ジンセノサイドＲｂ１などの
天然のジンセノサイド類と同様に、輸血用血球成分・血
小板の保存・維持、凍結細胞（精子、卵子、皮膚ケラチ
ノサイト、臍帯血、ＥＳ細胞、受精卵、幹細胞等）や凍
結培養皮膚シートの保存用組成物としても利用可能であ
る。
【００３２】また、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ
１を化学的に修飾することにより新規に得られたジヒド
ロジンセノサイドＲｂ１もしくはその代謝産物又はそれ
らの塩がＶＥＧＦ発現増強作用を介して血管再生・再構
築促進作用を示すことを始めて見出したものであり、従
って本発明は、ジンセノサイドＲｂ１又はその代謝産物
を、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用の他
の有効成分を探索するためのリード化合物として使用す
ることができることを証明するものである。また、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体の化学構造の一部を修飾してプロドラッグを作成した
のちに、任意の又は公知の投与経路を選択することも可
能である。このようなプロドラッグとしては、たとえば
ジンセノサイド類誘導体の水酸基をエステル化したもの
などが考えられるが、これに限定されるわけではない。
なお、本明細書における血流障害（病態を含む）として
は、例えば生体組織の損傷、創傷、外傷、熱傷もしくは
欠損により生じるものであってもよいし、外部からの物
理的又は化学的な力によるもの、外科的処置及び手術に
おける切断又は縫合によるもの、血管の老化、再生不良
又は新生不良によるもの、血管の破綻・破裂・閉塞によ
るもの、貧血や骨折によるもの、血栓や動脈硬化などの
病的なものなどのいずれの原因による障害であってもよ
い。また、血色不良、冷え症、肉体疲労なども血流障害
による病態の中に含まれる。
【００３３】本発明の「ジンセノサイド類」としては、
薬用人蔘の成分であるジンセノサイドＲｂ１などの天然
のジンセノサイドとよばれている化合物であり、これを
含有している薬用人蔘などの天然物又はその抽出物、エ
キス、分画成分、若しくは精製分画などであってもよ
く、さらに天然に存在するジンセノサイドＲｂ１などの
ジンセノサイド化合物（すなわち天然のジンセノサイド
類）を化学的な手段で化学修飾して誘導された化合物
（すなわちジンセノサイド類誘導体）であってもよい。
【００３４】本発明における「ジンセノサイド類」又は
天然に存在しているジンセノサイド化合物としては、例
えば次のものが挙げられる。すなわち、ジンセノサイド
Ｒｏ（ginsenoside Ro；チクセツサポニンＶ；chikuset
susaponin V；サポニンＡ；saponin A）、ジンセノサイ
ドＲａ１（ginsenoside Ra１）、ジンセノサイドＲａ２
（ginsenoside Ra２）、ジンセノサイドＲｂ１（ginsen
oside Rb１；サポニンＤ（saponin D）、ジンセノサイ
ドＲｂ２（ginsenoside Rb２）、ジンセノサイドＲｂ３
（ginsenoside Rb３）、ジンセノサイドＲｃ（ginsenos
ide Rc）、ジンセノサイドＲｄ（ginsenoside Rd）、ジ
ンセノサイドＲｅ（ginsenoside Re）；ジンセノサイド
Ｒａ３（ginsenoside Ra３）；ノトジンセノサイドＲ４
（notoginsenoside R４）；キンケノサイドＲ１（kinke
noside R１）；ジンセノサイドＲｓ１（ginsenoside Rs
１）；ジンセノサイドＲｓ２（ginsenosideRs２）；
（２０ｓ）−ジンセノサイドＲｇ３（20s-ginsenoside
Rg３）；２０−グルコジンセノサイドＲｆ（20-glucogi
nsenoside Rf）；ノトジンセノサイドＲ１（notoginsen
oside R１）；ジンセノサイドＲｆ（ginsenoside R
f）；（２０Ｒ）−ジンセノサイドＲｇ２（20R-ginseno
side Rg２）；（２０Ｒ）−ジンセノサイドＲｈ１（20R
-ginsenoside Rh１）；ジンセノサイドＲｆ（ginsenosi
de Rf）；ジンセノサイドＲｇ１（ginsenosideRg１）；
ジンセノサイドＲｇ２（ginsenoside Rg２）；チクセツ
サポニンＩ（chikusetsusaponin I）；ジンセノサイド
Ｒｇ３（ginsenoside Rg３）；ジンセノサイドＲｈ
１（ginsenoside Rh１）；ジンセノサイドＲｈ２（gins
enoside Rh２）；マロニルジンセノサイドＲｂ１（maro
nylginsenoside Rb１）；マロニルジンセノサイドＲｂ
２（maronylginsenoside Rb２）；マロニルジンセノサ
イドＲｃ（maronylginsenoside Rc）；マロニルジンセ
ノサイドＲｄ（maronylginsenoside Rd）；チクセツサ
ポニンＩａ（chikusetsusaponin Ia）；チクセツサポニ
ンＩｂ（chikusetsusaponin Ib）；チクセツサポニンII
I（chikusetsusaponin III）；チクセツサポニンIV（ｃ
hikusetsusaponin IV）；サポニンＢ（saponin B）；チ
クセツサポニンIVａ（chikusetsusaponin IVa）；サポ
ニンＣ（saponin C）；プロトパナキサジオール（proto
panaxadiol）、プロトパナキサトリオール（protopanax
atriol）、オレアノール酸（oleanolic acid）等、又は
これらの化合物の立体異性体である。本発明において、
これらのジンセノサイド類は、互いに化学構造が類似し
ているため共通の効果・効能・用途を有すると考えられ
るので、単独で用いることもできるし、あるいは、異な
る複数のジンセノサイド類を組み合わせて同時に用いる
こともできる。
【００３５】また、本発明の「ジンセノサイド類」にお
けるジンセノサイド化合物を含有している薬用人蔘など
の天然物又はその抽出物、エキス、分画成分、若しくは
精製分画としては、前記したジンセノサイド化合物を比
較的多量に含有している天然物であればよく、当該天然
物そのままであっても、それからジンセノサイド化合物
を含有する成分を抽出して濃縮した抽出物であってもよ
く、当該抽出物を液状又は個体状に製剤化したエキスま
たは錠剤であってもよく、さらに当該抽出物を精製分離
したジンセノサイド化合物を含有する分画、例えばサポ
ニン分画などであってもよく、さらに、ジンセノサイド
化合物含有分画を精製してジンセノサイド化合物が主成
分の精製物であってもよい。好ましい、ジンセノサイド
化合物を含有している薬用人蔘などの天然物又はその抽
出物、エキス、分画成分、若しくは精製分画としては、
例えば、薬用人蔘、薬用人蔘エキス、又は薬用人蔘の粗
サポニン分画などが挙げられる。なお、本発明のジンセ
ノサイド類は医薬組成物としてのみならず、化粧品組成
物、ケミカルピーリング用組成物、発毛育毛用組成物、
粘膜外用組成物、動植物の成長調整用組成物としても利
用可能であることがＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号に
おいて見出されている。加えて、ジンセノサイド類はフ
ィジカルピーリング用組成物、特定保健用食品の組成
物、ＯＴＣ製剤の組成物又は栄養補助食品の組成物とし
ても利用される。ＯＴＣ製剤の組成物として本発明の医
薬組成物を利用するときは、虚弱体質、肉体疲労、病中
病後、胃腸虚弱、食欲不振、血色不良、冷え症に有効と
される。なお、ＯＴＣ製剤の組成物も本発明では医薬組
成物の中に含むものとする。ジンセノサイド類からなる
ケミカルピーリング用組成物又はフィジカルピーリング
用組成物は、特にはピーリング終了直後よりピーリング
部位にＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号に記載のごとく
低濃度のものを外用投与すればピーリング部位の皮膚組
織再生が促進される。もちろん、本発明のケミカルピー
リング用組成物又はフィジカルピーリング用組成物は、
ピーリング前もしくはピーリング中に外用投与してもよ
い。
【００３６】また、天然に存在するジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド化合物を化学的な手段で化学修
飾して誘導された化合物としては、前記した天然のジン
セノサイド類の化学構造を以下の要領で修飾したものを
いう（本明細書においてはこれらの化合物を「ジンセノ
サイド類誘導体」という。）。すなわち、（１）ジンセ
ノサイド類のステロイド様骨格（ダマラン骨格）に結合
している側鎖（カーボンチェーン）の二重結合を還元し
たもの（いわゆるジヒドロジンセノサイド類）及び／又
はジンセノサイド類の糖がitol（イトール）類に還元さ
れたもの（２）ジンセノサイド類の水酸基をアシル化又
はアセチル化したもの、（３）アシル化又はアセチル化
に加えて側鎖（カーボンチェーン）の二重結合を単結合
にして、同部に任意の官能基（たとえば１つまたは複数
の水酸基）を結合させたもの又は二分子の水酸基を脱水
してエポキシ化したもの、（４）アシル化又はアセチル
化に加えて側鎖の二重結合を切断して末端をアルデヒド
基にしたもの、（５）アシル化又はアセチル化に加えて
側鎖の末端にアルキル基やアリル基等任意の官能基を結
合させたもの、（６）アシル化又はアセチル化に加えて
側鎖の二重結合を切断してカルボキシル基を結合させた
もの、（７）側鎖の二重結合を切断してカルボキシル基
を結合させたもの、（８）側鎖末端にある一方のメチル
基を水素原子に置換し、他方のメチル基をアルキル基や
アリル基等任意の官能基に置換したもの、（９）側鎖の
二重結合を単結合にして、同部に任意の官能基たとえば
１つまたは複数の水酸基を結合させたもの又は二分子の
水酸基を脱水してエポキシ化したもの、（１０）側鎖の
二重結合部にシクロペンタジエン等のジエン化合物を用
いてディールスアルダー（Diels-Alder）反応を施した
もの、（１１）プロトパナキサジオール、プロトパナキ
サトリオール、ダマラン、オレアノール酸又はそれらの
還元体を基本骨格として有する任意の化合物、である。
なお、前記したジンセノサイド類（特にプロトパナキサ
ジオール系サポニンとプロトパナキサトリオール系サポ
ニン）の誘導体については、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１
０２号（薬用人蔘からなる脳細胞または神経細胞保護
剤）及びＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号（ジンセノサ
イドＲｂ１からなる皮膚組織再生促進剤）にも記載され
ている。さらに、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号にお
いては、上記ジンセノサイド類誘導体の１つであるジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１の神経細胞保護作用、作成法
ならびにＮＭＲチャート等が記述されている。なお、前
記したジンセノサイド類誘導体は、ＰＣＴ／ＪＰ００／
０４１０２号、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号及び特
願２０００−４０３２０３号に記載されたジンセノサイ
ドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果、効
能、用途をすべて兼ね備えていると考えられる。なお、
現時点で合成困難である天然のジンセノサイド類をリー
ド化合物として利用することにより新規の薬効を有する
化合物を作成するという試みは、本発明者が最初に実施
したものである。
【００３７】また、ジンセノサイド類の中でもやや異な
る化学構造を有するオレアノール酸たとえばジンセノサ
イドＲｏ（チクセツサポニンＶ）については、以下の要
領で化学修飾したものが挙げられる。すなわち（１）ジ
ンセノサイド類（オレアノール酸）のステロイド様骨格
もしくはアグリコンの化学構造に１ヶ所存在する二重結
合を還元したもの（いわゆるジヒドロジンセノサイド
類）、（２）（１）の還元部位の水素原子を任意の官能
基（たとえば水酸基、アルキル基、アリル基等）に置換
したもの、（３）カルボキシル基をエステル化したも
の、（４）水酸基をアシル化又はアセチル化したもの、
（５）ならびに（１）〜（４）の修飾法のいずれか２つ
以上を組み合わせたもの、である。以上記述したジンセ
ノサイド類誘導体又はそれらの立体異性体は、互いに化
学構造が類似しているため、共通の効果・効能・用途を
有すると考えられるので、本発明において単独で用いる
こともできるし、あるいは、異なる複数のジンセノサイ
ド類誘導体又はジンセノサイド類と組み合わせて同時に
用いることもできる。
【００３８】本発明のジンセノサイド類誘導体の代謝産
物としては、本発明のジンセノサイド類誘導体が生体内
において代謝を受けた結果生産される化合物特には糖鎖
が切断されたものであり、本発明の有効成分は前記した
ジンセノサイド類誘導体に限定されるものではなく、こ
れらの生体内での代謝産物であって、本発明の目的を達
成することができる化合物である。なお、本発明の医薬
組成物は当然のことながら獣医薬組成物としても利用可
能であるが、本明細書では獣医薬組成物という表現は省
略することとする。
【００３９】次に本発明の低用量・低濃度のジンセノサ
イド類の脳血管障害治療効果、血管再生・再構築促進作
用、創傷治療効果、脊髄損傷治療効果、ＶＥＧＦ発現増
強作用、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強作用、カスパーゼ３発現
抑制作用、転写因子ＳＴＡＴ５・ＨＩＦ−１活性化作
用、等について具体例に基づいて詳細に説明する。この
ため、本発明のジンセノサイド類誘導体として代表的な
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１ならびに天然のジンセノ
サイド類として代表的なジンセノサイドＲｂ１を用いた
実験結果に基づいて説明する。
【００４０】本発明者らはまずジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１を作成した。以下にジヒドロジンセノサイドＲｂ
１の製造例ならびにＮＭＲのデータを示す。（１）１０
％Ｐｄ／Ｃ（パラジウムチャーコール）１０．２ｍｇを
秤量し、活セン付２口フラスコに入れる（２）メタノー
ル（特級）を１ｍｌ加えて懸濁させる。（３）水素風船
（約１．１気圧）をとりつけ３０分０℃で触媒を活性化
する。（４）ジンセノサイドＲｂ１ １９．９ｍｇをメ
タノール１ｍｌで溶かし注射器で注入する。（５）混合
物を１０時間半０℃で磁気スターラーにより激しく撹拌
する。（６）反応混合物をろ紙及び０．４５μｍのメン
ブランフィルターでろ過する。（７）メタノールを減圧
除去する。（８）純水１０ｍｌに溶解させたのち凍結乾
燥すると１９．１ｍｇ（収率９７％）のジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１を白色粉末として得た。ジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１の融点は１９３〜１９５℃である。ちな
みに、ジンセノサイドＲｂ１の融点は１９７〜１９８℃
（文献値）である。図１にジヒドロジンセノサイドＲｂ
１のＮＭＲチャート（400MHz, CD３OD）を示す。
【００４１】次に本発明者らは、前記の方法により得ら
れたジヒドロジンセノサイドＲｂ１が、細胞に対して好
ましい効果を及ぼす濃度をまず通常の培養実験で調べ
た。このため、本発明者らは培養神経細胞のアポトーシ
スもしくはアポトーシス様神経細胞死が、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１により抑止される濃度を調べた。本発
明者ら（阪中、田中）は、培養神経細胞を一酸化窒素供
与体であるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）に短
時間暴露すると神経細胞のアポトーシスもしくはアポト
ーシス様神経細胞死が誘導されることを報告している
（Toku K. et al., J. Neurosci. Res., 53, 415-425,
1998）。この培養実験系を用いて、本発明者らはすでに
ジンセノサイドＲｂ１が１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適細
胞外液濃度域で神経細胞のアポトーシスもしくはアポト
ーシス様神経細胞死を抑止することを見出している（Ｗ
Ｏ００／３７４８１号）。そこで、同様の実験系を用い
てジヒドロジンセノサイドＲｂ１の神経細胞保護作用を
調べた。
【００４２】妊娠１７日齢のラットの胎仔大脳皮質よ
り、トリプシンＥＤＴＡを用いて神経細胞を分離し、ポ
リエルリジンコートした２４ウェルプレートに蒔いた。
１０％牛胎仔血清を含むダルベコの修飾イーグル培地
（Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ））
中で１６時間培養後、培養液をインシュリン、トランス
フェリン等を含む神経細胞培養用無血清培地に置き換
え、３ないし４日間培養した。培養３または４日目に、
３００μＭの濃度でニトロプルシッドナトリウム（ＳＮ
Ｐ）を添加し、１０分間インキュベートした。その後、
培養液をジヒドロジンセノサイドＲｂ１（０〜１ｎｇ／
ｍｌ）及び牛血清アルブミンを含むイーグルの最低必要
培地（Eagle's minimum essential medium（ＥＭＥ
Ｍ））に置き換えた。ＳＮＰ負荷後１６時間目にLaemml
iの電気泳動用サンプル緩衝液を用いて神経細胞を溶解
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動蛋白
をニトロセルロース膜に転写後、神経細胞特異蛋白質Ｍ
ＡＰ２に対する抗体を用いてイムノブロッティングを行
った。神経細胞の生存率及び／又は突起伸長を定量する
ため、免疫染色されたＭＡＰ２のバンドをデンシトメト
リーにより解析した。結果を図２及び図３に示す。な
お、ＭＡＰ２イムノブロットの実験手技の詳細について
は、本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文に記述され
ている（Wen, T-C. et al., J.Exp.Med., 188, 635-64
9, 1998）。
【００４３】図２はミクロチュブル関連蛋白２（microt
uble-associated protein 2（ＭＡＰ２））のイムノブ
ロットの結果を示す、図面に代わる写真である。左から
１番目のレーンがコントロールの培養神経細胞であり、
明らかなＭＡＰ２のバンド（すなわち神経細胞のマーカ
ーのバンド）が認められた。ＳＮＰ処理をすると、多く
の神経細胞がアポトーシスもしくはアポトーシス様神経
細胞死に陥るので、ＭＡＰ２のバンドが左から２番目の
レーンのごとく明らかに弱くなった。ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を０．０１ｆｇ／ｍｌ（レーン３）から１
ｎｇ／ｍｌ（レーン７）の濃度で培養メディウムに添加
しておくと、ＳＮＰによる神経細胞のアポトーシス又は
アポトーシス様神経細胞死が明らかに抑止され、その結
果神経細胞の生存及び／又は突起伸長の指標であるＭＡ
Ｐ２の強いバンドが観察された。
【００４４】前述のＭＡＰ２のイムノブロット実験を５
回くり返し、結果をデンシトメトリー解析したものが図
３である。図３に示すごとく、０．０１ｆｇ／ｍｌ〜１
ｎｇ／ｍｌの至適細胞外液濃度域のジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１は有意に神経細胞のアポトーシスもしくはア
ポトーシス様神経細胞死を抑止することが判明した。す
なわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ＷＯ００／
３７４８１号に記載のジンセノサイドＲｂ１よりもかな
り広い至適細胞外液濃度域で、細胞特には神経細胞に対
して好ましい抗アポトーシス作用を発揮すると考えられ
る。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジ
ンセノサイド類誘導体は神経突起を伸長せしめることに
より、神経組織の再生及び／又は再構築をも促進すると
考えられる。従って、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類誘導体は、患部組織における細胞
外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以下、好ま
しくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、より好ま
しくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以下、さらに好ま
しくは０．０００００１ｆｇ／ｍｌ（約０．０００００
０９ｆＭ）〜１００００ｆｇ／ｍｌ（約９０００ｆＭ）
のときに細胞のアポトーシスもしくはアポトーシス様細
胞死を抑止することにより、優れた細胞保護作用を発揮
すると考えられる。すなわち、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、血流障害にさ
らされた生体組織の細胞を、抗アポトーシス作用を介し
て保護すると考えられる。ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド類誘導体は移植用組織・臓器の
細胞（幹細胞、受精卵、胚、ＥＳ細胞、皮膚ケラチノサ
イト等）、あらゆる組織由来の細胞、移植用凍結細胞、
移植用凍結組織、移植用凍結臓器、輸血用血球成分・血
小板、生殖細胞（凍結卵子、凍結精子、凍結受精卵）の
保護又は保存にも有用と考えられる。図３の＊はＰ＜
０．００１を、＊＊はＰ＜０．０００１を示す。統計解
析法はＡＮＯＶＡ＋Scheffeのpost hocテストによる。
【００４５】以上のようにジヒドロジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド類誘導体は、ＷＯ００／３７４
８１号に記載のジンセノサイドＲｂ１よりもかなり広い
至適細胞外濃度域で細胞特には神経細胞のアポトーシス
もしくはアポトーシス様神経細胞死を抑止することがイ
ンビトロ（in vitro）の実験系で明らかにされたが、実
際に血流障害をきたす生体内（in vivo）の動物実験系
でもジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイ
ド類誘導体が、ＷＯ００／３７４８１に記載のジンセノ
サイドＲｂ１と同様に優れた効果を示すかどうかを本発
明者は次にしらべた。このため以下のごとく血流障害を
きたす疾患又は病態としてたとえば脳血管障害を選び、
ジンセノサイド類誘導体の１つであるジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１の静脈内投与が、脳血管障害特には脳梗塞
の治療に有効かどうかをしらべた。
【００４６】約１２〜１６週齡の雄性脳卒中易発症高血
圧自然発症ラット（ＳＨ−ＳＰラット、体重２８０〜３
２０ｇ）を使用した。同動物は１２時間ごとの明暗サイ
クル室で飼育し、水ならびに餌は自由摂取とした。吸入
麻酔下で同動物の左中大脳動脈皮質枝（ＭＣＡ）を凝固
・切離した。ジヒドロジンセノサイドＲｂ１をＭＣＡ永
久閉塞直後に単回静脈内注入し(６μｇ又は０．６μ
ｇ)、その後アルザミニ浸透圧ポンプを用いて２４時間
静脈内へジヒドロジンセノサイドＲｂ１を持続注入(６
μｇ／日又は０．６μｇ／日)した(ｎ＝６)。なお、本
実験手技の詳細については本発明者ら（阪中、田中）の
既発表論文に記述されている（Igase K.et al., J.Cere
br. Blood Flow Metab., 19, 298-306, 1999）。なお、
ＭＣＡを永久閉塞した対照動物（虚血コントロール動
物）には同量の生理食塩水（vehicle、担体又は媒体）
のみを静脈内投与した（ｎ＝７）。MCA永久閉塞後２４
時間目に、致死量のペントバルビタールをラットの腹腔
内に注入した。同動物が死亡した直後に脳を摘出し、２
ｍｍの厚みの前額切片を作成した。同切片を、１％の塩
化２，３，５−トリフェニル-テトラゾリウムクロライ
ド（2, 3, 5-triphenyl-tetrazoliumchloride (TTC)）
溶液に３０分間３７℃で浸漬し、１０％ホルマリンにて
１２時間以上固定した。結果を、図４、図５に示す。図
４は生理食塩水を投与した２例を、図５はジヒドロジン
セノサイドＲｂ１６μｇ／日を静脈内投与した２例を示
す。
【００４７】図４に示すごとく、ＭＣＡ永久閉塞後生理
食塩水を投与したラットでは、向かって左側の大脳皮質
に、ＴＴＣで染色されない白色の脳梗塞病巣が明らかに
認められた。一方、図５に示すごとく、ジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１をＭＣＡ永久閉塞後に静脈内投与したラ
ットでは脳梗塞病巣が顕著に縮小していた。
【００４８】ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を静脈内投
与した脳梗塞ラット（ｎ＝６）の脳梗塞面積と、ビヒク
ル（vehicle（担体又は媒体））のみを投与した脳梗塞
ラットの脳梗塞面積（ｎ＝７）とを比較した。結果を図
６に示す。図６に示すごとくビヒクル（vehicle (salin
e)）投与脳梗塞群の脳梗塞面積に比べて、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１投与脳梗塞群の脳梗塞面積(infarct a
rea)は３分の１程度に縮小していた。図４の統計解析法
はMann-Whitney Uテストにより、＊＊印はＰ＜０．００
１を示す。
【００４９】以上のことより、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１の脳血管障害治療効果特に脳梗塞治療効果は、Ｗ
Ｏ００／３７４８１号で開示されたジンセノサイドＲｂ
１の効果に匹敵するほど優れたものであることが判明し
た。すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジ
ンセノサイド類誘導体は脳血管障害や脳梗塞などの血流
障害をきたす疾患又は病態に効果・効能を発揮すると言
える。また、ＷＯ００／４８６０８号に記載のジンセノ
サイドＲｂ１と同様に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体が、脳血管の再生及び／
又は再構築を促進すると考えられた。そこで本発明者は
さらにジヒドロジンセノサイドＲｂ１の静脈内投与量を
２倍（１２μｇ／日）にして、同様に脳梗塞治療効果が
得られるかどうかをしらべた所、予想に反して優れた効
果は認められなかった。すなわち、ＷＯ００／３７４８
１号においてジンセノサイドＲｂ１は体重３００ｇ程度
のＳＨ−ＳＰラットに対して６０μｇ／日の投与量でも
優れた脳梗塞治療効果を示したが、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体はそのような
高用量では脳梗塞治療効果及び／又は脳血管再生・再構
築促進作用を必ずしも発揮しないと考えられた。従っ
て、体重３００ｇ程度の脳梗塞ラットに対するジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１の至適投与量は、ジンセノサイド
Ｒｂ１の至適投与量よりも低く、詳細には１２μｇ／日
以下と考えられた。このことから、培養実験においては
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ジンセノサイドＲｂ
１よりも幅広い濃度域で神経細胞のアポトーシスもしく
はアポトーシス様神経細胞死を抑止するが、生体内（in
vivo）においてはジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、
ジンセノサイドＲｂ１と同量もしくはその１０分の１か
ら１０００分の１程度という低い投与用量域で優れた脳
梗塞治療効果及び脳血管再生・再構築促進作用を発揮す
ると言える。ただし、その他のジンセノサイド類誘導体
たとえばジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキ
シジンセノサイドＲｂ１などは、ジンセノサイドＲｂ１
と同等もしくはそれより１０００倍程度多い投与量・濃
度でジンセノサイドＲｂ１と同様の効果・効能を示すと
考えられる。
【００５０】本発明者は、さらに低用量のジヒドロジン
セノサイドＲｂ１が血流障害をきたす神経外傷たとえば
脊髄損傷においても好ましい効果をもたらすかどうかを
しらべた。ちなみに脊髄損傷や頭部外傷などの神経外傷
でも、血管の破綻や脳・脊髄組織の浮腫のために血流障
害が生じ、非可逆的な高次神経障害がもたらされる。そ
こで、本発明者らは血流障害をきたす疾患の１つとして
脊髄損傷をとりあげ、脊髄損傷に対するジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１の効果をしらべることとした。このた
め、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１．２μｇ／日の
用量で脊髄損傷ラット（体重約３００ｇ）の静脈内へ７
日間持続注入した実験例を以下に述べる。
【００５１】ハロセン、笑気による吸入麻酔下で、ラッ
トの下位胸髄に２０ｇの圧力を２０分間負荷した後、３
０分以上経過してから左大腿静脈にジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１(１．２μｇ)を単回注入し、さらに同静脈へ
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１（１．２μｇ／日）をア
ルザミニ浸透圧ポンプにて７日間持続投与した。対照動
物には同様のスケジュールで同量の生理食塩水（vehicl
e、担体又は媒体）を投与した。結果を図７、図８に示
す。
【００５２】図７及び図８の左側写真は脊髄損傷後２日
目の生理食塩水投与ラットを、図７及び図８の右側写真
は、同時期のジヒドロジンセノサイドＲｂ１(１．２μ
ｇ／日)投与ラットを、それぞれ示している。図７及び
図８の左側写真に示すごとく、下位胸髄に２０ｇの圧力
を２０分間負荷された生理食塩水投与ラットは、脊髄損
傷当日のみならず、脊髄損傷後２日目にも両下肢の対麻
痺を呈した。しかし下位胸髄に２０ｇの圧力を２０分間
負荷した後にジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１．２μ
ｇ／日の用量で静脈内へ持続投与すると、脊髄損傷当日
は下肢の対麻痺を呈していたが、図７及び図８の右側写
真に示すごとく脊髄損傷後２日目には、両下肢の対麻痺
が著しく改善し、ラットは物につかまりながら立ち上が
ることができるようになった。また、ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を８μｇ／日又は６０μｇ／日の用量で脊
髄損傷ラットの静脈内に投与しても優れた効果は認めら
れなかった。
【００５３】以上のことより、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、ＷＯ００／４
８６０８号に記載のジンセノサイドＲｂ１と比較しても
まったく遜色ないくらいに優れた脊髄損傷・神経外傷治
療効果を発揮することが判明した。しかも、体重３００
ｇの脊髄損傷ラットに対するジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１の至適投与量は１．２μｇ／日前後もしくはそれ以
下と考えられた。すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１を神経外傷・頭部外傷・脊髄損傷治療用医薬組成物
として利用するときは、その至適投与量はＷＯ００／４
８６０８号又はＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号に記載
のジンセノサイドＲｂ１の至適投与量（体重３００ｇの
ラットに対して６０μｇ／日）の５０分の１前後又はそ
れ以下となることが判明した。前述のごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は、高純度のジンセノサイドＲｂ
１を原材料として９７％の収率で作成することができる
ので、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ジンセノサイ
ドＲｂ１よりも効率良く、神経外傷・脳卒中などの血流
障害をきたす脳・神経疾患の予防、処置、治療に利用さ
れ得ることになる。
【００５４】脳血管障害（脳梗塞）モデル動物ならびに
脊髄損傷モデル動物を用いた前記の実験結果より、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体は血流障害をきたす疾患特には脳血管障害や脊髄損傷
の予防、処置又は治療のための医薬組成物となることが
発明された。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体は、細胞のアポトーシス
又はアポトーシス様細胞死を抑止するとともに血管の再
生・再構築を促進することにより、血流障害をきたす疾
患（たとえば脳血管障害、頭部外傷、神経外傷、脊髄損
傷等）の予防、処置又は治療に効果・効能を示すと考え
られる。
【００５５】さて、以下に脊髄損傷の病態についてもう
少し述べることにより、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体の効果・効能につき追記
することとする。脊髄のある分節たとえば下位胸髄に圧
負荷が加わり脊髄損傷が生じると、同部の灰白質神経細
胞のみならず同部の白質伝導路が障害を受ける。ちなみ
に白質伝導路は神経細胞の突起（すなわち軸索又は樹状
突起）とそれを絶縁するオリゴデンドロサイト由来の髄
鞘（ミエリン）からなる。白質伝導路の障害はさらに遠
位部（尾側）へと進展し、かつ伝導路の起始細胞すなわ
ち伝導路に線維を投射している上位の神経細胞体の二次
変性又はアポトーシス様細胞死をもたらす。このように
して、圧負荷を受けた下位胸髄の白質伝導路の障害は、
伝導路の起始細胞体（神経細胞体）ならびに下位胸髄以
下（すなわち腰髄、仙髄）の伝導路の二次変性を惹起す
ることにより、下肢の麻痺を引き起こす。また、下位胸
髄の損傷により、腰髄、仙髄に対する上位の脳からの神
経支配が途絶えるため、さらに腰髄、仙髄の灰白質でも
神経細胞の二次変性すなわちアポトーシス様細胞死が進
行し、両下肢の対麻痺が回復不能となる。また、このよ
うな症状と並行して、オリゴデンドロサイトのアポトー
シス、脱髄などが生じることが知られている(Crowe, M.
J. et al., Nature Med., 3, 73-76, 1997)。
【００５６】さらに、脊髄損傷においては上記の神経組
織固有の障害ならびに血流障害、血管損傷に加えて、そ
れに起因する神経因性膀胱、脳浮腫、神経組織の浮腫、
浮腫、排尿障害、排便障害、性機能障害、皮膚潰瘍、褥
創などが生じる。これらの、疾患、症状又は病態の多く
は、脊髄損傷により運動神経のみならず、自律神経や感
覚神経などが傷害を受けて機能不全に陥るため引き起こ
されると考えられる。また、血管損傷や浮腫などは神経
組織（脊髄組織）が過度の機械的、物理的圧力を受けた
ときに、容易に生じることが知られている。脊髄損傷に
伴う上記の症状、疾患、病変又は病態は、程度の差はあ
れ、頭部外傷においても認められる。
【００５７】従って、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１が
低用量・低濃度で寝たきりの脊髄損傷ラットを起立せし
めるという本発明の実験結果から判断すれば、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体
は、ＷＯ００／４８６０８号に記載のジンセノサイドＲ
ｂ１と同等もしくはそれよりも幅広い用量・濃度域で、
脊髄損傷や神経外傷（頭部外傷を含む）に起因する前記
した病態、症状、疾患の予防、処置、治療に有用である
と考えられる。このようなジヒドロジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド類誘導体の適応が期待される病
態、症状、疾患としては、神経組織の二次変性、浮腫、
脳浮腫、神経組織の浮腫、オリゴデンドロサイトのアポ
トーシス又はアポトーシス様細胞死、脱髄、血管の損
傷、神経因性膀胱、自律神経障害、感覚障害、排尿障
害、排便障害、性機能障害、皮膚潰瘍、褥創、神経麻
痺、末梢循環不全等があげられる。おそらく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体
は、ジンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド
類と同様に中枢神経組織の再生・再構築、脳脊髄の血管
の再生・再構築又は抗アポトーシス作用を介して前記病
態、症状又は疾患に効果、効能を発揮すると考えられ
る。
【００５８】また、本発明のジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体の静脈内投与は、血
管又は神経組織の再生・再構築という新規な効果・効能
を示す故、血管又は神経組織の病理組織学的変化をきた
す疾患、血管の損傷をきたす疾患、又は血流障害を主症
状とする疾病又は病態（たとえば一過性脳虚血発作、大
動脈炎症候群、糖尿病、癌、悪性腫瘍、肉腫、悪性新生
物、心不全、心筋症、急性末梢動脈閉塞症、ＤＩＣ、血
栓症、血栓性静脈炎、膠原病、脳血管障害、脳出血、ク
モ膜下出血、脳梗塞、動脈硬化症、末梢循環不全、冷え
症、血色不良、肉体疲労、閉塞性血栓血管炎、貧血、腎
性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、
狭心症、心筋梗塞、血管炎、網膜中心動静脈閉塞症、肝
・腎・心・脳虚血再灌流障害、血栓性血小板減少性紫斑
病、顆粒球減少症、血管損傷、ベーチェット病、糖尿病
性神経症、痔疾、閉塞性動脈硬化症、レイノー病、レイ
ノー症候群、創傷、熱傷、凍傷、電撃症、角膜潰瘍、角
膜創傷、レーザー傷害、免疫不全病、エイズ、骨髄異形
成症候群、播種性血管内凝固症候群、出血性ショック、
放射線障害、紫外線障害、褥創、皮膚潰瘍、糖尿病性皮
膚潰瘍、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、アルツハイマ
ー病、ピック病、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、脱
髄疾患、舞踏病、ポリグルタミン病、脳性マヒ、筋萎縮
性側索硬化症、緑内障、老人性黄斑変性症、エイズ脳
症、脳炎、多発性硬化症、糖尿病性神経症、網膜剥離、
網膜色素変性症、一酸化炭素中毒、新生児仮死、自律神
経障害、末梢神経障害、末梢神経炎、低酸素脳症、ギラ
ンバレー症候群、痙性対麻痺、進行性核上性麻痺、脊髄
血管障害、ミトコンドリア脳筋症、髄膜炎、骨折、骨粗
鬆症、脊椎（腰椎）椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症、脊
椎分離、すべり症、頚椎症、後縦靭帯骨化症に伴う脊髄
や神経根の圧迫・麻痺ならびに顔面神経麻痺等）に効果
を示すとされる。もちろんこれらの血管や神経組織の病
理組織学的変化をきたす疾患、血流障害を主症状とする
疾病において、血流障害にさらされた当該組織における
細胞死を抑止することもジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体の忘れてはならない効能
である。従って、末梢組織の血流障害、損傷、外傷又は
創傷においてはジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジ
ンセノサイド類誘導体は少なくとも２つの作用機構を介
して、組織細胞障害を軽減すると考えられる。ジンセノ
サイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類も前記した
疾患・病態の予防、処置又は治療のための医薬組成物と
して利用可能である。
【００５９】ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体からなる医薬組成物は、前記した脊
髄損傷実験結果より容易に推測されるごとく、一次神経
病変とシナプス連絡を有する脳の領域における二次病変
を抑止するので、すべての神経変性疾患、末梢神経障
害、脱髄疾患、炎症性脳・神経疾患、中毒性脳・神経疾
患、脳脊髄血管障害（たとえばアルツハイマー病、ピッ
ク病、進行性核上性麻痺、脊髄小脳変性症、パーキンソ
ン病、舞踏病、ポリグルタミン病、一酸化炭素中毒、脳
性マヒ、新生児仮死、低酸素脳症、エイズ脳症、脳炎、
急性散在性脳脊髄炎、急性小脳炎、横断性脊髄炎、筋萎
縮性側索硬化症、多発性硬化症等）の二次病変にも効能
を示し、これらの疾病による高次神経機能障害の進行を
緩らげ患者のＱＯＬ（生活の質、Quality of Life）を
高めることができる。これらの脳・神経疾患の具体例と
しては成書（神経内科ハンドブック、鑑別診断と治療、
第２版、編集、水野美邦、医学書院1993年）に記載され
たものがあげられる。もちろん、ＰＣＴ／ＪＰ００／０
４１０２号（薬用人蔘からなる脳細胞又は神経細胞保護
剤）に記述されたごとく、アポトーシス様神経細胞死抑
止効果を介して、これら脳・神経疾患の一次病変にもジ
ヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘
導体は効果を発揮すると考えられる。
【００６０】また、前述のごとく、本発明のジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体の静
脈内投与は脊髄損傷動物の麻痺を著しく改善すると考え
られる。周知のごとく、神経組織は他の末梢組織に比べ
て外傷に対して最も脆弱な組織であるので、ジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体から
なる医薬組成物が脊髄損傷の治療・処置に著効を示すと
いうことは、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体が中枢神経組織以外の末梢組織の外
傷、創傷（熱傷、凍傷、電撃症、放射性障害、レーザー
傷害、紫外線障害、内臓損傷を含む）にも有効であるこ
とを物語っている。
【００６１】次に、本発明者らはジヒドロジンセノサイ
ドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体が、血管が破綻
もしくは切断されることにより血流障害をきたす末梢組
織の疾患に対しても効果を示すかどうかしらべた。この
ため、血管が破綻もしくは切断される疾患として創傷特
には開放創を選び、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の開
放創治療効果を検討した。吸入麻酔下でラット（ｎ＝
４）の背部に直径６ｍｍのパンチバイオプシーを５ケ所
に施し開放創を作成した。これにより同部の血管は瞬時
に切断され、開放創部に血流障害が生じる。その後、各
開放創に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１をそれぞれ
０．０００１重量％（１０−４重量％）、０．００００
１重量％（１０−５重量％）、０．０００００１重量％
（１０−６重量％）、０．００００００１重量％（１０
−７重量％）、の濃度で含有するプロペト（眼科用白色
ワセリン）を１日単回０．１ｇ９日間外用塗布した。コ
ントロールには同量のプロペトのみを外用塗布した。そ
の後、麻酔により動物を安楽死させた直後に創傷部皮膚
を採取し写真撮影を実施した。採取した皮膚組織は固定
液中で保存した。結果を図９に示す。図９は図面に代わ
る写真である。図９では４例が示されており、上から第
１例目、第２例目、第３例目、及び第４例目が示されて
いる。各々、左側に２個、右側に３個づつの合計５ケ所
に開放創の跡があり、左側の上から１０−４重量％の場
合、１０−５重量％の場合、右側の上から１０−６重量
％の場合、１０−７重量％の場合、０重量％の場合（コ
ントロール）を示す。
【００６２】図９に示すごとく０．００００１重量％
（１０−５重量％）から０．００００００１重量％（１
０−７重量％）のジヒドロジンセノサイドＲｂ１を含有
するプロペト（すなわち１００ｎｇ／ｇから１ｎｇ／ｇ
の濃度のジヒドロジンセノサイドＲｂ１）を開放創に外
用塗布すると明らかに、プロペトのみを外用塗布した開
放創に比べて、創傷治癒が促進された。また、低濃度の
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を外用投与した例では、
創傷治癒部に明らかな発毛が観察された。従って、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体を皮膚外用剤として使用するときは、外用剤における
当該組成物の濃度は０．００１重量％以下又は未満、好
ましくは０．００００１重量％以下、より好ましくは
０．００００００１重量％（１０−７重量％）前後もし
くはそれ以下に設定することが好ましいと考えられた。
従って、血流障害をきたす疾患または病態（たとえば創
傷、熱傷、褥創、皮膚潰瘍、痔疾、等）の予防、処置又
は治療のために、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などの
ジンセノサイド類誘導体からなる医薬組成物を外用投与
又は局所投与するときも、皮膚外用剤又は局所投与剤
（粘膜外用剤、坐剤を含む）におけるその濃度は０．０
０１重量％以下又は未満、好ましくは０．００００１重
量％（１０−５重量％）以下、より好ましくは０．００
００００１重量％（１０−７重量％）以下に設定するこ
とが好ましい。前記疾患の予防、処置又は治療のための
皮膚外用剤ならびに局所投与剤（粘膜外用剤、坐剤を含
む）におけるジンセノサイド類誘導体の濃度の上限は１
％以下、好ましくは０．１％以下である。
【００６３】前述の実験例において、プロペトのみを外
用塗布した開放創の面積を分母にとり、０．０００１重
量％（１０−４重量％）から０．００００００１重量％
（１０−７重量％）のジヒドロジンセノサイドＲｂ１を
外用塗布した開放創の面積を分子にとり、その比を算出
した。結果を図１０に示す。図１０では、ｎ＝４で＊印
はＰ＜０．０５で有意差があることを示す。なお、検定
はFisherのPLSDによっている。図１０に示すごとく、
０．００００１重量％（１０−５重量％）以下の濃度の
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を開放創に外用投与する
と皮膚組織の再生・再構築が促進され、有意に創傷治癒
も促進された。特に０．００００１重量％（１０−５重
量％）以下のジヒドロジンセノサイドＲｂ１すなわち１
００ｎｇ／ｇ以下もしくは１００ｎｇ／ｍｌ以下のジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１の外用投与が開放創を有意に
縮小せしめたという事実は、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体が患部組織の細胞外
液濃度が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１００ｎｇ
／ｍｌ以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、さらに
好ましくは０．０００００１〜１００００ｆｇ／ｍｌの
ときに血管の新生・再生又は再構築を顕著に促進して創
傷治癒を早めることを強く支持している。なお、ＰＣＴ
／ＪＰ００／０５５５４号に記載のごとく創傷治癒の初
期段階では、血管内皮細胞、上皮細胞、表皮角化細胞、
血管平滑筋細胞、幹細胞、線維芽細胞などが活発に分裂
・増殖をくり返し、多数の新生血管や再生血管が形成さ
れるが、ひとたび創傷が治癒するとこれらの新生血管又
は再生血管は過剰なものから退縮もしくは消失すること
になる。この現象を本明細書ならびにＰＣＴ／ＪＰ００
／０５５５４号では血管の再構築と呼ぶこととする。す
なわち、あらゆる生体組織の再生・再構築現象において
は、細胞の分裂・増殖・移動と分化、接着、分裂増殖停
止という相反するイベントが秩序立てて起こることが必
要となる。本発明の医薬組成物は、これらの複雑なイベ
ントを確実にかつ速やかに成し遂げることができると考
えられる。また、血管の再構築促進作用が選択的に発揮
されれば、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１のジンセノサ
イド類誘導体は悪性新生物（癌、肉腫を含む）の予防、
治療、処置にも有用となり得る。もちろん、ジンセノサ
イドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類も同様の効果
・効能・用途を有する。
【００６４】以上の実験結果より、低濃度のジンセノサ
イド類誘導体特にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１の皮
膚外用塗布が、切断された血管の再生・再構築を促進す
るのみならず、皮膚の表皮組織、真皮の結合組織、真皮
の乳頭、皮脂腺、神経、汗腺、毛乳頭、立毛筋、毛包等
の再生・再構築をも促進し、創傷治療を早めると考えら
れる。本発明者の知る限り、低濃度のジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１の皮膚外用投与の効果は、ペプチド性因子
（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の効果よりはるかに優
れている。本実験で使用した低濃度のジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を含有する軟膏もしくは外用剤は、ジンセ
ノサイドＲｂ１を含有する軟膏もしくは外用剤と同様
に、皮膚のみならず創傷、損傷もしくは、病理組織学的
変化をきたしたあらゆる臓器・組織（角膜、口腔粘膜、
外耳、消化管粘膜、鼻粘膜、鼓膜、腟、膀胱、子宮、尿
道、気道粘膜、直腸、直腸粘膜、肛門等）に外用投与し
て、血管を始めとする病変組織の再生・再構築を促進せ
しめることができる。特にジンセノサイド類を含有して
なる坐剤を痔疾の予防、処置又は治療のために肛門及び
／又は直腸（粘膜）に外用投与すれば優れた効果が得ら
れる。本実験結果より、プロペト１０ｇあたりのジンセ
ノサイド類誘導体特にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１
の混入量は０．１ｍｇ以下、好ましくは０．０００１ｍ
ｇ以下ということが判明した。すなわち皮膚疾患を有す
るヒトもしくは脊椎動物へのジンセノサイド類誘導体特
にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１の至適皮膚外用投与
量は、かなり少ないということになる。前記疾患の予
防、処置又は治療の目的でプロペト１０ｇあたりにジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体を混入するときは、その上限は０．１ｇ以下、好まし
くは０．００１ｇ以下である。ジンセノサイドＲｂ１な
どの天然のジンセノサイド類を皮膚外用剤、粘膜外用剤
として用いるときの濃度についてはＰＣＴ／ＪＰ００／
０５５５４号に記述されている。
【００６５】前述のごとく、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体の皮膚外用塗布が、
切断された血管の再生・再構築を促進し、かつ皮膚の表
皮組織、真皮の結合組織、真皮の乳頭、皮下組織、血
管、立毛筋、皮脂腺、汗腺、毛乳頭、毛包等の再生・再
構築を促進するという事実は、当然のことながらジヒド
ロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体
の皮膚外用塗布が、血管内膜、血管中膜、血管外膜のみ
ならず表皮細胞、表皮角化細胞、メルケル細胞、メラノ
サイト、ランゲルハンス細胞、角質細胞、線維芽細胞、
血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、皮脂腺の細胞、脂肪細
胞、汗腺の細胞、毛包の細胞、立毛筋の細胞、間葉系細
胞、皮膚の幹細胞等の再生・再構築をも促すことを明ら
かにしている。このように低用量のジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体が単独で血管
や皮膚組織の再生・再構築もしくは創傷治癒をかくもあ
ざやかに成し遂げるということは、血管の再生・再構築
や皮膚組織の創傷治癒もしくは再生・再構築にかかわる
サイトカイン類、成長因子類又は増殖因子類やそれらの
受容体ならびに転写因子（たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−
β1、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジ
オポエチン、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ｅｐｈｒｉｎ−
Ｂ２、Ｅｐｈ−４Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｔ
ＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＧＦ、Ｓｈｃ、ＳＣ
Ｌ、ｅｔｓ−１０、ＮＤＦ、転写因子ＨＩＦ−１、ＮＦ
ｋＢ、ＶＥＧＦＲ、転写因子ＳＴＡＴｓ、ＥＧＦＲ、Ｈ
ＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、エリス
ロポエチン、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦ−β２、Ｔ
ＧＦ−β３、ＦＧＦ−２、Ｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ等）の産
生や血球成分・血漿成分の機能なども低用量のジンセノ
サイド類誘導体特にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１に
より調節されていることを物語っている。すなわち、シ
ンガーらの総説（Singer,A.J., Clark,R.A.F., New Eng
l. J. Med., 341，738-746，1999）ならびに実験医学
（17巻、６号、企画、渋谷正史、1999、羊土社）に記述
された分子群を調節することにより、創傷治癒もしくは
組織再生・再構築ならびに血管の再生・再構築にかかわ
る複雑な生命現象を、低用量・低濃度のジンセノサイド
類誘導体特にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１が単独で
すべて成し遂げたといえる。たとえば、血管再生・再構
築現象１つをとっても、血管内皮細胞の分裂、増殖、遊
走、移動、分化、接着ならびに管腔形成、細胞外基質の
再生・再構築、内膜、基底膜、中膜、外膜、自律神経の
再生・再構築等の複雑な過程を経なければならないが、
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類
誘導体はこれらの生命現象をすべて系統立てて調節する
ことができると考えられる。すなわち、ジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は皮膚組
織を構成するあらゆる細胞やその分泌物の再生・再構築
を促進すると考えられる。従って、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は皮膚などの
生体組織の病理組織学的変化をきたす器質的疾患ならび
に血流障害をきたす疾患に対して、生体組織特には血管
又は皮膚組織の再生・再構築促進作用を介して効果・効
能を発揮すると言える。このような皮膚の血流障害又は
病理組織学的変化をきたす疾患としては以下のものがあ
げられる。すなわち、皮膚組織の創傷、熱傷、放射線障
害、凍傷、紫外線障害、電撃症、外傷、皮膚潰瘍、褥
創、外科的手術後の各種の創傷、電撃症、レーザー障
害、接触性皮膚炎、水疱性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、
うつ帯性皮膚炎、乾皮症、皮脂欠乏症、糖尿病性皮膚潰
瘍、自家感作性皮膚炎、紅皮症、剥脱性皮膚炎、表皮水
疱症、光線過敏症、慢性色素紫斑（シャンバーグ病）、
ストロフルス、花粉症、虫刺され、痒疹、多形滲出性紅
斑、環状紅斑、結節性紅斑、天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状
皮膚炎、掌蹠膿疱症、乾癬、扁平苔癬、魚鱗癬、毛孔性
苔癬、黄色腫症、皮膚アミロイドーシス、単純疱疹、ウ
イルス性いぼ、伝染性軟属腫、膿皮症、皮膚結核、皮膚
非定型抗酸菌症、白癬、皮膚・口腔カンジダ症、疥癬、
毛虱症、梅毒、ケロイド、肥厚性瘢痕、血管腫、リンパ
腫、母斑、尋常性白斑、雀卵斑、肝斑、黒皮症、汗疱、
あせも、にきび、酒査皮（しゅさ）、酒査皮（しゅさ）
様皮膚炎、口腔粘膜損傷、口内炎、口囲皮膚炎、皮膚の
老化症状（例えば、皮膚の萎縮、易感染症、たるみ、ふ
け、脱毛、白髪、かゆみ、かさつき、皮脂欠乏、角層剥
離、角質細胞剥離、亀裂、ひびわれ、あかぎれ、しみ、
日焼け、しわ、そばかす、再生不良、色素沈着、乾燥
等）、脱毛症、爪囲炎、嵌入爪等があげられる。なお、
ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号ならびにＰＣＴ／ＪＰ
００／０５５５４号に記載されたごとく、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、ジ
ンセノサイド類特にはジンセノサイドＲｂ１と酷似した
効果・効能・薬理作用を示すので、当然のことながらジ
ンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類又は
ジンセノサイドＲｂ１を含有する天然物を、本発明の医
薬組成物（すなわちジヒドロジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体）の代わりに使用してもよ
い。ジンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド
類又はジンセノサイドＲｂ１を含有する天然物もしくは
そのエキスを、血流障害をきたす疾患や病態の予防、処
置又は治療のための医薬組成物として皮膚などへ外用投
与するときは、その濃度は０．００１重量％未満に設立
することが好ましい。ただし、ジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類と他の医薬組成物とを併用（混
合）するときは、ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノ
サイド類の濃度を０．００００２重量％未満に設定する
ことが好ましい。もちろん、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体の濃度も同様に０．
００００２重量％未満に設定してもよい。ジンセノサイ
ドＲｂ１などの天然のジンセノサイド化合物又はジンセ
ノサイド類は、患部組織における細胞外液濃度が１０ｎ
ｇ／ｍｌ（約９ｎＭ）以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ
（約０．９ｎＭ）以下、より好ましくは０．０１〜１０
０ｆｇ／ｍｌもしくは１〜１００００ｆｇ／ｍｌのとき
に血管の再生・再構築を促進する。もちろん、ジンセノ
サイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類も前記した
組織再生・再構築にかかわる分子群を増加、減少または
調節することにより、血管などの組織の再生・再構築を
促進するとされる。
【００６６】さて、前述のごとく、本発明の医薬組成物
は抗アポトーシス作用ならびに血管再生・再構築促進作
用を介して、血流障害をきたす疾患もしくは病態を予
防、処置又は治療すると考えられる。そこで、次に本発
明者らは、細胞のアポトーシス又は血管の再生・再構築
に関わる主要な因子（分子群）の発現をジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体が調節す
るかどうか調べた。このため、アポトーシス又はアポト
ーシス様細胞死に関わる代表的な分子として、Ｂｃｌ−
ｘＬ及びカスパーゼ３を、血管再生及び／又は再構築に
関わる代表的な分子としてＶＥＧＦをとりあげ、これら
の分子群の発現がジヒドロジンセノサイドＲｂ１により
変化するかどうかを検討した。
【００６７】実験手技は本発明者ら（阪中、田中）の既
発表論文（Wen, T-C. et al., J.Exp.Med., 188, 635-6
49, 1998）ならびにトネロらの論文（Tonello, C., FEB
S Letters, 442, 167-172, 1999）に準じた。胎生１７
日目ラットから摘出した大脳皮質神経細胞を１０％牛胎
仔血清を含む培地で培養した。培養２日目に無血清培地
に交換し、培養３日目にジヒドロジンセノサイドＲｂ１
を０，１，１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加し、６時間培
養した。その後培養神経細胞から総ＲＮＡを抽出した。
ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇからオリゴｄＴ
プライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成した。
ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いて行った。使用
したＰＣＲ-プライマーとＰＣＲ反応条件は以下の通り
である。なお、β-アクチンは内部標準である。 （１）β-アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２）Ｂｃｌ−ｘＬ Sense primer ＝ AAG CGT AGA CAA GGA GAT GCA Antisense primer＝ GGA GCT GAT CTG AGG AAA AAC C １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
１℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 （３）ＶＥＧＦ Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 （４）カスパーゼ３ Sense primer ＝ GCT AAC CTC AGA GAG ACA TTC ATG Antisense primer＝ TTA GTG ATA AAA GTA CAG TTC TTT １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
９℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％ア
ガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色により可視化した。結果を図１１及び図１２に示す。
図１１及び図１２は図面に代わる写真である。
【００６８】図１１に示すように、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１無添加神経細胞に比べて、ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を１又は１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加さ
れた神経細胞ではＢｃｌ−ｘＬとＶＥＧＦｍＲＮＡの発
現が増強した。特に１ｆｇ／ｍｌ添加群で最も強いＶＥ
ＧＦｍＲＮＡの発現を認めた。なお、ラットのＶＥＧＦ
は構成するアミノ酸の数に対応して、ＶＥＧＦ１２０、
ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１８８という３つのサブタイ
プに分けられるので、ＶＥＧＦｍＲＮＡのバンドも図１
１のごとく少なくとも２本認められる。更に図１２に示
すようにジヒドロジンセノサイドＲｂ１無添加神経細胞
に比べて、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１，１００
ｆｇ／ｍｌの濃度で添加した神経細胞ではカスパーゼ３
のｍＲＮＡの発現が抑制された。特に１ｆｇ／ｍｌ添加
群で最も強いカスパーゼ３のｍＲＮＡの発現抑制を認め
た。
【００６９】以上のことより、ジンセノサイド類誘導体
特にジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、Ｂｃｌ−ｘＬ又
はカスパーゼ３を始めとする成書（実験医学、17巻、1
３号、企画、長田重一、1999、羊土社）に記載されたア
ポトーシス関連分子群の発現を増加、減少又は調節する
ことにより、アポトーシスもしくはアポトーシス様細胞
死を抑止すると言える。また、ジンセノサイド類誘導体
特にジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ＶＥＧＦなどの
成書（実験医学、17巻、6号、企画、渋谷正史、1999、
羊土社）に記載された血管新生・再生・再構築関連分子
群の発現を増加、減少又は調節することにより、血管の
再生・再構築を促進すると考えられる。
【００７０】すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体からなる医薬組成物は、
Ｂｃｌ−ｘＬ発現の促進及び／又はカスパーゼ３発現の
抑制を介して、アポトーシスもしくはアポトーシス様細
胞死を抑止し、もって細胞死をきたす疾患（病態を含
む）の予防、処置、治療に利用される。もちろん、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体は、Ｂｃｌ−ｘＬ及び／又はカスパーゼ３の転写因子
（たとえばＮＦκＢ，ＳＴＡＴｓなど）の作用を増強、
減弱又は調節するとも考えられる。なお、本発明の医薬
組成物の適応が期待される細胞死をきたす疾患について
は、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号に記載されてい
る。また、本発明の医薬組成物は、前記した抗アポトー
シス作用に加えて、血管の再生・再構築を促進する作用
をも有するので、これら２つの作用を介して、血流障害
をきたす疾患や病態の予防、処置、又は治療のために有
用である。血流障害をきたす疾患や病態については本明
細書に既述した。なお、ジンセノサイドＲｂ１などの天
然のジンセノサイド類も、Ｂｃｌ−ｘＬ発現ならびにＶ
ＥＧＦ発現を促進し、カスパーゼ３の発現を抑制すると
考えられる。
【００７１】以下に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１以
外のジンセノサイド類誘導体について、図１３のジンセ
ノサイドＲｂ１誘導体を例にとって簡単に記述する。
【００７２】図１３左上の（１）は水酸基をアシル化又
はアセチル化した誘導体の例であり、（２）はアシル化
又はアセチル化に加えて側鎖の二重結合を単結合にして
同部に任意の官能基（たとえば水酸基）を結合させた例
であり、２分子の水酸基を脱水してエポキシ化すること
も可能である。図１３の（３）はアシル化又はアセチル
化に加えて側鎖の二重結合を切断して末端をアルデヒド
基にした誘導体の例であり、（４）はアシル化又はアセ
チル化に加えて側鎖の末端にアルキル基やアリル基等任
意の官能基を結合させた例であり、（５）はアシル化又
はアセチル化に加えて側鎖の二重結合を切断してカルボ
キシル基を結合した例であり、（６）はアシル化又はア
セチル化に加えて側鎖の二重結合部分をエポキシ化した
例であり、（７）は側鎖の二重結合を切断してカルボキ
シル基を結合した例であり、（８）は側鎖末端にある一
方のメチル基を水素原子に置換し、他方のメチル基をア
ルキル基やアリル基等任意の官能基に置換したものであ
り、（９）は側鎖の二重結合を単結合にして、同部に任
意の官能基たとえば水酸基を結合させた例であり、２分
子の水酸基を結合させたものが、ジヒドロキシジンセノ
サイドＲｂ１である。この場合、１つの水酸基のみをい
ずれかの水素原子と置換し、モノヒドロキシジンセノサ
イドＲｂ１を作成してもよい。この場合、１つの水酸基
のみをいずれかの水素原子と置換し、モノヒドロキシジ
ンセノサイドＲｂ１を作成してもよい。図１３の（１
０）は（９）に記載した２分子の水酸基を脱水してエポ
キシ化した例すなわちエポキシジンセノサイドＲｂ１で
ある。また、（１１）プロトパナキサジオール、プロト
パナキサトリオール、ダマラン又はそれらの還元体を基
本骨格として有する任意の化合物がジンセノサイドＲｂ
１誘導体の範疇の中に含まれる。この中には（１２）ジ
ンセノサイドＲｂ１の側鎖の二重結合部にシクロペンタ
ジエン等のジエン化合物を用いてＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅ
ｒ反応を施したもの又は（１３）ジンセノサイドＲｂ１
又はジンセノサイドＲｂ１の糖がitol類に還元されたも
のなども含まれる。また、薬用人蔘にはジンセノサイド
Ｒｂ１以外に公知のものだけでも３０種類前後の精製サ
ポニン類すなわち天然のジンセノサイド類又はジンセノ
サイド化合物が含まれているが（庄司順三、薬用人蔘
'９５、pp251-261、熊谷 朗編、共立出版株式会
社）、これらの精製サポニン類すなわちジンセノサイド
類の化学構造もジンセノサイドＲｂ１の化学構造と類似
しているので、既述のごとく血流障害をきたす疾患の予
防、処置又は治療用医薬組成物又は血管再生・再構築促
進剤となり得る。もちろん、ジンセノサイドＲｂ１をリ
ード化合物として利用することにより作成できる新規化
学的誘導体は前述のものに限定されるわけではない。ま
た、ジンセノサイドＲｂ１以外の精製サポニン類すなわ
ち天然のジンセノサイド類（特にプロトパナキサジオー
ル、プロトパナキサトリオール）についてもダマラン骨
格（ステロイド様骨格）側鎖を還元するかもしくは図１
３と同様の方法で化学的誘導体を作成することができ
る。また、ジンセノサイドＲｏを始めとするオレアノー
ル酸の化学的誘導体については、既述している。当然の
ことながら、前記のジンセノサイド類誘導体は、ＰＣＴ
／ＪＰ００／０４１０２号、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５
５４号、特願２０００−４０３２０３号及び特願２００
１−０４９３６８号に記載されたジンセノサイドＲｂ１
又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果・効能・用途
をすべて兼ね備えているとされる。
【００７３】次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類（ジンセノサイド類誘導体を含
む）がいかなる転写因子を活性化せしめることにより、
細胞死抑制遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬの発現を誘導するのかを
調べた。そのためまず予備実験として、本発明者らはジ
ンセノサイド類の代表としてジンセノサイドＲｂ１を選
び、ジンセノサイドＲｂ１が神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ遺
伝子の発現を増加させるかどうかをしらべた。なお、ジ
ンセノサイドＲｂ１の化学構造についてはＰＣＴ／ＪＰ
００／０４１０２号に記載されている。実験手技は本発
明者ら（阪中、田中）の論文（Wen T.-C., et al., J.
Exp. Med., 188, 635-649, 1998）に準じた。０ｆｇ／
ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌ及び１００００
０ｆｇ／ｍｌ（１００ｐｇ／ｍｌ）のジンセノサイドＲ
ｂ１で、２４時間前処理された培養神経細胞から総ＲＮ
Ａを抽出した。ＤＮａｓｅ処理済の総ＲＮＡ３μｇか
ら、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素(Moloney murin
e leukemia virus reverse transcriptase)を用いてｃ
ＤＮＡを生成した。遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）はＴａｑ
ポリメラーゼを用いて以下の条件で行った。すなわち、
（１）９４℃、２分間（２）９４℃、１．５分間；５５
℃、１．５分間；７２℃、２分間を１サイクルとし、Ｂ
ｃｌ−ｘＬに関しては２５サイクル、β−アクチンに関
しては２０サイクル、（３）７２℃、２分間である。
【００７４】ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルにて泳
動し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
なお、内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を
用いた。結果を図１４に示す。図１４は図面に代わる写
真である。
【００７５】また、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の神経細胞での
発現をジンセノサイドＲｂ１が増強するかどうか調べる
ため、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白抗体を用いてウエスタンブロ
ット法を実施した。ジンセノサイドＲｂ１存在下または
非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を４８時間培養
後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電気泳
動を実施した。その後泳動蛋白質をニトロセルロース膜
に転写しウエスタンブロットを行った。結果を図１５に
示す。図１５は図面に代わる写真である。さらに、抗Ｂ
ｃｌ−ｘＬ蛋白抗体と反応するバンドを画像解析装置で
定量化した。結果を図１６に示す。
【００７６】図１４に示すごとく、１ｆｇ／ｍｌあるい
は１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１で処理され
た培養神経細胞では、Ｂｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡの発現が
コントロールに比べて増加していた。一方、ジンセノサ
イドＲｂ１は１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適濃度域で、神
経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白質発現量を約５０％有意に増
加せしめた（図１５，１６）。
【００７７】次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１
がいかなる転写因子を介して、Ｂｃｌ−ｘＬ発現を促進
するのかをしらべた。このため、遺伝子導入が比較的容
易なアストロサイトを用いて以下の実験を実施した。始
めに、Ｂｃｌ−ｘプロモーター／ルシフェラーゼプラス
ミドを作成した。すなわちＣ５７ＢＬ／６マウスの尾組
織より抽出したＤＮＡを鋳型として、下記プライマー
ＬＦ１、プライマー ＬＲ１およびピロベストＤＮＡポ
リメラーゼ（pyrobest DNA polymerase）(Takara)を用
いて３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。反応溶液をキ
アＥｘIIゲルエキストラクションキット（QiaExII Gel
exraction kit）(Qiagen)にて精製後、制限酵素Ｘｈｏ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化、２％アガロースゲルに
て電気泳動し、６００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。
得られたゲルスライスから、キアＥｘIIゲルエキストラ
クションキット（QiaExII Gel exractionkit）を用いて
DNA断片を抽出し、ｐＧＬ−２Ｂａｓｉｃベクター(Prom
ega)に挿入した(Bcl-x promoter L)（図１７）。同様に
マウスDNAを鋳型として、プライマー ＲＦ１とプライ
マー ＲＲ１を用いて１５サイクルのＰＣＲ反応を行っ
た。反応溶液を１０００倍希釈し（溶液Ａ）、それを鋳
型としてプライマー ＲＦ２とプライマー ＲＲ２で３
０サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＳａｃＩとＢａｍＨＩ
で消化し、ｐＧＬ−２ＢａｓｉｃベクターのＳａｃＩ／
ＢｇＩＩＩ部位に挿入した (Bcl-x promoter R)（図１
７）。また溶液Ａを鋳型とし、プライマー ＲＦ１とプ
ライマー Ｍｕｔ−Ｒ、プライマー Ｍｕｔ−Ｆとプラ
イマー ＲＲ１を用いてそれぞれ３０サイクルのＰＣＲ
反応を行った。２％アガロースゲルにて電気泳動し、そ
れぞれ３１２ｂｐと３０９ｂｐのＤＮＡ断片を切り出
し、キアＥｘIIゲルエキストラクションキット（QiaExI
I Gel exraction kit）を用いてＤＮＡ断片を抽出し
た。抽出したＤＮＡ断片を重量比にて１：１で混合後、
それを鋳型としてプライマー ＲＦ２とプライマー Ｒ
Ｒ２で３０サイクルのＰＣＲ反応を行い、ＳａｃＩとＢ
ａｍＨＩで消化し、ｐＧＬ−２ＢａｓｉｃベクターのＳ
ａｃＩ／ＢｇＩＩＩ部位に挿入した (Bcl-x promoter R
(変異)（図１７）。 用いたプライマー(primer) Primer LF1 5'-ATACTTCCCAGCCGCAAAACGC-3' Primer LR1 5'-CAGAAGGCGACAGAGGAATTGC-3' Primer RF1 5'-GGGGTGGGGGGAAATTACAC-3' Primer RR1 5'-GGGCTCAACCAGTCCATTGTC-3' Primer RF2 5'-CCACGAGCTCGATCTGGTCGATGGAGGAAC-3' Primer RR2 5'-AAACACCTGCTCACTTACTGGGTC-3' Primer Mut-F 5'-AGGCATTGAGGATAAAAGGG-3' Primer Mut-R 5'-CCCTTTTATCCTCAATGCCT-3'
【００７８】アストロサイトの初代培養は以下の要領で
実施した。生直後のウイスター（Wistar）ラットより公
知の方法でアストロサイトを単離し、培養用フラスコで
培養し、２週間後に１２ウエルのプレート（12 well pl
ate）に植え替えた。なお、アストロサイトは本発明者
ら（阪中、田中）の既発表論文(Fujita, H. et al., Gl
ia, 18, 269-281, 1996; Tanaka, J. et al., Glia, 2
0, 23-37, 1997; Tanaka, J. et al.,Glia, 24, 198-21
5, 1998)に記載された方法に準じて生直後ラット脳より
分離した。
【００７９】遺伝子導入とルシフェラーゼアッセイは以
下の要領で実施した。リポフェクタミン（Lipofectamin
e）(Invitrogen)を用いて、１０％ＦＣＳ（牛胎仔血
清）存在下にて５時間のトランスフェクションを行っ
た。その後培地を新しいものに置き換えて３７℃で一晩
培養し、翌朝１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１
を加え３7℃で２４時間培養した。細胞表面をＰＢＳで
２回洗浄後、細胞をルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬
（Luciferase Cell Culture Lysis Reagent）(Promega)
１００μｌで溶解した。溶液中のルシフェラーゼ量は
ルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assaay
System）(Promega)およびルミネッセンサーＪＮＲ（Ａ
ＴＴＯ）を用いて測定した。
【００８０】結果を図１８に示す。図１８の左から１番
目と２番目のカラムに示すごとく、Ｂｃｌ−ｘプロモー
ターＬをトランスフェクションしたアストロサイトにジ
ンセノサイドＲｂ１を投与しても、コントロール（ジン
セノサイドＲｂ１非投与例）と比べてルシフェラーゼ活
性に変化は認められなかった。一方、図１８の左から３
番目と４番目のカラムに示すごとく、Ｂｃｌ−ｘプロモ
ーターＲをトランスフェクションしたアストロサイトに
ジンセノサイドＲｂ１を投与すると、コントロール（ジ
ンセノサイドＲｂ１非投与例）と比べて有意にルシフェ
ラーゼ活性が上昇した。図１７に示すごとくＢｃｌ−ｘ
プロモーターＲにＳＴＡＴ５結合配列類似の配列が存在
するが、Ｂｃｌ−ｘプロモーターＬにはそのような配列
は存在しない。従って、ジンセノサイドＲｂ１は、Ｂｃ
ｌ−ｘ遺伝子のエクソン２(Exon 2)の上流に存在する転
写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して、レポータージーン
であるルシフェラーゼ活性を上昇せしめると考えられ
た。一方、図１８の左から５番目と６番目のカラムに示
すごとく、変異型（ミューテーションを有する）ＳＴＡ
Ｔ５すなわちＳＴＡＴ５ｍを含むＢｃｌ−ｘプロモータ
ーＲ（変異）（図１７）をアストロサイトにトランスフ
ェクションしたのちにジンセノサイドＲｂ１を投与して
も、コントロール（ジンセノサイドＲｂ１非投与例）と
比べてルシフェラーゼ活性に変化はみられなかった（図
１８）。図１８の＊＊はＰ＜０．０１を示し、統計解析
法はSｔｕｄｅｎｔ ｔテストによる。
【００８１】以上のことより、ジンセノサイドＲｂ１は
Ｂｃｌ−ｘ遺伝子のエクソン２(Exon 2)の上流に結合部
位が存在する転写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して（図
１７）、レポータージーンであるルシフェラーゼの産生
をアップレギュレーションせしめると言える（図１
８）。本実験では、Ｂｃｌ−ｘＬを、測定が容易なレポ
ータージーン（ルシフェラーゼ）に置き換えた形でプロ
モーターアッセイを実施したが、実際の細胞において
は、ジンセノサイドＲｂ１は転写因子ＳＴＡＴ５の活性
化を介して、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を促進すること
が本実験で明らかとなった。おそらく、ジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類はJAK2の酵素活性をも上
昇せしめて、ＳＴＡＴ５をリン酸化し、リン酸化ＳＴＡ
Ｔ５のホモダイマー形成ならびに核内移行を促進するも
のと考えられる。その結果、ＳＴＡＴ５が転写因子とし
て機能すると考えられる。
【００８２】さて以下にＳＴＡＴ５について概説したの
ちに、ジンセノサイド類のＳＴＡＴ５活性化作用の意義
について述べる。サイトカインシグナルの細胞内情報伝
達分子として、これまでおよそ６種類のＳＴＡＴ (sign
altransducer and activator of transcription)と呼ば
れる転写因子が発見されている。中でもＳＴＡＴ５は、
インターロイキン２(IL-2)、インターロイキン３(IL-
3)、インターロイキン５(IL-5)、インターロイキン７(I
L-7)、インターロイキン９(IL-9)、インターロイキン１
５(IL-15)、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因
子 (granulocyte macrophagecolony-stimulating facto
r, GM-CSF)、成長ホルモン(growth hormone,GH)、プロ
ラクチン、エリスロポエチン(EPO)などのサイトカイン
やホルモンの刺激により活性化し、Ｂｃｌ−ｘ（Bcl-x
Ｌ, Bcl-xs, Bcl-xβを含む）、β−カゼイン、オンコ
スタチンＭ等の転写をアップレギュレーション(up-regu
lation)せしめることが知られている。従って、もし転
写因子ＳＴＡＴ５を活性化せしめるジンセノサイド類な
どの医薬組成物が見出されれば、その医薬組成物は前記
したサイトカインやホルモンと同様の生理作用、効果、
効能を発揮し、しかもＢｃｌ−ｘ、β−カゼイン、オン
コスタチンＭ等の発現をも誘導すると言える。
【００８３】上記のサイトカインやホルモンの中でも、
ＩＬ−２はＴ細胞の増殖促進、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞の誘導、細胞障害性Ｔ細胞の誘導、リンフォカ
イン活性化キラー（lymphokine activated killer）(LA
K)細胞の誘導、Ｂ前駆細胞の増殖分化誘導等の作用を有
しており、現在抗癌剤として発売されている。ＩＬ−３
は血液幹細胞増殖機能ならびに血小板前駆細胞増殖機能
を促進する。ＩＬ−５は、Ｂ細胞増殖誘導、Ｂ細胞の抗
体産生細胞への分化促進、好酸球の増殖・分化誘導、Ｉ
Ｌ−２受容体の発現誘導などの作用を有する。ＩＬ−７
はＢ前駆細胞の増殖・分化誘導、Ｔ前駆細胞の増殖・分
化誘導、ＬＡＫ細胞の誘導、単球の活性化などの作用を
有する。ＩＬ−９は血小板前駆細胞の増殖を促進する。
ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞やＬＡ
Ｋ細胞を活性化する。また、ＩＬ−１５は、Ｂ細胞の増
殖をも促進し、ＩＬ−２と同様に癌・肉腫・悪性新生物
のサイトカイン療法にも利用され得る。エリスロポエチ
ン（ＥＰＯ）は赤芽球系前駆細胞を赤血球に分化、増殖
させる故、腎性貧血又は二次性貧血の治療薬として臨床
応用されている。さらにＧＭ−ＣＳＦは好中球、好酸
球、マクロファージの増殖・分化を促進し、かつ巨核球
の分化を誘導するので、癌化学療法後の好中球の回復や
再生不良性貧血の治療に有用である。
【００８４】従って、前記したサイトカイン類は抗癌作
用、抗腫瘍効果、癌転移抑制効果、二次性貧血治療効
果、免疫不全病（エイズを含む）治療効果、腎性貧血治
療効果、再生不良性貧血治療効果、血小板減少症治療効
果、又は癌化学療法後の好中球回復促進効果を示すと言
える。
【００８５】一方、成長ホルモンの標的器官としては
肝、腎、脂肪細胞、筋肉、リンパ球、胸腺等があげら
れ、これらの器官又は組織では成長ホルモンの受容体が
発現されている。成長ホルモンは肝、筋肉、腎における
インスリン様成長因子（IGF-1、ソマトメジンＣ）の産
生分泌を刺激することにより、成長促進作用を示す。よ
り具体的には、成長ホルモンは軟骨細胞の増殖、コンド
ロイチン硫酸の合成、肝細胞などの細胞の増殖肥大、蛋
白同化などを促進する。従って、成長ホルモンは動植物
の成長調整用組成物、軟骨の老化・変性を抑止するため
の医薬組成物としても利用可能である。
【００８６】プロラクチンの標的器官としては、乳腺、
肝、腎、副腎、卵巣、前立腺、精嚢、胸腺、膀胱等があ
げられ、これらの器官又は組織ではプロラクチンの受容
体が発現されている。プロラクチンは乳腺発育促進、カ
ゼイン合成促進、乳汁分泌刺激、前立腺及び精嚢腺の発
育促進など広範な動物で多彩な生理作用を示す。従っ
て、プロラクチンは乳汁分泌不足、乳腺発育不良を示す
疾患、病態又は障害の予防、処置、治療に有用と考えら
れる。またプロラクチンは性機能障害の予防、処置、治
療にも有用であると考えられる。
【００８７】オンコスタチンＭは血球産生および血管内
皮様細胞の増殖を促進する。従って、オンコスタチンＭ
も貧血、免疫不全病、血小板減少症、顆粒球減少症、白
血球減少症、紫斑病、DICの予防、処置又は治療に有用
と考えられる。
【００８８】β−カゼインは乳汁中の主要蛋白質であ
り、プロラクチンによりその産生が誘導される。従って
β−カゼインは乳汁分泌不全の予防、処置又は治療に有
用と考えられる。以上まとめると、前記したサイトカイ
ン、ホルモン、オンコスタチンM又はβ−カゼインは、
悪性新生物、癌、肉腫、貧血、免疫不全病（エイズを含
む）、腎性貧血、二次性貧血、再生不良性貧血、遺伝性
球状赤血球症、自己免疫性溶血性貧血、骨髄異形性症候
群、顆粒球減少症、無顆粒球症、紫斑病、特発性血小板
減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、成
長ホルモン分泌不全性低身長症、下垂体性小人症、変形
性膝関節症、変形性股関節症、頸椎症性脊髄症、腰椎椎
間板ヘルニア、乳汁分泌不全又は変形性脊椎症の予防、
処置もしくは治療に有用であると考えられる。
【００８９】従ってジンセノサイドＲｂ１などのジンセ
ノサイド類は、あらゆる細胞特にはアストロサイトの転
写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して、サイトカイン(IL-
2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-9, IL-15, GM-CSF, EPO)、ホ
ルモン(GH,プロラクチン)、オンコスタチンＭ又はβ−
カゼインと同様の作用を示すか、これらの生理活性物質
の機能を代行すると言える。より詳細には、ジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類は、前記したサイト
カインやホルモン等と同様に、悪性新生物、癌、肉腫、
貧血、免疫不全病（エイズを含む）、腎性貧血、二次性
貧血、再生不良性貧血、遺伝性球状赤血球症、自己免疫
性溶血性貧血、骨髄異形成症候群、顆粒球減少症、無顆
粒球症、紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血
小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、成長ホル
モン分泌不全性低身長症、下垂体性小人症、変形性膝関
節症、変形性股関節症、頸椎症性脊髄症、腰椎椎間板ヘ
ルニア、乳汁分泌不全又は変形性脊椎症の予防、処置も
しくは治療に有用である。特に本発明の医薬組成物は、
腎性貧血、顆粒球減少症などの血液・造血臓器疾患又は
変形性膝関節症などの骨・軟骨疾患の予防、処置もしく
は治療に有用である。
【００９０】次に、本発明者らはジヒドロジンセノサイ
ドＲｂ１が神経細胞においてＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡの
みならずＢｃｌ−ｘＬ蛋白の発現を増強するかどうか調
べるため、Ｂｃｌ−ｘＬ抗体を用いてウエスタンブロッ
ト法を実施した。ジヒドロジンセノサイドＲｂ１存在下
または非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を２４時間
培養後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電
気泳動を実施した。その後泳動蛋白をニトロセルロース
膜に転写しウエスタンブロットを行った。なお実験手技
の詳細については、本発明者ら（阪中、田中）の既発表
論文（Wen T.-C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-64
9, 1998）に記載されている。結果を図１９に示す。図
１９は、図面に代わる写真である。さらに、抗Ｂｃｌ−
ｘＬ抗体と反応するバンドを画像解析装置で定量化し
た。結果を図２０に示す。
【００９１】図１９及び図２０に示すごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適濃
度域で、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白の発現量を有意に
増加せしめた。図１９及び図２０の＊はＰ＜０．０５を
示し、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｐ
ＬＳＤによる。
【００９２】以上の結果より、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体もジンセノサイド
Ｒｂ１と同様に神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現を増強せし
めると言える。しかも、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４
号に記載のごとくジヒドロジンセノサイドＲｂ１とジン
セノサイドＲｂ１の薬理作用は極めて類似しているの
で、当然のことながらジヒドロジンセノサイドＲｂ１も
ジンセノサイドＲｂ１と同様に転写因子ＳＴＡＴ５の活
性化を介して、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現をアップレ
ギュレーションせしめると考えられる。
【００９３】従ってジヒドロジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体は、アストロサイトなどの細
胞の転写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して、サイトカイ
ン(IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-9, IL-15,GM-CSF, EP
O)、ホルモン(GH,プロラクチン)、オンコスタチンＭ又
はβ−カゼインと同様の作用を示すか、これらの生理活
性物質の機能を代行すると言える。より詳細には、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体は、前記したサイトカインやホルモン等と同様に、悪
性新生物、癌、肉腫、貧血、免疫不全病（エイズを含
む）、腎性貧血、二次性貧血、再生不良性貧血、遺伝性
球状赤血球症、自己免疫性溶血性貧血、骨髄異形成症候
群、顆粒球減少症、無顆粒球症、紫斑病、特発性血小板
減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管
内凝固症候群、成長ホルモン分泌不全性低身長症、下垂
体性小人症、変形性膝関節症、変形性股関節症、頸椎症
性脊髄症、腰椎椎間板ヘルニア、乳汁分泌不全又は変形
性脊椎症の予防、処置もしくは治療に有用である。特に
本発明の医薬組成物は、腎性貧血、顆粒球減少症などの
血液・造血臓器疾患又は変形性膝関節症などの骨・軟骨
疾患の予防、処置もしくは治療に有用である。
【００９４】さて、ジンセノサイドＲｂ１はＢｃｌ−２
蛋白群に属する細胞死抑制遺伝子産物Ｂｃｌ−ｘＬの発
現上昇を介して強力に細胞のアポトーシスもしくはアポ
トーシス様細胞死を抑止することを本発明者らはすでに
見出している（ＷＯ００／３７４８１号）。また、ジン
セノサイドＲｂ１と同様に強力な抗アポトーシス作用を
示すプロサポシン関連ペプチド群もＢｃｌ−ｘＬ発現増
強作用を示し、かつインビボ（in vivo）及びインビト
ロ（in vitro）の実験系においてジンセノサイドＲｂ１
と同様に脳血管障害の予防、処置又は治療に有用である
ことが判明している（特願平１１−１８５１５５号、Ｅ
Ｐ００３０５５０４号, Igase, K. et al., J. Cereb.
Blood Flow Metab., 19, 298-306, 1999, ＷＯ００／３
７４８１号，ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号）。ま
た、本発明のジヒドロジンセノサイドＲｂ１も同様の作
用を有する。このような事実に基づけば、特願平１１−
１８５１５５号及びＥＰ００３０５５０４号に記載され
たプロサポシン関連ペプチド群は、ジンセノサイドＲｂ
１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に血流障害
をきたす疾患又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組
成物として利用できると推測される。また、本発明者ら
（阪中、田中）は、Ｌ−セリン及び／又はグリシンがや
はりＢｃｌ−２蛋白群に属する細胞死抑制遺伝子産物Ｂ
ｃｌ−ｗの発現上昇を介して強力に抗アポトーシス作用
を示すことを明らかにしている（Yang, L. et al.,Neur
osci. Lett., 295, 97-100, 2000）。ちなみに、Ｂｃｌ
−ｗとＢｃｌ−ｘＬはあらゆる組織の細胞に発現してお
り、両遺伝子産物の生理機能は酷似しているので、やは
りＬ−セリン及び／又はグリシンも血流障害をきたす疾
患又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組成物として
利用できると推測できる。さらに、特願２０００−４０
２６３９に記載のイソカルバサイクリン群も、Ｂｃｌ−
２蛋白群の１つであるＢａｘの発現を抑制して抗アポト
ーシス作用を示し、かつ脳血管障害の予防、処置又は治
療に有用であることが本発明者（阪中）の研究で明らか
にされている。従って、前記のイソカルバサイクリン群
も血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処置又は治療
のための医薬組成物として利用できると言える。従っ
て、Ｂｃｌ−２蛋白群の発現を調節することにより、ア
ポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死を抑止する化
合物は同時に血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処
置又は治療用の医薬組成物としても使用できると考えら
れる。ただし、その作用機構は抗アポトーシスという観
点からは説明が困難である。言い換えれば、本発明は被
検物質を培養細胞に投与して、Ｂｃｌ−２蛋白群の発現
調節作用を測定することからなる、血流障害をきたす疾
患又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組成物を探索
する方法をも提供するものである。もちろん、本発明
は、前記した方法により、培養細胞への投与によりＢｃ
ｌ−２蛋白群の発現調節作用を示した化合物又はそれら
の塩を含有してなる、血流障害をきたす疾患又は病態の
予防、処置又は治療用の医薬組成物をも提供する。
【００９５】なお、Ｂｃｌ−２蛋白群はアポトーシスも
しくはアポトーシス様細胞死に対して抑制作用を持つも
の（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−
１、Ｂｆ１−１／Ｂｏｄ、Ｎｒ−１３、ＢＲＡＧ−１、
Ｂｏｏ／Ｄｉｖａ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３）と、アポト
ーシスもしくはアポトーシス様細胞死に対して促進作用
を持つもの（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−ｘｓ、Ｂａｄ、
Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／Ｄ
Ｐ５、ＢＮＩＰ／Ｎｉｘ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｌｋ、Ｅ
ＧＬ−１）に大別される（臓器別アポトーシス証明法；
編集、大槻勝紀、小路武彦、渡辺慶一、南江堂、２００
０、ｐｐ１６−２４）。従って、Ｂｃｌ−２蛋白群の発
現調節作用を示す化合物としては、前記の抗アポトーシ
ス因子（anti-apoptotic factors）の発現を促進するも
の、もしくはプロアポプトティック因子（proapoptotic
factors）の発現を抑制するものが考えられる。たとえ
ば、Ｂｃｌ−ｘＬ発現増強作用を有するエリスロポエチ
ン、インターロイキン３などのサイトカイン類もしくは
成長因子類、（Wen et al., J. Exp. Med. 188, 635-64
9, 1998；特願平１１−１８５１５５号、ＥＰ００３０
５５０４号）などもＢｃｌ−２蛋白群の発現調節作用を
示すが故に、血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処
置又は治療用の医薬組成物として利用できる。ただし、
Ｂｃｌ−２蛋白群発現調節作用を示す化合物は前記のも
のに限定されるわけではない。たとえば、本発明者らは
ビタミンＥ類なども細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現を増強する
ことを見いだしている。
【００９６】次に本発明らは、ジンセノサイド類が転写
因子ＨＩＦ−１を活性化せしめ、VEGF発現を誘導するか
どうかをしらべた。このため、本発明のジンセノサイド
類として代表的なジンセノサイドＲｂ１を用いて以下の
実験を実施した。ＨＩＦ−１の詳細については後述す
る。
【００９７】まず、本発明者らはジンセノサイドＲｂ１
が細胞のVEGF mRNAの発現を増加させるかどうかを調べ
るため、細胞の例としてアストロサイトを選んで実験を
実施した。生直後のWistarラットより公知の方法でアス
トロサイトを単離し、培養用フラスコで培養し、１２日
後にポリＬ−リジンをコートした１０ｃｍのディッシュ
（dish）に植え替えた。アストロサイトは、１０％牛胎
仔血清(FCS)を含むDMEM培地で培養した。３〜４日後
に、無血清培地に交換し、ジンセノサイドＲｂ１を０，
１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加し、６時間培養した。な
お、アストロサイトは本発明者ら（阪中、田中）の既発
表論文(Fujita, H. et al., Glia, 18, 269-281, 1996;
Tanaka, J. et al., Glia, 20, 23-37, 1997; Tanaka,
J. et al., Glia, 24, 198-215, 1998)に記載された方
法に準じて生直後ラットの脳より分離した。
【００９８】その後培養アストロサイトから総ＲＮＡを
抽出した。ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇから
オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを
作成した。ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いてト
ネロの論文(Tonello, C., FEBS Letters, 442, 167-17
2, 1999)に準じて行った。使用したＰＣＲ−プライマー
とＰＣＲ反応条件は以下の通りである。なお、β−アク
チンは内部標準である。 （１）β−アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２）VEGF Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルに
て電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化
した。結果を図２１に示す。図２１は図面に代わる写真
である。
【００９９】図２１に示すように、ジンセノサイドＲｂ
１無添加アストロサイトに比べて、ジンセノサイドＲｂ
１を１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加されたアストロサイ
トではＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が増強した。
【０１００】次に、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ
１がヒト皮膚ケラチノサイトのＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現
をも誘導するかどうか調べた。このため、ヒト皮膚ケラ
チノサイトを単層培養し、ジンセノサイドＲｂ１を０〜
１０pg/mlの濃度で培養メディウムに添加後、０，１，
３，６，１２時間後にヒト皮膚ケラチノサイトから総RN
Aを抽出した。その後、以下に示したプライマーを用い
て、サイクル数２７でＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を
図２２に示す。図２２は図面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写
真である。 （１）ヒトＶＥＧＦ Sense primer ＝ TGG CAG AAG GAG GAG GGC AGA AT Antisense primer＝ GCA GCA GCC CCC GCA TCG CAT CA
【０１０１】図２２に示すごとく、１fg／ml〜１０pg/m
lの濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養ヒト皮膚ケラチ
ノサイトに添加すると１２時間以内にVEGF mRNAの発現
が誘導された。
【０１０２】次に、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ
１がＶＥＧＦ蛋白の発現を増加せしめるかどうかをしら
べた。このため、ヒト皮膚ケラチノサイトを単層培養
し、ジンセノサイドＲｂ１を０〜１０pg/mlの濃度で培
養メディウムに添加後、２４時間後又は４８時間後に培
養上清を回収した。その後、ヒト（human）ＶＥＧＦ
ＥＬＩＳＡキット（VEGF ELISA kit）(R&Dsystem)を用
いて、培養上清中のＶＥＧＦ濃度を測定した。結果を図
２３に示す。
【０１０３】図２３に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ
１添加後２４時間では、ジンセノサイドＲｂ１非添加例
と比べて、培養上清中のＶＥＧＦ濃度に大きな変化は認
められなかったが、ジンセノサイドＲｂ１添加後４８時
間では、ジンセノサイドＲｂ１非添加例と比べて、特に
１００ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌの濃度において培養
上清中のＶＥＧＦ濃度が増加した。
【０１０４】以上のことより、ジンセノサイドＲｂ１が
アストロサイトやケラチノサイトなどの細胞のＶＥＧＦ
発現を誘導することが新規に見出された。そこで次に本
発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１が転写因子HIF-1の
活性化を介して、ＶＥＧＦ発現誘導をもたらすかどうか
をしらべた。このため、まずｐＧＬ−３プロモーターベ
クター(Promega)のマルチプルクローニングサイト上の
ＢｇｌII部位に「ＴＡＣＧＴＧ」の６回くり返し配列、
すなわち（ＴＡＣＧＴＧ）６を挿入した。ちなみに、
「ＴＡＣＧＴＧ」は、転写因子ＨＩＦ−１と結合するＤ
ＮＡ上のＨＲＥ (hypoxia-responseelement)の共通塩
基配列(consensus sequence)である。従って、本発明で
は（ＴＡＣＧＴＧ）６を挿入したｐＧＬ−３プロモータ
ーベクターをＨＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドと呼ぶ
こととする。なお、対照としては、ｐＧＬ−３プロモー
ターベクター（プラスミド）を用いた。
【０１０５】アストロサイト及び神経細胞の初代培養は
以下の要領で実施した。生直後のウイスター（Wistar）
ラットより公知の方法でアストロサイトを単離し、培養
用フラスコで培養し、２週間後に１２ウエルプレート
（12well plate）に植え替えた。なお、アストロサイト
は本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文(Fujita, H.
et al., Glia, 18, 269-281, 1996; Tanaka, J. et a
l., Glia, 20, 23-37, 1997; Tanaka, J. et al.,Glia,
24, 198-215, 1998)に記載された方法に準じて生直後
ラットの脳より分離した。また、胎生１７日目のウイス
ター（Wistar）ラット大脳皮質より公知の方法で神経細
胞を単離し、ポリＬ−リジンをコートした１２ウエルプ
レート（12well plate）上で培養した。培養５日目の神
経細胞を遺伝子導入に使用した。
【０１０６】遺伝子導入とルシフェラーゼアッセイは以
下の要領で実施した。１穴あたり１μｇのプラスミドＤ
ＮＡ（すなわちＨＲＥルシフェラーゼプラスミド又はｐ
ＧＬ−３プロモーターベクター）と５μlのリポフェク
タミン（Lipofectamine）(Invitrogen)を用いて、１０
％ＦＣＳ存在下にて５時間のトランスフェクション（遺
伝子導入）を行った。その後培地を新しいものに置き換
えて３７℃で一晩培養し、翌朝０又は１００fgのジンセ
ノサイドＲｂ１を加え３７℃で２４時間培養した。細胞
表面をＰＢＳ(phosphate-buffered saline)で２回洗浄
後、細胞をルシフェラーゼ細胞培養ライシス試薬（Luci
ferase Cell Culture Lysis Reagent）(Promega) １０
０μｌで溶解した。溶液中のルシフェラーゼ量はルシフ
ェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay Syste
m）(Promega)およびルミネッセンサーＪＮＲ （ＡＴＴ
Ｏ）を用いて測定した。結果を図２４に示す。
【０１０７】図２４に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ
１１００fg/ml添加例では、非添加例に比べてルシフェ
ラーゼの量が増加した。このことは、ジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類が好ましくは低濃度で神経
細胞やアストロサイトなどの細胞の転写因子ＨＩＦ−１
を活性化せしめ、ＨＩＦ−１とＤＮＡ上のＨＲＥ (hypo
xia-response element)との結合を惹起することを明ら
かにしている。図２４の＊はＰ＜０．０１を示す。統計
解析法はStudents' tテストによる。
【０１０８】次に本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイ
トでもジンセノサイドＲｂ１が転写因子ＨＩＦ−１を活
性化させるかどうかをしらべた。このため、ヒト皮膚ケ
ラチノサイトを１２ウェルのタイプ１コラーゲンディシ
ュに単層培養し、プラスミドＤＮＡ（すなわちＨＲＥ−
ルシフェラーゼプラスミド又はＰＧＬ−３プロモーター
ベクター）のトランスフェクションを実施した。２４時
間後に培地を交換し０〜１ｎｇ／ｍｌの濃度のジンセノ
サイドＲｂ１を添加した。４８時間後に細胞をルシフェ
ラーゼ細胞培養ライシス試薬（Luciferase Cell Cultur
e Lysis Reagent）(Promega)で溶解した。溶液中のルシ
フェラーゼ量はルシフェラーゼアッセイシステム（Luci
ferase Assay System）(Promega)およびルミネッセンサ
ーＪＮＲ （ＡＴＴＯ）を用いて測定した。結果を図２
５に示す。
【０１０９】図２５に示すごとく、対照例（ＰＧＬ−３
プロモーターベクターを遺伝子導入した例）と比べて、
ＨＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドを遺伝子導入すると
ジンセノサイドＲｂ１添加によりルシフェラーゼの量が
増加した。特に、ルシフェラーゼ量の増加は、１０ｆｇ
／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１を添加し
た時に顕著であった。従って、ジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類がアストロサイト又はヒト皮膚ケ
ラチノサイトを含むあらゆる細胞の転写因子ＨＩＦ−１
を活性化せしめ、ＨＩＦ−１とＨＲＥとの結合を惹起す
るものと考えられる。
【０１１０】さて、転写因子の１つであるハイポキシア
誘導因子（Hypoxia Inducible Factor-1（ＨＩＦ−
１））はＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βからなるヘテロダ
イマーであり、ＨＩＦ−１αが低酸素負荷で活性化され
る因子と考えられる。低酸素によるＨＩＦ−１の活性化
機構については、現在まで（１）ＨＩＦ−１αのｍＲＮ
Ａは低酸素や虚血で著明に誘導される；（２）ＨＩＦ−
１αはユビキチン・プロテオソーム系で分解されるが、
低酸素下ではその分解が抑制される；（３）ＨＩＦ−１
αのリン酸化による活性変化；の３種の機構により調節
されていると報告されている。
【０１１１】以下に、転写因子ＨＩＦ−１がＤＮＡ上の
ハイポキシア応答要素（Hypoxia response element
（ＨＲＥ））に結合することにより発現誘導される遺伝
子群もしくは遺伝子産物とその作用について列記する。 １．エリスロポエチン（ＥＰＯ）：赤芽球系前駆細胞を
赤血球に分化、増殖させることにより、赤血球の産生を
促進し、全身への酸素供給量を増加させる。従って、Ｅ
ＰＯは主として腎性貧血治療薬として利用されている。 （２）トランスフェリンとその受容体：トランスフェリ
ンは鉄輸送蛋白であり、食物から体内に吸収された鉄と
結合することにより、鉄を骨髄に運び、ヘモグロビンの
合成に利用せしめる。 （３）ＶＥＧＦ（Vascular endothelial growth facto
r）とその受容体ＦＬＴ−１：血管新生又は血管再生を
促し、局所的な酸素供給を増加させる。 （４）解糖系の諸酵素たとえばアルドラーゼＡ（aldola
se A）とＣ; ホスホフルクトキナーゼＬ（phosphofruct
okinase L）とＣ; ホスホグリセラートキナーゼ−１（p
hosphoglycerate kinase-1 （ＰＧＫ−１））;ラクテー
トデヒドロゲナーゼ−Ａ（lactate dehydrogenase-A
（ＬＤＨ−Ａ））; ピルベートキナーゼＭ（pyruvate k
inase M）; エノラーゼＡ（enolase A） （５）１型及び３型グルコーストランスポーター（ＧＬ
ＵＴ１；ＧＬＵＴ３）：細胞内へのグルコースの取込み
を促進し、細胞の無酸素呼吸を可能ならしめる。 （６）アデニル酸キナーゼ３：ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤ
Ｐの反応を触媒する。この反応はＡＭＰ→ＡＴＰの第一
段階すなわちＡＴＰ産生の第一段階として重要である。 （７）ヘムオキシゲナーゼ（Heme Oxygenase-1 （ＨＯ
−１））：ヘムをＣＯ（一酸化炭素）とビリベルジンに
分解する。生成したＣＯは血管拡張作用により低酸素か
ら心筋細胞や神経細胞を保護する。 （８）チロシン脱水素酵素：カテコールアミン合成酵素
である。
【０１１２】以上のことより、ＨＩＦ−１は、（１）Ｖ
ＥＧＦ及びその受容体の発現上昇を介して、血管損傷又
は血流障害をきたす疾患又は病態（たとえば創傷、骨
折、熱傷、痔疾、放射線障害、脳血管障害、狭心症、心
筋梗塞、レーザー傷害、レイノー病、膠原病、閉塞性動
脈硬化症、皮膚潰瘍、糖尿病性皮膚潰瘍、心不全、褥創
等）の予防、処置又は治療、（２）エリスロポエチン及
びトランスフェリンの発現上昇を介して、貧血、腎性貧
血、二次性貧血の予防、処置又は治療、（３）解糖系諸
酵素、グルコーストランスポーター、アデ二ル酸キナー
ゼ３及びＨＯ−１の発現上昇を介して、低酸素環境下の
細胞を保護し、もって脳梗塞、狭心症、心筋梗塞の予
防、処置又は治療、（４）チロシン脱水素酵素発現上昇
を介して、カテコールアミン産生量を増加せしめ、もっ
て心不全の予防、処置又は治療にそれぞれ有用とされ
る。従って、転写因子ＨＩＦ−１を活性化せしめるジン
セノサイド類などの医薬組成物も、HIF-1と同様に創
傷、骨折、熱傷、痔疾、放射線障害、脳血管障害、レー
ザー傷害、レイノー病、膠原病、閉塞性動脈硬化症、皮
膚潰瘍、糖尿病性皮膚潰瘍、褥創、貧血、腎性貧血、二
次性貧血、脳梗塞、狭心症、心不全又は心筋梗塞の予
防、処置もしくは治療に有用となる。また、HIF-1と結
合するhypoxia response element (HRE)を欠損したマウ
スでは、運動神経細胞死が起こり、筋萎縮性側索硬化症
(ALS)に類似した病状を呈することが報告されているの
で(Oosthuyse B. et al., Nature Genetics, 28, 131-1
38, 2001)、ＨＩＦ−１はおそらくＶＥＧＦの神経細胞
保護作用及び血流改善作用を介して、神経細胞死をきた
す疾患（たとえば、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキ
ンソン病等の神経変性疾患）の予防、処置、治療にも有
用と考えられる。
【０１１３】以上のごとくジンセノサイドＲｂ１などの
ジンセノサイド類又は天然のジンセノサイド類は、転写
因子ＨＩＦ−１の活性化を介してエリスロポエチン、ト
ランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＶＥＧＦ、
ＶＥＧＦ受容体（ＦＬＴ−１）、解糖系の諸酵素（aldo
lase A, aldolase C,phosphofructokinase L, phosphof
ructokinase C, phosphoglycerate kinase-1, lactate
dehydrogenase A, pyruvate kinase M, enolase A）、
１型グルコーストランスポーター、３型グルコーストラ
ンスポーター、アデニル酸キナーゼ３、ヘメオキシゲナ
ーゼ１（heme oxygenase 1（ＨＯ１））又はチロシン脱
水素酵素の発現を促進すると言える。より詳細には、本
発明のジンセノサイド類からなる医薬組成物は、転写因
子ＨＩＦ−１により発現誘導される前記遺伝子産物又は
生理活性物質の作用を介して、創傷、骨折、熱傷、痔
疾、放射線障害、脳血管障害、レイノー病、膠原病、閉
塞性動脈硬化症、バージャー病、糖尿病性皮膚潰瘍、皮
膚潰瘍、レーザー傷害、褥創、貧血、二次性貧血、腎性
貧血、神経細胞死をきたす疾患、筋萎縮性側索硬化症、
脳梗塞、狭心症、心不全もしくは心筋梗塞等を予防、処
置又は治療するのに有用と考えられる。
【０１１４】さて、本発明者らは前述のごとく、ジヒド
ロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体
が神経細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を誘導することを
明らかにしている。そこで、次に本発明者らはジンセノ
サイド類誘導体がジンセノサイドＲｂ１と同様にアスト
ロサイトのＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を促進するかどうか
をしらべた。そのため、ジンセノサイド類誘導体の代表
例として還元型誘導体すなわち前記した構造式で示され
るジヒドロジンセノサイドＲｂ１を選び実験を実施し
た。生直後のウイスター（Wistar）ラットより公知の方
法でアストロサイトを単離し、培養用フラスコで培養
し、１２日後にポリＬ−リジンをコートした１０ｃｍデ
ィッシュ（10cm dish）に植え替えた。アストロサイト
は、１０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含むDMEM培地で培養
した。３〜４日後に、無血清培地に交換し、ジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１を０、１ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／
ｍｌの濃度で添加し、６時間培養した。なお、アストロ
サイトは本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文(Fujit
a, H. et al., Glia, 18, 269-281, 1996; Tanaka, J.
et al., Glia, 20, 23-37, 1997; Tanaka, J. et al.,
Glia, 24, 198-215, 1998)に記載された方法に準じて生
直後ラットの脳より分離した。
【０１１５】その後培養アストロサイトから総ＲＮＡを
抽出した。ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇから
オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを
作成した。ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いてト
ネラの論文(Tonello, C., FEBS Letters, 442, 167-17
2, 1999)に準じて行った。使用したＰＣＲ−プライマー
とＰＣＲ反応条件は以下の通りである。なお、β−アク
チンは内部標準である。 （１）β−アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２）ＶＥＧＦ Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルに
て電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化
した。結果を図２６に示す。図２６は図面に代わる写真
である。
【０１１６】図２６に示すように、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１無添加アストロサイトに比べて、ジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１を１ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌ
の濃度で添加されたアストロサイトではＶＥＧＦ ｍＲ
ＮＡの発現が増強した。なお、ラットのＶＥＧＦは構成
するアミノ酸の数に対応して、ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧ
Ｆ１６４、ＶＥＧＦ１８８という３つのサブタイプに分
けられるので、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのバンドも図２６の
ごとく少なくとも２本認められる。
【０１１７】次に本発明者らはジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１が神経細胞においてＶＥＧＦ mRNAのみならずＶ
ＥＧＦ蛋白の発現を増強するかどうか調べるため、抗Ｖ
ＥＧＦモノクローナル抗体（サンタクルズ社製）を用い
てウエスタンブロット法を実施した。ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１存在下または非存在下で、ラット大脳皮質
神経細胞を２４時間培養後、電気泳動用サンプル緩衝液
で細胞を溶解し、電気泳動を実施した。その後泳動蛋白
をニトロセルロース膜に転写しウエスタンブロットを行
った。なおウエスタンブロットの実験手技の詳細につい
ては、本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文（Wen T.
-C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998）に
記載されている。結果を図２７に示す。図２７は、図面
に代わるウエスタンブロットの写真である。さらに、抗
ＶＥＧＦ抗体と反応するバンドを画像解析装置で定量化
した。結果を図２８に示す。
【０１１８】図２７及び図２８に示すごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は１〜１００fg/mlの至適濃度域
で、神経細胞のＶＥＧＦ蛋白の発現量を有意に増加せし
めた。図２７及び図２８の＊はP＜０．０５を示し、統
計解析法はANOVA+Fisher's PLSDによる。
【０１１９】以上の結果より、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体もジンセノサイド
Ｒｂ１と同様に、細胞のＶＥＧＦ発現を増強せしめると
言える。しかも、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号に記
載のごとくジヒドロジンセノサイドＲｂ１とジンセノサ
イドＲｂ１の薬理作用は極めて類似しているので、当然
のことながらジヒドロジンセノサイドＲｂ１もジンセノ
サイドＲｂ１と同様に転写因子ＨＩＦ−１の活性化を介
して、細胞のVEGF発現をアップレギュレーションせしめ
ると考えられる。
【０１２０】従ってジヒドロジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体は、アストロサイトや神経細
胞などの細胞の転写因子ＨＩＦ−１の活性化を介して、
エリスロポエチン、トランスフェリン、トランスフェリ
ン受容体、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体（ＦＬＴ−１）、
解糖系の諸酵素（aldolase A, aldolase C, phosphofru
ctokinase L, phosphofructokinase C, phosphoglycera
te kinase-1, lactate dehydrogenase A, pyruvate kin
ase M, enolase A）、1型グルコーストランスポータ
ー、3型グルコーストランスポーター、アデニル酸キナ
ーゼ３、ヘメオキシゲナーゼ１（heme oxygenase 1（Ｈ
Ｏ１））又はチロシン脱水素酵素の発現を促進すると言
える。より詳細には、本発明のジンセノサイド類誘導体
からなる医薬組成物は、転写因子ＨＩＦ−１により発現
誘導される前記遺伝子産物又は生理活性物質の作用を介
して、創傷、骨折、熱傷、痔疾、放射線障害、脳血管障
害、レイノー病、膠原病、閉塞性動脈硬化症、バージャ
ー病、糖尿病性皮膚潰瘍、皮膚潰瘍、レーザー傷害、褥
創、貧血、二次性貧血、腎性貧血、神経細胞死をきたす
疾患、脳梗塞、狭心症、心不全もしくは心筋梗塞等を予
防、処置又は治療するために有用と考えられる。なお、
本発明ではジンセノサイド類誘導体もジンセノサイド類
の中に含まれることはすでに記述した。
【０１２１】
【実施例】次に、具体的な試験例について本発明を詳細
に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるも
のではない。
【０１２２】実施例１（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
作成実験） 本発明者らはまずジヒドロジンセノサイドＲｂ１を作成
した。以下にジヒドロジンセノサイドＲｂ１の製造例な
らびにＮＭＲのデータを示す。（１）１０％Ｐｄ／Ｃ
（パラジウムチャーコール）１０．２ｍｇを秤量し、活
セン付２口フラスコに入れる（２）メタノール（特級）
を１ｍｌ加えて懸濁させる。（３）水素風船（約１．１
気圧）をとりつけ３０分０℃で触媒を活性化する。
（４）ジンセノサイドＲｂ１ １９．９ｍｇをメタノー
ル１ｍｌで溶かし注射器で注入する。（５）混合物を１
０時間半０℃で磁気スターラーにより激しく撹拌する。
（６）反応混合物をろ紙及び０．４５μｍのメンブラン
フィルターでろ過する。（７）メタノールを減圧除去す
る。（８）純水１０ｍｌに溶解させたのち凍結乾燥する
と１９．１ｍｇ（収率９７％）のジヒドロジンセノサイ
ドＲｂ１を白色粉末として得た。ジヒドロジンセノサイ
ドＲｂ１の融点は１９３〜１９５℃である。ちなみに、
ジンセノサイドＲｂ１の融点は１９７〜１９８℃（文献
値）である。図１にジヒドロジンセノサイドＲｂ１のＮ
ＭＲチャート（400MHz, CD３OD）を示す。
【０１２３】実施例２（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
の抗アポトーシス作用） 次に本発明者らは、前記の方法により得られたジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１が、細胞に対して好ましい効果を
及ぼす濃度をまず通常の培養実験で調べた。このため、
本発明者らは培養神経細胞のアポトーシスもしくはアポ
トーシス様神経細胞死が、ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１により抑止される濃度を調べた。本発明者ら（阪中、
田中）は、培養神経細胞を一酸化窒素供与体であるニト
ロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）に短時間暴露すると
神経細胞のアポトーシスもしくはアポトーシス様神経細
胞死が誘導されることを報告している（Toku K. et a
l., J. Neurosci. Res., 53, 415-425, 1998）。この培
養実験系を用いて、本発明者らはすでにジンセノサイド
Ｒｂ１が１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適細胞外液濃度域で
神経細胞のアポトーシスもしくはアポトーシス様神経細
胞死を抑止することを見出している（ＷＯ００／３７４
８１号）。そこで、同様の実験系を用いてジヒドロジン
セノサイドＲｂ１の神経細胞保護作用を調べた。
【０１２４】妊娠１７日齢のラットの胎仔大脳皮質よ
り、トリプシンＥＤＴＡを用いて神経細胞を分離し、ポ
リエルリジンコートした２４ウェルプレートに蒔いた。
１０％牛胎仔血清を含むダルベコの修飾イーグル培地
（Dulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ））
中で１６時間培養後、培養液をインシュリン、トランス
フェリン等を含む神経細胞培養用無血清培地に置き換
え、３ないし４日間培養した。培養３または４日目に、
３００μＭの濃度でニトロプルシッドナトリウム（ＳＮ
Ｐ）を添加し、１０分間インキュベートした。その後、
培養液をジヒドロジンセノサイドＲｂ１（０〜１ｎｇ／
ｍｌ）及び牛血清アルブミンを含むイーグルの最少必要
培地（Eagle's minimum essential medium（ＥＭＥ
Ｍ））に置き換えた。ＳＮＰ負荷後１６時間目にラエム
リ（Laemmli）の電気泳動用サンプル緩衝液を用いて神
経細胞を溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、ニトロセルロース膜に転写後、神経細胞特異蛋白質
ＭＡＰ２に対する抗体を用いてイムノブロッティングを
行った。神経細胞の生存率及び／又は突起伸長を定量す
るため、免疫染色されたＭＡＰ２のバンドをデンシトメ
トリーにより解析した。結果を図２及び図３に示す。な
お、ＭＡＰ２イムノブロットの実験手技の詳細について
は、本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文に記述され
ている（Wen, T-C. et al., J.Exp.Med., 188, 635-64
9, 1998）。
【０１２５】図２はマイクロチュブル関連蛋白２（micr
otuble-associated protein2（ＭＡＰ２））のイムノブ
ロットの結果を示す図面に代わる写真である。左から１
番目のレーンがコントロールの培養神経細胞であり、明
らかなＭＡＰ２のバンド（すなわち神経細胞のマーカー
のバンド）が認められた。ＳＮＰ処理をすると、多くの
神経細胞がアポトーシスもしくはアポトーシス様神経細
胞死に陥るので、ＭＡＰ２のバンドが左から２番目のレ
ーンのごとく明らかに弱くなった。ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１を０．０１ｆｇ／ｍｌ（レーン３）から１ｎ
ｇ／ｍｌ（レーン７）の濃度で培養メディウムに添加し
ておくと、ＳＮＰによる神経細胞のアポトーシス又はア
ポトーシス様神経細胞死が明らかに抑止され、その結果
神経細胞の生存及び／又は突起伸長の指標であるＭＡＰ
２の強いバンドが観察された。
【０１２６】前述のＭＡＰ２のイムノブロット実験を５
回くり返し、結果をデンシトメトリー解析したものが図
３である。図３に示すごとく、０．０１ｆｇ／ｍｌ〜１
ｎｇ／ｍｌの至適細胞外液濃度域のジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１は有意に神経細胞のアポトーシスもしくはア
ポトーシス様神経細胞死を抑止することが判明した。す
なわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ＷＯ００／
３７４８１号に記載のジンセノサイドＲｂ１よりもかな
り広い至適細胞外液濃度域で、細胞特には神経細胞に対
して好ましい抗アポトーシス作用を発揮すると考えられ
る。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジ
ンセノサイド類誘導体は神経突起を伸長せしめることに
より、神経組織の再生及び／又は再構築をも促進すると
考えられる。従って、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類誘導体は、患部組織における細胞
外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以下、好ま
しくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、より好ま
しくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以下、さらに好ま
しくは０．０００００１ｆｇ／ｍｌ（約０．０００００
０９ｆＭ）〜１００００ｆｇ／ｍｌ（約９０００ｆＭ）
のときに細胞のアポトーシスもしくはアポトーシス様細
胞死を抑止することにより、優れた細胞保護作用を発揮
すると考えられる。すなわち、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、血流障害にさ
らされた生体組織の細胞を、抗アポトーシス作用を介し
て保護すると考えられる。ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド類誘導体は移植用組織・臓器の
細胞（幹細胞、ＥＳ細胞、皮膚ケラチノサイト等）、あ
らゆる組織由来の細胞、移植用凍結細胞、輸血用血球成
分・血小板、生殖細胞（凍結卵子もしくは凍結精子）の
保護又は保存にも有用と考えられる。図３の＊はＰ＜
０．００１を、＊＊はＰ＜０．０００１を示す。統計解
析法はＡＮＯＶＡ＋Scheffeのpost hocテストによる。
【０１２７】実施例３（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
の脳血管障害治療効果） 以上のようにジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジン
セノサイド類誘導体は、ＷＯ００／３７４８１号に記載
のジンセノサイドＲｂ１よりもかなり広い細胞外液濃度
域で細胞特には神経細胞のアポトーシスもしくはアポト
ーシス様神経細胞死を抑止することがインビトロ（in v
itro）の実験系で明らかにされたが、実際に血流障害を
きたすインビボ（in vivo）の動物実験系でもジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体
が、ＷＯ００／３７４８１号に記載のジンセノサイドＲ
ｂ１と同様に優れた効果を示すかどうかを本発明者は次
にしらべた。このため以下のごとく血流障害をきたす疾
患としてたとえば脳血管障害を選び、ジンセノサイド類
誘導体の１つであるジヒドロジンセノサイドＲｂ１の静
脈内投与が、脳血管障害特には脳梗塞の治療に有効かど
うかをしらべた。
【０１２８】約１２〜１６週齡の雄性脳卒中易発症高血
圧自然発症ラット（ＳＨ−ＳＰラット、体重２８０−３
２０ｇ）を使用した。同動物は12時間ごとの明暗サイク
ル室で飼育し、水ならびに餌は自由摂取とした。吸入麻
酔下で同動物の左中大脳動脈皮質枝(MCA)を凝固・切離
した。ジヒドロジンセノサイドＲｂ１をＭＣＡ永久閉塞
直後に単回静脈内注入し(６μｇ日又は０．６μｇ)、そ
の後アルザミニ浸透圧ポンプを用いて２４時間静脈内へ
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を持続注入(６μｇ／日
又は０．６μｇ／日)した(ｎ＝６)。なお、本実験手技
の詳細については本発明者ら（阪中、田中）の既発表論
文に記述されている（Igase K.et al., J. Cerebr. Blo
od Flow Metab., 19. 298-306, 1999）。なお、ＭＣＡ
を永久閉塞した対照動物（虚血コントロール動物）には
同量の生理食塩水（vehicle、担体又は媒体）のみを静
脈内投与した（ｎ＝７）。ＭＣＡ永久閉塞後24時間目
に、致死量のペントバルビタールをラットの腹腔内に注
入した。同動物が死亡した直後に脳を摘出し、２ｍｍの
厚みの前額切片を作成した。同切片を、１％の塩化２，
３，５−トリフェニル−テトラゾリウムクロライド（2,
3, 5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)）溶液に
３０分間３７℃で浸漬し、１０％ホルマリンにて１２時
間以上固定した。結果を、図４、図５に示す。図４は生
理食塩水を投与した２例を、図５はジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１６μｇ／日を静脈内投与した２例を示す。
【０１２９】図４に示すごとく、ＭＣＡ永久閉塞後生理
食塩水を投与したラットでは、向かって左側の大脳皮質
に、ＴＴＣで染色されない白色の脳梗塞病巣が明らかに
認められた。一方、図５に示すごとく、ジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１をMCA永久閉塞後に静脈内投与したラッ
トでは脳梗塞病巣が顕著に縮小していた。
【０１３０】ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を静脈内投
与した脳梗塞ラット（ｎ＝６）の脳梗塞面積と、ビヒク
ル（vehicle（担体又は媒体））のみを投与した脳梗塞
ラットの脳梗塞面積（ｎ＝７）とを比較した。結果を図
６に示す。図６に示すごとくビヒクル（vehicle (salin
e)）投与脳梗塞群の脳梗塞面積に比べて、ジヒドロジン
セノサイドＲｂ１（２Ｈ−Ｒｂ１）投与脳梗塞群の脳梗
塞面積(infarct area)は３分の１程度に縮小していた。
図６の統計解析法はMann-Whitney Uテストにより、＊＊
印はＰ＜０．００１を示す。
【０１３１】以上のことより、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１の脳血管障害治療効果特に脳梗塞治療効果は、Ｗ
Ｏ００／３７４８１号で開示されたジンセノサイドＲｂ
１などの効果に匹敵するほど優れたものであることが判
明した。すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１のジ
ンセノサイド類誘導体は脳血管障害や脳梗塞などの血流
障害をきたす疾患又は病態に効果・効能を発揮すると言
える。また、ＷＯ００／４８６０８号に記載のジンセノ
サイドＲｂ１と同様に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体が、脳血管の再生及び／
又は再構築を促進すると考えられた。そこで本発明者は
さらにジヒドロジンセノサイドＲｂ１の静脈内投与量を
２倍（１２μｇ／日）にして、同様に脳梗塞治療効果が
得られるかどうかをしらべた所、予想に反して優れた効
果は認められなかった。すなわち、ＷＯ００／３７４８
１号においてジンセノサイドＲｂ１は体重３００ｇ程度
のＳＨ−ＳＰラットに対して６０μｇ／日の投与量でも
優れた脳梗塞治療効果を示したが、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体はそのような
高用量では脳梗塞治療効果及び／又は脳血管再生・再構
築促進作用を必ずしも発揮しないと考えられた。従っ
て、体重３００ｇ程度の脳梗塞ラットに対するジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１の至適投与量は、ジンセノサイド
Ｒｂ１の至適投与量よりも低く、詳細には１２μｇ／日
以下と考えられた。このことから、培養実験においては
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ジンセノサイドＲｂ
１よりも幅広い濃度域で神経細胞のアポトーシスもしく
はアポトーシス様神経細胞死を抑止するが、生体内（in
vivo）においてはジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、
ジンセノサイドＲｂ１と同量もしくはその１０分の１か
ら１０００分の１程度という低い投与用量域で優れた脳
梗塞治療効果及び脳血管再生・再構築促進作用を発揮す
ると言える。ただし、その他のジンセノサイド類誘導体
たとえばジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキ
シジンセノサイドＲｂ１などは、ジンセノサイドＲｂ１
と同等もしくはそれより１０００倍程度多い投与量・濃
度でジンセノサイドＲｂ１と同様の効果・効能を示すと
考えられる。
【０１３２】実施例４（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
の脊髄損傷治療効果判定実験） 本発明者は、さらに低用量のジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１が血流障害をきたす神経外傷においても好ましい効
果をもたらすかどうかをしらべた。ちなみに脊髄損傷や
頭部外傷などの神経外傷でも、血管の破綻や脳・脊髄組
織の浮腫のために血流障害が生じ、非可逆的な高次神経
障害がもたらされる。そこで、本発明者らは血流障害を
きたす疾患の１つとして脊髄損傷をとりあげ、脊髄損傷
に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果をしらべ
ることとした。このため、ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１を１．２μｇ／日の用量で脊髄損傷ラット（体重約３
００ｇ）の静脈内へ７日間持続注入した実験例を以下に
述べる。
【０１３３】ハロセン、笑気による吸入麻酔下で、ラッ
トの下位胸髄に２０ｇの圧力を２０分間負荷した後、３
０分以上経過してから左大腿静脈にジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１(１．２μｇ)を単回注入し、さらに同静脈へ
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１（１．２μｇ／日）をア
ルザミニ浸透圧ポンプにて７日間持続投与した。対照動
物には同様のスケジュールで同量の生理食塩水（vehicl
e、担体又は媒体）を投与した。結果を図７、図８に示
す。
【０１３４】図７及び図８の左側写真は脊髄損傷後２日
目の生理食塩水投与ラットを、図７及び図８の右側写真
は、同時期のジヒドロジンセノサイドＲｂ１(１．２μ
ｇ／日)投与ラットを、それぞれ示している。図７及び
図８の左側写真に示すごとく、下位胸髄に２０ｇの圧力
を２０分間負荷された生理食塩水投与ラットは、脊髄損
傷当日のみならず、脊髄損傷後２日目にも両下肢の対麻
痺を呈した。しかし下位胸髄に２０ｇの圧力を２０分間
負荷した後にジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１．２μ
ｇ／日の用量で静脈内へ持続投与すると、脊髄損傷当日
は下肢の対麻痺を呈していたが、図７及び図８の右側写
真に示すごとく脊髄損傷後２日目には、両下肢の対麻痺
が著しく改善し、ラットは物につかまりながら立ち上が
ることができるようになった。また、ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を８μｇ／日又は６０μｇ／日の用量で脊
髄損傷ラットの静脈内に投与しても優れた効果は認めら
れなかった。
【０１３５】以上のことより、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、ＷＯ００／４
８６０８号に記載のジンセノサイドＲｂ１と比較しても
まったく遜色ないくらいに優れた脊髄損傷・神経外傷治
療効果を発揮することが判明した。しかも、体重３００
ｇの脊髄損傷ラットに対するジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１の至適投与量は１．２μｇ／日前後もしくはそれ以
下と考えられた。すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１を神経外傷・頭部外傷・脊髄損傷治療用医薬組成物
として利用するときは、その至適投与量はＷＯ００／４
８６０８号又はＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２号に記載
のジンセノサイドＲｂ１の至適投与量（体重３００ｇの
ラットに対して６０μｇ／日）の５０分の１前後又はそ
れ以下となることが判明した。前述のごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は、高純度のジンセノサイドＲｂ
１を原材料として９７％の収率で作成することができる
ので、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ジンセノサイ
ドＲｂ１よりも効率良く、神経外傷・脳卒中などの血流
障害をきたす脳・神経疾患の予防、処置、治療に利用さ
れ得ることになる。
【０１３６】脳血管障害（脳梗塞）モデル動物ならびに
脊髄損傷モデル動物を用いた前記の実験結果より、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体は血流障害をきたす疾患特には脳血管障害や脊髄損傷
の予防、処置又は治療のための医薬組成物となることが
発明された。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体は、細胞のアポトーシス
又はアポトーシス様細胞死を抑止するとともに血管の再
生・再構築を促進することにより、血流障害をきたす疾
患又は病態（たとえば脳血管障害、頭部外傷、神経外
傷、もやもや病、脊髄損傷等）の予防、処置又は治療に
効果・効能を示すと考えられる。
【０１３７】実施例５（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
を含有する皮膚外用剤による開放創治療） 次に、本発明者らはジヒドロジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体が、血管が破綻もしくは切断
されることにより血流障害をきたす疾患に対しても効果
を示すかどうかしらべた。このため、血管が破綻もしく
は切断される疾患として創傷特には開放創を選び、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１の開放創治療効果を検討し
た。吸入麻酔下でラット（ｎ＝４）の背部に直径６ｍｍ
のパンチバイオプシーを５ケ所に施し開放創を作成し
た。これにより同部の血管は瞬時に切断され、開放創部
に血流障害が生じる。その後、各開放創に、ジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１をそれぞれ０．０００１重量％（１
０−４重量％）、０．００００１重量％（１０−５重量
％）、０．０００００１重量％（１０−６重量％）、
０．００００００１重量％（１０−７重量％）、の濃度
で含有するプロペト（眼科用白色ワセリン）を１日単回
０．１ｇ９日間外用塗布した。コントロールには同量の
プロペトのみを外用塗布した。その後、麻酔により動物
を安楽死させた直後に創傷部皮膚を採取し写真撮影を実
施した。採取した皮膚組織は固定液中で保存した。結果
を図９に示す。図９は図面に代わる写真である。図９は
４例が示されており、上から第１例目、第２例目、第３
例目、及び第４例目が示されている。各々、左側に２
個、右側に３個づつの合計５ケ所に開放創の跡があり、
左側の上から１０−４重量％の場合、１０−５重量％の
場合、右側の上から１０−６重量％の場合、１０−７重
量％の場合、０重量％の場合（コントロール）を示す。
【０１３８】図９に示すごとく０．００００１重量％
（１０−５重量％）から０．００００００１重量％（１
０−７重量％）のジヒドロジンセノサイドＲｂ１を含有
するプロペト（すなわち１００ｎｇ／ｇから１ｎｇ／ｇ
の濃度のジヒドロジンセノサイドＲｂ１）を開放創に外
用塗布すると明らかに、プロペトのみを外用塗布した開
放創に比べて、創傷治癒が促進された。また、低濃度の
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を外用投与した例では、
創傷治癒部に明らかな発毛が観察された。従って、ジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導
体を皮膚外用剤として使用するときは、外用剤における
当該組成物の濃度は０．００１重量％以下又は未満、好
ましくは０．００００１重量％以下、より好ましくは
０．００００００１重量％（１０−７重量％）前後もし
くはそれ以下に設定することが好ましいと考えられた。
従って、血流障害をきたす疾患（たとえば創傷、熱傷、
褥創、皮膚潰瘍、痔疾等）の予防、処置又は治療のため
に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイ
ド類誘導体からなる医薬組成物を外用投与又は局所投与
するときも、皮膚外用剤又は局所投与剤におけるその濃
度は０．００１重量％以下又は未満、好ましくは０．０
０００１重量％（１０−５重量％）以下、より好ましく
は０．００００００１重量％（１０−７重量％）以下に
設定することが好ましい。前記疾患の予防、処置又は治
療のための皮膚外用剤ならびに局所投与剤におけるジン
セノサイド類誘導体の濃度の上限は１％以下、好ましく
は０．１％以下である。
【０１３９】前述の実験例において、プロペトのみを外
用塗布した開放創の面積を分母にとり、０．０００１重
量％（１０−４重量％）から０．００００００１重量％
（１０−７重量％）のジヒドロジンセノサイドＲｂ１を
外用塗布した開放創の面積を分子にとり、その比を算出
した。結果を図１０に示す。図１０では、ｎ＝４で＊印
はＰ＜０．０５で有意差があることを示す。なお、検定
はFisherのPLSDによっている。図１０に示すごとく、
０．００００１重量％（１０−５重量％）以下の濃度の
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を開放創に外用投与する
と皮膚組織の再生・再構築が促進され、有意に創傷治癒
も促進された。特に０．００００１重量％（１０−５重
量％）以下のジヒドロジンセノサイドＲｂ１すなわち１
００ｎｇ／ｇ以下もしくは１００ｎｇ／ｍｌ以下のジヒ
ドロジンセノサイドＲｂ１の外用投与が開放創を有意に
縮小せしめたという事実は、ジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１などのジンセノサイド類誘導体が患部組織の細胞外
液濃度が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１００ｎｇ
／ｍｌ以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、さらに
好ましくは０．０００００１〜１００００ｆｇ／ｍｌの
ときに血管の新生・再生又は再構築を顕著に促進して創
傷治癒を早めることを強く支持している。なお、ＰＣＴ
／ＪＰ００／０５５５４号に記載のごとく創傷治癒の初
期段階では、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、上皮細
胞、表皮角化細胞、幹細胞、線維芽細胞などが活発に分
裂・増殖をくり返し、多数の新生血管や再生血管が形成
されるが、ひとたび創傷が治癒するとこれらの新生血管
又は再生血管は過剰なものから退縮もしくは消失するこ
とになる。この現象をＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号
ならびに本明細書では血管の再構築と呼ぶこととする。
すなわち、あらゆる生体組織の再生・再構築現象におい
ては、細胞の分裂・増殖・移動と分化、接着、分裂増殖
停止という相反するイベントが秩序立てて起こることが
必要となるが、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１はこれら
のイベントを巧みに調節すると言える。従って、もしジ
ヒドロジンセノサイドＲｂ１の血管再構築促進作用が選
択的に発揮されれば、同医薬組成物は悪性新生物（癌、
肉腫を含む）の予防、処置又は治療にも有用となる。
【０１４０】以上の実験結果より、低濃度のジンセノサ
イド類誘導体特にジヒドロジンセノサイドＲｂ１の皮膚
外用塗布が、切断された血管の再生・再構築を促進する
のみならず、皮膚の表皮組織、真皮の結合組織、真皮の
乳頭、皮脂腺、神経、汗腺、毛乳頭、立毛筋、毛包等の
再生・再構築をも促進し、創傷治療を早めると考えられ
る。本発明者の知る限り、低濃度のジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１の皮膚外用投与の効果は、ペプチド性因子
（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の効果よりはるかに優
れている。本実験で使用した低濃度のジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を含有する軟膏もしくは外用剤は、皮膚の
みならず創傷、損傷もしくは、病理組織学的変化をきた
したあらゆる臓器・組織（角膜、口腔粘膜、外耳、消化
管粘膜、鼻粘膜、鼓膜、腟、膀胱、子宮、尿道、気道粘
膜、直腸、肛門等）に外用投与して、血管を始めとする
病変組織の再生・再構築を促進せしめることができる。
特にジンセノサイド類を含有してなる坐剤を痔疾の予
防、処置又は治療のために肛門及び／又は直腸（粘膜）
に外用投与すれば優れた効果が得られる。本実験結果よ
り、プロペト１０ｇあたりのジンセノサイド類誘導体特
にはジヒドロジンセノサイドＲｂ１の混入量は０．１ｍ
ｇ以下、好ましくは０．０００１ｍｇ以下ということが
判明した。すなわち皮膚疾患を有するヒトもしくは脊椎
動物へのジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロジンセ
ノサイドＲｂ１の至適皮膚外用投与量は、かなり少ない
ということになる。前記疾患を予防、処置又は治療する
目的でプロペト１０ｇあたりにジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体を混入するとき
は、その上限は０．１ｇ以下、好ましくは０．００１ｇ
以下である。
【０１４１】実施例６（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
による神経細胞のＢｃｌ−ｘＬｍＲＮＡ発現促進、ＶＥ
ＧＦｍＲＮＡ発現促進もしくはカスパーゼ３ｍＲＮＡ発
現抑制） 前述のごとく、本発明の医薬組成物は抗アポトーシス作
用ならびに血管再生・再構築促進作用を介して、血流障
害をきたす疾患もしくは病態を予防、処置又は治療する
と考えられる。そこで、次に本発明者らは、細胞のアポ
トーシス又は血管の再生・再構築に関わる主要な因子
（分子群）の発現をジヒドロジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体が調節するかどうか調べた。
このため、アポトーシス又はアポトーシス様細胞死に関
わる代表的な分子として、Ｂｃｌ−ｘＬ及びカスパーゼ
３を、血管再生及び／又は再構築に関わる代表的な分子
としてＶＥＧＦをとりあげ、これらの分子群の発現がジ
ヒドロジンセノサイドＲｂ１により変化するかどうかを
検討した。
【０１４２】実験手技は本発明者ら（阪中、田中）の既
発表論文（Wen, T-C. et al., J. Exp. Med., 188, 635
-649, 1998）ならびにトネロら（Tonello, C.）の論文
（FEBS Letters, 442, 167-172, 1999）に準じた。胎生
１７日目ラットから摘出した大脳皮質神経細胞を１０％
牛胎仔血清を含む培地で培養した。培養２日目に無血清
培地に交換し、培養３日目にジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１を０，１，１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加し、６時
間培養した。その後培養神経細胞から総ＲＮＡを抽出し
た。ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇからオリゴ
ｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成し
た。ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いて行った。
使用したＰＣＲ-プライマーとＰＣＲ反応条件は以下の
通りである。なお、β-アクチンは内部標準である。 （１）β-アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２）Ｂｃｌ−ｘＬ Sense primer ＝ AAG CGT AGA CAA GGA GAT GCA Antisense primer＝ GGA GCT GAT CTG AGG AAA AAC C １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
１℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 （３）ＶＥＧＦ Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 （４）カスパーゼ３ Sense primer ＝ GCT AAC CTC AGA GAG ACA TTC ATG Antisense primer＝ TTA GTG ATA AAA GTA CAG TTC TTT １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
９℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルに
て電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化
した。結果を図１１及び図１２に示す。図１１及び図１
２は図面に代わる写真である。
【０１４３】図１１に示すように、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１無添加神経細胞に比べて、ジヒドロジンセノ
サイドＲｂ１を１，１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加され
た神経細胞ではＢｃｌ−ｘＬとＶＥＧＦｍＲＮＡの発現
が増強した。特に１ｆｇ／ｍｌ添加群で最も強いＶＥＧ
ＦｍＲＮＡの発現を認めた。なお、ラットのＶＥＧＦは
構成するアミノ酸の数に対応して、ＶＥＧＦ１２０、Ｖ
ＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１８８という３つのサブタイプ
に分けられるので、ＶＥＧＦｍＲＮＡのバンドも図１１
のごとく少なくとも２本認められる。更に図１２に示す
ようにジヒドロジンセノサイドＲｂ１無添加神経細胞に
比べて、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１，１００ｆ
ｇ／ｍｌの濃度で添加した神経細胞ではカスパーゼ３ｍ
ＲＮＡの発現が抑制された。特に１ｆｇ／ｍｌ添加群で
最も強いカスパーゼ３ｍＲＮＡの発現抑制を認めた。
【０１４４】以上のことより、ジンセノサイド類誘導体
特にジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、Ｂｃｌ−ｘＬ又
はカスパーゼ３を始めとする成書（実験医学、17巻、1
３号、企画、長田重一、1999、羊土社）に記載されたア
ポトーシス関連分子群の発現を増加、減少又は調節する
ことにより、アポトーシスもしくはアポトーシス様細胞
死を抑止すると言える。また、ジンセノサイド類誘導体
特にジヒドロジンセノサイドＲｂ１は、ＶＥＧＦなどの
成書（実験医学、17巻、6号、企画、渋谷正史、1999、
羊土社）に記載された血管新生・再生・再構築関連分子
群の発現を増加、減少又は調節することにより、血管の
再生・再構築を促進すると考えられる。
【０１４５】すなわち、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１
などのジンセノサイド類誘導体からなる医薬組成物は、
Ｂｃｌ−ｘＬ発現の促進及び／又はカスパーゼ３発現の
抑制を介して、あらゆる種類の細胞のアポトーシスもし
くはアポトーシス様細胞死を抑止し、もって細胞死をき
たす疾患（病態を含む）の予防、処置、治療に利用され
る。もちろん、ジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１など
のジンセノサイド類誘導体はＢｃｌ−ｘＬ及び／又はカ
スパーゼ３の転写因子（たとえばＮＦκＢ、ＳＴＡＴｓ
等）の作用を増強、減弱又は調節するとも考えられる。
なお、本発明の医薬組成物の適応が期待される細胞死を
きたす疾患については、ＰＣＴ／ＪＰ００／０４１０２
号に記載されている。また、本発明の医薬組成物は、前
記した抗アポトーシス作用に加えて、血管の再生・再構
築を促進する作用をも有するので、これら２つの作用を
介して、血流障害をきたす疾患や病態の予防、処置、又
は治療のために有用である。血流障害をきたす疾患や病
態については本明細書に既述した。
【０１４６】実施例７（ジンセノサイド類誘導体特には
ジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセ
ノサイドＲｂ１による縫合不全発症の予防、治療、処
置） 糖尿病患者、高齢者、免疫不全病患者、低栄養患者、癌
患者などは外科的手術後に縫合不全を発症することが多
いので、これを未然に防ぐことが何よりも肝要であると
考えられている。従って、術前もしくは術後より通常の
治療にジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジン
セノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ
１を、通常１日当たり０．００１ｍｇ以上、好ましくは
０．１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上の用量で
静脈内へ連日単回注入もしくは持続注入しておくと、術
後の縫合不全発症率が有意に低下し、術創の回復も早く
なる。また、ジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキ
シジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲ
ｂ１の静脈内注入を実施するとともに、水溶性基剤、軟
膏基剤、点眼用基剤、脂溶性基剤等の任意又は公知の基
剤に低濃度のジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエ
ポキシジンセノサイドＲｂ１を混入して皮膚外用剤（ク
リーム、ゲル、パップ剤、噴霧剤又は軟膏等）、点眼液
又は眼軟膏を作成し、術創部局所及びその周辺部に創傷
が治癒するまで、塗布又は点眼してもよい。また、術中
にジンセノサイド類特にはジヒドロキシジンセノサイド
Ｒｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１を局所投与し
てもよい。その際に局部におけるジンセノサイド類誘導
体の細胞外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以
下、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、
より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以下、さ
らに好ましくは１００ｆｇ／ｍｌ（約９０ｆＭ）以下と
なるように基剤ならびに局所投与剤、点眼液又は眼軟膏
への混入量を調整する。すなわち、皮膚外用剤へのジン
セノサイド類誘導体混入量は０．１重量％以下、好まし
くは０．００１重量％以下とすることが好ましい。な
お、本実施例においては、ジンセノサイド類誘導体の１
つとして、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を用いてもよ
い。
【０１４７】実施例８（ジンセノサイド類誘導体特には
ジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセ
ノサイドＲｂ１による放射線障害もしくは熱傷の治療、
処置） 重症の放射線障害患者や熱傷患者は、皮膚組織が広範に
変性脱落し、皮膚培養シート移植によっても満足すべき
効果が得られず、患者の生命予後が脅かされることがあ
る。このような患者に対して、移植培養皮膚シートから
の皮膚組織再生や健常皮膚組織構成細胞の分裂・増殖・
病巣部への移動・分化・接着による病変組織の再生・再
構築を促すために、ジンセノサイド類誘導体特にはジヒ
ドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサ
イドＲｂ１を１日当たり０．００１ｍｇ以上、好ましく
は０．１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上の用量
で静脈内へ症状の改善がみられるまで連日単回注入もし
くは持続注入する。もちろん、ジンセノサイド類誘導体
特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシ
ジンセノサイドＲｂ１の静脈内注入を実施するととも
に、水溶性基剤あるいは脂溶性基剤にジンセノサイド類
誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエ
ポキシジンセノサイドＲｂ１を混入して皮膚外用剤（ク
リーム、ゲル、ローション、パップ剤、噴霧剤又は軟膏
等）を作成し、皮膚病変部及びその周辺の病巣が改善・
治癒するまで塗布してもよい。その際に病変部局所にお
けるジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジンセ
ノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１の細
胞外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以下、好
ましくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、より好
ましくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以下、さらに好
ましくは１００ｆｇ／ｍｌ以下（約９０ｆＭ）となるよ
うに基剤へのジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキ
シジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲ
ｂ１混入量を調整する。皮膚外用剤におけるジンセノサ
イド類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１
又はエポキシジンセノサイドＲｂ１の濃度は０．１重量
％以下、好ましくは０．００１重量％以下とすることが
好ましい。また、放射線障害や熱傷が比較的軽症の場合
は、前述の皮膚外用剤のみを投与しても構わない。もち
ろん、本実施例においては、ジンセノサイド類誘導体の
１つとして、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を用いても
よい。
【０１４８】実施例９（ジンセノサイド類誘導体特には
ジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセ
ノサイドＲｂ１による褥創の予防・治療・処置） 血流障害をきたす疾患の中でも寝たきり患者ならびに高
齢者の褥創は、全身状態を悪化させるきっかけともなり
ＱＯＬ（生活の質、quality of life）を著しく損なう
皮膚疾患である。褥創の早期には病変部皮膚の発赤がみ
られるが、この時点で病変部局所ならびにその周辺に塗
布して効果・効能を示す外用剤もしくは静脈内投与製剤
がほとんどないことが、皮膚科領域で大きな問題となっ
ている。もちろん、皮膚組織が欠損した褥創病変の治療
も困難を極めることが多々ある。ブドウ糖を含有するか
含有しない水溶性基剤あるいは脂溶性基剤にジンセノサ
イド類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１
又はエポキシジンセノサイドＲｂ１を混入して皮膚外用
剤（クリーム、パップ剤または軟膏）を作成し、褥創部
局所およびその周辺部に褥創病変が治癒するか縮小する
かあるいは悪化しなくなるまで、常時塗布する。皮膚外
用剤におけるジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキ
シジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲ
ｂ１の濃度は０．１重量％以下、好ましくは０．００１
重量％以下とすることが好ましい。その際に局部におけ
るジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジンセノ
サイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１の細胞
外液濃度が１００μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以下、好ま
しくは１００ｎｇ／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、より好ま
しくは１ｎｇ／ｍｌ（約０．９ｎＭ）以下、さらに好ま
しくは１００ｆｇ／ｍｌ（約９０ｆＭ）以下となるよう
に基剤へのジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシ
ジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ
１混入量を調整する。また、必要に応じて、本実施例７
ならびに本実施例８に記載された要領でジンセノサイド
類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又は
エポキシジンセノサイドＲｂ１の静脈内投与を併用す
る。ジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジ
ンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、
本明細書で記述されたごとく、強力な細胞保護作用を介
して褥創病変の伸展を抑止し、ひとたび皮膚組織が欠損
した褥創病変に対しては、血管もしくは皮膚組織の再生
・再構築を促進することにより優れた治療効果を発揮す
ると考えられる。もちろん、本実施例においては、ジン
セノサイド類誘導体の１つとして、ジヒドロジンセノサ
イドＲｂ１を用いてもよい。
【０１４９】実施例１０（ジンセノサイド類誘導体特に
はジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジン
セノサイドＲｂ１による消化性潰瘍の治療） 胃潰瘍や十二指腸潰瘍の薬物治療の手段として、Ｈ２受
容体阻害剤、プロトンポンプ阻害剤、消化管粘膜保護剤
等が主として用いられるが、薬剤によって一時的に潰瘍
病変が治癒しても、薬物投与を中止するとしばしば潰瘍
病変が再発する。また潰瘍病変は、消化管の難病に指定
されているクローン病や潰瘍性大腸炎においても頻繁に
みられ、患者の予後を悪化させる原因になっている。胃
潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病発症
後、通常の治療手段を施しながら、できるだけ早期にジ
ンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイ
ドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１の静脈内注
入、挿肛投与、挿腟投与、点鼻投与もしくは内視鏡下で
の病変部粘膜外用投与を実施し、内視鏡にて病変の治癒
もしくは改善が確認されるまで治療を継続する。もちろ
ん、本実施例においては、ジンセノサイド類誘導体の１
つとして、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を用いてもよ
い。
【０１５０】実施例１１（ジンセノサイド類誘導体特に
はジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポキシジン
セノサイドＲｂ１による糖尿病性皮膚潰瘍の治療） 糖尿病性皮膚潰瘍は病変部の血流障害や皮膚組織の欠損
等を伴う難治性疾患であるが、血管や皮膚組織の再生・
再構築を促進せしめる作用を有するジンセノサイド類誘
導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又はエポ
キシジンセノサイドＲｂ１を静脈内投与、局所注入もし
くは外用塗布すれば効果が得られる。すなわち、糖尿病
性皮膚潰瘍を有する患者に対して、通常の治療に加え
て、ジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジンセ
ノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１を１
日当たり通常０．００１ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍ
ｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上の用量で静脈内へ
連日単回注入もしくは持続注入する。また必要に応じ
て、本実施例８に記載したごとくジヒドロキシジンセノ
サイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１を含有
する皮膚外用剤を病変部及びその周辺部に塗布してもよ
いし、ジンセノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジン
セノサイドＲｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１の
生理食塩水溶解液又はブドウ糖溶解液を病変部局所に注
入してもよい。その際、病変部におけるジンセノサイド
類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲｂ１又は
エポキシジンセノサイドＲｂ１の細胞外液濃度が１００
μｇ／ｍｌ（約９０μＭ）以下、好ましくは１００ｎｇ
／ｍｌ（約９０ｎＭ）以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍ
ｌ（約０．９ｎＭ）以下、さらに好ましくは１００ｆｇ
／ｍｌ（約９０ｆＭ）以下となるように基剤へのジンセ
ノサイド類誘導体特にはジヒドロキシジンセノサイドＲ
ｂ１又はエポキシジンセノサイドＲｂ１混入量もしくは
それらを含有する生理食塩水又はブドウ糖液（溶解剤）
の局所注入量を調整する。もちろん、本実施例において
は、ジンセノサイド類誘導体の１つとして、ジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１を用いてもよい。
【０１５１】実施例１２（ジンセノサイドＲｂ１による
神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現誘導） 次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１などのジンセ
ノサイド類（ジンセノサイド類誘導体を含む）がいかな
る転写因子を活性化せしめることにより、細胞死抑制遺
伝子Ｂｃｌ−ｘＬの発現を誘導するのかを調べた。その
ためまず予備実験として、本発明者らはジンセノサイド
類の代表としてジンセノサイドＲｂ１を選び、ジンセノ
サイドＲｂ１が神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を
増加させるかどうかをしらべた。実験手技は本発明者ら
（阪中、田中）の論文（Wen T.-C., et al., J. Exp. M
ed.,188, 635-649, 1998）に準じた。０ｆｇ／ｍｌ、１
ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌ及び１０００００ｆｇ／
ｍｌ（１００ｐｇ／ｍｌ）のジンセノサイドＲｂ１で、
２４時間前処理された培養神経細胞から総ＲＮＡを抽出
した。ＤＮａｓｅ処理済の総ＲＮＡ ３μｇから、オリ
ゴｄＴプライマーと逆転写酵素(Moloney murine leukem
ia virus reverse transcriptase)を用いてｃＤＮＡを
生成した。遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）はＴａｑポリメラ
ーゼを用いて以下の条件で行った。すなわち、（１）９
４℃、２分間（２）９４℃、１．５分間；５５℃、１．
５分間；７２℃、２分間を１サイクルとし、Ｂｃｌ−ｘ
Lに関しては２５サイクル、β−アクチンに関しては２
０サイクル、（３）７２℃、２分間である。
【０１５２】ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルにて泳
動し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
なお、内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を
用いた。結果を図１４に示す。図１４は図面に代わる写
真である。
【０１５３】また、Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質の神経細胞での
発現をジンセノサイドＲｂ１が増強するかどうか調べる
ため、抗Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白抗体を用いてウエスタンブロ
ット法を実施した。ジンセノサイドＲｂ１存在下または
非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を４８時間培養
後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電気泳
動を実施した。その後泳動蛋白質をニトロセルロース膜
に転写しウエスタンブロットを行った。結果を図１５に
示す。図１５は図面に代わる写真である。さらに、抗Ｂ
ｃｌ−ｘＬ蛋白抗体と反応するバンドを画像解析装置で
定量化した。結果を図１６に示す。
【０１５４】図１４に示すごとく、１ｆｇ／ｍｌあるい
は１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１で処理され
た培養神経細胞では、Ｂｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡの発現が
コントロールに比べて増加していた。一方、ジンセノサ
イドＲｂ１は１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適濃度域で、神
経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白質発現量を約５０％有意に増
加せしめた（図１５，１６）。
【０１５５】実施例１３（ジンセノサイドＲｂ１による
転写因子ＳＴＡＴ５の活性化） 次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１がいかなる転
写因子を介して、Ｂｃｌ−ｘＬ発現を促進するのかをし
らべた。このため、遺伝子導入が比較的容易なアストロ
サイトを用いて以下の実験を実施した。始めに、Ｂｃｌ
−ｘプロモーター／ルシフェラーゼプラスミドを作成し
た。すなわちＣ５７ＢＬ／６マウスの尾組織より抽出し
たＤＮＡを鋳型として、下記プライマー ＬＦ１、プラ
イマー ＬＲ１およびピリベストＤＮＡポリメラーゼ
（pyrobest DNA polymerase）(Takara)を用いて３０サ
イクルのPCR反応を行った。反応溶液をキアＥｘIIゲル
エキスラクションキット（QiaExII Gel exraction ki
t）(Qiagen)にて精製後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化、２％アガロースゲルにて電気泳動
し、６００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。得られたゲ
ルスライスから、キアＥｘIIゲルエキスラクションキッ
ト（QiaExII Gel exraction kit）を用いてＤＮＡ断片
を抽出し、ｐＧＬ−２Ｂａｓｉｃベクター(Promega)に
挿入した(Bcl-x promoter L)（図１７）。同様にマウス
ＤＮＡを鋳型として、プライマー ＲＦ１とプライマー
ＲＲ１を用いて１５サイクルのＰＣＲ反応を行った。反
応溶液を１０００倍希釈し（溶液Ａ）、それを鋳型とし
てプライマー ＲＦ２とプライマー ＲＲ２で３０サイ
クルのＰＣＲ反応を行い、ＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化
し、ｐＧＬ−２ＢａｓｉｃベクターのＳａｃＩ／ＢｇＩ
ＩＩ部位に挿入した (Bcl-x promoter R)（図１７）。
また溶液Ａを鋳型とし、プライマー ＲＦ１とプライマ
ー Ｍｕｔ−Ｒ、プライマー Ｍｕｔ−Ｆとプライマー
ＲＲ１を用いてそれぞれ３０サイクルのＰＣＲ反応を
行った。２％アガロースゲルにて電気泳動し、それぞれ
３１２ｂｐと３０９ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、キア
ＥｘIIゲルエキスラクションキット（QiaExII Gel exra
ction kit）を用いてDNA断片を抽出した。抽出したＤＮ
Ａ断片を重量比にて１：１で混合後、それを鋳型として
プライマー ＲＦ２とプライマー ＲＲ２で３０サイク
ルのＰＣＲ反応を行い、ＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化
し、ｐＧＬ−２ＢａｓｉｃベクターのＳａｃＩ／ＢｇＩ
ＩＩ部位に挿入した (Bcl-x promoter R(変異)（図１
７）。 用いたプライマー(primer) Primer LF1 5'-ATACTTCCCAGCCGCAAAACGC-3' Primer LR1 5'-CAGAAGGCGACAGAGGAATTGC-3' Primer RF1 5'-GGGGTGGGGGGAAATTACAC-3' Primer RR1 5'-GGGCTCAACCAGTCCATTGTC-3' Primer RF2 5'-CCACGAGCTCGATCTGGTCGATGGAGGAAC-3' Primer RR2 5'-AAACACCTGCTCACTTACTGGGTC-3' Primer Mut-F 5'-AGGCATTGAGGATAAAAGGG-3' Primer Mut-R 5'-CCCTTTTATCCTCAATGCCT-3'
【０１５６】アストロサイトの初代培養は以下の要領で
実施した。生直後のウイスター（Wistar）ラットより公
知の方法でアストロサイトを単離し、培養用フラスコで
培養し、２週間後に１２ウエルプレート（12 well plat
e）に植え替えた。なお、アストロサイトは本発明者ら
（阪中、田中）の既発表論文(Fujita, H. et al., Gli
a, 18, 269-281, 1996; Tanaka, J. et al., Glia, 20,
23-37, 1997; Tanaka, J. et al.,Glia, 24, 198-215,
1998)に記載された方法に準じて生直後ラット脳より分
離した。
【０１５７】遺伝子導入とルシフェラーゼアッセイは以
下の要領で実施した。リポフェクタミン（Lipofectamin
e）(Invitrogen)を用いて、１０％ＦＣＳ（牛胎仔血
清）存在下にて５時間のトランスフェクションを行っ
た。その後培地を新しいものに置き換えて３７℃で一晩
培養し、翌朝１００ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１
を加え３7℃で２４時間培養した。細胞表面をＰＢＳで
２回洗浄後、細胞をルシフェラーゼ細胞培養ライシス試
薬（Luciferase Cell Culture Lysis Reagent）(Promeg
a) １００μｌで溶解した。溶液中のルシフェラーゼ量
はルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assaa
y System）(Promega)およびルミネッセンサーＪＮＲ
（ＡＴＴＯ）を用いて測定した。
【０１５８】結果を図１８に示す。図１８の左から１番
目と２番目のカラムに示すごとく、Ｂｃｌ−ｘプロモー
ターＬをトランスフェクションしたアストロサイトにジ
ンセノサイドＲｂ１を投与しても、コントロール（ジン
セノサイドＲｂ１非投与例）と比べてルシフェラーゼ活
性に変化は認められなかった。一方、図１８の左から３
番目と４番目のカラムに示すごとく、Ｂｃｌ−ｘプロモ
ーターＲをトランスフェクションしたアストロサイトに
ジンセノサイドＲｂ１を投与すると、コントロール（ジ
ンセノサイドＲｂ１非投与例）と比べて有意にルシフェ
ラーゼ活性が上昇した。図１７に示すごとくＢｃｌ−ｘ
プロモーターＲにＳＴＡＴ５結合配列類似の配列が存在
するが、Ｂｃｌ−ｘプロモーターＬにはそのような配列
は存在しない。従って、ジンセノサイドＲｂ１は、Ｂｃ
ｌ−ｘ遺伝子のエクソン２(Exon 2)の上流に存在する転
写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して、レポータージーン
であるルシフェラーゼ活性を上昇せしめると考えられ
た。一方、図１８の左から５番目と６番目のカラムに示
すごとく、変異型（ミューテーションを有する）ＳＴＡ
Ｔ５すなわちＳＴＡＴ５ｍを含むＢｃｌ−ｘプロモータ
ーＲ（変異）（図１７）をアストロサイトにトランスフ
ェクションしたのちにジンセノサイドＲｂ１を投与して
も、コントロール（ジンセノサイドＲｂ１非投与例）と
比べてルシフェラーゼ活性に変化はみられなかった（図
１８）。図１８の＊＊はＰ＜０．０１を示し、統計解析
法はStudent tテストによる。
【０１５９】以上のことより、ジンセノサイドＲｂ１は
Ｂｃｌ−ｘ遺伝子のエクソン２(Exon 2)の上流に結合部
位が存在する転写因子ＳＴＡＴ５の活性化を介して（図
１７）、レポータージーンであるルシフェラーゼの産生
をアップレギュレーションせしめると言える（図１
８）。本実験では、Ｂｃｌ−ｘＬを、測定が容易なレポ
ータージーン（ルシフェラーゼ）に置き換えた形でプロ
モーターアッセイを実施したが、実際の細胞において
は、ジンセノサイドＲｂ１は転写因子ＳＴＡＴ５の活性
化を介して、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を促進すること
が本実験で明らかとなった。おそらく、ジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類はＪＡＫ２の酵素活性を
も上昇せしめて、ＳＴＡＴ５をリン酸化し、リン酸化Ｓ
ＴＡＴ５のホモダイマー形成ならびに核内移行を促進す
るものと考えられる。その結果、ＳＴＡＴ５が転写因子
として機能すると考えられる。
【０１６０】実施例１４（ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１による神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白発現促進） 次に、本発明者らはジヒドロジンセノサイドＲｂ１が神
経細胞においてＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡのみならずＢｃ
ｌ−ｘＬ蛋白の発現を増強するかどうか調べるため、Ｂ
ｃｌ−ｘＬ抗体を用いてウエスタンブロット法を実施し
た。ジヒドロジンセノサイドＲｂ１存在下または非存在
下で、ラット大脳皮質神経細胞を２４時間培養後、電気
泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶解し、電気泳動を実施
した。その後泳動蛋白をニトロセルロース膜に転写しウ
エスタンブロットを行った。なお実験手技の詳細につい
ては、本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文（Wen T.
-C., et al., J. Exp. Med., 188, 635-649, 1998）に
記載されている。結果を図１９に示す。図１９は、図面
に代わる写真である。さらに、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体と反
応するバンドを画像解析装置で定量化した。結果を図２
０に示す。
【０１６１】図１９及び図２０に示すごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適濃
度域で、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白の発現量を有意に
増加せしめた。図１９及び図２０の＊はＰ＜０．０５を
示し、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｐ
ＬＳＤによる。
【０１６２】以上の結果より、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体もジンセノサイド
Ｒｂ１と同様に神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現を増強せし
めると言える。しかも、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４
号に記載のごとくジヒドロジンセノサイドＲｂ１とジン
セノサイドＲｂ１の薬理作用は極めて類似しているの
で、当然のことながらジヒドロジンセノサイドＲｂ１も
ジンセノサイドＲｂ１と同様に転写因子ＳＴＡＴ５の活
性化を介して、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ発現をアップレ
ギュレーションせしめると考えられる。
【０１６３】実施例１５（ジンセノサイドＲｂ１による
アストロサイトのＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現促進） 次に、本発明者らはジンセノサイドＲｂ１が細胞のVEGF
mRNAの発現を増加させるかどうかを調べるため、細胞
の例としてアストロサイトを選んで実験を実施した。生
直後のウイスター（Wistar）ラットより公知の方法でア
ストロサイトを単離し、培養用フラスコで培養し、１２
日後にポリＬ−リジンをコートした10cm dishに植え替
えた。アストロサイトは、１０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）
を含むＤＭＥＭ培地で培養した。３〜４日後に、無血清
培地に交換し、ジンセノサイドＲｂ１を０、１００ｆｇ
／ｍｌの濃度で添加し、６時間培養した。なお、アスト
ロサイトは本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文(Fuj
ita, H. et al., Glia, 18, 269-281, 1996; Tanaka,J.
et al., Glia, 20, 23-37, 1997; Tanaka, J. et al.,
Glia, 24, 198-215, 1998)に記載された方法に準じて
生直後ラットの脳より分離した。
【０１６４】その後培養アストロサイトから総ＲＮＡを
抽出した。ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇから
オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを
作成した。ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いてト
ネロの論文(Tonello, C., FEBS Letters, 442, 167-17
2, 1999)に準じて行った。使用したＰＣＲ−プライマー
とＰＣＲ反応条件は以下の通りである。なお、β−アク
チンは内部標準である。 （１） β−アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２） ＶＥＧＦ Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルに
て電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化
した。結果を図２１に示す。図２１は図面に代わる写真
である。
【０１６５】図２１に示すように、ジンセノサイドＲｂ
１無添加アストロサイトに比べて、ジンセノサイドＲｂ
１を１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加されたアストロサイ
トではＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が増強した。
【０１６６】実施例１６（ジンセノサイドＲｂ１による
ヒト皮膚ケラチノサイトのＶＥＧＦ発現誘導） 次に、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１がヒト皮膚
ケラチノサイトのVEGF mRNA発現をも誘導するかどうか
調べた。このため、ヒト皮膚ケラチノサイトを単層培養
し、ジンセノサイドＲｂ１を０〜１０ｐｇ／ｍｌの濃度
で培養メディウムに添加後、０，１，３，６，１２時間
後にヒト皮膚ケラチノサイトから総ＲＮＡを抽出した。
その後、以下に示したプライマーを用いて、サイクル数
２７でＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果を図２２に示す。
図２２は図面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写真である。 （１）ヒトＶＥＧＦ Sense primer ＝ TGG CAG AAG GAG GAG GGC AGA AT Antisense primer＝ GCA GCA GCC CCC GCA TCG CAT CA
【０１６７】図２２に示すごとく、１fg／ｍｌ〜１０ｐ
ｇ／ｍｌの濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養ヒト皮膚
ケラチノサイトに添加すると１２時間以内にＶＥＧＦ
ｍＲＮＡの発現が誘導された。
【０１６８】さらに、本発明者らは、ジンセノサイドＲ
ｂ１がＶＥＧＦ蛋白の発現を増加せしめるかどうかをし
らべた。このため、ヒト皮膚ケラチノサイトを単層培養
し、ジンセノサイドＲｂ１を０〜１０ｐｇ／ｍｌの濃度
で培養メディウムに添加後、２４時間後又は４８時間後
に培養上清を回収した。その後、ヒトＶＥＧＦＥＬＩＳ
Ａキット（human VEGF ELISA kit）(R&D system)を用い
て、培養上清中のVEGF濃度を測定した。結果を図２３に
示す。
【０１６９】図２３に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ
１添加後２４時間では、ジンセノサイドＲｂ１非添加例
と比べて、培養上清中のＶＥＧＦ濃度に大きな変化は認
められなかったが、ジンセノサイドＲｂ１添加後４８時
間では、ジンセノサイドＲｂ１非添加例と比べて、特に
１００ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌの濃度において培養
上清中のＶＥＧＦ濃度が増加した。以上のことより、ジ
ンセノサイドＲｂ１がアストロサイトやケラチノサイト
などの細胞のＶＥＧＦ発現を誘導することが新規に見出
された。
【０１７０】実施例１７（ジンセノサイドＲｂ１による
神経細胞及びアストロサイトの転写因子ＨＩＦ−１の活
性化） 次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１が転写因子HI
F-1の活性化を介して、VEGF発現誘導をもたらすかどう
かをしらべた。このため、まずｐＧＬ−３プロモーター
ベクター(Promega)のマルチプルクローニングサイト上
のＢｇｌII部位に「ＴＡＣＧＴＧ」の６回くり返し配
列、すなわち（ＴＡＣＧＴＧ）６を挿入した。ちなみ
に、「ＴＡＣＧＴＧ」は、転写因子ＨＩＦ−１と結合す
るＤＮＡ上のＨＲＥ (hypoxia-response element)の共
通塩基配列(consensus sequence)である。従って、本発
明では（ＴＡＣＧＴＧ）６を挿入したｐＧＬ−３プロモ
ーターベクターをＨＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドと
呼ぶこととする。なお、対照としては、ｐＧＬ−３プロ
モーターベクター（プラスミド）を用いた。
【０１７１】アストロサイトの初代培養は以下の要領で
実施した。生直後のWistarラットより公知の方法でアス
トロサイトを単離し、培養用フラスコで培養し、２週間
後に１２ウエルプレート（12well plate）に植え替え
た。なお、アストロサイトは本発明者ら（阪中、田中）
の既発表論文(Fujita, H. et al., Glia, 18, 269-281,
1996; Tanaka, J.et al., Glia, 20, 23-37, 1997; Ta
naka, J. et al., Glia, 24, 198-215, 1998)に記載さ
れた方法に準じて生直後ラットの脳より分離した。ま
た、胎生１７日のウイスター（Wistar）ラット大脳皮質
より公知の方法で神経細胞を単離し、ポリＬ−リジンを
コートした１２ウエルプレート（12Well plate）上で培
養した。培養５日目の神経細胞を遺伝し導入に使用し
た。
【０１７２】遺伝子導入とルシフェラーゼアッセイは以
下の要領で実施した。１穴あたり１μｇのプラスミドＤ
ＮＡ（すなわちＨＲＥルシフェラーゼプラスミド又はｐ
ＧＬ−３プロモーターベクター）と５μｌのリポフェク
タミン（Lipofectamine）(Invitrogen)を用いて、１０
％ＦＣＳ存在下にて５時間のトランスフェクション（遺
伝子導入）を行った。その後培地を新しいものに置き換
えて３７℃で一晩培養し、翌朝０又は１００fgのジンセ
ノサイドＲｂ１を加え３７℃で２４時間培養した。細胞
表面をＰＢＳ (phosphate-buffered saline)で２回洗
浄後、細胞をルシフェラーゼ細胞培養ライシス試薬（Lu
ciferase Cell Culture Lysis Reagent）(Promega) １
００μlで溶解した。溶液中のルシフェラーゼ量はルシ
フェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay Syste
m）(Promega)およびルミネッセンサーＪＮＲ（ＡＴＴ
Ｏ）を用いて測定した。結果を図２４に示す。
【０１７３】図２４に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ
１１００ｆｇ／ｍｌ添加例では、非添加例に比べてルシ
フェラーゼの量が増加した。このことは、ジンセノサイ
ドＲｂ１などのジンセノサイド類が好ましくは低濃度で
神経細胞やアストロサイトなどの細胞の転写因子ＨＩＦ
−１を活性化せしめ、ＨＩＦ−１とＤＮＡ上のＨＲＥ
(hypoxia-response element)との結合を惹起することを
明らかにしている。図２４の＊はＰ＜０．０１を示す。
統計解析法はStudents' tテストによる。
【０１７４】実施例１８（ジンセノサイドＲｂ１による
皮膚ケラチノサイトの転写因子ＨＩＦ−１の活性化） 次に本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトでもジンセ
ノサイドＲｂ１が転写因子HIF-1を活性化させるかどう
かをしらべた。このため、ヒト皮膚ケラチノサイトを１
２ウェルのタイプ１コラーゲンディシュに単層培養し、
プラスミドＤＮＡ（すなわちＨＲＥ−ルシフェラーゼプ
ラスミド又はＰＧＬ−３プロモーターベクター）のトラ
ンスフェクションを実施した。２４時間後に培地を交換
し０〜１ｎｇ／ｍｌの濃度のジンセノサイドＲｂ１を添
加した。４８時間後に細胞をルシフェラーゼ細胞培養ラ
イシス試薬（Luciferase Cell Culture Lysis Reagen
t）(Promega)で溶解した。溶液中のルシフェラーゼ量は
ルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Assay S
ystem）(Promega)およびルミネッセンサーＪＮＲ （Ａ
ＴＴＯ）を用いて測定した。結果を図２５に示す。
【０１７５】図２５に示すごとく、対照例（ＰＧＬ−３
プロモーターベクターを遺伝子導入した例）と比べて、
ＨＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドを遺伝子導入すると
ジンセノサイドＲｂ１添加によりルシフェラーゼの量が
増加した。特に、ルシフェラーゼ量の増加は、１０ｆｇ
／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１を添加し
た時に顕著であった。従って、ジンセノサイドＲｂ１な
どのジンセノサイド類がアストロサイト又はヒト皮膚ケ
ラチノサイトを含むあらゆる細胞の転写因子ＨＩＦ−１
を活性化せしめ、ＨＩＦ−１とＨＲＥとの結合を惹起す
るものと考えられる。
【０１７６】実施例１９（ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１によるアストロサイトのＶＥＧＦ発現誘導） 次に本発明者らはジンセノサイド類誘導体がジンセノサ
イドＲｂ１と同様にアストロサイトのＶＥＧＦ ｍＲＮ
Ａ発現を促進するかどうかをしらべた。そのため、ジン
セノサイド類誘導体の代表例として還元型誘導体すなわ
ち前記した構造式で示されるジヒドロジンセノサイドＲ
ｂ１を選び実験を実施した。生直後のウイスター（Wist
ar）ラットより公知の方法でアストロサイトを単離し、
培養用フラスコで培養し、１２日後にポリＬ−リジンを
コートした１０ｃｍディッシュ（10cm dish）に植え替
えた。アストロサイトは、１０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）
を含むＤＭＥＭ培地で培養した。３〜４日後に、無血清
培地に交換し、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０、１
ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加し、６時間
培養した。なお、アストロサイトは本発明者ら（阪中、
田中）の既発表論文(Fujita,H. et al., Glia, 18, 269
-281, 1996; Tanaka, J. et al., Glia, 20,23-37, 199
7; Tanaka, J. et al., Glia, 24, 198-215, 1998)に記
載された方法に準じて生直後ラットの脳より分離した。
【０１７７】その後培養アストロサイトから総ＲＮＡを
抽出した。ＤＮＡａｓｅ処理後、総ＲＮＡ ３μｇから
オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを
作成した。ＰＣＲ反応はＴａｑポリメラーゼを用いてト
ネロの論文(Tonello, C., FEBS Letters, 442, 167-17
2, 1999)に準じて行った。使用したＰＣＲ−プライマー
とＰＣＲ反応条件は以下の通りである。なお、β−アク
チンは内部標準である。 （１）β−アクチン Sense primer ＝ AGA AGA GCT ATG AGC TGC CTG ACG Antisense primer＝ TAC TTG CGC TCA GGA GGA GCA ATG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、５
５℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
２２サイクル。 （２）ＶＥＧＦ Sense primer ＝ CCA TGA ACT TTC TGC TCT CTT G Antisense primer＝ GGT GAG AGG TCT AGT TCC CG １）９４℃５分間で１サイクル、２）９４℃１分間、６
２℃１．５分間、７２℃１．５分間を１サイクルとして
３５サイクル。 発生後生成されたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルに
て電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化
した。結果を図２６に示す。図２６は図面に代わる写真
である。
【０１７８】図２６に示すように、ジンセノサイドＲｂ
１無添加アストロサイトに比べて、ジンセノサイドＲｂ
１を１ｆｇ／ｍｌ、１００ｆｇ／ｍｌの濃度で添加され
たアストロサイトではＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が増強
した。なお、ラットのＶＥＧＦは構成するアミノ酸の数
に対応して、ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧ
Ｆ１８８という３つのサブタイプに分けられるので、Ｖ
ＥＧＦ ｍＲＮＡのバンドも図２６のごとく少なくとも
２本認められる。
【０１７９】実施例２０（ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１による神経細胞のＶＥＧＦ蛋白発現誘導） さらに本発明者らはジヒドロジンセノサイドＲｂ１が神
経細胞においてＶＥＧＦ mRNAのみならずＶＥＧＦ蛋白
の発現を増強するかどうか調べるため、抗ＶＥＧＦモノ
クローナル抗体（サンタクルズ社製）を用いてウエスタ
ンブロット法を実施した。ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１存在下または非存在下で、ラット大脳皮質神経細胞を
２４時間培養後、電気泳動用サンプル緩衝液で細胞を溶
解し、電気泳動を実施した。その後泳動蛋白をニトロセ
ルロース膜に転写しウエスタンブロットを行った。なお
ウエスタンブロットの実験手技の詳細については、本発
明者ら（阪中、田中）の既発表論文（Wen T.-C., et a
l., J. Exp. Med., 188, 635-649,1998）に記載されて
いる。結果を図２７に示す。図２７は、図面に代わるウ
エスタンブロットの写真である。さらに、抗ＶＥＧＦ抗
体と反応するバンドを画像解析装置で定量化した。結果
を図２８に示す。
【０１８０】図２７及び図２８に示すごとく、ジヒドロ
ジンセノサイドＲｂ１は１〜１００ｆｇ／ｍｌの至適濃
度域で、神経細胞のＶＥＧＦ蛋白の発現量を有意に増加
せしめた。図２７及び図２８の＊はP＜０．０５を示
し、統計解析法はANOVA+Fisher's PLSDによる。
【０１８１】以上の結果より、ジヒドロジンセノサイド
Ｒｂ１などのジンセノサイド類誘導体もジンセノサイド
Ｒｂ１と同様に、細胞のVEGF発現を増強せしめると言え
る。しかも、ＰＣＴ／ＪＰ００／０５５５４号に記載の
ごとくジヒドロジンセノサイドＲｂ１とジンセノサイド
Ｒｂ１の薬理作用は極めて類似しているので、当然のこ
とながらジヒドロジンセノサイドＲｂ１もジンセノサイ
ドＲｂ１と同様に転写因子ＨＩＦ−１の活性化を介し
て、細胞のVEGF発現をアップレギュレーションせしめる
と考えられる。
【０１８２】
【発明の効果】本発明は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ
１などのジンセノサイド類誘導体を有効成分とする、血
流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成
物、もしくは血管の再生・再構築促進用医薬組成物を提
供するものである。本発明では、リード化合物としての
ジンセノサイド類特にはジンセノサイドＲｂ１、もしく
はジンセノサイドＲｂ１を含有する天然物又はそのエキ
スと同様に、低い至適細胞外液濃度域で優れた抗アポト
ーシス作用ならびに血管の再生及び／又は再構築促進作
用を示す医薬組成物が発明された。低濃度・低用量のジ
ンセノサイド類誘導体特にジヒドロジンセノサイドＲｂ
１は、血管の再生・再構築促進作用及び／又は抗アポト
ーシス作用を介して、血流障害をきたすあらゆる疾患や
病態の予防、治療もしくは処置に有用とされる。本発明
の医薬組成物は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現の促進及び／又はカ
スパーゼ３発現の抑制を介して、あらゆる種類の細胞の
アポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死を抑止し、
かつＶＥＧＦ発現の上昇を介して血管の再生・再構築を
促進する。さらに、本発明ではジンセノサイドＲｂ１又
はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド
類が細胞の転写因子ＳＴＡＴ５及び／又は転写因子ＨＩ
Ｆ−１を活性化せしめることにより、Ｂｃｌ−ｘＬ発現
及び／又はＶＥＧＦ発現を誘導することが見出された。
またジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類、ジ
ンセノサイドＲｂ１を含有する天然物又はそのエキス
も、本発明のジンセノサイド類誘導体と同様の効果・効
能・用途を有すると考えられる。本発明は、被検物質を
培養細胞に投与して、Ｂｃｌ−２蛋白群の発現調節作用
を測定することからなる、血流障害をきたす疾患の予
防、処置又は治療用の医薬組成物を探索する方法をも提
供するものである。
【０１８３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Vascular regeneration-promoting agent <130> PC909166 <140> <141> 2001-11-29 <150> JP2001-51151 <151> 2001-02-26 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer LF1 <400> 1 atacttccca gccgcaaaac gc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer LR1 <400> 2 cagaaggcga cagaggaatt gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer RF1 <400> 3 ggggtggggg gaaattacac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer RR1 <400> 4 gggctcaacc agtccattgt c 21 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer RF2 <400> 5 ccacgagctc gatctggtcg atggaggaac 30 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer RR2 <400> 6 aaacacctgc tcacttactg ggtc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Mut-F <400> 7 aggcattgag gataaaaggg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Mut-R <400> 8 cccttttatc ctcaatgcct 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for amplification of beta-actin <400> 9 agaagagcta tgagctgcct gacg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for amplification of beta-actin <400> 10 tacttgcgct caggaggagc aatg 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for amplification of Bcl-xL <400> 11 aagcgtagac aaggagatgc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for amplification of Bcl-xL <400> 12 ggagctgatc tgaggaaaaa cc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for amplification of VEGF <400> 13 ccatgaactt tctgctctct tg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for amplification of VEGF <400> 14 ggtgagaggt ctagttcccg 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for amplification of human VEGF <400> 15 tggcagaagg aggagggcag aat 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for amplification of human VEGF <400> 16 gcagcagccc ccgcatcgca tca 23 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for amplification of caspase3 <400> 17 gctaacctca gagagacatt catg 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for amplification of caspase3 <400> 18 ttagtgataa aagtacagtt cttt 24
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１のＮＭ
Ｒチャートを示す。
【図２】図２は、ＳＮＰによる培養神経細胞のアポトー
シスもしくはアポトーシス様神経細胞死に対するジヒド
ロジンセノサイドＲｂ１の保護効果を示す、図面に代わ
るＭＡＰ２イムノブロットの写真である。
【図３】図３は、ＳＮＰによる培養神経細胞のアポトー
シスもしくはアポトーシス様神経細胞死に対するジヒド
ロジンセノサイドＲｂ１の保護効果を示すグラフであ
る。
【図４】図４は、ＭＣＡ永久閉塞後（すなわち脳血管障
害発症後）に生理食塩水を静脈内投与されたラット脳
（２例）のTTC染色結果を示す、図面に代わる写真であ
る。
【図５】図５は、MCA永久閉塞後（すなわち脳血管障害
発症後）にジヒドロジンセノサイドＲｂ１（６μｇ／
日）を静脈内投与されたラット脳（２例）のＴＴＣ染色
結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】図６は、脳血管障害（脳梗塞）ラットに対する
ジヒドロジンセノサイドＲｂ１静脈内投与（６μｇ／
日、０．６μｇ／日）の効果を示す図である。
【図７】図７は、脊髄損傷後２日目のラットを示す図面
に代わる写真である。左側写真が生理食塩水静脈内投与
例であり、右側写真がジヒドロジンセノサイドＲｂ１静
脈内投与例である。
【図８】図８は、脊髄損傷後２日目の別のラットを示す
図面に代わる写真である。左側写真が生理食塩水静脈内
投与例であり、右側写真がジヒドロジンセノサイドＲｂ
１静脈内投与例である。
【図９】図９は、ラットの開放創に対する１０−４〜１
０−７重量％のジヒドロジンセノサイドＲｂ１の外用投
与の効果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、ラットの開放創に対する１０−４
〜１０−７重量％のジヒドロジンセノサイドＲｂ１の外
用投与の効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬｍＲＮＡ
発現ならびにＶＥＧＦｍＲＮＡ発現に対するジヒドロジ
ンセノサイドＲｂ１の効果を示す、図面に代わるＲＴ-
ＰＣＲの写真である。
【図１２】図１２は、神経細胞のカスパーゼ３ｍＲＮＡ
発現に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果を示
す、図面に代わるＲＴ-ＰＣＲの写真である。
【図１３】図１３は、ジンセノサイドＲｂ１をリード化
合物として利用することにより作成できる化学的誘導体
の一部を示す図である。
【図１４】図１４は、ジンセノサイドＲｂ１による神経
細胞のＢｃｌ−ｘＬｍＲＮＡの発現増強効果を示す、図
面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図１５】図１５は、ジンセノサイドＲｂ１による神経
細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白発現増強効果を示す、図面に代
わるウエスタンブロットの写真である。
【図１６】図１６は、ジンセノサイドＲｂ１による神経
細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白発現増強作用を示す、ウエスタ
ンブロットの結果を定量化したグラフである。
【図１７】図１７は、Ｂｃｌ−ｘプロモーター／ルシフ
ェラーゼプラスミドの作成の概略を示す模式図である。
【図１８】図１８は、ジンセノサイドＲｂ１によるＢｃ
ｌ−ｘＬプロモーター活性すなわちＳＴＡＴ５活性の変
化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白の発
現に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果を示
す、図面に代わるウエスタンブロットの写真である。
【図２０】図２０は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１に
よる神経細胞のＢｃｌ−ｘＬ蛋白発現増強作用を示す、
ウエスタンブロットの結果を定量化したグラフである。
【図２１】図２１は、ジンセノサイドＲｂ１によるアス
トロサイトのＶＥＧＦｍＲＮＡ発現増強作用を示す、図
面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図２２】図２２は、ジンセノサイドＲｂ１による皮膚
ケラチノサイトＶＥＧＦｍＲＮＡ発現増強作用を示す、
図面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図２３】図２３は、ヒト皮膚ケラチノサイトのＶＥＧ
Ｆ蛋白分泌に対するジンセノサイドＲｂ１の効果を示す
グラフである。
【図２４】図２４は、ジンセノサイドＲｂ１による神経
細胞及びアストロサイトのＳＴＡＴ５活性化を示すグラ
フである。
【図２５】図２５は、ジンセノサイドＲｂ１による皮膚
ケラチノサイトのＨＩＦ−１活性化を示すグラフであ
る。
【図２６】図２６は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１に
よるアストロサイトのＶＥＧＦｍＲＮＡ発現増強作用を
示す、図面に代わるＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図２７】図２７は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１に
よる神経細胞のＶＥＧＦ蛋白発現増強作用を示す、図面
に代わるウエスタンブロットの写真である。
【図２８】図２８は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１に
よる神経細胞のＶＥＧＦ蛋白発現増強作用を示す、ウエ
スタンブロットの結果を定量化したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/10 9/10 １０１ １０１ 13/00 13/00 13/12 13/12 17/00 17/00 17/02 17/02 19/02 19/02 19/08 19/08 19/10 19/10 25/28 25/28 27/02 27/02 29/00 29/00 31/18 31/18 37/02 37/02 43/00 １０５ 43/00 １０５ // Ｃ０７Ｊ 9/00 Ｃ０７Ｊ 9/00 (72)発明者 田中 潤也 愛媛県温泉郡重信町大字横河原355−31 (72)発明者 秦 龍二 愛媛県温泉郡重信町大字横河原1375 愛大 横河原宿舎136号 (72)発明者 宇野 英満 愛媛県松山市東長戸４丁目５−18 (72)発明者 倉本 誠 愛媛県松山市東長戸４丁目３−１ 愛大東 長戸宿舎353号 (72)発明者 橋本 公二 愛媛県温泉郡川内町松瀬川甲592−124 (72)発明者 満田 憲昭 愛媛県温泉郡重信町大字志津川 愛大重信 宿舎243号 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 AA03 EA19 MA01 MA04 MA63 MA66 NA14 ZA15 ZA36 ZA45 ZA51 ZA53 ZA55 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB05 ZB11 ZB22 ZC35 ZC55 4C091 AA02 BB01 CC01 DD01 EE06 FF02 FF06 GG03 GG05 HH01 JJ03 KK01 LL02 LL09 MM01 NN01 PA02 PA07 PB04 QQ01

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその代
    謝産物又はそれらの塩を含有してなる血流障害をきたす
    疾患又は病態の予防、処置又は治療用の医薬組成物。
  2. 【請求項２】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその代
    謝産物又はそれらの塩が、天然物から化学的な手段によ
    り化学修飾された誘導体である請求項１に記載の医薬組
    成物。
  3. 【請求項３】 化学的な手段が、還元である請求項２に
    記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】 化学修飾された誘導体が、ジヒドロジン
    セノサイドＲｂ１である請求項１〜３のいずれかに記載
    の医薬組成物。
  5. 【請求項５】 静脈内投与用製剤である請求項１〜４の
    いずれかに記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】 静脈内投与用製剤が、単回静脈内注入製
    剤又は静脈内持続投与用製剤である請求項５に記載の医
    薬組成物。
  7. 【請求項７】 皮膚外用剤である請求項１〜４のいずれ
    かに記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】 血流障害をきたす疾患又は病態が、脳血
    管障害、脊髄損傷又は創傷である請求項１〜７のいずれ
    かに記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】 脳血管障害が、脳梗塞である請求項８に
    記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 創傷が、開放創である請求項８に記載
    の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 血流障害をきたす疾患又は病態の予防
    ・処置又は治療が、血管の再生及び／又は再構築を促進
    させるものである請求項１〜１０のいずれかに記載の医
    薬組成物。
  12. 【請求項１２】 血管の再生及び／又は再構築が、細胞
    のＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）発
    現促進又は転写因子ＨＩＦ−１の活性化によるものであ
    る請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 血流障害をきたす疾患又は病態の予防
    ・処置又は治療が、細胞のアポトーシスもしくはアポト
    ーシス様細胞死を抑止させるものである請求項１〜１０
    のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 細胞のアポトーシスもしくはアポトー
    シス様細胞死の抑止が、Ｂｃｌ−ｘＬ発現促進、カスパ
    ーゼ３発現抑制及び／又は転写因子ＳＴＡＴ５の活性化
    によるものである請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 細胞が、神経細胞、アストロサイト及
    び／又は皮膚ケラチノサイトである請求項１２〜１４の
    いずれかに記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその
    代謝産物又はそれらの塩を含有してなる血管の再生及び
    ／又は再構築を促進させるための医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 血管が、脳、脊髄又は皮膚組織の血管
    である請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその
    代謝産物又はそれらの塩を含有してなる細胞のＶＥＧＦ
    （vascular endothelial growth factor）発現を促進す
    るための医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその
    代謝産物又はそれらの塩を含有してなる細胞のＢｃｌ−
    ｘＬ発現を促進するための医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその
    代謝産物又はそれらの塩を含有してなる細胞のカスパー
    ゼ３発現を抑制するための医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 細胞が、神経細胞である請求項１８〜
    ２０のいずれかに記載の医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 ジンセノサイド類誘導体もしくはその
    代謝産物又はそれらの塩が、天然物から化学的手段によ
    り化学修飾された誘導体である請求項１６〜２１のいず
    れかに記載の医薬組成物。
  23. 【請求項２３】 化学修飾された誘導体が、ジヒドロジ
    ンセノサイドＲｂ１である請求項２２に記載の医薬組成
    物。
  24. 【請求項２４】 ジンセノサイド類もしくはその代謝産
    物をリード化合物として、血流障害をきたす疾患又は病
    態に対する予防、処置又は治療のための有効成分を探索
    する方法。
  25. 【請求項２５】 血流障害をきたす疾患又は病態が、脳
    血管障害、脊髄損傷、創傷又は開放創である請求項２４
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ジンセノサイド類が、ジンセノサイド
    Ｒｂ１である請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２４〜２６に記載の方法により
    探索された物質を含有してなる、血流障害をきたす疾患
    又は病態に対する予防、処置又は治療のための医薬組成
    物。
  28. 【請求項２８】 血流障害をきたす疾患又は病態に対す
    る予防、処置又は治療のための有効成分を探索するため
    のリード化合物としてのジンセノサイド類又はその代謝
    産物の使用。
  29. 【請求項２９】 血流障害をきたす疾患又は病態が、脳
    血管障害、脊髄損傷、創傷又は開放創である請求項２８
    に記載の使用。
  30. 【請求項３０】 血流障害をきたす疾患又は病態の予
    防、処置又は治療用の医薬組成物を製造するためのジン
    セノサイド類もしくはその代謝産物又はそれらの塩の使
    用。
  31. 【請求項３１】 ジンセノサイド類が、ジンセノサイド
    Ｒｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１である請求項
    ２８〜３０のいずれかに記載の使用。
  32. 【請求項３２】 ジンセノサイド類もしくはその代謝産
    物又はそれらの塩を含有してなる転写因子ＳＴＡＴ５及
    び／又は転写因子ＨＩＦ−１を活性化するための医薬組
    成物。
  33. 【請求項３３】 ジンセノサイド類が、ジンセノサイド
    Ｒｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１である請求項
    ３２に記載の医薬組成物。
  34. 【請求項３４】 被検物質を培養細胞に投与して、Ｂｃ
    ｌ−２蛋白群の発現調節作用を測定することからなる、
    血流障害をきたす疾患又は病態の予防、処置又は治療用
    の医薬組成物を探索する方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載された方法により、
    培養細胞への投与によりＢｃｌ−２蛋白群の発現調節作
    用を示した化合物又はそれらの塩を含有してなる、血流
    障害をきたす疾患又は病態の予防、処置又は治療用の医
    薬組成物。
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