DE60112282T2

DE60112282T2 - Auf rezeptorgrundlage arbeitende screening-verfahren für protein wechselwirkungen

Info

Publication number: DE60112282T2
Application number: DE60112282T
Authority: DE
Inventors: Sven Eyckerman; Xaveer Van Ostade; Joel Vandekerckhove; Annick Verhee; Jan Tavernier
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: WO2001090188A2; EP1283878A2; US8003757B2; EP1612221A3; EP1612221A2; WO2001090188A9; JP2003533998A; AU8178401A; US20100173408A1; US7855270B2; CA2407872A1; JP4756813B2; DE60112282D1; EP1283878B1; US20030100021A1; AU2001281784B2; CA2407872C; ATE300611T1; WO2001090188A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Rezeptor, umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindedomäne und eine zytoplasmatische Domäne, die ein heterologes Köderpolypeptid umfasst, wobei der Rezeptor aktiviert wird durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und eines Beutepolypeptids an das heterologe Köderpolypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Verbindung-Verbindung-Bindung mittels des rekombinanten Rezeptors.
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind ein essentieller Schlüssel in allen biologischen Prozessen, von der Replikation und Expression von Genen bis zur Morphogenese von Organismen. Protein-Protein-Wechselwirkungen regeln unter anderem Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und die anschließenden Signalleitung; sie sind wichtig beim Zusammensetzen von Enzymuntereinheiten, bei der Bildung von biologischen supramolekularen Strukturen wie Ribosomen, Filamente und Viruspartikel und in Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen.
Forscher haben mehrere Ansätze entwickelt in Versuchen zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Co-Reinigung von Proteinen und Co-Immunopräzipitation waren unter den ersten verwendeten Techniken. Diese Verfahren sind jedoch langwierig und erlauben keine Hochdurchsatzdurchmusterung. Außerdem brauchen sie Lyse, die die normale zelluläre Integrität zerstört. Ein Hauptdurchbruch wurde erreicht durch die Einführung genetischer Ansätze, von denen das Hefe-2-Hybrid-System (Fields und Song, 1989) der wichtigste ist. Obwohl diese Technik weit verbreitet ist, hat sie einige Nachteile.
Die Fusionsproteine müssen in den Zellkern translozieren, was nicht immer geschieht. Proteine mit intrinsischen Transkriptionsaktivierungs-Eigenschaften können Falsch-Positive verursachen. Außerdem sind Wechselwirkungen, die von sekundären Modifikationen des Proteins wie Phosphorylierung abhängig sind, nicht einfach nachzuweisen.
Mehrere alternative Systeme sind entwickelt worden, um eines oder mehrere dieser Probleme zu lösen.
Ansätze basierend auf Phagen-Display umgehen die nukleäre Translokation. WO 9002809 beschreibt wie ein Bindeprotein auf der Oberfläche einer genetischen Packung dargestellt werden kann, z.B. ein filamentöser Phage, wobei das für das Bindeprotein kodierende Gen im Inneren des Phagen verpackt ist. Phagen, die ein Bindeprotein tragen, dass das Zielmolekül erkennt, werden isoliert und amplifiziert. Mehrere Verbesserungen des Phagen-Display-Ansatzes sind vorgeschlagen worden, wie beschrieben zum Beispiel in WO 9220791, WO 9710330 und WO 9732017.
Alle diese Verfahren leiden jedoch an den Schwierigkeiten, die der Phagen-Display-Methodik innewohnen: die Proteine müssen auf der Phagenoberfläche exponiert werden und werden so einer Umgebung exponiert, die physiologisch nicht relevant für in vivo Wechselwirkungen ist. Außerdem wird beim Durchmustern einer Phagenbibliothek eine Kompetition zwischen den Phagen auftreten, der in einer Selektion für Bindemoleküle mit hoher Affinität resultiert. Letztlich sind keine modifikationsabhängigen Phagen-Display-Systeme beschrieben worden.
US 5637463 beschreibt eine Verbesserung des Hefe-2-Hybrid-Systems, womit nach modifikationsabhängigen Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgemustert werden kann. Dieses Verfahren beruht jedoch auf der Co-Expression des modifizierenden Enzyms, das seine Aktivität im Zytoplasma ausüben wird und das andere Enzyme als dem an der Protein-Protein-Wechselwirkung beteiligten Enzym modifizieren kann, was auf seine Weise die Lebensfähigkeit des Wirtsorganismus beeinflussen kann.
Eine interessante Entwicklung ist beschrieben in US 5776689 , durch das so genannte Proteinrekrutierungssystem. Protein-Protein-Wechselwirkungen werden durch Rekrutierung eines Guaninnukleotidaustauschfaktors (Sos) an die Plasmamembran nachgewiesen, wo Sos ein Ras-Reportermolekül aktiviert. Das führt zum Überleben der Zelle, die sonst unter den verwendeten Kulturbedingungen nicht überleben würde. Obwohl dieses Verfahren sicherlich den Vorteil hat, dass Protein-Protein-Wechselwirkungen unter physiologischen Bedingungen im Submembranraum stattfinden, hat es mehrere Nachteile. Modifikationsabhängige Wechselwirkungen können nicht nachgewiesen werden. Außerdem verwendet das Verfahren den pleiotropen Ras-Signalweg, was technische Komplikationen verursachen kann.
Es besteht immer noch Bedarf an einem Selektionssystem für Protein-Protein-Wechselwirkungen, das diese Wechselwirkungen unter physiologischen Bedingungen untersuchen kann, mit einem geringen und kontrollierbaren Hintergrund, und mit dem modifikationsabhängige Wechselwirkungen isoliert werden können.
Die vorliegende Erfindung stillt dieses Bedürfnis und bietet noch weitere Vorteile.
Eine schematische Repräsentation der Erfindung ist in 1 gegeben.
Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Transmembranrezeptor zur Verfügung zu stellen, umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindedomäne und eine zytoplasmatische Domäne abgeleitet von einem Rezeptor, wobei die zytoplasmatische Domäne ein erstes interagierendes Polypeptid umfasst, das heterolog zu der zyto plasmatischen Domäne ist, und wobei der rekombinante Rezeptor durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch Bindung eines zweiten wechselwirkenden Polypeptids an das erste wechselwirkende Polypeptid aktiviert wird. In dieser Anmeldung wird das erste wechselwirkende Polypeptid „Köder" oder „Köderpolypeptid" genannt, und das zweite wechselwirkende Polypeptid wird „Beute" oder „Beutepolypeptid" genannt. Der rekombinante Rezeptor kann ein chimärer Rezeptor sein, in dem die Ligandenbindedomäne und die zytoplasmatische Domäne von zwei unterschiedlichen Rezeptoren abgeleitet sind. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein multimerisierender Rezeptor; das kann sowohl ein homomultimerisierender Rezeptor als auch ein heteromultimerisierender Rezeptor sein. Die zytoplasmatische Domäne des rekombinanten Rezeptors umfasst ein heterologes Köderpolypeptid, das an das carboxyterminale Ende fusioniert werden kann, einen Teil des carboxyterminalen Endes ersetzen kann oder als eine Insertion oder ein Austausch gegen ein endogenes internes Fragment in der zytoplasmatischen Domäne selbst liegen kann. Im Falle eines heteromultimerisierenden Rezeptors müssen nicht alle Ketten den Köder umfassen, sondern es ist ausreichend, wenn eine der zusammensetzenden Ketten den Köder in ihrer zytoplasmatischen Domäne umfasst. Mindestens eine der Aktivierungsstellen in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors ist inaktiviert worden, so dass der Rezeptor nicht aktiviert wird und es keinen aktiven Signalweg gibt, wenn nur ein Ligand an die Ligandenbindedomäne des rekombinanten Rezeptors bindet. Eine derartige Inaktivierung kann auf verschiedenen Wegen erzielt werden, z.B. durch Austausch der Aminosäure, die aktiviert werden kann, gegen eine andere Aminosäure, durch Veränderung des Aminosäurekontexts der Aktivierungsstelle, oder durch Entfernung der Aktivierungsstelle. Insertion des heterologen Köderpolypeptids und Inaktivierung der Aktivierungsstelle kann zu einer oder mehreren Deletionen in der zytoplasmatischen ursprünglichen Domäne führen. Der einzige limitierende Faktor für die Veränderungen in der zytoplasmatischen Domäne ist der, dass die zytoplasmatische Domäne direkt oder indirekt die ihr innewohnende modifizierende Enzymaktivität beibehalten sollte, entweder durch Erhalt einer, modifizierende Enzymaktivität'-Bindestelle, z.B. eine Jak-Bindestelle, oder durch Einbau einer aktiven modifizierenden Enzymaktivität in die zytoplasmatische Domäne selbst. Aktivierung des Rezeptors und des Signalwegs wird erreicht durch Bindung des Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch Bindung eines Köderpolypetids an das in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors umfasste heterologe Köderpolypeptid.
Das Gen, das für den rekombinanten Rezeptor, umfassend das Köderpolypeptid, kodiert, kann stromabwärts entweder eines konstitutiven oder eines induzierbaren Promotors platziert werden. Letztere Konstruktion könnte einige Vorteile haben in Fällen, wo es eine Kompetition um die Bindestelle zwischen Beutepolypeptid und endogenen Polypeptiden gibt. Induktion des rekombinanten Rezeptors umfassend das Köderpolypetid in Anwesenheit der Beutepolypeptide kann die Bindung erleichtern und Sättigung der Bindestellen mit endogenen Polypeptiden vermeiden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein rekombinanter Rezeptor nach dieser Erfindung, wo die Aktivierungsstelle eine Phosphorylierungsstelle ist und die modifizierende Enzymaktivität eine Kinase ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist ein homomultimerisierender rekombinanter Leptinrezeptor, mit einem heterologen Köderpolypeptid, das in oder vorzugsweise an das carboxyterminale Ende der zytoplasmatischen Domäne fusioniert ist. Das heterologe Köderpolypeptid kann einen Teil der zytoplasmatischen Domäne ersetzen. Vorzugsweise werden die die drei konservierten Tyrosinphosphorylierungsstellen in der zytoplasmatischen Domäne inaktiviert, bevorzugter durch einen Austausch von Tyrosin gegen Phenylalanin. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein homomultimerisierender rekombinanter Rezeptor, in dem eine inaktivierte zytoplasmatische Domäne des Leptinrezeptors, umfassend eine heterologes Köderpolypeptid wie oben beschrieben, fusioniert ist an die Ligandenbindedomäne des Erythropoietin- (EPO) Rezeptors. Noch eine weitere Ausführungsform ist ein heteromultimerisierender rekombinanter Rezeptor, in dem die inaktivierte zytoplasmatische Domäne des Leptinrezeptors, umfassend ein heterologes Köderpolypeptid, fusioniert ist an die Ligandenbindedomäne der Interleukin-5-Rezeptor α-Kette als eine Untereinheit, und an die Interleukin-5-Rezeptor β-Kette als weitere Untereinheit. Noch eine weitere Ausführungsform ist ein heteromultimerisierender rekombinanter Rezeptor, in dem die inaktivierte zytoplasmatische Domäne des Leptinrezeptors, umfassend ein heterologes Köderpolypeptid, fusioniert ist an die Ligandenbindedomäne der GM-CSFα-Kette als eine Untereinheit, und an die Interleukin-5-Rezeptor β-Kette als weitere Untereinheit.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung einen rekombinanten Rezeptor zur Verfügung zu stellen, umfassend eine Ligandenbindedomäne und eine zytoplasmatische Domäne, die ein heterologes Köderpolypeptid umfasst, das durch Modifikationen wie, aber nicht begrenzt auf, Phosphorylierungen, Acetylierung, Acylierung, Methylierung, Ubiquitinilierung, Glykosylierung oder proteolytische Prozessierung modifiziert werden kann, wobei der rekombinante Rezeptor aktiviert wird durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch Bindung eines Beutepolypeptids an das heterologe Köderpolypeptid und wobei die Bindung des Beutepolypeptids an das heterologe Köderpolypetid abhängig ist vom Modifizierungszustand des heterologen Köderpolypeptids, das heißt entweder gibt ist nur Bindung mit Modifikation, oder es gibt Bindung nur ohne Modifikation. Der Modifizierungszustand kann sein, ist aber nicht begrenzt auf, Anwesenheit oder Abwesenheit von Phosphorylierung, Acetylierung, Acylierung, Methylierung, Ubiquitinylierung oder Glykosylierung, oder Auftreten von proteolytischer Spaltung oder nicht. Der Köder wird durch die Köder-modifizierende Enzymaktivität modifiziert, die sein kann, aber die nicht notwendigerweise mit der modifizierenden Enzymaktivität identisch ist, die die Aktivierungsstelle modifiziert. Der rekombinante Rezeptor kann ein chimärer Rezeptor sein, in dem die Ligandenbindedomäne und die zytoplasmatische Domäne abgeleitet sind von zwei verschiedenen Rezeptoren. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein multimerisierender Rezeptor. Wie oben beschrieben, umfasst die zytoplasmatische Domäne des rekombinanten Rezeptors ein heterologes Köderpolypeptid, das an das carboxyterminale Ende fusioniert werden kann, oder einen Teil dieses carboxyterminalen Endes ersetzen kann oder sich als Insertion oder Austausch eines endogenen internen Fragments in der zytoplasmatischen Domäne selbst befinden kann. Im Falle eines heteromultimerisierenden Rezeptors müssen nicht alle Ketten den Köder umfassen, sondern es ist ausreichend, wenn eine der zusammensetzenden Ketten den Köder in ihrer zytoplasmatischen Domäne umfasst. Mindestens eine der Aktivierungsstellen in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors ist inaktiviert worden, so dass der Rezeptor nicht aktiviert ist und es keinen aktiven Signalweg gibt, wenn nur der Ligand an die Ligandenbindedomäne des rekombinanten Rezeptors bindet. Derartige Inaktivierung kann erzielt werden auf mehreren Wegen, z.B. durch Austausch der Aminosäure, die aktiviert werden kann, gegen eine andere Aminosäure, oder durch Abänderung des Aminosäurekontexts der Aktivierungsstelle oder durch Entfernen der Aktivierungsstelle. Insertion des heterologen Köderpolypeptids und Inaktivierung der Aktivierungsstellen könnte in einer oder mehreren Deletionen der zytoplasmatischen Ausgangsdomäne führen. Der einzige limitierende Faktor für die Veränderungen in der zytoplasmatischen Domäne ist der, dass die zytoplasmatische Domäne direkt oder indirekt die ihr innewohnende modifizierende Enzymaktivität beibehalten sollte, entweder durch Erhalt einer modifizierendes Enzym-Bindestelle, oder durch Einbau einer aktiven modifizierenden Enzymaktivität in die zytoplasmatische Domäne selbst. Vorzugsweise ist die Aktivierungsstelle eine Phosphorylierungsstelle, und die modifizierende Enzymaktivität ist eine Kinaseaktivität.
Die Modifizierung des Köders kann entweder in cis oder in trans sein, das heißt durch eine enzymatische Aktivität, die sich auf der gleichen zytoplasmatischen Domäne befindet, oder durch eine enzymatische Aktivität, die von woanders kommt. Vorzugsweise wird die Modifikation des Köders induziert durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein homodimerisierender Rezeptor, in dem der Köder phosphoryliert wird durch die der zytoplasmatischen Domäne innewohnende Kinaseaktivität, vorzugsweise durch ein Jak-Kinase, die an die zytoplasmatische Domäne bindet. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein heteromultimerisierender Rezeptor, wo die zytoplasmatische Domäne einer Kette einen zu modifizierenden Köder umfasst, und die zytoplasmatische Domäne einer anderen Kette die Köder-modifizierende Enzymaktivität umfasst.
Aktivierung des Rezeptors und des Signalwegs wird erreicht durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch Bindung eines Beutepolypeptids an das heterologe Köderpolypeptid, das sich in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors befindet.
Bindung des Beutepolypeptids ist abhängig vom Modifizierungszustand des heterologen Köderpolypeptids, das heißt, dass die Bindung nur stattfindet, wenn der Köder modifiziert ist, oder nur, wenn der Köder nicht modifiziert ist.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Beutepolypeptid zur Verfügung zu stellen; wobei das Beutepolypeptid ein Fusionsprotein ist, umfassend ein Polypeptid, das direkt oder indirekt wechselwirken kann mit einem Köderpolypetid und ein weiteres Polypetid, dass mindestens eine Aktivierungsstelle eines Rezeptors umfasst. Die Aktivierungsstelle ist vorzugsweise eine Phosphorylierungsstelle, bevorzugter eine Tyrosinphosphorylierungsstelle. Noch bevorzugter ist die Phosphorylierungsstelle Teil einer Signalgeber-und-Aktivator-von-Transkription-(Signal Transducer and Activator of Transcription; STAT)-Bindestelle, am Bevorzugtesten Teil einer STAT1- und/oder STAT3-Bindestelle. Direkte Wechselwirkung bedeutet, dass es einen direkten Protein-Protein-Kontakt zwischen dem heterologen Köderpolypeptid und dem Beutepolypeptid gibt; indirekte Wechselwirkung bedeutet, dass das heterologe Köderpolypeptid mit einem oder mehreren Polypeptiden wechselwirkt, die einen Komplex bilden, der mit dem Beutepolypeptid wechselwirkt oder umgekehrt. Im letzteren Fall kann das Beutepolypeptid entweder mit einer oder mit mehreren Polypeptiden des Komplexes wechselwirken. Die Bindung des Beutepolypeptids an das Köderpolypeptid kann abhängig sein vom Modifizierungszustand des Köderpolypeptids und/oder von Proteinen innerhalb des Bindekomplexes.
Falls Wechselwirkungen von nukleären Proteinen untersucht werden, kann das Beutepolypeptid eine nukleäre Export Sequenz (NES) umfassen, um sicherzustellen, dass es im Zytosol verfügbar ist. Es ist gezeigt worden, dass das NES-Signal (Aminosäuren 37–46) des hitzestabilen Inhibitors der cAMP-abhängigen Proteinkinase ein starkes nukleäres Lokalisationssignal aufhebt (Wiley et al., 1999). Diese NES wird das Beutepolypeptid im Zytoplasma halten, selbst wenn es ein starkes nukleäres Lokalisationssignal hat, was die Wechselwirkung mit dem Köder erleichtert.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Beutepolypeptid nach dieser Erfindung, wonach das Beutepolypeptid mit dem heterologen Polypeptid eines rekombinanten Rezeptors nach dieser Erfindung wechselwirkt. Nach Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne des rekombinanten Rezeptors und nach direkter oder indirekter Wechselwirkung des heterologen Köderpolypeptids mit dem Beutepolypeptid, kann die Aktivierungsstelle des Beutepolypeptids modifiziert werden durch die modifizierende Enzymaktivität, die der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors innewohnt. Die Modifikation der Aktivierungsstelle wird den Signalweg aktivieren. Vorzugsweise ist die Aktivierungsstelle eine Phosphorylierungsstelle und die modifizierende Enzymaktivität eine Kinaseaktivität. Bevorzugter umfasst die Aktivierung die Bindung eines STAT-Polypeptids an die phosphorylierte Phosphorylierungsstelle, gefolgt von einer Phosphorylierung des STAT-Polypetids und anschließende Dimerisierung zweier phosphorylierter STAT-Moleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Vektor, der für einen rekombinanten Rezeptor nach der Erfindung kodiert, und/oder ein Vektor, der für ein Beutepolypeptid nach dieser Erfindung kodiert. Der rekombinante Rezeptor und das Beutepolypeptid können sich in einem oder in separaten Vektoren befinden. Der Vektor kann jeder dem Fachmann bekannte Vektor sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, episomale Vektoren, integrierende Vektoren und virale Vektoren. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Ködervektor, womit der Köder in das Chromosom mittels Rekombinase-unterstützter Integration wie Cre-lox oder flp-frt integriert werden könnte, und oder ein retroviraler Beutevektor, der eine retrovirale Integration in das Genom gestattet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine eukaryotische Zelle umfassend einen rekombinanten Rezeptor nach der Erfindung. Vorzugsweise wird die eukaryotische Zelle erlangt durch Transformation oder Transfektion mit einem oder mehreren Vektoren nach der Erfindung. Die eukaryotische Zelle umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugetierzellen. Vorzugsweise ist die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle. Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine eukaryotische Zelllinie, die den retroviralen Rezeptor der Maus exprimiert, was sicheres retrovirales Arbeiten durch Verwendung retroviraler cDNS-Bibliotheken gestattet.
Noch ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ein Kit, umfassend einen oder mehrere Klonierungsvektoren, die die Konstruktion von einem oder mehreren Vektoren nach dieser Erfindung erlaubt. Es ist offensichtlich für den Fachmann, dass ein Klonierungsvektor, der für einen rekombinanten Vektor kodiert, in dem der für die zytoplasmatische Domäne kodierende Teil eine oder mehrere Restriktionsstellen umfasst, die eine Fusion einer für ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäure im Leseraster erlauben, einfach benutzt werden kann, um einen Vektor zu konstruieren, der für einen rekombinanten Rezeptor nach dieser Erfindung kodiert. Auf ähnliche Weise kann ein Klonierungsvektor, der für ein erstes Polypeptid kodiert, das mindestens eine Aktivierungsstelle umfasst, die wiederum mindestens eine oder mehrere Restriktionsstellen umfasst, die eine Fusion im Leseraster einer für ein zweites Polypeptid kodierenden Nukleinsäure mit dem ersten Polypeptid gestattet, einfach verwendet werden, um einen Vektor zu konstruieren, der für ein Beutepolypeptid nach dieser Erfindung kodiert. Alternativ können für die Konstruktion sowohl des für den rekombinanten Rezeptor kodierenden Vektors, als auch für den für das Beutepolypeptid kodierenden Vektor andere dem Fachmann bekannte Klonierungsstrategien benutzt werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum nachweisen von Verbindung-Verbindung-Bindungen durch Benutzung eines rekombinanten Rezeptors und/oder eines Beutepolypeptids nach dieser Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine eukaryotische Zelle, die einen rekombinanten Rezeptor nach dieser Erfindung trägt, transformiert oder transfiziert mit einer Vektorbibliothek, die für Beutepolypeptide nach dieser Erfindung kodiert. Köder-Beute-Bindung wird zu einer Aktivierung des Signalwegs führen und kann nachgewiesen werden durch Verwendung eines Reportersystems. Obwohl es kein essentielles Merkmal ist, kann der Gebrauch eines chimären Rezeptors einen zusätzlichen Vorteil für dieses Verfahren darstellen. Ein erster Vorteil der Verwendung eines chimären Rezeptors in diesem Verfahren ist, dass er die Eliminierung eines köderunspezifischen Hintergrunds gestattet. Tatsächlich kann durch Verwendung von zwei unterschiedlichen Rezeptoren, einem nicht-Köder-umfassenden und einem Köder-umfassenden Rezeptor, eine Unterscheidung zwischen köderspezifischer und köderunspezifischer Bindung getroffen werden. Das kann umgesetzt werden durch Verwendung einer Wirtszelle, die mindestens zwei Rezeptoren trägt, einem ersten Rezeptor, umfassend eine erste Ligandenbindedomäne und eine zytoplasmatische Domäne, die weder eine Aktivierungsstelle noch ein heterologes Köderpolypeptid umfasst, und ein zweiter Rezeptor, umfassend die selbe inaktivierte zytoplasmatische Domäne, jedoch nun mit einem heterologen Köderpolypeptid, und eine zweite Ligandenbindedomäne. Nach exogenem Zusatz des ersten Liganden zum Medium und Bindung des ersten Liganden an den Rezeptor, kann ein positives Signal nur nachgewiesen werden, wenn es keine köderspezifische Wechselwirkung eines Beutepolypeptids, das an ein Polypeptid fusioniert ist, das wiederum eine Aktivierungsstelle umfasst, mit der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors gibt; diese Zellen können selektioniert und/oder eliminiert werden. Nach Selektion und/oder Eliminierung der köderunspezifisch-wechselwirkenden Beuten, kann der zweite Ligand zum Medium zugegeben werden. Nach Bindung des zweiten Liganden an seine Ligandenbindedomäne, wird ein positives Signal nur nachgewiesen werden nach spezifischer Köder-Beute-Wechselwirkung, weil die Beuten, die an die zytoplasmatische Domäne binden, entfernt worden sind. Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines chimären Rezeptors ist, dass auf ähnliche Weise eine substraktive Selektion für Beuten, die nahverwandte aber doch unterschiedliche Köder binden, gemacht werden kann.
Eine spezifische Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Verbindung-Verbindung-Bindung ist ein Verfahren, wonach die Bindung eine Protein-Protein-Wechselwirkung ist. Eine weitere spezifische Ausführungsform ist ein Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wobei die Wechselwirkung vom Modifzierungszustand abhängig ist. Noch eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Nachweis von Verbindung-Verbindung-Bindung, wobei die Bindung über drei oder mehr Partner vermittelt wird. In diesem Fall können einer oder mehrere Partner nicht aus oder nicht vollständig von proteinöser Natur sein. Es ist offensichtlich für den Fachmann, dass ein rekombinanter Rezeptor nach dieser Erfindung als nicht-beschränkendes Beispiel ein kleines Molekül binden kann. Auf der anderen Seite kann das Beutepolypeptid nach der Erfindung ebenfalls an das kleine Molekül binden, so dass Köder und Beute miteinander verbunden sind über das kleine Molekül. Das kleine Molekül kann in der Wirtszelle als eine Verbindung vorhanden sein, die von der Zelle selbst produziert wird, oder als eine Verbindung, die aus dem Medium aufgenommen wird.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren zum Nachweis von Verbindung-Verbindung-Bindung die Herstellung einer eukaryotischen Zelle, umfassend einen rekombinanten Rezeptor nach dieser Erfindung, gefolgt von einer Transformation oder Transfektion der Zelle mit einer Bibliothek an Beutepolypeptidvektoren nach dieser Erfindung. Die Verbindung-Verbindung-Bindung wird nachgewiesen durch Aktivierung des Rezeptors, was zu einem aktiven Signalweg führt und in der Induktion eines Reportersystems resultiert. Ein Reportersystem kann jedes System sein, dass den Nachweis und/oder die Selektion von Zellen gestattet, die einen rekombinanten Rezeptor nach der Erfindung tragen. Es ist klar für den Fachmann, dass mehrere Reportersysteme verwendet werden können. Als nicht-beschränkendes Beispiel kann ein Luziferase-Gen, ein Antibiotikaresistenz-Gen oder ein Zelloberflächenmarker-Gen hinter einem Promotor platziert werden, der durch den Signalweg induziert wird. Alternativ können Reportersysteme verwendet werden, die auf einer Veränderung der Charakteristika von Verbindungen des Signalwegs basieren, wenn der Weg aktiv ist, z.B. die Phosphorylierung und/oder Dimerisierung solcher Verbindungen.
Die folgenden Definitionen werden dargelegt, um die Bedeutung und den Umfang verschiedener verwendeter Ausdrücke zu definieren, die zur Beschreibung der Erfindung verwendet werden.
Rezeptor wie hier verwendet bezeichnet nicht zwangsläufig ein einzelnes Polypeptid, sondern kann einen Rezeptorkomplex bezeichnen, der aus zwei oder mehr Polypeptiden besteht, und eine Ligandenbindedomäne und eine zytoplasmatische Domäne umfasst.
Rekombinanter Rezeptor bedeutet, dass mindestens eines der Polypeptide rekombinant ist. Vorzugsweise ist das die zytoplasmatische Domäne umfassende Polypeptid rekombinant.
Die Aktivierungsstelle eines Rezeptors ist die Stelle, die im Wildtyp-Rezeptor modifiziert wird nach Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne, was zu einer Reorganisation des Rezeptors und nachfolgender Aktivierung der modifizierenden Enzymaktivität führt, und an die eine Verbindung des Signalwegs nach Modifizierung binden kann, oder jede Stelle, die eine ähnliche Funktion erfüllen kann.
Im letzteren Fall ist die Aktivierungsstelle nicht zwangsläufig im selben Polypeptid angesiedelt wie im Wildtyp-Rezeptor, sondern kann sich auf einem anderen Polypeptid des Rezeptorkomplexes befinden.
Modifizierende Enzymaktivität, wie hier verwendet, bezeichnet die enzymatische Aktivität, die assozuert ist mit oder eingebaut ist in die zytoplasmatische Domäne des Rezeptors, die normalerweise induziert wird durch Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und anschließende Reorganisation des Rezeptors (z.B. durch Konformationsänderung), und die die Aktivierungsstelle modifizieren kann. Vorzugsweise ist die Aktivierungsstelle eine Phosphorylierungsstelle und die modifizierende Enzymaktivität ist eine Kinaseaktivität. Die Köder-modifizierende Enzymaktivität bedeutet eine Aktivität, die den Köder modifiziert. Sie kann, muss aber nicht zwangsläufig identisch mit der modifizierenden Enzymaktivität sein.
Aktivierung eines Rezeptors, wie hier verwendet, bedeutet, dass der Rezeptor durch Bindung einer Verbindung des Signalwegs an die modifizierte Aktivierungsstelle einen Signalweg induziert, woraufhin die Aktivierung normalerweise zur Induktion oder Repression von einem oder mehreren Genen führt. Das Gen ist vorzugsweise ein Reportergen, das die Überwachung der Aktivierung des Rezeptors gestattet. Ein aktivierter Rezeptor ist ein Rezeptor, wo die Bindung einer Verbindung an die Aktivierungsstelle durch Modifizierung der Stelle ermöglicht worden ist. Ein Rezeptor, in dem die modifizierende Enzymaktivität induziert worden ist ohne Modifizierung der Aktivierungsstelle, wird nicht als aktiviert angesehen.
Multimerisierender Rezeptor, wie hier verwendet, bedeutet, dass der aktivierte Rezeptor mehrere Polypeptide umfasst. Es bedeutet nicht notwendigerweise dass die Multimerisierung durch die Ligandenbindung induziert wird: der Rezeptor kann als vorgeformter Komplex existieren, dessen Konformation sich nach Ligandenbindung verändert.
Polypeptid wie hier verwendet bedeutet jede proteinöse Struktur, unabhängig von der Länge, und schließt Moleküle wie Peptide, phosphorylierte Proteine und glykosylierte Proteine mit ein. Polypeptide wie hierin verwendet ist nicht notwendigerweise eine unabhängige Verbindung, sondern kann ebenfalls verwendet werden, um einen Teil einer größeren Verbindung zu bezeichnen, z.B. eine Domäne eines Proteins.
Heterologes Köderpolypeptid, wie umfasst in der zytoplasmatischen Domäne eines Rezeptors, bedeutet, dass es innerhalb der zytoplasmatischen Domäne, oder an die zytoplasmatische Domäne fusioniert ein Polypeptid gibt, das nicht in der zytoplasmatischen Domäne eines nicht-rekombinanten Rezeptors vorliegt. Das heterologe Köderpolypeptid kann einen Teil der zytoplasmatischen Domäne ersetzen. Köder bedeutet hierin, dass dieses Polypeptid mit anderen Polypeptiden wechselwirken kann, die nicht zum normalen Rezeptorkomplex gehören.
Köderpolypeptid, wie hier verwendet, bedeutet ein Fusionsprotein umfassend ein Polypeptid, das an das heterologe Köderpolypeptid binden kann, und ein Polypeptid, das mindestens eine Aktivierungsstelle umfasst.
Ligand bedeutet jede Verbindung, die an die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors binden kann und die in der Lage ist, den Signalweg durch Bindung an die extrazelluläre Domäne zu initueren. Initueren, wie hier verwendet, bedeutet das Auslösen von Ereignissen, die normalerweise direkt auf die Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors folgen, z.B. Multimerisierung für einen multimerisierenden Rezeptor, aber es impliziert nicht eine Aktivierung des Rezeptors und/oder Vollendung des Signalwegs.
Verbindung bedeutet eine chemische oder biologische Verbindung einschließlich einfacher oder komplexer organischer oder anorganischer Moleküle, Peptide, Peptido-Mimetika, Proteine, Antikörper, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren oder Derivate davon.
Binden (u. Bindung) bedeutet jede Wechselwirkung, sei sie nun direkt oder indirekt. Eine direkte Wechselwirkung impliziert einen Kontakt zwischen den Bindungspartnern. Eine indirekte Wechselwirkung meint jede Wechselwirkung, bei der die Wechselwirkungspartner in einem Komplex von mehr als zwei Verbindungen wechselwirken. Diese Wechselwirkung kann mittels einer oder mehreren Überbrückungsverbindungen völlig indirekt sein, oder teilweise indirekt, wo es immer noch einen direkten Kontakt gibt, der aber stabilisiert wird über die Wechselwirkung von einer oder mehreren Verbindungen.
Funktionelles Fragment der inaktivierten zytoplasmatischen Domäne des Leptinrezeptors bedeutet ein Fragment der zytoplasmatischen Domäne des Leptinrezeptors, das immer noch die Bindung von Jak-Kinasen gestattet.
Inaktivierung einer Aktivierungsstelle bedeutet jede Veränderung, Mutation oder Deletion, die eine Modifizierung an der Position des potenziell modifizierten Rests im Polypeptid inhibiert. Insbesondere bedeutet die Inaktivierung einer Tyrosinphosphorylierungsstelle jede Veränderung, Mutation oder Deletion, die eine Phosphorylierung an der Position des potenziell phosphorylierten Tyrosinrests im Polypeptid inhibiert. Vorzugsweise ist es eine Mutation an dieser Stelle; bevorzugter ist es ein Wechsel von Tyrosin nach Phenylalanin.
Klonierungsvektor ist ein Vektor, der generell als ein Zwischenprodukt für die Konstruktion eines anderen Vektors erachtet wird. Es ist beabsichtigt eine oder mehrere Nukleinsäurefragmente einzusetzen, um einen oder mehrere neue Vektoren zu erhalten, die verwendet werden, um die Wirtszelle von Interesse zu transformieren oder zu transfizieren, oder selbst als Klonierungsvektoren verwendet werden.
1: Prinzip der Rezeptor-basierten Wechselwirkungsfalle. Ligandenbindung führt zur Aktivierung einer modifizierenden Enzymaktivität (MA). Aufgrund der Inaktivierung der normalen Rezeptoraktivierungsstelle (inaktivierte Aktivierungsstelle, iAS), führt die Aktivierung der modifizierenden Enzymaktivität nicht zu einer Aktivierung des Signalwegs, es sei denn das heterologe Köderpolypeptid in der zytoplasmatischen Domäne des rekombinanten Rezeptors (bezeichnet als „Köder") bindet an ein Beutepolypeptid (bezeichnet als „Beute"), das fusioniert ist an ein Polypeptid, das eine Aktivierungsstelle (AS) umfasst. Die modifizierende Enzymaktivität kann nun diese Aktivierungsstelle modifizieren; Modifizierung (x) der Aktivierungsstelle führt zur Aktivierung des Signalwegs und zur Induktion eines Reportersystems (bezeichnet als „nachweisbare Aktivität").
2: Funktionalität von EpoR-LepR-Chimären in der Hek293T PAP21 Zelllinie, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (Gezählte Ereignisse pro Sekunde, cps). Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pSV-SPORT + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT EpoR/LepR + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepRY985/1077F + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
3: Funktionalität der p53-SV40 GroßesT-Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps). Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pSV-SPORT + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT + pMET7-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSEL1-p53 + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSEL1-p53 + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSEL1-p53 + pMET7-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
4: Funktionalität der EpoR-CIS phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps).
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pSV-SPORT + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT + pEF-FLAG-I/mCIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSEL1-EpoR + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSEL1-EpoR + pEF-FLAG-I/mCIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSEL1-EpoRY-F + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
g. pSEL1-EpoR + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
5: Funktionalität der IRS1-GRB2-Vav-indirekten-Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps).
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pMET7mcs + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7mcs + pMG1-GRB2S + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7mcs + pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-GRB2S + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
6: Funktionalität der IRS1-GRB2-Vav indirekte Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps): GRB2-Dosis-abhängige Inhibition des Signals.
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 200 ng pMET7 GRB2SH3 + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 1000 ng pMET7 GRB2SH3 + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
7: Funktionalität der IRS1-GRB2-Vav indirekten Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps): VavS-Dosis-abhängige Inhibition des Signals.
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 200 ng pMET7 VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 1000 ng pMET7 VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
8: Aufbau eines optimierten MAPPIT-basierten Zwei-Hybrid-Durchmusterungsverfahrens
Die Vorgehensweise umfasst drei aufeinander folgende Schritte, angedeutet mit eingekreisten Nummern. Als erstes werden Zellen generiert, die den chimären Rezeptor mit dem C-terminalen „Köder" (CR-Köder) nach Rekombinase-unterstützter genomischer Integration exprimieren, gefolgt von Hygromycinselektion. Als nächstes werden gp130-„Beute"-Chimären nach retroviralem Gentransfer exprimiert. Schließlich induziert die Ligandenbindung, wenn spezifische (cognate) „Köder"-„Beute"-Wechselwirkung stattfindet, eine Signalkaskade, die zur Induktion des Puromycinresistenzmarkers und gleichzeitig zur Bildung von Zellkolonien in Selektiv-Medium führt. Die direkte RT-PCR-Amplifikation von für „Beute" kodierenden Transkripten lysierter Zellkolonien gestattet die rasche Identifizierung der „Beute".
9: die MAPPIT-Vorgehensweise für die Zwei-Hybrid-Durchmusterung

(A) Die HEK293-16 Zelllinie zeigt ligandeninduzierte Puromycinresistenz. HEK293-16-Zellen wurden in eine 24-Lochplatte ausgesäht, und wurden nicht behandelt (oberes Loch) oder wurden Puromycinselektion (1 μg/ml) unterworfen mit (mittleres Loch) oder ohne (unteres Loch) vorangegangene Aktivierung von gp130 durch Verwendung von LIF für 48 Stunden. Nach einer Woche wurden überlebende Zellen mit Kristallviolett gefärbt.
(B) Selektion isogener HEK293-16-Zellen, die den EpoR-„Köder" exprimieren. HEK293-16-Zellen wurden kotransfiziert mit dem pcDNA5/FRT-EpoR-„Köder" und den Flp-Rekombinase-Expressionsvektoren und auf Hygromycinresistenz selektioniert über 10 Tage (100 μg/ml). Die Zellen wurden gefärbt durch Verwendung eines polyklonalen Antiserums, das die extrazelluläre Domäne von dem EpoR erkennt, und eines Alexa488-markierten sekundären Antikörpers. Durchgezogene und gestrichelte Linien zeigen parentale bzw. hygromycinselektionierte HEK293-16 Zellen.
(C) Selektion von Zellen aufgrund einer spezifischen „Beute"-„Köder"-Wechselwirkung. Hygromycinresistente Zellen aus (B) wurden in eine 24-Lochplatte gesät, mit CIS"Beute"-exprimierendem Retrovirus (1/30 Verdünnung einer retroviralen Stocklösung) für 48 Stunden infiziert, und wurden entweder nicht behandelt (oberes Loch) oder für weitere 48 Stunden mit Epo stimuliert (mittleres Loch), bevor sie mit Puromycin (1 μg/ml) behandelt wurden. Das untere Loch zeigt Epo-stimulierte Zellen, die selektioniert wurden wie oben, die aber irrelevantes lacZ-Protein exprimieren (1/3 Verdünnung des retroviralen Stocks). Überlebende Zellen wurden nach 7 Tagen mit Kristallviolett gefärbt.
(D) Puromycinresistente Zellen exprimieren die „Beute"-Chimäre. Parentale HEK293-16-Zellen oder Puromycin-resistente Zellen aus (C) wurden permeabilisiert, aufeinander folgend behandelt mit anti-FLAG-Antikörper und FITC-markiertem sekundärem Antikörper und der FACS-Analyse unterworfen. Durchgezogenen und gestrichelte Linien zeigen parentale bzw. Puromycin-selektionierte HEK293-16-Zellen. (EINSCHUB) RT-PCR-Nachweis von Transkripten, die für die „Beute"-Chimäre kodieren. Zellen aus (C) wurden lysiert und das für die Beute kodierende Transkript wurde mittels RT-PCR amplifiziert. Der Pfeil kennzeichnet das CIS-spezifische Amplikon, das mittels DNS-Sequenzierung verifiziert wurde. Eine Negativkontrolle mit parentalen Zellen wurde ebenfalls durchgeführt (mittlere Spur). M: Markerspur.
(E) Dosis-abhängige Rückgewinnung von gp130-CIS"Beute"-exprimierenden Zellklonen. EpoR-„Köder"-exprimierende Zellen wurden in 75 cm² Kulturflaschen ausgesät und infiziert mit CIS-„Beute"-exprimierendem Retrovirus, 1/10 seriell verdünnt in einer komplexen retroviralen HEK293-cDNS-Bibliothek. Nach der Selektion wurden Puromycin-resistente Kolonien mit Kristallviolett gefärbt. Teilabbildung 1 zeigt Zellen, die mit 1/10-Verdünnung von CIS-„Beute" infiziert wurden, aber ohne Epo Stimulation. Teilabbildungen 2–5 zeigen die 1/10 bis 1/10000 seriellen Verdünnungen, wohingegen Teilabbildung 6 das Ergebnis von Zellen zeigt, die mit der retroviralen cDNS-Bibliothek in der Abwesenheit von CIS-„Beute" infiziert wurden. In einem parallelen „Spiking"-Experiment enthielten 19 von 21 analysierten Klonen gp130-CIS-„Beute"-Transkripte.
(F) Funktionelle Analyse der EpoR-„Köder"-SOCS-2-„Beute"-Wechselwirkung. MAPPIT-Durchmusterung einer HEK293 cDNS-Bibliothek unter Verwendung des EpoR-„Köders" führte zur Isolierung eines Zellklons, der das SOCS-2-„Beute"-Konstrukt exprimiert. Dieser ausgewählte Klon wurde transient transfiziert mit dem pXP2d2-rPAP1-luci-Reporter alleine, oder in Kombination mit dem für die LR-F3-Variante kodierenden Vektor, und wurde mit Epo bzw. Leptin für 24 Stunden stimuliert, bzw. unstimuliert gelassen. Die obere Teilabbildung zeigt die korrespondierende Luziferase-Induktion mit einer Diagramm-Darstellung des aktivierten Rezeptors darüber. In der unteren Teilabbildung ist eine graphische Darstellung der SOCS-2-„Beute"-Chimäre und von intaktem SOCS-2 und CIS gezeigt.
(G) Die EpoR-„Köder"-SOCS-2-„Beute"-Wechselwirkung ist phosphorylierungsabhängig. (Obere Teilabbildung) HEK293-16-Zellen, die chimäre Rezeptoren mit (293-16 EpoR) oder ohne (293-16 LR-F3) den EpoR-„Köder" exprimieren, wurden mit Epo stimuliert oder unbehandelt belassen. Liganden-abhängige Phosphorylierung des EpoR-„Köders" wird beobachtet, im Gegensatz zum Mangel an Phosphorylierung der LR-F3-Chimäre. (Mittlere und untere Teilabbildungen) HEK293T-Zellen wurden mit Expressionskonstrukten für den EpoR-„Köder" und für die SOCS-2-„Beute" transient transfiziert. Die mittlere Teilabbildung bzw. die untere Teilabbildung zeigen Liganden-abhängige „Beute"- und STAT3-Phosphorylierung, die nur beobachtet wird nach Transfektion mit pSEL1-EpoR, nicht aber mit pSEL1-EpoRF. Expressionskontrollen für die SOCS-2-„Beute" und für STAT3 sind ebenfalls gezeigt.

10: Funktionalität von IL3R-, IL5R- und GM-CSFR-LepR-Chimären in der HEK293T-Zelllinie, wie sie über Luziferase-Lichtemission in einem Chemilumineszenzzähler (cps) gemessen wurde.
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pSV-SPORT-EpoR/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR + pSV-SPORT-β_c/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR + pSV-SPORT-β_c/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR + pSV-SPORT-β_c/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
g. pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
h. pSV-SPORT-β_c/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651

NC: unstimulierte Negativkontrolle. Stimulationen wurden wie beschrieben in den Beispielen ausgeführt.
11: Funktionalität der Smad3-Smad4 phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle, wie gemessen über Luziferase-Lichtemission, gemessen in einem Chemilumineszenzzähler (cps).
Die Zellen wurden transfiziert mit:

a. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
b. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
c. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
d. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
e. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
f. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
g. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
h. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
i. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
j. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.

Zelllinien, Transfektions- und Infektionsverfahren
Transfektionen wurden gemäß dem Kalziumphosphatverfahrens (Graham und van der Eb, 1973) durchgeführt.
Rekombinantes Leptin der Maus, rekombinanter humaner Leukämie-inhibierender-Faktor (LIF) und rekombinantes humanes Erythropoietin (Epo) wurden von R&D Systems erworben. Typische Stimulationsbedingungen waren 100 ng/ml Leptin, 1 ng/ml LIF und 50 ng/ml Epo.
Zur Produktion von ecotropen Retroviren, die die kodierende Sequenz von gp130-CIS oder LacZ beinhalten, wurden ϕNX-Eco-Zellen in einer Dichte von 6 × 10⁶ Zellen/Petri-Schale am Tag vor der Transfektion ausgesät. Die Zellen wurden transfiziert mit 50 μg des retroviralen Vektors pBG1-CIS gemäß dem Kalziumphosphatverfahrens. 25 μM Chloroquin wurden 5 Min. vor der Transfektion zugesetzt. Das Medium wurde 24 und 48 Stunden nach der Transfektion geerntet, über einen 0.22 μm GV-Filter (Millipore) gefiltert und bei –80°C gelagert. Das Verpacken der HEK cDNS-Bibliothek wurde durchgeführt wie oben beschrieben mit der Ausnahme, dass 1.6 × 10⁷ Zellen in einem 175 cm² Falcon mit 87 μg pBG1-HEK293-cDNS transfiziert wurden. Zur Titerbestimmung war 10% pMFG-EGFP (Geschenk von Dr. Mulligan, Cambridge, MA) in der DNS in einem Parallelexperiment beinhaltet. Der Virustiter war ungefähr 5 × 10⁶ infektiöse Einheiten/ml, wie bestimmt über FACS-Analyse von EGFP-exprimierenden Zellen.
Zur Infektion mit CIS-„Beute" wurden Zielzellen in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Loch in eine 24-Lochplatte, und in einer Dichte von 10⁶ in 75 cm² Kulturflaschen ausgesät. Am Tag danach wurden die Zellen für 24–48 Stunden mit Virus-haltigem Überstand inkubiert, in Medium wie angegeben verdünnt. Polybren (Sigma) wurde in einer Endkonzentration von 2.5 μg/ml zugesetzt. Nach Infektion wurden die Zellen mit Epo (50 ng/ml) für 24–48 Stunden stimuliert, gefolgt von 10-tägiger Puromycinselektion (1–2 μg/ml wie angegeben; Sigma).
Konstruktion von Köder-, Beute- und Reporter/Selektor-Konstrukten
Herstellung der EpoR/LepR-Chimäre
Alle Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden durchgeführt unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Stratagene, typischerweise wurden 2,5–5 U Pfu pro Reaktion verwendet). Die Transmembran- und intrazellulären Anteile (Aminosäuren 839–1162) des Mausleptinrezeptors (LepR) wurden amplifiziert mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers MBU-O-447, der eine PacI-Restriktionsenzymerkennungsstelle beinhaltet, und unter Verwendung des Rückwärtsprimers MBU-O-448, der sowohl eine Verbindungssequenz (Gly-Gly-Ser) als auch eine Multiklonierungsstelle (MCS) mit SalI-, SacI-, SpeI-, NotI- und XbaI-Erkennungsstellen beinhaltet. Nur eine Aminosäure des extrazellulären Teils des LepR wurde in das Fragment aufgenommen (gly). Das Primerdesign führte zur Insertion eines Asn zwischen der PacI generierten Leu-Ile-Sequenz und dem extrazellulären Gly. Das Amplikon wurde gelgereinigt und in den pCR^®-Blunt-Vektor (Invitrogen) ligiert. PacI-SacI-Verdau dieses pCR^®-Blunt-Konstrukts führt, nach Gelreinigung, zum gewünschten LepR-Fragment.
Der pSV-SPORT-EpoR/IFNaR2-2-Vektor (Pattyn et al, 1999) exprimiert eine EpoR/IFNaR2-2-Rezeptorchimäre und wurde wie folgt konstruiert: RNS wurde isoliert aus 5 × 10⁶ TF-1-Zellen unter Verwendung des RNeasy Kit (Qiagen). RT-PCR wurde wie folgt durchgeführt: 2 μl (2 μg) an oligodT (12–18-mer; Pharmacia) wurden zugesetzt und bei 70°C für 10 min inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eis für 1 Min. gekühlt, und die cDNS wurde zubereitet durch zusetzen von 4 μl 10 × RT-Puffer (Life Sciences), 1 μl 20 mM dNTPs (Pharmacia), 2 μl 0,1 M DTT, und 1 μl MMLV reverser Transkriptase (200 U; Superscript RT; Life technologies) zu einem Endvolumen von 20 μl. Inkubationszeiten waren wie folgt: RT für 10 Min., 42°C für 50 Min., 90°C für 5 Min., und 0°C für 10 Min. Anschließend wurden 0,5 μl RnaseH (2 U; Life Technologies) zugesetzt und das Gemisch wurde bei 37°C für 20 Min. inkubiert, gefolgt von Abkühlung auf Eis. PCR auf diese cDNS wurde durchgeführt unter Verwendung von Pfu-Enzym (5 U; Stratagene). Vorwärtsprimer (MBU-O-167) und Rückwärtsprimer (MBU-O-308) wurden entworfen, um den extrazellulären Anteil des EpoR (Aminosäuren 1–249) zwischen einer Kpn1- und einer PacI-Stelle zu amplifizieren. Eine Bande korrekter Größe wurde gereinigt und die DNS wurde mit Kpn1 und Pac1 verdaut und in einen KpnI-PacI-geöffneten pSV-SPORT-IL-5Rα/IFNaR2-2-Vektor eingefügt. Dieser Vektor beinhaltet einen chimären Rezeptor, der die extrazelluläre Domäne des IL-5Rα-Rezeptors hat, fusioniert an die Transmembran- und intrazelluläre Domänen des IFNaR2-2. Über sequenzspezifische Mutagenese wurde eine PacI-Stelle dem Fusionspunkt mit Hilfe des Quikchange^TM sequenzspezifischen Mutagenese Kits (Stratagene, La Jolla) hinzugefügt, was zur Insertion von zwei Aminosäuren (Leu-Ile) vor der der Membran am nächsten gelegenen extrazellulären Aminosäure (Lys) von IFNaR2-2 führte. Infolgedessen könnte mittels der der kodierenden Sequenz vorausgehenden KpnI-Stelle und der an der Fusionstelle von extrazelluläre Domäne und Transmembran-Domäne geschaffenen PacI-Stelle die extrazelluläre Domäne von IL-5Rα gegen eine von EpoR, wie oben beschrieben, ausgetauscht werden.
Das mittels PacI-SacI-Verdau geschaffene LepR-Fragment wurde in den PacI-SacI verdauten und gelgereinigten pSV-SPORT-EpoR/IFNaR2-2-Vektor ligiert, was zu pSV-SPORT-EpoR/LepR führt.
Herstellung der IL-3Rα/LepR-, IL-5Rα/LepR-, GM-CSFRα/LepR- und β_c/LepR-Chimären
Die pSV-SPORT-IL-5Rα/IFNaR2-2- und pSV-SPORT-β_c/IFNaR1-Vektoren exprimieren eine IL-5Rα/IFNaR2-2- bzw. eine β_c/IFNaR1-Chimäre, zusammengesetzt aus dem extrazellulären Anteil der IL-5Rα- oder β_c-Kette und den Transmembran- und intrazellulären Anteilen von IFNaR2-2 oder IFNaR1. Eine PacI-Stelle wurde verwendet um die Fusionsstelle kurz vor dem Transmembransegment zu schaffen. Die IFNaR2-2- oder IFNaR1-Anteile in diesen Vektoren wurden gegen die gleichen Segmente des LepR unter Verwendung der PacI-Stelle und einer XbaI-Stelle, die sich genau hinter dem IFNaR2-2- oder IFNaR1-Stoppcodon befindet, ausgetauscht. Deshalb wurde das LepR-Fragment über einen PacI-XbaI-Verdau des pSV-SPORT-EpoR/LepR-Vektors (siehe Beispiel 1) hergestellt, und wurde in die PacI-XbaI-geöffneten und gelgereinigten pSV-SPORT-IL-5Rα/IFNaR2-2- und pSV-SPORT-β_c/IFNaR1-Vektoren eingesetzt, was zu den Vektoren pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR und pSV-SPORT-β_c/LepR führt.
Die pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR- und pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-Vektoren wurden wie folgt konstruiert: der extrazelluläre Anteil der IL-3Rα- und GM-CSFRα-Ketten wurde mittels Standard-RT-PCR-Verfahren mit Pfu-Polymerase amplifiziert. 2 μl TF-1 cDNS wurden eingesetzt. Vorwärtsprimer waren MBU-O-752 (IL-3Rα) und MBU-O-754 (GM-CSFRα), und generierten eine KpnI-Stelle. Die Rückwärtsprimer MBU-O-753 (IL-3Rα) und MBU-O-755 (GM-CSFRα) enthalten eine PacI-Stelle, die die Fusion an den LepR im Leseraster gestattet.
Nach dem Subklonieren in den pCR^®-Blunt-Vektor wurden die über KpnI-PacI ausgeschnittenen extrazellulären Fragmente in den KpnI-PacI geöffneten pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR ligiert. Für die GM-CSFRα-Konstruktion wurde ein partieller KpnI-Verdau angewendet, weil der extrazelluläre Anteil eine interne KpnI-Stelle beinhaltete. Die resultierenden Vektoren, pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR und pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR beinhalten chimäre Rezeptoren, die aus dem extrazellulären Anteil der IL-3Rα- oder GM-CSFRα-Kette, der an den Transmembran- und zytoplasmatischen Schwanz des LepR fusioniert ist, bestehen.
Herstellung der EpoR/LepR-F3-Chimäre
Die mutierten Leptinrezeptoren (Eyckerman et al., 1999) Y985-1077F und Y985-1077-1138F (LepR-F3; früher F-all genannt) wurden durch Benutzung des Quikchange^TM sequenzspezifischen Mutageneseverfahrens unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Stratagene) auf der pMET7-LepR-Matrize hergestellt. Die mutagenen Oligonukleotide waren MBU-O-157, MBU-O-158, MBU-O-159, MBU-O-160, MBU-O-161 und MBU-O-162. Jede einzelne Mutation war an eine Veränderung in der Restriktionsspaltung gekoppelt und wurde über Restriktions- und DNS-Seguenzanalyse bestätigt. Die Doppel- und Dreifachmutanten wurden mittels einer sequentiellen Herangehensweise hergestellt. Signalgebungseigenschaften der hergestellten Mutanten wurden auf Ebene der Geninduktion mittels eines rPAP1-luci-Reporterkonstrukts (siehe unten) und Northern-Blot-Analyse der Induktion von Metallothionein II-Gentranskripten ermittelt. Die Y985-1077F-Doppelmutante zeigte eine höhere Stimulation der relevanten Gene im Vergleich zu Wildtyp-LepR, was vermutlich auf den Verlust der Rekrutierung einer SH2-Modul-enthaltenden Tyrosinphosphatase wie SHP-1 oder SHP-2 zurückzuführen ist. Die Y985-1077-1138F (LepR-F3)-Dreifachmutante zeigte beinahe vollständigen Verlust der Induktion aufgrund der Eliminierung des Box3- oder des STAT-3-Assoziierungsmotivs. Dieses führt zu einem Rezeptor, der immer noch Phosphorylierung und Aktivierung der assozuerten JAK2-Kinase gestattet, der aber kein stimulatorisches Signal an die untersuchten Gene weiterleiten kann.
PCR-Amplifikation auf dieser pMET7-LepR-F3-Vektormatrize mittels MBU-O-447 und MBU-O-448 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer führte zu einem LepR-F3-Amplikon, das die Transmembran- und intrazellulären Domänen von LepR-F3 (+1 zusätzliches Gly des extrazellulären Anteils, siehe oben) umspannt, und das in den pCR-^®-Blunt-Vektor subkloniert wurde. PacI-SacI-Verdau des resultierenden Plasmids ergab ein DNS-Fragment beinhaltend die LepR-F3-Sequenz, das in den PacI-SacI verdauten und gelgereinigten pSV-SPORT-EpoR/IFNaR2-2-Vektor (siehe oben) ligiert wurde. Das führte zu Vektor pSV-SPORT-EpoR/LepR-F3, der umbenannt wurde in pSEL1.
Herstellung des Beute-Vektors
Beute-Konstrukte wurden im pMET7-Vektor generiert, der einen starken konstitutiven Hybrid-SRα-Promotor enthält (Takebe et al., 1988).
Durch sequenzspezifische Mutagenese (Quikchange^TM, Stratagene) wurde eine einmal vorkommende ApaI-Stelle hinter dem pMET7-Promotor und vor der einmal vorkommenden EcoRI-Stelle in den pMET7mcs-Vektor eingeführt, was zum Vektor pMET7mcsA (Primer MBU-O-567 und MBU-O-568) führt.
Der pMET7mcs-Vektor ist eine modifizierte Version von pMET7, die eine erweiterte MCS nach Insertion der zusätzlichen, einmal vorkommenden BglII-, EcoRV-, BstEII-, AgeI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen beinhaltet. PCR-Amplifikation auf der pSVL-gp130-Matrize mittels des Vorwärtsprimers MBU-O-586 und des Rückwärtsprimers MBU-O-443 generierte ein DNS-Fragment, das für ein 158 Aminosäuren-langes intrazelluläres Fragment der menschlichen gp130-Kette kodiert, das 4 STAT-3-Assoziierungsmotive (Aminosäuren 761–918, das Stoppcodon wurde nicht koamplifiziert) enthält. Der Vorwärtsprimer enthält von 5' nach 3' eine ApaI-Restriktionsschnittstelle, eine Kozak-Konsensussequenz, eine für die Flagepitopmarkierung kodierende Sequenz (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ile), und eine BglII-Restriktionsschnittstelle. Der Rückwärtsprimer kodiert für eine zusätzliche Scharniersequenz (Gly-Gly-Ser) und enthält eine EcoRI-Erkennungsstelle. ApaI- und EcoRI-Verdau des PCR-Produkts (nach Subklonierung in pCR^®-Blunt) und des pMET7-mcsA, gestattete uns das gp130-Fragment in den pMET7-Vektor zu ligieren, wodurch das pMET7-flag-gp130-Konstrukt generiert wird.
Das SV40 großes T-Antigen (SVT) wurde unter Verwendung eines Vektors des HybridZAP-2.1 Zwei-Hybrid-cDNS-Synthese-Kits (Stratagene; pSV40) als Matrize amplifiziert. Die Primer MBU-O-445 und MBU-O-446 wurden benutzt, um ein DNS-Fragment zu generieren, das für 448 Aminosäuren zwischen Rest 261 und 708 kodiert. Die N-terminale Deletion eliminiert das Kernlokalisierungssignal im SVT. Der Vorwärtsprimer enthält eine EcoRI-Erkennungsstelle, die eine Ligation im Leseraster an die gp130-Scharnier-Sequenz gestattet. Der Rückwärtsprimer enthält zusätzliche NruI-, XhoI-, BglII-, NotI- und XbaI-Restriktionsschnittstellen und kodiert ebenfalls für das Stoppcodon nach der für SVT kodierenden Sequenz. Subklonierung in pCR^®-Blunt, gefolgt von der Rückgewinnung des mit EcoRI und XbaI geschnittenen Amplikons gestattete Ligation in den EcoRI-XbaI-geöffneten pMET7-flag-gp130-Vektor, was den Vektor pMET7-flag-gp130-SVT ergab, der umbenannt wurde in pMG1-SVT. Verdau mit EcoRI-XhoI oder EcoRI-NotI gestattet die Insertion von Modellbeuten oder von cDNS-Bibliotheken in diesen Vektor. In diesen Fällen fungiert das SVT-Fragment als „Abstandshalter".
Konstruktion der p53-SVT-Wechselwirkungsfalle-Vektoren
Ein DNS-Fragment umfassend p53 der Maus wurde mit MBU-O-450 und MBU-O-451 mittels des p53-Kontrollplasmids aus dem HybridZAP-2.1 Zwei-Hybrid-cDNS-Synthese-Kits (Stratagene) als Matrize amplifiziert. Der Vorwärtsprimer beinhaltet eine SalI-Restriktionsschnittstelle, die die Kopplung an das EpoR/LepR-F3-Scharnierkonstrukt im Leseraster gestattet. Der Rückwärtsprimer beinhaltet ein Stoppcodon und eine XbaI-Restriktionsschnittstelle. Das 243-Aminosäuren-lange p53-Fragment (Aminosäuren 73–315) beinhaltet die Vechselwirkungsstelle mit SVT, ihm fehlt aber das Kernlokalisierungssignal und die Oligomerisierungsdomäne. Subklonierung über pCR^®-Blunt, Verdau mit SalI-XbaI und Gelreinigung ergaben ein Fragment, das in den SalI-XbaI-geschnittenen und gelgereinigten pSEL1-Vektor ligiert wurde, was zu pSEL1-p53 führte.
Die Herstellung des pMG1-SVT-Vektors ist oben beschrieben.
Amplifikation mittels MBU-O-695 und MBU-O-696 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer unter Verwendung von pMG1-SVT als Matrize führte zu einem SVT- Fragment (Aminosäuren 261–708 + Stoppcodon) zwischen der BglII- und XbaI-Erkennungsstelle. Das BglII-XbaI-verdaute und gereinigte PCR-Fragment wurde in einen BglII-XbaI-geschnittenen und gelgereinigten pMG1-SVT-Vektor ligiert, was zu pMET7-SVT führte.
Konstruktion der EpoR-CIS-Wechselwirkungsfalle-Vektoren
RNS wurde von 5 × 10⁶ TF-1-Zellen mittels des RNeasy Kits (Qiagen) präpariert und in 50 μl Wasser eluiert, wovon 10 μl als Einsatz in die RT-PCR verwendet wurden. RT-PCR wurde, wie in Abschnitt I.1.1 beschrieben, unter Standard-Reaktionsbedingungen durchgeführt. Ein intrazelluläres Fragment des humanen EpoR (Aminosäuren 370–453) wurde von 4 μl TF1-cDNS mittels MBU-O-675 und MBU-O-676 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer, mit zwei konsekutiven PCR-Reaktionen und einer Gelreinigung dazwischen, amplifiziert. SacI- und XbaI-Erkennungsstellen sind in den Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimern vorhanden. Der Rückwärtsprimer kodiert auch für ein Stoppcodon. Nach Gelreinigung der PCR-Amplikon-Bande der korrekten Größe, wurde das Fragment in pCR^®-Blunt subkloniert, mit SstI (das die selbe Erkennungsstelle wie SacI hat) und XbaI verdaut, und in den SstI-XbaI-verdauten und gelgereinigten pSEL1-Vektor ligiert, was zum pSEL1-EpoR-Konstrukt fuhrt.
Über sequenzspezifische Mutagenese (Quikchange^TM, Stratagene) wurde eine Tyr-nach-Phe-Mutation an Position 426 in den humanen EpoR auf dem pSEL1-EpoR-Konstrukt eingeführt, was zu einem inaktiven EpoR-Fragment führt. Vorwärtsprimer MBU-O-717 und Rückwärtsprimer MBU-O-718 wurden für die PCR-basierte Mutagenese benutzt, was auch zur Einführung einer EcoRI-Enzym-Erkennungsstelle führt. Die Einführung der Mutation wurde über Restriktion und DNS-Sequenz-Analyse bestätigt. Das Konstrukt wurde pSEL1-EpoRY-F genannt.
Der vollständige für das Zytokin-induzierbare SH2-enthaltende Protein CIS (Cytokine Inducible SH2-containing protein) der Maus kodierende Bereich (Aminosäuren 2–257) wurde mittels MBU-O-677 und MBU-O-678 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer amplifiziert. Der Vorwärtsprimer beinhaltet eine EcoRI-Erkennungsstelle und der Rückwärtsprimer enthält eine XbaI-Erkennungsstelle und ein Stoppcodon. Das amplifizierte und gelgereinigte Fragment wurde in den pCR^®-Blunt-Vektor subkloniert. Das eingefügte Insert wurde über EcoRI- und Xba-Verdau und Gelreinigung zurückgewonnen und wurde in einen EcoRI-XbaI- verdauten und gelgereinigten pMG1-SVT-Vektor kloniert, was zum Vektor pMG1-CIS führte.
Konstruktion der IRS1-Vav-Wechseltivirkungsfalle-Vektoren
Über einen Mutageneseansatz (Quikchange^TM, Stratagene) wurden 4 Aminosäuren (P₁₁₃₇-Y-M-P₁₁₄₀) innerhalb des mutierten Leptinrezeptors Y985-1077F (pMET7 LepR Y985-1077F) ausgetauscht gegen einen für ein Phosphotyrosin kodierenden Bereich aus humanem IRS1 (Insulin-Rezeptor-Substrat 1; S₈₉₂-P-G-E-Y-V-N-t-E-F₉₀₁). Das entfernt das funktionelle STAT3-Assoziierungsmotiv innerhalb des Leptinrezeptors. Die Primer MBU-O-515 und MBU-O-516 wurden für die PCR-basierte Mutagenese verwendet. Das Konstrukt wurde pMET7 LepR-IRS 1 genannt.
Mittels Standard-PCR-Verfahren mit Pfu-Polymerase wurde das komplette humane GRB2-Protein (Growth Receptor Bound; AS 1-217) durch Einsatz von 2 μl HepG2-cDNS und mittels MBU-O-467 und MBU-O-468 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer amplifiziert. Der Vorwärtsprimer beinhaltet eine zusätzliche EcoRI-Stelle, die eine Fusion im Leseraster an die gp130-Kette im pMG1-Vektor gestattet, und der Rückwärtsprimer beinhaltet eine zusätzliche XbaI-Stelle nach dem Stoppcodun. Nach Subklonierung in den pCR^®-Blunt-Vektor wurde das EcoRI-XbaI-ausgeschnittene Fragment in den EcoRI-XbaI-geschnittenen pMG1-Vektor ligiert, was pMG1-GRB2 ergab. Die SH2-Domäne von GRB2 (AS 60-158) wurde auf die gleiche Weise mittels der Primer MBU-O-469 und MBU-O-470 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer amplifiziert. Der Vorwärtsprimer beinhaltet eine zusätzliche EcoRI-Erkennungsstelle, die Fusion an die gp130-Kette im Leseraster gestattet, und der Rückwärtsprimer beinhaltet ein zusätzliches Stoppcodon und eine XbaI-Enzym-Erkennungsstelle. Nach Subklonierung des PCR-Fragments in den pCR^®-Blunt-Vektor, wurde das generierte EcoRI-XbaI-Fragment in den EcoRI-XbaI-geschnittenen pMG-1-Vektor ligiert, was den pMG1-GRB2S-Vektor ergab.
Ein Fragment des humanen GRB2 umfassend die C-terminale SH3-Domäne (AS 159-217) wurde mittels des pMG1-GRB2-Konstrukts als Matrize und MBU-O-770 and MBU-O-468 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer amplifiziert. MBU-O-770 gestattet eine Fusion im Leseraster an die Flag-Epitopmarkierung über eine BglII-Stelle, MBU-O-468 ist oben beschrieben. Nach Subklonierung dieses PCR-Fragments in den pCR^®-Blunt-Vektor, wurde das GRB2-Fragment in den pMG1-Vektor durch einen BglII-XbaI-basierten Austausch eingesetzt, was zum pMET7-GRB2SH3-Vektor führte.
Ein Fragment des humanen Vav (vavS: AS 259-789) wurde mittels Pfu-Polymerase von mRNS der humanen TF1-Zelllinie über Standard-RT-PCR-Techniken amplifiziert. Die Primer waren MBU-O-737 und MBU-O-738 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer. MBU-O-737 beinhaltet eine zusätzliche EcoRI-Stelle, die eine Fusion im Leseraster an gp130 gestattet, und MBU-O-738 beinhaltet ein Stoppcodon und eine XhoI-Enzym-Erkennungsstelle. Das amplifizierte Fragment wurde in den pCR-^®-Blunt-Vektor subkloniert und in den pMG1-Vektor via EcoRI-XhoI-basiertem Austausch ligiert. Das VavS-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung des Vorwärtsprimers MBU-O-771, des Rückwärtsprimer MBU-O-741 und pMG1-VavS als Matrize amplifiziert. Der Vorwärtsprimer beinhaltet eine BamHI-Stelle, die die Fusion im Leseraster an die Flag-Epitopmarkierung gestattet, und der Rückwärtsprimer enthält ein Stoppcodon und eine XbaI-Restriktionsschnittstelle. Das Amplikon wurde subkloniert in den pCR^®-Blunt-Vektor und mit BamHI und XbaI ausgeschnitten. Das gereinigte Fragment wurde in einen BglII-XbaI-geschnittenen pMG1-Vektor kloniert, was zum pMET7-VavS-Konstrukt führte.
Konstruktion der pGL3-rPAP1-luci- und pSEAP-rPAP1-Reporterkonstrukte
Genomische DNS wurde aus der Phäochromozytomrattenzelllinie PC12 mittels der DNAzol-Vorgehensweise (Gibco BRL) isoliert. Optimale Primer für die PCR-Amplifikation des PAP1-Promotors der Ratte wurden mittels des „Oligo Primer 3"-Programms (http://wwwgenome.wi.mit.cdu/cgi-bin/primer3.cgi) ausgewählt. Vorwärts- und Rückwärtsprimer waren MBU-O-222 bzw. MBU-O-223. Die Amplifikation wurde mittels Taq-Polymerase in 30 Zyklen durchgeführt: 2' auf 94°C, 2' auf 57°C, 2' auf 72°C, gefolgt von einer 10-minütigen Auffüllreaktion auf 72°C. Die optimale MgCl₂-Konzentration wurde bei 6 mM ermittelt. Das Promotorfragment wurde, nach Glättung mit Klenow-Polymerase, in den pCR^®-Blunt-Vektor kloniert.
Das Promotorfragment wurde aus diesem Plasmidkonstrukt mittels aufeinander folgendem PstI-Verdau, Klenow-Behandlung zur Glättung der Enden, und BamHI-Verdau ausgeschnitten, was zu einem Fragment mit einem glatten und einem überhängenden Ende führt. Das gelgereinigte Fragment wurde in einen SmaI-BglII-geöffneten und gelgereinigten pGL3-Kontrollvektor (Promega) kloniert. Verdau mit SstI-SpeI-Restriktionsenzymen und Gelreinigung führte zu einem Fragment, das in einen SstI-NheI-geschnittenen und gereinigten pGL3 Grund-Vektor kloniert wurde, was zum pGL3-rPAP1-luci-Konstrukt führte. DNS- Sequenzierung zeigte, dass 10 Nukleotide von der publizierten Sequenz abweichen, aber ohne Einfluss auf die Leptin-abhängige Induktion dieses Promotorsegments.
Das vollständige rPAP1-Promotorfragment wurde aus pGL3 rPAP1-luci mittels Partialverdau mit KpnI und XhoI ausgeschnitten und in den KpnI-XhoI-geöffneten pXP2d2-Vektor (Geschenk von Prof S. Nordeen) ligiert, was zu pXP2d2-rPAPI-luci führte. Die kodierende Sequenz für Puromycin wurde unter Verwendung der Primer MBU-O-719 and MBU-O-720 mit der pIRESpuro2-Matrize (Clontech) amplifiziert. Kombinierter XhoI-XbaI-Verdau gestattete den Einbau in das pXP2d2-rPAP1-luci-Konstrukt, was zu pXP2d2-rPAP1-puro^® führte.
Verdau des pGL3-rPAPI-Iuci-Konstrukts mittels der Restriktionsenzyme MluI und XhoI führte zu einem Fragment, das die volle Größe des rPAP1-Promotors umspannt. Dieses Fragment wurde gelgereingt und in einen MluI-XhoI-geschnittenen und gelgereinigten pSEAP-Vektor (TROPIX, Perkin Elmer) ligiert, was zum pSEAP-rPAP1-Konstrukt führte. Die Funktionalität dieses Konstrukts wurde überprüft über transiente Kotransfektion von pMET7 LepR und pSEAP-rPAP1 in PC12-Zellen unter Verwendung des Phospha-Light^TM-Reporterassaykits von TROPIX (Perkin Elmer).
Konstruktion des pcDNA5/FRT-EpoR und der pBG1-SVT, pBG1-CIS und pBG1-ccdB-Vektoren
Der Einbau von EpoR-LR-F3-EpoR in den pcDNA5/FRT-Vektor wurde durch erneute Amplifizierung des vollständigen chimären Konstrukts unter Verwendung von MBU-O-167 und MBU-O-769 auf der pSEL1-EpoR-Matrize erreicht, gefolgt von Subklonierung mittels Kpn1- und NotI-Stellen. Das Konstrukt wurde pcDNA5/FRT-EpoR genannt.
Das SVT-Fragment wurde erneut von pMG1-SVT mittels des Vorwärtsprimers MBU-O-766 und MBU-O-446 amplifiziert. BamHI-NotI-Verdau gestattete den Einbau in den pBMN-Z retroviralen Vektor (Geschenk von G. Nolan), was zum Vektor pBG1-SVT führte. EcoRI-NotI-basierter Austausch des SVT-Fragments gegen CIS (pMG1-CIS) führte zum pBG1-CIS-Vektor.
Um eine Gegenselektion gegen eine Selbst-Ligation des Vektors im Falle des Einbaus von cDNS-Bibliotheken in den pBG1-Vektor zu gestatten, wurde das E. coli control of cell death-Gen (ccdB) mittels der Primer MBU-O-835 und MBU-O-83 und der Matrize pENTRY11 (Life Technologies) amplifiziert, und in den pBG1-CIS-Vektor über eine EcoRI-NotI-Restriktion-basierten Einbau kloniert, der zum pBG1-ccdB-Vektor führte.
Konstruktion der Köder-modifizierenden Enzym-, der Ködersubstrat- und der Beutechimären.
Herstellung der pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 und pSV-SPORT-/β_c/LepR-F3 Chimären
Das LepR-Fragment in pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR- und pSV-SPORT-β_c/LepR-Chimären wurde ersetzt durch das LepR-F3-Fragment von pSEL1 (pSV-SPORT-EpoR/lepR-F3) mittels der PacI- und NotI-Stellen. Deshalb wurde das LepR-F3-Fragment über den PacI-NotI-Verdau des pSEL1-Konstrukts generiert, gelgereinigt und in die PacI-NotI-geöffneten und gelgereinigten pSV-SPORT-GM-CSFRα- oder pSV-SPORT-βc-Vektoren eingebaut, was zu den Vektoren pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 und pSV-SPORT-β_c/LepR-F3 führte.
Herstellung der pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-modifizierendes Enzym-Chimäre und der pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-modifizierendes Enzym-Chimäre und Herstellung der pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Köderchimäre und der pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Köderchimäre
Die pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3- und pSV-SPORT-β_c/lepR-F3-Vektoren wurden mit SalI verdaut, gelgereinigt und die Enden wurden mittels Klenow Fragment (Boehringer Mannheim) geglättet. Diese Vektoren mit glatten Enden wurden mit Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) inkubiert, um die geglätteten Enden zu dephosphorylieren. Für das modifizierende Enzym wurde ein Konstrukt, das den zytoplasmatischen Schwanz von ALK4 der Maus mit der Mutation T206D, die zu einer konstitutiv aktiven Kinase führt, im Vektor pGBT9 beinhaltet, von Prof. D. Huylebroeck erhalten. Der mutierte zytoplasmatische Schwanz von ALK4 wurde aus dem Konstrukt über einen EcoRI-BamHI-Verdau entfernt, gelgereinigt und mit Klenow-Fragment zur Glättung der Enden inkubiert. Das Fragment wurde in die geöffneten pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3- und pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Vektoren ligiert, was zu pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA und pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA führte.
Für den Köder war ein Konstrukt, das die humane cDNS kodierend für das gesamte Smad3-Protein im Vektor pcdef beinhaltete, ein freundliches Geschenk von Prof. D. Huylebroeck. Das Smad3-Fragment wurde mit einem EcoRI-XhoI-Verdau entfernt, gelgereinigt und die Enden mit Klenow-Polymerase (Boehringer Mannheim) geglättet. Dieses Smad3-Fragment wurde in die geöffneten pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3- und pSV- SPORT-β_c/LepR-F3-Vektoren (oben beschrieben) ligiert, was zu pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 und pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 führte.
Herstellung der pMG2-Beutechimäre
Zur Konstruktion des pMG2-Vektors wurde der pMG1-SVT-Vektor mit EcoRI und NotI verdaut, gefolgt von einer Inkubation mit Klenow-Polymerase (Boehringer Mannheim) zur Glättung der Enden. Diese Vektoren mit geglätteten Enden wurden mit Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) zur Deprosphorylierung der glatten Enden inkubiert. Die Kassette rfB des Gateway Vector Conversion-Systems (Life Technologies) wurde dann in den geöffneten Vektor ligiert, was zum pMG1-Gateway-Vektor führte. Eine PCR-Reaktion wurde mittels der Primer MBU-O-1094 und MBU-O-1076 auf der pMG1-SVT-Matrize durchgeführt, was zu einem Fragment führte, das Gateway-Rekombinationsstellen beinhaltet. Dieses Fragment beinhaltet auch einen Teil (Aminosäuren 905–918) der gp130-Kette. Das Fragment wurde dann in den pMG1-Gateway-Vektor mittels einer 2-stufigen Gateway-Reaktion (Life Technologies) kloniert, was zu pMG2-SVT führte, einem Beutekonstrukt mit insgesamt 6 STAT-Rekrutierungsstellen. Das pMG2-SVT-Konstrukt wurde mit EcoRI-XhoI verdaut und der Vektor wurde gelgereinigt. Für die Beute erhielten wir ein Konstrukt von Prof. D. Huylebroeck, das die cDNS beinhaltete, die für beinahe das gesamte humane Smad4-Protein kodiert, nur die ersten 3 Aminosäuren fehlen. Das Smad4-Insert wurde mittels eines EcoRI-XhoI-Verdaus entfernt, gelgereinigt und in den geöffneten pMG2-Vektor ligiert.
Konstruktion der Reporterzelllinien
Selektion der Hek293T PAP21-Reporterzelllinie
Das Blasticidin-System (Invitrogen) wurde verwendet, um ein stabile Zelllinie mit einem endogenen pSEAP-rPAP1-Reporterkonstrukt herzustellen. Sensitivität gegenüber dem toxischen Wirkstoff Blasticidin (Invitrogen) von Hek293T-Zellen wurde auf 3 μg/ml eingeschätzt. 10⁶ Zellen wurden in eine Petri-Schale ausgesät und am Tag nach dem Aussäen mittels des Kalziumphosphattransfektionssystems (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Insgesamt wurden 20 μg DNS transfiziert (18 μg von pSEAP-rPAP1seap und 2 μg von pcDNA6/V5-HisA, der ein Blasticidin-Resistenzgen beinhaltet). Nach 48 Stunden wurden die transfizierten Zellen in 96-Lochplatten zu 10 Zellen pro Loch ausgesät. Nach 24 Stunden wurde Blasticidin in einer Konzentration von 3 μg/ml zugesetzt und die Zellen wurden 3–4 Wochen lang unter Selektionsbedingungen behalten. Die resultierenden Einzelzellklone wurden durchmustert über Stimulation für 24 Stunden mit 20 ng/ml Hyper-IL6 (Fusionsprotein von IL-6 mit seinem spezifischen Rezeptor IL6-Rα; Fischer et al., 1997). Hek293T PAP21 wurde als die am besten reagierende Zelllinie ausgewählt.
Herstellung der HEK293-16-Zelllinie
Flp-In-293-Zellen (Invitrogen) wurden stabil mit einem Plasmid transfiziert, das Expressionskassetten für den ecotropen retroviralen Rezeptor der Maus (mEcoR) und für Neomycin-Resistenz enthält. Die Summe der Neomycin-resistenten Zellen (resistent gegenüber 400 μg/ml Geniticin, Life Technologies) wurden supertransfiziert bzw. in einem Verhältnis von 5:1 mit den folgenden zwei Plasmiden transfiziert: i) ein Plasmid, der die cDNS trägt, die für den Puromycin-Resistenzmarker (Puromycin-N-Acetyl-Transferase) kodiert, unter der Kontrolle der Promotorsequenzen von rPAP1 (pXP2d2-rPAP1-puro^®), ii) ein Plasmid, das die cDNS für den Blasticidin-Resistenzmarker (Blasticidin-S-Deaminase) trägt, unter der Kontrolle des EM7-Promotors (pcDNA6/V5-his, Invitrogen). Nach Selektion mit Blasticidin S (5 μg/ml, Invitrogen), wurden Einzelkolonien gepickt und in 24-Lochplatten ausgesät. Puromycin-Resistenz (1 μg/ml, Sigma; zugesetzt 48 Stunden nach dem Aussäen) wurde überwacht in der Abwesenheit oder Anwesenheit von LIF (1 ng/ml). Nach 5 weiteren Tagen wurden die überlebenden Zellen mittels einer Standardvorgehensweise mit Kristallviolett angefärbt.
RT-PCR-Analyse
Soweit nicht anders angegeben, wurden die Zellen in 100 μl RLT-Puffer (RNeasy^® Verfahren, Qiagen) lysiert und chromosomale DNS mittels Qiashredder-Säulen (Qiagen) geschert. Die Kügelchen (beads) wurden gemäß den Anweisungen des Hersteller (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal) vorbehandelt. Kurz gesagt, die Dynabeads wurden zweimal in einem Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,5 und 1 mM EDTA) gewaschen und mit 200 pmol biotinylierten Oligonukleotiden, die gerichtet sind gegen die gp130-Kette (5' GGGCTGGGTAGACTCGGATCTTGAGAAGAC), inkubiert. Als nächstes wurden die Kügelchen dreimal in dem oben erwähnten Hochsalzpuffer gewaschen und in einem Niedrigsalzpuffer (0,15 M NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,5 und 1 mM EDTA) in einer Konzentration von 10 μg/μl resuspendiert. 5 μl dieser Suspension wurden zu 100 μl Gesamtlysat, das 1/5 im Hochsalzpuffer verdünnt ist, gegeben. Nach 15 Minuten sanfter Rotation bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen dreimal mit dem Niedrigsalzpuffer gewaschen und in 30 μl Wasser für 2' bei 65°C eluiert. 15 μl dieser Probe wurden als Einsatz für eine Standard-PCR-Reaktion mit dem Qiagen OneStep RT-PCR-Kit verwendet. Die Primer 5' GGCATGGAGGCTGCGACTG and 5' TCGTCGACCACTGTGCTGGC wurden zur Amplifikation des „Beute"-Fragments verwendet. In einem Vorexperiment unter Verwendung von CIS als „Beute"-Matrize wurde eine effiziente Amplifikation mit Lysat von weniger als 10³ Zellen erreicht.
Reporterassays, Bindungsassays, Zellüberlebensassay und FACS-Analyse
Luziferase wurde nach der Lyse der Zellen und Zusatz von Luziferasesubstrat (Luciferin, Duchefa) gemessen. Die Lichtemission wurde mittels eines TopCount-Chemilumineszenzzählers (Canberra Packard) gemessen. Alle Luziferasemessungen wurden mittels eines Expressionskonstrukts, das β-Galactosidase konstitutiv exprimiert (pUT651), normalisiert, was für jede Transfektion unter Verwendung des GalactoStar Kits (TROPIX) in dreifacher Ausfertigung gemessen wurde.
Puromycin-resistente Zellkolonien wurden mit Kristallviolett nach einer Standardvorgehensweise gefärbt.
Die Expression des humanen Erythropoietin-Rezeptors wurde mittels eines Ziege anti-Mensch EpoR polyklonalen IgG (R&D Systems) zu 2 μg/ml und eines Alexa488-konjugierten Esel anti-Ziege IgG (Molecular Probes) zu 4 μg/ml überwacht. Zur Demonstration der Expression des FLAG-Epitop-markierten „Beute"-Konstrukts wurden die Zellen fixiert, mit Starfiqs^TM nach dem Protokoll des Herstellers (Immuno Quality Products) permeabilisiert und mit einem anti-FLAG Maus-mAK (Sigma) zu 8 μg/ml und einem Fluorescein-gekoppelten Schaf-Anti-Maus IgG (Amersham), 1/50 verdünnt, gefärbt. Alle FACS-Analysen wurden auf einem FACSCalibur durchgeführt (Becton Dickinson).
Herstellung der retroviralen cDNS-Bibliotheken und Durchmusterungsbedingungen
Die Konstruktion der HEK293-Bibliothek wurde mittels Standardverfahren durchgeführt. Kurz gesagt, 5 μg von HEK293-PolyA + mRNS wurden als Einsatz für sowohl für Oligo-dT- als auch zufallsgerichtete Erststrangsynthese (random primed first strand synthesis) mit Superscript II Reverser Transkriptase (Life Technologies) verwendet. Sowohl die OligodT- wie die Zufallsprimer beinhalten eine NotI-Stelle. Nach der Zweitstrangsynthese wurden Adaptoren, die eine EcoRI-Stelle beinhalten, ligiert. Die cDNS wurde analysier mittels Agarose-Gelelektorphorese und Fragmente zwischen 0.5 und 2.5 Kbp wurden unidirektional in den mit EcoRI-NotI geöffneten pBG1-ccdB-Vektor kloniert.
Für die Durchmusterung wurden 6 × 10⁷ „Köder"-exprimierende Zellen in einer Dichte von 2 × 10⁶ pro 175 cm² Gewebekulturflasche ausgesät. 24 Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen mit der retroviralen HEK293-„Beute"-cDNS-Bibliothek (Komplexität von 2 × 10⁶) für weiter 24 Stunden infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen 6,5 Stunden lang mit 50 ng/ml Epo stimuliert, und Puromycin wurde 20 Tage lang in einer Endkonzentration von 2 μg/ml zugesetzt. Einzelzellkolonien wurden gepickt und mittels eines funktionellen Assays und RT-PCR-Sequenzierung analysiert.
Immunopräzipitationen und Western-Blot-Analyse
Zur Demonstration der EpoR-„Köder"-Phosphorylierung transfizierten wir transient ungefähr 3 × 10⁶ HEK293T-Zellen mit Plasmiden, die für den EpoR-„Köder", oder für die EpoR-„Köder"-Y402F-Mutante, und die CIS/SOCS-2-„Beuten" kodieren. Geklärte Lysate (in modifiziertem RIPA-Puffer: 50 mM TrisHCl pH 8.0; 200 mM NaCl; 1% NP40; 0.5% DOC; 0.05% SDS; 2 mM EDTA; 1 mM Na₃VO₄; 1 mM NaF; 20 mM β-Glycerinphosphat; Complete^TM Proteaseinhibitor-Cocktail [Roche]) von stimulierten und unstimulierten Zellen wurden mit 2 μg Ziege Anti-Mensch EpoR polyklonalem IgG und Protein G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) inkubiert. Nach Präzipitation, Polyacrylamidgelelektrophorese und Blotting, wurde Phosphorylierung mittels eines PY20-Antikörpers (Transduction Laboratories) nachgewiesen.
Immunopräzipitation von „Beuten" wurde nach Transfektion der EpoR/EpoRF-Köder und der SOCS-2-„Beute" in HEK293T-Zellen durchgeführt. Inkubation der geklärten Lysate (modifizierter RIPA) mit einem anti-FLAG-M2-Affinitätsgel gestattete SOCS-2-„Beute"-Präzipitation. Phosphorylierung der „Beute" wurde mittels des PY20-Antikörpers nachgewiesen. Die Expressionsniveaus der „Beute" wurden nach dem Strippen der Blots und Neuinkubation mit anti-FLAG-Antikörper überprüft.
STAT3-Phosphorylierung wurde mit dem Phospho-STAT3- (Tyr705) Antikörper (Cell Signaling) nach den Anweisungen des Herstellers gezeigt. STAT3-Expression wurde auf denselben Blots mit einem anti-STAT3-Antikörper (Transduction Laboratories) verifiziert.
Beispiel 1: Funktionalität der EpoR-LepR-Chimäre in der Hek293T PAP21-Zelllinie
Um die Funktionalität der EpoR/LepR-Chimäre zu bestimmen, wurden 3 Plasmidkombinationen in HEK293 PAP21-Zellen transfiziert:

Transfektion wurde gemäß des Kalziumphosphatverfahrens (Graham und van der Eb, 1973) durchgeführt. Ein Präzipitat wurde mittels 3,4 μg insgesamten DNS-Einsatzes (0,4 μg für pUT651, 1 μg für jeden der anderen) in 300 μl Gesamtgemisch gebildet. 200 μl dieses Gemischs wurden zu 4 × 10⁵ Hek293T PAP21 Zellen zugesetzt, die am Tag vor der Transfektion in eine 6-Lochplatte (Falcon) ausgesät worden waren. 6 Stunden nach dem Zusetzen des Gemischs wurden die Zellen einmal mit Dulbecco's PBS (Life Technologies) gewaschen und neues DMEM-Medium (Life Technologies) wurde zugesetzt. Zwei Tage nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und die Zellen mittels 200 μl Zelldissoziierungsagens (Life Technologies) resuspendiert. Nach Neutralisierung mit 1200 μl DMEM-Medium wurden 50 μl der Zellsuspension in 96-Lochplatten (Costar) in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung ausgesät; und stimuliert durch Zugabe rekombinanten humanen Leptins (R&D Systems) in einer Endkonzentration von 100 ng/ml, oder rekombinanten humanen Erythropoietins (R&D Systems) in einer Endkonzentration von 0.5 Einheiten/ml, oder die Kombination von Leptin (gleiche Konzentration wie oben) plus Forskolin (Sigma, 10 μM Endkonzentration) oder der Kombination von Erythropoietin (gleiche Konzentration wie oben) plus Forskolin (gleiche Konzentration wie oben). Eine unstimulierte Negativkontrolle wurde ebenfalls in das Experiment mit eingebaut. Forskolin ist ein chemischer Wirkstoff, das die in den Zellen vorliegende Adenylatcyclase aktiviert, was zu erhöhten Mengen des intrazellulären Botenstoffs cAMP fuhrt. Die Behandlung transfizierter Zeilen mit Forskolin alleine führte nicht zu einer signifikanten Induktion der Luziferase-Aktivität. Über einen undefinierten Mechanismus fuhrt die Erhöhung des cAMP-Spiegels zu einer starken Kostimulation mit dem Leptinsignal auf die PAP1-Induktion (Eyckerman et al., 1999). 24 Stunden nach Stimulation wurden die Zellen in den Löchern lysiert und Luziferase-Substrat (Luciferin, Duchefa) wurde zugesetzt. Die Lichtemission wurde mittels eines TopCount Chemilumineszenzzählers (Canberra Packard) gemessen. Die Transfektion des Leervektors (Transfektion a) zeigte in allen Fällen kein Signal. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die Transfektion mit der EpoR/LepR-Chimäre resultierte in einer 3,7-fachen Induktion mit Erythropoietin, und einer 6,5-fachen Induktion mit Erythropoietin und Forskolin. Weder mit Leptin- noch mit Leptin + Forskolin-Stimulation konnte ein signifikantes Signal nachgewiesen werden. In mit der LepR Y985/1077F-Mutante transfizierten Zellen wurde eine 33,2-fache Induktion nachgewiesen, wenn mit Leptin stimuliert wurde, und eine 37,6-fache Induktion wurde nachgewiesen, wenn mit Forskolin kostimuliert wurde. Kein Signal wurde nachgewiesen sowohl in mit Erythropoietin als auch in mit Erythropoietin + Forskolin-stimulierten Zellen. Alle Ergebnisse wurden unter Verwendung des internen Transfektionskontrollvektors pUT651 und des GalactoStar-Kits (siehe oben) normalisiert.
Der Induktionsunterschied zwischen EpoR/LepR und LepR Y985/1077F ist sehr wahrscheinlich wegen der Eliminierung von Tyrosinen in letzterem Rezeptorkonstrukt, die involviert sind in die Rekrutierung von Tyroinphosphatasen und SOCS-Proteinen an den Komplex, was zu einem verstärkten Signal führt (Eyckerman et al., 1999).
Beispiel 2: Funktionalität der p53-SV40 Großes T-Wechselwirkungsfalle
Um die Funktionalität dieser modifikationsunabhängigen Wechselwirkung zu untersuchen, wurden die folgenden Plasmidkombinationen in 4 × 10⁵ Hek293T-Zellen transfiziert, die am Tag vor der Transfektion in eine 6-Lochplatte ausgesät worden waren:

Ein 300 μl Präzipitationsgemisch, das die 3.1 μg DNS (0.1 μg von pUT651, 1 μg von jedem der anderen) beinhaltete, wurde zubereitet. 200 μl wurden 6 Stunden lang den Zellen zugesetzt, nach denen sie einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen wurden. Nach dem Waschen wurde DMEM-Medium zu den Zellen gegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mittels 200 μl Zelldissoziierungsagens resuspendiert, das mit 2200 μl DMEM-Medium neutralisiert wurde. Von dieser Zellsuspension wurden für jede Transfektion 40 μl in eine 96-Lochplatte gebracht und Stimulation wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. 60 μl DMEM wurden in einem Endvolumen von 100 μl zugesetzt und 24 Stunden später wurden die Zellen 24 Stunden lang mit Erythropoietin oder Erythropoietin plus Forskolin (selbe Konzentrationen wie oben) stimuliert. Eine unstimulierte Negativkontrolle wurde ebenfalls in das Experiment miteinbezogen. Luziferase-Messungen sind in 3 gezeigt.
Transfizierte Zellen von Transfektionen a, b und c zeigten keine signifikante Induktion des Reporterkonstrukts unter allen getesteten Bedingungen. Eine 9,4-fache Induktion und eine 14,6-fache Induktion wurde in transfizierten Zellen von Transfektion d nach Stimulation mit Erythropoietin bzw. Erythropoietin plus Forskolin nachgewiesen, was ein wechselwirkungsabhängiges Signal impliziert. Kein Signal wurde nachgewiesen in Transfektion e und f. Das impliziert eine spezifische Wechselwirkung, die zu gp130-abhängiger STAT-3-Aktivierung führt. Alle Ergebnisse wurden mittels des internen Transfektionskontrollvektors pUT651 und des GalactoSTar-Kit (siehe oben) normalisiert.
Beispiel 3: Funktionalität der EpoR-CIS-phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle
Um die Funktionalität der EpoR-CIS-phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle zu bestimmen, wurden folgende Plasmidkombinationen in 4 × 10⁵ Hek293T-Zellen transfiziert, die am Tag vor der Transfektion ausgesät worden waren:

Ein Präzipitationsgemisch von 300 μl, das 3,1 μg DNS (0,1 μg von pUT651, 1 μg von jedem der anderen) beinhaltete, wurde zubereitet. 200 μl dieses Gemischs wurden den Zellen zugesetzt.
Nach 6 Stunden wurden die Zellen einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen, und DMEM-Medium wurde zugesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mittels 250 μl Zelldissoziierungsagens resuspendiert. Nach Neutralisation mit 2200 μl DMEM-Medium, wurden 100 μl dieser Zellsuspension in 96-Lochplatten (Costar) gebracht. Die Zellen wurden mit Erythropoietin oder Erythropoietin plus Forskolin (für die Endkonzentrationen siehe oben) stimuliert. Eine unstimulierte Negativkontrolle wurde ebenfalls in das Experiment mit einbezogen. Luziferaseexpression wurde 24 Stunden nach der Stimulation mittels eines TopCount Chemilumineszenzzählers (Canberra Packard) gemessen. Transfizierte Zellen von den Transfektionen a, b, c, e, f und g zeigten keine signifikante Induktion an Luziferaseaktivität. Transfizierte Zellen von Transfektion d zeigten eine 6,2-fache und eine 10,5-fache Induktion mit Erythropoietin bzw. Erythropoietin plus Forskolin. Das weist auf eine Erythropoietin-abhängige Phosphorylierung des EpoR-Köders hin, die zu einer Wechselwirkung zwischen dem CIS-Protein und EpoR führt. Die Wechselwirkung führt zur Phosphorylierung von gp130, STAT-Aktivierung und daher Signalgebung in Richtung des rPAP1-Promotors, die zu Luziferaseaktivität führt (4).
Beispiel 4: Funktionalität der IRS1-GRB2-Vav-indirekten Wechselwirkungsfalle
Um die IRS1-GRB2-Vav-indirekte Wechselwirkungsfalle zu untersuchen, wurden folgende Plasmidkombinationen in 4 × 10⁵ Hek293T-Zellen transfiziert, die am Tag vor der Transfektion ausgesät worden waren:

Ein 300 μl Präzipitationsgemisch, das 3,05 μg DNS (0,05 μg von pUT651, 1 μg von jedem der anderen) beinhaltete, wurde zubereitet. 200 μl dieser Mischung wurden für 16 Stunden den Zellen zugesetzt. Nach der Transfektion wurden die Zellen einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen und DMEM (beide von Gibco BRL) zugesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mittels 200 μl Zelldissoziierungsagens (Gibco BRL) resuspendiert, das mit 1,8 ml DMEM-Medium neutralisiert wurde. 100 μl der Zellsuspension wurden in einer Costar 96-Lochplatte ausgesät und wurden in einem Endvolumen von 200 μl mit Endkonzentrationen von 100 ng/ml Leptin, 100 ng/ml Leptin plus 10 μM Forskolin oder 10 μM Forskolin stimuliert oder unstimuliert belassen. 24 Stunden nach Stimulation wurden Luziferase- und Galactosidaseaktivitätsassays, wie oben beschrieben, durchgeführt. Von den Ergebnissen (5) können wir schließen, das die Zellen der Transfektionen a, b, c und d keine signifikante Induktion des rPAP1-Promotors zeigen. Zellen von Transfektion e zeigen eine leichte Induktion mit Leptin und eine moderate Induktion, wenn mit Forskolin costimuliert wird (2,5-fach), was eine direkte Wechselwirkung zwischen IRS-1 und GRB2S nahe legt. Transfektionsexperiment f zeigt eine klare Induktion an Luziferaseaktivität mit Leptin (5,2-fach), die stärker ist, wenn mit Forskolin kostimuliert wird (12,0-fach). Das deutet eine Wechselwirkung zwischen IRS1 und Vav an, die vermutlich über endogenes GRB2 vermittelt wird.
Um die Spezifität und die Beteiligung von GRB2 an der Wechselwirkung zu untersuchen, und um zu testen, ob das Signal durch Rekrutierung der gp130-Kette erzeugt wird, wurde eine Reihe an Kontrollexperimenten durchgeführt.
Die folgenden Plasmidkombinationen wurden, auf die gleiche Weise wie oben beschrieben, getestet:

0,05 μg pUT651-DNS und 1 μg pMET7-LepR-IRS1 und pGL3-rPAP1-luci wurden den 300 μl Präzipitationsgemisch zugesetzt. Die Ergebnisse (6) sind als x-fache Induktion gezeigt. Die Ergebnisse zeigen klar eine Dosis-abhängige Inhibition der rPAP1-Induktion, wenn GRB2SH3 überexprimiert wird. Wegen der Kompetition mit endogenem GRB2 um Vav-Bindung, ist die Rekrutierung des gp130-VavS-Fusionsproteins an den Komplex blockiert, was eine Dosis-abhängige Reduzierung der rPAP1-Promotoraktivität ergibt. Daraus schließen wir, dass die spezifische GRB2-VavS-Wechselwirkung für die Induktion der Luziferaseaktivität benötigt wird.
Um die kritische Rolle der Rekrutierung von gp130 bei der Induktion des rPAP1-Promotors zu untersuchen, wurden folgende Plasmidkombinationen wie oben beschrieben transfiziert:

Das 300 μl Präzipitationsgemisch beinhaltete ebenfalls 0,05 μg pUT651-DNS und 1 μg pMET7 LepR-IRS1 und pGL3-rPAP1-luci-DNS. Von den normalisierten Ergebnissen (7) können wir schließen, das gp130 im gp130-VavS-Fusionskonstrukt für PAP1-Promotorinduktion essentiell ist, weil Dosis-abhängige Kompetition mit ungekoppeltem VavS zu einer signifikanten Reduktion an Luziferaseaktivität führt.
Beispiel 5: Optimierung des Verfahrens der Bibliotheksdurchmusterung
Um eine einfache Durchmusterung einer wechselwirkungsabhängigen-cDNS-Bibliothek zu ermöglichen, wurde ein Selektionssystem wie in 8 umrissen entwickelt. Ein HEK293 Zellklon wurde verwendet (i) beinhaltend eine FRT-Integrationskassette in einem transkriptionell aktiven Locus (Flp-In-293 Zelllinie, Invitrogen), (ii) stabil exprimierend den ecotropen retroviralen Rezeptor EcoR der Maus, und (iii) mit einer stabil integrierten pXP2d2-rPAP1-puro^® Selektionskassette, die eine STAT-regulierte Expression des Puromycin-Resistenzgens bewirkt. Klon HEK293-16 zeigte hohe Sensitivität gegenüber Piromycin (1 μg/ml), aber erwarb Puromycin-Resistenz nach LIF (Leukemia Inhibitory-Faktor)-induzierter Aktivierung des endogenen gp130 (9A). Ein Modelldurchmusterungsexperiment schloss die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte mit ein: (i) EpoR-„Köder"-Expression wurde nach Flp-Rekombinase-vermittelter Integration des pcDNA/FRT-EpoR-„Köder"-Vektors erhalten. Isogene Zellen wurden auf Wachstum in Hygromycin-haltigem Medium (100 μg/ml, 10 Tage) selektioniert, und FACS-Analyse mittels anti-EpoR-Antikörpern deutete an, dass beinahe die gesamte Zellpopulation eine homogene Expression des chimären „Köder"-Rezeptors zeigte (9B). (ii) Hygromycin resistente Zellen wurden anschließend 24–48 Stunden lang mit CIS-„Beute"-exprimierendem Retrovirus infiziert. Retroviraler Gentransfer wurde gewählt um Expression von einem einzelnen Integrat zu erzielen (Kitamura et al., 1995; Kojima und Kitamura, 1999). (iii) Die Zellen wurden mit Epo (50 ng/ml) für weitere 24–48 Stunden vor der Puromycin-Selektion behandelt. Wie in 9C gezeigt, wurde Koloniebildung nur in Epo-stimulierten HEK293-16 Zellen, die den EpoR-„Köder"- und gp130-CIS-„Beute"-Proteine koexprimierten, beobachtet. FACS-Analyse mit anti-FLAG-Antikörper von permeabilisierten, Puromycin-resistenten Zellen bestätigte die Expression des „Beute"-Polypeptids (9D). Rasche Identifikation der exprimierten „Beute"-Transkripte wurde mittels eines RT-PCR-Verfahrens durchgeführt. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass alle „Beute"-Polypeptide an humanes gp130 fusioniert sind, wurde ein biotinylierter gp130-spezifischer Primer verwendet, um „Beute"-Transkripte direkt aus Zelllysaten mittels Streptavidin-Magnetkügelchen zu selektieren. Nach reverser Transkription, wurde selektive PCR-Amplifikation des „Beute"-Fragments mittels eines gp130/3'LTR-Primerpaars erreicht. DNS-Sequenzanalyse solcher Amplikons, die zurückgewonnen wurden von Epo-stimulierten, Puromycin-resistenten Zellen, zeigten, dass Transkripte kodierend für gp130-CIS-„Beute" wie erwartet exprimiert wurden (9D, Einschub). Die 9E zeigt die Ergebnisse eines „Spiking"-Experiments, wo eine komplexe retrovirale HEK293-cDNS-Bibliothek mit einer Verdünnungsreihe von Retrovirus, das die gp130-CIS-„Beute" exprimiert, gemischt wurde. Eine Dosis-abhängige Rückgewinnung von Zellklonen wurde nur in Gegenwart des Liganden beobachtet. RT-PCR-Zyklussequenzierung in einem parallelen Experiment erlaubte die Identifikation von gp130-CIS-„Beute"-Expression in 19 von 21 analysierten Klonen.
Beispiel 6: Bibliotheksdurchmusterung mit dem MAPPIT-System
Ein Durchmusterungsexperiment mit dem EpoR-„Köder" wurde mittels einer retroviralen HEK293-cDNS-Bibliothek (2 × 10⁶ unabhängige Klone) durchgeführt. Um Einzelintegranten zu begünstigen, wurden 6 × 10⁷ HEK293-16-Zellen, die den EpoR-„Köder" exprimieren, mit einer geschätzten Infektionseffizienz von 4% infiziert. Drei Wochen nach der Epo-Stimulation und Selektion in Medium mit 2 g/ml Puromycin, wurden 33 Kolonien gepickt und in einem Funktions-Assay analysiert (9F). Weil alle Klone „Köder" und „Beute" stabil koexprimieren, waren wir in der Lage, die spezifische Wechselwirkung mit dem EpoR-Köder" rasch zu zeigen, durch Kotransfektion mit den LR-F3-Konstrukten, denen der „Köder" fehlt, und den rPAP1-Luziferasekonstrukten. Drei Klone zeigten Induktion durch Epo, aber nicht durch Leptin, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung spezifisch mit dem Y402 EpoR-Motiv auftrat. In einem dieser Klone zeigte die RT-PCR-Analyse die Anwesenheit von einem spezifischen 1700-Basen-Amplikon und Zyklussequenzierung offenbarte, dass dieses Fragment für SOCS-2 kodiert, einem weiteren Mitglied der SOCS-Familie. Letzteres wurde im Leseraster innerhalb seiner Prä-SH2-Domäne an gp130 fusioniert (9F). Das unterstreicht erneut den niedrigen Hintergrund, der in diesem Zwei-Hybrid-Verfahren beobachtet wird. Nach Subklonierung in einen Plasmidvektor erwies sich die Liganden-abhängige Phosphorylierung der SOCS2-„Beute" und von STAT3 als abhängig von der Phosphorylierung des Y402 EpoR-Motivs (9G). Das zeigt jeden der Phosphorylierungs (und Wechselwirkungs)-Schritte, die der Reportergen-Aktivierung vorangehen.
Beispiel 7: die Verwendung von MAPPIT mit heterodimeren Rezeptoren: Funktionalität der IL3R-IL5R- und GM-CSFR-LEPR-Chimären in der Hek293T-Zelllinie
Um die Funktionalität der Epo-, IL-3R-, IL-5R- und GM-CSFR-LepR-Chimären zu vergleichen, wurden die folgenden Plasmidkombinationen in 4 × 10⁵ Hek293T-Zellen transfiziert, die am Tag vor der Transfektion ausgesät worden waren:

Ein 300 μl Präzipitationsgemisch wurde wie zuvor beschrieben zubereitet, und beinhaltete 0,05 μg pUT651 und 1 μg jedes der anderen Vektoren. 200 μl dieser Mischung wurden zu den Zellen zugesetzt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mittels Zelldissoziierungsagens resuspendiert und in eine 96-Lochplatte (Costar) transferiert. Die Transfektionen a–g wurden mit 10000, 1000, 100, 10 pg/ml des entsprechenden Zytokins stimuliert. Zellen der Transfektion h, die nur den pSV-SPORT-β_c/LepR exprimieren, wurden wahlweise mit 10 ng/ml Epo, IL-3, IL-5 oder GM-CSF behandelt. Eine unstimulierte Negativkontrolle wurde ebenfalls in das Experiment einbezogen. Die Luziferaseexpression wurde 24-Stunden nach der Stimulation gemessen. Die Ergebnisse sind in 10 aufgeführt. Die EpoR/LepR-Chimäre und eine Kombination von IL-3Rα/LepR mit β_c/LepR haben ähnliche Induktionsvielfache. Ein Signal über dem Hintergrund wird bei Zytokinkonzentrationen von 1 ng/ml beobachtet. Die biologische Aktivität von IL-5 auf Zellen, die mit der IL-5Rα/LepR- und β_c/LepR-Chimäre transfiziert sind, ist weniger als diese für IL-3 oder Epo. Zellen, die mit Chimären von GM-CSFR und des LepR transfiziert wurden, sind weitaus sensitiver gegenüber der Stimulation, mit einer klaren 7.7-fachen Induktion bei einer so geringen Konzentration wie 10 pg/ml. Die Zellen der Negativkontrollen, Transfektionen e, f g und h, zeigten keine signifikante Induktion der Luziferaseaktivität.
Beispiel 8: Funktionalität der Smad3-Smad4-phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle
Um die Funktionalität der Smad3-Smad4-phosphorylierungsabhängigen Wechselwirkungsfalle zu bestimmen, wurden die folgenden Plasmidkombinationen in 4 × 10⁵ Hek293T-Zellen transfiziert, die am Tag vor der Transfektion ausgesät worden waren:

a. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
b. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
c. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
d. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
e. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
f. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
g. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
h. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
i. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.
j. pSV-SPORT-β_c/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1-luci + pUT651.

Ein 300 μl Präzipitationsgemisch, das 2.92 μg (0,02 μg pUT651, 0.2 μg pXP2d2-rPAP1-luci + 0.9 μg jedes der anderen) enthielt, wurde zubereitet. 200 μl dieses Gemischs wurden den Zellen zugesetzt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen einmal mit Dulbecco's PBS gewaschen und DMEM-Medium wurde zugesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mittels 200 μl Zelldissoziierungsagens resuspendiert. Nach Neutralisation mit 2200 μl DMEM-Medium, wurden 40 μl dieser Zellsuspension in eine 96-Lochplatte (Costar) gebracht.
Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 100 μl mit einer Endkonzentration von 1 ng/ml GM-CSF, 1 ng/ml GM-CSF plus 10 μM Forskolin oder 10 μM Forskolin stimuliert oder sie wurden unstimuliert belassen. 24 Stunden nach der Stimulation wurden Luziferase- und Galactosidase-Aktivitätsassays wie oben beschrieben durchgeführt. Aus den Ergebnissen (11) können wir schließen, dass die Zellen von Transfektion c, d, e, f g, h, i, und j keine signifikante Induktion von Luziferaseaktivität zeigten. Zellen der Transfektion a zeigten eine geringfügige Induktion mit GM-CSF (3-fach), die auf 37-fach erhöht wird, wenn mit Forskolin kostimuliert wird. Transfektionsexperiment b zeigt eine klare Induktion des rPAP1-Promotors mit GM-CSF (9-fach), die wiederum stärker ausgeprägt ist, wenn mit Forskolin kostimuliert wird (71-fach). Das weist auf eine Köder-modifizierende Enzymaktivität hin, die ALK4CA-abhängige Phosphorylierung des Smad3-Köders, die zu einer Wechselwirkung zwischen Smad4 und phosphoryliertem Smad3 führt, bewirkt. Die Wechselwirkung führt zur Phosphorylierung von gp130, STAT-Aktivierung und daher Signalgebung in Richtung des rPAP1-Promotors, die zu Luziferaseaktivität fuhrt.
Beispiel 9: Die Verwendung von MAPPIT zur Durchmusterung von Verbindung-Verbindung-Wechselwirkungen umfassend Nicht-Polypeptid-Verbindungen
Ein Experiment wird mit Fujisporin durchgeführt, wobei FK506 chemisch an Cyclosporin A gekoppelt ist (z.B. WO 94/18317). Alternativ erhält man bivalente Verbindungen durch Fusion von FK506 an Tetrazyklin oder an einen Steroidliganden. Solche Hybridverbindungen haben die Kapazität mit beiden Proteinpartnern zu wechselwirken: FKBP12 und Cyclophilin (oder Tetrazyklin/Steroidrezeptoren).
Zellen, die die Rezeptor/FKBP12-Chimäre exprimieren, werden mit der Membranpermeablen divalenten Verbindung behandelt, und werden, nach dem Wegwaschen überschüssiger Verbindung, infiziert oder transfiziert, um die „Beute"-Expression zu verstärken. Alternativ werden sowohl Rezeptor/FKBP12- und „Beute"-Chimäre gleichzeitig vor dem Zusatz der Verbindung exprimiert. Vorsichtige Experimente zur Abhängigkeit von Verbindungsdosis und Wirkung- werden durchgeführt; angesichts des Dimerisierer-Effekts der Hybridverbindungen erhält man glockenförmige Dosis-Wirkung-Kurven. Zusatz an monovalenter Verbindung im Überschuss wird als Spezifitätskontrolle verwendet und reduziert signifikant die Signalausgabe.
Tabelle 1: Oligonukleotide, die für die Konstruktion der beschriebenen Vektoren benutzt wurden
Literaturverzeichnis

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinanter Rezeptor, umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindedomäne und eine von einem Rezeptor abstammende zytoplasmatische Domäne, wobei die zytoplasmatische Domäne ein erstes wechselwirkendes Polypeptid umfasst, das zu der zytoplasmatischen Domäne heterolog ist, wobei der rekombinante Rezeptor durch die Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch die Bindung eines zweiten wechselwirkenden Polypeptids mit dem ersten wechselwirkenden Polypeptid aktiviert wird.
Rekombinanter Rezeptor gemäß Anspruch 1, wobei der rekombinante Rezeptor ein homomultimerisierender Rezeptor ist.
Rekombinanter Rezeptor gemäß Anspruch 1, wobei der rekombinante Rezeptor ein heteromultimerisierender Rezeptor ist.
Rekombinanter Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei die Bindung des zweiten wechselwirkenden Polypeptids von dem Modifikationszustand des heterologen ersten wechselwirkenden Polypeptids abhängt.
Rekombinanter Rezeptor gemäß Ansprach 4, wobei der Modifikationszustand in der An- oder Abwesenheit von Phosphorylierung, Acetylierung, Acylierung, Methylierung, Ubiquitinierung oder Glykosylierung besteht.
Rekombinanter Rezeptor gemäß Anspruch 4, wobei der Modifikationszustand im Auftreten oder Unterbleiben einer proteolytischen Spaltung besteht.
Rekombinanter Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 4–6, wobei die Änderung des Modifikationszustands von der Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne abhängt.
Rekombinanter Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei das zweite wechselwirkende Polypeptid ein Fusionsprotein ist, umfassend ein Polypeptid, das wenigstens eine Aktivierungsstelle eines Rezeptors umfasst.
Rekombinanter Rezeptor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zytoplasmatische Domäne die zytoplasmatische Leptinrezeptordomäne, in welcher wenigstens eine der Tyrosin-Phosphorylierungsstellen inaktiviert wurde, oder ein funktionales Fragment der inaktivierten zytoplasmatischen Leptinrezeptordomäne, umfasst.
Vektor, kodierend einen rekombinanten Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1–9.
Eukaryotische Zelle, umfassend einen rekombinanten Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1–9.
Eukaryotische Zelle gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle eine Säugetierzelle, eine Pilzzelle oder eine Pflanzenzelle ist.
Kit, umfassend einen Klonierungsvektor, der die Konstruktion eines Vektors gemäß Anspruch 10 erlaubt.
In vitro-Verfahren zum Nachweis einer Bindung Verbindung/Verbindung unter Verwendung eines rekombinanten Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1–9.
Verfahren zum Nachweis einer Bindung Verbindung/Verbindung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindung vom Modifikationszustand abhängig ist.
Verfahren zum Nachweis einer Bindung Verbindung/Verbindung gemäß Anspruch 15, wobei die Modifikation Phosphorylierung, Acetylierung, Acylierung, Methylierung, Ubiquitinierung oder Glykosylierung ist.
Verfahren zum Nachweis einer Bindung Verbindung/Verbindung gemäß einem der Ansprüche 14–16, wobei die Bindung durch drei oder mehr Partner vermittelt wird.
Verfahren zum Nachweis einer Bindung Verbindung/Verbindung gemäß Anspruch 17, wobei wenigstens einer der Partner nicht oder nicht vollständig proteinöser Natur ist.
System zur Durchmusterung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wobei das System Folgendes umfasst: 1) einen rekombinanten Rezeptor, umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindedomäne und eine von einem Rezeptor abstammende zytoplasmatische Domäne, wobei die zytoplasmatische Domäne ein erstes wechselwirkendes Polypeptid umfasst, das zu der zytoplasmatischen Domäne heterolog ist, 2) ein Fusionspolypeptid, umfassend ein zweites wechselwirkendes Polypeptid und ein Polypeptid, umfassend wenigstens eine Aktivierungsstelle eines Rezeptors, und wobei der rekombinante Rezeptor durch die Bindung eines Liganden an die Ligandenbindedomäne und durch die Bindung des ersten wechselwirkenden Polypeptids an das zweite wechselwirkende Polypeptid aktiviert wird.