DE60037813T2

DE60037813T2 - Identifikation von stoffen, die transkriptionelle antworten auf hypoxia modifizieren

Info

Publication number: DE60037813T2
Application number: DE60037813T
Authority: DE
Inventors: David M. Brookline LIVINGSTON; Andrew L. Roslindale KUNG; Shoumo Bhattacharya
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2020-06-03
Also published as: JP2003501061A; ATE383877T1; WO2000074725A1; DE60037813D1; PT1198255E; EP1198255A4; EP1198255B1; CA2376438A1; EP1198255A1; ES2299427T3; JP4902915B2

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten gemacht. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
Erfindungshintergrund
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die transkriptionale Reaktionen auf Hypoxie modifizieren.
Da sich solide Tumoren aus einer einzelnen malignen Zelle zu einer multizellularen Masse entwickeln, fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Tumor-Mikroumgebung ab, da die Diffusionsfähigkeit der bestehenden Blutversorgung überschritten wird (Nordsmark et al., Acta. Oncol. 33: 383–389, 1994; Helmlinger et al., Nat. Med. 3: 177–182, 1997; Adam et al., Head Neck 21: 146–153, 1999). Tumorhypoxie verringert die Wirksamkeit vieler gebräuchlicher Therapien (Brown, Mol. Med. Today 6: 157–162, 2000), ist ein starker Stimulus für Angiogenese (Shweiki et al., Nature 359: 843–845, 1992) und ist mit der Tumorprogression (Zhong et al., Cancer Res. 59: 5830–5835, 1999; Hockel et al., Cancer Res. 56: 4509–4515, 1996) und -metastase (Brizel et al., Cancer Res. 56: 941–943, 1996) verknüpft. Da chronische Hypoxie Tumorzellen von ihren normalen Gegenstücken unterscheidet (Zhong et al., Cancer Res. 59: 5830–5835, 1999), sind therapeutische Strategien entwickelt worden, die versuchen, diesen Unterschied durch die Entwicklung von Arzneimitteln, die unter hypoxischen Bedingungen selektiv aktiviert werden (Zeman et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 12: 1239–1242, 1986), und von hypoxie-induzierten Gentherapieprotokollen auszunutzen (Binley et al., Gene Ther. 6: 1721–1727, 1999; Shibata et al., Gene Ther. 7: 493–498, 2000).
Zellulare Hypoxie löst eine vielfältige adaptive Reaktion aus, die hauptsächlich durch den heterodimeren Transkriptionsfaktor HIF-1α vermittelt wird (MacDonald et al., Mol. Cell. Biol. 13: 5907–5917, 1993; Maltepe et al., Nature 386: 403–407, 1997). Unter normoxischen Bedingungen ist die Alpha-Untereinheit (HIF-1α) infolge ihrer Zersetzung durch das Ubiquitin-Proteosom-System im Wesentlichen undetektierbar (Salceda et al., J. Biol. Chem. 272: 22642–22647, 1997; Huang et al., J. Biol. Chem. 271: 32253–32259, 1996). Dies wird teilweise über Targeting durch das Von-Hippel-Landau-Protein erreicht (Huang et al., J. Biol. Chem. 271: 32253–32259, 1996). Unter hypoxischen Bedingungen wird HIF-1α über noch nicht verstandene Mechanismen stabilisiert und sammelt sich an (Jiang et al., Am. J. Physiol. 271: C1172–1180, 1996). Stabilisiertes HIF-1α heterodimerisiert mit seinem Bindungspartner ARNT (Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor nukleärer Translokator) (Wang et al., J. Biol. Chem. 270: 1230–1237, 1995; Jiang et al., J. Biol. Chem. 271: 17771–17778, 1996), einem gemeinsamen Bindungspartner mehrerer βHLH-PAS-Domänenproteine. Das Heterodimer interagiert mit Koaktivatoren der p300/CBP-(Arany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12969–12973, 1996; Ebert et al., Mol. Cell. Biol. 18: 4089–4096, 1998; Kallio et al., EMBO J. 17: 6573–6586, 1998; Carrero et al., Mol. Cell. Biol. 20: 402–415, 2000) und SRC-1-Familie (Carrero et al., Mol. Cell. Biol. 20: 402–415, 2000), bindet an ein verwandtes hypoxie-responsives Element (HRE) (Jiang et al., J. Biol. Chem. 271: 17771–17778, 1996) und transaktiviert dadurch HRE enthaltende Promotoren und Enhancer. Die Expression von HIF-1-Zielgenen dient dazu, die zellulare Homöostase zumindest teilweise aufrechtzuerhalten, durch Förderung der anaeroben Glykolyse, der Erleichterung der Erythropoiese und Erhöhung der der Blutzufuhr durch Vasodilation und Angiogenese (Semenza, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 15: 551–578, 1999). Die Bedeutung des HIF-1-Reaktionspfads bei humaner Tumorigenese wird durch den Befund unterstrichen, dass HIF-1α bei mehreren humanen Krebsen überexprimiert wird (Zhong et al., Cancer Res. 59: 5830–5835, 1999).
Bhattacharya und Kollegen (Bhattacharya et al., Genes Dev. 13(1): 64–75, 1999) identifizierten p35srj als ein Protein, das die transkriptionale Antwort auf Hypoxie in einer Zelle moduliert, durch in Kontakt bringen der Zelle mit p35srj, Unterwerfen der Zelle hypoxischen Bedingungen und Bewerten einer transkriptionalen Antwort der Zelle auf hypoxische Bedingungen unter Verwendung eines Reportersystems im Anschluss an die Modulation der Wechselwirkung von CBP/p300 mit HIF-1α in der Testzelle.
Die Adaptierung an hypoxische Bedingungen spielt nicht nur bei der Tumorprogression eine Rolle sondern ist auch bei Zuständen lokaler Gewebehypoxie/anoxie wichtig, wie etwa bei der Pathogenese von myokardialer Ischämie und Schlaganfall. Es ist auch gezeigt worden, dass der HIF-Pfad bei bestimmten Entzündungszuständen wichtig ist, wie etwa Crohnsche Krankheit.
Kurzfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die eine transkriptionale Antwort auf Hypoxie in einer Zelle moduliert (beispielsweise eine kultivierte Zelle oder eine Zelle in einem Tier). Bei diesem Verfahren wird eine Zelle oder die extrazellulare Umgebung einer Zelle mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht. Die Zelle wird dann hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und es wird eine transkriptionale Reaktion der Zelle auf die hypoxischen Bedingungen bestimmt. Bei diesem Verfahren kann die transkriptionale Reaktion die Expression eines Reportergens unter der Kontrolle eines hypoxie-responsiven Promotors sein. Das Reportergen kann beispielsweise Luziferase, grün fluoreszierendes Protein oder zyan fluoreszierendes Protein sein. Die hypoxischen Bedingungen, denen die Zellen ausgesetzt werden, können Aussetzen geringen Sauerstoffpegeln sein oder chemisch induziert werden, beispielsweise durch Deferoxamin oder Kobaltchlorid.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die eine transkriptionale Reaktion auf Hypoxie in einer Zelle moduliert. Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung eines ersten Transkriptionsfaktors, der bei einer transkriptionalen Reaktion auf Hypoxie in einer Zelle involviert ist, oder einem Fragment davon, in Kontakt bringen des ersten Transkriptionsfaktors oder eines Fragments davon mit einer Kandidatenverbindung und Bestimmen, ob die Kandidatenverbindung die Wechselwirkung des ersten Transkriptionsfaktors mit einem zweiten Transkriptionsfaktor oder einem Fragment davon beeinträchtigt.
Ein anderes bei der Erfindung vorgesehenes Verfahren ist ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die eine transkriptionale Reaktion auf Hypoxie in einer Zelle moduliert. Dieses Verfahren umfasst das Bereitstellen eines ersten und zweiten Transkriptionsfaktors, die bei einer transkriptionalen Reaktion auf Hypoxie in einer Zelle involviert sind, oder Fragmenten davon, in Kontakt bringen des ersten und zweiten Transkriptionsfaktors, oder Fragmenten davon, mit einer Kandidatenverbindung und Bestimmen, ob die Kandidatenverbindung die Wechselwirkung des ersten und zweiten Transkriptionsfaktors beeinträchtigt.
Bei einem der zwei unmittelbar zuvor beschriebenen Verfahren kann der erste Transkriptionsfaktor ein Peptid von HIF-1α umfassen (beispielsweise die TAD-C-Region) und der zweite Transkriptionsfaktor kann das Peptid von p300/CBP umfassen, das aus den Aminosäuren 302 bis 418 besteht.
Es wäre möglich, ein Verfahren zur Behandlung eines Zustands bereitzustellen, der durch Hypoxie in einem Patienten, Hypoxie in einem lokalisierten Gewebe oder Aktivierung des HIF-1-Pfades gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren würde umfassen, einem Patienten eine Verbindung zu verabreichen, die eine transkriptionale Reaktion auf Hypoxie im Patienten moduliert. Im Fall einer Verbindung, die die Reaktion vermindert, könnte das Verfahren verwendet werden, um beispielsweise Krebs oder einen Entzündungszustand einer krankhaften Neovaskularisierung zu behandeln, die durch den Hypoxie-Reaktionspfad vermittelt wird. Im Fall einer Verbindung, die die Reaktion steigert, könnte das Verfahren verwendet werden, um beispielsweise myokardiale Ischämie, Schlaganfall oder einen Erythropoietinmangel zu behandeln. Die Verbindung kann beispielsweise an HIF-1α binden.
Die Erfindung bietet mehrere Vorteile. Beispielsweise könnten Verbindungen, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifiziert werden, als therapeutische Moleküle zur Verhinderung oder Behandlung von Zuständen verwendet werden, die durch Hypoxie gekennzeichnet sind. Demgemäß können Verbindungen, die sich als die transkriptionalen Reaktionen auf Hypoxie, beispielsweise die Wechselwirkung zwischen HIF-1α und p300/CBP, vermindernd erweisen, bei Verfahren zur Behandlung von Krebs verwendet werden, die zu einer Verringerung der Tumorangiogenese, metabolischer Entgleisung und Tumorzelltod führen. Verbindungen, die die transkriptionalen Reaktionen auf Hypoxie steigern, beispielsweise durch Potenzieren der Wechselwirkung zwischen HIF-1α und p300/CBP, können verwendet werden, um Zustände wie etwa ischämischen Schalganfall und myokardiale Ischämie zu behandeln. Erfindungsgemäß identifizierte Verbindungen könnten auch verwendet werden, um Entzündungszustände zu behandeln, wie etwa Crohnsche Krankheit sowie Erythropoietinmangel (wie er beispielsweise bei Nierentransplantationspatienten gefunden wird).
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und der Zeichnung ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1A ist eine schematische Darstellung von HIF-1α und p300. Die für jedes Protein angegebenen Aminosäurenummern definieren die Grenzen der minimalen Wechselwirkungsdomänen.
1B zeigt, dass für die Wechselwirkung von GST-CH1 mit HIF-1α Zink erforderlich ist. GST-CH1 (Aminosäuren 302 bis 528) wurde auf seine Fähigkeit getestet, an in vitro translatiertes (IVT) HIF-1α voller Länge entweder in seinem nativen Zustand nach Reinigung von Bakterien oder nach Waschen mit 1,10-Phenanthrolin (OP), einem Schwermetall-Chelator. Die Zugabe von 1 μM Zinksulfat nach Chelatisierung bewahrte die Bindungsaktivität.
1C zeigt die Ergebnisse von Tests von carboxy- und amino-terminalen Trunkationsmutanten von GST-CH1, mit Aminosäuregrenzen wie angegeben, auf ihre Fähigkeit zum Pull-down von IVT-HIF-1α voller Länge.
1D zeigt die Ergebnisse von Bindungstests der angegebenen Trunkationsmutanten des Carboxy-Terminus von HIF-1α, konstruiert als Fusionen an Gal4 und in vitro translatiert, unter Verwendung von GST-CH1 (Aminosäuren 302 bis 443). Angegeben ist ein Fünftel des gesamten IVT-Produkts, das für jeden Bindungstest verwendet wurde (Input), zusammen mit der durch GST-CH1 gebundenen Menge (Bound).
1E zeigt die Ergebnisse von Tests auf die Fähigkeit von seriellen Substitutionsmutanten von GST-CH1 (Aminosäuren 302 bis 528), produziert als GST-Fusionsproteine, mit der Sequenz NAAIRS eingesetzt anstelle der angegebenen Aminosäuren, an IVT-HIF-1α voller Länge zu binden.
2A ist ein Graph, der die Ergebnisse von Luziferase- und β-Galaktosidase-Tests zeigt, bei denen Hep3B-Zellen mit einem Epo-Luziferase-Reporter (100 ng), pCMV-LacZ (100 ng) und den angegebenen Expressionsplasmiden (300 ng) kotransfiziert wurden. Die Zellen wurden anschließend 18 Stunden vor dem Test entweder Umgebungs-(Normoxie, gepunktete Balken) oder 1% (Hypoxie, durchgezogene Balken) Sauerstoff ausgesetzt. Die Ergebnisse werden als korrigierte relative Lichteinheiten (RLU, Mittelwert von drei unabhängigen Transfektionen ± Standardabweichung) ausgedrückt.
2B ist ein Graph, der die Wirkung der TAD-C-Expression auf die p300/CBP-abhängige Transaktivierung zeigt. Hep3B-Zellen wurden mit den angegebenen thioredoxin-abhängigen Fusionsprotein-Expressionsplasmiden (300 ng), den angegebenen Gal4-Fusionsproteinen (20 ng), Gal4-Luziferase-Reporter (100 ng) und pCMV-LacZ (50 ng) kotransfiziert. Wo es angegeben ist, wurden die Zellen 18 Stunden lang Hypoxie ausgesetzt. Die Ergebnisse werden als korrigierte RLU (Mittelwert von drei unabhängigen Transfektionen ± Standardabweichung) ausgedrückt.
2C zeigt die Ergebnisse eines Ribonuklease-Schutztests, der ausgeführt wurde, um die VEGF- und GAPDH-mRNA-Abundanz zu bestimmen. Bei diesem Test wurden HepG-Zellen mit einer MOI von 10 mit Retroviren infiziert, die Gal4 alleine oder Gal4 fusioniert mit Wildtyp- oder mutantem (MUT) TAD-C-Polypeptid kodieren. Die Zellen wurden vor der Herstellung von Gesamt-RNA 18 Stunden lang entweder Umgebungs- oder 1% (Hypoxie) Sauerstoff ausgesetzt.
2D ist ein Graph, der die Zelltodpegel bei einem Experiment zeigt, bei dem HepG-Zellen mit einer MOI von 5 mit Retroviren infiziert wurden, die die angegebenen Gal4-Fusionsproteine kodieren. Die Zellen wurden 36 Stunden lang entweder Umgebungs- oder 1% Sauerstoff ausgesetzt und dann durch durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung von Annexin-V-Färbung und Vitalfarbstoffausschluss auf Zelltod getestet. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Der Stern kennzeichnet die statistische Signifikanz (p = 0,05) im Vergleich zu Kontrollen.
3A ist ein Graph, der die In-vivo-Wirkung der TAD-C-Expression zeigt. HCT116-Zellen wurden mit einer MOI von 5 mit Retroviren infiziert, die Gal4 alleine (Kreis), Gal4 fusioniert mit mutantem TAD-C-Polypeptid (Gal4-MUT, Quadrat) oder mit Wildtyp-TAD-C-Polypeptid (Dreick). Eine Gesamtmenge von 4 × 10⁶ Zellen wurde subkutan in nacktmäuse implantiert. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert ± Standardabweichung von 8 bis 10 unabhängigen Tumoren ausgedrückt. Der Einschub zeigt einen Immunblot für Gal4 in infizierten Zellen, der äquivalente Expressionspegel demonstriert.
3B ist ein Graph, der die Ergebnisse der in Bezug auf 3A beschriebenen Experimente für MDA-MB435S-Zellen zeigt.
3C ist ein Immunblot für p53 in HT116-Zellen, die mit dem angegebenen Retrovirus mit einer MOI von 10 infiziert wurden.
3D ist ein Immunblot für Gal4 bei einem Experiment, bei dem HCT116-Zellen mit Gal4-MUT oder Gal4-TADC mit einer MOI von 5 infiziert wurden. Die Zellen wurden dann in gleichen Verhältnissen gemischt und 6 × 10⁶ Zellen wurden in Nacktmäuse implantiert. Nach drei Wochen wurden Tumoren exzidiert (Tumor 1 bis 3) und Proteinextrakte wurden zusammen mit Extrakten, die aus Zellen vor der Implantation (Mix) hergestellt wurden durch Immunblotting auf Gal4 analysiert.
Die 4A und 4B sind Serien von Photographien, die zeigen, dass die In-vivo-Wirkung der TAD-C-Expression durch ein CH1-unabhängiges HIF-1α-Allel wiederhergestellt werden kann. Tumoren, die sich aus HCT116-Zellen ergeben, die mit Retroviren, die Gal4 fusioniert mit mutantem (MUT) oder Wildtyp-TAD-C-Polypeptid kodieren, mit einer MOI von 5 infiziert wurden, wurden nach 3 Wochen Wachstum exzidiert. Paraffinschnitte wurden mit H&E angefärbt oder auf Gal4 oder CD31/PECAM immungefärbt. Es sind das subkutane Gewebe (SQ), der Tumor (Tum) und die nektotischen Gebiete (Nec) angegeben. 4C ist ein Graph, der die Ergebnisse von Experimenten zeigt, bei denen HCT116-Zellen entweder mit pBABE-puro-VP16 (VP16) oder pBABE-puro-HIF-VP16 (HIFVP) infiziert und mit Puromycin selektiert wurden. Diese Zellen wurden dann mit Retroviren, die entweder Gal4-MUT oder Gal4-TADC kodieren, mit einer MOI von 5 infiziert. Eine Gesamtmenge von 6 × 10⁶ Zellen wurden in Nacktmäuse implantiert. Die Ergebnisse sind dann der Mittelwert von 8 unabhängigen Tumoren ± Standardabweichung.
Detaillierte Beschreibung
Lokale Gewebehypoxie steht mit vielen verschiedenen Krankheitsstadien in Zusammenhang, einschließlich bestimmte Tumoren, myokardiale Ischämie, Gehirnschlag, bestimmte entzündliche Prozesse, Schlaganfall, bestimmte Entzündungsprozesse, Neovaskularisationszustände und bestimmte polyzythämische Zustände. Eine vielfältige adaptive Antwort auf Hypoxie wird durch die Stabilisierung und Ansammlung der Alpha-Untereinheit von Hypoxie induzierendem Faktor 1 (HIF-1) erleichtert. HIF-1α bildet einen Komplex mit seinem Bindungspartner, Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor nukleärer Translokator, sowie den p300/CBP transkriptionalen Koaktivatoren. Dieser Komplex induziert die Transkription von Genen, die dazu dienen, zelluläre Homöostase angesichts hypoxischer Bedingungen aufrechtzuerhalten. Beispielsweise spielt der HIF-1/p300/CBP-Komplex eine Rolle bei der Induzierung der Expression von Genen, wie etwa jenen, die Erythropoietin kodieren, was zu Erythropoiese führt; vaskularer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), der ein primärer Mediator für Angiogenese ist; iNOS und Häm-Oxigenase, die eine Rolle bei der Vasodilation spielt; und der Glukosetransporter und glykolytische Enzyme, die eine Rolle beim anaeroben Stoffwechsel spielen.
Bisher sind keine lenkbaren Verfahren zur Abschwächung des HIF-1-Pfads beschrieben worden. Wir haben nun einen Weg identifiziert, hypoxie-induzierbare Transkription durch Störung der Wechselwirkung von HIF-1α mit p300/CBP zu unterbrechen. Um genau zu sein, wir haben einen Bereich in HIF-1α identifiziert, der mit der CH1-Region von p300/CBP interagiert, und haben gezeigt, dass die Unterbrechung der Wechselwirkung zwischen diesen Regionen die transkriptionale Reaktion auf Hypoxie in Zellen blockieren kann. Die Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Reagenzien oder Verbindungen (beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Antisense-Moleküle, Ribozomen, Tripel-Helizes und Antikörper oder Fragmente davon) bereit, die den HIF-1-Pfad stören. Die Unterbrechung kann an irgendeinem Punkt auf dem Pfad stattfinden, beispielsweise bei der Wahrnehmung eines verminderten Sauerstoffpartialdrucks durch die Zelle, Stabilisierung und Ansammlung von HIF-1α, Bindung von HIF-1α an ARNT und p300/CBP, Bindung von HIF-1α/ARNT/p300/CBP an hypoxie-responsive Elemente (HRE) von Hypoxie induzierbaren Genen und Transaktivierung von HRE-assoziierten Genen durch HIF-1α/ARNT/p300/CBP. Reagenzien, die diese Wechselwirkung blockieren oder unterbrechen, können bei Verfahren, um durch Hypoxie induzierte Genexpression zu verhindern, und auf diese Weise beispielsweise als anti-neoplastische Therapeutika verwendet werden. Solche Reagenzien können auch verwendet werden, um entzündliche Erkrankungen zu behandeln, wie etwa Crohnsche Krankheit, Retinopathien und Polyzythämie. Reagenzien, die diese Wechselwirkung potenzieren, können beispielsweise bei Verfahren zur Behandlung ischämischen Schlaganfalls oder myokardialer Ischämie verwendet werden.
Reagenzien, die transkriptionale Reaktionen auf Hypoxie modifizieren, beispielsweise durch Unterbrechen der HIF-1α/p300/CBP-CH1-Wechselwirkung, die an der zellulären Reaktionen auf Hypoxie beteiligt ist, können unter Verwendung irgendeines einer Vielzahl von Standardverfahren identifiziert werden, einschließlich In-vitro-, zellbasierte und In-vivo-Verfahren. Von besonderem Interesse sind Hochdurchsatz-Screeningverfahren, die beispielsweise auf Chips enthaltene Bibliotheken nutzen. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und können leicht zur Verwendung bei der Erfindung adaptiert werden.
Spezielle Beispiele von Screeningverfahren, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind wie folgt. Beispielsweise kann in einem bakteriellen System ein Fusionsprotein hergestellt werden, wie etwa ein GST-Fusionsprotein, das den Abschnitt p300/CBP enthält, der an HIF-1α bindet (beispielsweise ein Peptid, das die p300/CBP-CH1-Region enthält). Ein markiertes (beispielsweise S³⁵-markiertes) In-vitro-Transkriptions/Translations-HIF-1α-Peptid (beispielsweise TAD-C oder ein Peptid oder Polypeptid, das TAD-C enthält, bis zu HIF-1α voller Länge; siehe unten) kann dann auf Bindung an das Fusionsprotein getestet werden. Bei einer Variation dieses Verfahrens ist das HIF-1α-Peptid als ein Fusionsprotein gefertigt und es wird die Bindung eines eine markierte p300/CBP-CH1-Region enthaltenden Peptids gemessen. Details solch eines Beispiels eines In-vitro-Bindungstests, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind unten angegeben (siehe Experimentelle Ergebnisse und Materialien und Methoden unten).
Ein zusätzliches Beispiel eines In-vitro-Verfahrens, das bei der Erfindung verwendet werden kann, ist ein auf ELISA beruhender Test, bei dem GST-CH1 aus Bakterien exprimiert und gereinigt wird und ein HIF-Polypeptid (beispielsweise ein HIF-Peptid, das die Aminosäuren 786 bis 826 enthält) als ein biotinyliertes synthetisches Peptid synthetisiert wird. Der ELISA-Test wird durch Immobilisieren des biotinylierten HIF-Peptids an eine mit Strepatvidin beschichtete Platte gebildet. Dann werden Kandidatenverbindungen und anschließend GST-CH1 hinzugefügt. Nach Waschen wird die Menge an gebundenem GST-CH1 unter Verwendung eines enzymverknüpften Anti-GST-Antikörpers bestimmt. Der Test kann beispielsweise durch Immobilisieren von GST-CH1, Zugabe von biotinyliertem HIF-Peptid und Ermitteln der Bindung mit enzymverknüpftem Strepavidin abgewandelt werden. Zudem können CH1 und die HIF-Polypeptide in ihren Rollen im oben beschriebenen Test umgekehrt werden oder könnten alternativ mit anderen Epitopen (beispielsweise HA, myc oder HIS6) versehen werden und die Aktivität könnte durch Enzyme gemessen werden, die an den geeigneten Antikörper geknüpft sind. Darüber hinaus können bei den oben beschriebenen Verfahren verschiedene Bindungspartner im Pfad der durch Hypoxie induzierten Transkription verwendet werden. Beispielsweise können bei diesen Verfahren HIF-1α und ARNT oder HIF und das hypoxie-responsive Element von durch Hypoxie induzierten Genen als Zielbindungspartner verwendet werden. Zusätzliche In-vitro-Bindungsverfahren, die bei der Erfindung verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Die Verfahren werden in der Gegenwart oder bei Abwesenheit einer Kandidatenverbindung ausgeführt und die Ermittlung einer Änderung der Bindung kann als eine Auslesung zur Identifizierung einer Verbindung verwendet werden, die beim Modulieren der zellularen Antwort auf Hypoxie bei der Erfindung sinnvoll sein kann. Wie es oben erwähnt wurde, sind Verbindungen, bei denen gefunden wurde, dass sie die Bindung unterbrechen oder stören, Kandidaten zur Behandlung von Zuständen, bei denen es wünschenswert ist, die hypoxische Reaktion zu blockieren (beispielsweise neoplastische Krankheiten, siehe oben), während Verbindungen, bei denen gefunden wurde, dass sie die Bindung steigern, Kandidaten zur Behandlung von Zuständen sind, bei denen es wünschenswert ist, die hypoxische Reaktion zu potenzieren (beispielsweise myokardiale Ischämie und Schlaganfall).
Weil HIF-1 der primäre Regulator der Erythropoietinproduktion ist, können Verbindungen, bei denen gefunden wurde, dass sie transkriptionale Reaktionen auf Hypoxie steigern, außerdem einen Nutzen bei der behandlung von Patienten haben, die Krankheiten haben, die mit einem Mangel an Erythropoietin verbunden sind, beispielsweise Nierentransplantationspatienten und Patienten mit Anämie irgendwelcher Etiologie.
Zusätzlich zu In-vitro-Verfahren, wie jenen, die oben beschrieben wurden, kann irgendeines einer Vielzahl von zellbasierten Verfahren verwendet werden, um erfindungsgemäße Kandidatenverbindungen zu identifizieren oder zu charakterisieren. Beispielsweise können Zellen in der Gegenwart oder bei Abwesenheit einer Kandidatenverbindung hypoxischen Bedingungen unterworfen werden und es können Unterschiede im hypoxischen Phänotyp ermittelt werden. Beispielsweise kann die Expression eines durch Hypoxie induzierten Gens, wie etwa VEGF oder Erythropoietin, gemessen werden (beispielsweise durch RNAse-Schutz, Northern-Blot-Analyse, quantitative RT-PCR oder Echtzeit-PCR) oder es kann der Zelltod gemessen werden. Alternativ können Zellen mit einem Konstrukt transfiziert werden, die ein Reportergen (beispielsweise Luziferase, fluoreszierendes Protein oder β-Galaktosidase-Gen) und einen hypoxie-responsiven Promotor (beispielsweise den Erythropoietin-Reporter) enthalten, und die Wirkung der Verbindung auf die Expression kann gemessen werden. Zusätzliche zellbasierte Verfahren sind dem Fachmann bekannt und die Verwendung dieser Verfahren ist in der Erfindung eingeschlossen.
Beispielsweise kann ein zellbasierter Test verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die an verschiedenen Punkten entlang dem HIF-Pfad wirken. Solch ein Test kann die Verwendung einer Zellinie einschließen, die ein stabil integriertes, durch Hypoxie induzierbares Reportegen aufweist (beispielsweise Gene für Luziferase, ein fluoreszierendes Protein oder β-Galaktosidase) unter der Kontrolle eines hypoxieresponsiven Promotor- oder Enhancerelements (beispielsweise VEGF oder Erythropoietin). Zellen werden in einem Multiwellformat plattiert, Kandidatenverbindungen werden hinzugefügt und dann werden die Zellen entweder durch echte Hypoxie (beispielsweise 1% Sauerstoff) oder Zugabe von Deferoxamin oder CoCl₂ hypoxisch gemacht, um den HIF-Pfad künstlich zu aktivieren. Die durch Hypoxie induzierbare Transkription kann dann durch Fluoreszenz oder Luziferaseaktivität ausgelesen werden. Bei einer Variation dieses Verfahrens kann in der gleichen Zelle unter der Kontrolle eines anderen Promotors wie dem internen Standard ein zweites fluoreszierendes Protein oder Renilla-Luziferase konstitutiv exprimiert werden. Dies ermöglicht die Kontrolle der nichtspezifischen Unterdrückung der Transkription oder nichtspezifischen Zytotoxizität, die zu einer verminderten Fluoreszenz des konstitutiven Markers sowie des hypoxie-responsiven Markers führen würde. Wiederum hat dieses Verfahren den Vorteil, Verbindungen zu identifizieren, die auf p300/HIF-1α abzielen, kann aber auch verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die auf andere Knotenpunkte auf dem Pfad abzielen (beispielsweise die ARNT/HIF-1α-Wechselwirkung, die HIF-1/DNA-Wechselwirkung und die HIF-1α-Stabilisierung). Dieser Test könnte auch Verbindungen identifizieren, die den Hypoxie-Pfad aufwärtsregulieren. Solche Verbindungen können dahingehend einen Nutzen haben, dass sie proangiogenisch sind (beispielsweise zur Behandlung von koronarer Herzkrankheit, um die EPO-Produktion zu steigern, etc.).
Für irgendwelche zwei spezifischen Ziele kann ein auf einem Säugetier-Zwei-Hybrid basierender Test verwendet werden. Beispielsweise kann ein Partner an gelb fluoreszierendes Protein (beispielsweise YFP-CH1) und der andere Partner an zyan fluoreszierendes Protein (beispielsweise CFP-HIF-1α) fusioniert werden. Um diese Fusionsproteine zu exprimieren, werden Zellen stabil transfiziert. Die Wechselwirkung der Proteine kann durch FREI (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) bewertet werden. Verbindungen, die zu einem Verlust an FREI führen, werden als die Protein-Protein-Wechselwirkung unterbrechend identifiziert. Alternativ kann eine Zelle konstruiert werden, um Gal4-CHI, HIF-VP16 und einen Gal4-GFP-Reporter zu exprimieren. Der Verlust an GFP-Signal zeigt die Identifikation einer Verbindung an, die die Wechselwirkung des Säugetier-Zwei-Hybrids zwischen Gal4-CHI und HIF-VP16 unterbricht, mit sich ergebender verminderter GFP-Expression des ektopischen Gal4-Promotors. Diese Tests, die auf ektopisch exprimierten Proteinen beruhen, erfordern nicht notwendigerweise hypoxische Bedingungen.
Ein anderes Beispiel eines zellbasierten Tests umfasst die Verknüpfung eines hypoxieresponsiven Elements (HRE) an potentiell toxisches Genprodukt (beispielsweise HRE-TK), und dann Selektion nach Verbindungen, die unter hypoxischen Bedingungen (echt oder chemisch induziert) Zytotoxizität verhindern (beispielsweise mit Gancyclovir). Solch ein Test bewertet positiv für Verbindungen, die eine durch Hypoxie induzierbare Transkription zeigen und an sich nicht toxisch sind.
All diese oben beschriebenen Tests können als Hochdurchsatz-Screens von Bibliotheken natürlicher und synthetischer Verbindungen aufgebaut sein. Beispielsweise können Bibliotheken von Verbindungen, wie etwa Peptiden oder Proteinen, verwendet werden, die auf Chips immobilisiert sind. Zusätzlich sind die zellbasierten Tests insbesondere zugänglich sind für die Verwendung beim Screening nach Polypeptiden oder Proteinen, die die Hypoxiereaktion inhibieren. Um genau zu sein, es sind retrovirale Bibliotheken mit hohem Titer/hoher Komplexität konstruiert worden, die Polypeptide, Anti-Sense-RNA oder zufällige Peptide kodieren. Solche retroviralen Bibliotheken können verwendet werden, um eine stabil integrierte HRE-Reporterzelle zu infizieren, und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung können Zellen, bei denen sich die Hypoxiereaktion geändert hat, beispielsweise vermindert oder erhöht hat (beispielsweise wie durch Änderungen der Fluoreszenz erfasst), mit einer Häufigkeit von 1/100.000–1/1.000.000 aussortiert werden. Die vom integrierten Retrovirus kodierte Sequenz kann durch Bergung des Inserts unter Verwendung von PCR bestimmt werden. Zusätzlich können Kristall- oder Lösungsstrukturen von Komponenten des HIF-Pfads, von Fragmenten dieser Komponenten, wie etwa HIF-Polypetide (beispielsweise TAD-C), p300/CBP (beispielsweise CH1) sowie p35srj, oder Komplexen dieser Komponenten unter Verwendung von Standarddatenbanken bei der Identifizierung von kleinen Molekülen verwendet werden, die die 3D-Strukturen nachahmen.
Zusätzlich zu In-vitro- und zellbasierten Verfahren, wie etwa jenen, die oben beschrieben wurden, können In-vivo-Verfahren verwendet werden, um erfindungsgemäße Verbindungen zu identifizieren oder zu charakterisieren. Ein Beispiel eines In-vivo-Verfahrens ist ein Tumorimplantationsmodell, das Xenotransplantationen in Nacktmäuse umfasst. Bei solch einem Verfahren werden Tumorzellen in Nacktmäuse implantiert, die dann entweder mit einer Kandidatenverbindung behandelt oder unbehandelt belassen werden. Die Wirkung einer Kandidatenverbindung kann beispielsweise durch Messung der Tumorgröße oder durch postmortale histologische Analyse (beispielsweise Analyse von Pegeln an HIF-1α, VEGF, Angiogenese und Zelltod) bestimmt werden. Im Fachgebiet sind zusätzliche Tumormodelle bekannt und können bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Sobald Verbindungen als die gewünschte Wirkung aufweisend charakterisiert werden (beispielsweise vermindertes Tumorwachstum oder verminderte Angiogenese), können sie auf Wirkungen auf spezielle Typen von Krebsen analysiert werden, im Bestreben, zu bestimmen, welche Typen von Humankrankheiten unter Verwendung der Verbindungen behandelt werden können. In-vivo-Verfahren können auc verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren oder charakterisieren, die die durch Hypoxie induzierte Transkription potenzieren und somit Kandidatenverbindungen zur Behandlung von myokardialer Ischämie oder Schalganfall sind.
Bei einem zusätzlichen In-vivo-Verfahren können Tumorzellen konstruiert werden, um Luziferase zu exprimieren, solche Zellen können in Mäuse implantiert werden und nach Schwanzveneninjektion von Luziferin kann im lebenden Tier die Luziferaseaktivität ermittelt werden. Um genau zu sein, unter Verwendung einer empfindlichen CCD-Kamera können durch die Haut des Tieres querende Photonen auf nichtinvasive Weise ermittelt und quantifiziert werden. Die Tiere können mit der Zeit longitudinal verfolgt werden, da dies eine nichttödliche Technik ist. Als eine Erweiterung einer solchen Technologie haben wir Tumorzellinien konstruiert, die durch ein hypoxie-responsives Element (multimerisiertes Epo-Enhancer-HRE) Luziferaseaktivität aufweisen. Einmal in Nachtmäuse injiziert, kann der Betrag an Tumorhypoxie quantifiziert werden, sowie sich der Tumor vergrößert. Bei gegebenem Tumorvolumen, nach Quantifizieren der durch Hypoxie induzierbaren Luziferaseaktivität, können Verbindungen von Interesse injiziert werden. Die hypoxiespezifische Reporteraktivität in Tumorzellen können dann der Reihe nach verfolgt werden. Jede Verbindung, die die durch Hypoxie induzierbare Transktiption in vivo unterdrückt, kann auf diese Weise auf die Fähigkeit getestet werden, dies in einem intakten Tier in vivo zu tun. E wurden transgene Mäuse mit einer HRE-Luziferase integriert in jeder Zelle hergestellt. Unter Verwendung solch eines Tieres können wir die Wirkung einer gegebenen Verbindung auf. irgendeine „normal" auftretende lokale Gewebehypoxie bestimmtes erden (beispielsweise, ob es irgendeine durch Hypoxie inuzierbare Transkription in stark sauerstoffabhängigen Organen, wie etwa Gehirn oder Niere, gibt und wie die Kandidatenverbindungen diese Aktivität bewirken). Als eine weitere Erweiterung können Tumorzelllinien mit integrierter HRE-Renilla-Luziferase verwendet werden. Solche Tumorzelllinien werden in HRE-Luziferase transgene Mäuse implantiert, so dass separat Tumorzellhypoxie gemessen werden kann. Solch ein System kann verwendet werden, um Verbindungsdosen zu titrieren, um einen therapeutischen Index zu erreichen, bei dem eine durch Hypoxie induzierbare Transkription vermindert war, aber nicht normale Gewebeaktivität.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Screeningverfahren können Standardverfahren zur Herstellung von Peptidmimetika ausgeführt werden, um Moleküle zu erhalten, die transkriptionale Reaktionen auf Hypoxie modifizieren, beispielsweise durch Unterbrechen der Wechselwirkung zwischen HIF-1α und p300/CBP. Zusätzlich zu Kleinmolekülmodifizierern, die beispielsweise die Wechselwirkung zwischen HIF-1α und CH1 bewirken, können Peptidmoleküle identifiziert werden. Beispielsweise kann Phagen-Display verwendet werden, um Peptidliganden der CH1- und HIF-1α-Bindungsdomänen zu optimieren oder zu identifizieren. Unter Verwendung dieser Verfahren identifizierte Verbindungen können unter Verwendung der oben beschriebenen In-vitro-, zellbasierten und In-vivo-Systeme getestet werden.
p35srj ist ein Protein, das eine negative regulatorische Funktion auf den HIF-1-Pfad besitzt (Bhattacharya et al., Genes Dev. 13(1): 64–75, 1999). Es interagiert mit diesem Pfad durch Bindung an p300/CBP und inhibiert HIF-1-Transaktivierung durch Blockieren der HIF-1α/p300 CH1-Wechselwirkung. p35srj kann demgemäß bei der Erfindung als ein Prototyp-Protein verwendet werden, das mit dem HIF-1-Pfad interagiert.
Verbindungen, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können dem Patienten, der eine Behandlung bedarf (beispielsweise Patienten, die Krebs hat, eine der anderen oben aufgeführten Krankheiten oder irgendeine andere Krankheit oder einen Zustand, die bzw. der mit Hypoxie im Zusammenhang steht), unter Verwendung von Standardmodi zur Verabreichung, wie etwa orale, intravenöse, subkutane, intramuskulare und parenterale Verabreichung, verabreicht. Geeignete Dosierungen von Verbindungen, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifiziert wurden, können durch einen Fachmann leicht bestimmt werden und können beispielsweise 0,001 bis 50 mg/kg/Patient betragen. Zusätzlich können unter Verwendung gentherapeutischer Verfahren peptidbasierte Verbindungen verabreicht werden.
Verbindungen, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifiziert werden, können auch bei Bildgebungsverfahren verwendet werden. Wie es oben erläutert wurde, ist HIF-1α unter normoxischen Bedingungen nicht stabil und demgemäß enthalten normale Zellen keine detektierbaren Pegel an HIF-1α. Verbindungen, die erfindungsgemäß als HIF-1α bindend identifiziert wurden, können demgemäß zur Verwendung bei Hochauflösungs-Bildgebungsverfahren markiert werden, um Krebszellen oder Tumoren sowie ischämisches Gewebe, das beispielsweise aus Schlaganfall oder Herzkrankheit resultiert, zu detektieren.
Die Verfahren der Erfindung beruhen teilweise auf den folgenden experimentellen Ergebnissen.
Experimentelle Ergebnisse
Die detaillierten strukturellen Anforderungen für die p300/CBP-Bindung an HIF-1α wurden durch In-vitro-Tests entschlüsselt, die eine Reihe von GST-fusionierten Deletionsmutanten zentriert um die CH1-Domäne von p300, der primären HIF-1α-Wechselwirkungseinheit dieses Proteins, einsetzen (Arany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12969–12973, 1996; Kallio et al., EMBO J. 17: 6573–6586, 1998). Diese mutanten Fusionsproteine wurden auf die Bindung an in-vivo-translatiertes HIF-1α voller Länge getestet, ein von Zink abhängiger Prozess (1B). Die minimale HIF-1α-Bindungsdomäne erwies sich als 116 Reste umfassend (Aminosäuren 302 bis 418 von p300), die die CH1-Domäne und einige flankierende Sequenzen enthält (1A und 1C). Um die minimale p300-Bindungsdomäne von HIF-1α zu entschlüsseln, wurde eine Reihe von Gal4-fusionierten Trunkationsmutanten des C-Terminus erzeugt. Diese Gal4-Fusionsproteine wurden in vivo translatiert und auf ihre Fähigkeit untersucht, an GST-CH1 zu binden (Aminosäuren 302 bis 443). Die C-terminalen 41 Reste von HIF-1α, die so genannte C-terminale Transaktivierungsdomäne (TAD-C-Domäne) (Jiang et al., J. Biol. Chem. 272: 19253–19260, 1997) wurde als notwendig und ausreichend zur Bindung an GST-CH1 befunden (1A und 1D).
Um weiter die Anforderungen für die HIF-1α/CH1-Bindung zu studieren, wurde eine Reihe con GST1-CH1 (Aminosäuren 302 bis 528) internen Substitutionsmutanten erzeugt. Diesen seriellen, nicht überlappenden Mutanten überspannten die die Reste 341 bis 424 von p300. Bei jeder Mutante wurde fünf Reste entfernt und die Sequenz Asp-Ala-Ala-Ile-Arg-Ser (NAAIRS) eingesetzt. Die NAAIRS-Sequenz kann eine α-Helix- oder eine β-Strang-Konformation einnehmen (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5255–5259, 1985), womit die Wahrscheinlichkeit einer generalisierten konformativen Unterbrechung im Anschluss an das Deletions-/Insertionsereignis vermindert wird. Fast alle Susbtitutionen hoben die Bindung an HIF-1α voller Länge auf (1E), was darauf hindeutet, dass die CH1-Domäne eine komplexe, zinkkoordinierte Konformation einnimmt, um mit HIF-1α zu interagieren.
Die Überproduktion von Polypeptiden entsprechend diesen minimalen Bindungsdomänen (TAD-C oder CH1) führte zu einer Abschwächung der durch Hypoxie induzierbaren Reporteraktivität (2A). Darüber hinaus wiesen nur jene TAD-C- und CH1-Mutanten, die in vitro an ein intaktes Ziel binden (1C und 1D), in vivo eine dominant negative Wirkung auf die durch Hypoxie induzierbaren Reporteraktivität auf (2A). Bei Titrationsexperimenten stellt sich heraus, dass TAD-C-Polypeptide potentere Suppressoren der HIF-Funktion waren, als es die CH1 enthaltenden dominant negativen Polypetide waren, vielleicht wegen der unterstellten konformativen Komplexität von CH1. Demgemäß fokussierten sich anschließende Experimente auf die Aktivität eines Wildtyp-TAD-C-Polypeptids (Aminosäuren 786 bis 826 von HIF-1α) im Vergleich zu der einer um acht Reste verkürzten Mutante (aminosäuren 786 bis 818 von HIF-1α), die nicht dazu in der Lage war, an GST-CH1 zu binden (1D) und die versagte, eine dominant negative Wirkung auf die durch Hypoxie induzierbaren Reporteraktivität auszuüben (2A).
Im Vergleich mit diesen Wirkungen auf die durch HIF-1α vermittelte transkriptionale Aktivität hatte die TAD-C-Polypeptid-Überproduktion keine Wirkung auf RAR, SREBP2 oder SRC-1, die mit den N-terminalen (Chakravarti et al., Nature 383: 99–103, 1996), KIX-(Oliner et al., Genes Dev. 10: 2903–2911, 1996) bzw. den glutaminreichen (Yao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10626–10631, 1996) Domänen von p300/CBP Wechselwirken. Allerdings zeigte sie die transkriptionale Aktivität von STAT2, die, wie HIF-1α, CH1 verwendet, um seine Koaktivierung zu vermitteln (Arany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12969–12973, 1996; Bhattacharya et al., Nature 383: 344–347, 1996). Diese Ergebnisse implizieren, dass ein intaktes TAD-C-Polypeptid an die CH1-Domäne bindet und den Zugang mehrerer Proteine blockiert, ohne eine generalisierte suppressive Wirkung auf andere p300/CBP-Funktionen zu induzieren.
Um die Expression der relevanten TAD-C- und mutanten Polypetide zu erleichtern, wurden VSV-G pseudotypisierte Retroviren konstruiert, um Gal4-Trägerprotein alleine oder Gal4 fusioniert entweder an Wildtyp- oder mutantes TAD-C-Polypeptid zu exprimieren. HepG2-Zellen wurden mit diesen Retroviren mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 infiziert, entweder normalen oder hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und es wurden durch einen Ribonukleaseschutztest VEGF-mRNA-Pegel bestimmt. Bei diesen und verwandten Experimenten (siehe beispielsweise 3A Einschub) wurde regelmäßig eine äquivalente Expression von Gal4 und der Gal4 fusionierten Polypeptide erzielt. In Übereinstimmung mit den oben erwähnten Reportertests wurde die VEGF-mRNA-Abundanz in Zellen reproduzierbar vermindert, die Wildtyp- aber nicht mutantes TAD-C-Polypeptid exprimieren, sowohl unter normoxischen sowie hypoxischen Bedingungen (2C). Die Gesamtabundanz von HIF-1α unter hypoxischen Bedingungen wurde durch Einführung von TAD-C nicht verändert.
Das Zellüberleben unter normoxischen Bedingungen war im Wesentlichen gleich bei HepG2-Zellen, die entweder Gal4 alleine oder Gal4 fusioniert an TAD-C- oder Mutanten-Polypetid exprimiert (2D). Das Zellwachstum wurde ebenfalls nicht unter normoxischen Bedingungen beeinträchtigt. Unter hypoxischen Bedingungen wurde allerdings der Zelltod leicht, aber signifikant, bei Zellen erhöht, die Wildtyp-TAD-C-Polypeptid exprimieren, im Vergleich zu Zellen, die Gal4 alleine oder Gal4 fusioniert mit mutantem Polypeptid exprimieren (2D).
Um diese Befunde auszudehnen, wurde in einem Nacktmaus-Xenotransplantations-Modell das Wachstum von modifizierten humanen Tumorzellen getestet. Tumorzellen wurden retroviral bei gleicher MOI transduziert, was zu einer äquivalenten Expression von Gal4 oder Gal4 fusioniert an Wildtyp- oder mutantes TAD-C-Polypeptid führt (3A, Einschub). Das Tumorwachstum wurde bei HCT116- (3A) oder MDA-MB435S-Zellen (3B), die Wildtyp-TAD-C-Polypeptid exprimieren, signifikant und reproduzierbar abgeschwächt, im Vergleich zu den gleichen Zellen, die Gal4 alleine oder Gal4 fusioniert an mutantes Polypeptid exprimieren (3A und 3B). Diese Wirkung war unabhängig vom p53-Status, da HCT116-Zellen Wildtyp-p53 aufweisen, während MDA-MD435S-Zellen mutantes p53 exprimieren. Darüber hinaus demonstrierte eine Immunblot-Analyse für p53 keinen Unterschied in der p53- Abundanz in HCT115-Zellen, die diese drei ektopischen Gal4-Polypeptide exprimieren (3C).
Wir waren daran interessiert, zu lernen, ob die Anti-Tumor-Wirkung der TAD-C-Polypeptid-Expression infolge einer Paracrinwirkung erfolgt, bei der eine Zelle, die TAD-C produziert, einen Faktor oder Faktoren vervollkommnet, der bzw. die das Wachstum von umgebenden Tumorzellen unterdrücken. Um genau zu sein, Tumorzellen, die entweder Gal4-TAD-C- oder Gal4-mutantes Polypeptid exprimieren, wurden in gleichen Zahlen vor der Implantation gemischt. Wenn Tumoren nach drei Wochen Wachstum exzidiert wurden, gab es einen starken Hang zu Zellen, die das mutante Polypeptid exprimieren (3D), was darauf hinweist, dass die Anti-Tumor-Wirkung der Expression von TAD-C kein Ergebnis einer Paracrinwirkung war, die sich aus der Vervollkommnung eines trans-dominanten Anti-Tumor-Faktors ergibt.
Nekropsie und histologische Untersuchung der Injektionsstelle von Tumorzellen, die konstruiert wurden, um Gal4 fusioniertes Polypeptid zu exprimieren, offenbarte große Gebiete von zentraler Nekrose mit einem schmalen Rand vitaler Tumorzellen angrenzend an das subkutane Gewebe (4A), sogar bei Fehlen eines grob erkennbaren Tumors an diesen Stellen (4B). Kontrolltumoren, die aus Zellen entstehen, die Gal4 oder Gal4 fusioniert an mutantes Polypeptid exprimieren, zeigten kleine Gebiete von Nekrose, aber ausgedehnte Gebiete vitalen Tumors (4A). Immunfärbung auf die Endothelzellmarker, CD31/PECAM, zeigte reichliche Kapillarbildung innerhalb von Kontrolltumorsegmenten im Vergleich zu TAD-C exprimierenden Tumoren (4A). Es ist unklar, ob dies ein primärer oder ein sekundärer Effekt war, d. h. dass es wegen der verringerten Gefäßdichte weniger Tumorzellen gab oder umgekehrt.
Da mehrere bekannte Transkriptionsfaktoren mit der CH1-Domäne von p300 Wechselwirken und die TAD-C-Polypeptid-Expression die CH1-Funktion allgemein zu unterbrechen scheint (2B), haben wir uns gefragt, ob die Störung der HIF-1α-Bindung/Funktion eine kritische Komponente der TAD-C-Anti-Tumor-Wirkung ist.
Demgemäß wurde ein HIF-1α-Allel konstruiert, in dem die Sauerstoff-Degradations-Domäne entfernt war und TAD-C durch VP16 (HIF-VP16) ersetzt war, wobei ein konstitutiv aktives CH1-unabhängiges HIF-1α-Molekül erzeugt wird. HCT116-Zellen wurden zuerst entweder mit VP16 alleine oder mit HIF-VP16 transduziert. Nach Selektion wurden diese Zellen mit Gal4 fusioniert an Wildtyp- oder mutantem TAD-C-Polypeptid transduziert. Mit Koexpression von unfusioniertem VP16 wurde das Tumorwachstum durch TAD-C abgeschwächt im Vergleich zum mutantem Polypeptid (5B), in Übereinstimmung mit den oben zusammengefassten Ergebnissen. Allerdings gab es mit Koexpression von HIF-VP16 identisches Tumorwachstum durch Zellen, die entweder TAD-C oder mutantes Polypeptid exprimieren (5B). Durch Immunblot-Analyse hatte die Koexpression von HIF-VP16 keine Wirkung auf die Expression von TAD-C oder mutantem Polypeptid im Vergleich zur Koexpression von VP16 alleine. Demgemäß ist, ungeachtet anderer Effekte, die Unterbrechung der Wechselwirkung von HIF-1α mit CH1 ein notwendiges Ereignis bei der durch TAD-C vermittelten Suppression des Tumorwachstums.
Die oben beschriebenen experimentellen Ergebnisse wurden unter Verwendung der folgenden Materialien und Methoden erhalten.
Materialien und Methoden
Plasmide und Retroviren. Plasmide wurden unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt (Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, New York, 1988)) und wurden durch Sequenzieren verifiziert. Alle Säugetierexpressionsvektoren nutzten CMV-Promotoren. GST-Fusionsproteine wurden durch Subklonieren von PCR-Fragmenten in pGEX-Vektoren (Pharmacia) erzeugt. Gal4-Fusionsproteine wurden in pCMX-Gal4(N) gefertigt (R. Evans). Das Überprüfen der NAAIRS-Mutagenese von GST-CH1 (Aminosäuren 302 bis 528) wurde unter Verwendung einzelsträngiger Mutagenese (Muta-Gene, Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. pCMV-CH1-Mutanten wurden durch Subklonieren von PCR-Produkten in pCMV/myc/nuc (Invitrogen) konstruiert. Durch Subklonieren von PCR-Fragmenten von Thioredoxin A aus E. coli in pcDNA3.1 (Invitrogen) wurde ein thioredoxin-abhängiger Expressionsvektor erzeugt, wobei neue eindeutige Restriktionsstellen innerhalb der aktiven Schleife erzeugt wurden, ähnlich zu früheren Berichten (La Vallie et al., Biotechnology (NY) 11: 187–193, 1993). Das für die In-vitro-Translation verwendete HIF-1α-Plasmid, Epo-Luziferase-Reporter, Gal4-luciferase-Reporter und pCMV-LacZ-, Gal4-SRC1-, Gal4-SREBP2-, Gal4-RAR-, Gal4-STAT2- und Gal4-HIF1α-Expressionsvektoren sind kürzlich beschrieben worden (Arany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12969–12973, 1996; Yao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10626–10631, 1996; Bhattacharya et al., Nature 383: 344–347, 1996; Bhattacharya et al., Genes Dev. 13: 64–75, 1999). VSV-G-pseudotypisierte Retroviren wurden in pMMP konstruiert und durch Kotransfektion mit pMD-MLV und pMD-G (R. Mulligan) in 293T-Zellen verpackt. Titer wurden durch Infektion der intendierten Zielzelllinien bestimmt. HIF-VP16- and VP16-Retroviren wurden in pBABE-puro konstruiert und wie oben erwähnt verpackt und getitert.
In-vitro-Translation und In-vivo-Protein-Bindungstest. Mit der Ausnahme wo es angegeben ist, waren alle Reagenzien von Sigma. In-vitro-Transkription/Translation (IVT) wurde in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin (NEN) unter Verwendung von T3- oder T7-Polymerase gekoppelt mit Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (TNT, Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. GST-Fusionsproteine wurden in Bakterien produziert und davon gereinigt und die Bindung von IVT-Proteinen wurde wie kürzlich beschrieben (Grossman et al., Mol. Cell. 2: 405–415, 1998) ausgeführt. Mit der Ausnahme wo es angegeben ist, bestand der Bindungs- und Waschpuffer aus 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,2% NP-40, 1 mM DTT, 10 μM ZnCl₂, 2 μM EDTA, PMSF 50 μg/ml, Pepstatin 1 μg/ml, Leupeptin 1 μg/ml, and Aprotinin 1,9 μg/ml. Wo angegeben, wurden Schwermetalle durch drei Wechsel des Waschpuffers, der 1,10-Phenanthrolin (Aldrich) bei 10 mM enthielt, chelatisiert. Bei der Zink-Rekonstitution nach Chelatisierung von Schwermetallen wurde ultrareines Zinkchlorid (> 99,999%, Aldrich) eingesetzt.
Reportertests. Luziferase- und β-Galaktosidasetests wurden wie kürzlich beschrieben ausgeführt (Bhattacharya et al., Genes Dev. 13: 64–75, 1999). In allen Fällen wurde die Luziferaseaktivität auf β-Galaktosidaseaktivität als eine interne Kontrolle für die Transfektionswirksamkeit und globale Änderungen der transkriptionalen Aktivität korrigiert. Die Ergebnisse wurden als korrigierte relative Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt. Für jedes Reporterexperiment wurden wenigstens zwei unabhängige Experimente ausgeführt.
Hypoxie. Hypoxie wurde durch Inkubieren von Zellen in einer feuchten Umgebung bei 37°C in einem Cellstar 3-Gas-Inkubator (Harris) bewahrt bei 10% CO₂ und 1% O₂ erreicht. Akkurate O₂- und CO₂-Regulation wurde periodisch mit einem Fryrite Gasanalysator (Bacharach) verifiziert.
Zellkultur und retrovirale Infektion. Tumorzelllinien wurden aus ATCC erhalten und wurden in DMEM kultiviert, das mit 10% FBS, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin (Gibco-BRL) ergänzt war. Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden der Reihe nach 12 Stunden auseinander mit VSV-G pseudotypisiertem pMMP-Gal4 Retroviren infiziert, um in Abhängigkeit vom Experiment eine finale MOI von 5 oder 10 zu erreichen. Es wurde keine Selektion verwendet, da Immunfärbung bei dieser MOI routinemäßig 100% Infektion von Zellen demonstrierte. Für pBABE-puro-VP16 oder pBABE-puro-HIF-VP16 wurden Zellen 4 Tage lang mit einer MOI von < 1 infiziert und mit Puromycin (2 μg/ml) infiziert. Den Zellen wurde ermöglicht, sich 1 Tag lang zu erholen, und wurden dann mit einer MOI von 5 mit pMMP-Gal4-Retroviren infiziert.
Immunblot-, Ribonukleaseschutz- und Zelltod-Tests. Immunblot-Analysen auf Gal4 (RK5Cl, Santa Cruz Biotechnology), p53 (DO-1, Oncogene Research) und HIF-1α (OZ15 (Arany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12969–12973, 1996)) wurden unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, New York, 1988)) ausgeführt. Die gesamte RNA wurde isoliert (RNeasy, Qiagen) und Ribonukleaseschutztests wurden unter Verwendung eines Multiprobe Human-Angiogenese-Kits (RiboQuant, Pharmingen) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Der Zelltod wurde durch Anfärben mit Anti-Annexin-V-Antikörper (Pharmingen) und 7-Aminoactinomycin D (Pharmingen) gemessen und durch Durchflusszytometrie gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.
Xenotransplantationsmodell. Nacktmäuse (Taconic) wurden mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen erhalten und ihnen ermöglicht, sich 1 Woche vor der Tumortransplantation zu akklimatisieren. Den Tumorzellen wurde ermöglicht, sich nach der retroviralen Infektion vor der Implantation in Nacktmäuse wenigstens 48 Stunden lang zu erholen. Die angegebene Zahl der Tumorzellen wurde subkutan und bilateral in die Flanken von Mäusen injiziert. Die Tumoren wurden mit Schieblehren gemessen und das Tumorvolumen wurde als 0,5 × L × W² berechnet. Für jede Zelllinie wurden wenigstens zwei unabhängige Experimente ausgeführt. Wo es angegeben ist, wurden die Tumoren exzidiert und in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert oder zerhackt und in RIPA/300-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% DOC, 0,1% SDS, 1 mM DTT, Proteaseinhibitoren) lysiert. Immunfärbung mit Anti-Gal4 (IKE, Santa Cruz Biotechnology) oder Anti-CD31 (MEC13.3, Pharmingen) wurde unter Verwendung des Vectastain-ABC-Elite-Systems (Vector) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.

Claims

In-vivo-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die eine Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in einer Zelle innerhalb eines nichtmenschlichen Tieres moduliert, wobei die Zelle ein Reportergen unter der Kontrolle eines auf Hypoxie reagierenden Elements umfasst, wobei das Verfahren folgendes umfasst: In Kontakt bringen der Zelle in vivo oder der extrazellulären Umgebung der Zelle in vivo mit einem Verbindungskandidaten, Unterwerfen der Zelle den hypoxischen Bedingungen in vivo und Beurteilen der Transkriptionsreaktion der Zelle auf die hypoxischen Bedingungen durch Messen der Transkriptionsreaktion in vivo, wobei die Zelle keine menschliche embryonale Stammzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reportergen Luciferase, grün fluoreszierendes Protein, gelb fluoreszierendes Protein oder cyan fluoreszierendes Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reportergen Luciferase kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das auf Hypoxie reagierende Element multimeriserter Epo-Enhancer HRE ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die hypoxiespezifische Reportergenaktivität im selben Tier fortlaufend verfolgt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hypoxischen Bedingungen, denen die Zellen ausgesetzt werden, durch Deferoxamin oder Kobaltchlorid hervorgerufen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Zunahme oder Abnahme der Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in der Zelle in der Gegenwart des Verbindungskandidaten im Vergleich zur Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in einer Zelle bei Abwesenheit des Verbindungskandidaten anzeigt, dass der Verbindungskandidat die Transkriptionsreaktion auf Hypoxie moduliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nichtmenschliche Tier ein Säugetier ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Säugetier eine Maus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verbindungskandidat ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Verbindungskandidat ein kleines Molekül ist.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die eine Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in einer Zelle moduliert, unter Verwendung eines Säugetier-Zwei-Hybrid-Tests, wobei das Verfahren folgendes umfasst: In Kontakt bringen einer Zelle oder der extrazellulären Umgebung einer Zelle mit einer Bibliothek von Verbindungskandidaten in vitro, wobei die Zelle ein Fusionsprotein, das ein p300/CBP-Peptid umfasst, das aus den Aminosäuren 302 bis 418 von p300/CBP besteht, fusioniert an einen Fusionspartner, und ein Fusionsprotein von HIF-1α oder einem Fragment davon, fusioniert an einen zweiten Fusionspartner, enthält und die Bindung des p300/CBP-Peptids an HIF-1α durch Erfassen der Wechselwirkung des ersten mit dem zweiten Fusionspartner erfasst wird, wobei eine Verbindung, die die Bindung des p300/CBP-Peptids an HIF-1α oder einem Fragment davon moduliert, eine Verbindung ist, die eine Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in einer Zelle moduliert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der erste Fusionspartner Gal4 ist und der zweite Fusionspartner VP16 ist und die Zelle zudem ein Gal4-Reportergen-Konstrukt enthält, wobei die Bindung des p300/CBP-Peptids an HIF-1α oder einem Fragment davon dann zur Transkription des Gal4-Reportergen-Konstrukts in der Zelle führt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der erste und zweite Fusionspartner aus gelb fluoreszierendem Protein und cyan fluoreszierendem Protein ausgewählt sind und die Wechselwirkung durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das HIF-1α-Fragment im Wesentlichen aus der TAD-C-Region von HIF-1α besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Bibliothek von Verbindungskandidaten natürliche und/oder synthetische Verbindungenumfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Verfahren im Hochdurchsatzformat ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die Bibliothek von Verbindungskandidaten auf einem Chip enthalten ist.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die eine Transkriptionsreaktion auf Hypoxie in einer Zelle moduliert, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellen von HIF-1α oder einem Fragment davon; Bereitstellen der Region von p300/CBP, die aus den Aminosäuren 302 bis 418 besteht; In Kontakt bringen entweder von HIF-1α oder einem Fragment davon oder einer Mischung von HIF-1α oder einem Fragment davon mit den p300/CBP-Aminosäureresten 302 bis 418 mit einem Verbindungskandidaten; und Bestimmen, ob der Verbindungskandidat die Wechselwirkung des HIF-1α oder des Fragments davon mit den p300/CBP-Aminosäureresten 302 bis 418 beeinträchtigt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das HIF-1α-Fragment im Wesentlichen aus der TAD-C-Region von HIF-1α besteht.