JP2006514112A - 糖尿病の治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルコース代謝を調節するため、グルコースホメオスタシスを行うため、血中グルコースレベルを低減するための方法及び化合物に関する。また、糖尿病、高血糖、並びにグルコース代謝の改変又は障害に関連する障害及び症状を治療又は予防するための方法及び化合物を提供する。

Description

本発明は、グルコースの調節およびホメオスタシスと、グルコース調節障害に関連した糖尿病などの疾患の治療または予防とに関する。

本出願は、それぞれ参照によりその全体において本明細書に組み込まれる２００２年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４３１，３５１号；２００３年６月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４７６，３３１号；および２００３年６月６日に出願された米国特許仮出願第６０／４７６，７２６号の優先権を主張するものである。

真性糖尿病は、より一般的には糖尿病として知られているが、インスリンの分泌、インスリンの作用、またはこれら両方の欠乏による高血糖を特徴とする疾患である。１型糖尿病（以前にはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）として知られていた)は、ランゲルハンス島に影響を与え、身体がインスリンを産生する能力を破壊する自己免疫疾患である。１型糖尿病は、糖尿病全症例の１０％を占め、米国では１００万人にも上る人々が患っている。２型糖尿病（以前にはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）として知られていた)は、身体がインスリンを十分に産生できないか、または産生されたインスリンを適切に利用できないことを原因とする代謝障害である。米国における全糖尿病患者の約９０％が２型糖尿病を罹患している。１型および２型糖尿病は、インスリンの分泌、インスリンの作用、またはこれら両方の欠損による高血糖を特徴とする代謝障害である。

糖尿病の罹患率は憂慮すべき速度で増大している。１９７６年から１９９４年の間に、米国の成人における糖尿病は、全人口の８．９％から１２．３％にまで増加した。現在、米国では、約１６００万人（全人口の６％）が糖尿病を罹患しており、さらに約８０万人が今年、糖尿病と診断されるであろう（Ｈａｒｒｉｓら、（１９９８年）、Diabetes Care、第２１巻、５１８〜５２４１ページ；Ｎａｔｈａｎ（２００２年）、N Engl J Med、第３４７巻、１３４２〜１３４９ページ）。糖尿病には、発症前、発症中、または発症後に、例えば、様々な微小血管系疾患、ならびに、例えば、網膜障害、ネフロパシー、およびニューロパシーを含めた他の疾患など、身体中で様々な器官に影響を与える広範囲の状態および合併症が付随して、失明および腎不全などを引き起こすことがある。糖尿病は、クオリティオブライフの深刻な低下をもたらし得るものであり、致命的となることさえある。したがって、当技術分野では、糖尿病および関連合併症の発症および進行を、治療および予防する効果的な方法が必要とされている。

糖尿病全般、そして特に２型糖尿病の発症には、耐糖能異常（ＩＧＴ）または糖尿病前症を含めたグルコース代謝の変化の他に、糖尿病の家族歴、ある特定の民族または人種群、妊娠糖尿病の病歴、肥満、特に高レベルの内臓脂肪または腹部脂肪、デスクワーク中心のライフスタイル、年齢、高血圧、および統合失調症などいくつかの危険因子が関連している。したがって、当技術分野では、糖尿病に関連した危険因子の発症および進行を治療および予防する効果的な方法が必要とされている。

糖尿病などの状態は、グルコース調節のコントロールの喪失と関連する。糖尿病状態および高血糖状態は、アテローム性動脈硬化、例えば卒中などの血管障害、肥満、例えば鬱血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、およびその下流の作用などの心臓病、または、これらの状態および疾患に関連した危険因子を含めた、様々な状態および疾患の発症を引き起こしたり、これらに反応して発症したり、または、これらに別の方法で関連することがある。したがって、当技術分野では、糖尿病または高血糖と関連したこれらの状態を治療または予防する必要性、あるいはこれらの状態が発症する危険性を最小にする必要性がある。望ましい治療効果を実現するために、種々の状態、および種々の状態の種々の側面に複数の治療方法の適用を必要とすることがある現在の方法とは対照的に、本発明の方法は、一群の関連過程を標的とする一化合物の投与を可能にし、協調的効果を効果的に実現する薬理学的な方法を提供することによって、この必要性に答えるものである。

現在の糖尿病治療は、血中グルコースレベル（血糖値）を制御しようとする(例えば、血糖コントロールを実現しようとする)ものであり、自然な生理的グルコースホメオスタシスの再生を試みる。ライフスタイルの改善(例えば、栄養制限食および運動量の増加)は推奨できるが、この方法は有効性が限られている。そのようなライフスタイルの改善は、寄与する生理的因子の発達を阻止または抑制しないかもしれないし、疾患の進行を遅延させるだけで、阻止しないかもしれない。さらに、患者コンプライアンスの不足によって、この方法の有効性が限られることもある。

一般的な治療方法では、例えば、一連の注射によるインスリン治療を行うが、この注射は慎重にスケジュール決定された様式で投与を行う必要があり、しばしば毎日投与または１日複数回の投与さえ必要とされる。インスリン注射を必要とする治療は、低血糖および高インスリン血症の危険性を伴うものである。さらに、そのような治療の成功は、例えば推奨された治療スケジュールに従わなかったなど、患者コンプライアンスの不足によって妨げられることも多い。例えば、インスリン分泌促進剤(膵臓からのインスリン分泌を刺激する化合物)の投与など、インスリンをベースにした他の治療も、同様に、低血糖などを誘導する危険性を伴っている。これらの治療、および、例えばＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト療法などの利用可能な治療には、例えば体重増加など、他の影響も付随するが、体重増加は、それ自体、単独で糖尿病の危険因子となる。したがって、糖尿病、高血糖、ならびに、肥満および体重増加などの糖尿病の関連危険因子を効果的に治療または予防する方法および化合物であって、投与の容易さが改善されており、かつ、例えば体重増加などの、糖尿病に関連する他の因子の発達、または発達の危険性を伴わない方法および化合物が必要とされている。グルコースホメオスタシスを実現する身体自らの生理学的メカニズムをより密接に模擬する、糖尿病および関連した状態の治療方法が必要とされている。投与の容易さが改善されており、患者コンプライアンスの可能性と共に、患者の快適さも増大している治療コースが必要とされている。さらに、糖尿病または関連した状態の治療であって、治療されている状態を増悪または悪化させる影響を伴わない治療が必要とされている。

グルコース代謝、例えばグルコース合成、プロセッシング、および利用などは、適切なグルコースバランスおよびホメオスタシスを維持するのに不可欠である。グルコース代謝またはグルコース調節の破壊は、グルコースホメオスタシスの破壊を導き、血糖の不均衡な高水準(すなわち、高血糖)または低水準(すなわち、低血糖)をもたらすことがある。高血糖および低血糖は、クオリティ・オブ・ライフに影響を与え、慢性または重度の形態では神経損傷および血管損傷を起こす。したがって、グルコース代謝およびホメオスタシスを調節する(例えば、血糖コントロールを実現する)有効な手段と、例えば糖尿病および高血糖など、グルコース代謝およびホメオスタシスの変化または障害に関連した状態および障害を治療または予防する方法とが必要とされている。

本発明は、糖尿病、高血糖、ならびに関連した障害および危険因子を治療または予防する方法を提供することによって、これらの必要性を満たそうとするものである。本方法は、協調的な治療方法と、投与経路の改善とを提供し、例えば体重増加など、いくつかの治療に関連した望ましくない副作用を排除することによって、現存の治療を改良したものである。グルコース代謝を調節して、血糖コントロールを実現する方法も提供する。

本発明は、グルコース代謝を調節して、グルコースホメオスタシスを実現する方法および化合物に関する。被験体の血糖値を低下させる方法、インスリン抵抗性を低下させる方法、糖化ヘモグロビンレベルを低下させる方法、および血糖コントロールを改善する方法も提供する。糖尿病、高血糖、および、血糖値の増大に関連した他の状態を治療または予防する方法、ならびに、例えば、糖尿病の危険因子である状態、または糖尿病と並行して、もしくは糖尿病の結果として発症する状態など、糖尿病に関連した状態を治療または予防する方法も提供する。

様々な実施形態において、被験体は、細胞、組織、または器官である。他の実施形態では、被験体は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。被験体が細胞である場合、本発明は、この細胞が原核または真核の単離細胞であり得ることを特に企図する。被験体が組織である場合、本発明は、内在性組織、および、例えば培養中で成長した組織など、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織の両方を特に企図する。好ましい実施形態では、被験体が動物であり、特に、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および霊長類の種を含めた哺乳動物種の動物である。最も好ましい実施形態では、被験体がヒトである。

本発明は、グルコース代謝を調節する方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化することによって、被験体のグルコース代謝を調節することによって被験体のグルコース代謝を調節することを含む。様々な態様において、ＨＩＦαはＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、またはＨＩＦ３αである。好ましい態様では、ＨＩＦαの安定化がＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量、被験体に投与することを含む。

ＨＩＦαの安定化は、当業者にとって利用可能であり、かつ既知な方法のいずれによってでも実施でき、ＨＩＦα、または、例えばＨＩＦαを基質とする酵素を含めた、ＨＩＦαと相互作用する因子と相互作用するか、結合するか、またはこれを改変するいかなる薬剤を使用するものでもあり得る。ある特定の態様では、本発明は、例えば安定したＨＩＦ突然変異ミューテインなどの構成的に安定したＨＩＦ変種、またはそのような変種をコードするポリヌクレオチドの提供を企図する。他の態様では、本発明は、ＨＩＦαの安定化が、ＨＩＦを安定させる薬剤の投与を含むことを企図する。そのような薬剤は、ポリヌクレオチド、例えばアンチセンス配列、ポリペプチド、抗体、他のタンパク質、炭化水素、脂肪、脂質、ならびに、例えば小分子などの有機物および無機物で構成され得る。好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＦαを安定化する薬剤を被験体に投与することによって、例えば被験体におけるＨＩＦαを安定化することを企図するが、この薬剤は、ＨＩＦαを安定化する例えば小分子化合物などの化合物である。

本発明は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体のグルコース代謝を調節することによって、被験体のグルコース代謝を調節する方法をさらに企図する。好ましい態様では、本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。最も好ましい態様では、本発明の化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。別の好ましい態様では、ＨＩＦヒドロキシラーゼは、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３からなる群より選択される。

本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体のグルコース代謝過程を調節することによって、被験体のグルコース代謝過程を調節する方法を提供する。様々な実施形態において、グルコース代謝過程は、例えば、グルコース取り込み、グルコース輸送、グルコース貯蔵、グルコースプロセッシング、グルコース利用およびグルコース合成などからなる群より選択される。

特定の実施形態では、本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体におけるグルコース調節因子の発現を変化させることによって、被験体におけるグルコース調節因子の発現を変化させる方法を企図する。

一実施形態では、本発明は、被験体のＨＩＦαを安定化して、または本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体におけるグルコース調節因子の発現を増強することによって、被験体におけるグルコース調節因子の発現を増強する方法を提供する。さらなる実施形態では、グルコース調節因子は、ＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ−１、ＧｌｕＴ−１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ＩＧＦＢＰ−１、およびＩＧＦからなる群より選択される。特定の態様では、グルコース調節因子の発現の増強が持続的増強である。一態様では、グルコース調節因子は解糖因子である。さらなる態様では、解糖因子は、ＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、およびヘキソキナーゼ１からなる群より選択される。

本発明は、被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現するための方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現することによって、被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現することを含む。別の態様では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現することによって、被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現することを含む。

本発明は、被験体の血糖値を低下させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の血糖値を低下させることによって、被験体の血糖値を低下させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の血糖値を低下させることによって、被験体の血糖値を低下させることを含む。

本発明は、被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させることによって、被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させることによって、被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させることを含む。

糖尿病を罹患しているか、または糖尿病を罹患／発症する危険性のある被験体の糖尿病を治療または予防する方法も、本発明に包含される。一実施形態では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって糖尿病を治療または予防することによって、糖尿病を罹患しているか、または糖尿病を罹患する危険性のある被験体の糖尿病を治療または予防することを含む。別の実施形態では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の糖尿病を治療または予防することによって、被験体の糖尿病を治療または予防することを含む。

本発明は、被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防する方法も提供する。一実施形態では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防することによって、被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防することを含む。別の実施形態では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防することによって、被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防することを含む。様々な実施形態において、上記障害は、糖尿病、高血糖、肥満、耐糖能異常、高血圧、網膜障害、ニューロパシー、ネフロパシー、高脂血症、および血管疾患からなる群より選択される。

本発明は、被験体の糖尿病に関連した状態を治療または予防する方法も企図する。一実施形態では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の糖尿病に関連した状態を治療または予防することによって、被験体の糖尿病に関連した状態を治療または予防することを含む。別の実施形態では、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の糖尿病に関連した治療または予防することによって、被験体の糖尿病に関連した状態を治療または予防することを含む。様々な実施形態において、上記障害は、高血圧、肥満、高血糖、耐糖能異常、高脂血症、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜障害、アテローム性動脈硬化、および血管疾患からなる群より選択される。一実施形態では、被験体は、糖尿病を罹患している被験体である。別の実施形態では、被験体は、糖尿病を罹患する危険性のある被験体である。

本発明は、被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させることによって、被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させることによって、被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させることを含む。

本発明は、被験体におけるインスリン抵抗性を低下させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体におけるインスリン抵抗性を低下させることによって、被験体におけるインスリン抵抗性を低下させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体におけるインスリン抵抗性を低下させることによって、被験体におけるインスリン抵抗性を低下させることを含む。

本発明は、被験体における血糖コントロールを増強させる方法を提供する。一態様では、本方法は、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体における血糖コントロールを増強させることによって、被験体における血糖コントロールを増強させることを含む。別の態様において、本方法は、本発明の化合物を有効量、被験体に投与して、それによって被験体における血糖コントロールを増強させることによって、被験体における血糖コントロールを増強させることを含む。さらなる態様では、被験体は、高血糖を有している被験体である。

様々な実施形態において、本発明は、本発明の化合物を含む製剤、薬物、または医薬組成物と、そのような製剤、薬物、または医薬組成物の製造方法および使用方法とを提供する。

本発明の組成物および方法を記載する前に、これらは変化しうるものであり、本発明は、記載する特定の方法、プロトコール、細胞系、アッセイ、および試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するものであり、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、その文章によって別のことが明確に指示されない限り、複数に対する言及も含まれる。したがって、例えば、「ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ」に対する言及には、複数のそのような断片も含まれ、「ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ」に対する言及は、１つまたは複数の化合物と、本明細書に記載する等価物、および当業者に公知の等価物とに対する言及である。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書に記載されたものと同様または等価ないかなる方法および物質も用いることができるが、好ましい方法、装置、および物質をこれより記載する。本明細書に引用するすべての文献を、それらの文献に報告された、本発明との関連において使用し得る可能性のある方法、試薬、および道具を記載および開示する目的で、参照によりそれら全体として本明細書に組み込む。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行したとする権利が得られないことを承認するものとして解釈するべきではない。

本発明の実施には、別段の指示がない限り、化学、生化学、分子生物学、細胞生理学、遺伝子学、免疫、および薬学のいかなる在来法も、当技術分野の技術の範囲内で利用されよう。そのような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０年）、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｌ．Ｅ．、およびＧｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．編（２００１年）、The Pharmacological Basis of Therapeutics、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｃｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ら編、Methods In Enzymology、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｃ．Ｃ．編（１９８６年）、Handbook of Experimental Immunology、第Ｉ〜ＩＶ巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら編集（１９８９年）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編（１９９９年）、Short Protocols in Molecular Biology、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍら編（１９９８年）、Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．およびＧｒａｈａｍ，Ａ．編（１９９７年）、PCR (Introduction to Biotechniques Series)、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ。

定義
本明細書において、「グルコース調節」または「グルコース代謝の調節」という用語は、それによって、細胞、組織、器官、器官系、または生物全体が、グルコース代謝における特定の過程を改変することによって、例えば、増大または減少させることによって、グルコースホメオスタシスを維持する過程を指す。グルコース代謝またはグルコース代謝過程は、グルコース合成、プロセッシング、輸送、取り込み、利用、または貯蔵に関与する過程を包含し、これには糖新生および解糖も含まれる。グルコース代謝および調節の特定の態様には、細胞膜を通したグルコース移動と、細胞によるグルコースの保持または分泌とを促進するグルコーストランスポーターまたは酵素の発現；例えば解糖および糖新生酵素を含めた、グルコース利用または生成に関与した酵素の発現および／または活性の変化；ならびに、例えば、間質（すなわち、細胞外）液、細胞内液、血液、尿、および同様のものを含めた体液または培養液中のグルコース分布の変化が含まれる。

「グルコースホメオスタシス」という用語は、生物内の正常なグルコースレベル、特に、正常な血糖値を維持することを指す。

「血糖コントロール」という用語は、正常、または正常に近い血糖値を維持、回復、または実現することを指す。血糖コントロールは、生物内の糖化ヘモグロビンレベルを正常化することを指す場合もある。

「代謝性疾患（metabolic condition）」および「代謝障害」という用語は、互換性をもって使用され、例えばインスリン抵抗性など、グルコース調節または血糖コントロールの障害または改変に関連するか、またはこれによって悪化したいかなる障害も指す。そのような障害には、糖尿病、高血糖、肥満などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書において、「高血糖」という用語は、正常値を超えた血糖値を全般的に指す。高血糖は、当業者によって認められ、かつ使用されているいかなる尺度によっても判定することができる。現在、ヒトでは、正常血糖は、約７０から１２０ｍｇ／ｄｌの間であると考えられるが、絶食状態に応じて変動する。食事前には、血糖は約８０から１２０ｍｇ／ｄｌまでの範囲で変動しうるが、食事の２時間後には、血糖は約１８０ｍｇ／ｄｌか、またはそれ未満となりうる。さらに、絶食を行った個体では、正常血糖は約１１０ｍｇ／ｄｌ未満である。約１２６ｍｇ／ｄｌ以上の血糖値を有する被験体は、通常、高血糖であるとみなされ、血糖が約２００ｍｇ／ｄｌを超えている被験体は、通常、糖尿病であるとみなされる。

「肥満」という用語は、体脂肪が過剰であることを指す。当業者によって認められ、かつ使用されているいかなる尺度によっても肥満症を判定することができる。現在認められている、肥満の基準の１つがボディマスインデックス（ＢＭＩ）であり、これは、メートルでの身長の二乗に対するキログラムでの体重で表す尺度である。通常、年齢が２０歳を越えた成人では、ＢＭＩが約１８．５と２４．９との間であると正常とみなされ、ＢＭＩが約２５．０と２９．９との間であると太り過ぎとみなされ、ＢＭＩが約３０．０以上であると肥満とみなされ、ＢＭＩが約４０以上であると病的な肥満とみなされる（例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（２０００年）、Am J Clin Nutr、第７２巻、６９４〜７０１ページ参照）。これらのＢＭＩの範囲は、疾患の危険性の増大に対する体重の影響に基づいている。太り過ぎおよび肥満に関連したいくつかの一般的な状態には、心血管疾患、高血圧、骨関節炎、癌、および糖尿病が含まれる。ＢＭＩは体脂肪と相関するが、ＢＭＩと実際の体脂肪との関係は年齢および性別によって異なっている。例えば、ＢＭＩが同じ場合、女性の方が男性より高いパーセントの体脂肪を有する可能性がより高い。

肥満の別の尺度は体脂肪率である。間接的に体脂肪を測定するには、皮下脂肪厚測定、水密度測定（hydrodensitometry）、生体電気インピーダンス分析（ＢＩＡ）、二重エネルギーＸ線吸収法、全身カリウム測定、およびｉｎ ｖｉｖｏ中性子放射化分析を含めた様々な方法が利用可能である。水密度測定、すなわち静水計量法（ＨＷ）では、水中および空気中での被験体の体重の相違を測定することによって、身体の総体積を決定する。同様に、空気置換プレチスモグラフィー（ＡＰ）測定は、一定の空気体積を有するチャンバーに被験体が入ることによって引き起こされるチャンバー体積の減少を測定することによって、身体の総体積を決定する。その後、全身密度および体組成を、実証済みの予測方程式を用いて計算する。ＢＩＡは、電極間を流れる小な電流から引き起こされる電圧低下から身体の電気抵抗、すなわちインピーダンスを推算する。インピーダンスのレベルは、身体における水および電解質組成の指標であり、その後、除脂肪組織組成および体水分量を、展開（developed）回帰方程式から推算するのに使用される。除脂肪組織の水分率を仮定して、別の回帰方程式を用いて、除脂肪体重と体脂肪量を推算する。女性の体脂肪率は、通常約１７から２７パーセントであるべきであるが、約３１パーセントまでは許容範囲とみなされる。男性では、体脂肪率は、通常約１０から２０パーセントであるべきであるが、約２５パーセントまでは許容範囲とみなされる。

「ＨＩＦα」という用語は、低酸素症誘発因子タンパク質のアルファサブユニットを指す。ＨＩＦαは、ヒトＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ１６６６５）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ４１４９５）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ２２６６８）；マウスＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ６１２２１）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ２０１３０およびＡＡＢ４１４９６）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ７２７３４）；ラットＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ７０７０１）、ＨＩＦ−２α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６１２）、およびＨＩＦ−３α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６１１）；ならびにウシＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ７８６７５）を含めたいずれのヒトもしくは哺乳動物タンパク質、またはその断片であってもよい。また、ＨＩＦαは、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＢ９６６２８）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＣ４８５１）、およびニワトリＨＩＦ−１α（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ３４２３４）を含めたいずれの非哺乳動物タンパク質またはその断片であってもよい。また、ＨＩＦα遺伝子配列は、例えば上述のＨＩＦα遺伝子配列の全体または一部をプローブとして用いて、別の種のＨＩＦα遺伝子配列を回収および決定することによって、通常のクローニング技法によって入手してもよい。

ＨＩＦαの断片には、ヒトＨＩＦ−１αアミノ酸４０１から６０３（Ｈｕａｎｇら、同上）、アミノ酸５３１から５７５（Ｊｉａｎｇら（１９９７年）、J Biol Chem、第２７２巻、１９２５３〜１９２６０ページ）、アミノ酸５５６から５７５（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、同上）、アミノ酸５５７から５７１（Ｓｒｉｎｉｖａｓら（１９９９年）、Biochem Biophys Res Commun、第２６０巻、５５７〜５６１ページ）、およびアミノ酸５５６から５７５（IvanおよびKaelin（２００１年）、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ページ）で定義される領域が含まれる。さらに、ＨＩＦαの断片には、例えばＨＩＦα天然配列中のＬ_３９７ＴＬＬＡＰおよびＬ_５５９ＥＭＬＡＰにある、少なくとも１回現れるＬＸＸＬＡＰモチーフを含有するいかなる断片も含まれる。さらに、ＨＩＦα断片には、ＨＩＦαの少なくとも１つの機能的または構造的特性を保持するいかなる断片も含まれる。例えば、実施例１４のスクリーニングアッセイで使用に供するＨＩＦαペプチドは、ＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号５）を含むものでもよい。

「ＨＩＦヒドロキシラーゼ」という用語は、ＨＩＦタンパク質、特にＨＩＦαサブユニットのアミノ酸残基をヒドロキシル化することができるいかなる酵素も指す。このアミノ酸残基は、プロリンおよび／またはアスパラギン残基であることが好ましい。

「ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ」という用語は、ＨＩＦタンパク質中のアスパラギン残基をヒドロキシル化することができるいかなる酵素も指す。ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化されるアスパラギン残基は、例えばＨＩＦ−１α中のＮ_８０３残基、または別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なアスパラギン残基を含むことが好ましい。ＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼには、ＨＩＦαのトランス活性化の調節を担うアスパラギニルヒドロキシラーゼであるＨＩＦ阻害因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ）（ＦＩＨ）が含まれる（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ２７３０８；Ｍａｈｏｎら（２００１年）、Genes Dev、第１５巻、２６７５〜２６８６ページ；Ｌａｎｄｏら（２００２年）、Science、第２９５巻、８５８〜８６１ページ；Ｌａｎｄｏら（２００２年）、Genes Dev、第１６巻、１４６６〜１４７１ページ。Ｅｌｋｉｎｓら（２００２年）、J Biol Chem、Ｃ２００６４４２００も参照のこと）。

「ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ」および「ＨＩＦ ＰＨ」という用語は、ＨＩＦタンパク質中のプロリン残基をヒドロキシル化できるいかなる酵素も指す。ＨＩＦ ＰＨによってヒドロキシル化されるプロリン残基は、例えばヒトＨＩＦ−１α天然配列中のＬ_３９７ＴＬＬＡＰおよびＬ_５５９ＥＭＬＡＰにあるようなＬＸＸＬＡＰモチーフの中にあるプロリンを含むことが好ましい。ＨＩＦ ＰＨには、Ｔａｙｌｏｒ（２００１年、Gene、第２７５巻、１２５〜１３２ページ）によって記載され、ＡｒａｖｉｎｄおよびＫｏｏｎｉｎ（２００１年、Genome Biol、第２巻、ＲＥＳＥＡＲＣＨ０００７）、Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年、Cell、第１０７巻、４３〜５４ページ）、ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（２００１年、Science、第２９４巻、１３３７〜１３４０ページ）によって特徴決定されたＥｇｌ−Ｎｉｎｅ（ＥＧＬＮ）遺伝子ファミリーのメンバーが含まれる。ＨＩＦ ＰＨ酵素の例には、ヒトＳＭ−２０（ＥＧＬＮ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ３３９６５；Ｄｕｐｕｙら（２０００年）、Genomics、第６９巻、３４８〜５４ページ）、ＥＧＬＮ２アイソフォーム１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１０；Ｔａｙｌｏｒ、同上）、ＥＧＬＮ２アイソフォーム２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６００２５）、およびＥＧＬＮ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１１；Ｔａｙｌｏｒ、同上）；マウスＥＧＬＮ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１５）、ＥＧＬＮ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１１）、およびＥＧＬＮ３（ＳＭ−２０）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ４２５１７）；ならびにラットＳＭ−２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１９３２１）が含まれる。加えて、ＨＩＦ ＰＨには、線虫（Caenorhabditis elegans）ＥＧＬ−９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ５６３６５）およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＣＧ１１１４遺伝子産物（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ５２０５０）が含まれうる。また、ＨＩＦ ＰＨには、上述した完全長タンパク質のいかなる活性断片も含まれる。

本明細書において用いられる「試料」は、限定されるものではないが、唾液、血液、尿、血清、血漿、硝子体液、滑液、脳脊髄液、羊水、および器官組織（例えば、生検された組織）；細胞から単離された染色体、細胞小器官、または他の膜；ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど；および透明化した細胞または組織、あるいはそのような細胞または組織からのブロットまたはインプリントを含めた、例えば、体液、分泌液、組織、細胞、または培養細胞などのいかなる供給源に由来するものでもよい。試料は、例えば、ヒト被験体、または非ヒト哺乳動物被験体などのいかなる供給源に由来するものでもよい。また、いかなる疾患動物モデルに由来する試料も企図される。試料は、溶液中に存在することも、例えば、基質に固定または結合されていることもある。試料は、代謝調節に関連した転写産物もしくはタンパク質の存在を調べるのに、または脂肪およびグルコースレベルを測定するのに適したいかなる物質も指すことがある。そのような試料を入手する方法は、当技術分野における技術レベルの範囲内にある。

本明細書において、「被験体」には、原核もしくは真核の単離細胞、または培養中で増殖した組織も含まれうる。被験体には、動物、特にラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および霊長類、特にヒトを含めた哺乳動物種が含まれることが好ましい。

発明
本発明は、糖尿病、高血糖、ならびに、グルコース代謝および／またはホメオスタシスの改変または障害に関連した他の状態を治療または予防する方法および化合物を提供する。糖尿病に関連した状態、およびグルコース代謝の改変または障害に関連した他の状態の発症および／または進行を治療する、予防する、または遅延させるのに有用な方法および化合物、ならびにグルコース代謝を調節して、グルコースホメオスタシスを実現する方法および化合物も提供する。

本発明は、低酸素症誘発因子アルファサブユニット（ＨＩＦα）の安定化が血糖値の低下を導くという発見に関する。本発明はさらに、ＨＩＦαの安定化がグルコース代謝を調節するという発見にも関する。加えて、本発明はさらに、本発明の化合物を用いて、血糖値を低下させ、グルコース代謝を調節し、そして、グルコースホメオスタシスを実現することができるという発見にも関する。

低酸素症誘発因子（ＨＩＦ）は、複数の生物学的経路に関与する生理因子である。ＨＩＦαは、標準酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）すなわち正常な酸素条件下で分解される。低酸素すなわち酸素が少ない条件下では、ＨＩＦαは安定化され、多くの下流の作用をもたらす。最近になって、ＨＩＦαサブユニット上の特定残基のヒドロキシル化が、ＨＩＦαを分解の標的とし、それによって正常な酸素条件下における安定したＨＩＦ複合体の形成が阻止されることが判明し、さらに、このヒドロキシル化が、ある特定のＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性によって起こると決定された（例えば、ＩｖａｎおよびＫａｅｌｉｎ（２００１年）、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ページ；Ｊａａｋｋｏｌａら（２００１年）、Science、第２９２巻、４６８〜４７２ページ；Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）、Cell、第１０７巻、４３〜５４ページ；ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（２００１年）、Science、第２９４巻、１３３７〜１３４０ページを参照）。これらのＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素ファミリーに属する。これらの酵素は酸素に依存しており、酸素が少ない条件、すなわち低酸素条件下では、ＨＩＦα残基のヒドロキシル化が阻害される。治療上のＨＩＦαの安定化、およびＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害することによるＨＩＦαの安定化に関しては以前に記載されている（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号を参照）。

方法
一態様では、本発明は、血糖値を低下させる方法、または被験体の低酸素症誘発因子アルファサブユニット（ＨＩＦα）を安定化させることによってグルコース代謝を調節する方法を提供する。さらなる態様では、これらの方法は、被験体のＨＩＦαヒドロキシル化を阻害することによって、血糖値を低下するか、グルコース代謝を調節することを含む。好ましい態様では、本発明の方法は、被験体のＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性を阻害することによって血糖値を低下させるか、またはグルコース代謝を調節する方法を包含する。最も好ましい態様では、これらの方法は、ＨＩＦプロリヒドロキシラーゼ酵素の活性を阻害することによって血糖値を低下させるか、またはグルコース代謝を調節することを含む。

ＨＩＦαの安定化は、当業者に利用可能であり、かつ公知の方法のいずれでも実施することができ、ＨＩＦα、または、例えばＨＩＦαを基質とする酵素を含めたＨＩＦαと相互作用する因子と、相互作用するか、結合するか、またはこれをを改変するいかなる薬剤の使用によっても行うこともできる。ある特定の態様では、本発明は、例えば安定なＨＩＦ突然変異ミューテインなどの構成的に安定なＨＩＦα変種、またはそのような変種をコードするポリヌクレオチドの提供を企図する（例えば、米国特許第６，５６２，７９９号および第６，１２４，１３１号；ならびに米国特許第６，４３２，９２７号を参照）。他の態様では、本発明は、ＨＩＦαの安定化がＨＩＦαを安定化する薬剤の投与を含むことを企図する。この薬剤は、例えばアンチセンス配列などのポリヌクレオチド（例えば、国際公開第ＷＯ０３／０４５４４０号参照）、ポリペプチド、抗体、他のタンパク質、炭化水素、脂肪、脂質、ならびに例えば小分子などの有機物および無機物で構成することができる。好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＦαを安定化する薬剤を被験体に投与することによって、例えば被験体におけるＨＩＦαを安定化することを企図するが、この薬剤は、ＨＩＦαを安定化する例えば小分子化合物などの化合物である。

他の実施形態では、本発明の方法は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼファミリーより選択される少なくとも１つの酵素の活性を阻害することによって、ＨＩＦαを安定化することを含む。好ましい実施形態では、この酵素は、例えば、ＥＧＬＮ−１、ＥＧＬＮ−２、ＥＧＬＮ−３などのＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素である（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（２００１年）、Gene、第２７５巻、１２５〜１３２ページ；Ｅｐｓｔｅｉｎら（２００１年）、Cell、第１０７巻、４３〜５４ページ；ならびにＢｒｕｉｃｋおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ（２００１年）、Science、第２９４巻、１３３７〜１３４０ページを参照）。しかし、この酵素が、例えばプロコラーゲンリジルヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル３−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼα（Ｉ）およびα（ＩＩ）、チミン７−ヒドロキシラーゼ、アスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ、ε−Ｎ−トリメチルリシンヒドロキシラーゼ、およびγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼなどを含めた２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素ファミリーより選択されるいかなる酵素であることも、特に企図されている（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Biochem J、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＭｙｌｌｙｈａｒｊｕおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９７年）、EMBO J、第１６巻、１１７３〜１１８０ページ；Thornburgら（１９９３年）、３２巻、１４０２３〜１４０３３ページ；およびＪｉａら（１９９４年）、Proc Natl Acad Sci USA、９１巻、７２２７〜７２３１ページ参照）。

特定の実施形態では、これらの方法は、例えばプロリン残基、アスパラギン残基など、ＨＩＦαにおける特定残基のヒドロキシル化を阻害することによって、血糖値を低下させるか、またはグルコース代謝を調節することを含む。好ましい実施形態では、これらの残基がプロリン残基である。特定の実施形態では、これらの残基は、ＨＩＦ−１α中のＰ_５６４残基もしくは別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なプロリン、またはＨＩＦ−１α中のＰ_４０２残基もしくは別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なプロリンなどでありうる。他の実施形態では、本方法は、例えば、ＨＩＦ−１α中のＮ_８０３残基または別のＨＩＦαアイソフォーム中の相同なアスパラギン残基などのＨＩＦαアスパラギン残基のヒドロキシル化を阻害することも包含しうる。

化合物
一態様では、本発明は、本発明の化合物を被験体に投与することによって血糖値を低下させるか、またはグルコース代謝を調節する方法を提供する。本発明の化合物は、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性を阻害するか、または他の方法でモジュレートする任意の化合物である。２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素には、ヒドロキシラーゼ酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒドロキシラーゼ酵素は、標的基質残基をヒドロキシル化するものであり、これには、例えば、プロリル、リジル、アスパラギニル（アスパラギル、アスパラチル）ヒドロキシラーゼなどが含まれる。ヒドロキシラーゼは、例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンヒドロキシラーゼなど、標的基質で記載されるときも、および／または、例えば、プロリルヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼなど、基質中の標的残基で記載されるときも、または、例えば、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼなど、これら両方で記載されるときもある。代表的な２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素には、例えば、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３などのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼと、例えばＨＩＦ阻害因子（ＦＩＨ）などのＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼとを含めたＨＩＦヒドロキシラーゼ；例えば、プロコラーゲンリジルヒドロキシラーゼ、ならびに、例えばプロコラーゲンプロリル３−ヒドロキシラーゼ、プロコラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼα（Ｉ）およびα（ＩＩ）などのプロコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼなどのプロコラーゲンヒドロキシラーゼ；チミン７−ヒドロキシラーゼ；アスパラチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ；ε−Ｎ−トリメチルリシンヒドロキシラーゼ；およびγ−ブチロベタイン（ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ）ヒドロキシラーゼなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。酵素活性には、いずれの２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼに付随する活性も含まれうるが、基質中のアミノ酸残基のヒドロキシル化が特に企図される。基質中のプロリンおよび／またはアスパラギン残基のヒドロキシル化が明確に含まれるが、他のアミノ酸のヒドロキシル化も企図される。

特定の実施形態では、本発明の化合物は、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。様々な実施形態で、この活性は、例えば、ＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、またはＥＧＬＮ３などのＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼによるものである。他の実施形態では、この活性は、例えば、限定されるものではないが、ＦＩＨなどを含めたＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼによるものである。

一態様では、例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が、さらにコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害することがあり、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が、さらにＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害することがあるなど、１つまたは複数の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素に対する阻害活性を示す本発明の化合物が、別の１つまたは複数の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素に対する阻害活性を示すことがある。

一態様では、本発明は、本発明の化合物を被験体に投与することによって血糖値を低下させるか、またはグルコース代謝を調節する方法を提供する。本発明の化合物は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する小分子化合物である。本発明の好ましい化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物である。この阻害は、直接的にも、間接的にも可能であり、競合的にも、非競合的にも可能である。本発明のさらに別の化合物を同定するための例示的化合物および方法を以下に提供する。

グルコース
正常な状態では、グルコースは、末梢組織に対する、身体の主要なエネルギー源として機能する。脳および他の神経組織は、正常な状態における唯一のエネルギー源としてグルコースを必要とし、例えば長期の絶食など、ストレスが大きい状態でさえもかなりの量のグルコースを必要とする。肝臓は、血糖レベルを調節する主要な器官であり、貯蔵されたグリコーゲンの分解からグルコースを産生するか、乳酸、ピルビン酸、グリセロール、およびアミノ酸などの前駆体から合成することによって、絶食時間中に血糖レベルが低下するのを阻止する。例えばグルコース内部平衡など、グルコースホメオスタシスの維持には、肝臓によるグルコース産生と、末梢グルコース取り込みおよび利用との間のバランスが必要である。

血中グルコースホメオスタシス、すなわちグルコース内部平衡の維持は、多くの生化学因子による密接な制御および影響を受けるが、様々な過程を包含する。グルコースホメオスタシスを実現するために、身体は、グルコース取り込み、輸送、貯蔵、プロセッシング、合成、利用などを含めたいくつかのレベルでグルコースを調節する。したがって、グルコースホメオスタシスは、例えば、身体の要求、食物摂取などの外部要因と、インスリン、グルカゴンなどの循環レベルなどの内部要因とを含めた多くの要因の影響を受ける。

上昇したグルコースレベル（高血糖値）
グルコースの正常な調節を破壊すると、正常な血糖値から逸脱した血糖値、すなわち、正常な血糖値と比較して上昇または低下している血糖値を導きうる。例えば、高血糖、糖尿病などに特徴的な慢性的に高い血糖値は、様々な器官、組織、および身体組織における多数の有害作用の原因となりうる。糖尿病、高血糖、または高血糖値は、アテローム性動脈硬化の加速、慢性心臓病、心筋梗塞、卒中、微小血管障害の増加、血脈管構造への損傷、腕部および脚部における循環の減少を引き起こす末梢血管疾患、大血管合併症、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、白内障などの眼疾患、糖尿病性腎症、腎臓損傷などを含めた腎障害、糖尿病性神経障害、末梢ニューロパシー、自律神経系における神経損傷を含めた神経損傷および他のニューロパシー、高インスリン血症、高脂血症、インスリン抵抗性、グルコース代謝障害、耐糖能異常、皮膚および結合組織障害、足の傷害および潰瘍形成,、糖尿病性ケトアシドーシスなどを含めた多数の障害および状態と関連している。

グルコース調節の改変または障害、ならびに、糖尿病、高血糖などを含めた障害の存在または発症の危険性は、循環しているグルコースの測定、または血中／血漿グルコースレベルの測定によって特定することができる。血糖値は、ほとんどの場合、空腹時血糖試験、随時血糖試験、または経口ブドウ糖負荷試験で測定される。

血糖値は、空腹時血糖試験で測定できる。そのような分析では、測定値は、正常な空腹時（すなわち、８時間、水以外の液体および食物をとらない）血糖値が、通常、約７０ｍｇ／ｄＬから１１０ｍｇ／ｄＬの範囲内に維持されていることを反映する。空腹時血糖値が通常の範囲を超えて上昇している場合、例えば約１２６ｍｇ／ｄＬ以上のレベルにある場合、例えば糖尿病と診断することができる。一実施形態では、本発明は、空腹時血糖値を、正常な空腹時血中レベル、すなわち約７０ｍｇ／ｄＬから１１０ｍｇ／ｄＬの範囲内に維持するか、またはこれを実現する化合物および方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、低い空腹時血糖値（すなわち、正常な空腹時レベル未満の血糖値）を、約７０ｍｇ／ｄＬから１１０ｍｇ／ｄＬの範囲内に上昇または回復させる化合物および方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、高い空腹時血糖値（すなわち、正常な空腹時レベルより上まで上昇した血糖値）を、約１２６ｍｇ／ｄＬ未満かつ７０ｍｇ／ｄＬ超、より好ましくは約１２０ｍｇ／ｄＬ未満かつ７０ｍｇ／ｄＬ超、そして、最も好ましくは約１１０ｍｇ／ｄＬ未満、７０ｍｇ／ｄＬ超に減少（低下）または回復させる化合物および方法を提供する。

血糖値の別の測定法は随時血糖試験である。この方法で測定した血糖値は、通常、１００ｍｇ／ｄＬ台前半から中程までの値を示す。随時血糖値が約１８０ｍｇ／ｄＬ以上であると、高血糖状態であり、約２００ｍｇ／ｄＬ以上のレベルは、例えば糖尿病などのグルコース調節障害に関連した疾患の存在、またはこれを発症する危険性を示すものである。したがって一態様では、本発明は、随時血糖試験で測定した際の血糖値を、正常レベル、すなわち１００ｍｇ／ｄＬ台前半から中程までのレベルに維持するか、またはこれを実現する方法および化合物を提供する。別の態様では、随時血糖試験で測定した際に、正常レベル未満までに低下していた血糖値を、正常レベル、すなわち１００ｍｇ／ｄＬ台前半から中程までのレベルに回復させるのに本発明の方法および化合物を用いることができる。さらなる態様では、正常レベルを超えたレベルまで上昇した血糖値を、正常レベル、すなわち１００ｍｇ／ｄＬ台前半から中程までのレベルに低下／減少させるのに本発明の方法および化合物を用いることができる。様々な態様において、これらの方法および化合物は、高血糖値を約２００ｍｇ／ｄＬ未満かつ１００ｍｇ／ｄＬ超のレベル、より好ましくは約１８０ｍｇ／ｄＬ未満かつ１００ｍｇ／ｄＬ超のレベル、そして最も好ましくは約１５０ｍｇ／ｄＬ未満かつ１００ｍｇ／ｄＬ超のレベルに低下させる。

グルコース調節障害、高血糖、糖尿病などを有しているか、またはその危険性がある被験体を特定するには、経口ブドウ糖負荷試験を用いることもできる。この試験では、個体は、終夜の絶食の後、糖水溶液を飲む。その後数時間にわたって血糖値を調べる。正常な耐糖能／グルコース調節を有する人、例えば、糖尿病などになっていない個体では、測定された血糖値は、溶液を投与後に上昇し、その後迅速に低下するであろう。正常な血糖値は、糖水溶液を飲んだ２時間後で約１４０ｍｇ／ｄＬ未満であり、さらに、０時間目と、２時間目との間に取得される全測定値が約２００ｍｇ／ｄＬ未満である。耐糖能異常は、通常、経口ブドウ糖負荷試験中測定された血糖値が約１４０ｍｇ／ｄＬから１９９ｍｇ／ｄＬの範囲にある場合に診断される。糖尿病は、通常、測定された血糖値が約２００ｍｇ／ｄＬである場合に診断される。本発明の方法および化合物は、経口ブドウ糖負荷試験の後で、正常な血糖値を、維持、回復、または実現するのに有用である。

グルコース調節因子の発現
一実施形態では、本発明は、その産物が細胞によるグルコース取り込みおよび利用に関与する遺伝子の発現を増強する方法および化合物を提供する。そのような遺伝子には、グルコーストランスポーター（ＧｌｕＴ）−１およびＧｌｕＴ−３などのグルコーストランスポーターと；アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、ホスホフルクトキナーゼＬ、およびホスホフルクトキナーゼＰなどの解糖系酵素とが含まれるが、これらに限定されるものではない。治療によってグルコース輸送および利用をアップレギュレーションすることで、インスリン抵抗性が効果的に低下され、血糖が低下し、そしてそれによって、例えば、２型糖尿病、高血糖、血糖コントロール障害、耐糖能異常などの代謝障害を罹患する患者で有益な効果がもたらされよう。

一態様では、本発明は、高血糖を治療または予防する方法および化合物を提供する。そのような化合物および方法は、例えば、グルコース放出の増大、グルコース利用の低減および／またはグルコース取り込み障害によって起こる血糖値の上昇など、高血糖に関連した障害を治療または予防するのに適している。これらの障害は、さらに、インスリン抵抗性、耐糖能異常、２型糖尿病および／または肥満と関連している。

一態様では、本発明の方法は、全身のグルコース、ならびにプロセッシングおよび利用を含めたグルコース代謝のレベルおよび活性を調節する一群の遺伝子発現を活性化する方法を提供する。これらの方法は、例えばインスリンの産生またはインスリンに対する反応の損失によって、そのような過程を調節する身体の自然な機構に生じた欠陥を代償するものである。本発明は、血糖コントロール障害と関連した代謝性疾患または障害を治療する方法を提供する。そのような障害には、耐糖能異常（ＩＧＴ）、糖尿病前症、糖尿病、高血糖などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、摂取の際に特定の器官で活性化するプロドラッグ化合物の選択的な設計を特に企図する。例えば、肝臓は脂肪ホメオスタシスに関与する多数のタンパク質を生成するので、本発明は、本発明の方法において選択的に肝臓を標的とすることを企図する。肝臓における、例えばアルドラーゼなどの遺伝子の選択的なアップレギュレーションは、肝臓特異な酵素によって不活性型から活性型に転換される化合物を用いることで実現できる。例えば、活性化合物のカルボン酸を対応するアルコールに置換することができる。肝臓内のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性がそのような化合物を活性型に変換するであろう。他の器官にはＡＤＨ活性がないので、この化合物は、肝臓においてのみ選択的に活性化されよう。同様に、他の器官、例えば、脂肪組織、腎臓、骨格筋、心臓などを、本発明の方法で使用される化合物の標的にしてもよい。

インスリン
インスリンは、代謝平衡の調節において極めて重要であり、体内のほとんどの細胞におけるグルコース取り込みの刺激を行う。インスリン存在時には、ほとんどの細胞がグルコースをそれらの代謝燃料として使用し、脂肪細胞はグルコースを用いて脂肪を合成し、腎細胞はグルコースをグリコーゲンおよび脂肪に変換する。血糖が上昇すると、グルコース取り込みに関連したいくつかの事象によってインスリンの分泌が刺激され、ただちに血中インスリンの上昇が続く。その後血糖値が低下すると、インスリン分泌が迅速に減少し、神経系細胞を除いて、細胞内へのグルコース流入が抑制される。グルコースの供給がなければ、細胞は、グリコーゲンおよび脂肪を代謝燃料として用いる。肝臓および脂肪細胞は、貯蔵されたグリコーゲンおよび脂肪の分解を開始する。この結果、肝臓はグルコースを血液から取り込まずにむしろこれを血中に供給し、さらに肝臓および脂肪組織の両方が脂肪酸を血中に供給する。したがって、インスリンレベルが低いと、インスリン応答性の組織におけるグルコース取り込みが減弱され、肝臓における糖新生およびグリコーゲン分解が促進され、グリコーゲン合成が減少し、そして、貯蔵されたグリコーゲンおよび脂肪の動員が促進される。

身体がインスリンを産生できなかったり、例えばインスリン感受性の低下、すなわちインスリン抵抗性など、インスリンに応答できなかったりすると、糖尿病および高血糖を含めた様々な障害が引き起こされうる。

グルコース輸送障害には、原因としてインスリン抵抗性が関係している。本発明は、異常のグルコース輸送を回復させるか、またはグルコース輸送を増加させるために、インスリン抵抗性を低下させる方法を企図する。本発明は、インスリン抵抗性を低下または減少させる方法を提供する。ある特定の態様では、ＨＩＦαを安定化することによってインスリン抵抗性を低下させる。他の態様では、ＨＩＦ ＰＨ活性を阻害することによってインスリン抵抗性を低下させる方法を提供する。

インスリン感受性の増大は、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）の高血漿レベルと正の相関関係にある。また、ＩＧＦＢＰ−１血漿中レベルは、青年におけるボディマスインデックスと負の相関関係にある（Ｔｒａｖｅｒｓら、（１９９８年）、J Clin Endocrinol Metab、第８３巻、１９３５〜１９３９ページ）。さらに、ＩＧＦＢＰ−１レベルが低いことは、心血管系危険因子および２型糖尿病の増大と相関する（Ｇｉｂｓｏｎら（１９９６年）、J Clin Endocrinol Metab、第８１巻、８６０〜８６３ページ）。したがって、インスリン感受性の回復または維持、すなわち、インスリン抵抗性の治療には、ＩＧＦＢＰ−１レベルが増大していることが望ましいであろう。

さらに、インスリン抵抗性および２型糖尿病は、ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＰＦＫ）に影響を及ぼす遺伝的欠損によっても引き起こされる。ＰＦＫは解糖カスケードにおける律速酵素であるので、特にこの酵素における活性の低下、そして解糖カスケード全般における活性の低下は、明らかにインスリン抵抗性および２型糖尿病と関係している。したがって、インスリン感受性の回復または維持、例えばインスリン抵抗性の低下には、ＰＦＫ、ならびに例えばアルドラーゼ、エノラーゼ、およびヘキソキナーゼなどの他の解糖因子のレベルが増大していることが望ましいであろう。

本発明の化合物がＩＧＦＢＰ−１、ＰＦＫ、および他の解糖酵素の発現を増強することが示された（例えば、実施例４を参照）。したがって一実施形態では、本発明は、例えばＩＧＦＢＰ−１およびＰＦＫなど、それらの産物がグルコースプロセッシングおよび利用に関与する遺伝子を協調発現するための方法および化合物を提供する。別の実施形態では、本発明は、そのような遺伝子の協調発現によって、例えばインスリン抵抗性を低下させるなど、インスリン感受性を増強する方法および化合物を提供する。一態様では、この方法は、例えば被験体のＨＩＦαを安定化することを包含する。本発明は、本発明の化合物、例えばＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤を被験体に投与することによって、被験体におけるインスリン感受性を増強する方法をさらに提供する。

糖化ヘモグロビン
糖尿病の管理と合併症に関する試験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ）（ＤＣＣＴ）による結果は、血糖コントロールの改善によって、非増殖網膜症および増殖網膜症（４７％減少）、ミクロアルブミン尿症（３９％減少）、臨床ネフロパシー（５４％減少）、およびニューロパシー（６０％減少）を含めた、糖尿病の合併症が減少することを実証した（ＤＣＣＴ研究群（１９９３年）、N Engl J Med、第３２９巻、９７７〜９８６ページ）。さらに、英国予想糖尿病試験（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ）（ＵＫＰＤＳ）は、血糖コントロールが微小血管系合併症の減少に関連すること、および、厳密な血圧コントロールが大血管合併症および微小血管系合併症の両方を有意に減少させることを実証した（ＵＫＰＤＳ群（１９９８年）、Lancet、第３５２巻、８３７〜８５３ページ）。

糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン、グリコシル化ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、またはＨｂＡ１としても知られている）は、ヘモグロビン分子に様々な糖（最も一般的にはグルコース）が結合して形成され、血糖濃度に正比例した速度で形成される。糖化ヘモグロビンレベルの測定は、測定前２から３カ月にわたる間の平均血糖濃度の正確な指標を提供する。臨床上では、糖化ヘモグロビンレベルは、糖尿病患者における血糖コントロール評価を提供する。正常な（非糖尿病患者の）糖化ヘモグロビンレベルは４から６％の範囲にある。糖尿病個体の研究において、ＤＣＣＴは、ＨｂＡ１ｃレベルを平均７．２％のＨｂＡ１ｃレベルに低下または維持することによって、ＨｂＡ１ｃレベルがさらに高い糖尿病個体と比較して、網膜障害が７６％減少し、ニューロパシーが６０％減少し、腎臓病が５０％減少し、そして心血管疾患が３５％減少することが判明した。

本発明は、被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させる化合物および方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法および化合物は、４から６％の糖化ヘモグロビンレベルを維持、回復、または実現するのに有用である。別の実施形態では、本発明の方法および化合物は、糖化ヘモグロビンレベルを約９％未満、より好ましくは約８％未満、最も好ましくは約７％未満まで減少させる。

糖尿病および肥満
肥満は、糖尿病の危険因子であり、時には糖尿病を悪化させる副作用でもある。肥満は、過剰な脂肪沈着、特に内臓脂肪または中央脂肪（ｃｅｎｔｒａｌ ｆａｔ）レベルの上昇を特徴とする。したがって、肥満を治療または予防することによって、糖尿病を発症する危険性を最小にすることが可能であり、事実、糖尿病の危険性があると診断された個体または糖尿病の個体には、減量療法がしばしば処方される。

本発明の化合物は体重増加を防止または遅延させ、かつ内臓脂肪および腹部脂肪を減少させることがインビボ検査で示されている（例えば実施例９および１０を参照）。したがって一態様では、本発明は、肥満を軽減または防止することによって糖尿病を治療または予防する方法を提供する。一態様では、この方法は、例えば被験体のＨＩＦαを安定化することを包含する。本発明は、本発明の化合物、例えばＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤を被験体に投与することによって、被験体における肥満を治療または防止する方法を提供する。

上述のように、糖尿病は様々な障害および疾患と関連している。例えば心血管疾患（ＣＶＤ）は、２型糖尿病患者の主要死亡原因である。２型糖尿病の個体は、ＣＶＤで死亡する確率が非糖尿病個体に比べて２から６倍高い。これらの患者の死亡のうちかなりの数が慢性心臓疾患（ＣＨＤ）によると考えられる。高脂血症は、２型糖尿病において一般的であり、ＣＨＤの発症に寄与する。タイプ２糖尿病個体に共通した脂質プロフィルには、非糖尿病個体より総トリグリセリドが高いこと、およびＨＤＬコレステロールが低いことが含まれる。トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールの同様の異常が、肥満（特に内臓脂肪が多い個体）、高血圧、およびインスリン抵抗性（例えば、代謝症候群）の非糖尿病個体でも観測される。高トリグリセリドレベルは、心血管疾患の危険因子に関係があるとされており、トリグリセリドの上昇は代謝症候群の重要要素である。糖尿病性異脂肪血症を予防または治療することによって、大血管合併症の危険性が減少することがある。

糖尿病および高血圧
高血圧は糖尿病の危険因子である。さらに、高血圧および関連の有害作用は、糖尿病に付随して、または糖尿病の結果として生じ得る。したがって、高血圧を治療または予防することによって、糖尿病になる危険性または発症を最小にすることができ、また、糖尿病におけるこの側面に取り組んだ治療方法は貴重であろう。

本発明はそのような方法を提供する。詳細には、糖尿病に関連した高血圧を治療するのに、本発明の方法および化合物を適用することができる。例えば、本発明の化合物は、例えばアドレノメデュリンおよび一酸化窒素シンターゼなどの血圧調節因子の発現を増強した（例えば、実施例１２参照）。したがって、一態様では、本発明は、高血圧を軽減または予防することによって、糖尿病を治療または予防する方法を提供する。一態様では、この方法は、例えば被験体のＨＩＦαを安定化することを包含する。本発明は、本発明の化合物、例えばＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する薬剤を被験体に投与することによって、被験体における高血圧を治療または予防する方法をさらに提供する。

協調的治療方法
糖尿病は、並行、重複および／または連続して発症または生じうる様々な有害な状態および作用と関連している。例えば高血圧、血管および循環障害、および肥満は、糖尿病になる危険性を増大させるか、または糖尿病に付随して発症しうる。したがって、そのような様々な危険因子および症候に対し同時に対処できる治療方法は貴重であろう。

本発明はそのような方法を提供する。詳細には、本発明の方法および化合物は、多重効果を実現させるために適用できる。例えば、上述のように、肥満は糖尿病発症の危険因子である。さらに、肥満症は、糖尿病の結果として、例えば特定の治療方法によって、発症しうる。例えば、インスリン療法は、脂肪貯蔵および肥満の増大を導きうる。詳細には、インスリンは脂肪組織内への脂質の取り込みを媒介し、肥満を増大させ、次にはインスリン抵抗性を悪化させる。したがって、本発明は、一態様において、肥満の治療または防止と、インスリン感受性の増強とを、連携した様式で行うことによって、糖尿病を治療または予防する方法を提供する。

本発明の化合物は、血糖値を低下させ（例えば、実施例６を参照）；内臓脂肪または腹部脂肪を減少させ（例えば、実施例９を参照）；解糖系酵素の発現を増大して、これによってインスリン感受性を増強し（例えば、実施例４を参照）；そして、血圧調節因子の発現を増強して（例えば、実施例１２を参照）、これによって身体による血管緊張性の調節を可能にし、正常血圧レベルを維持するか、または、例えば高血圧効果などの、血管緊張性の変動に対抗する。したがって、一態様では、本発明は、糖尿病を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化することによって、血糖値を低下させ、かつ内臓脂肪を減少させる方法を提供する。別の方法は、これに加えて、インスリン感受性を増強することによって、被験体の糖尿病を治療または予防することをさらに含む。別の方法は、これに加えて、血圧調節因子の発現を増強することによって、被験体の糖尿病を治療または予防することをさらに含む。

代謝障害
本発明は、代謝活性を調節する化合物と、この化合物を用いて代謝機能不全に関連した障害または状態を治療する方法とを提供する。そのような障害には、糖尿病、高血糖、および肥満が含まれるが、これらに限定されるものではない。

一態様では、本発明は、上記化合物を用いて糖尿病を予防または治療する方法であって、治療上有効な量の上記化合物またはその薬学的に許容される塩を、単独で、または薬学的に許容される賦形剤と併せて、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、上記化合物は、例えば、グルコースホメオスタシス障害、耐糖能異常、高血糖、糖尿病、または肥満など、素因となる状態に基づいて投与できる。

別の態様では、本発明は、上記化合物を用いて高血糖を予防または治療する方法であって、治療上有効な量の上記化合物またはその薬学的に許容される塩を、単独で、または薬学的に許容される賦形剤と併せて、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、上記化合物は、例えば糖尿病など、高血糖の発症に関連した状態があると診断された患者に投与される。

上記化合物は、他の様々な治療方法と併用して投与することができる。一実施形態では、上記化合物は外来性インスリン、例えば、ヒト組換型インスリンと併用して投与される。

グルコース調節
本発明の方法および化合物は、アルドラーゼの発現を増強した。これらの結果は、本発明の方法および化合物が解糖に関与した遺伝子の発現を調節するのに有用であることを実証した。例えば解糖を増大させることによって、グルコース代謝を調節する方法および化合物を提供する。

本発明は、ＧｌｕＴ−１の発現を増強する方法および化合物を提供する。一態様では、本発明の方法は、グルコース取り込みに関与した因子の発現を調節する。したがって、本発明の方法および化合物は、細胞内へのグルコース輸送を増大させる治療方法を提供する。治療によってグルコース輸送因子をアップレギュレーションすることで、インスリン抵抗性が効果的に低下され、インスリン感受性が増強され、血糖値が低下され、それによって高血糖または糖尿病の患者で有益な効果が生成されよう。

本発明の方法および化合物は、腎臓、肝臓、および肺で、ホスホフルクトキナーゼＰ、ホスホフルクトキナーゼＬ、エノラーゼ１、ＧｌｕＴ−１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、およびヘキソキナーゼ１を含めたグルコース調節因子の発現を増強した。一実施形態では、本発明の方法は、その産物がグルコース取り込みおよび利用に関与する遺伝子の発現を協調的に調節し、それによってグルコース代謝を調節する。治療によるグルコース輸送および利用のアップレギュレーションは、インスリン抵抗性を減少し、インスリン感受性を増強し、血糖値を低下して、それによって高血糖および糖尿病を治療する手段を提供するであろう。

インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）をコードする遺伝子の発現は、本発明の方法および化合物を用いることで、腎臓および肝臓で増強される。高血漿レベルのＩＧＦＢＰ−１は、高インスリン感度と正の相関関係にある。したがって、本発明の方法および化合物は、インスリン感受性を増強し、かつグルコース輸送の促進を提供して、それによってグルコース代謝を調節するのに有用である。治療によるインスリン感受性およびグルコース輸送の増大は、血糖値を減少させ、それによって高血糖および糖尿病を治療する方法を提供するであろう。

本発明は、細胞内へのグルコース取り込みを増強する方法および化合物を提供する。本発明の化合物および方法は、インスリンの存在下でグルコース取り込みを増強するが、これは、本発明の化合物および方法は細胞のインスリン感受性を増強し、その結果、グルコース取り込みの増強と、グルコース調節の変化がもたらされることを示すものである。治療によるインスリン感受性およびグルコース取り込みの増強は、インスリン感受性が減弱している個体、すなわちインスリン抵抗性の個体を治療するのに有用であり、それによって血糖値を低下させ、さらに高血糖および糖尿病を治療する方法を提供する。

本発明の方法および化合物は、組織内でのインスリン刺激性グルコース取り込みを増強するのにも有用である。本発明の方法および化合物を、組織内でのグルコース取り込みを増強して、インスリンに対する感受性を増強するのに用いることができる。グルコース取り込みの増強は、高血糖および糖尿病などでグルコースレベルが高い個体、またはグルコースホメオスタシスを維持または実現できない個体における血糖値を低下させる手段を提供する。したがって、本発明の方法および化合物は、インスリン感受性の増強、グルコース取り込みの増強、および血糖値の低減によって、高血糖および糖尿病を治療するのに有用である。

本発明の化合物で治療された動物は、用量依存的な血糖値の低下を示した。化合物の用量を変化させることによって、血糖値が望ましいレベルに維持された。したがって、一態様では、本発明の化合物および方法は、血糖レベルを調節するのに有用である。別の態様では、本発明の化合物および方法は、血糖値を低下させるのに有用である。したがって、本発明の方法および化合物は、治療によって血糖値を低下させるのに有用である。血糖値を低下させることによって、本発明は高血糖および糖尿病を治療する方法を提供する。

本発明の化合物を投与することによって、食餌誘発性肥満および耐糖能異常の動物モデルにおける、循環からのグルコースクリアランスが改善された。グルコースクリアランスの増強は血糖値を低下させる。したがって、一態様では、本発明の方法は、グルコースクリアランスの増強、または血糖値の低減によって、例えば肥満個体などの耐糖能異常の個体におけるグルコース代謝を調節するのに有用である。別の態様では、本発明の方法および化合物は、耐糖能異常の個体のグルコースホメオスタシスを回復または維持する。治療によるグルコースクリアランスの増強および血糖値の低減は、糖尿病患者および糖尿病になる危険性が高い患者を含めた患者の治療に有用である。

糖尿病の治療
本発明の方法および化合物は、糖尿病の動物モデルにおける血糖値を低下させた。さらに、本発明の方法および化合物は、糖尿病および耐糖能異常の動物モデルにおけるグルコースホメオスタシスを回復および実現した。本発明の化合物の投与によって血糖値が低下したことは、本発明の化合物は、高血糖または糖尿病を罹患している個体における血糖値を治療によって低下させるのに有用であることを示唆する。本発明の化合物および方法は、グルコース代謝を調節することによって、グルコースホメオスタシスを回復、実現、または維持するのに有用である。

動物を本発明の化合物で治療することによって、糖尿病動物モデルにおける糖化ヘモグロビンの蓄積が抑制された。糖化ヘモグロビンレベルには、糖尿病患者、または高血糖の個体における血糖コントロール、およびグルコースホメオスタシスの維持が反映される。糖化ヘモグロビンレベルが低下したことは、本発明の化合物および方法が、個体におけるグルコース調節を改変し、それによってグルコースホメオスタシスを回復、実現、または維持するのに有用であることを示す。したがって、本発明の化合物および方法は、グルコース代謝を調節して、グルコースホメオスタシスを回復、実現、または維持することによって高血糖および糖尿病を治療するのに有用である。

本発明の化合物で治療された動物は、体重増加における用量依存的な遅延を示した。詳細には、用量依存的な内臓脂肪体の減少が、この化合物で治療された動物で観測された。したがって、本発明の化合物および方法は、脂肪貯蔵を低減し、内臓脂肪を減少させるのに有用である。肥満、特に、過剰な内臓脂肪、腹部脂肪、または中央脂肪を伴った肥満は、高血糖および糖尿病の発症に関連している。詳細には、肥満は、インスリン感受性の低下、およびインスリン抵抗性の増大などに関連しており、これらによって高血糖および糖尿病の発症がもたらされる。一態様では、本発明の方法および化合物は、内臓脂肪を減少させることによって、高血糖または糖尿病を発症する危険性を低減する。別の態様では、本発明の方法および化合物は、肥満を軽減することによって、高血糖または糖尿病を発症する危険性を低減する。

医薬製剤および投薬経路
本発明の組成物は、当技術分野で周知なように、直接的に、または賦形剤を含有する医薬組成物中において送達することができる。本発明の治療方法は、代謝障害、特に、例えば糖尿病、高血糖など、グルコース調節に関連した障害の被験体、またはその危険性を有する被験体に、本発明の化合物を有効量、投与することを含みうる。好ましい実施形態では、被験体が哺乳動物被験体であり、最も好ましい実施形態では、被験体がヒト被験体である。

有効量、例えば化合物または薬物の用量は、通常の実験によって容易に決定でき、有効かつ好都合な投与経路および適切な剤形も同様である。様々な剤形および薬物送達系が当技術分野で利用可能である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ編（２０００年）、Remington's Pharmaceutical Sciences、同上；ならびに、Ｈａｒｄｍａｎ、Ｌｉｍｂｉｒｄ、およびＧｉｌｍａｎ編（２００１年）、The Pharmacological Basis of Therapeutics、同上を参照のこと）。

適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、局所、鼻腔内、肺内、眼、腸内、および非経口投与が含まれうる。非経口投与のための主要経路には、静脈内、筋肉内、および皮下投与が含まれる。投与の二次経路には、腹腔内、動脈内、関節内、心臓内、槽内、皮内、病巣内、眼内、胸膜内、髄腔内、子宮内、および脳室内投与が含まれる。治療される徴候、ならびに、薬物の物理的、化学的、および生物学的性質によって、使用される剤形の種類および投与経路が決定され、局所送達および全身送達のどちらが好ましいかも同様である。

本発明の化合物の医薬剤形は、即時放出、制御放出、持続放出、または標的薬物送達系で提供することができる。一般的に使用される剤形には、例えば、溶液および懸濁液、（マイクロ）エマルジョン、軟膏剤、ゲル、パッチ、リポソーム、錠剤、糖剤、軟カプセル剤または硬カプセル剤、坐剤、腟坐薬、インプラント、非晶質または結晶質粉末薬、エーロゾル、および凍結乾燥製剤が含まれる。用いられる投与経路に応じて、薬物の適用または投与に、例えば、注射器および針、吸入器、ポンプ、注射ペン、塗布器、特別なフラスコなどの特別な装置が必要となりうる。医薬剤形は、薬物、賦形剤、および容器／密閉系で構成されることが多い。賦形剤は、不活性成分とも呼ばれるが、薬物の製造、安定性、投与、および安全を改善または促進するために、１つまたは複数の賦形剤を本発明の化合物に添加することができ、それによって望ましい薬物放出プロフィールを実現する方法を提供することができる。したがって、薬物に添加される賦形剤の種類は、例えば薬物の物理的および化学的性質、投与経路、製造手順など、様々な要因に依存しうる。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で利用可能であり、これらには様々な薬局方に記載されているものが含まれる（例えば、ＵＳＰ、ＪＰ、ＥＰ、およびＢＰ、ＦＤＡウェブページ（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ）、Inactive Ingredient Guide、１９９６年、ならびにHandbook of Pharmaceutical Additives、Ａｓｈ編；Synapse Information Resources, Inc.、２００２年を参照）。

本発明の化合物の医薬剤形は、例えば、従来の混合、ふるい分け、溶解、溶融、顆粒化、糖衣剤作成、打錠、懸濁、押出し、スプレー乾燥、研和、乳化、（ナノ／マイクロ）カプセル封入、封入、または凍結乾燥プロセスなど、当技術分野で周知の方法のいずれで製造してもよい。上述のように、本発明の組成物は、活性分子を薬学的使用に供する製剤に加工するのを促進する１つまたは複数の生理的に許容できる不活発な成分を含むことができる。

適切な剤形は、望ましい投与経路に依存する。静脈内注入用には、例えば上記組成物を水溶液中に、必要に応じて、剤形ｐＨを調節するために、例えばリン酸、ヒスチジン、またはクエン酸を含めた生理的に適合した緩衝剤、および例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤を用いて製剤してもよい。経粘膜または鼻腔内投与用には、場合によっては透過増強剤を含有する、半固体、液体製剤、またはパッチが好ましいことがある。そのような湿潤剤は、概して当技術分野で公知である。経口投与用には、上記化合物を、液体または固体剤形に、そして即時または制御／持続放出製剤として製剤できる。被験体による経口摂取用に適切な剤形には、錠剤、錠剤、糖剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。上記化合物は、坐剤および停留浣腸剤など、例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有した直腸用組成物に製剤してもよい。

固形経口投与薬は、賦形剤を用いて得ることができ、賦形剤には、充填剤、崩壊剤、結合剤（乾式および湿式）、溶解抑制剤、潤滑剤、滑沢剤、抗粘着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒａｎｔ）、陽イオン性交換樹脂、湿潤剤、酸化防止剤、保存剤、着色、および矯味剤が含まれうる。これらの賦形剤は、合成原料ものでも、天然原料のものでもありうる。そのような賦形剤の例には、セルロース誘導体、クエン酸、第二リン酸カルシウム、ゼラチン、炭酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム／マグネシウム、マンニトール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ケイ酸化物、二酸化ケイ素、安息香酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、ステアリン酸またはその塩、糖（すなわち、ブドウ糖、スクロース、乳糖など）タルク、トラガント粘滑薬、植物油（硬化油）、およびワックスが含まれる。エタノールおよび水は顆粒化補助剤として機能しうる。ある特定の例では、錠剤を、例えば、味遮蔽フィルム、胃酸耐性フィルム、または遅延放出性フィルムでコーティングすることが望ましい。天然および合成ポリマーは、着色剤、糖、および有機溶剤または水と併用して、しばしば、錠剤をコーティングするのに用いられ、糖衣剤となる。錠剤よりカプセルが好ましい場合には、薬物粉末、懸濁液、またはその溶液は、適合した硬カプセル剤または軟カプセル剤に入れて送達することができる。

一実施形態では、本発明の化合物を、例えば、ゲル、（マイクロ）エマルジョン、軟膏剤、溶液、（ナノ／ミクロ）懸濁液、またはフォームなどの皮膚用パッチ剤、半固形または液体製剤を通して局所的に投与することができる。皮膚およびその下層組織中への薬物の浸透を、例えば、透過増強剤を用いて；水、有機溶剤、ワックス、油、合成ポリマー、天然ポリマー、界面活性剤、乳化剤を含めた親油性、親水性、および両親媒性賦形剤の適切な選択および組合せによって；ｐＨ調節によって；そして、錯形成剤の使用によって、調節することができる。本発明の化合物の皮膚透過性を調節するために、イオン泳動などの他の技法を用いてもよい。例えば、全身曝露を最小にした局所送達が望ましい状況では、経皮または局所投与が好ましいであろう。

吸入による投与、または鼻への投与を行うためには、本発明による使用に供する化合物を、溶液、懸濁液、エマルジョン、または半固体エーロゾルの形態で、気密容器またはネブライザーから、通常、例えばメタンまたはエタンから誘導されたハロゲン化炭素、二酸化炭素、またはいかなる他の適当なガスなどの噴霧剤を使用して送達するのが便利である。局所エーロゾルには、ブタン、イソブテン、およびペンタンのような炭化水素が有用である。加圧されたエーロゾルの場合には、適切な用量単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって、測定してもよい。吸入器またはインサフレーターでの使用用に、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。これらは、通常、上記化合物の粉末混和物および乳糖またはデンプンなどの適当な粉末薬基剤を含有する。

注入による非経口投与用に製剤された組成物は、通常、無菌であり、例えば、アンプル、シリンジ、および注射ペンなどの単位剤形、または多用量用容器で提供することができるが、後者は、通常、保存剤を含有する。上記組成物は、油性または水性媒体による懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ってもよく、また、緩衝剤、等張化剤、薬剤を促進する粘着性や、界面活性剤、懸濁剤、分散剤、酸化防止剤、生体適合ポリマ−、キレート剤、保存剤などの製剤物質を含有してもよい。注入部位に応じて、媒体は、水、合成油、植物油および／または、有機助溶媒を含有してもよい。ある特定の例では、凍結乾燥製剤または濃縮液などを用いて、非経口製剤を、投与前に再構成または希釈してもよい。デポー製剤は、本発明の化合物の制御放出または持続放出を提供するが、これには、ナノ／マイクロ粒子の注入可能懸濁液、またはナノ／マイクロもしくは非微粒化結晶が含まれうる。ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはその共重合体などのポリマーは、当技術分野で周知の他のものに加えて、調節／持続放出性マトリクスとして使用することができる。他のデポー送達系は、インプラントと切開を必要としたポンプの形態で提供されうる。

本発明の分子の静脈内注入に適した担体は当技術分野で周知あり、これには、例えば水酸化ナトリウムなどのイオン化化合物を形成する塩基、しょ糖、または塩化ナトリウム、等張化剤として、例えばリン酸またはヒスチジンを含有する緩衝剤を含有する水性溶液が含まれる。例えば、ポリエチレングリコールなどの助溶媒を添加してもよい。これらの水性基剤系は、本発明の化合物を溶解するのに有効であり、全身性投与の際に生じる毒性が少ない。溶液系における構成成分の比率は、溶解性および毒性特性を破壊することなく、かなり変動させることができる。さらに、構成成分の種類も多様でありうる。例えば、ポリソルベートまたはポロキサマーなどの低毒性界面活性剤を用いてもよく、ポリエチレングリコールまたは他の助溶媒を使用することもでき、ポリビニルピロリドンなどの生体適合ポリマーを添加してもよく、また、ブドウ糖の代わりに他の糖およびポリオールを用いてもよい。

本発明の治療方法に有用な組成物の治療上有効な量は、まず当技術分野で周知の様々な技法を用いて推算することができる。動物実験で用いられる初期量は、細胞培養アッセイで定めらた実効濃度に基づいたものでもよい。例えば、動物実験および細胞培養アッセイから得られたデータを用いて、ヒト被験体に適切な用量範囲を決定することができる。

本発明の化合物、物質、または薬物の治療上有効な用量または量とは、被験体における、症候の改善または延命もたらす化合物、物質、または薬物の量または用量を指す。そのような分子の毒性および有効性は、細胞培養または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）の測定など、標準的な薬学手法を行うことで決定できる。治療効果をもつ用量に対する毒性作用をもつ用量の比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比率として計算できる。高い治療係数を示す薬剤が好ましい。

有効量または治療上有効な量は、組織、システム、動物、またはヒトにおける、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が求める生物学的または医学的反応、例えば、グルコース代謝調節、増大した血糖値または高血糖値の低下、例えば糖尿病など、グルコース代謝の改変に関連した障害の治療または防止を引き起こすであろう化合物または医薬組成物の量である。

用量は、毒性がないか、またはほとんどないＥＤ５０を含んだ循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および／または投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路、用量、および投与間隔は、当技術分野で公知の方法に従って、被験体の状態の詳細を考慮して選択されるべきである。

投薬量および間隔は、例えば、グルコース代謝調節、血糖値の低下などの所望の効果を実現するのに十分な、活性部分の血漿中レベル、すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を提供するように個別に調整してもよい。ＭＥＣは、各化合物によって異なるであろうが、例えば、インビトロデータおよび動物実験から推算できる。ＭＥＣを実現するのに必要な用量は、個別の特性と投与経路とに依存するであろう。局所投与または選択的摂取の場合では、薬物の有効局所濃度が血漿中濃度とは関係ないことがある。

投与される薬剤または組成物の量は、治療される被験体の性別、年齢、および体重、疾患の重篤度、投与方法、ならびに処方する医師の判断を含めた様々な因子に依存しうる。

本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有したパックまたは調剤装置に入れて提供してもよい。そのようなパックまたは装置は、例えば、ブリスター包装などの金属もしくはプラスチックホイル、またはバイアルなどにおけるガラス栓およびゴム栓などを含んでもよい。このパックまたは調剤装置には、投与用の説明書が付随してももよい。適合した薬学的担体中に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製し、適当な容器内に配置し、そして、示された状態の治療用に標識することもできる。

化合物およびそのスクリーニング方法
本発明の化合物は、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物であり、詳細には、上記ヒドロキシラーゼ活性は２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性である。上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ酵素の活性であることがより好ましい。上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ酵素の活性であることが最も好ましい。

本発明の方法は、ＨＩＦαの安定化に基づいて、被験体における特定の結果を実現する方法である。本発明の方法は、その被験体のＨＩＦαを安定化し、特定の結果を実現するために、化合物を投与することで実行されることが好ましい。これらの方法は、本発明の化合物を投与して実行されることが最も好ましい。

本発明の化合物は、ＨＩＦαの安定化に関する本発明の方法において、例示的に使用される。詳細には、本発明は、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性および／またはＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害する化合物、ＨＩＦαを安定させる化合物などをさらにスクリーニングして、同定するための方法および化合物を提供する。本発明の化合物には、ヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物が含まれ、好ましくは上記ヒドロキシラーゼ活性が２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素の活性であり、また、より好ましくは上記ヒドロキシラーゼ活性がＨＩＦヒドロキシラーゼの活性である。上記ＨＩＦヒドロキシラーゼは、ＨＩＦタンパク質、好ましくはＨＩＦαサブユニットにおける、例えばプロリン残基およびアスパラギン残基などを含めた、いずれのアミノ酸をヒドロキシル化するものでもよい。特に好ましい実施形態では、上記ヒドロキシラーゼ活性は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼおよび／またはＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼの活性である。

２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ活性の阻害剤は当技術分野で公知である。例えば、プロコラーゲンプロピル４−ヒドロキシラーゼの小分子阻害剤がいくつか同定されている（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８４年）、Eur J Biochem、第１３８巻、２３９〜２４５ページ；Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ（１９９８年）、Matrix Biol、第１６巻、３５７〜３６８ページ；Ｂｉｃｋｅｌら（１９９８年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２８巻、４０４〜４１１ページ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２０００年）、Proc Natl Acad Sci USA、第９７巻、４７３６〜４７４１ページ；ならびにＦｒａｎｋｌｉｎら（２００１年）、Biochem J、第３５３巻、３３３〜３３８ページを参照；これらすべてを参照により全体として本明細書に組み込む）。ＨＩＦヒドロキシラーゼの小分子阻害剤も同定されている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０７４９８１号、第ＷＯ０３／０４９６８６号、および第ＷＯ０３／０８０５６６号を参照；これらすべてを参照により全体として本明細書に組み込む）。本発明は、これらの化合物、および当技術分野で公知の方法を用いて同定可能な他の化合物の使用を特に企図する。

２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼファミリーにおけるすべての酵素が、それらのヒドロキシラーゼ活性に酸素、Ｆｅ^２＋、２−オキソグルタル酸、およびアスコルビン酸を必要とする。（例えば、Ｍａｊａｍａａら（１９８５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、第２２９巻、１２７〜１３３ページ；ＭｙｌｌｙｈａｒｊｕおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９７年）、ＥＭＢＯ Ｊ、第１６巻、１１７３〜１１８０ページ；Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら（１９９３年）、３２巻、１４０２３〜１４０３３ページ；ならびにＪｉａら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１巻、７２２７〜７２３１ページを参照）。したがって、本発明の化合物には、鉄キレート剤、２−オキソグルタル酸ミメティック、および、例えばプロリンまたはアスパラギンの修飾アミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施形態では、本発明は、２−オキソグルタル酸の構造ミメティックの使用を提供する。そのような化合物は、標的の２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ酵素を、２−オキソグルタル酸に関しては競合的に、そして鉄に関しては非競合的に阻害しうる（Ｍａｊａｍａａら（１９８４年）、同上；およびＭａｊａｍａａら（１９８５年）、同上）。例えば、参照によりすべて本明細書に全体として組み込まれているＭａｊａｍａａら、同上；ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ（１９９８年）、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ、第１６巻、３５７〜３６８ページ；Ｂｉｃｋｅｌら（１９９８年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２８巻、４０４〜４１１ページ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら（２０００年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９７巻、４７３６〜４７４１ページ；Franklin（１９９１年）、Biochem Soc Trans、第１９巻、８１２〜８１５ページ；Ｆｒａｎｋｌｉｎら（２００１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、第３５３巻、３３３〜３３８ページ；ならびに国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号に記載された化合物が特に企図される。

例示的化合物には、限定されるものではないが、米国特許第５，９１６，８９８号および第６，２００，９７４号、ならびに国際公開第第ＷＯ９９／２１８６０号に記載のものを含めたフェナントロリン；限定されるものではないが、例えば米国特許第５，７１９，１６４号および第５，７２６，３０５号に記載の置換キノリン−２−カルボキシアミドおよびそのエステルを含めた複素環式カルボニルグリシン；例えば米国特許第６，０９３，７３０号に記載の置換イソキノリン−３−カルボキシアミドおよびそのエステル；例えば欧州特許第０６５０９６１号および米国特許第５，６５８，９３３号に記載の３−メトキシピリジンカルボニルグリシンおよびそのエステル；例えば米国特許第５，６２０，９９５号および第６，０２０，３５０号に記載の３−ヒドロキシピリジンカルボニルグリシンおよびそのエステル；例えば米国特許第５，６０７，９５４号、第５，６１０，１７２号、および第５，６２０，９９６号に記載の５−スルホンアミドカルボニルピリジンカルボン酸およびそのエステルが含まれる。これらの特許に記載されたすべての化合物、特に、化合物請求項に記載された化合物、および実施例における最終産物を、この参照により本明細書に組み込む。

したがって、本発明の好ましい化合物には、例えば、複素環式カルボキシアミドが含まれる。特に好ましい複素環式カルボキシアミドには、例えばイソキノリン、キノリン、ピリジン、シンノリン、カルボリン誘導体などが含まれる。加えて、好ましい化合物の構造クラスには、アントラキノン、アザフルオレン、アザフェナントロリン、ベンゾイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンゾチオフェン、カテコール、クロマノン、α−ジケトン、フラン、Ｎ−ヒドロキシアミド、Ｎ−ヒドロキシ尿素、イミダゾール、インダゾール、インドール、イソチアジアゾール、イソチアゾール、イソオキサジアゾール、イソオキサゾール、α−ケト酸、α−ケトアミド、α−ケトエステル、α−ケトイミン、オキサジアゾール、オキサリルアミド、オキサゾール、オキサゾリン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピリダジン、ピリジン、キナゾリン、フェナントロリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チアゾリン、チオフェン、およびトリアゾールが含まれる。

次の例示的化合物が、本明細書に記載された本発明の方法を実証するのに本発明の実施例で用いられた。すなわち、［（７−クロロ−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ａ）、［（１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｂ）、［（４−ヒドロキシ−７−フェノキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｃ）、４−オキソ−１，４−ジヒドロ−［１，１０］フェナントロリン−３−カルボン酸（化合物Ｄ）、［（１−クロロ−４−ヒドロキシ−７−メトキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｅ）、［（３−ヒドロキシ−６−イソプロポキシ−キノリン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｆ）、［（３−ヒドロキシ−ピリジン−２−カルボニル）−アミノ］−酢酸（化合物Ｇ）、および［（７−ベンジルオキシ−１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボニル）−アミノ］−酢酸メチルエステル（化合物Ｈ）である。

本発明の化合物、すなわちヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を同定するのに、以下に記載するものを含めた様々なアッセイおよびスクリーニング技術を用いることができる。これらの化合物は、本発明の方法での使用に適している。当業者ならば利用可能なアッセイおよびスクリーニング法を用いて、本発明の方法での使用に適した他の化合物、すなわちＨＩＦαを安定化する化合物を同定できる。

通常、アッセイは、反応基質の消費または反応生成物の生成に付随した検出可能なシグナルを提供するであろう。検出には、例えば、蛍光色素、放射性同位元素、酵素結合体、および他の当技術分野で周知の検出可能な標識を用いることができる。結果は、定性的でも、定量的でもよい。反応生成物の単離は、ビオチンまたはヒスチジン標識など、沈殿またはアフィニティクロマトグラフィーを介して他の反応成分からの精製を可能にする標識によって促進されてもよい。

ヒドロキシラーゼ活性のアッセイは、当技術分野において標準的なものである。そのようなアッセイは、直接的に、または間接的にヒドロキシラーゼ活性を測定することができる。例えば、アッセイは、例えば酵素基質、標的タンパク質、合成ペプチドミメティック、またはその断片中に存在する、ヒドロキシル化された、例えばプロリン、アスパラギンなどの残基を測定することができる（例えば、Ｐａｌｍｅｒｉｎｉら、（１９８５年）、J Chromatogr、第３３９巻、２８５〜２９２ページ参照）。化合物の存在下におけるヒドロキシル化プロリンまたはアスパラギンの減少は、ヒドロキシラーゼの活性を阻害する化合物であることを示すものである。別法として、アッセイは、ヒドロキシル化反応の他の産物、例えば２−オキソグルタル酸からのコハク酸の生成を測定することもできる（例えば、Ｃｕｎｌｉｆｆｅら（１９８６年）、Biochem J、第２４０巻、６１７〜６１９ページを参照）。ＫａｕｌｅおよびＧｕｎｚｌｅｒ（１９９０年；Anal Biochem、第１８４巻、２９１〜２９７ページ）は、２−オキソグルタル酸からのコハク酸の生成を測定する例示的操作法を記載する。

ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性をモジュレートする化合物を同定するのに、上述のものなどの操作法を用いることができる。例示的な操作法を実施例１４（下記）に記載する。標的タンパク質には、ＨＩＦαまたはその断片、例えばＨＩＦ（５５６〜５７５）；例えば、実施例１４に記載するアッセイでの使用に供された例示的基質であるＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号５）が含まれうる。酵素には、例えばＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ３３９６５などを参照）、またはＨＩＦアスパラギニルヒドロキシラーゼ（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ２７３０８などを参照）が含まれ、いかなる供給源から入手したものでもよい。酵素は、未精製細胞溶解液または部分的に精製された形態で存在していてもよい。例えば、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を測定するか、または間接的に測定する操作法は、Ｉｖａｎら（２００１年、Science、第２９２巻、４６４〜４６８ページ；２００２年、Proc Natl Acad Sci USA、第９９巻、１３４５９〜１３４６４ページ）、およびＨｉｒｓｉｌａら（２００３年、J Biol Chem、第２７８巻、３０７７２〜３０７８０ページ）に記載されており；別の方法が国際公開第ＷＯ０３／０４９６８６号に記載されている。化合物の非存在下および存在下における酵素活性を測定し、比較することによって、ＨＩＦαのヒドロキシル化を阻害する化合物が同定されよう。

ＨＩＦαの安定化および／またはＨＩＦ活性化のアッセイでは、試料中にあるＨＩＦαの直接測定（例えば、下記の実施例１４を参照）、例えば、フォンヒッペルリンダウタンパク質と会合したＨＩＦαの減少を測定すること（例えば、国際公開第ＷＯ００／６９９０８号参照）によるＨＩＦαの間接的測定、またはＨＩＦ反応性標的遺伝子もしくはレポーター構築物の活性化（例えば、米国特許第第５，９４２，４３４号を参照）を行う。この化合物の非存在下および存在下におけるＨＩＦおよび／またはＨＩＦ反応性標的タンパク質のレベルを測定し、比較することによって、ＨＩＦαを安定化する化合物および／またはＨＩＦを活性化する化合物が同定されよう。

ヒドロキシル化に共役した２−オキソ［１−^１４Ｃ］グルタル酸の脱炭酸をベースにしたアッセイを用いて、ＨＩＦ特異的なプロリルヒドロキシラーゼ活性をモジュレートする化合物を同定することができる（Ｈｉｒｓｉｌａら（２００３年）、J．Biol．Chem.、第２７８巻、３０７７２〜３０７８０ページを参照）。反応は、内在性ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼまたは組換え型ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを発現する細胞から得た、例えばトリトン−Ｘ−１００などの界面活性剤で可溶化した細胞抽出物１０〜１００μＬ；例えばＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号５）などの基質ペプチド０．０５μｍｏｌ；ＦｅＳＯ_４ ０．００５μｍｏｌ、２−オキソ［１−^１４Ｃ］グルタル酸 ０．１６μｍｏｌ、アスコルビン酸 ２μｍｏｌ、カタラーゼ ６０μｇ、ジチオトレイトール０．１μｍｏｌ、および２５℃でｐＨ７．８に調整されたトリス−ＨＣｌ緩衝液５０μｍｏｌを含有する１．０ｍｌの反応体積で行われる。酵素反応は、３７℃で２０分間行う。反応によって生成された^１４ＣＯ_２を、反応混合物上の雰囲気に懸垂した塩基含浸濾紙に捕捉し、シンチレーションカウンターで測定する。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当業者ならば容易に想起されよう。

本発明は、本発明を例示することのみを意図する以下の実施例を参照にすることで、さらに理解されよう。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載する発明を例証することのみのために提供する。実施形態は本発明の一態様のみの例示として意図されており、本発明の範囲は、例示された実施形態によって限定されない。機能上等価であるいかなる方法も本発明の範囲に包含される。当業者には、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、以上の記述および添付の図から明らかになるであろう。そのような変更も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものである。

試験物質
本発明の方法で使用されるプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤を代表する化合物は、当業者に公知である標準的な化学的方法によって合成した。化合物は、高速液体クロマトグラフィーで純度を分析し、光から保護しながら室温で保存した。様々な用途のために製剤する間、均一粒径を促進するために、化合物を、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ ７平床式マイクロミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ ＧＭＢＨ社、独国）を用いて、懸濁液中、７５０ｒｐｍで２０分間かけて微粉化した。

強制経口投与用の微粉化化合物の懸濁液は、使用直前に調製した。化合物は、０．５％ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｇａｒｄｅｎａ ＣＡ）、および０．１％ポリソルベート８０（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ社、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ ＮＪ）を含有する水溶液に懸濁し、用量投与（dose administration）中にはマグネチックスターラまたは回転振盪機を用いて定常的に撹拌した。懸濁液の濃度は、所与の体積において意図した用量レベルが実現するように計算した。別法として、化合物は、重量を計量し、適切な大きさの経口投与用ゼラチンカプセル中に入れるか（この場合対照動物には同じ大きさの空のカプセルを与えた）、または化合物を１００ｍＭヒスチジン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ社）溶液に溶解して、水の代わりに自由に提供した。

注入による投与用には、最初に、化合物を等モル量の水酸化ナトリウムと、１０％グルコース（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社）または塩化ナトリウムと化合した２５ｍＭヒスチジン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ社）の等張水溶液中で混合した。

グルコース調節因子のインビトロでの発現の増大
グルコース調節および代謝に関与するタンパク質および遺伝子の発現に対する本発明の化合物の影響は以下の通りである。ヒト２９３Ａ細胞（アデノウイルスによって形質転換した胎児腎臓上皮）を３５ｍｍ培養皿中に集密状態にまき、５％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、１０％ＣＯ_２で１日間培養した。培地をＯｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉに変え、さらに１８から２４時間インキュベーションを続けた。その後、ビヒクル対照または化合物Ｂを培地に添加し、細胞をさらに２４時間、４８時間、または７２時間インキュベートした。プレートを氷上に置き、培養上清を除去し、溶解緩衝液１（ＬＢ−１：１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ ＩＧＥＰＡＬ）を添加した。細胞溶解物を掻きとって採取し、氷上で１５分間インキュベートし、その後４℃、３０００ｘｇで、５分間、遠心して分画した。サイトゾル画分である上清を回収し、サイトゾルタンパク質を、還元条件下で、１レーンあたりに添加するタンパク質を等量にして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離した。

１５０Ｖで２時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、その後、タンパク質のＰＶＤＦ膜上への転写を、４℃、４００ｍＡで、１．５時間かけて行った。膜をブロッキング緩衝液中で、２時間、または終夜インキュベートし、Ｔ−ＴＢＳで１回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液中に実効濃度に希釈した抗アルドラーゼ抗体を添加した。穏やかに撹拌しながら、４℃で終夜インキュベートした後、膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した複合化二次抗体と室温で１時間インキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、Ｘ線フィルムとＥＣＬ ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＷＥＳＴ ＦＥＭＴＯまたはＰＩＣＯ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とをメーカーの指示に従って使用して、現像および可視化を行った。

図１Ａに見られるように、アルドラーゼ発現は、化合物Ｂで２４、４８、および７２時間、処置した細胞において時間の経過と共に増大し、一方、ビヒクル対照で処置した培養物はアルドラーゼ発現の増大を示さなかった。化合物Ｂで処置した培養物は、βチューブリン発現の増大を示さなかったが、これはアルドラーゼの増大が特異的であり、タンパク質発現の全般的な増大を伴っていないことを示すものである。

これらの結果は、本発明の化合物および方法が、解糖に関与する遺伝子発現の調節に有用であることを示し、本発明の化合物による処置が、解糖を促進することによってグルコース利用および代謝を増大させることを示唆した。

グルコーストランスポーター（ＧｌｕＴ）−１のインビトロでの発現の増大
ヒトＳＳＣ−２５（扁平上皮細胞癌）またはラットＨ９ｃ２（心室心筋細胞）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中、１０％ＣＯ_２、３７℃において、１００ｍｍ培養皿中で集密状態に増殖させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ビヒクル対照、化合物Ｄ（１０および２５μＭ）、または化合物Ｃ（５、１０、および２０μＭ）と１６時間インキュベートした。プレートを氷上に置き、培養上清を除去し、溶解緩衝液１（ＬＢ−１：１０ｍＭトリスｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ＩＧＥＰＡＬ）を添加した。細胞溶解物を掻きとって採取し、氷上で１５分間インキュベートし、その後４℃、３０００ｘｇで、５分間、遠心した。サイトゾル画分である上清を回収し、サイトゾルタンパク質を、還元条件下で、１レーンあたりに添加するタンパク質を等量にして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離した。

１５０Ｖで２時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、その後、タンパク質のＰＶＤＦ膜上への転写を、４℃、４００ｍＡで、１．５時間かけて行った。膜をブロッキング緩衝液中で、２時間、または終夜インキュベートし、Ｔ−ＴＢＳで１回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液中に実効濃度に希釈した抗ＧｌｕＴ−１抗体（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を添加した。穏やかに撹拌しながら、４℃で終夜インキュベートした後、膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した複合化二次抗体と室温で１時間インキュベートした。膜をＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、Ｘ線フィルムとＥＣＬ ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＷＥＳＴ ＰＩＣＯ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とをメーカーの指示に従って使用して、現像および可視化を行った。

図１Ｂに示すデータは、グルコース取り込みを媒介する主要な誘導性グルコーストランスポーターであるＧｌｕＴ−１のタンパク質レベルが、化合物Ｄおよび化合物Ｃの両方によって、それぞれＳＣＣ−２５およびＨ９ｃ２細胞で増大したことを示す。本発明の化合物および方法によって、細胞におけるＧｌｕＴ−１発現を増強できることは、グルコース取り込みに対する化合物の効果をインビトロで検査する手段を提供するものである。これらの結果は、本発明の化合物および方法が、グルコース取り込みに関与するタンパク質の発現を増強するのに有用であり、したがって、特に高血糖、糖尿病、またはグルコースホメオスタシス調節における他の欠陥を有する患者において、グルコース取り込みを促進し、血糖値を低下させる治療方法を提供することを示した。

グルコース調節因子のインビボでの発現の増大
遺伝子誘導の経時パターンを測定するために、２４匹のオスのスイスウェブスターマウス（３０〜３２ｇ）をＳｉｍｏｎｓｅｎ社から入手し、これらに０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）（０ｍｇ／ｋｇ／日）または１．２５％化合物Ｂ（０．５％ＣＭＣ中に２５ｍｇ／ｍｌ）（１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、４ｍｌ／ｋｇの体積で強制経口投与する処置を行った。最終投与の４、８、１６、２４、４８、または７２時間後に、動物をイソフルランで麻痺にかけた。その後マウスを犠牲にし、腎臓、肝臓、脳、肺、および心臓の組織試料を単離し、ＲＮＡＬＡＴＥＲ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中に−８０℃で保存した。

本発明の化合物の用量反応性を調査するために、１２匹のオスのスイスウェブスターマウス（３０−３２ｇ）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ社（Ｇｉｌｒｏｙ ＣＡ）より入手）に、０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、化合物Ｄ（０．５％ＣＭＣ中に２５ｍｇ／ｍｌ）（１００ｍｇ／ｋｇ／日）、または化合物Ｂ（０．５％ＣＭＣ中に７．５および２５ｍｇ／ｍｌ）（それぞれ、３０および１００ｍｇ／ｋｇ／日）を、４ｍｌ／ｋｇの体積で１日に１回強制経口投与する処置を４日間行った。最終投与の４時間後に、動物に麻酔をかけ、屠殺し、約１５０ｍｇの肝臓および各腎臓を摘出し、ＲＮＡＬＡＴＥＲ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中に−２０℃で保存した。

次のプロトコールを用いて、上述の実験で得た組織からＲＮＡを単離した。各器官から５０ｍｇの切片を切り取り、ＲＬＴ緩衝液（ＲＮＥＡＳＹキット；Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）８７５μｌを添加し、この断片を、ローター／ステーターＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ ＯＨ）を用いて約２０秒間ホモジナイズした。不溶性物質をペレットにするためにホモジネートを３分間、微量遠心し、上清を新しいチューブに移し、メーカーの指示に従ってＲＮＥＡＳＹキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用することで、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを８０μＬの水で溶出し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を用いて定量した。その後、メーカーの指示に従ってＤＮＡ−ＦＲＥＥキット（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いることでＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去した。２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの純度および濃度を決定した。

別法では、組織試料を切り出し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）中で、ローター／ステーターＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを室温に戻し、０．２体積のクロロホルムを添加し、試料を激しく撹拌した。混合物を室温で数分間インキュベートし、その後、４℃、１２０００ｇで、１５分間、遠心した。水相を収集し、０．５体積のイソプロパノールを添加した。試料を混合し、室温で１０分間インキュベートし、４℃、１２０００ｇで１０分間、遠心した。上清を除去し、ペレットを７５％ＥｔＯＨで洗浄し、４℃、７５００ｇで５分間、遠心した。その後、メーカーの指示に従ってＤＮＡ−ＦＲＥＥキット（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いることでＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去した。２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの純度および濃度を決定した。

ＲＮＡは、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、５０ｎｇ／ｍｌグリコーゲン、および２．５体積のエタノール中において、−２０℃で１時間沈殿させた。試料を遠心分離し、ペレットを８０％冷エタノールで洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁した。二本鎖ｃＤＮＡは、メーカーの指示に従って、Ｔ７−（ｄＴ）２４第１ス鎖プライマー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）と、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＣＨＯＩＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて合成した。最終ｃＤＮＡは、ＰＨＡＳＥ ＬＯＣＫ ＧＥＬインサート（Ｂｒｉｎｋｍａｎ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を用いて、等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール２５：２４：１で抽出した。水相を収集し、０．５体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２．５体積のエタノールとを用いてｃＤＮＡを沈殿させた。別法では、メーカーの指示に従ってＧＥＮＥＣＨＩＰサンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用することで、ｃＤＮＡを精製した。

ビオチン標識ｃＲＮＡは、メーカーの指示に従ってＢＩＯＡＲＲＡＹ ＨＩＧＨＹＩＥＬＤ ＲＮＡ転写物ラベリングキット（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ ＮＹ）を使用することで、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）反応によってｃＤＮＡから合成した。最終標識産物は、メーカーの指示に従ってＧＥＮＥＣＨＩＰサンプルクリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用することで精製および断片化した。

ハイブリダイゼーションカクテルは、５μｇのプローブを１ｘハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ［Ｎａ^＋］、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、０．０３ｎＭ対照オリゴＢ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および１ｘＧＥＮＥＣＨＩＰ真核細胞ハイブリダイゼーション対照（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に希釈して１００μｌにすることで調製した。このカクテルを、９９℃で５分間、そして４５℃で５分間、順次にインキュベートし、その後５分間、遠心した。マウスゲノムＵ７４ＡＶ２アレイ（ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を室温にし、その後、回転させながら１ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で、４５℃、１０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、この緩衝液をハイブリダイゼーションカクテル８０μｌで置換し、カウンタバランスを用いて、４５℃、６０ｒｐｍで１６時間、アレイのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、アレイを６ｘＳＳＰＥ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、その後、洗浄し、メーカーのｍｉｃｒｏ＿１ｖ１プロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に従って、Ｒフィコエリトリン結合ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）と、ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）と、ＧＥＮＥＣＨＩＰ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００測定器（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とを使用することによって染色した。アレイは、ＧＥＮＥＡＲＲＡＹスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）とを用いて分析した。

マウスゲノムＵ７４ＡＶ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）は、マウスＵｎｉＧｅｎｅデータベースビルド７４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）における、機能上の特徴決定を行った全配列（約６０００）と、未解明の約６０００のエクスプレスドシーケンスタグ（ＥＳＴ）クラスタとを表すものである。

図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示すように、グルコース調節に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が、化合物Ｂによる処置の後で、協調的に増強された。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに示された転写産物パターンには、血小板型ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）−Ｐ（Ａ）、肝臓型ＰＦＫ−Ｌ（Ｂ）、エノラーゼ１（Ｃ）、グルコーストランスポーター（ＧｌｕＴ）−１（Ｄ）、乳酸デヒドロゲナーゼ１（Ｅ）、アルドラーゼ１（Ｆ）、およびヘキソキナーゼ１（Ｇ）が含まれる。タイムコースでは、ほとんどのｍＲＮＡレベルが、化合物の投与後の早期にピークに達し、その後２４から４８時間後に対照レベルに戻った。さらに、解糖系酵素をコードする遺伝子の発現は、異なった器官相互で同様なものであったが、腎臓（図２Ａ）、肝臓（図２Ｂ）、および肺（図２Ｃ）では、相対的な発現レベルにおける増大と、特定のｍＲＮＡにおける増大の持続時間との両方で相違を示した。これらの相違は、それぞれの組織において極めて重要なエネルギー供給源が、特にストレス時に、どの程度、解糖活性によって提供されるかの相違に一部関係する。これらの結果は、本発明の化合物が解糖効果を特異的に誘導すること、および、これらの効果には組織によって相違がありうることを示した。

図３Ａに示すように、低用量（３０ｍｇ／ｍｌ）または高用量（１００ｍｇ／ｍｌ）の化合物Ｂで処置することによって、腎臓におけるＧｌｕＴ−１をコードする遺伝子の発現が用量依存的に改変された。この場合のＧｌｕＴ−１発現の増大は、血糖値を細胞によるグルコース取り込みを促進することによって調節しうる機構を提供するものである。図３Ｂに示すように、化合物Ｂによる処置によって誘導されたＩＧＦＢＰ−１発現は、腎臓および肝臓において、時間的にはほとんど同じであるが、一方の組織を他の組織と比較した場合、定量的には発現レベルに相違があった。ＩＧＦＢＰ−１は、インスリン様成長因子の輸送を促進し、ＩＧＦＢＰ−１の循環レベルの増大は、インスリンの感受性およびグルコース有効性の増強と同様に、例えば、耐久性訓練に関連している（例えば、Ｍａｎｅｔｔａら（２００３年）、Metabolism、第５２巻、８２１〜８２６ページ）。したがって、本発明の化合物は、血中グルコース取り込みの直接的媒介因子と、血糖およびグルコース調節のホルモン性調節因子に対する間接的な効果とを特異的に誘導することができる。

グルコース取り込みの増大
インスリン抵抗性は、身体におけるインスリンに応答する能力の低下である。インスリン抵抗性、またはインスリン感受性の低下は、高血糖、糖尿病、および高インスリン血症を伴うことが多い。インスリン抵抗性の低下、またはインスリン感受性の増強は、以下の通り、本発明の化合物を投与した後にグルコース取り込みを測定することで判定される。

グルコース取り込みに対する本発明の化合物の作用をインビボで測定するために、ＤＩＯ（食餌誘発性肥満）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に高脂肪食を４週間与え、肥満およびインスリン抵抗性を誘導した。別法として、ＺＤＦラット、または他のいかなる２型糖尿病遺伝モデルを用いてもよい。動物は、処置群および対照群に分割した。処置した動物には、高脂肪食摂取を継続しながら、１０日間、化合物を与えた。１０日後に、絶食された動物に、頚静脈、けい動脈、および大腿部カテーテルを、全身麻酔の下で装着した。血漿中グルコースを基礎濃度に維持するのに十分な速度で、インスリンおよび１０％グルコースを持続注入することによって、インスリン抵抗性を定量する標準的な方法である高インスリン血症−正常血糖クランプ法を行った。血液試料を採取して、血糖値をモニターし、グルコース注入速度が適切に調整されるようにした。

正常血糖定常状態下では、グルコース注入速度が体の全組織によるグルコース取り込みと等しく、したがって、組織インスリン感受性の尺度となる。基底時およびインスリン刺激時における全身グルコース代謝回転を推算するために、［３−^３Ｈ］グルコースを、クランプ操作法前および定常状態中に注入した。定常状態グルコースレベルがいったん実現されれば（約６０〜７５分）、２−デオキシ−Ｄ−［１−^１４Ｃ］グルコースをボーラス投与して、個々の組織におけるインスリン刺激時のグルコース取り込みを推算する。ボーラス注入の１、３、５、１０、２０、３０、および４５分後に、グルコースおよびトレーサ濃度を測定するために血液試料を採取した。特定組織のグルコース取り込みは、安楽死の１２０分間後に採取した組織試料で測定した。これらの方法は、当業者にとって周知のものである。

本発明の化合物で動物を処置することによって、インスリン感受性の増強と、インスリン抵抗性の低減とを介して、筋肉および肝臓などの組織でグルコース取り込みが増大した。本発明の化合物を投与した後にグルコース取り込みが増大したことは、インスリン抵抗性の患者、またはインスリン感受性が低下もしくは欠損している患者において、インスリン抵抗性を治療法によって低減させ、インスリン感受性を増強するのに、本発明の化合物が有用であることを示すものである。したがって、本発明の方法および化合物は、高血糖、糖尿病、またはグルコースホメオスタシスの調節における他の欠陥を有する患者において、グルコース取り込みをインビボで増強し、血糖値を低下させる。

血糖値の用量依存的な低下
血糖値に対する化合物投与の効果を、以下の通りに検査した。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ社から入手した５０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６〜７週齢）に、０．５％ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、または２０、６０、１００もしくは２００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物Ｂを、１日に１回強制経口投与によって連続して１４日間投与した。体重および明白な毒性の徴候における変化、ならびに死亡率に関して動物をモニターした。１５日目に、水を自由に利用可能な状態で終夜絶食させた後、イソフルランで動物を麻痺にかけ、腹腔を開き、下大静脈から血液を採取した。約１ｍｌの一試料を血液分析用にＥＤＴＡを含有するチューブに採取し、約１ｍｌの第２の試料を血清化学分析用に抗凝血物質を含まないチューブに採取した。血液サンプル分析は、ＩＤＥＸＸ社（Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）が行った。

図４に示すように、本発明の化合物で処置した動物が用量依存的に血糖値の低下を示すことが、２回の別々の実験で示された。化合物の用量と血糖値との関係は、本発明の方法および化合物を適切な投与量で用いることで、血糖値が望ましいレベルに維持されることを示唆した。したがって、本発明の化合物および方法は、血糖値を調整するのに、そして特に低下させるのに有用である。さらに、本発明の方法および化合物は、被験体の血糖値を治療によって低下させるのに有用であり、この場合、被験体は、例えば、高血糖または糖尿病など、グルコース調節障害を有する。

食餌誘発性２型糖尿病動物モデルにおける耐糖能の増大
高脂肪食を与えられたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、重度の肥満、高血糖、および高インスリン血症を発症し、食餌誘発性肥満、２型糖尿病、および耐糖能異常のモデルとされている。４０匹のオスＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から入手し、次の実験群に分割した。群１：標準的なマウス固形飼料を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群２：標準的なマウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｅを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）；群３：高脂肪マウス固形飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ社から入手した４５％脂肪飼料）を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群４：高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｅを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）。この食餌計画を、体重および食物消費を毎日測定しながら１４日間継続した。その後、動物を４時間絶食させ、２ｇグルコース／ｋｇ体重のグルコース負荷を用いて、腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。グルコース投与の０、１５、３０、６０、および９０分後に、血糖値測定用の血液試料を採取した。

図５Ａに示すように、標準的固形飼料を与えられたマウスは、化合物投与を受けたマウス（ＲｘＣｈｏｗ）も、受けなかったマウス（ＶｅＣｈｏｗ）も、ほぼ同じ速度でグルコースクリアランスを行ったが、これは高脂肪固形飼料を与えられ、化合物による処置を受けたマウス（ＲｘＨＦ）と実質的に同じ速度であった。しかし、高脂肪固形飼料を与えられ、化合物投与を受けなかったマウスは、他のいずれの群よりも遅い速度でグルコースクリアランスを行った。標準的な固形飼料を与えられ、化合物で処置した動物（ＲｘＣｈｏｗ）および化合物で処置されなかった動物（ＶｅＣｈｏｗ）を、高脂肪固形飼料を与えられ、化合物を受けなかった動物（ＶｅＨＦ）と比較した場合、個々の動物のＩＰＧＴＴに対して計算されたグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）における相違は、統計的に有意であった（ｔ検定、ｐ＜０．００１）。さらに、高脂肪固形飼料を与えられ、化合物の投与を受けなかった動物（ＶｅＨＦ）のグルコースＡＵＣを、高脂肪固形飼料を与えられ、化合物による処置を受けたマウス（ＲｘＨＦ）と比較した場合にも、血糖値における統計的に有意な相違が観測された（ｔ検定、ｐ＜０．０５）（図５Ｂを参照）。しかし、図５Ｂに示すように、標準的な固形飼料（ＲｘＣｈｏｗ）または高脂肪食（ＲｘＨＦ）を与えられ、処置を受けたマウスと、標準的な固形飼料を与えられ、化合物の投与を受けなかったマウス（ＶｅＣｈｏｗ）との間では、グルコースＡＵＣに、いかなる統計的な相違もなかった。

これらのデータは、本発明の化合物で動物を処置することによって、食餌誘発性肥満症および耐糖能異常の動物モデルにおいて、血液からのグルコースクリアランスが改善され、血糖値が低下され、耐糖能が定常化され、グルコースホメオスタシスは回復したことを示す。これらの結果は、処置した動物で、グルコース利用および調節が改善されたことを示唆するものであった。このように、グルコース利用および調節（例えば、耐糖能異常）の食餌誘発性障害モデルにおいて、正常な耐糖能が本発明の化合物によって回復したことは、本発明の方法および化合物が、耐糖能異常の患者におけるグルコースホメオスタシスを治療によって回復するのに有用であることを示す。

本発明の化合物を投与した後における、グルコース利用および調節の改善、ならびにグルコースホメオスタシスの回復は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いても測定することができる。血糖値に対する化合物投与の効果を測定するのに、上記実施例７に記載したものと同様の実験が行われる。４０匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを次の実験群に分割する。群１：ビヒクル対照動物に標準的なマウス固形飼料を与える（ｎ＝１０）；群２：ビヒクル対照動物に高脂肪マウス固形飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ社から入手した４５％脂肪飼料）を与える（ｎ＝１０）；群３：動物に、高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｅを強制経口投与で投与する（ｎ＝１０）；群４：動物に、高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａを強制経口投与で投与する（ｎ＝１０）。この食餌計画は、毎週、体重を測定しながら２８日間継続される。動物を終夜絶食させ、その後、１ｇグルコース／ｋｇ体重のグルコース負荷を用いて、ＯＧＴＴを行う。グルコース投与の０、３０、６０、９０、１２０、および１８０分間後に、グルコースレベル用に血液試料を採取する。

ヘモグロビン糖化の減少
糖化ヘモグロビンは、様々な糖（最も一般的にはグルコース）がヘモグロビン分子に結合することで形成され、血糖濃度に正比例した速度で形成される。糖化ヘモグロビンレベルの測定は、測定前２〜３カ月にわたる平均血糖濃度の正確な指標を与える。臨床的には、糖化ヘモグロビンレベルは、糖尿病患者または高血糖の患者における血糖コントロールの評価を提供する。

糖化ヘモグロビンレベルに対する化合物投与の効果を、次の糖尿病マウスモデルを用いて検査した。２０匹のオスのｄｂ／ｄｂマウス（Ｈａｒｌａｎ社）に、ビヒクル（１００μＭヒスチジン）または化合物Ａ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する飲料水を８週間与えた。検査開始前と、処置後４および８週間目に、テール静脈から血液試料を尾静脈から採取し、ＨｂＡ１ｃレベルをＨｂＡ１ｃＮＯＷキット（Ｍｅｔｒｉｋａ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を用いて測定した。

ＨｂＡ１ｃレベルは、ベースラインと比較して、対照群の８週間目に有意に増大していた（ｐ＜０．０５）（図６）。図６で示すように、ＨｂＡ１ｃは、０週目の約７．５％から、８週目の約１０％にまで増大した。化合物処置群におけるＨｂＡ１ｃレベルは、時間と共に増大せず、８週目には、処置されなかったものの値より有意に低かった。本発明の化合物で処置した動物のＨｂＡ１ｃレベルは、８週目には約７．５％であった。

これらのデータは、本発明の化合物で動物を処置することによって、２型糖尿病モデルにおける、糖化ヘモグロビンの蓄積が低減されたことを示した。ＨｂＡ１ｃは、糖尿病患者における総合的な血糖コントロールを反映するものである。化合物によってこのモデルにおけるＨｂＡ１ｃが低減されたことは、本発明のそのような化合物が、糖尿病または高血糖患者において、血糖コントロールを治療によって改善するのに有用であることを示す。

体重増加の低下および脂肪貯蔵の低減
動物における体重減少および脂肪貯蔵に対する本発明の化合物の効果を以下の通りに検査した。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ社から入手した５０匹のオスのＳＤ系ラット（６〜７週齢）に、０．５％ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、または２０、６０、１００もしくは２００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物Ｂを、１日に１度の強制経口投与によって連続して１４日間投与した。体重および明白な毒性の徴候における変化、ならびに死亡率に関して動物をモニターした。１５日目に、水を自由に利用可能な状態で終夜絶食させた後、動物をイソフルランで麻痺にかけた。約１ｍｌの全血の一試料を血液分析用にＥＤＴＡを含有するチューブに採取し、約１ｍｌの第２の試料を血清化学分析用に抗凝血物質を含まないチューブに採取した。血液サンプル分析は、ＩＤＥＸＸ社（Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）が行った。血液採取後、隔膜を切開し、動物を犠牲にした。各動物における、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺、胃、小腸の肉眼観察測を記録し、大腸を組織学的な評価のために採取した。

図７Ａに示すように、本発明の化合物で処置した動物は、体重増加における用量依存的な遅延を示した。動物の検査法は、処置した動物における、ほとんどの器官の絶対重量は、対照の処置されなかった動物における、それぞれの臓器重量と有意に異なっておらず、したがって成長には一般的な遅延がなかったことを示した。例えば、化合物で処置した動物の絶対心臓重量は、対照と比較して、統計的に有意な相違を示さなかった（図７Ｂ）。しかし、相対的臓器重量は、処置しなかった対照と比較して、処置した動物において有意に増大した。例えば、全体重に対する比率として計算される相対心臓重量は、対照と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの化合物で処置した動物において、有意に増大していた（ｐ＝０．０３６、片側ＡＮＯＶＡ／チューキー検定）。

絶対臓器重量（例えば、心臓重量）は有意に減少しなかったので、処置した動物には、一般的な増殖遅延過程はない。さらに、臓器重量が全体重に比較して有意に増大していたので、別の組織に選択的損失があったのである。図８に示すように、化合物で処置した際、動物は内臓脂肪の用量依存的な減少を示した。上部パネルの矢印は、低用量の化合物で処置した動物に存在する内臓脂肪体を示し、一方、下部のパネルは、より高用量の化合物で処置した動物における、脂肪パットの完全な不在を示すものである。

これらの結果は、本発明の化合物および方法は、筋肉質量の減失を伴わずに、体重の低下または減少を誘導し、さらに内臓脂肪を低減し、体重の調整に有用であることを示した。併せて、これらの結果は、本発明の方法および化合物が、体重増加を効果的に制御し、特に内臓脂肪を減少させたことを示した。そのような方法および化合物は、肥満の治療または防止に有利であり、したがって、肥満に関連した糖尿病を治療または予防するのに有用である。

食餌誘発性肥満動物モデルにおける体重増加の低減
高脂肪食を与えたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、重度の肥満、高血糖、および高インスリン血症を発症し、食餌誘発性肥満、２型糖尿病、および耐糖能異常のモデルとされている。４０匹のオスＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から入手し、次の実験群に分割した。群１：標準的なマウス固形飼料を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群２：高脂肪マウス固形飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ社から入手した４５％脂肪飼料）を与えたビヒクル対照動物（ｎ＝１０）；群３：高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ｅを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）；群４：高脂肪マウス固形飼料を与え、７５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａを強制経口投与で投与した動物（ｎ＝１０）。この食餌計画は、毎週、体重を測定しながら２８日間継続された。その後、動物を犠牲にし、それらの器官および脂肪体を採取し、重量測定した。

図９Ａに示すように、高脂肪食を与えた動物（群２）は、標準的固形飼料を与えた動物（群１）より有意に重い体重を有した（ｐ＜０．０５）。しかし、高脂肪食を与えられたが、化合物Ｅまたは化合物Ａで処置した動物（それぞれ群３および群４）は、有意に少ない体重増加を示した（ｐ＜０．０５）。実際、高脂肪食にもかかわらず、化合物で処置した動物は本質的には正常食を与えられた動物と同じ体重を有した（群３および群４を群１と比較されたし）。同様に、図９Ｂに示すように、高脂肪を与えた動物（群２）は、標準的固形飼料を与えた動物（群１）、および高脂肪食を与え、また、本発明の化合物で処置した動物（群３および群４）の両方と比較して、腹部脂肪体の重量が有意に増大していた。図９Ｂからわかるように、高脂肪食を与え、かつ化合物で処置した動物は、正常食を与えられた動物と本質的には同じ重量の脂肪体を有した。

２８日間の検査の後、これらの動物の様々な器官の重量を測定した。図９Ｃに示すように、腎臓、肝臓、および心臓の臓器重量は、いずれの実験群間でも相違していなかった。これらの結果は、観測された体重の相違が、脂肪貯蔵の減少による結果であり、成長率の低下によるものではなかったことを示した。これらのデータは、本発明の化合物で動物を処置したことによって、高脂肪食摂取と関連した体重増加がなくなったことを示した。このように、本発明の化合物によって体重増加が防止されたことは、有害な食餌摂取の下でさえ、体重増加を治療によって減少させるのに、本発明の化合物が有用であることを示した。さらに、体重増加に対する本発明の方法および化合物による治療作用は、肥満患者において、治療によって体重減少を調節するのにも、そのような化合物が潜在的に有用であることを示唆する。

肥満マウスにおける体重減少
動物における体重減少に対する本発明の化合物の投与効果を、以下の通り検査する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から入手する。高脂肪食を与えられたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、重度の肥満、高血糖、および高インスリン血症を発症し、食餌誘発性肥満、２型糖尿病、および耐糖能異常のモデルとされている。高脂肪食（４５％のカロリーが脂肪）を８週間マウスに与えるが、その後には、マウスは肥満となっている。肥満マウスを２つの実験群に分割する。群１動物は、対照の肥満マウスであり、群２動物は、本発明の化合物で処置した肥満マウスである。年齢が適合した非肥満体マウスの追加群も検査に含まれる。その後、動物を本発明の化合物またはビヒクル対照で毎日処置する。マウスの体重は、２１日間、１週間に２回測定する。２１日目に、動物は、体重を量り、その後犠牲にする。腹部脂肪体、肝臓、腎臓、および心臓を、分析用に単離し、重量を計る。

化合物投与による体重減少は、肥満患者において、治療によって体重を減少させるのに、本発明の化合物が有用であることを示す。

血圧の調整に関与する遺伝子発現の増強
高血圧は、糖尿病、ならびに糖尿病に関連する障害および疾患の危険因子である。血圧の調整に対する本発明の化合物の効果を、以下の通りに検査した。動物を化合物Ｂまたは化合物Ｄで処置し、ＲＮＡ試料を上記実施例４の記載の通りに調製した。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡレベルの測定には、以下の方法を用いた。ｃＤＮＡ合成は、メーカーの指示に従って、１μＭランダム六量体プライマー、トータルＲＮＡ １μｇ、およびＯＭＮＩＳＣＲＩＰＴ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。この結果得られたｃＤＮＡを水で５倍に希釈して、最終体積を１００μＬとした。相対的な遺伝子発現レベルの分析は、メーカーの指示に従って、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ ＤＮＡ ＭＡＳＴＥＲ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ社）および遺伝子特異的プライマーを用い、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して、定量的ＰＣＲによって行った。試料を６分間９４℃まで加熱し、その後、９５℃を１５秒、６０℃を５秒、そして７２℃を１０秒のサイクルを合計４２サイクル行った。誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）特異的プライマーは次の通りである。

ｍ−ｉＮＯＳ−Ｆ２ ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴ（配列番号１）
ｍ−ｉＮＯＳ−Ｒ２ ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列番号２）

１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子発現の相対的レベルを対照として測定した。定量的ＰＣＲは、メーカーの指示に従って、ＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）と遺伝子特異的プライマーとを用いＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。試料を１５分間９５℃まで加熱し、その後、９４℃を１５秒、６０℃を２０秒、そして７２℃を１０秒のサイクルを合計４２サイクル行った。リボソームＲＮＡ特異的プライマーは次の通りである。

１８Ｓ−ｒａｔ−２Ｂ ＴＡＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＡＴＣＧＡ（配列番号３）
１８Ｓ−ｒａｔ−２Ａ ＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴ（配列番号４）

各ＰＣＲ実施には、標準曲線試料および水ブランクが含まれた。さらに、増幅の特異性を評価するために、各ＰＣＲ実施の完了後に溶融カーブ（ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ）を作成した。ｉＮＯＳ遺伝子発現は、その試料用の１８ＳリボソームＲＮＡの発現レベルと比較して正規化した。

図１０Ａに示すように、ｉＮＯＳをコードする遺伝子の発現は、本発明の化合物で処置した後８時間以内に増強され、その後、対照レベルに戻った。さらに、ｉＮＯＳの誘導は、用量依存的であり、本発明の２つの異なる化合物（化合物Ｂおよび化合物Ｄ）で実現された。これら２つの化合物は、本発明の方法で使用できる２つの異なるファルマコホア、すなわちフェナントロリン誘導体、および複素環式カルボキシアミドの例示的化合物である。これらの結果は、本発明の化合物による処置が、血管拡張性調節に関与するタンパク質であるｉＮＯＳ発現を増大させたことを示した。したがって、本発明の化合物および方法は、血管拡張応答を誘導して、血圧を低下させるのに有用である。

アドレノメデュリンｍＲＮＡ発現を測定するために、試料を上記実施例４の記載の通り調製し、ハイブリダイゼーションを行い、分析した。図１０Ｂに示すように、血管拡張応答に関与するタンパク質をコードする代表的な遺伝子であるアドレノメデュリンの発現は、本発明の化合物Ｂで処置した動物体内の様々な組織で増強された。化合物Ｂで処置した後のタイムコースでは、心、腎臓、および肺のアドレノメデュリンｍＲＮＡレベルは、発現の急速な増大を示し、その後１６から２４時間以内に対照レベルに戻った。

併せて、これらの結果は、本発明の方法および化合物が、血管拡張性機構を通して血圧の調節に関与する遺伝子の発現を活性化する手段を提供することを示した。そのような遺伝子には、誘導性酸化窒素シンターゼおよびアドレノメデュリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。治療による血管拡張性因子のアップレギュレーションは、血圧を低下させ、それによって、例えば、糖尿病などの代謝障害の患者に利益を与える効果的な方法を提供する。血圧を低下させることによって、本発明の方法および化合物は、糖尿病と、高血糖など、糖尿病に関連する他の代謝障害を治療または予防する方法を提供する。

血清トリグリセリドの減少
トリグリセリドレベルに対する化合物投与の効果を、以下の糖尿病のマウスモデルを用いて調べた。２０匹のオスのｄｂ／ｄｂマウス（Ｈａｒｌａｎ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）がこの試験に使用された。ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体のホモ機能喪失変異を有する。ｄｂ／ｄｂマウスのトリグリセリドレベルは、通常、正常マウスと比較して、１．５〜２倍上昇している（Ｎｉｓｈｉｎａら（１９９４年）、Metabolism、第４３巻、５４９〜５５３ページ）。ｄｂ／ｄｂマウスのトリグリセリドレベルは、年齢と共に増大する（ＴｕｍａｎおよびＤｏｉｓｙ（１９７７年）、Diabetologia、第１３巻、７〜１１ページ）。ビヒクル（１００μＭヒスチジン）または化合物Ａ（１００μＭヒスチジン中に０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する飲料水を８週間、マウスに与えた。検査終了時に、動物を終夜絶食させ、全身麻酔の下に尾部大静脈から血液試料を採取し、血清分離チューブに入れた。血液試料は分析のためにＱｕａｌｉｔｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｓ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に送った。

図１１に示すように、対照ｄｂ／ｄｂマウスのトリグリセリドレベルは、実験の終了時に約１２０ｍｇ／ｄＬであった。しかし、本発明の化合物で処置した動物のトリグリセリドレベルは、対照より有意に低く、約８５ｍｇ／ｄＬであった。トリグリセリドレベルの増大は、心血管疾患になる危険性の増大に関連しており、高トリグリセリドは代謝症候群の要素である。本発明の化合物および方法は、例えば糖尿病、症候群Ｘ、大血管疾患、または他の異脂肪血症など、高トリグリセリドに通常、関連する状態において、トリグリセリドレベルを効果的に低下または維持するので、本発明の方法は、そのような状態を有するか、またはその危険性のある個体を治療するのに有用である。

化合物の同定およびＨＩＦα安定化
ＨＩＦ特異的なプロリルヒドロキシラーゼ活性をモジュレートする化合物は、ヒドロキシル化に共役した２−オキソ［１−^１４Ｃ］グルタル酸の脱炭酸に基づいたアッセイを用いて同定することができる（Ｈｉｒｓｉｌａら（２００３年）、J．Biol．Chem.、第２７８巻、３０７７２〜３０７８０ページを参照）。この反応は、内在性ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼまたは組換え型ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを発現する細胞から得た、例えばトリトン−Ｘ−１００などの界面活性剤で可溶化した細胞抽出物１０〜１００μＬ；例えばＤＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ（配列番号５）などの基質ペプチド０．０５μｍｏｌ；ＦｅＳＯ_４ ０．００５μｍｏｌ，２−オキソ［１−^１４Ｃ］グルタル酸０．１６μｍｏｌ、アスコルビン酸２μｍｏｌ、カタラーゼ６０μｇ、ジチオトレイトール０．１μｍｏｌ、および２５℃でｐＨ７．８に調整されたトリス−ＨＣｌ緩衝液５０μｍｏｌを含有する１．０ｍｌの反応体積で行われる。酵素反応は、３７℃で２０分間行う。反応によって生成された^１４ＣＯ_２を、反応混合物上の雰囲気に懸垂した塩基含浸濾紙に捕捉し、シンチレーションカウンターで測定する。

本発明の化合物および方法を用いたＨＩＦαの安定化を以下の通りに調べた。アデノウイルスで形質転換した胎児腎臓上皮（２９３Ａ）、頚部上皮腺癌（ＨｅＬａ）、肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）、扁平上皮癌（ＳＳＣ−２５）、および肺線維芽細胞（ＨＬＦ）に由来するヒト細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ；およびＱｂｉｏｇｅｎｅ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡを参照）を、別々に１００ｍｍ培養皿中に接種し、以下の培地、すなわち、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中でＨｅＬａ細胞を；ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中でＨＬＦ細胞を；ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ中で２９３Ａ細胞を；そして、最少必須培地（ＭＥＭ）、アールのＢＳＳ（Ｅａｒｌｅ’ｓ ＢＳＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、Ｈｅｒｎｄｏｎ ＶＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ中でＨｅｐ３Ｂ細胞を、３７℃、２０％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２で増殖させた。細胞層が集密状態に達したときに、培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）で置換し、細胞層を３７℃、２０％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２で、約２４時間インキュベートした。その後、本発明の化合物（化合物Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびＨのうち１つ）またはＤＭＳＯ（０．５〜１％）を、既存の培地に添加し、インキュベーションを終夜で継続した。

インキュベーションの後、培地を除去し、遠心し、分析用に保存した。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＩＧＥＰＡＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）中で氷上で１５分間、溶解した。細胞溶解液を４℃、３０００ｘｇで、５分間、遠心し、サイトゾル画分（上清）を収集した。核（ペレット）を再懸濁し、１００μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、およびプロテアーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）中で溶解し、４℃、１３０００ｘｇで、５分間、遠心し、核タンパク質画分（上清）を収集した。

タンパク質濃度に基づいて核分画を正規化し、４〜１２％のＴＧゲル上に添加し、還元状態下で分画した。タンパク質のＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）上への転写を５００ｍＡで１．５時間行った。膜のブロッキングをＴ−ＴＢＳ、２％ミルク中、室温で、１時間行い、Ｔ−ＴＢＳ、２％ミルクに１：２５０で希釈したマウス抗ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）と、終夜インキュベートした。ブロットは、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＷＥＳＴ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を用いて現像した。図１２Ａに示すように、本発明の代表的化合物（化合物Ｄ）は、様々な細胞型において用量依存的にＨＩＦαを安定化し、ＨＩＦαが細胞内に蓄積するのを可能にした。

別法では、メーカーの指示に従って、核分画をＮｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を用いて調製し、ＴＲＡＮＳＡＭ ＨＩＦ−１ ＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）を用いることで、ＨＩＦ−１αを分析した。図１２Ｂに見られるように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、本発明の化合物で処置した際に、用量依存的なＨＩＦαの安定化を示した。また、図１２Ｂは、本発明の様々な化合物（化合物Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）で処置した上皮細胞（２９３Ａ）および肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）が、ビヒクルで処置した対照細胞と比較して、ＨＩＦαの安定化および蓄積を示したことも明らかにする。

当業者には、本明細書に示されたものおよび記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、以上の記述から明らかになるであろう。そのような変更も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものである。

これにより、本明細書に引用された全引用文献を、全体として参照により本明細書に組み込む。

図１Ａ及び１Ｂは、本発明の化合物で処置した細胞におけるアルドラーゼおよびグルコーストランスポーター−１（ＧｌｕＴ−１）の誘導を示す図である。 図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、本発明の化合物で処置した動物の腎臓、肝臓、および肺におけるグルコース調節に関与する遺伝子の発現の増大を示す図である。 図３Ａ及び３Ｂは、本発明の化合物で処置した動物の腎臓および肝臓における、それぞれＧｌｕＴ−１およびＩＧＦＢＰ−１をコードする遺伝子の用量反応および経時反応を示す図である。 図４は、本発明の化合物で処置した動物における血糖値の低下を示す図である。 図５Ａ及び５Ｂは、本発明の化合物で処置した際の、食餌誘発性２型糖尿病動物モデルにおけるグルコース抵抗性の増大を示す図である。 図６は、本発明の化合物で処置したｄｂ／ｄｂマウスにおけるヘモグロビン糖化の減少を示す図である。 図７Ａ及び７Ｂは、本発明の化合物で処置した動物における体重および心臓重量の変化を示す図である。 図８は、本発明の化合物で処置した動物における内臓脂肪の減少を示す図である。 図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、本発明の化合物で処置した食餌誘発性肥満動物モデルにおける体重増加および腹部脂肪体重量の低下を示す図である。 図１０Ａ及び１０Ｂは、本発明の化合物による処置に続く、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびアドレノメデュリンをコードする遺伝子の発現を示す図である。 図１１は、本発明の化合物で処置した動物におけるトリグリセリドレベルを示す図である。 図１２Ａ及び１２Ｂは、本発明の化合物で処置した細胞におけるＨＩＦ−１αの安定化を示す図である。

【配列表】

Claims (37)

1. グルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、ＨＩＦαを安定化して、それによってグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
2. グルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量投与して、それによってグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
3. 前記安定化がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記安定化がｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１に記載の方法。
5. 前記投与がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項２に記載の方法。
6. 前記投与がｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２に記載の方法。
7. 細胞内のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、前記細胞内のＨＩＦαを安定化して、それによって前記細胞内のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
8. 細胞内のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、前記細胞内のＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量、前記細胞に投与して、それによって前記細胞内のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
9. 被験体のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、前記被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって前記被験体のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
10. 被験体のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節する方法であって、前記被験体のＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を有効量、前記被験体に投与して、それによって前記被験体のグルコース代謝またはグルコース代謝過程を調節することを含む方法。
11. 前記ＨＩＦαの安定化が、ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性を阻害する化合物を投与して、それによってＨＩＦαを安定化することを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＨＩＦヒドロキシラーゼ活性がＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性である、請求項２、８、１０、または１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記被験体が動物である、請求項９に記載の方法。
14. 前記被験体が哺乳動物である、請求項９に記載の方法。
15. 前記被験体がヒトである、請求項９に記載の方法。
16. 前記グルコース代謝過程がグルコース取り込み、グルコース輸送、グルコース貯蔵、グルコースプロセッシング、およびグルコース利用からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
17. ＨＩＦαがＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、およびＨＩＦ３αからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
18. 前記ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼがＥＧＬＮ１、ＥＧＬＮ２、およびＥＧＬＮ３からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
19. 被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体におけるグルコースホメオスタシスを実現することを含む方法。
20. 被験体の血糖値を低下させる方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の血糖値を低下させることを含む方法。
21. 被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させる方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の糖化ヘモグロビンレベルを低下させることを含む方法。
22. グルコース調節因子の発現を変化させる方法であって、ＨＩＦαを安定化して、それによってグルコース調節因子の発現を変化させることを含む方法。
23. 前記グルコース調節因子がＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ１、ＧｌｕＴ−１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ＩＧＦＢＰ−１、およびＩＧＦからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 被験体における前記グルコース調節因子の発現を変化させることが、前記グルコース調節因子の発現を増強することである、請求項２２に記載の方法。
25. 解糖因子の発現を変化させる方法であって、ＨＩＦαを安定化して、それによって解糖因子の発現を変化させることを含む方法。
26. 前記解糖因子がＰＦＫ−Ｐ、ＰＦＫ−Ｌ、エノラーゼ１、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ１、およびヘキソキナーゼ１からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 糖尿病を罹患しているか、または糖尿病を発症する危険性のある被験体の糖尿病を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の糖尿病を治療または予防することを含む方法。
28. 被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の血糖値の上昇に関連した障害を治療または予防することを含む方法。
29. 前記血糖値の上昇に関連した障害が糖尿病、高血糖、肥満、高血圧、高脂血症、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜障害、耐糖能異常、アテローム性動脈硬化、および血管疾患からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
30. 被験体の糖尿病に関連した状態を治療または予防する方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって糖尿病に関連した状態を治療または予防することを含む方法。
31. 前記糖尿病に関連した状態が高血糖、肥満、高血圧、高脂血症、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜障害、耐糖能異常、アテローム性動脈硬化、および血管疾患からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記被験体が糖尿病を罹患している被験体である、請求項２０に記載の方法。
33. 前記被験体が糖尿病を罹患する危険性のある被験体である、請求項２０に記載の方法。
34. 被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させる方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体の血中トリグリセリドレベルを低下させることを含む方法。
35. 被験体におけるインスリン抵抗性を低下させる方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって被験体におけるインスリン抵抗性を低下させることを含む方法。
36. 被験体における血糖コントロールを増強させる方法であって、被験体のＨＩＦαを安定化して、それによって血糖コントロールを増強させることを含む方法。
37. 前記被験体が、高血糖を有している被験体である、請求項３６に記載の方法。

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