DE69831136T2 - Eiweisbruchstückergänzungstests zum nachweis biomolekularinteraktionen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Funktionsbestimmung neuer Genprodukte. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Proteinfragmentkomplementationassays (PCA). PCAs ermöglichen die Erfassung einer Vielfalt verschiedener Arten von Protein-Protein-, Protein-RNA-, Protein-DNA-, Protein-Kohlehydrat-Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen von organischen Molekülen in Proteingrösse in verschiedenen zellulären Kontexten, die für die Untersuchung solcher Wechselwirkungen geeignet sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Viele biologische Prozesse, einschließlich Transkription, Translation und Stoffwechsel- oder Signaltransduktionswege werden durch nicht kovalent gebundene Multienzymkomplexe vermittelt1,101. Die Bildung von Multiprotein- oder Proteinnukleinsäurekomplexen stellt den effizientesten chemischen Mechanismus dar. Ein großer Teil der modernen biologischen Forschung befasst sich mit der Identifizierung von Proteinen, die an zellulären Prozessen beteiligt sind, mit der Bestimmung ihrer Funktionen und damit, wie, wann und wo sie in Wechselwirkung mit anderen Proteinen stehen, die an spezifischen Übertragungswegen beteiligt sind. Des Weiteren entsteht mit den schnellen Fortschritten im Bereich der Genomsequenzierungsprojekte ein Bedarf, Verfahren zu entwickeln, um "Protein-Kopplungskarten" zu erstellen, genaue Verzeichnisse von Proteinwechselwirkungen, die funktionelle Anordnungen von Proteinen darstellen2,3. Obwohl es sehr wichtig ist, die Proteinanordnung bei biologischen Prozessen zu verstehen, gibt es wenige geeignete Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo4,5. Lösungsansätze beinhalten die Verwendung chemischer Vernetzungsreagenzien und den Resonanzenergietransfer zwischen über Farbstoff gebundenen Proteinen102,103. Ein leistungsfähiges und häufig angewandtes Verfahren, das Hefe-Two-Hybrid-System, wird verwendet, um neue Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren und die Aminosäure-Determinanten spezifischer Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen4,6-8. Der Lösungsansatz ermöglicht schnelles Screenen einer Vielzahl von Klonen, einschließlich cDNA-Bibliotheken. Einschränkungen dieser Technik umfassen die Tatsache, dass die Wechselwirkung in einem spezifischen Kontext (dem Kern von S. cerevisiae) erfolgen muss, und sie grundsätzlich nicht verwendet werden kann, um induzierte von konstitutiven Wechselwirkungen zu unterscheiden.
  • Vor kurzem wurde von Johnsson und Varshavsky108 ein neues Verfahren zur Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen vorgestellt, und zwar der auf Ubiquitin basierende Split-Protein Sensor (USPS)9. Das Verfahren basiert auf der Spaltung von Proteinen mit N-terminalen Fusionen zu Ubiquitin durch Zytosolproteasen (Ubiquitinasen), die deren Tertiärstruktur erkennen. Das Verfahren beruht auf dem Wiederzusammenbau der Tertiärstruktur des Proteins Ubiquitin aus komplementären N- und C-terminalen Fragmenten und ganz entscheidend auf der Erweiterung dieses Wiederzusammenbaus durch mit diesen Fragmenten verschmolzenen Oligomerisationsdomänen. Der Wiederzusammenbau wird erfasst als spezifische Proteolyse des zusammengebauten Produkts durch Zytosol-Proteasen (Ubiquitinasen). Die Autoren zeigten, dass eine Fusion eines Reporter-Protein-Ubiquitin-C-terminalen Fragments auch durch Ubiquitinasen gespalten werden kann, aber nur, wenn sie mit einem zum C-terminalen Fragment komplementären N-terminalen Fragment von Ubiquitin koexprimiert waren. Die Wiederherstellung einer zu beobachtenden Ubiquitinase-Aktivität fand nur statt, wenn die N- und C-terminalen Fragmente durch GCN4-Leukin-Zipper gebunden waren109,110. Die Autoren schlugen vor, dass dieses "Split-Gen"-Verfahren als in vivo-Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen und zur Analyse der Kinetik von Proteinanordnungen in Zellen angewandt werden könnte. Leider erfordert dieses Verfahren zusätzliche zelluläre Faktoren (in diesem Fall Ubiquitinasen) und das Erfassungsverfahren eignet sich nicht für das Hochleistungs-Screenen von cDNA-Bibliotheken.
  • Rossi, F., C. A. Charlton und H. M. Blau (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA 94, 8405-8410) berichteten von einem Assay basierend auf der klassischen Komplementation von α- und ω-Fragmenten von β-Galaktosidase (β-gal) und Induktion einer Komplementation durch induzierte Oligomerisation der Proteine FKBP12 und des Säugetier-Empfängers von Rapamycin durch Rapamycin in transfizierten C2C12-Myoblastenzelllinien. Die Wiederherstellung der β-gal-Aktivität wird durch Verwendung des Substrats Fluoreszein-di-β-D-Galaktopyranosid und mithilfe von mehreren Fluoreszenzerfassungs-Assays erfasst. Obwohl dieser Assay einige Ähnlichkeiten mit der vorliegenden Erfindung aufweist, gibt es einige bedeutende Unterschiede. Erstens wird dieser spezielle Komplementations-Ansatz seit über dreißig Jahren in einer riesigen Zahl von Anwendungen, einschließlich der Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. M. Krevolin und D. Kates (1993, U.S. Patent Nr. 5,362,625) lehrt die Verwendung dieser Komplementation zur Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Des Weiteren wurde bereits über die Erzielung der β-gal-Komplementation in Säugetierzellen berichtet (P. Moosmann und S. Rusconi (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1171–1172). Die einzelnen hier vorgestellten PCAs sind vollständig de novo entworfene Assays zur Erfassung von Wechselwirkungen und sind bis jetzt in keiner Weise beschrieben, außer in Publikationen, die aus dem Labor des Anmelders hervorgingen. Zweitens beschreibt diese Anmeldung ein allgemeines Verfahren, um Assays für molekulare Wechselwirkungen aus einer großen Zahl von Enzym- oder Protein-Detektoren zu entwickeln, wobei es sich bei allen um de novo entwickelte Assays handelt, wohingegen der β-gal-Assay nicht neu ist, genauso wenig wie alle allgemeinen Verfahren oder Vorgehensweisen bezüglich früherer, gut dokumentierter, vorhandener Anwendungen.
  • Wie im Fall von USPS, erfordert das Hefe-Two-Hybrid-Verfahren einen zusätzlichen zelluläre Mechanismus zur Erfassung, der nur in spezifischen zellulären Kompartimenten vorhanden ist. Deshalb besteht Bedarf an einem Erfassungssystem, das die Wiederherstellung einer spezifischen Enzymaktivität aus Fragmenten des Assay selbst verwendet, ohne die Notwendigkeit weiterer Proteine zur Erfassung der Aktivität. Vorzugsweise sollte der Assay eine oligomerisations-gestützte Komplementation von Fragmenten monomerer oder multimerer Enzyme beinhalten, die keine weiteren Proteine zur Erfassung ihrer Aktivität erfordern. Des Weiteren wäre es, wenn die Struktur eines Enzyms bekannt wäre, möglich, Fragmente des Enzyms zu entwerfen, um sicherzustellen, dass die wieder zusammengebauten Fragmente aktiv wären, und Mutationen einzubringen, um die Erfassungsstringenz des Wiederzusammenbaus zu verändern. Die Kenntnis der Struktur ist jedoch keine Voraussetzung für die Herstellung komplementärer Fragmente, wie nachstehend erklärt wird. Die Flexibilität beim Entwurf eines solchen Ansatzes würde ihn geeignet machen für Situationen, in denen andere Erfassungssysteme nicht geeignet sind.
  • Jüngste Weiterentwicklungen im Bereich der humanen Genomforschung haben zu einem schnellen Fortschritt bei der Identifizierung neuer Gene geführt. Bei Anwendungen für die biologische und pharmazeutische Forschung besteht nun der dringende Bedarf, die Funktionen neuer Genprodukte zu bestimmen, zum Beispiel für Gene, die in Zusammenhang mit Krankheits-Phänotypen stehen. Es sind die Fragen bezüglich der Funktion, bei denen die die auf Genomen basierende pharmazeutische Forschung stecken bleibt und es besteht nun der Bedarf an Verbesserungen in der Entwicklung einfacher und automatisierbarer funktioneller Assays. Ein erster Schritt bei der Definition der Funktion eines neuen Gens ist die Bestimmung seiner Wechselwirkungen mit anderen Genprodukten in einem geeigneten Kontext; das heißt, da Proteine spezifische Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Biopolymeren als Teil funktioneller Anordnungen zeigen, besteht ein geeigneter Weg zur Untersuchung der Funktion eines neuen Gens darin, dessen physische Beziehungen mit den Produkten anderer Gene zu bestimmen.
  • Techniken zum Screenen nach Protein-Wechselwirkungen, wie z.B. das Hefe-"Two-Hybrid"-System, haben die Molekularbiologie verändert, aber sie können nur eingesetzt werden, um bestimmte Arten von konstitutiv interagierenden Proteinen oder Wechselwirkungen von Proteinen mit anderen Molekülen in eng definierten zellulären und kompartimentären Kontexten zu untersuchen und erfordern den Ablauf komplexer zellulärer Mechanismen (Transkription). Ein rationelles Screenen nach Protein-Wechselwirkungen im Kontext eines spezifischen Problems erfordert flexiblere Ansätze; speziell sind hier Assays erforderlich, die nicht nur die Kriterien zur Erfassung molekularer Wechselwirkungen erfüllen, sondern auch für zur Bestätigung dieser Wechselwirkungen als spezifisch und biologisch relevant.
  • Nachfolgend eine Aufstellung der Assay-Charakteristika, die solche Kriterien erfüllen:
    • 1) Ermöglichung der Erfassung von Protein-Protein-, Protein-DNA/RNA oder Protein-Wirkstoff-Wechselwirkungen in vivo oder in vitro.
    • 2) Ermöglichung der Erfassung dieser Wechselwirkungen in geeigneten Kontexten, wie z.B. in einem spezifischen Organismus, Zelltyp, Zellkompartiment oder einer Organelle.
    • 3) Ermöglichung der Erfassung induzierter gegenüber konstitutiver Protein-Protein-Wechselwirkungen (wie z.B. durch einen Zellwachstums- oder -hemmfaktor).
    • 4) Die Fähigkeit, spezifische von nicht-spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen durch die Steuerung der Empfindlichkeit des Assay zu unterscheiden.
    • 5) Ermöglichung der Erfassung der Kinetik der Proteinanordnung in Zellen.
    • 6) Ermöglichen des Screenens von Bibliotheken von cDNA, kleinen organischen Molekülen, oder DNA oder RNA nach molekularen Wechselwirkungen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung strebt an, den oben genannten Bedarf, zu dem der Stand der Technik keinerlei Angaben macht, abzudecken. Die vorliegende Erfindung bietet ein allgemeines Verfahren zur Erfassung von Protein-Wechselwirkungen mit anderen Biopolymeren einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, Kohlehydrate oder für das Screenen von Bibliotheken kleiner Moleküle nach Verbindungen von potentiell therapeutischem Wert. In einer bevorzugten Ausführungsform strebt die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer oligomerisations-gestützten Komplementation von Fragmenten monomerer Enzyme an, die keine weiteren Proteine für die Erfassung ihrer Aktivität erfordert. In einer solchen Ausführungsform wird hiermit ein Proteinfragmentkomplementationsassay (PCA) zur Verfügung gestellt, der auf der Wiederherstellung der Dihydrofolatreduktaseaktivität durch Komplementation bestimmter Fragmente des Enzyms in E. coli basiert. Dieser Assay erfordert keine weiteren endogenen Faktoren zur Erfassung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen (z.B. Leukin-Zipper-Wechselwirkungen) und kann zweckmäßigerweise auf das Screenen von Bibliotheken von cDNA, Nukleinsäuren, kleinen Molekülen oder Proteinanordnungen nach molekularen Wechselwirkungen ausgedehnt werden. Darüber hinaus kann der Assay auch für die Erfassung von Protein-Wechselwirkungen in jedem zellulären Kontext oder Zellkompartiment angepasst werden und dazu verwendet werden, um sowohl in prokaryoten als auch in eukaryoten Systemen induzierte von konstitutiven Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden.
  • In einem ersten Aspekt sieht die Erfindung einen Proteinfragmentkomplementationsassay für die Erfassung molekularer Wechselwirkungen vor, umfassend einen Wiederzusammenbau von einzelnen Fragmenten eines Proteins, wobei der Wiederzusammenbau der Proteinfragmente durch die Wechselwirkung von molekularen Domänen bewirkt wird, die mit jedem Proteinfragment verschmolzen sind, wobei der Wiederzusammenbau der Proteinfragmente unabhängig von anderen molekularen Prozessen ist und wobei der Wiederzusammenbau durch die Wiederherstellung der Proteinaktivität erfasst wird.
  • Bei dem Protein handelt es sich vorzugsweise um ein monomeres Protein; besser noch ist das Protein ein Enzym; noch bevorzugter ist das Enzym ein monomeres Enzym. Ein bevorzugtes Molekulargewicht für das Enzym liegt zwischen 10 und 40 kDa.
  • Das Enzym, das im Assay entsprechend dem ersten Aspekt der Erfindung verwendet wird, kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Glutathion-S-Transferase, Dihydrofolatreduktase, Luciferase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Adenosindeaminase, Hygromycin-B-Phosphotransferase und L-Histidinol-NAD+-Oxidoreduktase besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dihydrofolatreduktase am Aminosäurerest 114 mutiert.
  • Das Protein, das im Assay entsprechend dem ersten Aspekt der Erfindung eingesetzt wird, kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Grünfluoreszenzprotein und einem Bleomycin bindenden Protein (Zeocin-Resistenzgen) besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Grünfluoreszenzprotein am Aminosäurerest 65 mutiert.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erfassen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden, nicht-menschlichen Organismen und/oder in nicht-menschlichen Zellen und/oder menschlichen Zellen bereit, die isoliert und/oder kultiviert wurden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Synthetisieren von Probe- bzw. Sonden-Proteinfragmenten aus einem Enzym, das durch Zerlegen des für das Enzym codierenden Gens in mindestens zwei Fragmente eine dominante Selektion ermöglicht;
    • (b) Aufbauen von Fusionsproteinen, die aus den Sonden-Proteinfragmenten bestehen, die mit molekularen Domänen verbunden sind, welche auf Wechselwirkungen hin untersucht werden sollen;
    • (c) Koexprimieren der Fusionsproteine; und
    • (d) Erfassen der Wiederherstellung der Enzymaktivität mittels des Assays gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Koexpression der komplementären Fusionsproteine durch die Bindung der molekularen Domänen aneinander katalysiert.
  • Bei dem Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung ist das Enzym vorzugsweise Dihydrofolatreduktase.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Fusionsproteine Peptide auf, die aus N- und C-terminalen Fragmenten der Dihydrofolatreduktase bestehen und mit den GCN4-Leukin-Reißverschlusssequenzen bzw. -Zippersequenzen verschmolzen sind.
  • Darüber hinaus bietet die Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Expressionsbibliothek, umfassend das Durchführen eines Proteinkomp ementationsassays nach dem ersten Aspekt der Erfindung, wobei es sich beim Assayerfassungsmittel um eine Wiederherstellung der Proteinaktivität handelt. Vorzugsweise erfolgt bei diesem Verfahren des Screenens eine Wechselwirkung zwischen Teilen eines ersten oder zweiten Mo leküls aufgrund der Gegenwart von mindestens einem anderen Molekül, das die Wechselwirkung vermittelt.
  • Ein bestimmtes Verfahren zum Entwurf eines Proteinkomplementationsassays (PCA) basiert auf folgenden Charakteristika: 1) Ein Protein oder Enzym, das relativ klein und monomer ist, 2) für das umfangreiche Literatur hinsichtlich struktureller und funktioneller Informationen vorhanden ist, 3) für das einfache Assays für die Wiederherstellung des Proteins oder der Aktivität des Enzyms, sowohl in vivo als auch in vitro existieren, und 4) für das Überexpression in eukaryoten und prokaryoten Zellen gezeigt wurde. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, wird die Struktur des Enzyms betrachtet, um zu entscheiden, welches die beste Stelle in der Polypeptidkette ist, um das Gen in zwei Teile zu spalten, basierend auf folgenden Kriterien: 1) Die Fragmente sollten zu Subdomänen kontinuierlicher Polypeptide werden; das heißt, dass die entstehenden Fragmente nicht die Subdomänen-Struktur des Proteins stören, 2) die katalytischen und Kofaktor-Bindungsstellen sollten alle in einem Fragment enthalten sein, und 3) neu entstehende N- und C-Termini sollten auf der gleichen Seite des Proteins sein, um die Notwendigkeit langer Peptidverbindungsstücke zu vermeiden und die Untersuchung der Richtungsabhängigkeit der Proteinbindung zu ermöglichen.
  • Es sollte klar sein, dass die oben genannten Kriterien nicht alte erfüllt sein müssen, damit die vorliegende Erfindung gut funktioniert. Es ist von Vorteil, wenn das Enzym klein ist, vorzugsweise zwischen 10 und 40 kDa. Obwohl monomere Enzyme bevorzugt werden, können auch multimere Enzyme als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden. Das dimere Protein Tyrosinase kann im Sofort-Assay eingesetzt werden. Die Information bezüglich der Struktur des Enzyms bietet einen weiteren Vorteil beim Entwurf des PCA, ist aber nicht notwendig. Tatsächlich wird ein zusätzliches Verfahren, einen PCA zu entwickeln, vorgestellt, basierend auf einer Kombination aus durch Exonuklease aufgeschlossenen Proteinfragmenten, gefolgt von gerichteter Proteinentwicklung in Anwendung auf das Enzym Aminoglycosidkinase. Obwohl die Überexpression in prokaryoten Zellen bevorzugt wird, ist sie nicht unbedingt notwendig. Dem erfahrenen Fachmann wird klar sein, dass die Enzymkatalysestelle (des gewählten Enzyms) sich nicht unbedingt auf demselben Molekül befinden muss.
  • Die vorliegende Anmeldung erklärt das Grundprinzip und die Kriterien für die Verwendung eines bestimmten Enzyms in einem PCA. 1 zeigt eine allgemeine Beschreibung eines PCA. Das Gen für ein Protein oder Enzym wird an einer vernünftigen Stelle in zwei oder mehr Fragmente zerschnitten. Mithilfe molekularbiologischer Techniken werden die gewählten Fragmente subkloniert, und mit den Enden 5' jedes Fragments werden Proteine, von denen eine Wechselwirkung bekannt ist oder vermutet wird, verschmolzen. Dann wird die Kotransfektion oder Transformation dieser DNA-Konstrukte in Zellen vorgenommen. Der Wiederzusammenbau des Sondenproteins oder -enzyms aus seinen Fragmenten wird katalysiert durch die Bindung der Testproteine aneinander, und die Wiederherstellung wird bei einigen Assays beobachtet. Es ist entscheidend, zu verstehen, dass diese Assays nur funktionieren, wenn die verschmolzenen, interagierenden Proteine den Wiederzusammenbau des Enzyms katalysieren. Das heißt, die Beobachtung der wiederhergestellten Enzymaktivität muss ein Maßstab für die Wechselwirkung der verschmolzenen Proteine sein.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung konzentriert sich auf einen PCA basierend auf dem Enzym Dihydrofolatreduktase. Eine Erweiterung des Verfahrens auf Assays mit Eukaryoten, Zellen, Screenen von Bibliotheken und eine spezifische Anwendung für Probleme im Hinblick auf die Untersuchung integrierter biochemischer Übertragungswege, wie Transduktionswege, wird vorgestellt. Weitere Assays, einschließlich derer, die auf Enzymen basieren, die als dominante oder rezessive Wirkstoffauswahl oder den Stoffwechsel betreffende Wiedergewinnungswege wirken können, werden offenbart. Außerdem werden auch PCAs offenbart, die auf Enzymen basieren, die ein farbiges oder fluoreszierendes Produkt bilden. Die vorliegende Erfindung lehrt, wie das PCA-Verfahren zur Funktionsprüfung neuer Gene, zum Screenen natürlicher Produkte oder Verbindungsbibliotheken für pharmakologische Aktivität und Identifizierung neuer Genprodukte, die mit DNA, RNA oder Kohlehydraten interagieren, sowohl generalisiert als auch automatisiert werden kann. Sie lehrt auch, wie das PCA-Verfahren angewandt werden kann, um natürliche Produkte oder kleine Moleküle aus Verbindungsbibliotheken mit potentiellem therapeutischen Wert zu identifizieren, die solche molekularen Wechselwirkungen hemmen oder aktivieren können, und wie Enzymsubstrate und kleinmolekulare Inhibitoren von Enzymen identifiziert werden können. Schließlich lehrt sie, wie das PCA-Verfahren genutzt werden kann, um proteintechnische Experimente durchzuführen, die zu künstlichen Enzymen mit industriellen Anwendungsmöglichkeiten oder zu Peptiden mit biologischer Aktivität führen könnten.
  • Hier werden einfache Verfahren zum Entwurf und zur Durchführung von Assays zur Erfassung von Protein-Wechselwirkungen in vivo offenbart. Wir haben komplementäre Fragmente der natürlichen mDHFR entwickelt, die, wenn sie in auf Minimalmedium gewachsenen E. coli koexprimiert werden, das Überleben von Klonen ermöglichen, die die beiden Fragmente exprimieren, wobei die Grundaktivität des endogenen bakteriellen DHFR durch den kompetitiven Inhibitor Trimethoprim (3) gehemmt wird. Die Wiederherstellung der Aktivität erfolgte nur, wenn beide N- und C-terminalen Fragmente der DHFR als C-terminale Fusionen an GCN4-Leukin-Zippersequenzen koexprimiert wurden, was darauf hinweist, dass der Wiederzusammenbau der Fragmente die Bildung eines Leukin-Zippers zwischen den N- und C-terminalen Fusionspeptiden erfordert. Die schrittweise Zunahme der Zellverdopplungszeiten, resultierend aus den destabilisierenden Mutationen gerichtet auf die Bindungsschnittstelle (Ile114 zu Val, Ala oder Gly) zeigt, dass das beobachtete Überleben der Zellen unter selektiven Bedingungen ein Ergebnis der spezifischen, durch Leukin-Zipper unterstützten Vereinigung des mDHFR-Fragments [1,2] mit Fragment [3] ist, im Gegensatz zu den nichtspezifischen Wechselwirkungen von Z-F[3] mit Z-F[1,2]. Einige detaillierte und viele zusätzliche Beispiele werden angeführt.
  • Wie bereits bei dem auf Ubiquitin basierenden Split-Protein-Sensor (USPS)9 dargelegt wurde, kann ein Verfahren der Proteinfragmentkomplementation verwendet werden, um Gleichgewichts- und Kinetik-Aspekte von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu untersuchen. Der DHFR-Assay und andere PCAs sind jedoch einfachere Assays. Es handelt sich um vollständige Systeme; es sind keine weiteren endogenen Faktoren notwendig und die Ergebnisse der Komplementation werden oh ne weiteres Zutun direkt beobachtet. Der hier beschriebene, auf E. coli beruhende Zellüberlebens-Assay sollte somit besonders für das Screenen von cDNA-Bibliotheken nach Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignet sein. mDHFR-Expression in Zellen kann durch Bindung fluoreszierender Substratanaloga mit hoher Affinität zu DHFR überwacht werden26.
  • Es gibt mehrere weitere Aspekte der PCAs, die sie von allen anderen Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo (außer USPS) unterscheiden. Wir haben komplementäre Enzymfragmente entwickelt, die es ermöglichen, die Stringenz des Assay zu steuern, und die dazu verwendet werden könnten, Schätzwerte der Kinetik- und Gleichgewichtskonstanten für die Vereinigung zweier Proteine zu erhalten. Zum Beispiel verändern bei DHFR die Punktmutationen des Wildtyp-Enzyms Ile114 zu Val, Ala oder Gly die Stringenz der Wiederherstellung der DHFR-Aktivität. Zur Bestimmung von Schätzwerten von Gleichgewichts- und Kinetikparametern für eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung, könnte man eine Reihe von DHFR-PCA-Experimenten mit zwei Proteinen durchführen, die mit bekannter Affinität interagieren, und dabei die Wildtyp- oder destabilisierenden DHFR-Fragmente verwenden. Der Vergleich der Zellwachstumsgeschwindigkeiten in diesem Modellsystem mit Geschwindigkeiten bei einem DHFR-PCA unter Verwendung von unbekannten Substanzen würde einen Schätzwert für die Stärke der unbekannten Wechselwirkung ergeben.
  • Es sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die vorgestellten DHFR-Assays oder andere PCAs beschränkt werden soll, da diese nur nicht-einschränkende Ausführungsformen des Proteinkomplementationsassays der vorliegenden Erfindung sind. Darüber hinaus sollten die PCAs nicht auf den Kontext, in dem sie verwendet werden könnten, beschränkt werden. Es könnten Konstrukte entworfen werden, um durch Hinzunahme von Signalpeptidsequenzen27,28 die PCA-Fusionen gezielt auf bestimmte Kompartimente in der Zelle loszulassen. Induzierte Protein-Protein-Wechselwirkungen könnten von konstitutiven Protein-Protein-Wechselwirkungen durch eine eukaryote Version des PCA unterschieden werden, und zwar im Fall einer Wechselwirkung, die durch einen biochemischen Vorgang ausgelöst wird. Das System könnte auch so angepasst werden, dass es zum Screenen nach neuen, induzierten Protein-Molekül- Verbindungen zwischen einem Empfängerprotein und einer Expressionsbibliothek verwendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung leistet insofern Pionierarbeit, als sie den ersten Proteinkomplementationsassay darstellt, der ein solches Maß an Einfachheit und Vielseitigkeit aufweist. Die erläuterten Ausführungsformen sind auf mDHFR basierende Proteinfragmentkomplementationsassays (PCA), bei denen ein Leukin-Zipper die Wiederherstellung der DHFR-Aktivität steuert. Die Aktivität wurde bei einem E. coli-Überlebens-Assay erfasst, was sowohl praktisch als auch kostengünstig ist. Dieses System veranschaulicht die Verwendung der mDHFR-Fragmentkomplementation bei der Erfassung der Leukin-Zipper-Dimerisierung und könnte zur Erfassung unbekannter, spezifischer Protein-Molekül-Wechselwirkungen in vivo verwendet werden.
  • Es sollte klar sein, dass diese Erfindung nicht auf die hier vorgestellten PCAs beschränkt ist, da zahlreiche andere Enzyme ausgewählt und entsprechend den Lehren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispiele für solche Marker findet man bei Kaufmann (1987, Genetic Eng. 9: 155–198) und den darin angeführten Quellenangaben sowie in Tabelle 1 dieser Anmeldung.
  • Es sollte dem erfahrenen Fachmann, den die vorliegende Erfindung betrifft, auch klar sein, dass die Erfindung nicht auf die Verwendung von Leukin-Zippern als die beiden interagierenden Moleküle beschränkt ist. Es können tatsächlich zahlreiche andere Arten von Protein-Molekül-Wechselwirkungen entsprechend den Lehren der vorliegenden Erfindung verwendet und identifiziert werden. Die bekannten Arten von Motiven, die an Protein-Molekül-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in der Fachwelt hinlänglich bekannt.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nun folgenden Beschreibung deren bevorzugter Ausführungsformen sowie den angehängten Beispielen und beigelegten Ansprüchen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 bietet eine allgemeine Beschreibung eines PCA. Mithilfe von molekularbiologischen Techniken werden die gewählten Fragmente des Enzyms subkloniert und mit den Enden 5' jedes Fragments werden Proteine, von denen eine Wechselwirkung bekannt ist oder vermutet wird, verschmolzen. Dann wird die Kotransfektion oder Transformation dieser DNA-Konstrukte in Zellen vorgenommen und bei einigen Assays die Wiederherstellung beobachtet.
  • 2 ist eine schematische Darstellung der Fusionskonstrukte, die in einer der Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Dargestellt sind das Hexahistidinpeptid (6His), der Homodimerisierungs-GCN4-Leukin-Zipper (Zipper) und die mDHFR-Fragmente (1, 2 und 3). Die Bezeichnungen für die Konstrukte werden verwendet, um sowohl die DNA-Konstrukte als auch die von diesen Konstrukten exprimierten Proteine zu identifizieren.
  • 3: (A) zeigt einen E. coli-Überlebens-Assay auf Minimalmediumplatten. Kontrolle: Linke Seite der Platte: E. coli, das pQE-30 (keine Insertion) enthält; rechte Seite: E. coli, das pQE-16 enthält, welches für natürliche mDHFR codiert. Feld I: linke Seite jeder Platte: Transformation mit Konstrukt Z-F[1,2]; rechte Seite jeder Platte: Transformation mit Konstrukt Z-F[3]. Feld II: Kotransformation mit den Konstrukten Z-F[1,2] und Z-F[3]. Feld III: Kotransformation mit den Konstrukten Kontroll-F[1,2] und Z-F[3]. Alle Platten enthalten 0,5 mg/ml Trimethoprim. In Feld I bis III enthalten die Platten auf der rechten Seite 1 mM IPTG.
    • (B) E. coli-Überlebens-Assay mithilfe von destabilisierenden DHFR-Mutanten. Feld I: Kotransformation von E. coli mit den Konstrukten Z-F[1,2] und Z-F[3:Ile114Val]. Feld II: Kotransformation mit Z-F[1,2] und Z-F[3:Ile114Ala.]. Eingefügt ist eine 5-fache Vergrößerung der rechten Platte. Feld III: Kotransformation mit Z-F[1,2] und Z-F[3:Ile114Gly]. Alle Platten enthalten 0,5 mg/ml Trimethoprim. Die Platten auf der rechten Seite enthalten 1 mM IPTG.
  • 4 zeigt die Koexpression von mDHFR-Fragmenten.
    • (A) Agarosegelanalyse des Restriktionsmusters entstehend aus Hincll-Aufschluss der Plasmid-DNA. Spur 1 enthält DNA isoliert aus E. coli kotransformiert mit den Konstrukten Z-F[1,2] und Z-F[3]. Die Spuren 2 und 3 enthalten DNA isoliert aus E. coli transformiert mit dem Konstrukt Z-F[3] bzw. Konstrukt Z-F[1,2]. Die Fragmentmigration (in bp) ist an der rechten Seite angezeigt.
    • (B) Die SDS-PAGE-Analyse der mDHFR-Fragmentexpression. Spuren 1 bis 5 zeigen unverarbeitetes Lysat untransformierter E. coli (Spur 1), oder E. coli exprimierend Z-F[1,2] (20,8 kDa; Spur 2), Z-F[3] (18,4 kDa; Spur 3), Kontroll-F[1,2] (14,2 kDa; Spur 4), und Z-F[1,2] + Z-F[3] (Spur 5). Spur 6 zeigt 40 ml aus 2 ml ko-gereinigtem Z-F[1,2] und Z-F[3]. Pfeilspitzen zeigen auf die betreffenden Proteine. Die Migration der Molekulargewichtsmarker (in kDa) ist auf der rechten Seite angezeigt.
  • 5 stellt die allgemeinen Merkmale eines PCA basierend auf einem Überlebens-Assay wie dem DHFR-PCA dar. Der Assay kann in einem bakteriellen sowie einem Säugetier-Kontext verwendet werden. Die eingebaute Empfänger-DNA kann eine bekannte Sequenz sein, die für ein interessierendes Protein (oder eine interessierende Proteindomäne) codiert, oder kann eine cDNA-Bibliothek sein.
  • 6 zeigt einen Autoradiograph eines COS-Zell-Lysats nach einer 30-minütigen 35S-Met-Cys-Pulskennzeichnung. Das Expressionsmuster ist im Prinzip identisch zu dem bei E. coli beobachteten (siehe 4). Die in die Zellen transfizierte (oder kotransfizierte) DNA ist über den entsprechenden Spuren angegeben.
  • 7 zeigt die Ergebnisse einer proteintechnischen Anwendung des mDHFR-Bakterien-PCA. Zwei halbzufällige Leukin-Zipper-Bibliotheken wurden erstellt (wie im Text beschrieben) und jede N-terminal in eines der mDHFR-Fragmente eingebaut. Die Kotransformation der entstehenden Zipper-DHFR-Fragment-Bibliotheken in E. coli und das Ausplattieren auf einem selektiven Medium ermöglichte das Überleben von Klonen, die erfolgreich interagierende Leukin-Zipper enthielten. Vierzehn Klone wurden isoliert und die Zipper wurden sequenziert, um die Reste an den "e-" und "g"-Positionen zu identifizieren. Die "e-g"-Paare wurden kategorisiert, und zwar als sich anziehende Paare (Ladung:Ladung, Ladung:neutral polar oder neutral polar:neutral polar) oder sich abstoßende Paare (Ladung:Ladung) und die Zahl jeder Art von Wechselwirkung wurde für jeden Klon vermerkt. Die Gesamtzahl der Wechselwirkungen für jeden Klon ist 6; die Wechselwirkungen sind im Histogramm verzeichnet.
  • Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich deutlicher beim Lesen der nun folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, die als Beispiele dienen und nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend interpretiert werden sollen.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Auswahl der mDHFR für einen PCA
  • Mit dem Entwurf eines Proteinfragmentkomplementationsassays (PCA) strebten wir an, ein Enzym zu identifizieren, für das Folgendes zutrifft: 1) Ein Enzym, das relativ klein und monomer ist, 2) für das strukturelle und funktionelle Informationen vorhanden sind, 3) für das einfache Assays für die Messung sowohl in vivo als auch in vitro existieren, und 4) für das Überexpression in eukaryoten und prokaryoten Zellen gezeigt wurde. Murine DHFR (mDHFR) erfüllt alle Kriterien für einen oben genannten PCA. Prokaryote und eukaryote DHFR ist für zelluläre C1-Metabolismen zentral und ist absolut notwendig für das Zellüberleben sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten. Es katalysiert speziell die Reduktion von Dihydrofolat zu Tetrahydrofolat zur Verwendung für den Transfer von C1-Einheiten, die für die Biosynthese von Serin, Methionin, Purinen und Thymidylat erforderlich sind. Die DHFRs sind kleine (17 kD bis 21 kD), monomere Proteine. Die Kristallstrukturen von DHFR aus verschiedenen bakteriellen und eukaryoten Quellen sind bekannt und Substratbindungsstellen und aktive Bindungsstellenreste wurden bestimmt111-114, was somit einen vernünftigen Entwurf von Proteinfragmenten möglich macht. Die Faltung, Katalyse und Kinetik einer Zahl von DHFRs sind ausführlich untersucht worden115-119. Die Enzymaktivität kann in vitro mit einem einfachen spektrophotometrischen Assay120 überwacht werden, oder in vivo durch Zell-Überleben in Zellen, die in Abwesenheit von DHFR-Endprodukten gewachsen sind. DHFR wird insbesondere vom Antifolatwirkstoff Trimethoprim gehemmt. Da Säugetier-DHFR eine 12000-fach geringere Affinität zu Trimethoprim hat als bakterielle DHFR121, ist das Wachsenlassen von mDHFR-exprimierenden Bakterien bei Vorhandensein von für Bakterien tödlichen Trimethoprim-Werten ein effizientes Mittel zur Auswahl für den Wiederzusammenbau von mDHFR-Fragmenten zu einem aktiven Enzym. Hohe mDHFR-Expressionswerte wurde in transformierten prokaryoten oder transfizierten eukaryoten Zellen gezeigt122-128.
  • Designrelevante Überlegungen
  • mDHFR hat ein hohes Maß an Sequenz-Identität mit der menschlichen DHFR (hDHFR)-Sequenz gemeinsam (91% Identität) und ist hochgradig homolog zum E. coli-Enzym (29% Identität, 68% Homologie), und diese Sequenzen haben visuell überlagerbare Tertiärstrukturen gemeinsam111. Ein Vergleich der Kristallstrukturen von mDHFR und hDHFR legt nahe, dass ihre aktiven Stellen im Wesentlichen identisch sind127,128. DHFR wurde beschrieben als zusammengesetzt aus drei strukturellen Fragmenten, die zwei Domänen bilden129,130, die Adenin bindende Domäne (Reste 47 bis 105 = Fragment [2] und eine diskontinuierliche Domäne (Reste 1 bis 46 = Fragment [1] und 106 bis 186 [3]; Nummerierung entsprechend der Murin-Sequenz). Die Folatbindungstasche und die NADPH-Bindungsfuge werden vor allem von Resten gebildet, die zu den Fragmenten [1] und [2] gehören. Fragment [3] ist nicht direkt an der Katalyse beteiligt.
  • Die Reste 101 bis 108 der hDHFR, an der Verbindungsstelle zwischen Fragment [2] und Fragment [3], bilden eine ungeordnete Schleife, die auf der gleichen Seite des Proteins wie beide Termini liegt. Wir wählten, mDHFR zwischen den Fragmenten [1,2] und [3] zu spalten, am Rest 107, um eine minimale Störung der aktiven Stelle und der NADPH-Kofaktor-Bindungsstellen zu verursachen. Der natürliche N-Terminus von mDHFR und der durch die Spaltung entstandene, neue N-Terminus befinden sich auf derselben Oberfläche der Enzyme112,128 und ermöglichen somit ein einfache Anbindung einer N-terminalen Kovalente jedes Fragments an Assoziations-Fragmenten, wie den in dieser Studie eingesetzten Leukin-Zippern. Mithilfe dieses Systems haben wir einen durch Leukin-Zipper unterstützten Zusammenbau der mDHFR-Fragmente zu aktiven Enzymen erreicht.
  • BEISPIEL 1
  • VERSUCHSPROTOKOLL
  • DNA-Konstrukte
  • Mutagene und Sequenzierungs-Oligonukleotide wurden von Gibco BRL bezogen. Restriktionsendonukleasen und DNA-modifizierende Enzyme kamen von Pharmacia und New England Biolabs. Die mDHFR-Fragmente, die ihr eigenes In-frame-Stoppkodon tragen, wurden in pQE-32 (Qiagen) subkloniert, stromabwärts von und in-frame mit dem Hexahistidin-Peptid und einem GCN4-Leukin-Zipper (1; 2). Alle letztlich sich ergebenden Konstrukte basierten auf der von Qiagen stammenden pQE-Reihe von Vektoren, die ein induzierbares Promotor-Operator-Element (Tac) enthalten, eine Konsensus-Ribosomenbindungsstelle, Startkodon und Nukleotide, die für ein Hexahistidin-Peptid codieren. Ungekürzte mDHFR wird aus pQE-16 (Qiagen) exprimiert.
  • Expressionsvektor. der den GCN4-Leukin-Zipper enthält
  • Die Reste 235 bis 281 des GCN4-Leukin-Zippers (ein SalI/BamHI 254 bp Fragment) wurden aus einem Hefeexpressionsplasmid pRS3169 gewonnen. Der ausgesparte Terminus an der BamHI-Stelle wurde mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und das Fragment wurde verbunden mit pQE-32, linearisiert mit SalI/HindIII (eingesetzt). Das Produkt, Konstrukt Z, trägt eine offene Leseraster-Codierung für die Sequenz Met-Arg-Gly-Ser, gefolgt von einer Hexahistidin-Markierung und 13 Resten, die den GCN4-Leukin-Zipper-Resten vorangehen.
  • Bildung von DHFR-Fragmenten
  • Der eukaryote vorübergehende Expressionsvektor, pMT3 (gewonnen aus pMT2)16, wurde als Matrize für die PCR-Generation von mDHFR verwendet, die die Merkmale enthält, die das Subklonieren und die separate Expression von Fragment [1,2] und Fragment [3] ermöglichen. Das Megaprimer-Verfahren der PCR-Mutagenese29 wurde verwendet, um ein ungekürztes Produkt mit 590 bp zu generieren. Oligonukleotide, komplementär zu der Nukleotidsequenz, für die N- und C-Termini von mDHFR codierend und eine neue BspEI-Stelle außerhalb der Codierungssequenz enthaltend, wurden neben einem Oligonukleotid verwendet, um ein neues Stoppkodon nach Fragment [1,2] zu bilden, gefolgt von einer neuen Spel-Stelle für die Verwendung zum Subklonieren von Fragment [3].
  • Aufbau eines neuen multiplen Klonierbereichs und Subklonieren von DHFR-Fragmenten [1,2] und [3]
  • Komplementäre Oligonukleotide, die die neuen Restriktionsstellen enthalten: SnaBI, NheI, SpeI und BspEI, wurden zusammen hybridisiert, woraus sich 5'- und 3'-Überhänge komplementär zu EcoRI ergaben, und wurden dann in pMT3 an einer einzigartigen EcoRI-Stelle eingesetzt. Das 590-bp-PCR-Produkt (oben beschrieben) wurde mit BspEI aufgeschlossen und eingebaut in pMT3, linearisiert an BspEI, was das Konstrukt [1,2,3] ergab. Das 610-bp-BspEI/EcoNI-Fragment (codierend für das DHFR-Fragment [1,2], gefolgt von einem neuen Stopp und Fragment [3] bis zu EcoNI) wurde bei EcoNI eingesetzt und in pMT3 subkloniert, geöffnet mit BspEI/HpaI, was das Konstrukt F[1,2] ergab. Das 250-bp-SpeI/BspEI-Fragment von Konstrukt [1,2,3], codierend für das DHFR-Fragment [3] (ohne In-frame-Stoppkodon) wurde in pMT3 subkloniert, das mit denselben Enzymen geöffnet war. Das Stoppkodon der Wildtyp-DHFR-Sequenz, stromabwärts von Fragment [3] in pMT3, wurde wie folgt eingebaut. Spaltung mit EcoNI, sowohl im eingebauten Fragment [3] als auch im Wildtyp-Fragment [3] vorhanden, Entfernung der 683-bp-Intervening-Sequenz und Wiederverbindung des Vektors ergaben ein Konstrukt aus Fragment [3] mit dem Wildtyp-Stoppkodon, Konstrukt F[3].
  • Bildung des Expressionskonstrukts
  • Die 1051 bp und 958 bp SnaBI/XbaI-Fragmente der Konstrukte F[1,2] bzw. F[3] wurden jeweils zu Konstrukt Z subkloniert, geöffnet mit BglII(eingesetzt)/NheI, was die Konstrukte Z-F[1,2] und Z[3] (2) ergab. Für das Kontrollexpressionskonstrukt wurde das für den Zipper codierende Fragment 180-bp-XmaI/BspEI aus Konstrukt Z-F[1,2] entfernt; dies ergab das Kontrollkonstrukt F[1,2] (2).
  • Erzeugung von Stabilitätsmutanten
  • Es wurde eine auf Bindungsstellen ausgerichtete Mutagenese durchgführt30, um Mutanten an Ile114 (Nummerierung der WildtypmDHFR) zu bilden. Die Mutagenesereaktion wurde am KpnI/BamHI-Fragment von Konstrukt Z-F[3] durchgeführt, das in pBluescript SK+ (Stratagene) subkloniert wurde, und zwar unter Verwendung von Oligonukleotiden, die ein stille Mutation codieren, was eine neue BamHI-Stelle hervorbringt. Das durch Restriktion identifizierte 206-bp-NheI/EcoNI- Fragment vermuteter Mutanten wurde zurück zu Z-F[3] subkloniert. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • E. coli-Überlebens-Assay
  • E. coli-Stämme BL21, die das Plasmid pRep4 trugen (von Qiagen, für die konstitutive Expression des lac-Repressors), wurden kompetent gemacht, mit den passenden DNA-Konstrukten transformiert und zwei mal mit Minimalmedium gewaschen, bevor sie auf Minimalmediumplatten ausplattiert wurden, die 50 mg/ml Kanamycin, 100 mg/ml Ampicillin und 0,5 mg/ml Trimethoprim enthielten. Eine Hälfte jeder Transformationsmischung wurde in Abwesenheit und die zweite Hälfte bei Vorhandensein von 1 mM IPTG plattiert. Alle Platten wurden 66 Stunden lang bei 37°C aufbewahrt.
  • E. coli-Wachstumskurven
  • Aus der Kotransformation erhaltene Kolonien wurden vermehrt und dazu verwendet, 10 ml Minimalmedium zu inokulieren, dieses ergänzt durch Ampicillin, Kanamycin sowie IPTG (1 mM), und ggf. Trimethroprim (1 mg/ml). Kotransformanten von Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Gly] wurden unter nicht-selektiven Bedingungen erhalten, indem die Transformationsmischung auf L-Agar (+ Kanamycin und Ampicillin) ausplattiert und durch Restriktionsanalyse auf Vorhandensein der beiden Konstrukte gescreent wurde. Alle Wachstumskurven wurden dreifach durchgeführt. Zur Messung der optischen Dichte wurden regelmäßig Aliquote entnommen. Die Verdoppelungszeit wurde für frühes logarithmisches Wachstum berechnet (OD 600 zwischen 0,02 und 0,2).
  • Protein-Überexpression und Purifikation
  • Bakterien wurden in Fleischbrühe3l bei Vorhandensein der entsprechenden Antibiotika auf einen OD600 von ungefähr 1,0 vermehrt. Die Expression wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert und man ließ die Inkubation für weitere 3 Stunden laufen. Zur Analyse des Rohextrakts wurden Pellets von 150 ml induzierter Zellen durch Kochen unter Zugabe von Farbstoff aufgelöst. Die Lysate wurden durch Mikrozentrifugieren geklärt und durch SDS-PAGE32 analysiert. Zur Protein-Purifikation wurde ein Zellpellet aus 50 ml induziertem, mit Konstrukt Z-F[1,2] und Z-F[3] kotransformiertem E. coli durch Beschallung aufgelöst und eine denaturierende Purifikation des unlöslichen Pellets vorgenommen, wobei Ni-NTA (Qiagen) wie vom Hersteller beschrieben verwendet wurde. Die Proteine wurden mit einem stufenweisen Imidazolgradienten eluiert. Die Fraktionen wurden mit SDS-PAGE analysiert.
  • ERGEBNISSE
  • Entwurf von mDHFR-Fragmenten für ein PCA
  • mDHFR hat eine hohe Sequenzidentität mit der menschlichen DHFR (hDHFR)-Sequenz. Da die Koordinaten der Murin-Kristallstruktur nicht verfügbar waren, beruhten unsere designrelevanten Überlegungen auf der hDHFR-Struktur. DHFR wurde beschrieben als aus drei strukturellen Fragmenten zusammengesetzt, die zwei Domänen bilden: die Adenin bindende Domäne (F[2]) und eine diskontinuierliche Domäne (F[1] und F[3])13,18. Die Folatbindungstasche und die NADPH-Bindungsfurche setzen sich vor allem aus zu F[1] und F[2] gehörenden Resten zusammen. Die Reste 101 bis 108 der hDHFR bilden eine ungeordnete Schleife, die auf der gleichen Seite des Proteins liegt wie beide Termini. Diese Schleife tritt an der Verbindungsstelle zwischen F[2] und F[3] auf. Durch die Spaltung der DHFR am Rest 107 bildeten wir F[1,2] und F[3] und verursachten somit eine minimale Störung der aktiven Stelle und der Substratbindungsstellen. Der natürliche N-Terminus der mDHFR und der neue N-Terminus, der durch die Spaltung gebildet wurde, wurden kovalent an die C-Termini der GCN4-Leukin-Zipper gebunden (1).
  • E. coli-Überlebens-Assays
  • In 2 sind die allgemeinen Merkmale der exprimierten Konstrukte und die in dieser Studie verwendete Nomenklatur dargestellt. 3 (Feld A) stellt die Ergebnisse der Kotransformation von Bakterien mit Konstrukten dar, die für Z-F[1,2] und Z-F[3] bei Vorhandensein von Trimethoprim codieren, was deutlich zeigt, dass ein Koloniewachstum unter selektivem Druck nur in Zellen möglich ist, die beide Fragmente von mDHFR exprimieren. Es gibt kein Wachstum bei alleinigem Vorhandensein von entweder Z-F[1,2] oder Z-F[3]. Die Induktion der Proteinexpression mit IPTG ist essentiell für das Koloniewachstum (3A). Die Anwesenheit des Leukin-Zippers an beiden Fragmenten der mDHFR ist essentiell, wie durch die Kotransformation von Bakterien mit beiden Vektoren gezeigt wurde, die für mDHFR-Fragmente codieren, von denen nur eines einen Leukin-Zipper trägt (3A). Es soll beachtet werden, dass die Wachstumskontrolle von mit ungekürzter mDHFR transformierten E. coli unter Abwesenheit von IPTG aufgrund der niedrigen Expressionswerte in nicht-induzierten Zellen möglich ist.
  • Die Bestätigung für die Anwesenheit beider Plasmide in Bakterien, in Trimethoprim wachsen zu können, wurde durch eine Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA erhalten, die man gereinigt aus isolierten Kolonien gewann. 4(A) zeigt die Anwesenheit des 1200 bp HincII-Restriktionsfragments von Konstrukt Z-F[1,2] sowie die 487 und 599 bp HincII-Restriktionsfragmente von Konstrukt Z-F[3]. Ebenfalls vorhanden ist das 935 bp HincII-Fragment von pRep4. Die Überexpression der Fusionsproteine ist in 4(B) dargestellt. In allen Fällen ist eine Überexpression eines Proteins des erwarteten Molekulargewichts auf dem SDS-PAGE des Rohlysats sichtbar. Die Purifikation der koexprimierten Proteine unter denaturierenden Bedingungen ergab zwei Bänder von offensichtlicher Homogenität bei der Analyse mit SDS-Page unter Coomassie-Färbung (4B).
  • Stabilitätsmutanten
  • Die Anmelden generierten Mutanten von F[3], um zu prüfen, ob die Wiederherstellung der mDHFR-Aktivität durch den Fragmentzusammenbau spezifisch war. Die Proteinstabilität kann reduziert werden, indem das Seitenkettenvolumen im hydrophoben Kern eines Proteins verändert wird9,22-25. Der Rest Ile114 der mDHFR kommt in einem Kern-β-Strang an der Schnittstelle zwischen F[1,2] und F[3] vor, isoliert von der aktiven Stelle. Ile114 steht in einem van-der-Waals-Kontakt mit Ile51 und Leu93 in F[1,2]11. Wir mutierten Ile114 zu Val, Ala oder Gly. 3 (Feld B) zeigt die Ergebnisse der Kotransformation von E. coli mit Konstrukt Z-F[1,2] und den mutierten Z-F[3]-Konstrukten. Die aus der Kotransformation mit Z-F[3:Ile114Ala] erhaltenen Kolonien wuchsen langsamer als die mit Z-F[3] oder Z-F[3:Ile114Val] kotransformierten (siehe Ein schub zu 3B). Bei mit Z-F[3:Ile114Gly] kotransformierten Zellen wurde kein Koloniewachstum festgestellt. In dem Fall, wo Kolonien beobachtet wurden, unterschieden sich die Anzahlen von erhaltenen Transformanten nicht stark voneinander, vorausgesetzt, dass mit Z-F[1,2] und entweder Z-F[3], Z-F[3:Ile114Val] oder Z-F[3:Ile114Ala] kotransformierte Zellen dieselbe Überlebensquote haben. Die Überexpression der Mutanten Z-F[3:Ile114X] war im gleichen Bereich wie Z-F[3], was durch SDS-PAGE unter Coomassie-Färbung bestimmt wurde. (Daten nicht beigefügt).
  • Wir verglichen auch die relative Effizienz des Wiederzusammenbaus von mDHFR-Fragmenten durch Messung der Verdopplungszeit der Kotransformanten in flüssigem Medium. Die Verdopplungszeit im Minimalmedium war für alle Transformanten konstant (Daten nicht beigefügt). Selektiver Druck durch Trimethoprim in Abwesenheit von IPTG verhinderte das Wachstum von E. coli es sei denn, es wurde mit pQE-16 transformiert, das aufgrund der niedrigen Expressionswerte in nicht-induzierten Zellen für ungekürzte DHFR codiert. Die Induktion von mDHFR-Fragmentexpressionen mit IPTG ermöglichte das Überleben kotransformierter Zellen (außer im Fall von Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Gly], obwohl die Verdopplungszeiten im Vergleich zum Wachstum in Abwesenheit von Trimethoprim deutlich erhöht waren. Die Verdopplungszeiten, die für Zellen gemessen wurde, die Z-F[1,2] + Z-F[3], Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Val] und Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Ala] exprimieren, waren 1,6-fach, 1,9-fach bzw. 4,1-fach länger als die Verdopplungszeit von pQE-16-exprimierenden E. coli in Abwesenheit von Trimethoprim und IPTG. Das Vorhandensein von IPTG verhinderte unerwarteter Weise das Wachstum von mit ungekürzter mDHFR transformierten E. coli. Das Wachstum wurde teilweise durch die Zugabe der Folatstoffwechsel-Endprodukte Thymin, Adenin, Pantothenat, Glycin und Methionin wiederhergestellt (Daten nicht beigefügt). Dies legt nahe, dass die induzierte Überexpression von mDHFR für E. coli tödlich war, wenn sie auf Minimalmedium gewachsen waren, und zwar aufgrund der Erschöpfung der Folat-Reserven durch die Bindung an das Enzym.
  • In einer weiteren Ausführungsform nahmen die Anmelder Punktmutationen am GCN4-Leukin-Zipper von Z-F[1,2] und Z-F[3] vor, für die direkte Gleichgewichts- und Kinetikparameter bekannt sind; diese bekannten Werte wurden mit Parametern in Korrelation gesetzt, die aus dem PCA (Pelletier und Michnick, in Vorbereitung) abgeleitet wurden. Der Vergleich der Zellwachstumsgeschwindigkeiten in diesem Modellsystem mit Geschwindigkeiten bei einem DHFR-PCA unter Verwendung von unbekannten Substanzen würde einen Schätzwert der Stärke der unbekannten Wechselwirkung ergeben. Dies sollte die Bestimmung von Schätzwerten von Gleichgewichts- und Kinetikparametern für eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung hat einen auf mDHFR basierenden Proteinfragmentkomplementationsassay (PCA) dargestellt und gezeigt, bei dem ein Leukin-Zipper die Wiederherstellung der DHFR-Aktivität steuert. Die Aktivität wurde durch einen E. coli Überlebens-Assay erfasst, was sowohl praktisch als auch kostengünstig ist. Dieses System stellt die Verwendung der mDHFR-Fragmentkomplementation zur Erfassung von Leukin-Zipper-Dimerisierung dar und könnte zur Erfassung unbekannter, spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo angewandt werden.
  • E. coli-Aminoglycosid-Kinase: Optimierung und Entwurf eines PCA unter Verwendung eines Exonuklease-Molekular-Entwicklungs-Verfahrens
  • Obwohl die Anmelder gezeigt haben, dass das oben beschriebene Verfahren der technischen Entwicklung dazu verwendet werden kann, komplementäre Enzymfragmente zu bilden, ist offensichtlich, dass die Proteine sich nicht so entwickelt haben, dass man von diesen Fragmenten erwarten könnte, dass sie optimale physikalische Eigenschaften haben, die die Löslichkeit, Faltbarkeit (schnelle Faltung), Proteaseresistenz oder enzymatische Aktivität umfassen. Eine alternative Ausführungsform des Verfahrens der technischen Entwicklung ist der Endonuklease/Entwicklungs-Lösungsansatz. Dieses Verfahren kann alleine oder in Verbindung mit dem Verfahren der technischen Entwicklung verwendet werden. Die Vorteile dieses Lösungsansatzes bestehen darin, dass im Prinzip keine vorhergehenden Kenntnisse der Proteinstruktur notwendig sind, dass die optimalen Fragmente für den PCA ausgewählt werden und dass diese Fragmente auch optimale Eigenschaften haben. Nach der Auswahl der optimalen komplementären Fragmente werden diese multiplen Durchgängen randomisierter Mutagenese unterzogen. Erreicht wird die Mutagenese durch eine suboptimale PCR kombiniert mit chemischer Mutagenese oder DNA-Shuffling (W. P. C. Stemmer, (1994) Proc, Natl, Acad, Sci. USA 91, 10747-10751). Das gesamte Verfahren wird für die Verwendung von Aminoglycosidkinase (AK) beschrieben, ein Beispiel für einen Antibiotika-Resistenzmarker, der für die dominante Selektion prokaryoter Zellen, wie E. coli oder eukaryoter Zellen wie Hefe oder Säugetier-Zelllinien verwendet werden kann. Die Struktur der AK ist bereits bekannt und so wäre das Verfahren (1) möglich, jedoch beschlossen wir, Verfahren (1) wie oben für DHFR definiert, mit Verfahren (2) zu kombinieren.
  • VERSUCHSPROTOKOLL
  • Das Optimierungs-/Auswahlverfahren stellt sich wie folgt dar:
  • Erstellung einer Bibliothek von AK-Fragmenten basierend auf Produkten des Aufschließens von Exonuklease
  • Ineinandergesetzte Sets von Deletionen werden an den Enden 5' und 3' der AK-Gene gebildet. Um unidirektionale Deletionen zu erzeugen, werden Restriktionsstellen unverwechselbarer Struktur in die die AK-Gene flankierenden Regionen eingebaut. An den Termini 5' und 3' wird eine "äußere" Haftstelle mit einem hervorstehenden Terminus 3' (SphI bzw. KpnI) und eine "innere" Haftstelle mit ausgespartem Terminus 3' (BglII bzw. SalI) durch eine PCR hinzugefügt. Die Spaltung an SphI und BglII (oder KpnI und SalI) führt zur Entstehung eines hervorstehenden Terminus, der zurück zur flankierenden Sequenz führt, und eines ausgesparten Terminus, der in das AK-Gen führt. Aufschließen mit E. coli-Exonuklease III und S1 Nuklease (S. Henikoff, (1987), Methods in Enzymology 155, 156–165) führt zu einem Set von ineinander gesetzten Deletionen nur vom ausgesparten Terminus. Somit werden 10 mg DNA mit SphI und BglII (oder KpnI und SalI) aufgeschlossen, in Phenol-Chloroform extrahiert, und 12,5 U Exonuklease III hinzugegeben. In 30-Sek.-Intervallen werden 10 Minuten lang Aliquote entnommen und in eine Lösung mit 2 U S1 Nuklease gegeben. Die neu gebildeten Enden werden mit T4-DNA-Polymerase (0,1 U Ligase pro Probe) gefüllt und das Set von Vektoren durch Ligation stumpfer Enden (10 U Ligase pro Probe) wieder geschlossen. Die durchschnittliche Länge der Deletion wird zu jedem Zeit punkt durch die Restriktionsanalyse der Sets bestimmt. Dies ergibt Sets von AK-Genen, die von den Termini 5' oder 3' deletiert sind. Diese Manipulation wird direkt in den pQE-32-Zipper-Konstrukten vorgenommen, so dass die Produkte direkt zum Screenen der Aktivität verwendet werden können.
  • Screenen nach AK-Aktivität
  • Als ersten Schritt zur Bestimmung der Anforderungen für die Fragmentkomplementation müssen wir die minimalen N-terminalen und C-terminalen Fragmente von AK bestimmen, die alleine aktiv sind. Sets aus Deletionen werden individuell zu BL21-Zellen von E. coli transformiert und die Expression der AK-Fragmente wird durch IPTG induziert. Die Sets, bei denen eine signifikante Anzahl von Kolonien unter Vorhandensein von G418 auftritt, dienen zur Indikation der ungefähren Länge der N- und C-terminalen AK-Fragmente, die die Aktivität beibehalten. Die Fragmentkomplementation muss deshalb mit innerhalb dieser Grenzen gewählten Fragmenten erfolgen. Die Zipper-gesteuerte Fragmentkomplementation wird wie folgt erfasst: passende Sets von Deletionen, oder Pools von Sets, werden zu BL21 kotransformiert, die Expression wird mit IPTG induziert und das Wachstum wird bei Vorhandensein von G418 in verschiedenen Konzentrationen überwacht. Große Kolonien, die bei Vorhandensein von hohen G418-Konzentrationen wachsen, werden als die effektivsten komplementären Produkte gewählt.
  • Gesteuerte Entwicklung optimaler AK-Fragmente bei Verwendung von "DNA-Shuffling"
  • Nachdem optimale Fragmente gewählt wurden, werden die individuellen Fragmente durch Restriktions-Aufschluss an SphI und KpnI entfernt, und ermöglichen somit konstante 5' und 3' Priming-Regionen, die die N- oder C-terminalen komplementären Fragmente der AK flankieren. Diese Oligonukleotide (2–4 mg) werden mit DNasel (0,005 Einheiten/μl, 100 μl) aufgeschlossen und Fragmente aus 10–50 Nukleotiden werden aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt extrahiert. Dann wird mit der fragmentierten DNA eine PCR durchgeführt, und zwar mithilfe einer Taq-Polymerase (2,5 Einheiten/μl) in einer PCR-Mischung, die 0,2 mM dNTPs, 2,2 mM Mg2Cl (oder 0 mM für eine suboptimale PCR), 50 mM KCl, 10 mM Tris·HCl, pH 9,0, 0,1% TritonX-100 enthält. Ein PCR-Programm: 94°C 60 s; 94°C 30 s; 55°C 30 s; 72°C 30 s 30–50 mal; 72°C 5 min. Nach 25 Zyklen werden alle 5 Zyklen Proben entnommen, um die Erscheinung der wieder zusammengebauten vollständigen Fragmente auf Agarosegel zu überwachen. Das primerlose PCR-Produkt wird dann auf 1:40 oder 1:60 verdünnt und als Matrize für PCR mit 5', 3' komplementären Konstantbereich-Oligos als Primer für weitere 20 Zyklen verwendet. Das Endprodukt wird mit SphI und KpnI durch Restriktion aufgeschlossen und die Produkte werden zurück in den PQE32-Zipper subkloniert, um die endgültige Bibliothek aus Expressionsplasmiden zu ergeben. Wie zuvor werden E. coli B21-Zellen mit C-terminalen oder N-terminalen komplementären Fragment-Expressions-Vektoren mit einer geschätzten Effizienz von 109 sequentiell transformiert und schließlich Zellen mit dem komplementären Fragment kotransformiert. Man lässt E. coli auf Agaroseplatten wachsen, die 1 mg/ml G418 enthalten, und nach 16 Stunden werden die größten Kolonien ausgewählt und in flüssigem Medium bei ansteigenden Konzentrationen von G418 wachsen gelassen. Dann werden diejenigen Klone ausgewählt, die die maximale Resistenz gegenüber G418 zeigen, und wenn die maximale Resistenz oder mehr erreicht wird, wird die Entwicklung beendet. Andernfalls wird der DNA-Shufflingprozess wiederholt. Schließlich werden optimale Fragmente sequenziert und physikalische Eigenschaften sowie die enzymatische Aktivität bewertet. Dieser optimierte AK-PCA ist nun einsatzbereit für die Untersuchung auf dominante Selektion in anderen Zelltypen einschließlich Hefe- und Säugetierzelllinien. Dieses Verfahren kann zur Entwicklung eines jeden PCA basierend auf Enzymen eingesetzt werden, die einem Wirkstoff oder Toxin dominante oder rezessive Selektion gewähren, oder auf Enzymen, die ein farbiges oder fluoreszierendes Produkt erzeugen. In den letzten beiden Fällen zielt der Entwicklungsprozesses auf ein minimales Wiedererreichen des Signals für das intakte Wildtyp-Enzym ab, oder auf eine Verstärkung des Signals. Dieses Verfahren kann auch ohne Kenntnis der Enzymstruktur verwendet werden, unabhängig davon, ob das Enzym eine mono-, di- oder multimere Struktur hat. Die Kenntnis der Enzymstruktur schließt die Anwendung auch dieses Verfahrens, wie unten beschrieben, jedoch nicht aus.
  • Wie man verstehen wird, kann die Kenntnis der Enzymstruktur verwendet werden, um einen effizienteren Weg zu finden, die molekulare Entwicklung zu nutzen, um einen PCA zu entwickeln. In diesem Fall wird die Enzymstruktur dazu verwendet, minimale Domänen des betreffenden Proteins zu definieren, wie bereits im Fall von DHFR. Statt Fragmente von vollständig zufälliger Länge für die N- oder C-terminalen Fragmente zu generieren, wählen wir in der Exonuklease-Phase die Fragmente, die die geringste Bereitschaft zeigen, für eine der beiden Domänen zu codieren. Im Fall von AK können zum Beispiel zwei gut definierte Domänen in der Struktur unterschieden werden, bestehend aus den Resten 1–94 im N-Terminus und den Resten 95–267 im C-Terminus. Das Aufschließen der Endonuklease erfolgt wie oben, aber es werden die Reaktionsprodukte gewählt, die minimal für eine der beiden Domänen codieren. Wie oben beschrieben sind diese dann die Startpunkte für die Fragmentselektion und Entwicklungszyklen.
  • Heteromerer Enzym-PCA
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf einen PCA, der auf der Verwendung von heterodimeren oder heteromultimeren Enzymen basiert, bei denen der gesamte katalytische Mechanismus in einer unabhängig faltenden Untereinheit enthalten ist und die andere Untereinheit Stabilität und/oder einen Kofaktor für die enzymatische Untereinheit bietet. Bei dieser Ausführungsform des PCA wird die Regulations-Untereinheit in komplementäre Fragmente gespalten und mit interagierenden Proteinen verschmolzen. Diese Fragmente werden zusammen mit der Enzymuntereinheit in Zellen kotransformiert/transfiziert. Wie beim Einzelenzym-PCA, der für DHFR und AK beschrieben wurde, sind die Wiederherstellung und Erfassung der Enzymaktivität abhängig vom durch Oligomerisationsdomänen unterstützten Wiederzusammenbau der Regulations-Untereinheit zur natürlichen Topologie. Jedoch interagiert die wiederhergestellte Untereinheit dann mit der intakten enzymatischen Untereinheit, so dass sich Aktivität ergibt. Dieser Lösungsansatz erinnert an das USPS-System, wobei er jedoch den Vorteil hat, dass das Enzym in diesem Fall kein konstitutives zelluläres Enzym ist, sondern vielmehr ein exogenes Genprodukt. Als solches besteht kein Problem mit Hintergrund- Aktivität der Wirtszelle, das Enzym kann auf höheren Ebenen exprimiert werden als ein natürliches Gen, und es kann auch modifiziert werden, um an spezifische subzelluläre Kompartimente gerichtet zu werden (durch Subklonieren kompartiment-spezifischer Signalpeptide auf die N- oder C-Termini des Enzyms und der Untereinheits-Fragmente). Der spezifische Vorteil dieses Lösungsansatzes besteht darin, dass sich, während das Einzel-Enzym-Verfahren zu suboptimaler enzymatischer Aktivität führen kann, bei diesem Lösungsansatz das Enzym unabhängig faltet und tatsächlich als Chaperon für die fragmentierte Regulations-Untereinheit dienen und bei seiner erneuten Faltung unterstützend wirken kann. Außerdem muss das Falten der Fragmente nicht unbedingt vollständig erfolgt sein, um die Regulation der Enzyme zu gewähren. Dieser Lösungsansatz wird mit einem kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay umgesetzt, den wir basierend auf Streptomyces-Tyrosinase entwickelt haben. Dieses Enzym katalysiert die Umwandlung von Tyrosin zu Deoxyphenylalanin (DOPA). Die Reaktion kann durch die Umwandlung von Fluorcinyl-Tyrosin zur DOPA-Form gemessen werden. Das aktive Enzym besteht aus zwei Untereinheiten, der katalytischen Domäne (Melc2) und einer Kupfer bindenden Domäne (Melc1). Melc1 ist ein kleines Protein mit 14 kD, das für die Aktivität von Melc2 absolut notwendig ist. In dem Assay, den wir entwickeln, wird das Protein Melc1 in zwei Fragmente gespalten, die als Komplementationsteil des PCA dienen. Diese Fragmente, verschmolzen mit Oligomerisationsdomänen, werden mit Melc2 koexprimiert, und die Basis des Assay besteht darin, das die Melc2-Aktivität von der Komplementation der Melc1-Fragmente abhängig ist. Die Stöchiometrie von Proteinkomplexen kann auch wie folgt angegangen werden (z.B. ob ein Komplex aus zwei oder drei Proteinen besteht). Man verschmilzt zwei Proteine mit den zwei Melc1-Fragmenten und ein drittes mit dem intakten Melc2. Somit kann gezeigt werden, dass die der minimale komplementäre aktive Komplex der Tyrosinase erfordert, dass alle drei Komponenten und somit ein Trimer notwendig sind. Ein Schlüsselaspekt dieses Lösungsansatzes ist, dass wir einfach spezifische Wechselwirkungen zeigen können, indem wir eine Komponente, insbesondere die katalytische Untereinheit der Protein-Melc2-Fusion von der anderen Komponente abhängig machen, und zwar durch seine Unterexpression im Hintergrund überexprimierter Melc1-Fragment-Protein-Fusionen.
  • Auf Multimerunterbrechung basierender PCA
  • Obwohl die Anmelder nur die Fragmentkomplementation von intakten Proteinen, Proteindomänen oder Untereinheiten als einen PCA umfassend beschrieben haben, bezieht sich eine alternative Ausführungsform auf PCAs, die auf der Unterbrechung der Schnittstelle zwischen z.B. einem dimeren Enzym beruhen, das eine stabile Verbindung der Untereinheiten für die katalytische Aktivität benötigt. In diesen Fällen würde eine selektive oder zufällige Mutagenese an der Untereinheits-Schnittstelle die Wechselwirkung stören und die Basis des Assays wäre, dass die mit den Untereinheiten verschmolzenen Oligomerisations-Domänen die notwendige Bindungsenergie zur Verfügung stellen, um die Untereinheiten zu einem funktionellen Enzym zu verbinden.
  • Vektorenentwurf in Anwendung auf PCAs
  • Die bis jetzt genannten PCA-Verfahren haben Zwei-Plasmid-Transformations-Verfahren zur Expression komplementärer Fragmente verwendet. Dieser Lösungsansatz hat einige Vorteile, wie z.B. die Verwendung verschiedener Wirkstoffresistenzmarker zur Auswahl der optimalen Gen-Inkorporation, zum Beispiel in transformierten oder transfizierten Zellen oder für die optimale Transformation komplementärer Plasmide in Bakterien und zur Steuerung der Expressionswerte von PCA-Fragmenten mithilfe verschiedener Promotoren. Einzel-Plasmid-Verfahren haben jedoch Vorteile im Hinblick auf die Einfachheit der Transfektion/Transformation. Proteinexpressionswerte können auf verschieden Weisen gesteuert werden, während die Wirkstoffauswahl auf eine von zwei Arten erfolgen kann: Im Falle von PCAs, die auf einem Überlebens-Assay basieren, der Enzymen verwendet, die selbst Wirkstoffresistenzmarker sind, wie z.B. AK, oder wenn das Enzym einen Übertragungsweg komplementiert, wie z.B. DHFR, müssen keine zusätzlichen Wirkstoffresistenzgene in die Expressionsplasmide inkorporiert werden. Wenn der PCA jedoch auf einem Enzym basiert, das ein farbiges oder fluoreszierendes Produkt bildet, wie z.B. Tyrosinase oder Glühwürmchen-Luciferase, muss ein weiteres Wirk stoffresistenzgen aus dem Plasmid exprimiert werden. Die Expression von PCA-komplementären Fragmenten und verschmolzenen cDNA-Bibliotheken/Empfängergenen kann auf Einzelplasmiden wie individuellen Operonen unter der Steuerung separater induzierbarer oder konstitutiver Promotoren zusammengestellt werden oder kann polycistronisch exprimiert werden. Bei E. coli kann die polycistronische Expression mithilfe von bekannten intercodierenden Bereichssequenzen erreicht werden; wir verwenden zum Beispiel den Bereich im mel-Operon, aus dem wir die Tyrosinase melc1-melc2-Gene gewonnen haben, von denen wir gezeigt haben, dass sie unter Steuerung eines starken (Tac)-Promotors in hohem Maß in E. coli exprimiert werden. Gene könnten auch von unabhängigen Promotoren exprimiert und induziert werden, wie z.B. Tac und Arabinose. Für Säugetier-Expressionssysteme können Einzelplasmidsysteme sowohl für vorübergehende als auch für stabile Zelllinienexpressionen und für konstitutive und induzierbare Expressionen verwendet werden. Darüber hinaus kann eine differentielle Steuerung der Expression einer der komplementären Fragmentfusionen, meist des über Andockmittel verschmolzenen Fusionsfragments, gesteuert werden, um die Expression zu minimieren. Dies ist ein wichtiger Punkt bei der Verringerung nichtspezifischer Hintergrund-Wechselwirkungen. Beispiele für differenzielle Steuerung komplementärer Fragmentexpressionen enthalten folgende Verfahren:
    • i) Bei policistronischer Expression, ob vorübergehend oder stabil, ist die Expression des zweiten Gens notwendigerweise weniger effizient, und dies alleine könnte dazu dienen, die Quantität eines der komplementären Fragmente zu begrenzen. Alternativ dazu kann beim ersten Genprodukt die Expression durch Mutation eines stromaufwärts gelegenen Donors/Splicingortes begrenzt werden, während das zweite Gen unter Kontrolle eines retroviralen internen Startortes gestellt werden kann, wie dem von ECMV, um die Expression zu verstärken.
    • ii) Individuelle komplementäre Fragmentfusionspaare können auch unter Kontrolle induzierbarer Promotoren gestellt werden, die alle handelsüblich sind, einschließlich derer, die auf einem auf Tet reagierenden PhCMV*-1-Promotor beruhen, und/oder Steroidrezeptor-Reaktionselemente. In einem solchen System können die beiden komplementären Fragmentgene akti viert und die Expressionswerte durch dosisabhängige Expression mit dem Induktor, in diesem Fall Tetrazyklin und Steroidhormone, gesteuert werden.
  • BEISPIEL 2
  • Anwendung des PCA-Verfahrens zur Erfassung neuer Genprodukte in biochemischen Übertragungswegen und Kartierung dieser Übertragungswege
  • Einer der größten Vorteile von PCAs gegenüber anderen Verfahren zum Screenen molekularer Wechselwirkungen ist, dass sie dazu entwickelt sind, sowohl in vivo als auch in jeder Art von Zelle angewendet zu werden. Dieses Merkmal ist entscheidend, wenn das Ziel der Anwendung einer Technik darin besteht, neue Wechselwirkungen aus Bibliotheken zu identifizieren und gleichzeitig in der Lage zu sein, zu bestimmen, ob die beobachteten Wechselwirkungen biologisch relevant sind. Das detaillierte, unten angeführte Beispiel und weitere Beispiele am Ende dieses Abschnittes zeigen, wie es möglich ist, Wechselwirkungen mithilfe von PCAs zu bestätigen. Im Prinzip wird dies wie folgt erreicht: Bei biochemischen Übertragungswegen, wie z.B. bei rezeptorvermittelter Hormonsignalisierung, wird eine Kaskade von enzymvermittelten chemischen Reaktionen durch ein bestimmtes molekulares Ereignis ausgelöst, wie z.B. durch die Hormonbindung an den Membranoberflächenrezeptor. Dann treten Enzymwechselwirkungen mit Proteinsubstraten und Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit durch Enzyme modifizierten Substraten auf. Solche biochemischen Signalkaskaden treten nur in spezifischen Zellarten und Modellzelllinien zur Untersuchung dieser Prozesse auf. Deshalb muss man, um induzierte Wechselwirkungen, wie z.B. mit bekannten Proteinen in einem Übertragungsweg mit noch undefinierten Proteinen zu erfassen, offensichtlich das Screenen in adäquaten Modellzelllinien und im richtigen Zellkompartiment durchführen. Nur das PCA-Verfahren kann verwendet werden, um dies generalisiert durchzuführen. Protein-Molekül-Wechselwirkungs-Techniken wie z.B. die Hefe-Two- oder Hefe-Three-Hybrid-Technik können in einem Kontext mit solchen Ereignissen nicht durchgeführt werden, außer im begrenzten Fall einer nukleären Wechselwirkung in Hefe oder bei Wechselwirkungen, die nicht ausgelöst werden. Es gibt Säugetier-Two-Hybrid-Techniken, mit denen es möglich sein könnte, induzierte Proteinwechselwirkungen zu erfassen, aber wiederum nur, wenn die beteiligten Proteine gleichzeitig aktiviert, zum Kern transportiert und mit ihren Partnern interagieren können. Bei PCAs gibt es diese Beschränkungen nicht, da sie keine weiteren zellulären Mechanismen erfordern, die nur in spezifischen Kompartimenten verfügbar sind. Ein weiterer Punkt ist, dass es durch die Durchführung des PCA-Verfahrens in geeigneten Modellzellarten auch möglich ist, adäquate positive und negative Kontrollen zur Untersuchung eines spezifischen Übertragungsweges einzuführen. Zum Beispiel ist es bei einem Hormonsignal-Übertragungsweg wahrscheinlich, dass Hormonsignalagonisten und -antagonisten oder dominant-negative Mutanten von Signalkaskadenproteinen bekannt sind, die sich stromaufwärts befinden oder parallel zu den Ereignissen, die im PCA untersucht werden, wirken. Diese Reagenzien könnten dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob neue Wechselwirkungen, die durch den PCA erfasst werden, biologisch relevant sind. Im Allgemeinen könnte man dann von Wechselwirkungen, die nur erfasst werden, wenn ein Hormon eingebaut wird, aber nicht sichtbar sind, wenn gleichzeitig ein Antagonist eingebaut wird, annehmen, dass sie Wechselwirkungen darstellen, die für den untersuchten Prozess relevant sind.
  • Nachfolgend findet sich eine detaillierte Beschreibung einer Anwendung des DHFR, die diese Punkte darstellt, sowie weitere Beispiele, in denen PCA-Verfahren verwendet werden könnten.
  • Anwendung des DHFR-PCAs zur Kartierung von durch Wachstumsfaktoren vermittelten Signaltransduktionswegen
  • Eines der frühesten erfassbaren Ereignisse in der durch Wachstumsfaktoren aktivierten Zellproliferation ist die Serinphosphorylierung des S6-Proteins der ribosomalen Untereinheit 40S. Die Entdeckung von Serin/Threonin-Kinasen die insbesondere S6 phosphorylieren, haben entscheidend dazu beigetragen, neue mitogen vermittelte Signaltransduktionswege zu identifizieren. Die Serin/Threonin-Kinase p70S6k wurde als eine spezifische S6-Phosphorylase identifiziert131-136. Diese Kinase p70S6k wird durch eine Serin- und Threonin-Phosphorylierung an spezifischen Stellen im Ansprechen auf verschiedene mitogene Signale aktiviert, einschließlich Serumtotzellen, Wachstumsfaktoren einschließlich Insulin und PDGF, und durch Mitogene, wie z.B. Phorbolester. Es wurden in den letzten fünf Jahren beachtliche Anstrengungen unternommen, um zu bestimmen, wie p70/p85S6k im Ansprechen auf Mitogene aktiviert wird. Zwei durch Rezeptoren vermittelte Wege werden mit der p70S6k-Aktivierung in Zusammenhang gebracht, einer in Verbindung mit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI(3)k) und der andere in Verbindung mit dem PI(3)k-Homolog mTOR137-144. Der Schlüssel zum Verständnis dieses Vorschlages liegt darin, dass die Rolle des Enzyms bei der Aktivierung von p70S6k durch Wirkung zweier natürlicher Produkte auf die Phosphorylierung und Enzymaktivität ermittelt wurde: Rapamycin, das die mTOR-Aktivität indirekt hemmt und Wortmannin, das die PI(3)k-Aktivität direkt hemmt. Es ist ebenfalls wichtig, zu beachten, dass bis heute keine direkten stromaufwärts liegenden Kinasen oder anderen regulierenden Proteine von p70S6k identifiziert wurden.
  • Die Wechselwirkungen von p70S6k mit seinem bekannten Substrat S6 können als Testverfahren für den DHFR-PCA bei E. coli und in Säugetier-Zelllinien untersucht werden. Man kann auch danach streben, neue Wechselwirkungen mit diesem Enzym zu identifizieren, die dann zu neuen Einblicken in die Art der Regulierung dieses wichtigen Enzyms führen würden. Da die Aktivierung des Enzyms durch multiple Wege vermittelt wird, die mithilfe spezifischer Wirkstoffe selektiv gehemmt werden können, ist dies auch ein ideales System, um PCAs als Verfahren zur Unterscheidung induzierter von konstitutiven Protein-Protein-Wechselwirkungen zu prüfen.
  • a) Untersuchung des E. coli-Überlebensassays: Wechselwirkung von p70S6k mit S6
  • Dieser Test ist ideal, da das offensichtliche Km (= 250 nM) von p70S6k für das S6-Protein145 ungefähr das gleiche ist wie das KD für Leukin-zipper bildende Peptide aus dem in unserem Testsystem verwendeten GCN4. Wir werden für unsere Untersuchungen jedoch eine konstitutiv aktive Form des Enzyms verwenden müssen. Ein vom Enzym D77-p70S6k abgeschnittener N-Terminus ist konstitutiv aktiv und wird in diesen Untersuchungen verwendetl47.
  • Methodik: D77-p70S6k-F[1,2]-Fusion und D77-p70S6k-F[3]-Fusion, oder F[1,2] und D77-p70S6k-F[3]-Fusion (zur Kontrolle) werden in E. coli und den in Minimalmedium gezüchteten Zellen bei Vorhandensein von Trimethoprim kotransformiert. Zur Analyse der Kinaseaktivität gegenüber ribosomale Untereinheiten 40S und zur Koexpression der beiden Proteine werden Kolonien ausgewählt und ausgebreitet.
  • a) Modifikation des Bakterien-Überlebensassays zum Screenen nach Bibliotheken: Identifikation neuer interagierender Proteine
  • Das Screenen einer Expressionsbibliothek nach Wechselwirkungen mit einem bestimmten Empfänger (in diesem Fall p70S6k-D77) wird bei diesem System unkompliziert sein, vorausgesetzt, dass nur folgende Schritte beteiligt sind: 1-Aufbau der Fusionsexpressionsbibliothek als eine Fusion mit dem mDHFR-Fragment [3]; 2-Transformation der Bibliothek in E. coli BL21, das pRep4 enthält (zur konstitutiven Expression des Lac-Repressors; dies ist erforderlich, wenn ein Proteinprodukt toxisch für die Zellen ist), und ein für die Fusion codierendes Plasmid: p70S6k-D77-[1,2]; 3-Ausplattieren auf Minimalmedium bei Vorhandensein von Trimethoprim und IPTG; 4-Auswahl einer beliebigen der wachsenden Kolonien, Propagierung und Isolation der Plasmid-DNA, gefolgt von der Sequenzierung der DNA-Inserte; 5-Reinigung von unbekannten Fusionsprodukten mittels des HexaHis-Tags und Klassieren mit SDS-PAGE.
  • Methodik:
  • Das gesamte Verfahren ist in 5 dargestellt. 1-Aufbau einer direktionalen Fusionsexpressionsbibliothek.
  • i-cDNA-Produktion: Man kann poly(A) + RNA von BA/F3 Zellen (B-Lymphozyten) isolieren, da diese Zellen erfolgreich in der Untersuchung der auf Rapamycin sensiblen p70S6k-Aktivierungskasdade verwendet wurden139. Um auf ungekürzte mRNA anzureichern, wird die mRNA mittels der 5'-Cap-Struktur durch das CAPture-Verfahrenl48 einer Affinitätsreinigung unterzogen. Die reverse Transkription wird durch einen "Verbindungsstück-Primer" gestartet: Dieser hat ein Poly(T)-Ende zum Starten des Po ly-(A)-mRNA-Endes und eine XhoI-Stelle für die spätere Verwendung zum direktionalen Subklonieren der Fragmente. Dann wird der erste Strang methyliert. Nach Synthese des zweiten Strangs und Abstumpfen des Produkts werden "EcoRI-Adapter" hinzugefügt, die zum Aufschließen der Verbindungsstücke mit EcoRI und XhoI führen (die Inserte werden durch Methylierung geschützt), was eine ungekürzte cDNA hervorbringt, die für die direktionale Insertion in einen mit EcoRI und XhoI geöffneten Vektor bereit ist. Da der Erfolg des Screenens von Bibliotheken zu einem großen Teil von der Qualität der produzierten cDNA abhängt, werden wir die oben angeführten Verfahren verwenden, da sich gezeigt hat, dass sie durchgehend cDNA-Bibliotheken von hoher Qualität produzieren.
  • ii-Insertion von cDNA in Vektoren: Die Bibliothek wird aufgebaut als C-terminale Fusion mit mDHFR F[3] in Vektor pQE-32 (Qiagen), da wir mit diesem Vektor in BL21-Zellen hohe mDHFR-Fusions-Expressionswerte erzielt haben. Drei dieser Vektoren werden gebildet, die sich an ihrem Ende 3' unterscheiden, welches die neue, von uns erarbeitete Polyklonierungsstelle ist (bereits beschrieben, unter Verfahren), die entweder 0, 1 oder 2 zusätzliche Nukleotide trägt. Dies ermöglicht das Durchlesen von F[3] in den Bibliotheksfragmenten in allen 3 Translations-Leserastern. Die cDNA-Fragmente werden in allen Vektoren gleichzeitig direktional an den EcoRI- und XhoI-Stellen eingebaut.
  • 2,3,4 und 5- Diese Schritte wurden bereits weiter vorne unter "Ergebnisse" beschrieben, abgesehen vom finalen Sequenzieren von Klonen, die mittels Sequenzpr mern identifiziert werden, die für Vektorsequenzen spezifisch sind, die die Stellen der Bibliotheksinsertionen flankieren. Die Protein-Reinigung wurde ebenfalls bereits beschrieben, mit einer Ein-Schritt-Reinigung auf Ni-NTA (Qiagen). Wenn die Produktgröße mehr als 15 kDa über dem Molekulargewicht der DHFR-Komponente (gleich einem cDNA-Insert von mehr als 450 bp) liegt, lassen wir die Inserte am Sheldon Biotechnology Center (McGill University) sequenzieren.
  • c) Entwicklung des Eukaryoten-Assays:
  • Die Transformation des oben beschriebenen Systems ist nützlich, um einen äquivalenten Assay für die Verwendung in eukaryoten Zellen zu produzieren. Das Grundprinzip des Assays ist dasselbe: die Fragmente von mDHFR werden mit gebundenen Domänen verschmolzen, die Domänenbindung wird durch die Wiederherstellung der DHFR-Aktivität in eukaryoten Zellen erfasst. (5)
  • Bildung der Expressionskonstrukte: Die für die GCN4-Zipper-mDHFR-Fragmentfusionen codierenden DNA-Fragmente wurden in einem Stück in pMT3, einen eukaryoten vorübergehenden Expressionsvektor126, eingefügt. Die Expression der Fusionsproteine in COS-Zellen war auf SDS-PAGE nach 35[S]Met-Bezeichnung sichtbar.
  • Überlebens-Assays in eukaryoten Zellen: Zwei Systeme können für die Erfassung des mDHFR-Wiederzusammenbaus parallel verwendet werden:
    i-CHO-DUKX B11-Zellen (Chinesische Hamster-Eierstock-Zelllinie mit mangelnder DHFR-Aktivität) werden mit GCN4-Zipper-mDHFR-Fragmentfusionen kotransfiziert. Die Zellen werden in Abwesenheit von Nukleotiden gezüchtet; nur Zellen mit wiederhergestellter DHFR unterliegen der normale Zellteilung und Koloniebildung.
  • ii-Methotrexat-(MTX)-resistente Mutanten von mDHFR wurden gebildet, mit dem Ziel der Transfektion von Zellen mit konstitutiver DHFR-Aktivität, wie z.B. COS- und 293er Zellen. Wir mutierten F[1,2], um nacheinander jede der fünf Mutationen, die Ki (MTX) deutlich erhöhen, einzubauen: Gly15Trp, Leu22Phe, Leu22Arg, Phe31Ser und Phe34Ser (Nummerierung entsprechend der Wildtyp-mDHFR-Sequenz). Diese Mutationen erfolgen an unterschiedlichen Positionen, entsprechend der aktiven Stelle und entsprechend F[3], und haben verschiedene Auswirkungen auf Km (DHF), Km (NADPH) und Vmax der ungekürzten Säugetier-Enzyme, in welchen sie sich befanden. Die Mutanten Z-F[1,2: Leu22Phe], Z-F[1,2: Leu22Arg] und Z-F[1,2: Phe31Ser] ermöglichten jeweils das Überleben von Bakterien mit hoher Wachstumsgeschwindigkeit, wenn sie mit Z-F[3] kotransformiert wurden (Ergebnisse nicht dargestellt). Die fünf Mutanten werden in eukaryoten Zellen untersucht, in der Wiederherstellung von mDHFR-Fragmenten zur Produktion von Enzymen, die COS- oder 293er Zellwachstum bei selektivem Druck von MTX unterhalten können, das den Hintergrund aufgrund der Aktivität des natürlichen Enzyms eliminiert. Die Mutation bietet einen Vorteil bei der Auswahl, wobei sie keinen augenfälligen Nachteil im Hinblick auf den Wiederzusammenbau des aktiven En zyms aufweist. Wenn die in einem beliebigen der Überlebens-Assays wiederherstellte mDHFR eukaryotes Zellwachstum ermöglicht, das deutlich langsamer ist als mit dem Wildtyp-Enzym, wird Thymidylat zum Wachstumsmedium hinzugefügt, um teilweise den selektiven Druck zu verringern, der durch den Mangel an Nukleotiden besteht.
  • d) Test des Eukaryoten-Überlebens-Assays
  • Zu Beginn ist es erforderlich, zu untersuchen, ob induzierte Wechselwirkungen mit p70S6k erfasst werden können. Man kann dasselbe Testsystem wie für E. coli das oben beschrieben wurde, verwenden: Induktion der Assoziation von p70S6k mit S6-Protein.
  • Methodik
  • Die mDHFR-Leu22Phe-Mutanten S6-F[1,2] und p70S6k-F[3], oder F[1,2] und p70S6k-F[3] (zur Kontrolle) werden in COS-Zellen kotransfiziert und die Zellen werden 48 Stunden lang in einen Serumtotzustand überführt, gefolgt vom Replattieren der Zellen bei geringer Dichte in Serum und MTX. Die Kolonien werden zur Analyse der Kinaseaktivität gegenüber ribosomale Untereinheiten 40S, und zur Koexpression der beiden Proteine, ausgewählt und ausgebreitet. Weitere Kontrollen zur Hemmung der Proteinassoziation mit Wortmannin und Rapamycin werden durchgeführt.
  • e) Modifikation des Eukaryoten-Überlebens-Assay für Screenen nach Bibliotheken
  • Ein großer Teil der erforderlichen Arbeit zur Erstellung einer Bibliothek für die Verwendung bei eukaryoten Zellen ist bereits getan, da die EcoRi/XhoI direktionale cDNA, die mithilfe des von Stratagene stammenden "cDNA-Synthese-Kits" produziert wurde, unmittelbar direktional in den von Stratagene erhältlichen Zap-Express®-Vektor eingefügt werden kann (Zap Express® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA).
  • Methodik:
  • Die Schritte 1 bis 5 entsprechen den Schritten für das Screenen nach Bakterien-Bibliotheken (siehe oben). 1-Die Bibliothek wird wieder als C-terminale Fusion zu mDHFR F[3] aufgebaut. F[3] (ohne Stoppkodon) wird In-frame in Zap Express® eingefügt, gefolgt von der Insertion in neue Poly-Verbindungsstücke, die die Expression der Inserte in allen drei Leserastern ermöglichen (oben beschrieben), und von der EcoRI/XhoI di rektionalen cDNA. Diese Bakteriophagen-Bibliothek wird vermehrt und mit dem Helfer-Phagen von Stratagene behandelt, um einen eukaryoten Expressions-Phagemid-Vektor (pBK-CMV), der die Fusionsinserte trägt, auszuschneiden. 2-Kotransfektion der Bibliothek und p70S6k-F[1,2]-Konstrukte in eukaryote Zellen: wir führen das Screenen in COS- oder 293er Zellen durch, da diese auf das Serum reagieren, indem sie den p70S6k Signalweg aktivieren. Selektionsexperimente werden wie für das oben beschriebene S6-Testsystem durchgeführt. 3-Propagation, Isolierung und Sequenzierung der eingefügten DNA werden durchgeführt. 4-Die klonierten Fusionsproteine werden auf SDS-PAGE durch direkte Sichtbarmachung nach 35S-Met/Cys-Kennzeichnung, oder durch Western-Blotting unter Verwendung eines kommerziellen polyklonalen Antikörpers gegen mDHFR klassiert.
  • Generalisierung des Verfahrens: Das Schema zur Erfassung von Partnern für das Protein p70S6k kann für Untersuchungen jedes biochemischen Übertragungswegs in jedem lebenden Organismus angewandt werden. Diese Übertragungswege können sich auch auf Krankheitsprozesse beziehen. Der sich auf Krankheit beziehende Übertragungsweg kann ein intrinsischer Prozess von Zellen im Menschen sein, aus dem eine Pathologie entsteht, zum Beispiel eine Mutation, Deletion oder Unter- oder Überexpression eines Gens. Alternativ kann der biochemische Übertragungsweg für einen pathogenetischen Organismus oder Mechanismus der Wirt-Invasion ein ganz spezifischer sein. In diesem Fall können Komponentenproteine solcher Prozesse Ziele eines therapeutischen Verfahrens sein, wie die Entwicklung von Wirkstoffen, die die Invasion durch den Organismus hemmen oder ein Komponentenenzym in einem biochemischen Übertragungsweg, das für den pathogenetischen Organismus spezifisch ist.
  • Entzündliche Krankheiten stellen einen ganz bestimmten Fall dar, der beide Beispiele betreffen kann. Von den Protein-Protein-Wechselwirkungen, die die Adhäsion von Leukozyten an entzündete Gewebe vermitteln, ist bekannt, dass sie solche Proteine wie das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1) beinhalten, sowie bestimmte Zytokine wie IL-6 und IL-8, die während einer Entzündung produziert werden. Viele der am Beginn einer Entzündungsreaktion beteiligten Proteine sind jedoch bis jetzt nicht bekannt; darüber hinaus weiß man wenig über die intrazellulären Signalübertragungswege, die durch extrazelluläre Assoziationen ausgelöst werden. Die PCAs könnten zur Aufklärung der Mechanismen beim Beginn einer Entzündung sowie bei den folgenden Signalwirkungen verwendet werden. Zum Beispiel wurden Signalübertragungswege im Zusammenhang mit einer Entzündung, wie die durch IL-1, IL-6, IL-8 und Tumornekrose vermittelten, ziemlich im Detail untersucht und es sind viele direkte und stromabwärts liegende Regulatoren. Diese Regulatoren können als Startpunktziele in einem PCA-Screen-Vorgang verwendet werden, um weitere Signal- oder Modulationsproteine zu identifizieren, die auch Empfänger für die Entwicklung von Wirkstoffen sein könnten.
  • Es gibt ein erhöhtes Risiko für Infektion durch enterale Pathogene im Falle einer Darmentzündung, das die idiopathischen intestinalen Krankheiten kennzeichnet. Es gibt zwei Mechanismen, die hier besser verstanden werden müssen und die durch PCA angesprochen werden können:
    • i- die zellulären Mechanismen der Entzündung wie oben beschrieben, und
    • ii- die Entdeckung der spezifischen Zelloberflächen-Liganden, die der pathogene Organismus erkennt und an denen er andockt. Sezernierte Proteine, die vom Pathogen produziert werden, können sich an die basolaterale Membran der Epithelzellen (wie im Fall der Infektion mit Yersinia pseudotuberculosis) anhängen oder in intestinale Epithelzellen transloziert werden (Infektion mit Salmonella), und Infektiösität und/oder physiologische Antworten auf die Infektion fördern. In den meisten Fällen sind die Wechselwirkungen zwischen dem pathogenen Protein und den Epithelzellen jedoch unbekannt.
  • Zelladhäsion und Regeneration des Nervensystems Ein fachbezogenes Beispiel für die Zelladhäsion umfasst Prozesse, die an der Entwicklung und Regeneration des Nervensystems beteiligt sind. Cadherine sind Membranproteine, die kalziumabhängige Zell-Zell-Adhäsionen vermitteln. Dazu benötigen sie eine andere Art von zytoplasmatischen Proteinen, genannt Cathenine. Diese bilden eine Brücke zwischen Cadherinen und dem Zytoskelett. Cathenine sind auch Regulatorgene, die differenzierungsspezifische Gene steuern. Das Protein β-Cathenin kann z.B. in bestimmten Situationen mit einem Transkriptionsfaktor (lef-1) interagieren und dann in den Kern transloziert werden, wo es die Zahl der von lef-1 transaktivierten Gene beschränkt (Differenzierung). Dieser Prozess wird gesteuert durch den Wnt-Signalübertragungsweg (homolog zum verzweigungsfreien Pfad bei Drosophila) durch die Inaktivierung von GSK3B, die den anschließenden Abbau von APC (ein zytoplasmatisches Adapterprotein) erlaubt. PCA-Verfahren könnten verwendet werden, um neue, an der Regulation dieser Prozesse beteiligte Proteine zu identifizieren.
  • Proteine, die an viralen Integrationsprozessen beteiligt sind, sind Beispiele von Empfängern, die mithilfe der PCA-Verfahren auf Inhibitoren untersucht werden könnten. Beispiele für den HIV-Virus beinhalten:
    • i) Hemmung von Integrase oder Transport des Prä-Integrations-Komplexes: Protein Ma oder vpr.
    • ii) Hemmung des Zellzyklus in G2 durch vpr (Wechselwirkung durch Cyklin B) und Auslösung der Induktion der Apoptose.
    • iii) Hemmung der Wechselwirkung von gp160 (Vorläufer des Membranproteins) mit Furin.
  • Zusätzliche HIV-Proteine als therapeutisches Ziel:
    • i) Vpr: nukleäre Lokalisierungssequenz (Empfänger): Wechselwirkungsort des Vpr mit Phosphatasen A.
    • ii) Vif: Wechselwirkung mit Vimentin (mit dem Zytoskelett assoziiertes Protein).
    • ii) Vpu: Degradation von CD4 in RE, vermittelt durch das zytoplasmatische Ende von Vpu.
    • iii) Nef: Myristoylationssignal von Nef.
  • BEISPIEL 3
  • Weitere Beispiele für Proteinfragmentkomplementationsassays
  • Weitere Beispiele für Assays werden hier dargelegt. Der Grund für die Produktion dieser Assays ist, alternative PCA-Verfahren zur Verfügung zu stellen, die für spezifische Protein-Assoziationsfragen wie z.B. die Untersuchung der Gleichgewichts- oder Kinetikaspekte eines Zusammenbaus geeignet sind. Es ist auch möglich, dass in bestimmten Kontexten (zum Beispiel spezifischen Zellarten) oder für bestimmte Anwendungen ein ganz bestimmter PCA nicht funktioniert, ein anderer jedoch schon. Nach stehend erfolgen folgen kurze Beschreibungen diverser PCA-Ausführungsformen.
    • 1) Glutathion-S-Transferase (GST). GST aus dem Plattwurm Schistosoma japonicum ist ein kleines (28 kD), monomeres, lösliches Protein, dass sowohl in prokaryoten als auch in eukaryoten Zellen exprimiert werden kann. Eine hochauflösende Kristallstruktur wurde gelöst und dient als Startpunkt für den Entwurf eines PCA. Es wurde ein einfacher und kostengünstiger kolorimetrischer Assay für die GST-Aktivität entwickelt, bestehend aus der reduktiven Konjugation von reduziertem Glutathion mit 1-chlor-2,4-Dinitrobenzen (CNDB), einem glänzenden, gelben Produkt. Wir haben einen PCA entworfen, der auf ähnlichen strukturellen Kriterien basiert, wie sie die bei der Entwicklung des DHFR-PCA unter Verwendung von GCN4-Leukin-Zippern als Oligomerisationsdomänen vorliegen. Kotransformanten von Zipper-GST-Fragmentfusionen werden in E. coli auf Agarplatten exprimiert und Kolonien werden auf Nitrozellulosepapier transferiert. Die Erfassung der Fragmentkomplementation wird in einem Assay durchgeführt, in dem eine Glutathion-CDNB-Reaktionsmischung als Aerosol auf die Nitrozellulose aufgebracht wird und Kolonien, die koexprimierte Fragmente von GST exprimieren, werden als gelbe Bilder erfasst.
    • 2) Grünfluoreszenzprotein (GFP) GFP aus Aequorea victoria wird zu einem der beliebtesten Proteinmarker für die Genexpression. Das ist darauf zurückzuführen, dass das kleine, monomere, aus 238 Aminosäuren bestehende Protein von Natur aus fluoreszierend ist, und zwar aufgrund des Vorhandenseins eines internen Chromophors, das aus der autokatalytischen Zyklisierung des Polypeptid-Gerüsts zwischen den Resten Ser65 und Gly67 sowie der Oxidation der Einfachbindung von Tyr66 entsteht. Das GFP-Chromophor absorbiert Licht optimal bei 395 nm und besitzt auch ein zweites Absorptionsmaximum bei 470 nm. Diese bi-spezifische Absorption legt die Existenz von zwei Niedrigenergie-Entsprechungen des Chromophors nahe, dessen relative Population von der lokalen Umgebung des Chromophors abhängt. Ein Mutant Ser65Thr, der die Isomerisation eliminiert (einziges Absorptionsmaximum bei 488 nm) führt zu einer 4 bis 6 Mal stärkeren Fluoreszenz wie die des Wildtyps. Vor kurzem wurde die Struktur des GFP von zwei Gruppen gelöst, womit es jetzt zu einem Kandidaten für einen strukturbasierten PCA-Entwurf wird, den wir zu entwickeln begonnen haben. Wie beim GST-Assay machen wir alle anfänglichen Entwicklungsschritte in E. coli mit GCN4-Leukin-Zipper-bildenden Sequenzen als Oligomerisationsdomänen. Es wird eine direkte Erfassung der Fluoreszenz durch visuelle Observation unter breitspektralem UV-Licht eingesetzt. Wir werden dieses System auch in COS-Zellen untersuchen, wobei die Auswahl der kotransfizierenden Substanzen unter Verwendung von durch Fluoreszenz aktivierte Zellauswahl (FACS) vonstatten geht.
  • Glühwürmchen-Luciferase Glühwürmchen-Luciferase ist ein 62 kDA Protein, das die Oxidation des heterozyklischen Luciferins katalysiert. Das Produkt besitzt eines der höchsten Quantenausbeuten für biolumineszierende Reaktionen: Für jedes oxidierte Luciferin-Molekül wird ein Photon freigesetzt. Die Struktur der Luciferase wurde vor kurzem entschlüsselt, was die strukturbasierte Entwicklung eines PCA ermöglicht. Wie bei unserem GST-Assay, werden Zellen auf einer Nitrozellulose-Matrix gezüchtet. Die Zugabe des Luciferins an der Oberfläche der Nitrozellulose ermöglicht diesem, durch die Zytoplasmamembranen zu diffundieren und die photolumineszierende Reaktion auszulösen. Die Erfassung erfolgt unmittelbar auf photographischem Film. Luciferase ist ein idealer Kandidat für einen PCA: die Erfassungsassays sind schnell, kostengünstig, sehr sensibel, und verwenden nicht-radioaktives Substrat, das kommerziell erhältlich ist. Das Substrat der Luciferase, Luciferin, kann durch die Zytoplasmamembran (bei saurem ph-Wert) diffundieren, und ermöglicht somit die Erfassung von Luciferase in intakten Zellen. Dieses Enzym wird derzeit bei einer Vielzahl von Expressionssystemen als Reportergen verwendet. Die Expression dieses Proteins wurde in bakteriellen, Säugetier- und pflanzlichen Zellen genau charakterisiert, womit nahe gelegt ist, dass es einen vielseitigen PCA bieten würde.
  • Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (XGPRT) Das E. coli-Enzym XGPRT wandelt Xanthin in Xanthin-Monophosphat (XMP) um, einem Vorläufer von GMP. Da das Säugetier-Enzym Hypoxanthinguanin-Phospho ribosyltransferase HGPRT nur Hypoxanthin und Guanin als Substrate verwenden kann, kann die bakterielle XGPRT als dominanter Selektions-Assay für einen PCA für Zellen verwendet werden, die unter Vorhandensein von Xanthin gewachsen sind. XGPRT exprimierende Vektoren verleihen Säugetierzellen die Fähigkeit, in selektivem Medium zu wachsen, das Adenin, Xanthin und Mycophenolsäure enthält. Die Funktion der Mycophenolsäure ist, die de novo Synthese von GMP zu hemmen, indem es die Umwandlung von IMP zu XMP blockiert (A. B. Chapman, (1983) Molec. & Cellul. Biol. 3, 1421–1429). Das produzierte GMP entstammt dann nur der Umwandlung von Xanthin zu XMP, katalysiert durch die bakterielle XGPRT. Wie mit Aminoglycosid können Phosphotransferasefragmente aus XGPRT generiert werden, basierend auf der bekannten Struktur (siehe Tabelle 1) und unter Verwendung des oben beschriebenen Design-Entwicklungs-Verfahrens mit Fragmenten, die mit den GCN4-Leukin-Zippern als Test-Oligomerisationsdomänen verschmolzen sind. Die komplementären Fusionen werden kotransfiziert und die Proteine vorübergehend in COS-7-Zellen exprimiert, oder in CHO-Zellen stabil exprimiert, die im selektiven Medium gewachsen sind. Im Fall von CHO-Zellen werden die Kolonien gesammelt und sequentiell bei ansteigenden Konzentrationen der selektiven Verbindungen rekultiviert, um auf Populationen von Zellen anzureichern, die die Fusion bei hohen Konzentrationen effektiv exprimieren.
    • 5) Adenosindeaminase Adenosindeaminase (ADA) ist in kleinsten Mengen in praktisch jeder Säugetierzelle vorhanden. Obwohl es kein essentielles Enzym für das Zellwachstum ist, kann ADA in einem dominanten Selektions-Assay verwendet werden. Es ist möglich, Wachstumsbedingungen zu schaffen, unter denen die Zellen ADA benötigen, um zu überleben. ADA katalysiert die irreversible Umwandlung zytotoxischer Adeninnukleoside zu deren respektiven nicht-toxischen Inosin-Analoga. Durch Zugabe zytotoxischer Konzentrationen von Adenosin oder zytotoxischer Adenosin-Analoga, wie z.B. 9-β-D-Xylofuranosyladenin zu den Zellen, wird ADA für das Zellwachstum benötigt, um dem zytotoxischen Agens seine toxische Wirkung zu nehmen. Zellen, die das ADA-Gen beinhalten, können dann zur Verstärkung ausgewählt werden, bei Vorhandensein von geringen Konzentrationen von 2'-Deoxycoformycin, einem stark bindenden Über gangszustands-Analoginhibitor von ADA. ADA kann dann für einen auf Zellüberleben basierenden PCA verwendet werden (R. J. Kaufmann et al., (1986) Proc. of the Nat. Acad. Sci. (USA) 83, 3136-3140). Wie bei den anderen, oben beschriebenen Systemen, können Fragmente von ADA basierend auf der bekannten Struktur (siehe Tabelle 1) unter Verwendung des oben beschriebenen Design-Entwicklungs-Verfahrens mit Fragmenten erzeugt werden, die mit den GCN4-Leukin-Zippern als Testoligomerisationsdomänen verschmolzen sind. Die komplementären Fusionen werden kotransfiziert und die Proteine vorübergehend in COS-7-Zellen exprimiert, oder in CHO-Zellen stabil exprimiert, die in selektivem Medium gezüchtet wurden, das 2'-Deoxycoformycin enthielt. Im Fall von CHO-Zellen werden Kolonien gesammelt und bei steigenden Konzentrationen von 2'-Deoxycoformycin schrittweise rekultiviert, um auf Populationen von Zellen anzureichern, die die Fusion bei hohen Konzentrationen effektiv exprimieren.
    • 6) Bleomycin bindendes Protein (Zeocin-Resistengen) Zeocin, ein Mitglied der Bleomycin/Phleomycin-Familie von Antibiotika, ist toxisch für Bakterien, Pilze, Pflanzen und Säugetierzellen. Die Expression des Zeocin-Resistenzgens verleiht Resistenz gegen Bleomycin/Zeocin. Das Protein verleiht Resistenz durch Bindung an und Absonderung des Wirkstoffs und verhindert somit seine Assoziation und Hydrolyse der DNA. J. Berdy, (1980) In Amino Acid and Peptide Antibiotics, J. Berdy, ed. (Boca Raton, FL: CRC Press), S. 459–497; P. Mulsant, G. Tiraby, J. Kallerhoff und J. Perret, (1989 Somat. Cell. Mol. Genet. 12, 243–252). Bleomycin bindendes Protein (BBP) könnte dann für einen PCA basierend auf Zellüberleben verwendet werden. Wie bei den anderen, oben beschriebenen Systemen, können ADA-Fragmente basierend auf der bekannten Struktur gebildet werden (siehe Tabelle 1), und zwar unter Verwendung des oben beschriebenen Design-Entwicklungs-Verfahrens mit Fragmenten, die mit GCN4-Leukin-Zippern als Test-Oligomerisationsdomänen verschmolzen sind. Das BBP ist ein kleines (8 kD) Dimer, das sich mittels einer Untereinheit-Grenzflächen-Bindungsstelle an Wirkstoffe bindet. Deshalb wäre das Design in dem Punkt ein wenig anders, dass zuerst eine Einzelkettenform des Dimers gebildet würde, und zwar durch Fusion von zwei BBP-Genen mit einer kurzen Sequenz, codierend für ein einfaches Polypeptid-Verbindungsstück, das zwischen die beiden Untereinheiten gesetzt wird. Fragmente basieren in diesem Fall auf einer kurzen Sequenz einer der Untereinheits-Module, während die anderen Fragmente aus der verbleibenden Sequenz der Untereinheit plus der anderen Untereinheit zusammengesetzt sind. Die Komplementation und die Selektionsexperimente werden wie für oben beschriebene Beispiele unter Verwendung von Bleomycin oder Zeocin als selektive Wirkstoffe durchgeführt.
    • 7) Hygromycin-B-Phosphotransferase Das Antibiotikum Hygromycin-B ist ein Aminozyklitol, das die Proteinsynthese durch Unterbrechung der Translokation und Förderung des Falschlesens hemmt. Das E. coli Enzym Hygromycin-B-Phosphotransferase entgiftet die Zellen durch das Phosphorylieren von Hygromycin B. Bei Expression in Säugetierzellen kann Hygromycin-B-Phosphotransferase Resistenz gegen Hygromycin-B verleihen (L. Gritz und J. Davies, (1983) Gene 25, 179–188). Das Enzym ist ein dominant selektierbarer Marker und könnte für einen PCA basierend auf Zell-Überleben verwendet werden. Während die Struktur des Enzyms nicht bekannt ist, wird vermutet, dass dieses Enzym homolog zu Aminoglycosidkinase ist (Shaw et al., (1983) Microbiol. Rev. 57, 138–163). Es ist deshalb möglich, das kombinierte Design/Entwicklungs-Verfahren zu verwenden, um einen PCA mit diesem Enzym zu produzieren und eine dominante Selektion in Säugetierzellen mit der Selektion bei steigenden Konzentrationen von Hygromycin B. zu durchzuführen.
    • 8) L-Histidinol-NAD+-Oxidoreduktase Das hisD-Gen von Salmonella typhimurium codiert für die L-Histidinol-NAD+-Oxidoreduktase, die Histidinol zu Histidin umwandelt. Säugetierzellen, die in Medium ohne Histidin aber mit Histidinol gewachsen sind, können für die Expression von hisD gewählt werden (S. C. Hartman, R. C. Mulligan (1988), Proc. of the nat. Acad. Sci. (USA) 85, 8047-8051). Ein weiterer Vorteil der Verwendung von hisD zur dominanten Selektion ist, dass Histidinol selbst toxisch ist, und somit die Aktivität von endogener Histidyl-tRNA-Synthetase hemmt. Histidinol ist auch kostengünstig und durchdringt Zellen leicht. Die Struktur von Histidinol-NAD+-Oxidoreduktase ist unbekannt und somit basiert die Entwicklung eines PCA basierend auf diesem Enzym ausschließlich auf dem Exonuklease-Fragment/Evolutions-Verfahren.
  • Die folgende Tabelle zeigt alternative Ausführungsformen unter Verwendung anderer PCA-Reporter. Abkürzungen in der Tabelle: D, dominanter Selektionsmarker; R, rezessiver Selektionsmarker. Struktur: Vier-Buchstaben-Codes = Proteindatenbank-(PDP)-Einträge; K, bekannt aber nicht in PDB hinterlegt; U, unbekannt. mono/oligo: M, Monomer, D, Dimer, tetra, Tetramer.
  • 10 Tabelle 1: Zusammenstellung weiterer möglicher PCA-Reporter-Anwärter A-Assays basierend auf dominanter oder rezessiver Auswahl
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • ii-Virusplaque-Assays
    Figure 00470002
  • B-Zelltod-Assays
    Figure 00470003
  • C-Kolorimetrischer/Fluorimetrischer Assay
    Figure 00480001
  • D-Heteromere Enzymstrategien
    Figure 00480002
  • BEISPIEL 4
  • Beispiele für PCA-Varianten zur Erfassung multipler Protein/Protein-, DNA/Protein-, RNA/Protein-Wirkstoffkomplexe
  • Bis hierher wurden spezifische Beispiele nur für PCA-Anwendungen für Proteinpaar-Wechselwirkungen gegeben. Es ist jedoch möglich, PCA für Multiprotein-, Protein-RNA-, Protein-DNA- oder Protein-Kleinmolekül-Wechselwirkungen zu verwenden. Es gibt zwei allgemeine Schemata zur Erzeilung solcher Systeme. Multi-Untereinheit-PCA: Zwei Proteine müssen nicht interagieren, damit ein PCA-Signal beobachtet werden kann; wenn ein Partner-Protein oder Proteinkomplex zwei Proteine gleichzeitig bindet, besteht die Möglichkeit, einen solchen Komplex aus drei Proteinen zu erfassen. Ein Multi-Untereinheit-PCA wird verständlich anhand des Beispiels der Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (TK), einem Homodimer mit 40 kD. Bei diesem Entwurf enthält die TK-Struktur zwei gut definierte Bereiche, bestehend aus einem Alpha/Beta-Bereich (Reste 1–223) und einem Alphahelix-Bereich (224–374). Als Testsystem verwenden wird das Dimer Rop1, ein Homodimer mit 4 Helixbündeln. Die beiden TK-Fragmente werden durch PCR extrahiert und zum vorübergehenden Transfektionsvektor pMT3 subkloniert, der erste parallel zum Adenovirus-Major-Late-Promotor, ein Tripartite-Leader 3' am ersten ATG, und der zweite stromabwärts einer ECMV-internen Startstelle. Restriktionsstellen, die vorher zwischen dem ersten und letzten ATG eingebaut wurden, werden zu BamHI/KpnI und PstI/EcoRI Klonierungsstellen stromabwärts der beiden ATGs subkloniert. Diese werden verwendet, um durch PCR generierte Fragmente der Rop1-Untereinheiten zu zwei verschiedenen Vektoren zu subklonieren. Danach werden Ltk-Zellen durch Lipofektion mit den beiden Plasmiden kotransfiziert und Kolonien der überlebenden Zellen werden in einem Medium seriell selektiert, das steigende Konzentrationen von HAT (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin) aufweist. Zellen, die komplementäre Fragmente von zu den vier Rop1 verschmolzenen TK exprimieren, wachsen unter diesem selektiven Druck, oder sterben andernfalls ab. Ein spezifisches Beispiel für die Verwendung dieses Konzepts wäre die Bestimmung von Bestandteilen von Multiprotein-Komplexen, die vorübergehend oder konstitutiv in Zellen gebildet werden.
  • Die Einsatzmöglichkeiten von PCA sind nicht auf die Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen beschränkt, sondern können auf die Erfassung von Wechselwirkungen von Proteinen mit DNA, RNA oder kleinen Molekülen ausgelegt werden. Bei diesem Entwurf werden zwei Proteine mit PCA-komplementären Fragmenten verschmolzen, aber die beiden Proteine interagieren nicht miteinander. Die Wechselwirkung muss durch eine dritte Einheit ausgelöst werden, die ein beliebiges Molekül sein kann, das sich gleichzeitig an die beiden Proteine anhängt oder eine Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen auslöst, indem es eine Konformationsänderung in einem der beiden Partner hervorruft. Zwei Beispiele wurden in unserem Labor unter Verwendung des mDHFR-PCA in E. coli gezeigt. Im ersten Fall wird ein natürliches Produkt, der immunsuppressive Wirkstoff Rapamycin verwendet, um eine Wechselwirkung zwischen seinem Rezeptor FKBP12 und einem Partnerprotein mTOR (Säugetier-Empfänger von Rapamycin) zu induzieren. Wir erfassen dies durch die Kotransformation von mit FKBP oder mTOR verschmolzenen DHFR-Fragmenten in E. coli gewachsen bei Vorhandensein oder unter Abwesenheit von Trimethoprim (wie oben beschrieben) und Rapamycin (0 bis 10 nM). Wir haben gezeigt, dass die Förderung des Wachstums, wie durch Koloniebildung erfasst, vollständig von der Zugabe von Rapamycin abhängig ist, was nahe legt, dass der mDHFR-PCA einen durch Rapamycin induzierten Zusammenbau von FKBP12-mTOR und die nachfolgende Wiederherstellung der DHFR-Aktivität erfasst. Dies ist ein Beispiel für die Verwendung des PCA-Verfahrens, um auf kleine Moleküle zu untersuchen, die Wechselwirkungen zwischen Proteinen induzieren können. Allgemeine Anwendungen für die therapeutische Entwicklung wären möglich, und zwar in Form des Screenens von Molekülbibliotheken nach kombinatorischen Verbindungen kleiner Moleküle, die Wechselwirkungen zwischen Proteinen induzieren, die die Aktivitäten entweder eines oder beider Proteine hemmen können, oder spezifische zelluläre Prozesse aktivieren, die durch andere Ereignisse initiiert werden, wie z.B. durch über Wachstumsfaktoren vermittelte Rezeptordimerisierung. Die Entdeckung solcher kleiner Moleküle könnte zur Entwicklung oral verfügbarer Wirkstoffe für die Behandlung eines breiten Spektrums humaner Krankheiten führen.
  • Ein weiteres Beispiel für eine induzierte Wechselwirkung, das wir mit dem DHFR-PCA untersucht haben, ist die Wechselwirkung des Onkogens GTPase p21ras und dessen direkter, stromabwärts liegender Empfänger, die Serin/Threoninkinase raf. Diese Wechselwirkung tritt nur auf, wenn sich die GTPase in der GTP-gebundenen Form befindet, wobei die Wechselzahl von GTP zu GDP zu Freisetzung des Komplexes führt. Wie im Fall des FKBP-mTor-Komplexes haben wir diese induzierte Wechselwirkung in E. coli gezeigt. Der PCA könnte allgemein verwendet werden, um solche induzierten Wechselwirkungen zu untersuchen, und zum Screenen nach Verbindungen, die diese Wechselwirkungen bei pathologischen Zu ständen freisetzen oder verhindern. Die ras-raf-Wechselwirkung selbst könnte ein Ziel einer therapeutischen Intervention sein. Onkogene Formen von ras bestehen aus Mutanten, die unfähig sind, sich in GTP umzuwandeln und deshalb ständig mit aktiviertem ras verbunden bleiben. Dies führt zu einem konstitutiven, unkontrollierten Wachstumssignal das teilweise in die Onkogenese führt. Die durch PCA stattfindende Identifikation von Verbindungen, die diesen Prozess hemmen, wäre in einem großen Bereich der Krebstherapie wertvoll. Weitere Beispiele der multimolekularen Anwendungen von PCA könnten die Identifizierung neuer DNA- oder RNA-Bindungsproteine umfassen. Beim einfachsten Entwurf verwendet man ein bekanntes DNA- oder RNA-Bindungsmotiv, z.B. einen Retinoidsäure-Rezeptor-Zinkfinger bzw. ein einfaches DNA-Bindungsprotein wie z.B. IF-1. Eine Hälfte des PCA besteht aus der DNA- oder RNA-Proteinbindungsdomäne, verschmolzen mit einem der PCA-Fragmente (Kontrollfragment). Das komplementäre Fragment wird mit der cDNA-Bibliothek verschmolzen. Eine dritte Einheit, das für eine Sequenz codierende Gen, die ein Element enthält, von dem bekannt ist, dass es sich an das Kontrollprotein bindet, und ein zweites vermeintliches oder bekanntes regulatives Element werden für nach dieser Sequenz codiert. Ein Testsystem besteht aus tat/tar-Elementen, die die Elongation bei der Transkription/Translation von HIV-Genen steuern. Ein Anwendungsbeispiel wäre die Identifizierung der Tat-Bindungselemente, von denen vorgeschlagen wurde, dass sie in eukaryoten Genomen existieren und möglicherweise Gene auf dieselbe oder eine ähnliche Weise regulieren wie die HIV-Gene. (D. J. SenGupta et al., (1996) Proc. Natl. Acad. USA 6, 8496-8501).
  • BEISPIEL 5
  • Beispiele für PCA-Anwendungen zum Screenen nach Wirkstoffen: Screenen von Verbindungskombinationsbibliotheken nach den Verbindungen, die Protein/Protein-, Protein/RNA-, Protein/DNA-Komulexe hemmen oder induzieren
  • A) Screenen nach Wirkstoffen
  • Screenen von Verbindungskombinationsbibliotheken nach den Verbindungen, die Protein/Protein-, Protein/RNA-, und Protein/DNA-Komplexe hemmen oder induzieren. Das PCA-Verfahren kann direkt zur Identifikation potentiell therapeutischer Moleküle verwendet werden, die in Kombinationsbibliotheken organischer Moleküle vorhanden sind. Es ist möglich, Hochleistungs-Screenen solcher Bibliotheken durchzuführen, um nach solchen Verbindungen zu screenen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Protein-DNA/RNA-Wechselwirkungen hemmen oder induzieren (wie oben erläutert). Darüber hinaus ist es möglich, nach Verbindungen zu screenen, die Enzyme hemmen, deren Substrate andere Proteine, DNA, RNA oder Kohlehydrate sind, wie nachstehend erläutert wird. Bei dieser Anwendung werden interagierende Proteine/Proteinsubstratpaare oder Kontroll-DNA/RNA bindende Protein-Enzym-Paare mit PCA-komplementären Fragmenten verschmolzen und Plasmide, die diese Paare enthalten, in eine Zelle transformiert/transfiziert, und zwar zusammen mit einem dritten DNA- oder RNA-Element, wie im jeweiligen Fall erforderlich. Transformierte/transagierte Zellen lässt man in Flüssigkultur in Multiwell-Platten wachsen, wobei jeder Napf mit einer einzelnen Verbindung aus einem Array von kombinatorisch synthetisierten Verbindungen inokuliert wird. Das Erscheinen eines Ergebnisses hängt von der Wirkung einer Verbindung ab. Wenn die Verbindung eine Protein-Wechselwirkung hemmt, ist das Ergebnis negativ (kein PCA-Signal ist ein positives Ergebnis). Wenn die Verbindung eine Protein-Wechselwirkung induziert, ist das Ergebnis ein positives PCA-Signal. Kontrollen für nicht-spezifische Wirkungen von Bestandteilen beinhalten: 1) Demonstration, dass die Verbindung am PCA-Enzym selbst nicht wirkt (Gegenprobe mit Zellen, die mit dem intakten Wildtyp-Enzym transfiziert sind, das als PCA-Sonde verwendet wird), und im Fall eines Zellüberlebensassays, dass die Verbindung für die Zellen nicht toxisch ist, die nicht transfomiert/transfiziert wurden. Neben der Verfügbarkeit eines Hochleistungsassays für die biologische Aktivität von Verbindungen, bietet ein PCA gegenüber in-vitro-assays auch den Vorteil, dass er ein Test für die Zellmembranpermeabilität aktiver Verbindungen ist. Spezifisch gezeigte Beispiele eines PCA zum Wirkstoffscreenen in unserem Labor beinhalten die Anwendung eines DHFR-PCA in E. coli zur Erfassung von Verbindungen, die therapeutisch relevante Ziele hemmen. Diese beinhalten Bax/Bcl2 fkbp12/tor ras/raf, die Carboxyl-Terminaldimerisierungs-Domäne des HIV-1-Kapsidproteins, IkB- Kinase IKK-1 und IKK-2 Dimerisierungs-Domänen (Leukin-Zipper und Helix-Schleife-Helix-Domänen). In jedem Fall werden die beiden Proteine 5' stromaufwärts von entweder F[1,2] oder F[3] wie oben beschrieben subkloniert. Plasmide, die die komplementären Fragmente enthalten, werden in BL21-Zellen kotransformiert. Kolonien aus Minimalmediumplatten, die IPTG und Trimethoprim enthalten, werden gezielt ausgesucht und in flüssigem Medium unter den gleichen selektiven Bedingungen wachsen gelassen; dann wird das Material tiefgefroren. Für einen einzigen Screening-Zyklus wird über Nacht eine Priming-Kultur aus gefrorenem Material in LB-Medium wachsen gelassen. Von einem selektiven Minimalmedium, das Trimethoprim, Ampicillin, IPTG enthält, werden in jeden Napf einer 384er Platte 25 ml zugegeben. Jeder Napf wird dann mit 1 μl einer individuellen Probe aus einem Verbindungs-Array inokuliert (ArQule Inc.), um eine Endkonzentration von 10 μM zu erreichen. Jeder Napf wird dann mit 2 ml der über Nacht gewachsenen Kultur beimpft und die Platten werden in einem speziell dafür ausgelegten Rührbad bei 37°C bebrütet. Die Platten werden in zweistündigen Intervallen auf einem optischen Absorptionsspektroskop-Plattenlesegerät, das mit einem PC und einem Tabellenkalkulationsprogramm verbunden ist, bei 600 nm (Scattering) über einen Zeitraum von 8 Stunden ausgelesen. Die Wachstumsgeschwindigkeiten werden aus den individuellen Zeitablesungen für jeden Napf errechnet und mit der Standardkurve verglichen. Ein "Treffer" ist definiert als ein Fall, in dem eine einzelne Verbindung die Wachstumsgeschwindigkeit auf weniger als das 95%-Konfidenzintervall senkt, basierend auf der Standardabweichung für Wachstumsgeschwindigkeiten, die in allen Näpfen innerhalb der Testplatte beobachtet werden. "Beinahe-Treffer" werden definiert als die Fälle, in denen die Wachstumsgeschwindigkeiten sich innerhalb des 95%-Konfidenzintervalls befinden. Für jeden der Treffer oder Beinahe-Treffer werden die folgenden Kontrollen durchgeführt: Dasselbe Experiment wird mit BL21-Zellen durchgeführt, die mit einem leeren Vektor (und ohne Trimethoprim) transformiert werden, mit einem Vektor, der das ungekürzte DHFR-Gen enthält, oder mit kotransfizierten Zellen, bei denen die Proteinexpression nicht durch IPTG induziert wird. Wenn in all diesen Fällen die Verbindung keine Wirkung zeigt, kann daraus geschlossen werden, dass es speziell die untersuchte Protein-Protein-Wechsel wirkung unterbricht. Solche bestätigten Treffer oder Beinahe-Treffer werden dann nochmals untersucht, um eine Dosis-Ergebnis-Kurve für die einzelne Verbindung zu erstellen, mit Konzentrationen, die sich von 1 pM bis zu 1 mM in Größenschritten von 10 verändern. Das PCA-Verfahren für das Screenen nach Verbindungen kann auch in den oben beschriebenen Fällen von Multiprotein bzw. Protein/RNA/DNA eingesetzt werden, und kann einfach an die DHFR oder jeden anderen PCA in E. coli oder an Hefe-Varianten desselben PCA angepasst werden. Dieses Screenen kann auch für Enzyme verwendet werden, deren Empfänger andere Proteine oder Nukleinsäuren für bekannte Enzym/Substrat-Paare sind, oder auch für neu identifizierte Enzym/Substrat-Paare, wie unten beschrieben wird.
  • Proteine, die an viralen Integrationsprozessen beteiligt sind, sind Beispiele für die Ziele, die mithilfe der PCA-Verfahren auf Inhibitoren getestet werden könnten. Beispiele für den HIV-Virus beinhalten:
    • i) Hemmung der Integrase oder des Transports des Präintegrationskomplexes: Protein Ma oder vpr.
    • ii) Hemmung des Zellzyklus in G2 durch vpr (Wechselwirkung durch Cyklin B) und dadurch Induktion der Apoptose.
    • iii) Hemmung der Wechselwirkung von gp160 (Vorläufer des Membranproteins) mit Furin.
  • Zusätzliche HIV-Proteine als therapeutisches Ziel:
    • i) Vpr: Zelllokalisierungssequenz (Empfänger): Wechselwirkungsstelle von vpr mit Phosphatasen A.
    • ii) vif: Wechselwirkung mit Vimentin (dem Zytoskelett zugeordnetes Protein).
    • ii) Vpu: Degradation von CD4 in RE, vermittelt durch das zytoplasmatische Ende von Vpu.
    • iii) nef: Myristoylationssignal von Nef.
  • Weitere allgemeine Ziele für das Screenen nach Wirkstoffen könnten Proteine beinhalten, die mit neurodegenerativen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, wie z.B. Alpha-Synuklein. Dieses Protein wurde mit dem frühen Beginn von Morbus Parkinson in Verbindung gebracht und wird derzeit auch in Zusammenhang mit Morbus Alzheimer gebracht. Es gibt auch β-Amyloidproteine, die mit Morbus Alzheimer in Zusammenhang gebracht werden.
  • Ein Beispiel von Protein-Kohlehydrat-Wechselwirkungen, die ein Ziel für das Screenen nach Wirkstoffen wären, beinhaltet die Selektine, die für gewöhnlich an Entzündungen beteiligt sind. Diese Zelloberflächen-Glykoproteine sind direkt an der Diapedese beteiligt.
  • Eine Reihe von Tumorsuppressorgenen, deren Aktivitäten durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt werden, könnten nach potentiellen Anti-Krebs-Verbindungen gescreent werden. Diese beinhalten PTEN, einen Tumorsuppressor, der direkt an der Bildung von Hämatomen beteiligt ist. Er ist auch beteiligt an erblichem Brust- und Schilddrüsenkrebs. Weitere interessante Tumorsuppressorgene umfassen p53, Rb und BARC1.
  • BEISPIEL 6
  • Beispiele für Anwendungen des PCA-Verfahrens zur Erfassung von Enzym/Substrat-Wechselwirkungen
  • Die oben beschriebenen Beispiele werden zur Identifizierung neuer molekularer Wechselwirkungen mit Molekülen, die sich kaum aneinander binden, verwendet. Die Erfassung der Substrate von Enzymen ist jedoch auch vollständig mit dem unten gezeigten PCA-Verfahren kompatibel:
    • i) Enzyme, die kompakte Komplexe mit Proteinsubstraten bilden oder einen effizienten PCA-Fragmentzusammenbau induzieren oder
    • ii) Mutierte Enzyme, die sich fest mit dem Substrat verbinden, aber aufgrund von Mutationsresten, die an nukleophilen Angriffen und/oder Pro duktfreisetzung (Bindung des Substrats) beteiligt sind, keiner Produktfreisetzung unterliegen.
  • Enzyme können kompakte Komplexe mit ihren Substraten bilden (Kd ~ 1–10 mM). In diesen Fällen kann ein PCA effizient genug sein, um solche Wechselwirkungen zu erfassen. Falls dies jedoch nicht zutrifft, kann ein PCA dazu dienen, schwächere Wechselwirkungen zu erfassen. Allgemein gilt, dass, wenn die Katalysegeschwindigkeit und Produktfreisetzung langsamer ist als die Geschwindigkeit des Wiederzusammenfaltens des PCA-komplementären Fragments, eine effektiv irreversible Faltung und eine Wiederherstellung der PCA-Reporteraktivität erfolgt ist. Deshalb wird das PCA-Signal erfasst, selbst wenn es keine Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat mehr gibt. Deshalb kann die Erfassung neuer Enzymsubstrate durch die Verwendung eines PCA möglich sein, und zwar unabhängig von der effektiven Substrat-Kd oder der Geschwindigkeit der Produktfreisetzung. Für Fälle, in denen die Produktfreisetzung viel schneller erfolgt als der Zusammenbau/das Falten der PCA-Fragmente, steht durch die Generierung von "Substratbindungs"-Mutanten des Testenzyms ein alternativer Lösungsansatz zur Verfügung. Ein Beispiel dieses Lösungsansatzes, angewandt auf das Protein Tyrosinphosphatase PTP1B, bei dem Substratbindungsmutanten durch Mutation des nukleophilen Aspartam 181 zu Alanin generiert wurden, ergibt ein katalytisch totes Enzym, das aber fähig ist, kompakte Komplexe mit einem bekannten Substrat, dem EGF-Rezeptor und anderen unbekannten Proteinen zu bilden (A. J. Flint et al., (1996) Proc. Natl. Acad. USA 941680-1685). Eine Anwendung der Verwendung eines PCA zum Screenen nach interagierenden Partnern von PTP1B ist wie folgt: Wir verwenden den auf Aminoglycosidkinase (AK) basierenden PCA in vorübergehend transfizierten COS- oder 293er Zellen. Die Substratbindungsmutant-Katalysedomäne von PTB1B wird mit N-terminalen komplementären Fragmenten von AK verschmolzen, während aus einer C-terminalen Fusion der anderen AK-Fragmente eine cDNA-Bibliothek gebildet wird. Die Zellen werden mit den komplementären AK-Paaren kotransfiziert und in selektiven Konzentrationen von G418 wachsen gelassen. Nach 72 Stunden werden die Kolonien der überlebenden Zellen gezielt ausgesucht und PCR wird in situ unter Verwendung von Primern durchgeführt, die dazu ausgelegt sind, die 3' und 5' flankierenden Bereiche der cDNA-codierenden Region zu festigen. Um PCR erweiterte Produkte werden dann 5'-sequenziert, um das Gen zu identifizieren.
  • Enzyminhibitoren: Screenen von Verbindungskombinationsbibliotheken nach den Verbindungen, die Enzym-PROTEIN-Substratkomplexe hemmen mit entweder:
    • i) Enzymen, die feste Komplexe mit Proteinsubstraten bilden oder
    • ii) Mutierten Enzymen, die sich fest an das Substrat anhängen, aber aufgrund der Mutation keiner Produktfreisetzung unterliegen.
  • BEISPIEL 7
  • Anwendung des PCA-Verfahrens in der Proteintechnik/Proteinentwicklung
  • Das PCA-Verfahren kann verwendet werden, um Peptide oder Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu generieren, die von therapeutischer Bedeutung sein können, wie dies heutzutage mit der Phagenanzeigetechnik geschieht. Es ist auch möglich, Enzyme mit einem neuen Substrat oder neuen physikalischen Eigenschaften zur industriellen Enzymentwicklung zu entwickeln. Zwei detaillierte Beispiele der Anwendung des PCA-Verfahrens zu diesem Zweck sind unten angeführt, mit zusätzlichen Anwendungen, die weiter unten angegeben sind.
    • 1) Auswahl von heterodimerisierenden Leukin-Zippersequenzen hoher Affinität (J. Pelletier, K. Arndt, A. Plueckthun und S. Michnick, Manuskript in Arbeit). Der oben beschriebene mDHFR-PCA wurde in einem Schema zur Selektion von effizient heterodimerisierenden, künstlichen Leukin-Zippern verwendet. Es wurde vorgeschlagen, dass die Bildung von Salzbrücken zwischen positiv und negativ geladenen Resten an komplementären "e" und "g"-Positionen wichtig für die Stabilisierung der Leukin-Zipperbildung ist; dieser Ansicht wurde jedoch widersprochen. Um die Definition der Bedeutung der Salzbrückenbildung an den e- und g- Positionen zu unterstützen, wurden Leukin-Zipperbibliotheken erstellt. Beide basieren auf der GCN4-Leukin-Zippersequenz, enthalten aber spezifische Sequenzinformationen für entweder Jun- oder Fos-Zipper, um heterodimierisierende Paare zu bilden. Außerdem wurden die Positionen e-1 bis e-4 und g-1 bis g-4 jeder Bibliothek randomisiert, um für positiv oder negativ geladene Reste oder neutral polare Reste zu codieren. Diese Bibliotheken wurden um PCR erweitert und in die Z-F[1,2]- oder Z-F[3]-Konstrukte (oben beschrieben) subkloniert, von denen die GCN4-Zippersequenzen entfernt worden waren. Die bakterielle mDHFR-PCA-Auswahl erfolgte auf selektivem festem Medium, wie bereits beschrieben. Kolonien wurden gezielt ausgesucht und sequenziert; die Sequenzanalyse zeigt, dass die Verteilung von geladenen oder neutralen Resten an e-g-Paaren nicht zufällig ist, sondern mehr zu Paarungen entgegengesetzter Ladung tendiert oder zur Paarung eines geladenen mit einem neutralen Rest, als zur Paarung mit gleicher Ladung (siehe 7). Wir schlossen daraus, dass verbesserte Zipperpaarungen zu einer Steigerung der Effizienz der DHFR-Fragmentkomplementationen führen sollten, was zu schnelleren Bakterienverdopplungszeiten führt (siehe Tabelle 1 in der mDHFR-PCA-Beschreibung), und wir führten eine Selektion/Anreicherung der neuen GCN4-bezogenen Zipper wie folgt durch. Die entwickelten Zipperbibliotheken, exprimiert als N-terminale Fusionen mit DHFR F[1,2] oder F[3:I114A] wurden kotransformiert, Klone wurden gewählt, vermehrt und in selektiver Flüssigkultur vermischt, die Mischung wurde in einem Verhältnis 1:1.000.000 zum Klon Z-F[1,2] + Z-F[3:I114A] (Original GCN4-Leukin-Zipper) hinzugefügt. Die Mischung wurde in mehreren Durchgängen in selektivem Flüssigmedium vermehrt. Die Restriktionsanalyse zeigt, dass in 4 Durchgängen die Population der GCN4-exprimierenden Bakterien bezogen auf die neuen Zippersequenzen abnimmt (Daten nicht beigefügt), was anzeigt, das einige der künstlichen, Zipper enthaltenden Klone sich mit einer höheren Geschwindigkeit vermehren als die, die GCN4 enthalten. Bakterien aus späteren Durchgängen wurden auf selektives Medium ausplattiert und einzelne Klone sequenziert, um die Identität des am erfolgreichsten entworfenen Zipperpaares darzustellen (Daten nicht beigefügt).
    • 2) Anwendung von PCA auf Enzymfunktion und -entwurf PCA-Entwicklung: Adenosindeaminase (ADA) erfüllt alle Kriterien für einen oben genannten PCA. ADA ist ein kleines (~40 kD) und leicht zu reinigendes monomeres Zink-Metall-Enzym und die Struktur von muriner ADA ist nun bekannt. Einige in-vitro ADA-Aktivitätsassays wurden entwickelt, wobei UV-Spektrophotometrie und Stopped Flow Fluorimetrie beteiligt waren. E. coli-ADA katalysiert die irreversible Umwandlung des zytotoxischen Adenin-Nukleosids zu nicht-toxischen Inosinen.
  • Eukaryote und prokaryote Zellen, vermehrt bei Vorhandensein von zytotoxischen Konzentrationen von Adenosin oder Adenosin-Analoga, benötigen ADA, um diesen Verbindungen die toxische Wirkung zu nehmen. Das ist die Grundlage eines Dominantselektionsverfahrens, das zur Auswahl von Zellen, die ein spezifisches Gen in Säugetier-Zellen exprimieren, verwendet wird. Das ADA-Gen wurde auch in SF3834 E. coli-Zellen exprimiert, denen die Gencodierung für das endogene ADA fehlt. Sobald die Gencodierung für ADA in ADA-Bakterien-DNA eingebaut wird, können die Zellen, die ADA exprimieren, bei hohen Konzentrationen von zugegebenem Adenosin überleben, die Zellen, die das nicht tun, sterben ab. Dies bildet die Grundlage eines in vivo stattfindenden ADA-Aktivitätsassays.
  • Wir wählten ADA vor allem, weil es als ein dominant selektiver Marker in Säugetier- und Bakterienzellen verwendet werden kann, in denen das Gen ausgeschaltet wurde. Der Grund, warum wir dominant selektive Gene wählten, besteht darin, dass beim Screenen nach neuen Protein-Protein-Wechselwirkungen, besonders beim Untersuchen nach Wechselwirkungen eines bekannten Proteins gegenüber einer Bibliothek von Millionen von unabhängigen Klonen, die Selektion als Filter für Zellen dient, die eventuell eine positive Reaktion zeigen, aus Gründen, die jedoch nichts mit einer spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkung zu tun haben. Wir werden drei Testsysteme von interagierenden Proteinen verwenden, einschließlich Leukin-Zipper bildende Sequenzen, die Proteine raf und p21 und das induzierte Oligomerisationssystem, ein FK506 bindendes Protein (FKBP) und mTOR, die durch die makrozyklische immunsuppressive Verbindung Rapamycin interagieren. Für alle diese Systeme bilden wir E. coli und vorübergehende Säugetier-Transfektionsplasmide und subklonieren die Testproteine als Fusionen mit zu ADA komplementä ren Fragmenten. Der primäre Assay wird das Überleben der SF3834 E. coli-Zellen sein, die mit den komplementären ADA-Fragmenten transformiert wurden, welche mit den Test-Oligomerisationsproteinen bei Vorhandensein toxischer Konzentrationen von Adenosin verschmolzen wurden. Wir werden dann aus den Kolonien die Fusionproteine extrahieren und in vitro-Assays der ADA-Aktivität, wie unten beschrieben, durchführen. Der Nutzen von ADA-PCA als Verfahren zu Identifizierung neuer Proteine, die mit einer Test-Andockstelle interagieren, liegt auf dem Gebiet von Säugetier-COS-7- und HEK-293T-Zellen, die vorübergehend mit FKBP transfiziert werden, das mit einem der ADA-Fragmente verschmolzen ist, wobei das andere Fragment mit einer cDNA-Bibliothek aus einer normalen humanen Milz verschmolzen ist, die 106 unabhängige Klone enthält. Wie beim E. coli-Assay werden Zellen, die in einem Medium überleben, das toxische Konzentrationen von ADA enthält, gesammelt und isolierte Plasmide werden getestet, um die Gene für die interagierenden Proteine durch PCR-Erweiterung und Ketten-Propagations-Terminatons-Techniken zu identifizieren.
  • Für die Proteinfunktion erforderliche strukturelle Motive: Die Bestimmung der für die enzymatische Funktion von ADA erforderlichen strukturellen Elemente werden durch Veränderung der Strukturen der Enzymfragmente untersucht. Zuerst wird ADA in zwei separate Domänen zerschnitten – eine verantwortlich für die Substratbindung (Reste 1–210) und eine, die für die Katalyse verantwortlich ist (Reste 211–352). Diese separaten Teile werden an bekannte Domänen angefügt, wie z.B. Leukin-Zipper (siehe Beispiel 1 oben). Der Wiederzusammenbau wird die Aktivität wiederherstellen, was durch eine detaillierte in-vitro Kinetikanalyse der Bindungs- und Katalyseeigenschaften des wieder zusammengebauten Enyzms unter Verwendung der UV-Spektrophotometrie und der Stopped-Flow-Fluorimetrie beurteilt wird, um enzymatische Reaktionen zu beobachten. Dieses System stellt eine andere Handhabe bezüglich der Manipulation der Enzymaktivität zur Verfügung, was ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung enzymatischer Mechanismen darstellt. Zum Beispiel der Unterschied im kinetischen Verhalten des wieder zusammengebauten Enzyms bei Vermischung mit dem Substrat, verglichen mit dem bei Vorhandensein von Substrat wieder zusammengebauten Enzym (wobei das Substrat bereits an die Bindungsdomäne gebunden sein kann), ermöglicht eine eingehende Untersuchung der Bedeutung der Bindungsenergie für die Katalyse. Nachfolgende Punktmutationen zu den funktionellen oder Zusammenbau-Domänen des Proteins ermöglichen dann eine sehr subtile Störung und detaillierte Quantifizierung der Beziehung der Bindungsenergie zur Katalyse. Diese genaue Kontrolle über Struktur und Zusammenbau verschiedener funktioneller Domänen des Enzyms ermöglichen die eingehende Untersuchung der Funktion der enzymatischen Struktur, die Definition der strukturellen Motive und ein Verständnis für ihre Rolle bei der Katalyse.
  • Neues Protein-Katalysator-Design: Die genaue Kenntnis des Enzymmechanismus, gewonnen durch die Bestimmung der strukturellen Erfordernisse für die Katalyse, werden dann durch die Kombination dieser funktionellen "Bausteine" mit den funktionellen Motiven genutzt, die für die Substratbindung und Katalyse in anderen Enzymen verantwortlich sind, und ermöglichen somit die Erzeugung eines neuen Proteinkatalysators. Zum Beispiel wird das katalytische Motiv von ADA modifiziert zu einem Zytidin bindenden Motiv, wobei ein neues Enzym mit potentiell nützlichen katalytischen Eigenschaften entsteht. Die Aktivität dieser neuen Enzyme kann einfach beurteilt werden durch in-vivo Assays ähnlich denen eines PCA-Systems, oder durch in-vitro Aktivitätsassays. Darüber hinaus wird die detaillierte mechanistische Erforschung der entstehenden Enzyme, die mit diesem System möglich ist, ein vernünftiges Design jeder nachfolgenden Generation von Katalysatoren ermöglichen.
  • BEISPIEL 8
  • Beispiele für die Anwendung des PCA-Verfahrens zur Erfassung molekularer Wechselwirkungen im ganzen Organismus
  • Es ist eine logische Erweiterung der obigen Beschreibungen von PCA-Anwendungen zu den Einsatzmöglichkeiten dieser Techniken in ganzen Modellorganismen wie z.B. Drosophila, Nematoden, Zebrafischen und Pufferfischen. Der einzige Unterschied zu anderen aufgeführten Verfahren ist, dass die verwendeten Vektoren verschieden sein (z.B. retrovirale Vek toren) und alle für den PCA benötigten Substrate bioverfügbar sein müssten, oder die Erfassung in situ erfolgen müsste.
  • BEISPIEL 9
  • Beispiele für die Anwendung eines PCA-Verfahrens für die Gentherapie
  • Eine weitere bedeutende Ausführungsform der Erfindung ist die Bereitstellung einer Möglichkeit und eines Verfahrens für die Gentherapie bei Säugetierkrankheiten. Von besonderem Interesse ist die therapeutische Verwendung von PCA bei Krebs. In einer Ausführungsform der genannten PCA-Gentherapie wird ein PCA unter Verwendung von Fragmenten (modulare Proteineinheiten), die z.B. von einem Proteintoxin abgeleitet wurden, entwickelt: Pseuodomonas-Exotoxin, Diphterietoxin und das Pflanzentoxin Gelonin, oder andere ähnliche Moleküle. Zur Therapie zum Beispiel von Brustkrebs wird zuerst ein Säugetier-, retrovirales, adenovirales oder eukaryotes künstliches chromosomales (EACs) genetisches Konstrukt vorbereitet, das ein Fragment des ausgewählten Toxins unter Steuerung des Protomotors für die Expression des Onkogens erbB32 einbaut. Es ist wohlbekannt, dass das erbB2-Onkogen bei Brustkrebs und Adenokarzinomzellen überexprimiert ist (D. J. Slamon et. al., Science, 1989, 244, 707). Das HER2/neu (c-erbB-2)-Proto-Onkogen codiert einen 185-kDa Transmembranprotein-Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptor der Unterklasse 1, p185HER2. Das humane erbB2-Onkogen liegt auch auf Chromosom 17, Bereich q21 und umfasst 4.480 Basen paare und p185HER2 dient als Rezeptor für einen 30-kDa Glykoprotein-Wachstumsfaktor, sezerniert aus humanen Brustkrebszelllinien (R. Lupu et. Al., Science, 1990, 249, 1152).
  • Das Transgen wird "in vivo" oder "ex vivo" mithilfe von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in die Empfängerzellen eingebaut, z.B. durch homologe Rekombination, um Transgene am gewünschten Ort durch retrovirale, adenovirale oder EACs einzubauen. Ein zweites genetisches Konstrukt, das ein Fusionsgen enthält, das Empfänger-DNA beinhaltet, die ein interagierendes Protein codiert, das mit dem erbB2-Onkogen interagiert, das über das in dieser Erfindung beschriebene PCA-Verfahren entdeckt wurde, und dem "zweiten" Fragment des Toxinmoleküls. Dieses Konstrukt wird dem Patienten durch der Fachwelt bekannte Verfahren verabreicht, wie z.B. im US-Patent Nr. 5,399,346 und 5,585,237 gezeigt ist, deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Die transgene Expression des beschriebenen onkogenen erbB2-Toxinfragments wird nun vom konstitutiven onkogenen Promotor gesteuert. Die Proliferation von Tumorzellen produziert somit einen Teil des Toxins, das als Fusion am erbB2-Onkogen hängt. Bei Vorhandensein des zweiten genetischen Konstrukts, das durch den PCA entdeckte interagierende erbB2-Onkogen exprimierende "interagierendes Protein – Toxinfragment", entsteht dann: erbB2-Onkogen-Toxin "Fragment A": es entsteht interagierendes Protein – Toxinfragment B und der Tod der Empfängertumorzellen wird durch die Bildung eines aktiven Toxins durch Proteinfragmentkomplementation induziert, womit eine wirksame und effiziente Therapie besagter Krankheit zur Verfügung gestellt wird.
  • Dies kann ausgeweitet werden auf andere Krankheiten und andere Toxine einsetzende Verfahren, die hier beschrieben und durch diese Erfindung verkörpert sind.
  • BEISPIEL 10
  • Beispiele für die Anwendung von PCA-Verfahren zur Erfassung molekularer Wechselwirkungen in vitro
  • Jedes beliebige der oben beschriebenen PCA-Verfahren könnte an die in vitro Erfassung angepasst werden. Im Gegenteil zu den in-vivo PCAs würde die Erfassung jedoch mit gereinigten PCA-Fragment-Fusionsproteinen durchgeführt werden. Diese Verwendungsmöglichkeiten von PCA haben das Potential für die Verwendung in diagnostischen Kits. Der oben beschriebene Test DHFR-Assay zum Beispiel, bei dem die interagierenden Domänen FKBP12 und TOR sind, könnte als diagnostischer Test für Rapamycinkonzentrationen zur Überwachung der Dosierung bei Patienten, die mit diesem Medikament behandelt werden, verwendet werden.
  • Wie unten dargestellt, stellt die vorliegende Erfindung bereit:
    • 1) Ermöglichung der Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo oder in vitro.
    • 2) Ermöglichung der Erfassung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in geeigneten Kontexten, wie z.B. in einem spezifischen Organismus, Zelltyp, zellulärem Kompartiment oder einer Organelle.
    • 3) Ermöglichung der Erfassung von induzierter gegenüber konstitutiver Protein-Protein-Wechselwirkungen (wie durch einen Zellwachstums- oder Inhibitingfaktor).
    • 4) Die Möglichkeit, spezifische von nicht-spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden, und zwar durch die Kontrolle der Sensitivität des Assays.
    • 5) Ermöglichung der Erfassung der Kinetik der Proteinzusammenbaus in Zellen.
    • 6) Ermöglichung des Screenens von cDNA-Bibliotheken nach Protein-Protein-Wechselwirkungen.
  • Weitere Aspekte der Erfindung lassen sich aufzeigen in der Identifikation neuer Wechselwirkungen mit dem Enzym p70S6k, um seine Steuerung zu bestimmen sowie die Art, wie separate Signalkaskaden auf diesem Enzym konvergieren.
  • Das PCA-Verfahren ist besonders hilfreich für die Erfassung der Kinetik des Proteinzusammenbaus in Zellen. Die Kinetik des Proteinzusammenbaus kann mithilfe von fluoreszierenden Proteinsystemen bestimmt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann PCA für das Screenen nach Wirkstoffen verwendet werden. Die PCA-Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen, die spezifische biochemische Übertragungswege in Zellen blockieren, ermöglichen ein sorgfältig zielgerichtetes und kontrolliertes Verfahren zur Identifikation von Produkten, die nützliche pharmazeutische Eigenschaften haben.
  • Literaturverzeichnis
    • 1. Reed, L. J.: Multienzyme Complexes. Acc. Chem. Res. 7, 40–46 (1974).
    • 2. Lander, E. S.: The new genomics – global views of biology. Science 274, 536–539 (1996).
    • 3. Evangelista, C., Lockshon, D. & Fields, S.: The yeast two-hybrid system – prospects for protein linkage maps. Trends in Cell Biology 6, 196–199 (1996).
    • 4. Guarente, L.: Strategies for the identification of interacting proteins.[Review]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1693–41 (1993).
    • 5. Adams, S. R., Harootunian, A. T., Buechler, Y. J., Taylor, S. S. & Tsien, R. Y.: Fluorescence ratio imaging of cyclic AMP in single cells. Nature 349, 694–7 (1991).
    • 6. Chien, C. T., Bartel, P. L., Sternglanz, R. & Fields, S.: The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–82 (1991).
    • 7. Fields, S. & Song, O.: A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245–6 (1989).
    • 8. Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. & Brent, R.: Cdi1, a human G1 and S phase protein Phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791–803 (1993).
    • 9. Johnsson, N. & Varshavsky, A.: Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10340–4 (1994).
    • 10. Volz, K. W., Matthews, D. A., Alden, R. A., Freer, S. T., Hansch, C., Kaufmann, B. T. & Kraut, J.: Crystal structure of avian dihydrofolate reductase containing phenyltriazine and NADPH. J. Biol. Chem. 257, 2528–36 (1982).
    • 11. Oefner, C., D'Arcy, A. & Winkler, F. K.: Crystal structure of human dihydrofolate reductase complexed with folate. Eur. J. Biochem. 174, 377–85 (1988).
    • 12. Filman, D. J., Bolin, J. T., Matthews, D. A. & Kraut, J.: Crystal structures of Escherichia coli and Lactobacillus casei dihydrofolate reductase refined at 1.7A resolution. II. Environment of bound NADPH and implications for catalysis. J. Biol. Chem. 257, 13663–72 (1982).
    • 13. Bystroff, C. & Kraut, J.: Crystal structure of unliganded Escherichia coli dihydrofolate reductase. Ligand-induced conformational changes and cooperativity in binding. Biochemistry 30, 2227–39 (1991).
    • 14. Appleman, J. R. Prendergast, N., Delcamp, T. J. Freisheim, J. H. & Blakeley, R. L.: Kinetics of the formation and isomerization of methotrexate complexes of recombinant human dihydrofolate reductase. J. Biol. Chem. 263, 10304–13 (1988).
    • 15. Loetscher, P., Pratt, G. & Rechsteiner, M.: The C terminus of mouse ornithine decarboxylase confers rapid degradation on dihydrofolate reductase. Support for the pest hypothesis. J. Biol. Chem. 266, 11213–20 (1991).
    • 16. Kaufmann, R. J., Davies, M. V., Pathak, V. K. & Hershey, J. W.: The phosphorylation state of eucaryotic initiation factor 2 alters translational efficiency of specific mRNAs. Mol. Cell. Biol. 9, 946–58 (1989).
    • 17. Stammers, D. K., Champness, J. N., Beddell, C. R., Dann, J. G., Eliopoulos, E., Geddes, A. J., Ogg, D. & North, A. C.: The structure of mouse L1210 dihydrofolate reductase-drug complexes and the construction of a model of human enzyme. FEBS Lett. 218, 178–84 (1987).
    • 18. Gegg, C. V., Bowers, K. E. & Matthews, C. R. in Techniques in Protein Chemistry (eds. Marshak, D. R.) 439–448 (Academic Press, New York, USA, 1996).
    • 19. Perry, K. M., Onuffer, J. J., Gittelman, M. S., Barmat, L. & Matthews, C. R.: Longrange electrostatic interactions can influence the folding, stability, and cooperativity of dihydrofolate reductase. Biochemistry 28, 7961–8 (1989).
    • 20. Bullerjahn, A. M. & Freisheim, J. H.: Site-directed deletion mutants of a carboxyl-terminal region of human dihydrofolate reductase. J. Biol. Chem. 267, 864–70 (1992).
    • 21. Buchwalder, A., Szadkowski, H. & Kirschner, K.: A fully active variant of dihydrofolate reductase with a circularly permuted sequence. Bochemistry 31, 1621–30 (1992).
    • 22. Chen, X., Rambo, R. & Matthews, C. R.: Amino acid replacements can selectively affect the interaction energy of autonomous folding units in the alpha subunit of tryptophan synthase. Biochemistry 31, 2219–23 (1992).
    • 23. Prevost, M., Wodak, S. J., Tidor, B. & Karpuls, M.: Contribution of the hydrophobic effect of protein stability: analysis based on simulations of the Ile 96-Ala mutation in barnase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10880–4 (1991).
    • 24. Kellis, J., Jr., Nyberg, K., Sali, D. & Fersht, A. R.: Contribution of hydrophobic interactions to protein stability. Nature 333, 784–6 (1988).
    • 25. Kellis, J., Jr., Nyberg, K. & Fersht, A. R.: Energetics of complementary sidechain packing in a protein hydrophobic core. Biochemistry 28, 4914–22 (1989).
    • 26. Henderson, G. B., Russell, A. & Whiteley, J. M.: A fluorescent derivative of methotrexate as an intracellular marker for dihydrofolate reductase in L1210 cells. Arch. Biochem. Biophys. 202, 29–34 (1980).
    • 27. Denzer, A. J., Nabholz, C. E. & Spiess, M.: Transmembrane orientation of signal-anchor proteins is affected by the folding state but not the size of the N-terminal domain. EMBO J. 14, 6311–7 (1995).
    • 28. Spiess, M., Schwartz, A. L. & Lodish, H. F.: Sequence of human asialoglycoprotein receptor cDNA. An internal signal sequence for membrane insertion. J. Biol. Chem. 260, 1979–82 (1985).
    • 29. Picard, V., Ersdal-Badju, E., Lu, A. & Bock, S. C.: A rapid and efficient one-tube PCR-based mutagenesis technique using Pfu DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 22, 2587–91 (1994).
    • 30. Kunkel, T. A., Roberts, J. D. & Zakour, R. A.: Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154, 367–82 (1987).
    • 31. Tartof, K. D. & Hobbs, C. A.: New cloning vectors and techniques for easy and rapid restriction mapping. Gene 67, 169–82 (1988).
    • 32. Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–5 (1970).
    • 33. Ellenberger, T. E., Brandl, C. J., Struhl, K. & Harrison, S. C.: The GCN4 basic region leucine zipper binds DANN as a dimer of uninterrupted alpha helices: crystal structure of the protein-DNA complex. Cell 71, 1223–37 (1992).
    • 34. Cody, V., Luft, J. R., Ciszak, E., Kalman, T. I. & Freisheim, J. H.: Crystal structure determination at 2.3 A of recombinant human dihydrofolte reductase ternary complex with NADPH and methotrexate-gamma-tetrazole. Anti Cancer Drug Des. 7, 483–91 (1992).
    • 101. Reed, L. J.: Multienzyme Complexes. Acc. Chem. Res. 7, 40–46 (1974).
    • 102. Guarente, L.: Strategies for the identification of interacting proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1639–41 (1993).
    • 103. Adams, S. R., Harootunian, A. T., Buechler, Y. J., Taylor, S. S. & Tsien, R. Y.: Fluorescence ratio imaging of cyclic AMP in single cells. Nature 349, 694–7 (1991).
    • 104. Chien, C. T., Bartel, P. L., Sternglanz, R & Fields, S.: The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–82 (1991).
    • 105. Fields, S. & Song, O.: A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245–6 (1989).
    • 106. Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. & Brent, R.: Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791–803 (1993).
    • 107. Guarente, L.: Strategies for the identification of interacting proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1639–41 (1993).
    • 108. Johnson, N. & Varshavsky, A.: Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10340–4 (1994).
    • 109. O'Shea, E. K., Klemm, J. D., Kim, P. s. & Alber, T.: X-ray structure of the GCN4 leucine zipper, a two-stranded, parallel coiled coil. Science 254, 539–44 (1991).
    • 110. Ellenberger, T. E., Brandl, C. J., Struhl, K. & Harrison, S. C.: The GCN4 basic region leucine zipper binds DNA as a dimer of uninterrupted alpha helices: crystal structure of the protein-DNA complex. Cell 71, 1223–37 (1992).
    • 111. Volz, K. W., Matthews, D. A., Alden, R. A., Freer, S. T., Hansch, C., Kaufman, B. T. & Kraut, J.: Crystal structure of avian dihydrofolate reductase containing phenyltriazine and NADPH. J. Biol. Chem. 257, 2528–36 (1982).
    • 112. Oefner, C., D'Arcy, A. & Winkler, F. K.: Crytal structure of human dihydrofolate reductase complexed with folate. Eur. J. Biochem. 174, 377–85 (1988).
    • 113. Filman, D. J. Bolin, J. T., Matthews, D. A. & Kraut, J.: Crystal structures of Escherichia coli and Lactobacillus casei dihydrofolate reductase refined at 1.7 A resolution. II. Environment of bound NADPH and implications for catalysis. J. Biol. Chem. 257, 13663–72 (1982).
    • 114. Bystroff, C. & Kraut, J.: Crystal structure of unliganded Escherichia coli dihydrofolate reductase. Ligand-induced conformational changes and cooperativity in binding. Biochemistry 30, 2227–39 (1991).
    • 115. Jones, B. E. & Matthews, C. R.: Early intermediates in the folding of dihydrofolate reductase from Escherichia coli detected by hydrogen exchange and NMR. Protein Sci. 4, 167–77 (1995).
    • 116. Jennings, P. A., Finn, B. E., Jones, B. E. & Matthews, C. R.: A re-examination of the folding mechanism of dihydrofolate reductase from Escherichia coli: verifi cation and refinement of a four-channel model. Biochemistry 32, 3783–9 (1993).
    • 117. Fierke, C. A., Johnson, K. A. & Benkovic, S. J.: Construction and evaluation of the kinetic scheme associated with dihydrofolate reductase from Escherichia coli. Biochemistry 26, 4085–92 (1987).
    • 118. Andrews, J., Fierke, C. A., Birsdall, B., Ostler, G., Feeney, J., Roberts, G. C. & Benkovic, S. J.: A kinetic study of wild type and mutant dihydrofolate reductase from Lactobacillus casei. Biochemistry 28, 5743–50 (1989).
    • 119. Thillet, J., Adams, J. A. & Benkovic, S. J.: The kinetic mechanism of wild-type and mutant mouse dihydrofolate reductases. Biochemistry 29, 5195–202 (1990).
    • 120. Hillcoat, B. L., Nixon, P. F. & Blakley, R. L.: Effect of substrate decomposition on the spectrophotometric assay of dihydrofolate reductase. Anal. Biochem. 21, 178–89 (1967).
    • 121. Appleman, J. R., Prendergast, N., Delcamp, T. J., Freisheim, J. H. & Blakley, R. L: Kinetics of the formation and isomerization of methotrexate complexes of recombtnant human dihydrofolate reductase. J. Biol. Chem. 263, 10304–13 (1988).
    • 122. Grange, T., Kunst, F., Thillet, J., Ribadeau-Dumas, B., Mousseron, S., Hung, A., Jami, J. & Rietet, R.: Expression of the mouse dihydrofolate reductase cDNA in B. subtilis: a system to select mutant cDNAs coding for methotrexate resistant enzymes. Nucleic Acids Res. 12, 3585–601 (1984).
    • 123. Loetscher, P., Pratt, G. & Rechsteiner, M.: The C terminus of mouse omithine decarboxylase confers rapid degradation on dihydrofolate reductase. Support for the pest hypothesis. J. Biol. Chem. 266, 11213–20 (1991).
    • 124. Hao, H., Tyshenko, M. G. & Walker, V. K.: Dihydrofolate reductase of Drosophila. Cloning and expression of a gene with a rare transcript. J. Biol. Chem. 269, 15179–85 (1994).
    • 125. Kaufman, R. J.: Identification of the components necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 689–93 (1985).
    • 126. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Pathak, V. K. & Hershey, J. W.: The phosphorylation state of eucaryotic Initiation factor 2 alters translational efficiency of specific mRNAs. Mol. Cell. Biol. 9, 946–58 (1989).
    • 127. Oefner, C., D'Arcy, A. & Winkler, F. K.: Crystal structure of human dihydrofolate reductase complexed with folate. Eur. J. Biochem. 174, 377–85 (1988).
    • 128. Stammers, D. K., Champness, J. N., Beddelt, C. R., Dann, J. G., Eliopoulos, E., Geddes, A. J., Ogg, D. & North, A. C.: The structure of mouse L1210 dihydrofolate reductase-drug complexes and the construction of a model of human enzyme. FEBS Lett. 218, 178–84 (1987).
    • 129. Gegg, C. V., Bowers, K. E. & Matthews, C. R. in Techniques in Protein Chemistry (eds. Marshak, D. R.) 439–448 (Academic Press, New York, USA, 1996).
    • 130. Bystroff, C. & Kraut, J.: Crystal structure of unliganded Escherichia coli dihydrofolate reductase. Ligand-induced conformational changes and cooperativity in binding. Biochemistry 30, 2227–39 (1991).
    • 131. Harmann, B. & Kilimann, M. W.: cDNA encoding a 59 kDa homolog of ribosomal protein S6 kinase from rabbit liver. FEBS Lett. 273, 248–52 (1990).
    • 132. Kozma, S. C., Ferrari, S., Bassand, P., Siegmann, M., Totty, N. & Thomas, G.: Cloning of the mitogen-activated S6 kinase from rat liver reveals an enzyme of the second messenger subfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7365–9 (1990).
    • 133. Grove, U. R., Banerjee, P., Balasubramanyam, A., Coffer, P. J., Price, D. J., Avruch, J. & Woodgett, J. R.: Cloning and expression of two human p70 S6 kinase polypeptides differing only at their amino termini. Mol. Gell. Biol. 11, 5541–50 (1991).
    • 134. Banerjee, P., Ahmad, M. F., Grove, J. R., Koziosky, C., Price. D. J. & H Avruch. J.: Molecular structure of a major insulin/mitogen-activated70-kDa S6 protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8550–4 (1990).
    • 135. Reinhard, C., Thomas, G. & Kozma, S. C.: A single gene encodes two isoforms of the p70 S6 kinase: activation upon mitogenic Stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4052–6 (1992).
    • 136. Reinhard, C., Fernandez, A., Lamb, N. J. & Thomas, G.: Nuclear localization of p85s6k: functional requirement for entry into S phase. EMBO J. 13,1557–65 (1994).
    • 137. Chung, J., Kuo, C. J., Crabtree, G. R. & Blenis, J.: Rapamycin-FKBP specifically blocks growth-dependent activation of and signaling by the 70 kd S6 protein kinases. Cell 69, 1227–36 (1992).
    • 138. Price, D. J., Grove, J. R., Calvo, V., Avruch, J. & Bierer, B. E.: Rapamycin-induced Inhibition of the 70-kilodalton S6 protein kinase. Science 257, 973–7 (1992).
    • 139. Kuo, C. J., Chung, J., Fiorentino, D. F., Flanagan, W. M., Blenis, J. & Crabtree, G. R.: Rapamycin selectively inhibits interleukin-2 activation of p70 S6 kinase. Nature 358, 70–3 (1992).
    • 140. Terada, N., Franklin, R. A., Lucas, J. J., Blenis, J. & Gelfand, E. W.: Failure of rapamycin to block proliferation once resting cells have entered the cell cycle despite inactivation of p70 S6 kinase. J. Biol. Chem. 268, 12062–8 (1993).
    • 141. Calvo, V., Crews, C. M., Vik, T. A. & Bierer, B. E.: Interleukin 2 stimulation of p70 S6 kinase activity is inhibited by the immunosuppressant rapamycin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7571–5 (1992).
    • 142. Weng, Q. P., Andrabi, K., Kozlowski, M. T., Grove, J. R. & Avruch, J.: Multiple independent inputs are required for activation of the p70 S6 kinase. Mol. Cell. Biol. 15, 2333–40 (1995).
    • 143. Ming, X. F., Burgering, B. M., Wennstrom, S., ClaessoN-Welsh, L., Heldin, C. H., Bös, J. L, Kozma, S. C. & Thomas, G.: Activation of p70/p85 S6 kinase by a pathway independent of p21ras [see comments]. Nature 371, 426–9 (1994).
    • 144. Cheatham, L, Monfar, M., Chou, M. M. & Blenis, J.: Structural and functional analysis of pp70S6k. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11696–700 (1995).
    • 145. Flotow, H. & Thomas, G.: Substrate recognition determinants of the mitogenactivated 70K S6 kinase from rat liver. J. Biol. Chem. 267, 3074–8 (1992).
    • 146. Wendt, H., Baici, A. & Bosshard, H. R.: Mechanism of assembly of a leucine zipper domain. J. Am. Chem. Soc. 116, 6973–6974 (1994).
    • 147. Mahalingam, M. & Templeton, D. J.: Constitutive activation of S6 kinase by deletion of amino-terminal autoinhibitory and rapamycin sensitivity domains. Mol. Gell. Biol. 16, 405–13 (1996).
    • 148. Edery. I., Chu. L. L., Sonenberg, N. & Pelletier, J.: An efficient strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA cap retention procedure (CAPture). Mol. Cell. Biol. 15, 3363–71 (1995).
    • 149. Hussain, A., Lewis, D., Yu, M. & Melera, P. W.: Construction of a dominant selectable marker using a novel dihydrofolate reductase. Gene 112, 179–88 (1992).
    • 150. Lim, K., Ho, J. X., Keeling, K., Gilliland, G. L., Ji, X., Ruker, F. & Carter, D. C.: Three-dimensional structure of Schistosoma japonicum glutathione S-transferase fused with a six-amino acid conserved neutralizing epitope of gp41 from HIV. Protein Scei. 3, 2233–44 (1994).
    • 151. Habig, W. H., Keen, J. H. & Jakoby, W. B.: Glutathione S-transferase in the formation of cyanide from organic thiocyantes and as an organic nitrate reductase. Biochemical & Biophysical Research Communications 64, 501–6 (1975).
    • 152. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. & Prasher, D. C.: Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802–5 (1994).
    • 153. Cody, C. W., Prasher, D. C., Westler, W. M., Prendergast, F. G. & Ward, W. W.: Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea greenfluorescent protein. Biochemistry 32, 1212–8 (1993).
    • 154. Morin, J. G. & Hastings, J. W.: Energy transfer in a bioluminescent System. Journal of Cellular Physiology 77, 313–8 (1971).
    • 155. Morise, H., Shimomura, O., Johnson,. H. & Winant, J.: Intermolecular energy transfer in the bioluminescent System of Aequorea. Biochemistry 13, 2656–62 (1974).
    • 156. Ward, W. W. & Bokman, S. H.: Reversible denaturation of Aequorea greenfluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry 21, 4535–40 (1982).
    • 157. Heim, R., Prasher, D. C. & Tsien, R. Y.: Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12501–4 (1994).
    • 158. Orrno, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsien, R. Y. & Remington, S. J.: Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 273, 1392–1395 (1996).
    • 159. Youvan, D. C. & Michelbeyerte, M. E.: Structure and fluorescence mechanism of gfp. Nature Biotechnology 14, 1219–1220 (1996).
    • 160. DeLuca, M., Woods, K.: Photographic Detection of luminescence in Escherichia coli Contaning the Gene for Firefly luciferase. Analytical Biochemestry 161, 501–507 (1986).
    • 161. Conti, E., Franks, N. P., Brick, P.: Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylateH-forming enymes. Structure 4, 287–298 (1996).
    • 162. Magrath, I. T., Gupta, A., Jain, V. K.: A Rapid Screening Method for Bacteria Contaning Firefly Luciferase Plasmids. Biotechniques 15, 4–6 (1993).
  • Abkürzungen: PCA, Proteinfragmentkomplementierungsassay; mDHFR, Murin-Dihydrofolatreduktase; hDHFR, menschliche Dihydrofolatreduktase; Z-F[1,2], GCN4- Leuzin-Zipper-mDHFR-Fragment[1,2]; USPS, auf Ubiquitin basierender Spaltungsproteinsensor; IPTG, Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid; PMSF, Phenylmethylsulfonylfluorid; SDS-PAGE, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Claims (22)

  1. Proteinfragmentkomplementationsassay zum Erfassen von molekularen Wechselwirkungen, umfassend einen Wiederzusammenbau von einzelnen Fragmenten eines Proteins, wobei der Wiederzusammenbau der Proteinfragmente durch die Wechselwirkung von molekularen Domänen bewirkt wird, die mit jedem Proteinfragment verschmolzen sind, wobei der Wiederzusammenbau der Proteinfragmente unabhängig von anderen molekularen Prozessen ist und wobei der Wiederzusammenbau durch die Wiederherstellung der Proteinaktivität erfasst wird.
  2. Assay nach Anspruch 1, wobei das Protein ein monomeres Protein ist.
  3. Assay nach Anspruch 1, wobei das Protein ein Enzym ist.
  4. Assay nach Anspruch 3, wobei das Enzym ein monomeres Enzym ist.
  5. Assay nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Enzym ein Molekulargewicht zwischen 10 und 40 kDa hat.
  6. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym Glutathion-S-Transferase ist.
  7. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym Dihydrofolatreduktase ist.
  8. Assay nach Anspruch 7, wobei die Dihydrofolatreduktase am Aminosäurerest 114 mutiert ist.
  9. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym Luciferase ist.
  10. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase ist.
  11. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym eine Adenosindeaminase ist.
  12. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym eine Hygromycin-B-Phosphotransferase ist.
  13. Assay nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Enzym L-Histidinol NAD+-Oxidoreduktase ist.
  14. Assay nach Anspruch 2, wobei das Protein ein Grünfluoreszenzprotein ist.
  15. Assay nach Anspruch 14, wobei das Grünfluoreszenzprotein am Aminosäurerest 65 mutiert ist.
  16. Assay nach Anspruch 2, wobei das Protein ein Bleomycin bindendes Protein (Zeocin-Resistenzgen) ist.
  17. Verfahren zum Erfassen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden, nicht-menschlichen Organismen und/oder in nicht-menschlichen Zellen und/oder menschlichen Zellen, die isoliert und/oder kultiviert wurden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Synthetisieren von Probe- bzw. Sonden-Proteinfragmenten aus einem Enzym, das durch Zerlegen des für das Enzym kodierenden Gens in mindestens zwei Fragmente eine dominante Selektion ermöglicht; (b) Aufbauen von Fusionsproteinen, die aus den Probe-Proteinfragmenten bestehen, die mit molekularen Domänen verbunden sind, welche auf Wechselwirkungen hin untersucht werden sollen; (c) Koexprimieren der Fusionsproteine; und (d) Erfassen der Wiederherstellung der Enzymaktivität mittels des Assays nach einem der Ansprüche 3 bis 13.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Koexpression der komplementären Fusionsproteine durch die Bindung der molekularen Domänen aneinander katalysiert wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Enzym Dihydrofolatreduktase ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Fusionsproteine Peptide aufweisen, die aus N- und C-terminalen Fragmenten der Dihydrofolatreduktase bestehen und mit den GCN4-Leucin-Reißverschlusssequenzen bzw. -Zippersequenzen verschmolzen sind.
  21. Verfahren zum Screenen einer Expressionsbibliothek, umfassend das Durchführen eines Proteinkomplementationsassays nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei es sich beim Assayerfassungsmittel um ein Wiederherstellen der Proteinaktivität handelt.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem eine Wechselwirkung zwischen Teilen eines ersten oder zweiten Moleküls aufgrund der Gegenwart von mindestens einem anderen Molekül erfolgt, das die Wechselwirkung vermittelt.
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Families Citing this family (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6897017B1 (en) * 1997-01-31 2005-05-24 Odyssey Thera Inc. Vivo library-versus-library selection of optimized protein-protein interactions
US20020064769A1 (en) * 2000-10-05 2002-05-30 Watson Michnick Stephen William Dynamic visualization of expressed gene networks in living cells
CA2196496A1 (en) * 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US7062219B2 (en) * 1997-01-31 2006-06-13 Odyssey Thera Inc. Protein fragment complementation assays for high-throughput and high-content screening
US7306914B2 (en) * 1997-01-31 2007-12-11 Odyssey Thera Inc. Protein fragment complementation assays in whole animals applications to drug efficacy, ADME, cancer biology, immunology, infectious disease and gene therapy
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
DK1801214T3 (da) 1997-07-07 2011-01-24 Medical Res Council In vitro sorteringsfremgangsmåde
US6333154B1 (en) * 1997-12-04 2001-12-25 Institut Pasteur Bacterial multi-hybrid system and applications thereof
US20050221280A1 (en) * 1998-02-02 2005-10-06 Odyssey Thera, Inc. Protein-protein interactions for pharmacological profiling
US6828099B2 (en) * 1998-02-02 2004-12-07 Odyssey Thera Inc. Protein fragment complementation assay (PCA) for the detection of protein-protein, protein-small molecule and protein nucleic acid interactions based on the E. coli TEM-1 β-Lactamase
US7855167B2 (en) * 1998-02-02 2010-12-21 Odyssey Thera, Inc. In vivo screening of protein-protein interactions with protein-fragment complementation assays
US7166424B2 (en) * 1998-02-02 2007-01-23 Odyssey Thera Inc. Fragments of fluorescent proteins for protein fragment complementation assays
AU756617B2 (en) 1998-07-28 2003-01-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Leptin-mediated gene-induction
AU5143099A (en) * 1998-07-30 2000-02-21 Universite De Montreal Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
JP2002526756A (ja) * 1998-09-24 2002-08-20 デューク ユニバーシティ 生細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用の測定方法
EP1117762A4 (de) 1998-09-29 2004-02-25 Gamida Cell Ltd Verfahren zur kontrolle der proliferation und differenzierung von stammzellen und vorläuferzellen
US20040038317A1 (en) * 1999-03-15 2004-02-26 Kalobios, Inc. Breakpoint fusion fragment complementation system
US8148110B2 (en) 1999-03-15 2012-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by β-lactamase reporter fragment complementation
DE60036942T2 (de) * 1999-05-24 2008-08-07 New England Biolabs, Inc., Beverly Verfahren zur herstellung von getrennten, nicht-übertragbaren genen, welche befähigt sind ein aktives proteinprodukt zu exprimieren
US20040096938A1 (en) * 1999-05-24 2004-05-20 Ming-Qun Xu Method for generating split, non-transferable genes that are able to express an active protein product
AU6045900A (en) * 1999-05-25 2000-12-12 Panorama Research, Inc. Interaction-activated proteins
US6673554B1 (en) * 1999-06-14 2004-01-06 Trellie Bioinformatics, Inc. Protein localization assays for toxicity and antidotes thereto
EP1194539A2 (de) * 1999-06-25 2002-04-10 Universität Zürich Hetero-assoziierende coiled-coil peptide und screenings-verfahren dafür
WO2001000866A1 (en) 1999-06-26 2001-01-04 Odyssey Pharmaceuticals, Inc. An in vivo library-versus-library selection of optimized protein-protein interactions
WO2001001137A1 (en) * 1999-06-30 2001-01-04 Children's Medical Center Corporation Fusion protein and uses thereof
AU6363900A (en) * 1999-07-22 2001-02-13 Children's Medical Center Corporation Expression cloning using a tagged cdna library
WO2001051629A2 (en) * 2000-01-13 2001-07-19 Panorama Research, Inc. Circularly permutated, interaction-activated proteins
WO2001053479A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Sangamo Biosciences, Inc. Molecular switches ii
WO2001060840A2 (en) * 2000-02-14 2001-08-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Complementation assay assessing protein solubility and folding
US6727070B2 (en) 2000-02-14 2004-04-27 The Board Of Regents, The University Of Texas System Protein/solubility folding assessed by structural complementation
US6780599B2 (en) 2000-05-12 2004-08-24 Yale University Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins
WO2001088168A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Odyssey Pharmaceuticals, Inc. Mapping molecular interactions in plants with protein fragments complementation assays
DE60112282T2 (de) * 2000-05-22 2006-04-20 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Auf rezeptorgrundlage arbeitende screening-verfahren für protein wechselwirkungen
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
GB0022458D0 (en) * 2000-09-13 2000-11-01 Medical Res Council Directed evolution method
DE60239097D1 (de) * 2001-03-02 2011-03-17 Gpc Biotech Ag Drei-hybrid-assaysystem
DE10110449A1 (de) * 2001-03-05 2002-09-19 Lisa Wiesmueller Testsystem zur Bestimmung von Genotoxizitäten
US20020177217A1 (en) * 2001-03-26 2002-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Method for studying protein-protein interactions
EP1392870B1 (de) * 2001-05-09 2008-02-27 Discoverx, Inc. Screening auf enzyminhibitoren
DE60234131D1 (de) * 2001-08-01 2009-12-03 Cellomics Inc Neue fusionsproteine und molekulare bindungsassays
GB0118995D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Univ Wales Medicine Detection of mutations in nucleic acids
AU2007200686B2 (en) * 2001-09-20 2011-07-14 Immunex Corporation Selection of cells expressing heteromeric polypeptides
WO2003035887A1 (en) * 2001-09-20 2003-05-01 Immunex Corporation Selection of cells expressing heteromeric polypeptides
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
WO2003046176A2 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Hybrigenics Protein-protein interactions in human immunodeficiency virus
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (de) * 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd Verfahren zur expansion von stamm- und vorläuferzellen und damit erhaltene expandierte zellpopulationen
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
US7335478B2 (en) * 2002-04-18 2008-02-26 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Reactivation-based molecular interaction sensors
US7432063B2 (en) * 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
SE0200531D0 (sv) * 2002-02-22 2002-02-22 Avaris Ab Novel biomolecular complexes, method for their production and use
ATE377644T1 (de) * 2002-03-25 2007-11-15 Applera Corp Systeme und verfahren zum nachweis der funktion nukleärer rezeptoren unter verwendung von reporterenzymmutanten komplementierungen
WO2003093793A2 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Trellis Bioscience, Inc. Binary or polynary targeting and uses thereof
GB0214553D0 (en) * 2002-06-25 2002-08-07 Univ Leeds Reporter module molecules having active ion channel activity
US7662554B2 (en) * 2002-10-09 2010-02-16 The Trustees Of Boston University Nucleic acid supported protein complementation
US9740817B1 (en) 2002-10-18 2017-08-22 Dennis Sunga Fernandez Apparatus for biological sensing and alerting of pharmaco-genomic mutation
EP1590477B1 (de) 2003-01-29 2009-07-29 454 Corporation Verfahren zur amplifikation und sequenzierung von nukleinsäuren
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
WO2005001115A2 (en) * 2003-05-30 2005-01-06 Odyssey Thera, Inc. Monitoring gene silencing and annotating gene function in living cells
US8048627B2 (en) 2003-07-05 2011-11-01 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
US8346482B2 (en) 2003-08-22 2013-01-01 Fernandez Dennis S Integrated biosensor and simulation system for diagnosis and therapy
CA2541765A1 (en) 2003-10-10 2004-10-01 Promega Corporation Luciferase biosensor
GB0329353D0 (en) * 2003-12-19 2004-01-21 Amersham Biosciences Uk Ltd Cytochrome C protein and assay
WO2005077125A2 (en) * 2004-02-11 2005-08-25 Applera Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
AU2005250333A1 (en) * 2004-04-16 2005-12-15 Genentech, Inc. Omi PDZ modulators
AU2005250369A1 (en) * 2004-05-18 2005-12-15 Genentech, Inc. M13 virus major coat protein variants for C-terminal and BI-terminal display of a heterologous protein
US8586294B2 (en) 2004-05-18 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of protein translocation by beta-galactosidase reporter fragment complementation
US20090221440A1 (en) * 2004-07-12 2009-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to identifying protein-protein interactions
EP2336177A1 (de) 2004-08-04 2011-06-22 Amgen, Inc DKK-1 Antikörper
US20060040338A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Odyssey Thera, Inc. Pharmacological profiling of drugs with cell-based assays
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
US20060094059A1 (en) * 2004-09-22 2006-05-04 Odyssey Thera, Inc. Methods for identifying new drug leads and new therapeutic uses for known drugs
EP1797427A4 (de) * 2004-09-22 2009-04-08 Odyssey Thera Inc Verfahren zur identifizierung neuer arzneimittel-leads und neuer therapeutischer verwendungen für bekannte arzneimittel
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060094682A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Odyssey Thera, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of diabetes and obesity
CA2585549A1 (en) 2004-11-18 2006-05-26 Vib Vzw Novel type leptin receptor antagonist
US20060160109A1 (en) * 2004-11-22 2006-07-20 Odyssey Thera, Inc. Harnessing network biology to improve drug discovery
US20070212677A1 (en) * 2004-11-22 2007-09-13 Odyssey Thera, Inc. Identifying off-target effects and hidden phenotypes of drugs in human cells
EP1828408A4 (de) * 2004-12-04 2008-08-27 Univ California Los Alamos Nat Nachweissystem für protein-protein-wechselwirkungen unter verwendung von fluoreszenzproteinmikrodomänen
US20060204999A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Stephen Macevicz Detecting molecular complexes
US8227572B2 (en) * 2005-08-19 2012-07-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Arachnocampa luciferases
JP2009513141A (ja) * 2005-10-27 2009-04-02 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ タンパク質相補によるリアルタイムインビボ核酸検出
US20090220942A1 (en) * 2005-10-27 2009-09-03 Natalia Broude Activated split-polypeptides and methods for their production and use
GB0523954D0 (en) * 2005-11-24 2006-01-04 Ucb Celltech Bioassays
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
US7601517B2 (en) 2006-01-10 2009-10-13 Stanford University Split protein self complementing fragments, systems, and methods of use thereof
CA2636855C (en) 2006-01-11 2016-09-27 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
WO2008018905A2 (en) * 2006-01-17 2008-02-14 Cellumen, Inc. Method for predicting biological systems responses
US9359635B2 (en) 2006-04-03 2016-06-07 Promega Corporation Permuted and nonpermuted luciferase biosensors
US7695928B2 (en) 2006-04-10 2010-04-13 Genentech, Inc. Disheveled PDZ modulators
US20070254338A1 (en) * 2006-04-24 2007-11-01 Amgen Inc. Method for making recombinant protein using complementation dependent DHFR mutants
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP3031918B1 (de) 2006-05-11 2018-03-14 Raindance Technologies Inc. Mikrofluidische vorrichtungen
JP5406019B2 (ja) 2006-05-17 2014-02-05 セルーメン、インコーポレイテッド 自動化組織分析のための方法
US8178654B2 (en) 2006-05-23 2012-05-15 Stanford University Estrogen receptor intramolecular folding systems, estrogen receptor intramolecular folding sensors, methods of use thereof, methods of detecting ER ligands, and methods of detecting ER agonists and antagonists
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
MX2009004464A (es) * 2006-10-27 2009-11-02 Univ Boston Conjugados biomoleculares divididos, dirigidos para el tratamiento de enfermedades, malignidades y desordenes, y metodos para su produccion.
EP2095119A2 (de) * 2006-11-10 2009-09-02 Cellumen, Inc. Biosensoren für protein-protein-interaktion und verfahren zu ihrer verwendung
EP2118304A4 (de) * 2007-02-05 2010-04-28 Panbio Ltd Homogene in-vitro-fec-testverfahren und komponenten
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20090075313A1 (en) * 2007-05-04 2009-03-19 Stanford University Split protein fragments, split protein systems, methods of making split protein systems, and methods of using split protein systems
EP2177611B1 (de) 2007-08-01 2013-11-20 Japan Science and Technology Agency Verfahren zur messung der antigenkonzentration
WO2009026303A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Amgen Inc. Human c-fms antigen binding proteins
US8986997B2 (en) * 2007-08-31 2015-03-24 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for increasing biological molecule stability
TW200918553A (en) 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
EP2210104A4 (de) * 2007-11-01 2011-02-23 Univ Arizona State Zellfreie verfahren zum nachweis von protein-ligand-wechselwirkungen
EP2220247A4 (de) 2007-11-16 2011-10-26 Nuvelo Inc Antikörper gegen lrp6
WO2009111073A2 (en) * 2008-03-06 2009-09-11 Odyssey Thera, Inc. High-content and high throughput assays for identification of lipid-regulating pathways, and novel therapeutic agents for lipid disorders
WO2009142735A2 (en) 2008-05-19 2009-11-26 Promega Corporation LUCIFERASE BIOSENSORS FOR cAMP
EP2315629B1 (de) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Tröpfchenbibliotheken
JP5739807B2 (ja) * 2008-08-18 2015-06-24 ディスカヴァーエックス コーポレイション 受容体チロシンキナーゼアッセイ
JP5954990B2 (ja) 2008-11-03 2016-07-20 モレキュラー・パートナーズ・アーゲーＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ａｇ Ｖｅｇｆ−ａレセプター相互作用を阻害する結合タンパク質
US9388406B2 (en) 2008-11-17 2016-07-12 Cornell University System useful for reporting protein-protein interactions in the bacterial periplasm
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
US8871686B2 (en) 2009-07-07 2014-10-28 Agency For Science, Technology And Research Methods of identifying a pair of binding partners
US8524457B2 (en) 2009-09-22 2013-09-03 William Patterson Method for the selection of specific affinity binders by homogeneous noncompetitive assay
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
JO3244B1 (ar) 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2517025B1 (de) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Verfahren zur reduzierung des austauschs von molekülen zwischen tröpfchen
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
CA2789425C (en) 2010-02-12 2020-04-28 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis with polymerase error correction
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
MX2012011986A (es) 2010-04-15 2013-03-05 Amgen Inc RECEPTOR FGF HUMANO Y PROTEINAS ENLAZADAS A ß-KLOTHO.
AR081361A1 (es) 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
WO2011143339A1 (en) 2010-05-11 2011-11-17 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
US9290794B2 (en) 2010-05-11 2016-03-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
AR083740A1 (es) 2010-10-27 2013-03-20 Amgen Inc Anticuerpos dkk1 (dickkopf-1) y metodos de uso
CA2818990C (en) 2010-11-26 2021-06-15 Molecular Partners Ag Designed repeat proteins binding to serum albumin
EP2673614B1 (de) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Verfahren zur bildung gemischter tröpfchen
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012118903A2 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
EP2686688B1 (de) 2011-03-17 2019-05-08 Cernostics, Inc. Systeme und zusammensetzungen zur diagnose von barrett-ösophagen und verwendungsverfahren dafür
EP2702069A4 (de) 2011-04-29 2015-04-29 Janssen Biotech Inc Il4/il13-bindende repeat-proteine und verwendungen davon
EP2714970B1 (de) 2011-06-02 2017-04-19 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2013033080A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Wayne State University Device and method for optimizing photobiological processes
MX2014004027A (es) 2011-10-14 2014-04-30 Genentech Inc Activadores de zimogeno.
CA2858572C (en) 2011-12-08 2023-01-17 Amgen Inc. Human lcat antigen binding proteins and their use in therapy
CN104204192A (zh) 2012-02-13 2014-12-10 加米达细胞有限公司 间充质干细胞调理的基质及其产生和使用方法
EP2825549B1 (de) 2012-03-16 2018-10-10 F. Hoffmann-La Roche SA Gleichmässig stabilisierte manipulierte proteine
US9139863B2 (en) 2012-03-16 2015-09-22 Genentech, Inc. Engineered conformationally-stabilized proteins
IL307989A (en) 2012-04-27 2023-12-01 Novo Nordisk As Human CD30 ligand antigen-binding proteins
BR112014032316A2 (pt) 2012-06-28 2017-06-27 Molecular Partners Ag proteínas de repetição de anquirina projetadas que se ligam ao fator de crescimento derivado de plaqueta
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
EP2738180A1 (de) 2012-11-30 2014-06-04 Molecular Partners AG Bindeproteine mit mindestens zwei Bindedomänen gegen HER2
US20140271629A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Amgen Inc. Chrdl-1 antigen binding proteins and methods of treatment
SG11201507306VA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Promega Corp Activation of bioluminescence by structural complementation
EP3683237A1 (de) 2013-03-15 2020-07-22 Amgen Inc. Humane pac1-antikörper
WO2014144553A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Secreted frizzle-related protein 5 (sfrp5) binding proteins and methods of treatment
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
EP3094974B1 (de) 2014-01-14 2019-02-27 Asedasciences AG Identifizierung von funktionszellzuständen
AU2015224552A1 (en) * 2014-03-03 2016-09-15 Novogy, Inc. Reducing horizontal gene transfer of functional proteins
WO2015192089A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Axion Biosystems, Inc. Multiwell microelectrode array with optical stimulation
CN106605382B (zh) * 2014-08-27 2020-11-06 Lg 电子株式会社 在无线通信系统中的发送数据的方法及用于其装置
CN105406948B (zh) * 2014-09-12 2020-03-06 中兴通讯股份有限公司 一种实现并行多用户数据传输的方法及主节点
WO2016040767A2 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Amgen Inc. Chrdl-1 epitopes and antibodies
CA2963228C (en) * 2014-10-01 2021-05-04 Lg Electronics Inc. Data transmission method in wireless communication system and device therefor
US9942055B2 (en) * 2015-02-12 2018-04-10 Intel IP Corporation Apparatus, system and method of multicast communication
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
MX2018007859A (es) 2015-12-23 2018-11-09 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1.
WO2017182437A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Universität Innsbruck Quantification of an interaction between a ras protein and a raf protein
US10239891B2 (en) * 2017-05-15 2019-03-26 Indicator Systems International, Inc. Compositions to detect remnant cancer cells
WO2018026965A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Isi Life Sciences, Inc. Compositions and methods for detecting cancer cells in a tissue sample
EP3497231B1 (de) * 2016-08-08 2023-10-04 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Bakterielle systeme zur analyse von ubiquitinierten polypeptiden
WO2018060415A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Universität Innsbruck Full length kinase activity-conformation reporter
AU2018206279B2 (en) 2017-01-06 2020-09-03 Abl Bio Inc. Anti-alpha-syn antibody and use thereof
JOP20190177A1 (ar) 2017-01-17 2019-07-16 Amgen Inc طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr)
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
JOP20190259A1 (ar) 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1
WO2018237097A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Amgen Inc. METHOD OF TREATING OR REDUCING METABOLIC DISORDERS USING GASTRIC INHIBITING PEPTIDE RECEPTOR BINDING PROTEINS (GIPR) IN ASSOCIATION WITH GLP-1 AGONISTS
CA3071852A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Amgen Inc. Method of conjugation of cys-mabs
US11932846B2 (en) 2017-08-08 2024-03-19 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Chloramphenicol resistant split protein and uses thereof
WO2019225787A1 (ko) 2018-05-24 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-b7-h3 항체 및 그 용도
EP4266058A3 (de) 2018-07-06 2024-02-21 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Genetisch codiertes system zur konstruktion und zum nachweis biologischer wirkstoffe
CN111198272B (zh) * 2018-11-20 2023-09-08 香港理工大学深圳研究院 体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用
MX2021006783A (es) 2018-12-10 2021-07-15 Amgen Inc Transposasa de piggybac mutada.
CA3153963A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of restoring lysosomal function of retinal pigment epithelial cells by activation of tfeb
EP4054590A1 (de) 2019-11-04 2022-09-14 Amgen Inc. Verfahren zur behandlung von leukämie
CA3165802A1 (en) * 2020-01-25 2021-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for small molecule control of precise base editing of target nucleic acids and methods of use thereof
US20230184765A1 (en) 2020-04-17 2023-06-15 Vyriad, Inc. Detection assays for coronavirus neutralizing antibodies
AU2021345124A1 (en) 2020-09-16 2023-03-30 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific T-cell engaging molecules for the treatment of cancer
WO2022060878A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for treating prostate cancer
TW202233660A (zh) 2020-10-30 2022-09-01 美商安進公司 過表現胰島素樣生長因子受體突變體以調節ｉｇｆ補充
CN112375775A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 中南民族大学 一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用
IL302739A (en) * 2020-11-17 2023-07-01 Nerd Bio Llc High-throughput drug screening methods
WO2022232376A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Amgen Inc. Methods for reducing low molecular weight species of recombinantly-produced proteins
CA3222782A1 (en) 2021-06-10 2022-12-15 Amgen Inc. Engineered nrg-1 variants with improved selectivity toward erbb4 but not against erbb3
TW202328442A (zh) 2021-09-10 2023-07-16 美商安進公司 平臺宿主對ｉｇｆ—培養基之適應
WO2023183231A1 (en) 2022-03-21 2023-09-28 Amgen Inc. Combination therapy methods with t-cell engaging molecules for treatment of prostate cancer
WO2024064744A2 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Dna Twopointo, Inc. Engineered split dhfr-based methods and systems for selecting cells that have stably acquired a heterologous polynucleotide
WO2024077044A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof
WO2024089297A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Urban Joerg Novel fluorescent and bioluminescent proteins and reporter systems for ratiometric measurement of luminescence

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
CA2068190C (en) 1991-05-15 1996-12-17 Microgenics Corporation Methods and compositions for enzyme complementation assays using the omega region of beta-galactosidase
US5585237A (en) 1993-10-25 1996-12-17 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from recombinant DNA
US5585245A (en) * 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
US5610015A (en) * 1995-03-23 1997-03-11 Wisconsin Alumni Research Foundation System to detect protein-RNA interactions
CA2196496A1 (en) * 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6872871B2 (en) * 1998-02-02 2005-03-29 Odyssey Thera Inc. Mapping molecular interactions in plants with protein fragments complementation assays
US6897017B1 (en) * 1997-01-31 2005-05-24 Odyssey Thera Inc. Vivo library-versus-library selection of optimized protein-protein interactions
US6294330B1 (en) * 1997-01-31 2001-09-25 Odyssey Pharmaceuticals Inc. Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
US6828099B2 (en) * 1998-02-02 2004-12-07 Odyssey Thera Inc. Protein fragment complementation assay (PCA) for the detection of protein-protein, protein-small molecule and protein nucleic acid interactions based on the E. coli TEM-1 β-Lactamase

Also Published As

Publication number Publication date
AU5850598A (en) 1998-08-25
US20070148682A1 (en) 2007-06-28
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CA2196496A1 (en) 1998-07-31
US20110287950A1 (en) 2011-11-24
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EP0966685B1 (de) 2005-08-10
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DE69831136D1 (de) 2005-09-15
US7160691B2 (en) 2007-01-09
WO1998034120A1 (en) 1998-08-06
US20130022999A1 (en) 2013-01-24
US6428951B1 (en) 2002-08-06
US8192944B2 (en) 2012-06-05
JP4262778B2 (ja) 2009-05-13
EP0966685B9 (de) 2006-03-15

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