JP2000506007A - 細胞によるアッセイ - Google Patents

細胞によるアッセイ

Info

Publication number
JP2000506007A
JP2000506007A JP9530305A JP53030597A JP2000506007A JP 2000506007 A JP2000506007 A JP 2000506007A JP 9530305 A JP9530305 A JP 9530305A JP 53030597 A JP53030597 A JP 53030597A JP 2000506007 A JP2000506007 A JP 2000506007A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
domain
binding
cell
cells
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9530305A
Other languages
English (en)
Inventor
リックルス，リチャード・ジェイ
Original Assignee
アリアド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アリアド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド filed Critical アリアド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Publication of JP2000506007A publication Critical patent/JP2000506007A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/72—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing SH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホペプチド結合対、即ち、少なくとも１つのホスホペプチド結合ドメインを有するタンパク質ドメインとこれらのドメインを結合させるリン酸化ドメインとの間の相互作用の阻害剤を同定するための方法および物質を提供する。この阻害剤は薬剤組成物に対しておよびホスホペプチドドメイン結合が関与する疾患の治療に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞によるアッセイ 発明の技術分野 本発明はある種の分子相互作用の阻害剤を同定するための材料および方法に関 する。発明の背景 細胞シグナル伝達、即ち、細胞外事象から細胞内結末に至る一連の事象は、正 常と病気の両方の状態における細胞機能の１つの様相である。シグナル伝達分子 として機能する数多くのタンパク質がこれまでに同定されており、それには受容 体および非受容体チロシンキナーゼ類、ホスファターゼ類、ならびに酵素もしく は調節活性を持つ他の分子が含まれる。これらの分子は一般に、他のタンパク質 と特異的に会合して、細胞活性を変質させ得るシグナリング複合体を形成する能 力を示す。 シグナリングタンパク質は、シグナル伝達中にタンパク質−タンパク質相互作 用を命令する非触媒モジュールとして作用する、保存配列のドメインをしばしば 含んでいる。かかるドメインの１例はSrcホモロジードメイン２(SH2)であり、こ れは種々のタンパク質の多様な組合わせおよび位置で見出されている。例えば、 一部のSrcファミリーのチロシンキナーゼ（例、Ab1、GRB2およびP13K）は、どれ もSH2ドメインを１つずつ含んでいる。ZAPやSykのような別のチロシンキナーゼ は、SH2ドメインを２つずつ含んでいる。１つのタンパク質中に複数のSH2ドメイ ンが存在すると、可能なタンパク質−タンパク質相互作用の多様性が大きくなる 。 SH2ドメインは、ホスホチロシンを含有するタンパク質配列またはモチーフに 選択的かつ特異的に結合することにより、特定のタンパク質またはタンパク質ド メインとの会合を命令する。例えば、リガンド結合により、PDGFβ受容体は二量 体化し、複数のチロシン残基を自己リン酸化させる。この受容体内部でのチロシ ン含有タンパク質モチーフのリン酸化は、c-src、PLC-γ、P13Kおよびras-GAPの ようなSH2含有タンパク質とのその物理的会合を発動させ、シグナリング複合体 を形成する。他の例としては、縦列SH2含有タンパク質であるSykによるIgE受容 体のβもしくはγサブユニット上のチロシン−リン酸化モチーフへの結合、なら びに縦列SH2含有タンパク質であるZAP-70によるＴ細胞受容体のサブユニット上 のチロシン−リン酸化モチーフとの結合が挙げられる。チロシンリン酸化された タンパク質ドメインに対する別のタンパク質受容体も知られており、これには、 いわゆるホスホチロシン結合ドメイン(”PTB”)またはホスホチロシン相互作用 ドメイン(”PID”)が含まれる。病気のプロセスに決定的役割を果たす多くのシ グナリング経路が、ホスホチロシンを含むタンパク質もしくはタンパク質ドメイ ンとチロシンリン酸化ドメインのSH2または他のタンパク質受容体との結合によ り媒介される。 このようなシグナリング複合体の形成または安定性を妨げる薬剤を、このよう なシグナリングが媒介する病気または病理作用の治療または予防を目的として、 これらの複雑な生物学的プロセスの厳密な介入を行うために使用できるかも知れ ない。しかし、特定の細胞事象を妨害する薬剤に有用な化合物をスクリーニング する場合の一般的だが大きな１つの問題は、そのメカニズムと作用の特異性を解 読することである。典型的には、特に興味あるタンパク質−タンパク質相互作用 の、多くないまでも数工程だけ下流の事象に対する試験化合物の効果を測定する ことにより、シグナリングカスケードの阻害について調査する。ある化合物がど のような数の中間工程にもその効果を発揮する可能性があるという点で、このよ うな実験の結果は解釈するのが困難となることがある。 多様な分子の相互作用を検出するには、SongとFieldsが報告したいわゆる「ツ ーハイブリッド(two-hybrid)」相互作用アッセイが使われてきた[Nature，340： 245-247(1989)]。Fieldsら、米国特許第5,283,173号（1994年２月１日）も参照 。このツーハイブリッドアッセイは、転写因子がDNA結合または転写活性化のど ちらかを命令する分離しうる機能性モジュールを含んでいるという観察に基づく ものである。細胞内で発現されたDNA結合ドメインは、DNAには結合するが、転写 活性化ドメインが欠如しているので転写を活性化することはない。逆に、転写 活性化ドメインだけでは、DNA結合ドメインにより与えられるような、DNAとの命 令されたおよび／または緊密な相互作用が存在しないと、転写に影響を及ぼさな いであろう。しかし、DNA結合ドメインと転写活性化ドメインが別々の融合タン パク質の一部としてそれぞれ発現され、それらの融合タンパク質が会合すること ができると、こうして形成された「ツーハイブリッド」複合体が再構成転写因子 を表す（図１を参照）。このような再構成転写因子は、DNA結合ドメインが認識 するDNA結合部位の下流に位置するリポーター遺伝子（例、β−ガラクトシダー ゼもしくはアルカリ性ホスファターゼ(SEAP)のような検出に都合のよいマーカー または細胞生存性にとって重要なタンパク質に対する遺伝子）の転写を開始する ことができる。リポーター遺伝子の発現量、即ち、遺伝子産物の産生量は、融合 タンパク質が互いに複合する程度を反映していよう。融合タンパク質の会合を妨 げる化合物は、リポーター遺伝子発現を減少させよう。 ツーハイブリッドアッセイ手法を使用して、仮定されたSH2依存性タンパク質 −タンパク質相互作用の酵母を用いた同定が行われた[Xing，Z．et al.，Mol．B iol．Cell，5:413-412（1994）およびOsborne，M.A．et al.，Biotechnol.，13 ：1474-1478(1995)]。それらの実験では、タンパク質結合対（このような結合の 阻害剤ではなく）が同定された。ツーハイブリッド手法はまた、酵母におけるあ る種のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害を検出するのにも使用されたが、 リン酸化リガンドやそれらの受容体が関与するタンパク質−タンパク質相互作用 の阻害に対してではなかった[Chaudhuri，B．et al.，FEBS Lett.，357:221-226 (1995)]。酵母によるツーハイブリッド手法は他の目的には有用であるかもしれ ないが、哺乳類細胞でホスホペプチド媒介相互作用を阻害する薬剤をスクリーニ ングするのには役に立たないであろう。なぜなら、酵母細胞の使用は、研究者を 酵母細胞壁を通過することができる種類の化合物に制限してしまうか、または少 なくともこの種の化合物に「命中」することになろう。この人工的な制限により 、実験的な薬剤分子の設計に対して、哺乳類細胞における主要なシグナリング相 互作用を妨げることができるが、酵母細胞壁を通過することができない重要な新 しい化合物を逃してしまう危険性が入り込むことになろう。 従って、本技術分野では、多様な宿主細胞中でホスホペプチド媒介タンパク質 −タンパク質結合の阻害剤を同定するための改善された方法および組成物が今な お要請されている。発明の要約 本発明は、特定のシグナル伝達経路に関与する主要分子を標的とする阻害性化 合物の同定を可能にする、メカニズムに基づくin vivoアッセイを提供すること により、この要請に取り組んだものである。 本発明は、一対の融合タンパク質をコードする組換えDNA分子を含み、かつこ の分子を発現することができる細胞を提供する。１つのDNA分子は、１もしくは ２以上の転写活性化ドメイン(TAD)と、ホスホペプチド結合対、即ちホスホペプ チド結合ドメインもしくはそのペプチドリガンド、の少なくとも一方のメンバー とを含む、転写を活性化させる（転写活性化性の）融合タンパク質をコードする 。別のDNA分子は、１もしくは２以上のDNA結合ドメイン(DBD)と、ホスホペプチ ド結合対の残りのメンバーとを含むDNA結合融合タンパク質をコードする。この 細胞はさらに、DNA結合融合タンパク質が結合することができるDNA配列に連結し たリポーター遺伝子を含んでいる。このリポーター遺伝子は、例えば前記の２つ の融合タンパク質が会合して有効な転写因子を再構成した後に、リポーター遺伝 子の転写を活性化させた時に発現される検出可能な遺伝子産物をコードする。こ の遺伝子工学操作された細胞はさらに、ツーハイブリッド形成のために必要とさ れるような前記ペプチドリガンドの１もしくは２以上のチロシン残基をリン酸化 することができるプロテインキナーゼを含んでいる。このキナーゼは、該細胞に 対して内在性であってもよく、或いは導入された異種遺伝子の遺伝子産物であっ てもよい。１態様において、融合タンパク質の１つはキナーゼドメインを含み、 そのため、それ自身のキナーゼ機能を与える。融合タンパク質の一方または両方 が、融合タンパク質の調節性隔絶(regulated sequestering)または不活性化が可 能な核内(nuclear)ホルモン結合ドメイン(HBD)を任意に含んでいてもよい。この ような態様では、そのホルモンの添加により、HBDを保有する融合タンパク質が ツーハイブリッド形成に利用可能となる。この細胞が２つの融合タンパク質を発 現し、ペプチドリガンドドメインがチロシンリン酸化されてしまうと、２ つの融合タンパク質は、一方の融合タンパク質のリン酸化ペプチドリガンドが他 方の融合タンパク質のPBDと複合化することにより、互いに結合することができ る。このように複合化すると、融合タンパク質は、その融合タンパク質の一方の DNA結合ドメインにより認識（即ち、結合）されたDNA配列に連結したリポータ− 遺伝子の転写を検出可能に活性化することができる。 本発明の１つの目的は、上記のDNA分子を提供することである。別の目的は、 このDNA分子を宿主細胞に導入して、ここに説明するアッセイ方法を実施するの に有用な遺伝子工学操作された細胞を提供することである。 本発明の別の目的は、チロシンリン酸化されたリガンドとそれに対するホスホ ペプチド結合ドメインとの結合、またはそのホスホペプチド結合対が媒介する生 物学的活性、の阻害剤が試験材料中に存在するか否かを同定する方法を提供する ことである。この方法は、試験材料の存在下および不存在下で、上記の遺伝子工 学操作された細胞を細胞増殖に適した培地中で培養または維持し、検出可能なリ ポーター遺伝子産物の産生が試験材料の存在下で減少したか否かを決定すること を包含する。実際には、試験材料を上記細胞、例えば、この細胞を培養している 培地に添加し、培養液を融合タンパク質間の複合体の形成が可能な条件下で培養 する。ホルモン調節を含む態様では、試験材料の添加前、添加中、または往々に して好ましいことがあるように、添加後にホルモンを添加すればよい。転写活性 化性の融合タンパク質へのDNA結合融合タンパク質の結合が、試験材料を存在さ せない場合より存在させた方が非常に少ない程度にしか起こらない、即ち、試験 材料の存在または濃度増大によりツーハイブリッド複合体の濃度が低下する場合 には、試験材料は、ホスホペプチド結合対の阻害剤であるか、これを含有するこ とになる。ツーハイブリッド複合体の存在または不存在は、リポーター遺伝子の 発現のレベルを測定することにより監視してもよい。 リキャップ(recap)するには、例となるin vivoアッセイのフォーマットは、PB Pが媒介する転写制御下でリポーター遺伝子を発現することができる遺伝子工学 操作された細胞に頼る。このような細胞は、対象のホスホペプチド結合ドメイン と、対応するペプチドリガンドとを、それぞれ別個の融合タンパク質の形態で含 んでいる。従って、このような融合タンパク質はいずれも、コンポーネント領 域としてとりわけ、少なくとも１つのPBDまたはペプチドリガンド配列を持って いる。上記の２つの融合タンパク質は、一方の融合タンパク質のチロシンリン酸 化されたリガンドドメインが他方の融合タンパク質のPBDに結合することによっ て互いに複合体を形成することができるように設計される。別に説明するように 、このリガンドドメインをチロシンリン酸化することができるキナーゼ活性の存 在下、およびホルモンに依存する態様では必要なホルモンの存在下で、リポータ −遺伝子の転写に必要なツーハイブリッド複合体の形成または持続を妨害する阻 害性物質が存在しなければ、上記細胞はリポーター遺伝子を発現する。このアッ セイでは、細胞を適当な培地中で培養または維持して、リポーター遺伝子の発現 のための基準を確立する。この培地に試験材料を添加し、試験材料がリポーター 遺伝子の発現を阻害する能力を測定する。異なる濃度の試験材料を用いた一連の 実験を並行して実施してもよい。試験材料の存在下でリポーター遺伝子の発現の レベルが低下する場合には、試験材料は阻害剤である。こうして同定された試験 材料の構造がなお不明の場合には、その化合物を他のアッセイ成分から分離し、 特性決定してもよい。所望により、類似の融合タンパク質を発現するが、別のPB Dおよび／またはペプチドリガンドドメインを保有する遺伝子工学操作された細 胞を用いて、この阻害剤を再評価してもよい。これは、その阻害剤と、それを同 定したPBPとの間の相互作用の選択性を確認する手段ともなる。所望により、こ の阻害剤の同定に使われたPBDまたはペプチドリガンドドメインに対する該阻害 て同定された阻害剤は、上述したin vitro結合アッセイ法で測定してもよく、さ らに所望に応じて各種のin vitroおよび／またはin vivoアッセイ法により薬理 作用および／または毒性作用について評価してもよい。 本発明に従って多様な試験材料を評価することができ、そのような材料の例と しては、微生物ブロス、細胞抽出物、細胞系から又は遺伝子ライブラリで形質転 換された宿主細胞から得られた調整培地、合成化合物の収集物、慣用の製薬化学 手法もしくは構造による薬品設計に基づいた合成プログラムから得られた組合わ せライブラリーまたは他の化合物もしくは混合物が挙げられる。 かくして、本発明はホスホペプチドが結合する相互作用の選択的阻害剤を同定 する手段を提供する。冒頭に述べたように、ホスホペプチド結合ドメインは、多 くの重要な正常および病気のプロセスに関連する細胞内シグナル伝達経路に関与 するタンパク質をはじめとする、多様なタンパク質中に存在している。従って、 本発明を利用して同定された阻害剤は、多様な目的に有用である可能性がある。 まず、これらの阻害剤は、特定のタンパク質、特に新たに発見されたタンパク質 のホスホペプチドドメインまたはホスホペプチド受容体の機能分類のために、こ こに説明したようなアッセイにおける生物学的試薬として使用できよう。こうし て、このようなタンパク質のファミリーまたはクラスを、結合特異性に関して機 能的に定義してもよい。 さらに、本発明の阻害剤は、ホスホペプチド結合ドメインが媒介する分子相互 作用から起こる生物学的事象の出現を阻害するのに使用できる。本発明はかくし て、ホスホペプチド結合ドメインを含むタンパク質とそれに対する天然リガンド （即ち、正常では細胞内でSH2、PIDまたは他のホスホペプチド結合タンパク質に 結合するタンパク質）との間の相互作用、またはこのような相互作用が媒介する 生物学的活性、を阻害する（完全または不完全に）ための方法および試薬を提供 する。研究関係では、シグナリング事象の生物学的役割と関係したシグナル伝達 経路の細胞および分子生物学の研究のために、この阻害剤を利用することができ る。 本発明の方法により同定された阻害剤は、慣用の材料および手段を用いて、薬 剤に許容される担体および／または他の賦形剤を含有する薬剤組成物に処方する ことができる。このような組成物を、ホスホペプチド／PBDが媒介するタンパク 質−タンパク質相互作用がからんだ細胞事象から起こる疾患または症状の予防ま たは治療のために、動物（ヒトまたはヒト以外）に投与することができる。この ような組成物の投与は、本技術分野で周知のように、適当な処方を用いて任意の 通常の投与経路（非経口、経口、吸入など）によればよい。本発明の阻害剤は慣 用の賦形剤、即ち、非経口投与に適した薬剤に許容される有機または無機担体物 質と混ぜて用いることができる。従って、これらの方法により初めて同定された 阻害剤、このような阻害剤を含有する薬剤組成物、ならびにこのような阻害剤を 天然のホスホペプチド結合対の結合性相互作用により媒介される病気の治療もし くは予防のために患者に投与することを含む薬学的方法も、本発明の重要な目的 である。 本発明の他の様相および利点については、以下の本発明の好適態様の詳細な説 明でさらに述べられている。図面の簡単な説明 図１は、本発明の各種のアッセイ形態を示す。 図２は、哺乳類細胞中でのゼータ(ζ)ITAM-縦列ZAPSH2依存性ツーハイブリッ ド形成の結果を示す棒グラフである。分泌アルカリ性ホスファターゼ(SEAP)活性 (RU)が、グラフの各欄に対応する下記DNAを受けた細胞に対してプロットされて いる：（1）キャリアーDNA、（2）pMSZ（実施例1D）、（3）pMSZとpMAZ22（実施 例1E）、（4）pMS（GAL4 DNA結合ドメイン-vSrcキナーゼ）、および(5)pMSとpMA Z22。 図３は、エストロゲン調節アッセイ系を示す。この棒グラフは、浦乳類G5IL-2 HT1080細胞中でのζITAM−縦列ZAP SH2依存性ツーハイブリッド形成についてエ ストロゲンの存在下(+)および不存在下(-)で観察された結果を示す。プラスミド DNAを受けた細胞に対するSEAP活性が２回ずつプロットされている：即ち、１欄 と２欄がキャリアーDNA、３欄と４欄がpMSZ、５欄と６欄がpMSZとpMAZ22、７欄 と８欄がpMerSZ（実施例1F）、そして９欄と10欄がpMerSZとpMAZ22である。 図４は、それぞれ誘導物質（エストロゲン）の存在下（濃色の棒）または不存 在下（淡色の棒）で増殖させた４種類の安定なクローンＡないしＤに対するSEAP 活性単位をプロットしたZAPツーハイブリッドアッセイの棒グラフである。 図５は、培地へのエストロゲン添加後０分から24時間の時間に対する、誘導ζ ITAM−縦列ZAP SH2依存性ツーハイブリッド活性を持つクローンＤにおけるSEAP 産生(RU)の時間経過をプロットした棒グラフである。このグラフはまた、親細胞 （遺伝子工学操作していないG5IL-2 HT1080細胞）がエストロゲンの存在下(+)ま たは不存在下(-)で培養した時にSEAPを産生しないことも示している。 図６は、下記のグラフ中の欄に対応するプラスミドDNAでトランスフェクショ ンされた哺乳類細胞中での特異的βITAM-Src SH2依存性ツーハイブリッド形成に 対して、SEAP活性(RU)をプロットした棒グラフである：(1)pMSB（実施例1K）、 （2）pMSBとpMAS2(実施例1N)、または(3)pMSBとpMAZ22。 図７は、哺乳類細胞中でのβITAM-Src SH2依存性ツーハイブリッド形成のエス トロゲン調節に対してSEAP活性(RU)をプロットした棒グラフである。エストロゲ ンの存在下(+)または不存在下(-)が表示されている。各欄は、pMerSB（実施例1L ）で［１欄と２欄］、またはpMerSBとpMAS2(実施例1N)とで［３欄と４欄］トラ ンスフェクションされた細胞を２つずつ表す。 図８は、エストロゲンの存在下(+)または不存在下(-)で誘導GAL4-エストロゲ ン受容体1.b.d.-VP16転写活性化剤を含有する安定な哺乳類細胞系のSEAP活性(RU )をプロットした棒グラフである。 図９は、一過性トランスフェクションにより（図９、パネルＡ）グラフの１〜 ４欄）または安定な細胞系を使用した場合（図９、パネルＢ、５欄と６欄）に観 察された浦乳類細胞中でのβITAM-Fyn SH2依存性ツーハイブリッド形成のエスト ロゲン調節に対して、SEAP活性(RU)をプロットした棒グラフである。エストロゲ ンの存在下(+)または不存在下(-)が表示されている。各欄は、pMerSB（実施例1L ）で［１欄と２欄］、またはpMerSBとpMAF2（実施例1P）とで［３欄と４欄］ト ランスフェクションされた細胞を２つずつ表す。５欄と６欄は、エストロゲンの 不存在下（５欄）または存在下（６欄）で培養されたpMerSBとpMAF2の両方を含 有する安定な細胞系（実施例２に記載のように調製）を表す。発明の詳細な説明 本発明は、ある種のシグナル伝達経路に関与する主要な分子の阻害剤を同定す るためのメカニズムに基づく細胞ツーハイブリッドアッセイを提供することによ り、新薬発見の技術分野における現在の要求に取り組んだものである。本アッセ イは、試験化合物または未知化合物が特定のホスホペプチドが媒介する会合を妨 げることができるかどうかを決定することができ、またそのような阻害剤の同定 と機能の特性決定のための組成物と方法を提供する。本発明により、あるタンパ ク質のSH2、PIDまたは他のホスホペプチド結合ドメインとその天然のリガンドと の間の分子会合の阻害剤の同定が可能になる。こうして同定された阻害剤は、 それ自体が治療用および薬剤組成物および療法に有用である。 数ある特徴の中で、本発明は、チロシンリン酸化リガンドとそのホスホペプチ ド結合タンパク質との結合により媒介される相互作用を妨げ、阻害し、さもなく ば妨害する化合物の高処理量(high throughput)同定に有用な、遺伝子工学操作 された細胞、好ましくは真核細胞を提供する。本発明の細胞は、リポーター遺伝 子および２つの融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、またこれを発現する ことができる。この２つの融合タンパク質の一方はホスホペプチド結合ドメイン を含み、他方はそのPBDのリガンドを含んでいる。これら２つの融合タンパク質 は互いに結合することができ、そうなった時には該リポーター遺伝子の転写を検 出可能に活性化することができる。 融合タンパク質の一方または両方は、その融合タンパク質を所望の細胞位置も しくは区画に、または不活性な高次構造(conformation)に調節可能に隔絶するこ とができるドメインを含む、１または２以上の任意のドメインまたはエレメント をさらに含んでいてもよい。 本発明を実施する際には、上記成分(components)を含む細胞を、細胞増殖とリ ポーター遺伝子の検出可能な発現レベルを可能にする適当な培地中で適当な条件 下で培養する。試験物質を培地に添加し、細胞を適当な培養時間、即ち、阻害剤 が細胞に入り込み、ツーハイブリッド形成または持続を妨げ、リポーター遺伝子 発現に検出可能な変化を生ずるだけの時間、培養する。その後、リポーター遺伝 子の発現レベルを測定する。リポーター遺伝子の発現レベルの低下は、試験物質 が阻害剤の候補であることを意味する。 本アッセイを、リポーター遺伝子とその関連する調節エレメントを含み、さら に陽性（正の）対照として、転写因子融合タンパク質をコードする遺伝子を含み 、かつこれを発現することができる対照細胞を用いて繰り返してもよい。転写因 子融合タンパク質は、DNA結合ドメインとリポーター遺伝子の転写を作動させる 転写活性化ドメインの両方を含んでいる。DBDおよびTADは、それぞれDNA結合お よび転写活性化融合タンパク質中に別々に存在する典型的には同じドメインであ る。或いは、対照細胞は、転写因子融合タンパク質の代わりに、上述したような 一次(primary)ツーハイブリッドアッセイ細胞によって発現されるホスホペプ チド結合対ではなく、異なるタンパク質結合対に基づいて設計された２種類の別 のツーハイブリッド融合タンパク質を発現するものでもよい。試験物質が、この ような対照中でリポーター遺伝子の発現レベルを有意に変化させないのであれば 、試験物質が不可逆的なメカニズムにより本アッセイまたは本アッセイの測定値 を一般的に阻害するのではないという結論を裏付けている。このような対照は、 阻害剤の候補のホスホペプチド結合性阻害剤の状態確認を助ける。Ｉ．定義 本発明の理解を容易にするために、以下の定義を行う： 本明細書で用いた「ペプチドリガンド」とは、１または２以上のチロシン残基 を含み、かつ少なくとも１つのペプチドリガンドのチロシン残基がリン酸化され た時にSH2またはPIDドメインのようなホスホペプチド結合ドメインに結合するこ とができる、ポリペプチドモチーフまたはその断片を意味する。ペプチドリガン ドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片もしくは一部で よい。（「ポリペプチド」と「タンパク質」という用語は、本書では互いに交換 可能な用語として使用している。） 「ホスホペプチド結合ドメイン」(PBD)は、特徴的なチロシンリン酸化リガン ドに選択的かつ特異的に結合することができる、典型的にある種のシグナリング タンパク質中に存在するアミノ酸配列またはポリペプチド領域である。チロシン リン酸化リガンドのPBDへの結合は、そのタンパク質の会合または細胞内シグナ ルの伝達を媒介または命令すると考えられている。 「ホスホペプチド結合対」(PBP)は、１つのPBDとその１つのペプチドリガンド とからなる。 「SH2ドメイン」は、PBDの１例である。「SH2リガンド」はペプチドリガンド の１例である。 「ホスホペプチド結合対阻害剤」は、PBDとそのチロシンリン酸化ペプチドリ ガンドとの間の結合の形成または維持の阻害作用を示すことができる化合物であ る。ホスホペプチド結合対阻害剤は、あるPBDにそのPBDのあるチロシンリン酸化 ペプチドリガンドに対して競合的アビディティーにより結合するか、そのPBD のチロシンリン酸化ペプチドリガンドにそのPBDに対して競合的アビディティー により結合するか、さもなくばあるPBDとあるチロシンリン酸化ペプチドリガン ドとの間の正常な結合を破壊することにより、機能することができる。 「DNA結合ドメイン」(DBD)は、あるDNA配列、典型的には標的またはリポータ ー遺伝子に結合した転写調節DNAエレメント、に結合するポリペプチドまたはタ ンパク質ドメイン、例えば、転写因子の一部、である。 「転写アクチベーター（活性化）ドメイン」(TAD)は、標的遺伝子の転写調節D NAエレメントに近接している場合に、遺伝子転写を活性化させる（そして典型的 には核局在化配列に結合する）ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン、例えば 、転写因子の一部、である。 「リポーター遺伝子」は、発現されると検出可能な遺伝子産物を産生する遺伝 子である。 「DNAエレメント」なる用語は、DBDに結合し、適切な転写因子またはツーハイ ブリッド複合体の存在下で転写を可能にする、典型的には標的またはリポーター 遺伝子の上流にある、転写調節DNA配列を意味する。 「DNA結合融合タンパク質」は、PBPの一員の少なくとも１コピーにDBDの少な くとも１コピーが融合してなる融合タンパク質である。「転写アクチベーター融 合タンパク質」は、TADの少なくとも１コピーがPBPの別のメンバーの少なくとも １コピーに融合してなる融合タンパク質である。II ．本発明の遺伝子工学操作された細胞 Ａ．宿主細胞 本発明の新規な遺伝子工学操作された細胞を調製するのに、異種DNAによる形 質転換が可能で、培養により増殖または維持することができる任意の真核細胞を 使用できる。しかし、現時点では哺乳類細胞が好ましい。哺乳類細胞としては、 制限されないが、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、イヌ、ウシまたはヒト を含む霊長類由来のものが挙げられる。細胞は、制限されないが、マスト細胞、 繊維芽細胞、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、好中球、他のＴ細胞、上皮 細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、その他の細胞タイプを含む、多様な組織タイ プのものでよく、一次細胞でも細胞系でもよい。 酵母細胞も本発明の宿主真核細胞として使用できる。 本発明の宿主細胞は、DNA結合融合タンパク質と転写アクチベーター融合タン パク質との「ツーハイブリッド」複合体に応答したDNAエレメントの転写調節下 に、リポーター遺伝子を含む異種DNA、ならびに融合タンパク質をコードし、そ の発現を命令することができる異種DNAをその中に導入することにより遺伝子工 学操作される。 ２つの融合タンパク質をコードするDNA分子、ならびにリポーター遺伝子とそ の関連したDNAエレメントは、別々のDNAとして、または１または２以上のDNAを 一緒に連結させて、宿主細胞中に導入しうる。 Ｂ．リポーター遺伝子作成物 適当なリポーター遺伝子には、その発現が検出可能であるあらゆる遺伝子が含 まれる。多くのこのような遺伝子が本技術分野で知られており、それには、制限 されないが、検出可能な色の変化を生ずる反応を触媒する酵素をコードするもの 、他では毒性の剤の存在下もしくは他では必須栄養素の不存在下で持続した細胞 増殖もしくは生存を可能にする酵素をコードするもの、その「リポーター」遺伝 子の発現の低減により活性化もしくは増進される生物学的機能のリプレッサーも しくはサプレッサー、または単純に検出に都合がよい遺伝子が含まれる。 本発明を実施するのに使用しうるリポーター遺伝子の例としては、制限されな いが、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよ び西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素をコードする遺伝子が挙げられる。 これらの遺伝子でコードされるタンパク質は、容易に検出できる産物を生成する 反応を触媒する。また、リポーター遺伝子は、Thy1のような容易に検出できる細 胞表面マーカーか、または好ましくは市販の好都合なアッセイが利用できるhGH のような分泌タンパク質をコードするものでもよい。周知の１つのリポーター遺 伝子は、本明細書の実施例でも使用している、分泌アルカリ性ホスファターゼ(S EAP)をコードする遺伝子である[Berger，J.，et al.，Gene，66:1-10(1988)]。 SEAPの産生は、細胞を溶解する必要がなく、培地から監視することができる。 そのため、本発明のアッセイ中の種々の時点で、慣用の比色または蛍光定量法を 用いて好都合な検出が可能となる。 リポーター遺伝子は、DBDにより認識され、ツーハイブリッド形成（即ち、第 １および第２の融合タンパク質の複合体化）に応答した遺伝子発現を可能にする DNAエレメントに連結される。DNAエレメントは、TATAボックスエレメントの上流 の複数のDBD結合部位からなる合成プロモーター配列を含んでいてもよい。この ような結合部位の数は、本発明の融合タンパク質により誘導されるリポーター遺 伝子発現の全体レベルを最適化するように調整することができる。このような結 合部位の例としては、GAL4結合部位が挙げられる［例えば、Acheson 「DNA腫瘍 ウイルス」Cold Springs Harbor，NY(Tooze，J.編，1980)，pp151-160；Ped en et al.，Scienece，209:1392-1396(1980)；Liu & Green，Cell，61:1217-1224(1 990);およびPtashne & Gann，Nature，346:329-331(1990)を参照］。 リポーター遺伝子のDNAエレメントは、細胞内に導入された場合、外部から添 加された第２の融合タンパク質のDBDの不存在下では好ましくは占拠されないで あろう。このDNAエレメントの占拠の程度を、融合タンパク質、キナーゼドメイ ンまたは転写因子融合タンパク質の不存在および存在下でリポーター遺伝子転写 のレベルを測定することにより決定してもよい。 例として、本発明の１つの具体的態様では、反復したGAL4結合部位を含むDNA エレメントに連結したSEAPをコードするDNAを含むリポーター遺伝子作成物を使 用する。このリポーター遺伝子に対する適当なプロモーターの使用に関するそれ 以外の指針を、Fields et al.,米国特許第5,283,173号（1994年２月１日）およ びVasavada et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，88:10686-10690（1991）か ら得てもよい。 Ｃ．融合タンパク質作成物 本発明の２つの融合タンパク質は、典型的には、(a)１もしくは２以上のDNA結 合ドメイン(”DBD”、これは同じものでも異なるものでもよい)か、または(b)１ もしくは２以上の転写活性化ドメイン(”TAD”、これは同じものでも異なるもの でもよい）のいずれかを、１もしくは２以上のホスホペプチド結合ドメインもし くはそれに対するペプチドリガンドに加えて、含んでいる。例えば、１態様にお いて、第１の融合タンパク質は１つのSH2ドメインまたは縦列SH2領域（２つのSH 2ドメイン）と１つの転写活性化ドメインとを有し、一方、第２の融合タンパク 質は１つのDNA結合ドメインと１つのSH2リガンドドメイン（これはチロシンリン 酸化後にSH2ドメインに結合することができる）とを有する。 ・第１融合タンパク質：SH2ドメイン-TAD ・第２融合タンパク質：DBD-SH2リガンド 好適態様においては、後でより詳しく説明するように、第２融合タンパク質は、 ホルモンリガンド結合ドメイン、およびDBDとSH2リガンドドメインを連結するプ ロテインチロシンキナーゼドメインを含んでいる。 この２つの融合タンパク質のDBDとTADは、典型的には転写因子を起源とする。 DBDとTADは同じまたは異なる転写因子に由来するものでよく、遺伝子工学操作に より最適化してもよい。DBDとTADは、しばしば分離可能なDNA結合および転写活 性化ドメインを有する転写因子に由来する。 ｉ．転写因子 活性のために２つのサブユニットを必要とする転写因子、即ち、１つの転写因 子を２つの別個の機能ドメイン（例、TADとDBD)に分けることができるもの、は 多数が知られている。各ドメインはそれ単独では（転写に）不活性であるが、対 をなすコンポーネントが近接していると活性な転写因子となる。 本発明で使用できる転写因子としては、酵母GAL4が挙げられ、これは２つのド メインに分けることができる[Ma & Ptashne，Cell，48:847-853（1987）および 米国特許第5,283,173]。例えば,GAL4(1-147)-SNF1とSNF4-GAL4(768-881)との融 合を使用してもよい。ここで、SNF1とGAL4は、結合ドメインとして本発明の結合 タンパク質で置換してもよい。GAL4とVP16との、またはHNF-1とVP16との組合わ せを用いることもできる。これらの各タンパク質は、連結されたパートナー、つ まり相互作用対の部分を有していよう。相互作用（結合パートナーの認識）は、 TAD(VP16)をDNA(GAL4またはHNF-1)に導き、転写が誘導されよう。本発明の方法 に使用してもよい他の転写因子としては、これらに限られないが、Jun，Fos， およびATF/CREBファミリーのメンバー、Oct1，Sp1，HNF-3，ステロイド受容体ス ーパーファミリーなどが挙げられる。本発明を実施するのに使用しうる他のTAD およびDBDは本技術分野で周知である。 転写因子は所望の宿主細胞に対して内在性でも外在性でもよい。転写因子が外 在性であるが、宿主内で機能性であって、内在性RNAポリメラーゼと協同するこ とができる（それに対する遺伝子を導入しうる外在性RNAポリメラーゼを必要と するのではなく）場合には、転写因子のDBDまたはTADと一緒に機能する外在性プ ロモーターエレメントを、リポーター遺伝子の調節転写のための別の作成物に付 与することができる。こうして、転写の開始を、その外在性プロモーター領域と 関連した遺伝子、即ち、リポーター遺伝子に制限することができる。 ii ．DNA結合ドメイン 本発明に使用するためのDNA結合ドメインは、本技術分野で公知の多様なDNA結 合ドメインから選ぶことができる。例としては、ホメオドメイン類、ジンクフィ ンガー類、およびペアードボックス(paired-box)類のDNA結合ドメインが挙げら れ、それらの多くの実例が文献で知られている。そのタンパク質とDNAとの分子 接触に関する詳細な情報が利用可能な場合には、そのタンパク質のDNA認識特異 性をアミノ酸置換により遺伝子工学操作してもよい。 DNA結合ドメインに対する好ましい特徴は、他の細胞性タンパク質との相互作 用の欠如である。或いは、このような相互作用の性質が精密にわかっているべき であり、そうであればそのDNA結合ドメイン内で適当なアミノ酸置換によりこれ らの相互作用を排除することができる。また、DNA結合ドメインは、利用する細 胞タイプに対してユニークであることが好ましいであろう。DNA結合エレメント は、細胞に導入する時に、外部から添加されたDNA結合ドメインの不存在下では 占拠されない（少なくとも過度には）ことが好ましいであろう。バックグラウン ド占拠のレベルを、既述したように適切な調節によって決定してもよい。 細胞タイプ特異的因子（in vivoアッセイに用いた細胞内では見出されない） 、変化させた結合特異性を持つDNA結合ドメイン、および原核性DNA結合ドメイン は、ここに説明した方法によく適している。１つの好適なDNA結合ドメインは 、Phox1タンパク質（Grueneberg，D.A.，Natesan，S.，Alexandre，C．& Gilman ，M.Z.,(1992)ヒトとショウジョウバエのホメオドメインタンパク質、血清応答 因子のDNA結合活性の増大、Science 257，1089-1095; Genbank受託番号: M95929 ）に由来する。このタンパク質はホメオドメイン類の一員である。Phox1由来の6 9アミノ酸ドメインでDNAの結合に十分である。このタンパク質に対する高アフィ ニティーDNA認識配列も既に同定されており、そのDNA認識特異性を変化させ、ヒ ト細胞においてある種の内在性タンパク質と相互作用するその能力に影響するア ミノ酸置換についても同様である(Grueneberg et al.)。 第二の好適なDNA結合ドメインは、SRE-ZBPタンパク質（Attar，R.M．& Gilman ，M.Z．（1992）c-fos血清応答エレメントに結合する新規ジンクフィンガータン パク質の発現クローニング、Mol．Cell．Biol．12，2432-2443; Genbank受託番 号: M88579）に由来する。SRE-ZBPはジンクフィンガータンパク質のC2H2クラス の一員である。これは７個の縦列ジンクフィンガーを有する。これらのジンクフ ィンガードメインのいずれか１つ、または２以上のドメインの組合わせ、を用い て新規な認識特異性を持つDNA結合ドメインを形成することができる。また、DNA 結合認識の一般構造および様式がこのクラスのタンパク質について知られている 。DNA認識は必要なら直接修飾することができる。 第三の好適なDNA結合ドメインは、既に言及したGAL4結合ドメインである。 第四の好適な種類のDNA結合ドメインは、国際特許出願公開No．WO96/20951に 記載された、ZFHD1で例示される複合DNA結合ドメインである。Pomeranz et al. ，1995，Science267:93-96も参照。 iii ．転写活性化ドメイン 好ましい転写活性化ドメインは、サイズが小さく、活性が強力で、細胞に対し て無毒なものである。それ以外の特徴は具体的な応用に関係してくる。例えば、 ある特定のタイプの細胞または組織に使用される作成物について、その宿主細胞 内で特に高い活性を持つアクチベータードメインが使用される。宿主細胞DNA中 への標的遺伝子の安定な組込みを含む応用では、クロマチンサプレッションに耐 えるアクチベータードメインが使用される。 多くの活性化ドメインが本技術分野で知られている。本発明を実施する際に使 用しうる活性化ドメインを２つ例示すると、VP16活性化ドメインとNF-kB p65活 性化ドメインである。例えば、国際特許出願公開No．WO96/20951およびNo．WO96 /41865を参照。 iv ．ホスホペプチド結合対 融合タンパク質のそれぞれは、PBPの少なくとも１メンバー、即ち、少なくと も１つのホスホペプチド結合ドメインまたはそのペプチドリガンド、に連結され た少なくとも１つのDBDまたは少なくとも１つのTADのいずれかを含んでいる。PB Pの１例は、SH2ドメインとそのペプチドリガンド（例、ZAP SH2ドメインとTCR ζITAMのような免疫受容体活性化モチーフ）である。既に指摘したように、リガ ンドドメインは１または２以上のTyr残基を含有しており、この残基はSH2ドメイ ンに結合するにはリン酸化される必要がある。別の例として、ペプチドリガンド ドメインは、IgE TTAM、ポリオーマ・ミドルＴリン酸化配列、または合成共通チ ロシンリン酸化結合部位でもよい。 一部の態様では、SH2またはPIDまたは他のこのようなドメインの挙動に対して アロステリック的にまたは他の方式で影響を及ぼすとは一般に見なされていない タンパク質ドメインの封入を、折り畳みの安定化、発現の増進、またはタンパク 質の同定もしくは操作の手段（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼもし くは他の同定／精製を助けるドメインや、エピトープタグ等への融合）を与える 目的で含有させてもよい。 後で例示するように、融合タンパク質は複数のPBDまたはそのリガンドを含ん でいてもよい。例えば、本発明の１態様では、ZAP-70（２つのSH2ドメインを含 む）由来の縦列SH2ドメインを含む融合タンパク質を使用する。 融合タンパク質中に使用するPBPのペプチドリガンドのメンバーは上に定義さ れている。例えば、結合対メンバーの一方がSH2ドメインである場合、他方のメ ンバー、即ち、ペプチドリガンドは、少なくとも１つのTyrを含む天然のITAMで よい。その非リン酸化状態では、ペプチドリガンドはPBDを結合させないだろう 。これらのリガンドを、細胞内で内在性または（導入された）異種プロテインチ ロシンキナーゼ活性によりリン酸化する必要がある。 多数のSH2ドメイン、PIDおよび他のホスホペプチド結合ドメイン、ならびにそ のリガンドが、本技術分野で知られており、本発明での使用に適合しうる。以下 の追加の背景情報および指針は、実施者に関心があり、有用であるかもしれない 。SH2 ドメインおよびSH2様ドメインの同定 「SH2様ドメインまたはそのサブドメイン」なる用語は、Srcホモロジ−領域2( SH2ドメイン)と実質的に相同性である配列、またはSH領域、好ましくはSH領域の 保存領域、のサブドメインを意味する。Srcホモロジー領域は約100アミノ酸の非 触媒性ドメインであり、これはウイルス性Fpsおよびウイルス性Src細胞質チロシ ンキナーゼ中でその触媒活性および基質リン酸化の両方に及ぼす効果のの点で最 初に同定された(T．Pawson，Oncogne 3，491(1988)およびI．Sadowski et al.， Mol．Cell．Biol．6，4396(1986))。SH2ドメインは多様な真核タンパク質中で見 出されており、その一部は細胞内シグナル伝達において機能する。多数が本技術 分野で知られている。SH2ドメインを含むタンパク質の例としては（多様な種か らの対応物も含む）、(1)srcファミリープロテインチロシンキナーゼ(Src，Lyn ，Fyn，Lck，Hck，Fgr，Yes)、のメンバー(2)Shc、(3)Tsk、（4）Btk、(5)VAV、 (6)Grb2、(7)Crk、および(8)シグナルトランスデューサーおよび転写(STAT)タン パク質が挙げられる。また、ZAP-70、p85ホスファチジルイノシトール3'キナー ゼ(P13K)、Syk、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)、およびホスホリパーゼＣ− γのような多くのタンパク質が２つのSH2ドメインを持っている。SH2ドメインを 含むタンパク質は、ヒト、齧歯類、ヒツジ、ウシ、セノラブディティスエレガン ス(C．elegans)、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、扁形動物、淡水海綿 、およびヒドラにおいて同定されている。 未知のDNA、RNAまたはタンパク質配列から新たなSH2ドメインまたはSH2様ドメ インを同定する１つの方法は、利用可能な多くのコンピュータアラインメントプ ログラムのいずれかを用いる方法である。１例はpfscanであり、これはワールド ワイドウェブ(WWW)サイトを経て、http://ulrec3.unil.ch/software/profi lescan.htmlで動かすことができる。このプログラムを使うには、タンパク質配 列を、SH2ドメインモチーフを記述する「プロフィル」に対して試験する。この プログラムの情報によれば、プロフィルの特に強みは、非常に幅の広いタンパク 質モチーフを記述するのに使用できることである。これらのプロフィルは、普通 は最初の配列セットの複数の配列から得られる。配列それ自体に加えて、プロフ ィルは、どのタイプの残基がそのドメイン内のどの位置に許されるか、どのアミ ノ酸が保存されるか、どのアミノ酸が保存されないか、どの位置もしくは領域で 挿入が許されうるか、およびどの領域が可欠（なくてもよい）か、といったこと も同定する。PfscanとPROSITEに関するこれ以上の情報はISREC(Swis Institute for Experimental Cancer Research)のバイオ情報グループにより管理されてい るウェブページhttp://ulrec3.unil.ch/index.htmlで得ることができる。 １例として、我々はpfscanプログラムでヒトSrcのペプチド配列を解析した。 その結果を次に示す。このプログラムは、Src（１）SH2ドメインについて、Src ペプチド配列のアミノ酸150-247からの領域を包含すると明らかに同定した。さ らに、SH3およびキナーゼの両ドメインもpfscanにより同定された。 ある相手(match)のNScoreは、所定サイズのランダムデータベースにおいて所定 品質（またはそれ以上）の相手の予想される数の負の常用対数である。NScore<< １では、これがそのデータベース中でその相手を見つける蓋然性に近づく。予想 される相手の数はデータベースのサイズに依存するので、データベースのサイズ の常用対数を次のように計算前に差し引く必要がある： −log(NExp)＝NScore - log（DBsize） ここで、（NExp＝偶然の相手の予想される数）および（DBsize＝データベースの キャラクターのサイズ）。 次の表は、NScoreをSwissProtデータベースおよび非冗長(nonredundant，nr) タンパク質データベースに対する蓋然性にいかに変換するかのいくつかの例を示 す。この計算は次のデータベースのサイズに基づいている： SwissProtデータベースについては18,531,385（log＝7.27） nrデータベースについては58,154,119（log＝7.76） 予想される偶然の相手の数 NScore SwissProt 非冗長(nr) 7.0 1.8 5.8 7.5 0.58 1.82 8.0 0.18 0.58 8.5 0.058 0.182 9.0 0.018 0.058 9.5 0.006 0.0182 10.0 0.0018 0.0058 10.5 0.0006 0.0018 ・・等々・・ 試験配列のセグメントは、SH2プロフィルNScore値＞7.5、好ましくは＞８、より 好ましくは＞９、さらにより好ましくは＞10で、SH2ドメインを含んでいる。 別の例として、ヒトZAP-70由来のＮ末端160アミノ酸配列をpfscanに適用した 。結果はアミノ酸10-120により結合されたSH2ドメインを示した。 配列アラインメントにより決定されたようなSH2ドメインまたはSH2様ドメイン をコードする最小セグメントは、本アッセイで機能または最適に機能するのに 十分ではないかもしれない。この最小セグメントのＮ末端および／またはＣ末端 のいずれかの追加の配列が、本発明の範囲内でペプチドリガンドへのコードされ たタンパク質の結合を最適にするのに必要または望ましいかもしれない。これら の追加の配列は、その天然タンパク質配列に由来するものでもよく、または他の タンパク質さらには発現ベクターに添加される非天然配列に由来するものでもよ い。しかし、必要な配列は、SEAPの産生をSH2ドメイン−ホスホペプチド相互作 用の指標として使用して遺伝学的に、またはin vitro結合アッセイで生化学的に 、容易に決定することができる。 SH2ドメインは、DNAstarコンピュータパッケージ（マジソン、ウィスコンシン） の中のMegAlignのような、他のコンピュータアラインメントプログラムを用いて 同定することもできる。これを行うには、１または２以上の既知SH2ドメインと 試験配列とをクラスタル(clustal)法により整列させる。ある既知SH2ドメインに 同一のアミノ酸を≧25％、ある場合には30〜50％、別の場合には＞50％の割合で 有する配列を、SH2ホモロジードメインと同定する。試験物質と、異なる２以上 の既知SH2ドメインとの間の、同一アミノ酸の位置は、１つの位置以外は違って いてもよい。これまで同定された全てのSH2ドメインが、SH2ホモロジードメイン の最初から約25〜40残基中に保存アルギニン残基を持っている。ヒトsrcでは、 このアルギニンは配列FLVRESの中に見出せる。ここで、アミノ酸残基の略号は次 の通りである：F，Phe；L，Leu；V，Val；R，Arg；E，Glu；S，Ser。 SH2ドメインまたはSH2様ドメインを同定する別の手法は、SH2ドメインの特徴 について統合された(federated)ヌクレオチドまたはタンパク質データベース中 で質問を流すことによる。SWTSS-PROTデータベース中では、これはFTまたは”fe ature”の表題の下にリストされている。SWISS-PROTデータベースにはWWW上でEB I http://www.ebi.ac.ukでアクセスすることができる。例えば、ヒトSrc(P12931 )に対してリストされたファイル中では、SH2ドメインを含む領域は150-247であ ると示されている。 SH2ドメインまたはSH2様ドメインを同定するさらに別の手法は、既知のSH2ド メインに対するリン酸化ペプチドリガンドを用いてcDNA発現ライブラリーをスク リーニングして、SH2タンパク質類に対するcDNA類を分離することにより行うこ とができる。SH2特異性プローブと共にPCRまたは低緊縮(low stringency)スクリ ーニングを用いてもよいであろう。SH2ドメイン、またはSH2ドメインを含むタン パク質は、天然供給源（例、細胞、組織、器官等）から分離したもの；細菌、酵 母もしくは真核細胞中で組換えにより産生させたもの；無細胞翻訳系を用いてin vitroで産生させたもの；または合成（例、ペプチド合成）で生成させたもので よい。 ある種のSH2ドメインまたはSH2様ドメインは、pfscanプログラムにより同定す ることができず、またコンピュータアラインメントプログラムにより検出するた めの既知SH2ドメイン配列との有意な相同性を示さないことがある。それにもか かわらず、これらの配列は、既知のSH2ドメインと同一または類似の三次元（立 体）構造を示し、SH2様ドメインとして機能して、ホスホチロシン含有ペプチド またはタンパク質を結合する機能を果たす。いくつかの既知のSH2ドメインの立 体構造が既に決定された。SH2ドメインは５または６本のβ鎖からなる２つの逆 平行βシートとして特徴づけられる。αヘリックスを形成する領域がこのドメイ ン内に存在していても、いなくてもよい。SH2ドメインまたはSH2様ドメインは、 Ｘ線結晶学またはNMR分光学により解析した時にSH2様ドメイン構造を有すると認 められることがある。或いは、ホモロジーモデル化により予測された構造を用い て特定のタンパク質配列をSH2様ドメインとして同定することもできる。 http://ulrec3.unil.ch/prf details/alignments/SH2.msfから取られるような pfscan用のSH2プロフィル（プロフィルマトリックスはhttp://ulrec3.unil.ch/c gi bin/get_pstprf?SH2から得ることができる）を形成するために用いるSH2ドメ インのアラインメントは、多様な種のタンパク質に由来する約390のSH2ドメイン のアラインメントに基づく。Swiss-Protデータベースでアラインメントに使用さ れる、SH2ドメインを含有するタンパク質のリストは下記を含んでいる（P##### はSwiss-Protデータベース受託番号）： 試験ペプチドまたはヌクレオチド配列内のSH2ドメインを同定する一般的な方 法は次の通りである： １．そのcDNAまたはRNAを一文字記号のタンパク質配列に翻訳する。これはDNAst riderまたはDNAstarパッケージ中のEditSeqのようなコンピュータプログラムを 用いて行うこともできよう。 ２．WWWサイトのhttp://ulrec3.unll.ch/software/profilescan.htm1に進む。 ３．pfscanフォームの適切なボックス中に試験配列をコピーする。 ４．そのフォームをpfscanのサーバーに提示する。 ５．結果がウェブのブラウザーから又は電子メールを経て送り返される。 本発明は以上に説明したSH2 ドメインおよびSH2様ドメインに関する。ここに 提示した情報を用いて、後述する実施例との類似により、本発明を任意のSH2ド メイン、SH2様ドメイン、PIDもしくはPID様ドメインならびにそのペプチドリガ ンド（例、ZAP、Syk、Src、またはFynSH2ドメインの代わりに）と共に実施する ことができる。PID ドメインまたはPID様ドメインの同定 SH2ドメインに代わるホスホチロシン結合ドメインは、いわゆるホスホチロシ ン相互作用ドメイン(PID)である。平均で約160アミノ酸を含んでいるこのドメイ ンは、最初にShcタンパク質中で同定された。共通pTyr-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(ホスホ チロシンの後に３以上のアミノ酸が続く）を持つ配列を認識するSH2ドメインと は異なり、PIDドメインは共通Asn-Xaa-Pro-pTyr（一文字記号でNPXYとも呼ばれ る）を持つ配列を認識する。この応用に関して説明する本発明はまたPIDドメイ ンおよびPID様ドメインにも関連する。この場合、SH2ドメインコーディング配列 の代わりに適切なベクター中でPIDドメイン用のコーディング配列に置き換え、S H2ドメインリガンドに代えてPIDドメインを認識するリガンドを用いる。PIDリガ ンドのリン酸化は、ここに説明したようにv-Srcを用いて行うことができよう。 別のプロテインキナーゼを用いてPIDリガンドをリン酸化することもできよう。 また、細胞内に内在性のプロテインキナーゼがPIDリガンドのリン酸化を触媒す ることもできよう。 これらのドメインに関する有意義な情報が本技術分野で知られている。PIDド メインの詳細な説明は、WWW上のhttp://www.bork.embl-heidelberg.de/Modules/ pid-gif.htmlサイトでも見つけることができる。下記の情報はそのサイトから採 録したものである。 典拠資料−PROSITEの説明 SH2以外に、ホスホチロシン相互作用ドメイン(PIドメインまたはPID)[3]は、ト ランスフォーミングタンパク質Shc中に見出された第２のホスホチロシン結合ド メインである[1,2]。Shcは活性化増殖因子受容体を浦乳類細胞の増殖を調節する シグナリング経路に結合させ、発癌性チロシンキナーゼのトランスフォーミング 活性にも関与しているかもしれない。PIドメインは、増殖因子受容体を含ん でいる多くのチロシンリン酸化タンパク質中に見出されているAsn-Pro-Xaa-Tyr( p)モチーフに特異的に結合する。PIDはまた、下に列挙したShc関連タンパク質Sc k[1]およびいくつかの他の非関連な調節タンパク質[3]にも見出されている。 ・哺乳類Shc（46kDおよび52kDイソ型）は、１つのＮ末端PID、1つのコラー ゲン様ドメインおよび１つのＣ末端SH2ドメインを含んでいる。 ・ヒトShc関連タンパク質Sckは、１つのPIドメインと１つのSH2ドメインを含 んでいる。 ・哺乳類X11は神経系で著しく発現される。これはPIDの約100AA下流にある２ つのディスク(disc)相同性領域(DHR)を含んでいる。 ・ショウジョウバエ核Numbタンパク質が、ショウジョウバエの胚における知覚器 官形成中の細胞運命の決定に要求される。これは１つのPIDを有する。 ・セノラブディティス・ハイポセティカルタンパク質F56D2.1は１つのＮ末端メ タロプロテイナーゼドメインの次に１つのPIDを含んでいる。 ・ラットFE65。FE65の配列中に見出されたWWドメインならびに２つのPIDは、こ のタンパク質が恐らくシグナル伝達に関係していることを意味している。 ・無能化された(disabled)ショウジョウバエタンパク質は、中枢神経系軸索およ び体壁筋に見出される細胞質チロシンリン酸化タンパク質である。 ・選択的スプライシングにより産生するマウスマイトジェン応答ホスホプロテイ ンイソ型P96，P93およびP67は、１つのＮ末端PIDを含んでいる。これはまた 、選択的に発現されたヒトのオーソローガス体(ortholog)Doc-2にもあてはま る。 ・ヒトEST05045タンパク質フラグメントは１つのPIDを有する。 参考文献 ［1］Kavanaugh，W.M.，Williams，L.T.，Science266:1862-1865（1994） ［2］Blaiki，P，et al.，J．Biol．Chem．269，32031-32034（1994） ［3］Bork，P.，Margolis B.，Cell80，693（1995） 多様な種に由来する約40のPIドメインに基づくPIドメイン・アラインメントがht tp://ulrec3.unil.ch/prf details/alignments/PID.msfのWWWサイトに示されて いる。約50のPID配列に基づくアラインメントがhttp://www.bork.embl-heidelbe rg.de/Modules/pi-ali.htmlのウェブサイトに示されている。 配列アラインメントにより決定されたようなPIDドメインまたはPID様ドメイン をコードする最小セグメントは、本アッセイで機能または最適に機能するのに十 分ではないかもしれない。この最小セグメントのＮ末端および／またはＣ末端の いずれかの追加の配列が、本発明の範囲内でペプチドリガンドへのコードされた タンパク質の結合を最適にするのに必要または望ましいかもしれない。これらの 追加の配列は、その天然タンパク質配列に由来するものでもよく、または他のタ ンパク質さらには発現ベクターに付加される非天然配列に由来するものでもよい 。しかし、必要な配列は、SEAPの産生をPIDドメイン−ホスホペプチド相互作用 の指標として使用して遺伝学的に、またはin vitro結合アッセイで生化学的に、 容易に決定することができる。 ｖ．任意ドメイン 本発明の融合タンパク質の一方または両方は、１または２以上の任意タンパク 質をさらに含んでいてもよく、この任意タンパク質には、上述したようなプロテ インキナーゼドメイン、またはその融合タンパク質を2-ハイブリッド形成に利用 不可能に調節する（例、融合タンパク質を所望の細胞位置もしくは区画で隔絶す るか、ま融合タンパク質を不活性な高次構造に維持することにより）ことができ るドメインが含まれる。 キナーゼドメイン。１例として、細胞が、SH2、PIDまたは他のホスホペプチド 結合ドメインに対するペプチドリガンドのチロシン残基をリン酸化することがで きる内在性プロテインキナーゼを有していない場合、その細胞に異種キナーゼ活 性を導入する。このような異種キナーゼをコードするDNAを独立転写単位（即ち 、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列のようなそれ自身の転写調節エ レメントを持つ）としてその細胞内に導入してもよい。或いは、キナーゼ活性を 、本発明の２つの融合タンパク質の１つの内部に機能的キナーゼドメインとし て導入してもよい。１態様では、融合タンパク質が１または２以上の転写活性化 ドメインに連結した１または２以上のSH2ドメインを含む第１のキメラと、DBD- キナーゼドメイン−ペプチドリガンドドメイン融合を含む第２のキメラとを持っ ている。 １態様において、v-Srcタンパク質由来のプロテインキナーゼドメインを用い て、DNA結合ドメインに連結したペプチドリガンドをリン酸化する。別のプロテ インキナーゼを用いて、このリン酸化を行ってもよい。プロテインキナーゼドメ インの認識は、pfscanを用いてSH2もしくはPIDについて説明したのと同じ手法で 行ってもよ、またクラスタルＶ(ClustaｌV)分析、ハイブリダイゼーション、ま たは機能性生化学的分析により行ってもよい。プロテインキナーゼ相同性領域を 画定するセグメントは約280アミノ酸である。プロテインキナーゼドメインの詳 細なアラインメントは、上に示したpfscanウェブサイトまたはサンディエゴのカ リフォルニア大学のプロテインキナーゼウェブサイト(http://www.sdsc.edu/kin ases/)で得ることができる。配列アラインメントにより決定したようなプロテイ ンキナーゼドメインをコードする最小セグメントは、Ｎ末端部分では保存グリシ ン、そしてＣ末端部分では保存アルギニンが境界となる。しかし、ペプチドリガ ンドを本発明に関連して機能的にリン酸化するために、この最小セグメントのＮ 末端および／またはＣ末端のいずれかで追加の配列が、コードされるタンパク質 にとって必要または望ましいかもしれない。これらの追加の配列は、天然プロテ インキナーゼ配列に由来するものでもよく、または他のタンパク質さらには発現 ベクターに付加される非天然配列に由来するものでもよい。必要な配列は、SEAP の産生をSH2(またはPID)ドメイン−ホスホペプチド相互作用の指標として使用し て遺伝学的に、またはin vitroリン酸化反応で生化学的に、容易に決定すること ができる。 ホスホトレオニンまたはホスホセリン修飾ペプチドを認識するドメインに対し ては、v-Srcキナーゼドメインの代わりに適当なプロテインキナーゼを使用する ことになろう。 局在化ドメイン。別の例として、本発明の融合タンパク質は、核へのタンパク 質のトランスロケーションを与えるターゲッティング配列をさらに含んでいても よい。このようなターゲッティング配列は、バイパルタイト塩基性反復（bipart ite basic repeat）と呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有していてもよい［例、 Garcia-Bustos et al，Biochem ．Biophys．Acta，1071:83-101（1991）を参照] 。この配列は、分子内部またはＮ末端もしくはＣ末端の近くのどの部分にも現れ ることができ、融合タンパク質の核内での局在化を生ずる。 核ホルモン結合ドメイン。細胞内に導入された化合物は、不安定なために、細 胞内に導入されてしまうと長時間は存在しないことがある。そのような場合、細 胞を試験材料に曝す時に全ての成分を細胞内に存在させることが有利となるかも しれない。そのため、我々は核ホルモンリガンド結合ドメイン（HBD)を含む融合 タンパク質をコードする作成物を作った。エストロゲン、グルココルチコイド、 レチノイン酸、アルドステロンおよびビタミンＤ受容体をはじめとする多くのこ のようなホルモン受容体およびリガンドが知られており、これらを本発明の実施 時に使用してもよい。核ホルモンリガンド結合ドメインの調節性（Picard et al ，Cell（1988）54，1073-1080；Eilerrs et al，Nature（1989）340，66-68）に より、融合タンパク質の相互作用の翻訳後調節が可能となる。例示として、エス トロゲン受容体ドメインは自律調節ドメインとして作用し、異種タンパク質に融 合すると、このステロイド受容体ドメインはキメラタンパク質をホルモン制御に さらす。この調節性は、HBDと熱ショックタンパク質とのホルモン可逆的(revers able)相互作用に起因する。例えば、PBD-TAD融合タンパク質およびDBD-HBD-キナ ーゼ-PBDリガンド融合タンパク質は、リポータ−遺伝子作成物を含む細胞内で発 現させることができる。ステロイドホルモンの添加による場合だけ、融合タンパ ク質が相互作用することができる。ホルモンが存在しないと、HBD含有タンパク 質は、ツーハイブリッド複合体を形成するためにその相補的融合タンパク質と相 互作用する能力を持たない。 本発明の融合タンパク質内に任意に含有させてもよい他のドメインとしては、 抗体を用いた検出を可能にする抗体認識配列（エピトープタグ）が挙げられる。 このような監視は、融合タンパク質が作製されていること、および発現のレベル がホスホペプチドドメイン結合の阻害について試験した化合物により影響されな いことを確認するのに使用することができる。III ．本発明の融合タンパク質作成物、リポーター遺伝子プラスミドおよび遺伝 子工学操作された細胞のアセンブリ 本発明の融合タンパク質をコードし、リポーター遺伝子を含む作成物を、多く の場合はその作成物を含む宿主細胞の選択を考慮して１または２以上のマーカー と一緒に、１または２以上のDNA分子または作成物として細胞中に導入すること ができる。作成物は常法により調製することができ、これはコーディング配列お よび調節領域を適当に分離し、連結し、適当なクローニング宿主でクローン化し 、制限酵素によりもしくは配列決定または他の適当な手段により分析するという 方法でよい。特に、PCRを用いて、ある機能単位の全部または一部を含む個々の 断片を分離してもよく、この場合「プライマー修復」、連結、in vitro突然変異 誘発等を適当に用いて１または２以上の突然変異を導入してもよい。例えば、そ のDNA結合ドメインまたはTADをコードするあるDNA配列を、PBPの適当なメンバー をコードするDNAに結合させる。これらの配列を、全ての意図したドメインを有 する単一ポリペプチドに細胞内で翻訳されうる単一のオープンリーディングフレ ーム（翻訳領域）をこれらが構成するように結合させる。ポリペプチド内の各ド メインの順序と配置は変動しうる。作成物は、完成し、適切な配列を持つことが 確かめられたら、任意の好都合または望ましい手段によって宿主細胞中に導入す ればよい。作成物は、エピソーム複製が可能なベクター（例、BVPもしくはEBVベ クター）中または宿主細胞の染色体への組込み用に設計されたベクター中に組み 入れてもよい。作成物は、細胞への形質導入または感染のために、アデノウイル ス、アデノ随伴ウイルス(AAV)もしくは単純ヘルペスウイルス（HSV)、またはレ トロウイルスベクターを含むその他のような、非複製性の欠陥ウイルスゲノム中 に組込んでパッケージングしてもよい。或いは、作成物を、プロトプラスト融合 法、電気穿孔法、バイオリスティックス、リン酸カルシウムトランスフェクショ ン、リポフェクション、DNAのマイクロインジェクション等により導入してもよ い。宿主細胞は、場合によっては、作成物の導入前に培養して増殖および拡張さ せた後、作成物の導入および作成物の組込みのための適当な処理を行うことにな ろう。単純なトランスフェクション操作を用いることが最も好都合かも知 れない。細胞を次いで拡張させ、作成物中に存在するマーカーによってスクリー ニングする。うまく使用できる多様なマーカーとしては、hprt、ネオマイシン耐 性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等、ならびにTac，CD8，CD3，Thy １およびNGF受容体といった各種の細胞表面マーカーが挙げられる。 場合により、作成物を特定の遺伝子座に組込みたい場合には、相同的組換えの ための標的部位を持つようにしてもよい。例えば、内在性遺伝子を欠失させるか 、および／またはこれを（同じ遺伝子座または別のどこかで）本発明の組換え標 的作成物と置換させることができる。相同的組換えに対しては、Ωベクターまた はＯベクターのいずれかを一般に使用できる。例えば、Thomas&Capecchi，Cel1 （1987）51，503-512；Mansour，et al.，Nature（1988）336，348-352;およびJ oyner，et al.，Nature（1989）338，153-156を参照。 作成物は、全ての遺伝子を含む単一DNA分子として、またはそれぞれ１もしく は２以上の遺伝子を含む２以上の異なるDNA分子として、導入しうる。複数の作 成物を、それぞれ同じまたは異なるマーカーを用いて、同時または続けて導入す ることができる。 作成物DNAのストックの調製およびトランスフェクションの実施に使用できる 、細菌もしくは酵母の複製起点、選択可能および／もしくは増幅可能なマーカー 、原核生物もしくは真核生物中での発現のためのプロモーター／エンハンサーエ レメント、および哺乳類の発現調節エレメント等といった有用なエレメントを含 むベクターは本技術分野では周知であり、多くが市販されている。 このような融合タンパク質およびリポーター遺伝子のための作成物のデザイン 、アセンブリ、プラスミドへの取込み、およびトランスフェクションに関するさ らなる背景情報および実務者への一般的な案内が、下記の国際特許出願公開公報 から入手できる：WO94/18317，WO95/02684，WO96/20951，WO95/24419およびWO96 /41865。これらの内容を参考のためにここに援用する。IV ．本発明のアッセイ方法 上述した各種のDNA作成物を含む遺伝子工学操作された細胞を用いて、本発明 のアッセイ方法を行うことができる。このようなアッセイにより、PBPとそのチ ロシンリン酸化リガンドとの結合の阻害剤が試験物質中に存在することを同定す ることが可能となる。その阻害活性について評価を行う試験物質または化合物は 、例えば、微生物ブロス、細胞抽出物、細胞からの調整培地、合成化合物および 組合わせライブラリーを包含する多様な供給源から得ることができ、個々にまた はプールして試験できる。本発明のアッセイ方法を用いて、所望の阻害剤を同定 するために、天然物および試験化合物ライブラリーまたは構造的に偏らせた多様 性ライブラリーをスクリーニングしてもよい。試験物質は１または２以上の試験 ペプチドの混合物から選択してもよく、この混合物は合成ペプチドのライブラリ ーの形態または各種のペプチドを発現するファージライブラリーの形態で与えら れる。 Ａ．一般的方法 本発明の方法は上述したような細胞、特に第２の融合タンパク質も異種キナー ゼドメインを含んでいる細胞を使用する、すなわち本発明の細胞はリガンドドメ インをチロシンリン酸化することができる内在性もしくは異種キナーゼを含んで いる。この方法によれば、上述した遺伝子工学操作された細胞を、試験物質の存 在下および不存在下のどちらでもその細胞を増殖させることができる適当な条件 下で、慣用の培地にて培養または維持する。例えば、上記の導入された遺伝子を 安定に保持する細胞を選ぶのに必要な薬剤を含んでいる標準的な組織培養培地中 で細胞を培養する。細胞の培養は、標準的な組織培養皿（例、マルチ皿およびマ イクロウェルプレート）で行ってもよく、また所望に応じて他の容器もしくは容 器列中で行ってもよい。 試験化合物を培地に添加して、PBP相互作用に対するその効果を調べる。この 時点での細胞は、組織培養培地（血清加または無血清）中または平衡塩類溶液中 に浸してもよい。試験する化合物が細胞透過性で、従って細胞に直接添加できる こともある。或いは、ストレプトリシン０、テタノリシンまたは他の細胞透過性 化剤(cell permeabilizing agent)を用いてまず細胞を透過性にすることが必要 となることもある。 阻害剤となる試験物質の不存在下での細胞のインキュベーションおよび増殖中 に、細胞は上記の融合タンパク質およびリポーター遺伝子産物を発現することが できる。普通これは、DNA結合性の融合タンパク質がリポーター遺伝子のDNAエレ メントに結合することを伴う。ペプチドリガンドドメイン中のチロシン残基が細 胞中のキナーゼ活性（内在性または異種性）によりリン酸化される。リン酸化し たペプチドリガンド（例、ITAM）は、他方の融合タンパク質上のそのPBD(例、SH 2ドメイン)上に結合し（例、1994年10月４日付のpawson、米国特許第5,352,660 号を参照）、ツーハイブリッド複合体を形成する。最終的な結果は、検出可能な リポーター遺伝子産物の測定可能な発現である。 従って、この方法の追加の工程は、検出可能な遺伝子産物の産生が試験物質の 存在下で減少するか否かを決定することである。転写を誘導させた後、細胞また は培地の評価によりリポーター遺伝子発現を測定する。アッセイを96ウェルプレ ートまたは他の列状の容器で行い、リポーター遺伝子発現をその場で測定する形 態もある。別の場合には、細胞または培地を集め、評価のために抽出物を調製す る（必要なら）。検出可能なリポーター遺伝子産物の測定値を試験物質の存在下 と不存在下とで比較することにより、PBP相互作用の阻害剤としての試験物質の 同定が可能となる。PBP相互作用により誘導される検出可能な遺伝子産物の転写 を、標準的な比色または蛍光分析法を用いてアッセイする。 例えば、試験化合物がPBP複合体の生成および／または安定性の阻害剤ではな い場合には、上述したように、非阻害剤の結果は試験化合物なしに得られた結果 と似るはずであるので、検出可能なリポーター遺伝子産物の測定値は試験物質の 存在下と不存在下とでほぼ同じとなろう。試験化合物がPBP相互作用の推定阻害 剤である場合には、リポーター遺伝子発現レベルの低下が見られる。この低下は 、試験化合物がPBDとそのリン酸化ペプチドリガンドとの結合を阻害し、それに よりツーハイブリッド複合体の生成または持続を阻害したことを示している。こ うして培養液中に存在する試験物質の量および試験化合物とPBPのいずれかのメ ンバーとの結合の強さに応じて、リポーター遺伝子発現が消失または低減する。 例えば、本発明の１態様において、試験化合物を、in vivoでTCR ζITAMとの ZAP-70縦列SH2ドメイン間の相互作用の阻止(blocking)／阻害について真核宿 主細胞中でスクリーニングする（実施例3)。ITAM配列へのZAP SH2結合を阻止 する化合物を、vSrcキナーゼドメイン、エストロゲン受容体ドメイン、およびTC RζITAMリガンドがDNA結合ドメインに融合している第１の融合タンパク質、なら びにTADに融合したZAPの縦列SH2ドメインを含んでいる第２の融合タンパク質を 用いて検出する。ZAP SH2ドメインとζITAMドメインとの相互作用で、アクティ ベータードメインはDNAエレメントの近くにもってこられ、リポーター遺伝子転 写が誘導される。ZAP SH2-ζITAM相互作用を阻止する化合物はリポーター遺伝子 発現を減少させる。 この態様において、例示として、本発明のアッセイ法は、従来のＴ細胞アッセ イに比べていくつかの利点を与える。このアッセイの読出し値は、特定のSH2リ ガンドとSH2ドメイン含有含有ポリペプチド（例、ZAP-70縦列SH2ドメイン）との 間の相互作用に直接依存する。これに対して、細胞増殖、細胞溶解活性またはサ イトカイン産生を測定する標準的なＴ細胞アッセイでは、活性化とアッセイの終 点との間に多くの段階がある。そのため、標準的なＴ細胞アッセイでは多くの非 特異的な阻害剤が測定値に関与するが、これらは本発明のアッセイでは測定値に 関与しない。 Ｂ．非特異的阻害の消去 非特異的なメカニズムによりリポーター遺伝子発現を阻害する（例、細胞性転 写または翻訳への一般的な阻害作用を持つことによる）試験化合物を排除するた め、リポーター遺伝子転写がPBP相互作用に依存しない場合の試験化合物のリポ ーター遺伝子発現に対する効果についてもアッセイする。この目的には、転写活 性化ドメインをDBDによりDNAに直接もたらす（細胞内でDBD／転写活性化ドメイ ン融合を発現させることにより）指標細胞系を利用する。HBDに関係する試験物 質の他の無関係な作用に基づく偽の陽性を排除するため、融合タンパク質はさら にホルモン結合ドメイン(HBD)を含んでいてもよい。そのような場合、陽性対照 指標細胞系とアッセイ細胞系との唯一の差は、リポーター遺伝子発現のためのPB P複合体形成へのアッセイ細胞系の依存性である。 転写の一般的な阻害作用は、試験化合物への暴露中に放射性標識ウリジンパル スラベリングを行うことによっても現れる。放射性標識の一般的取込みの阻害は 転写に対する一般的な阻害作用を示している。 Ｃ．アッセイ成分への細胞の同時暴露 本発明の別の側面において、細胞中にトランスフェクションされた第１の融合 タンパク質は上述したようにHBDを含んでいる。HBDはこの細胞の使用方法のこの 側面の重要な特徴である。細胞内に導入された試験化合物は不安定で、従って細 胞内に導入されると長時間は存在しないことがある。細胞をPBP相互作用の潜在 的な阻害剤に暴露する時点で全ての相互作用成分を細胞中に存在させることが有 利であるかもしれない。 ホスホペプチド結合タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤は、２つのやり 方でその効果を発揮できよう。これらの阻害剤は、リガンド/HBD/TADとPBDに対 して競合するか、既にPBDと複合化しているリガンド/HBD/TADを置換することが できよう。メカニズム的には、結合ドメインとそのリガンドとの間の相互作用を 阻止する方が置換するより容易であろう。潜在的な阻害剤、即ち、試験化合物を 、複合体形成（ホルモン添加）より前に、複合体形成を阻止するために細胞中に 導入することができる。 Ｄ．無細胞アッセイ この方法の別の態様では、上記のような細胞から調製または上記の精製成分か ら調製した無細胞転写系を、遺伝子工学操作細胞の代わりに使用してもよい。無 細胞の実施では、ペプチドリガンドは、ライブラリー、細胞ブロス、天然抽出物 等から同定された合成または非合成ペプチド、ペプトイドまたは小分子でよい。 このアッセイ方法は、無細胞環境中で行う点を除いて上記と同じである。この場 合、キナーゼドメインは好ましくは、DBDとホスホペプチド結合ドメインに対す るリガンドドメインとを含有する融合タンパク質の一部とすべきである。Ｖ．同定されたホスホペプチド結合対阻害剤 本発明の方法によって同定されたPBP阻害剤は、SH2ドメインのような興味ある PBDに選択的に結合する。このような阻害剤は、興味あるホスホペプチド結合ド メインにより媒介されるタンパク質−タンパク質、タンパク質−ペプチド、タン パク質−ヌクレオチド、タンパク質−ポリヌクレオチド、タンパク質−脂質、タ ンパク質−炭水化物、またはタンパク質−小分子相互作用を阻止または阻害す ることができる。 ある剤がホスホペプチド結合またはブロッキング／阻害剤であると同定された ら、組換えタンパク質製造法または化学合成といった既知の方法を用いてそれを 製造することができる。この剤は、それが最初に同定された、この剤を含む供給 源から得ることもできる。 Ａ．逆スクリーン 上記アッセイによってPBP阻害剤を同定したら、プロテインキナーゼとは無関 係なリポーター遺伝子発現を生じさせる単量体転写因子（即ち、DBDとTADの両方 の１または２以上のコピーを含む陽性対照の融合タンパク質）を発現する細胞を 用いた迅速で高処理量の逆スクリーンにより、容易に非特異的阻害剤を同定する か、阻害剤の特異性を確認することができる。本発明の方法により阻害剤である と同定された試験化合物は、１もしくは２以上の別の興味あるPBDに対する、ま たはそのドメインを含む別のタンパク質に対する、結合活性についてさらに評価 してもよい。これは各種の手法を用いて行うことができ、多くの手法が本技術分 野においてよく知られている。 逆スクリーンアッセイは、本発明の上述した一般的アッセイの中心的な特徴の 全てを含んでいてもよいが、阻害剤が他のリガンドまたは他のドメインに結合す るかどうかを決定するように融合タンパク質を変化させる。読み（測定結果）は 、最初のスクリーンに用いた特定のPBDペプチドおよびペプチドリガンドとは関 係しない。このような逆スクリーンを特異性を得るように上記のように繰り返し てもよい。従って、あらゆる非特異的阻害剤（例、RNA転写、タンパク質合成） 同定することができる。 例えば、このような同定された阻害剤を、SH2ドメインとそのリン酸化リガン ドとの結合の競合阻害剤としての活性について評価してもよい【例、pawson)米 国特許第5,352,660号(1994.10.4)]。別の例として、逆スクリーンアッセイは、 リポーター遺伝子とその関連対照エレメント(associated control element)と対 照融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、発現することができる対照細胞を 使用してもよい。この対照融合タンパク質は、既に述べたように、それぞれのDN A結合および転写活性化融合タンパク質中に別々に存在するDBDとTADの両方を 含んでいる。或いは、それぞれがPBDについて認められたものとは異なる結合特 異性を持つ結合相手の半分づつを含んでいる２つの融合タンパク質を用いて、タ ンパク質−タンパク質相互作用を上記のようにアッセイしてもよい。試験化合物 がリポーター遺伝子の発現レベルを著しく変化させることができない場合、その 阻害剤としての活性が確認される。 本発明の方法により興味ある１または２以上の追加のPBDへの結合に対して阻 害剤であることが示された試験化合物を評価するのに有用な別の逆スクリーンア Mol ．Cell．Biol.，13:3567-3576（1993）を参照］。 別の逆スクリーンでは、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインに連結され た核に位置するチロシンホスファターゼの発現を生じさせるプラスミドを細胞内 に導入することができる。多くのタンパク質が、その機能をステロイドホルモン 受容体リガンド結合ドメインへの融合によりステロイドホルモン依存性にされて いる。ステロイドホルモン受容体のホルモン結合ドメインは分子スイッチとして 作用する。コグネイト（同族体）リガンドの不存在下では融合タンパク質は不活 性である。しかし、ホルモン結合は非常にすばやい（数秒ないし数分以内）キメ ラタンパク質の「機能獲得」に至る。機能についてホルモン依存性にされた異種 タンパク質は、酵素と転写因子の両方を含んでいる。従って、エストロゲンの添 加により、検出可能なタンパク質産生が、ペプチドリガンドの脱リン酸化により 削減されよう。このような細胞を用いて、その細胞がエストロゲンに露出された 時に起こるリポーター産生の減少を阻止するホスファターゼ阻害剤についてスク リーニングすることができよう。 別の可能な逆スクリーンでは、化合物をここに説明したようなアッセイで試験 してもよいが、但しPBDおよびペプチドリガンドドメインを、WO95/24419に記載 されたようなSH3およびSH3リガンドドメインに置換する。化合物は、これがアッ セイ系の非PBP関連成分を阻害するか、またはSH3媒介タンパク質−タンパク質相 互作用も阻害しない場合は、活性であるべきではない。 本発明のアッセイ系において同定された阻害剤は、可能な治療応用、毒物学的 および薬理学的活性について常法によりさらに評価することができる。例えば、 こうして阻害剤であると同定された試験化合物を、適当な細胞によるアッセイま たは動物モデルを用いて、興味あるPBDによる相互作用が関与する経路により媒 介される細胞またはその他の生物学的事象を阻害する活性についてさらに評価し てもよい。多様な細胞および他の生物学的事象に対する試験化合物の阻害活性を 評価するのに適した細胞系アッセイおよび動物モデルが本技術分野で知られてい る。新たなアッセイおよびモデルが定期的に開発され、科学文献に発表されてい る。 制限しない例として、喘息またはアレルギー性症状発現を生ずるシグナルの伝 達に関係するSH2ドメインに結合する化合物を、マスト細胞または好塩基球脱顆 粒アッセイで評価してもよい。本発明の方法によりヒスタミン、ロイコトリエン 、ホルモン性メディエーターおよび／もしくはサイトカインのような特異的メデ ィエーターの細胞性放出に関してSH2阻害剤であると同定された試験化合物の阻 害活性、並びにホスファチジルイノシトール加水分解もしくはチロシンリン酸化 のレベルに関するその生物学的活性を、生物学的活性の指標として慣用のin vit roアッセイで特性決定することができる［例、Edward L．Barsumian et al.，Eu r ．J．Immunol. ，11:317-323(1981);M.J．Forrest，Biochem ．Pharmacol.，42:1 221-1228(1991)(活性化好中球からのＮ−アセチル−β−グルコサミナダーゼの 測定);およびV.M．Stephan et al.，J ．Biol．Chem.，267:5434-5441(1992)を参 照］。 例えば、ヒスタミン放出をAMAC社（メイン州ウェストブルック）から市販のキ ットを用いてラジオイムノアッセイにより測定することができる。こうして本発 明の方法により同定された阻害剤の活性を評価し、それらを相互に、または陽性 対照として使用できる既知の活性な化合物もしくは臨床的に関連する化合物と比 較することができる。 一般的に言って、このようなアッセイにおける150〜300μMのIC50の評点は興 味ありと考えられ、50〜150μMの評点は良好と考えられ、約50μM以下の評点は 非常に興味ありと考えられる。in vivoモデルの前に、本発明により同定された 阻害剤を、感作モルモットの気管ストリップ組織の抗原刺激収縮を阻止するその 能力についてex vivoアッセイで試験してもよい。このアッセイにおける活 性は、潜在的な抗喘息薬の効力の予測に有用であることが示された。 数多くの喘息の動物モデルが開発され、使用できる［レビューとしては、THEL UNG所載のLarson「可逆的気道閉塞の実験モデル」Scientific Foundations，Cry stal，West et al(編)，Ravan Press，New York，pp．953-965(1991);Waner et al.，Am ．Rev．Respir．Dis.，141:253-257（1990）を参照］。喘息の動物モデ ルに使用される種としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヒツ ジ、および霊長類が挙げられる。他の利用可能なin vivoモデルは、Cross et al .，Lab Invest.，63:162-170(1990)；およびKoh，et al.，Science，256:1210-1 213(1992)に記載されている。 別の例として、癌細胞の増殖の開始、維持または拡大に関係するシグナルの伝 達に関係するPBDに結合するPBP阻害剤であると本発明の方法により同定された化 合物を、関連する従来のin vitroおよびin vivoアッセイにおいて評価してもよ い。例えば、Ishii et al.，J ．Antibiot.，XLII:1877-1878(1989);および米国 特許第5,206,249号（1993年４月27日発行）を参照。VI ．本発明により同定された阻害剤の使用 本発明により同定された阻害剤は、特定のタンパク質、特に新たに発見された タンパク質のPBDの機能的分類のために、ここに説明したようなアッセイにおけ る生物学的試薬として使用できる。PBD保有タンパク質のファミリーまたはクラ スを、今やリガンド特異性に関して機能的に規定できる。さらに、本発明により 同定された阻害剤を用いて、PBPにより媒介される分子相互作用から生ずる生物 学的事象の発生を阻害することができる。このような相互作用の阻害は、PBP媒 介事象の生物学のよりよい理解を目的とする研究に有用となりうる。 このような結合またはブロッキング剤は、例えば、PBP相互作用により媒介さ れる細胞プロセスに起因する症状または疾患の診断、予防または治療に有用であ るかもしれない。例えば、骨粗鬆症の発生もしくは進行を予防したり、またはそ の過程を逆転させるために、それを必要とする患者にSrc SH2を選択的に結合さ せるSH2結合またはブロッキング剤を投与して患者を治療することができる。 ホスホペプチド結合またはブロッキング剤が治療上有用となりうる症状は他に も多くあり、例えば、SH2ドメイン含有タンパク質のSrc、PLC-γおよびGrb7が関 係している胸部癌が挙げられる。他の関連症状としては前立腺癌が挙げられ、こ の場合はいずれもSH2ドメインを含んでいるGrb2、PLCg、およびP13Kを標的とす ることがこの疾患の治療または予防に有用であるかもしれない。Grb2もしくはAb l SH2ドメインとBcr-ablとの相互作用の阻害は、慢性骨髄性白血病(CML)または 急性骨髄性白血病(AML)の治療に有用であるかもしれない。 PBP阻害剤のさらに他の関連用途は、STATタンパク質のPBDを標的とすることに よりインタ−フェロン、成長因子、またはサイトカインが媒介する疾患（例、炎 症性疾患）を予防することであろう。Ｔ細胞の活性化に関係していると考えられ ているZAP-70のSH2ドメインをブロックする剤は、自己免疫疾患の治療に有用で あろう。ZAP-70の一方または両方のSH2ドメインをブロックする阻害剤はまた、 皮膚または臓器移植の拒絶反応を予防するための免疫抑制剤としても有用であろ う。 薬理学的に重要な細胞性事象に要求されるタンパク質−タンパク質相互作用を 阻害する能力のため、本発明の方法により同定されたPBD/ペプチドリガンド相互 作用阻害剤を、それを必要とする個体の治療または予防用の薬剤組成物および方 法に使用することができる。このような阻害剤を用いて、このような相互作用に より媒介される疾患またはそれらの病理学的作用を治療または予防することがで きる。 例えば、２つのZAP SH2ドメインの一方を完全にブロックする医薬は、ZAPが活 性化TCRと会合するのを効果的に防止し、こうしてＴ細胞活性化をブロックする 筈である。ZAPアンタゴニストまたは阻害剤は、特異的にＴ細胞を阻害し、現在 使われている免疫抑制薬であるFK506およびシクロスポリン（これらはより遍在 的に発現されるタンパク質であるカルシニューリンを標的とする）の毒性が避け られよう。カルシニューリンは、Ｔ細胞の他にいくつかの組織中での細胞活性に 必要とされるので、シクロスポリンおよびFK506は腎および中枢神経系において 副作用を引き起し、そのために臓器移植拒絶反応の患者へのその投与は著しく制 限される。VII ．薬剤組成物および方法 Ａ．組成物 本発明により同定された阻害剤は、治療に（または予防に）有効な量の阻害剤 を、慣用の材料および手段を用いて、薬剤に許容される担体および／または他の 賦形剤（即ち、非経口投与に適した薬剤に許容される有機または無機担体物質） と混合して含有する薬剤組成物に処方することができる。このような担体として は、これらに限られないが、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリ セロール、エタノール、およびこれらの組合わせが挙げられる。担体および組成 物は滅菌することができる。処方組成物は投与方式に適合させるべきである。 組成物は、所望により、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有す ることができる。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸剤、カプ セル剤、持効性処方、または散剤（粉末）とすることができる。組成物はまた、 トリグリセリドのような慣用の結合剤および担体を用いて座薬として処方するこ ともできる。経口処方組成物は、医薬用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステ アリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム 等といった標準的な担体を含有しうる。 ある特定の態様において、組成物はヒトへの静脈内投与に適合させた薬剤組成 物として通常の操作に従って処方される。典型的には、静脈内投与用の組成物は 滅菌等張緩衝剤水溶液中の溶液である。必要に応じて、組成物はさらに可溶化剤 と注射部位の痛みの緩和のために局所麻酔薬を含有していてもよい。一般に、各 成分は別々にまたは一緒に混合して単位用量（一回量）形態にし、例えば、有効 成分の量を表示したアンプルまたはサシェット（小袋）のような気密シール容器 中に密封した凍結乾燥粉末または無水濃厚液として供給される。組成物を輸液に より投与しようとする場合、滅菌した医薬用の水または食塩水を入れた輸液ビン を用いて供給することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用 滅菌水または食塩水のアンプルを用意して、成分を投与前に混合できるようにし てもよい。 局所用組成物は、ゲル、軟膏、ローション、またはクリーム等の薬理学的に許 容される担体を包含し、これらは、制限されないが、水、グリセロール、アルコ ール、プロピレングリコール、脂肪アルコール類、トリグリセリド類、脂肪酸エ ステル類、または鉱油類等の担体を包含する。他の局所用担体は、流動パラフィ ン、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール(95%)、 ポリオキシエチレンモノラウレート(5%)水溶液、またはラウリル硫酸ナトリウム (5%)水溶液を包含する。酸化防止剤、保湿剤、粘度安定化剤、および類似の添加 剤といった他の材料も必要に応じて添加しうる。 各種の処方組成物の製造のための材料と方法は本技術分野で周知である［例、 米国特許第5,182,293号および第4,837,311号を参照］。 Ｂ．方法 本発明は、有効量のPBP阻害剤を個体に投与することにより、上で言及した疾 患または障害の症状および／または重篤度の治療、予防および／または緩和方法 を提供する。個体は、これらに制限されないが、ウシ、ブタ、ニワトリ等を含む 動物であり、好ましくは哺乳類であり、特に好ましくはヒトである。「哺乳類」 とは、マウス、ラットおよびモルモット等の齧歯類、ならびにイヌ、ネコ、ウマ 、ウシ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類およびヒトを意味する。このような有効量は 、ここに説明したアッセイを含む本技術分野で周知の慣用のアッセイで、本発明 により同定された阻害剤を評価することにより容易に決定することができる。 このような組成物の投与は、この技術分野で周知のように適当な処方組成物を 用いて任意の慣用の経路で行うことができる。例えば、リポソーム中のカプセル 化、微粒子、マイクロカプセルといった、各種の薬剤供給系が知られており、本 発明の阻害剤を投与するのに使用できる。興味ある１つの供給方式は経肺投与で ある。他の導入方法としては、これらに限られないが、皮内、筋肉内、腹腔内、 静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、点鼻および経口経路が挙げられる。阻害剤の投与 は、輸液もしくは大量注射、上皮もしくは粘膜皮膚の内層（例、口の粘膜、直腸 および腸管粘膜等）を通る吸収により行ってもよく、他の生物学的に活性な薬剤 と一緒に投与してもよい。 投与は全身でも局所でもよい。鼻、気管または肺の症状の治療または予防用の 好ましい投与経路は、経口、経鼻、または気管用エアゾールもしくはネブライザ ーである。このように、具体的態様においては、本発明の阻害剤を処置を必要と する体内部位に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、 制限を意図しないが、手術中の局所輸液、局所塗布、注射、カテーテル手段、座 薬手段、または皮膚パッチもしくは埋設手段により達成しうる。この埋設材は、 サイアラスティック(sialastic)膜のような膜や繊維を含む、多孔質、非多孔質 、もしくはゼラチン状材料のものでよい。 有効量の阻害剤の個体への投与は、その個体の皮膚の患部に化合物をじかに投 与（塗布）することにより局所的に行うこともできる。場合によっては、阻害剤 を皮膚の上、内部、または下に配置された器材の内部に配置できる場合が想定さ れる。このような器材としては、該化合物を受動的または能動的放出機構により 皮膚に放出するパッチ、埋設材、および注入材がある。 ある障害または症状の治療または予防に有効な本阻害剤の量は、その障害また は症状の性質に依存して変動し、標準的な臨床技術により決定することができる 。また、最適投与量範囲の決定を助けるため、in vitroまたはin vivoアッセイ を場合により採用してもよい。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験シス テムから得られた用量−応答曲線から外挿してもよい。例えば、本阻害剤の典型 的な有効用量は、哺乳類体重当たりで約0.01〜50mg/kg、好ましくは約0.1〜10mg /kgの範囲であり、１回または複数回に分けて投与される。一般に、この阻害剤 は上記のような治療を必要とする患者に、約1〜2000mg/人の日用量範囲で投与す ることができる。 有効成分としての本阻害剤の厳密な投与量レベルは、付添い医師または他の健 康管理提供者が決定すべきであり、考慮するホスホペプチド結合相互作用、投与 経路、ならびに個体の年齢、体重、性別および一般健康状態；疾患の性質、重篤 度および臨床段階；ならびに同時治療の併用の有無、を含む周知の因子に応じて 変動しよう。 Ｃ．キット 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の１または２以上の成分を入れた１または ２以上の容器を備えた薬剤パックまたはキットも提供する。このような容器に、 医薬もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を監督する政府機関により指 定された形態の注意書を任意に添えることができ、その注意書はヒトの投与に対 する製造、使用または販売の監督官庁による認可を反映する。 生理学的に許容できる界面活性剤（例、グリセリド類）、賦形剤（例、ラクト ース）、担体および希釈剤などの他の成分を含有させてもよい。 以下の実施例は本発明の種々の側面を説明する。これらの実施例は請求の範囲 に規定された本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 実施例１：プラスミド Ａ．プラスミドpYSZ、GAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-ζITAM酵母発現ベクター プラスミドpGTB9(Clontech Laboratories)を、酵母中でのGAL4(1-147)-vSrcキ ナーゼ-ζITAMの発現のために使用した。このプラスミドは２ミクロンの複製起 点とAmp(細菌)またはTrp(酵母)選択のための配列とを有する。pGTB9はまた、GAL 4DBD融合タンパク質の発現を命令するADH1調節配列も有する。GAL4コーディング 配列の下流は、複数の制限エンドヌクレアーゼクローニング部位である。 vSrc遺伝子(Genbank受託#J02342)キナーゼドメインを、PCR増幅後にEcoRI/Bam HI断片としてpGTB9中のGAL4配列の下流に導入した。PCRに利用した５'および３' オリゴヌクレオチドはそれぞれ次の通りであった：(EcoRI末端)cgGAATTCtccaagc cccagaccca（配列番号１）および(Bam H1末端)gcGGATCCctcagcgacctccaaca(配列 番号２)。これらのオリゴヌクレオチドはvSrcの残基248〜526を増幅する。PCRで 得られたvSrcキナーゼDNAをクローニング後に配列決定して増幅プロセスの忠実 度をチェックした。 pET23b（Invitrogen）中にクローニングしたヒトζ鎖細胞質残基をコードする 配列(Genbank受託#J04132、残基52〜164)を、Nde １およびHInd IIIを用いて切 り出した。ζ残基をコードする制限断片を、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末 端化し、平滑末端化Sall消化pGTB9-vSrcキナーゼDNAに結合させた。この組換えD NAを制限エンドヌクレアーゼで消化させて、適正な向きでζコーディング配列を 含んでいるクローンを同定した。 Ｂ．pYAZ22、GAL4活性化ドメイン−縦列ZAP SH2酵母発現ベクター プラスミドpGAD424(Clontech Laboratories)を、酵母中でのGAL4活性化ドメイ ン−縦列ZAP SH2融合タンパク質の発現のために使用した。ヒトZAP-70の残基１ 〜259を含有するpGex2KT-huZAP(1-259)(Genbank受託#L05148)をBamHIで消化し、 T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化した。EcoRIリンカー(New England Biol abs、カタログ#1020)を添加した後、ZAPの縦列SH2ドメインをコードするヌクレ オチド配列(残基1〜259)をEcoRI断片として分離し、pGAD424のEcoRI部位中にク ローニングした。 この組換えDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化させて、適正な向きでZAP SH2 ドメインコーディング配列を含んでいるクローンを同定した。 Ｃ．pYerSZ、エストロゲン調節性GAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-ζITAM酵母発現 ベクター ヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン(l.b.d)コーディング配列(残基 282〜595)を、５'および３'オリゴヌクレオチドプライマーとしてそれぞれ(EcoR I末端)cgGAATTCtctgctggagacatgagagct（配列番号３）および(EcoRI末端)cgGAAT TCgactgtggcagggaaaccct(配列番号４)を用いて、pHuER(Genbank受託#M12674）か らPCRにより増幅した。増幅したDNAを制限エンドヌクレアーゼEcoRIを用いて消 化させた後、エストロゲン受容体l.b.d.配列をEcoRI切断pYSZ（実施例1A）中に クローニングした。正しい向きでエストロゲン受容体配列を持っている組換えク ローンを分離した。この新たなプラスミドのpYerSZは、酵母中で、GAL4 DBD-エ ストロゲン受容体l.b.d.-vSrcキナーゼ-ζITAM融合タンパク質の発現を命令する 。 Ｄ．pMSZ、GAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-ζITAM哺乳類細胞発現ベクター pECE72系ベクターであるpBXG1[Sadowski，I．とPtashne，M.，Nucl.Acids Res . ，17:7539(1989)]を、哺乳類細胞中でのGAL4 DBD融合タンパク質の発現のため に用いた。pECE72[Ellis，L.，et al.，Cell，45:721-732(1986)]はSV40ウイル ス複製起点、SV40初期プロモーターおよびSV40ポリアデニル化調節配列を有する 。GAL4(1〜147)およびGAL4コーディング配列に対してＣ末端側の複数のクローニ ング部位を、pSKGAL147[Kakidani，H．とPtashne，M.，Cell，52:161-167(1988) ]からHind III/Xbal断片として得て、Hind III/Xbal切断pECE72中に挿入し、pBX G1を生成させた。 vSrcキナーゼζITAMをコードする配列をpYSZ（実施例1A）からEcoRI/BgIII断 片として切り出し、EcoRI/BamHI消化pBXG1中にクローニングして、哺乳類細胞中 でGAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-ζITAMの発現を命令することができるプラスミドp MSZを生成させた。 Ｅ．pMAZ22、ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン−縦列ZAP SH2ドメイン哺 乳類細胞発現ベクター pMVN1(Ivan Sadowski，ブリティッシュコロンビア大学、カナダ、バンクーバ ー）を哺乳類細胞中での転写活性化ドメイン−縦列ZAP SH2ドメイン融合タンパ ク質の産生のために用いた。pMVN 1は、SV40初期プロモーター、HSV TK翻訳リー ダー配列、SV40核局在化配列およびVP16活性化ドメイン残基を持ち、その後に新 規融合タンパク質の作成のための複数のクローニング部位を含んでいる。ZAPの 縦列SH2ドメインをコードする配列(残基1〜259)を、pYAZ22（実施例1B）からEco RI断片として切り出し、EcoRI消化pMVN1中に適正な向きでクローニングした。 Ｆ．pMerSZ、GAL4(1-147)-エストロゲン受容体l.b.d.-vSrcキナーゼ-ζITAM哺 乳類細胞発現ベクター ヒトエストロゲン受容体l.b.d．コーディング配列を上の1Cに記載したように して用意した。 増幅したDNAをEcoRIを用いて消化させた後、エストロゲン受容体l.b.d.配列を EcoRI切断pMSZ（実施例1D）中にクローニングした。正しい向きでエストロゲン 受容体配列を持っている組換えクローンを分離した。この新たなプラスミドのpM erSZは、哺乳類細胞中で、GAL4 DBD-エストロゲン受容体l.b.d.-vSrcキナ−ゼ- ζITAM融合タンパク質の発現を命令する。 Ｇ．pYSBNGAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-βITAM酵母発現ベクター pGTB9-vSrcキナーゼDNA(実施例1A参照)をGAL4 DBD-vSrcキナーゼ-βITAM鎖融 合タンパク質の産生のために遺伝子工学操作した。β配列(Genbank受託#S21154) はpCD8−β[Rivera，V．とBrugge，J.，Mol ．Cell．Biol.，15:1582-1590(1995) ]から、５'および３'オリゴヌクレオチドとしてそれぞれ(BamHI末端)gcGGATCCgg agctggggaagaactca（配列番号５）および(Shll末端)acgcGTCGACttataaatcaa tgggaggag(配列番号６)を用いて増幅した。得られた増幅DNAは、BamHIおよびSal lで消化させた後に、BamHI/Sall消化pGTB9-vSrcキナーゼ中にクローニングした 。 Ｈ．pYerSB、GAL4(1-147)-エストロゲン受容体l.b.d.-Srcキナーゼ-βITAM酵 母発現ベクター 同じヒトエストロゲン受容体l.b.d．コーディング配列を上の1Cに記載したよ うに用意し、PCRにより増幅して、EcoRI切断pYSB（実施例1G）中にクローニング した。正しい向きでエストロゲン受容体配列を持っている組換えクローンを分離 した。この新たなプラスミドのpYerSBは、酵母中でGAL4 DBD-エストロゲン受容 体l.b.d.-vSrcキナーゼ-βITAM融合タンパク質の発現を命令する。 Ｉ．pYAS32、GAL4活性化ドメイン−Src SH3/SH2酵母発現ベクター pGAD424(Clontech Laboratories)を、酵母細胞中での転写活性化ドメイン−ヒ トSrc SH3/SH2ドメイン融合タンパク質の産生のために使用した。Src SH3/SH2ド メインをコードする配列（残基84〜249）[Tanaka，A.とFujita，D.J.，Mol ．Cel l．Biol. ，6:3900-3909(1986)]を、５'および３'オリゴヌクレオチドとしてそれ ぞれ(EcoRI末端)cctcacGAATTCggtggagtgaccacctttgtggcc(配列番号７)および(Ba mHI末端)ccactcGGATCCgccggggcacacggtggtgaggc（配列番号８）を用いてPCRによ り増幅した。EcoRIおよびBamHIを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化後に、PCR 産物をEcoRI/BamHI消化pGAD424に結合させた。 J．pYAS2、GAL4活性化ドメイン−Src SH2酵母発現ベクター pGAD424を、酵母細胞中での転写活性化ドメイン−ヒトSrc SH2ドメイン融合タ ンパク質の産生のために使用した。Src SH2ドメインをコードする配列（残基144 〜249）[Tanaka，A.とFujita，D.J.,(1986)上掲］を、５'および３'オリゴヌク レオチドとしてそれぞれ(EcoRI末端)cctcacGAATTCggcgactccatccaggctgaggag(配 列番号９)および(BamHI末端)ccactcGGATCCgccggggcacacggtggtgaggc（配列番号1 0)を用いてPCRにより増幅した。 EcoRIおよびBamHIを用いた消化後に、PCR断片をEcoRT/BamHI消化pGAD424中に クローニングした。 Ｋ．pMSB、GAL4(1-147)-vSrcキナーゼ-βITAM鎖哺乳類細胞発現ベクター pYSB（実施例1G）を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBgIIIで切断し、vSrc キナーゼ-βITAM鎖残基をコードするDNA断片を分離し、EcoRI/BamHI消化pBXG1( 実施例1G)に結合させた。 Ｌ．pMerSB、GAL4(1-147)-エストロゲン受容体l.b.d.-vSrcキナーゼ-βITAM鎖 哺乳類細胞発現ベクター pMSB（実施例1K）を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで切断した。上の1Cに記載 したようにして用意した、ヒトエストロゲン受容体l.b.d．コーディング配列を 含んでいるEcoRI DNAフラグメントを、EcoRI消化pMSBに結合させた。正しい向き でエストロゲン受容体配列を持っている組換えクローンを分離した。この新たな プラスミドのpMerSBは、哺乳類細胞中でGAL4 DBD-エストロゲン受容体1.b.d.-vS rcキナーゼ-βITAM融合タンパク質の発現を命令する。 Ｍ．pMAS32、ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン−ヒトSrc SH3/SH2ドメイ ン融合タンパク質哺乳類細胞発現ベクター pMVN 1(Ivan Sadowski,ブリティッシュコロンビア大学、カナダ、バンクーバ ー）を哺乳類細胞中でのTAD−ヒトSrc SH3/SH2ドメイン融合タンパク質の産生の ために用いた。Src SH3/SH2ドメインをコードする配列（残基84〜249、上記を参 照）を、５'および３'オリゴヌクレオチドとしてそれぞれ(EcoRI末端)cctcacGAA TTCggtggagtgaccacctttgtggcc(配列番号11)および(BamHI末端)ccactcGGATCCgccg gggcacacggtggtgaggc（配列番号12）を用いてPCRにより増幅した。 EcoRIおよびBamHIを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化後に、PCR産物をEcoRI /BamHI消化pMVN 1に結合させた。 Ｎ．pMAS2、ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン−ヒトSrc SH2ドメイン融合 タンパク質哺乳類細胞発現ベクター Src SH2ドメインをコードする配列（残基144〜249）［Tanakaら，上掲］を、 ５'および３'オリゴヌクレオチドとしてそれぞれ(EcoRI末端)cctcacGAATTCggcga ctccatccaggctgaggag(配列番号13)および(BamHT末端)ccactcGGATCCgccggggcacac ggtggtgaggc（配列番号14）を用いてPCRにより増幅した。 EcoRIおよびBamHIを用いた消化後に、PCR断片をEcoRI/BamHI消化pMVN 1（実施 例1M）中にクローニングした。 Ｏ．pMerVP、GAL4 DBD-エストロゲン受容体l.b.d.-VP16 TAD融合タンパク質哺 乳類細胞発現ベクター 上の1Cに記載したようにして用意した、ヒトエストロゲン受容体l.b.d．コー ディング配列を含んだEcoRI DNA断片を、EcoRI消化pBXG1(実施例1G)に結合させ た。正しい向きでエストロゲン受容体配列を含んでいるクローン（pMerと称する ）を制限エンドヌクレアーゼ分析により同定した。VP16 TAD残基を鋳型プラスミ ドpMVN1(実施例1M)と５'および３'オリゴヌクレオチドとしてそれぞれ(BamHI末 端)cgGGATCCagcctgggggacgagctc(配列番号15)および(Spel末端)ggACTAGTcccaccg tactcgtcaat(配列番号16)を用いて増幅した。BamHIおよびSpelによる消化後に、 PCRフラグメントをBamHI/Spel消化pMer中にクローニングした。 Ｐ．pMAF2、ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン−ヒトFyn SH2ドメイン融合 タンパク質哺乳類細胞発現ベクター Fyn SH2ドメインをコードする配列(残基149〜251)[Genbank M14333]を、Fyn S H2ドメインコーディング配列がEcoRIおよびBamHI末端を含むように５'および３' オリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅した。EcoRIおよびBamHIを用いた消 化後に、PCRフラグメントをEcoRI/BamHI消化pMVN1(実施例1M)中にクローニング した。実施例２：安定な哺乳類細胞系 実施例１に記載した選択したプラスミドDNAを、リポフェクチン試薬(Gibco BR L)を製造業者が示唆するように使用して哺乳類細胞中に導入することにより、多 様な細胞系が確立された。 選択した宿主細胞系は哺乳類HT1080繊維肉腫細胞系［American Type Culture Collection受託番号CRL7951］である。この細胞は、下記を含んでいるSEAPリポ ーター作成物を用いてリポフェクションにより調製される： （a）GAL4応答／依存性プロモーター（５つのGAL4結合部位がコアのIL-2プロ モーターに結合したもの、”G5-IL2”プロモーター）、これは次の(b)の上流に 位置する、 （b）分泌アルカリ性ホスファターゼ(SEAP)コーディング配列、および ハイグロマイシン遺伝子を含むプラスミド。 この細胞系G5-IL2 HT1080を以下の多様な実施例に使用した。実施例３：ツーハイブリッド機構に基づくin vivoアッセイ−哺乳類細胞中での ζITAM−縦列ZAP SH2依存性ツーハイブリッド形成 本発明のアッセイの基本的な例において、ツーハイブリッド相互作用が、Ｔ細 胞活性化中に起こる決定的な事象、即ち、Ｔ細胞受容体のTCRζITAM鎖へのZAP-7 0チロシンキナーゼのSH2ドメイン依存性結合、を反復する。 実施例２のG5-IL2 HT1080繊維肉腫細胞系をリポフェクションにより次の２つ のエフェクタープラスミドでトランスフェクションする： 1）pMSZ(実施例1D)は、GAL4 DBD残基、vSrcキナーゼドメイン及びヒトζITAM 鎖からなる新規な融合タンパク質の発現を命令する。この融合タンパク質がDNA に結合し、チロシンキナーゼ活性を持つことになる。G5-IL2プロモーターに局在 化したこれら分子のクラスタリング（集塊化）は効率的なζITAMリン酸化の促進 を助けることになる。 2）pMAZ22(実施例1E)はヘルペスウイルスVP16 TADに融合したZAPの縦列SH2ド メインの発現を生じさせる。 対照および比較として使用するため、担体DNAだけで、またはpMSZだけで、ま たはpMS（GAL4 DBD-vSrcキナーゼ）で、またはpMSおよびpMAZ22で、HT1080細胞 をトランスフェクションした。 トランスフェクションした宿主細胞を６ウェル皿で培養した。トランスフェク ションから48時間後に、培地中に放出されたSEAPの量を、蛍光分析を用いて定量 した[J．Berger et al.，Gene，66:1-10(1988)]。ツーハイブリッド形成の程度 （即ち、ZAP SH2-ζITAM相互作用の転写への影響と量）は、培地中に放出された SEAPリポーター遺伝子の量（即ち、活性）を測定することにより確認した。 このアッセイ結果を図２に示す。担体DNAでトランスフェクションした細胞は 培地中にSEAPを放出しない（図２、１欄）。GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-ζITAM融合 タンパク質は、細胞中で発現させた時に、競合的転写アクティベーターではない （図２、２欄）。しかし、さらにVP16-縦列ZAP SH2融合タンパク質をこれら の細胞中で作ると、ツーハイブリッド形成によって転写が誘導され、細胞は多量 のSEAPを培地中に分泌する（図２、３欄）。即ち、HT1080繊維肉腫細胞中でのSE AP産生の誘導に必要な要件は、チロシンリン酸化ζITAMと縦列ZAP SH2ドメイン との相互作用と一致する。SEAP産生の誘導には、上記２種類の融合タンパク質の 両方の発現が必要である。ZAP SH2ドメインによるチロシンリン酸化ζITAMの認 識および結合が、VP16 TADをプロモーターに効果的にもたらし、それによりSEAP リポーター遺伝子の転写が誘導される。 ツーハイブリッド形成はζITAM鎖依存性（図２、３欄と５欄を比較）である。 さらに、GAL4 DBD融合タンパク質でvSrcキナーゼドメインを欠失したもの(GAL4D BD-ζITAM)またはζ鎖を欠失したもの、即ち、pMS（GAL4 DBD-vSrcキナーゼ）は 、単独またはpMAZ22、即ち、VP16 TAD-縦列ZAP SH2融合タンパク質と一緒に細胞 中で産生させた場合に、SEAP産生を誘導することができない（図２、４および５ 欄を参照）。対照として１欄と２欄も参照。図２に示した結果に加えて、GAL4 D BDおよびVP16 TAD-縦列ZAP SH2をコードするか、またはGAL4 DBD-vSrcキナーゼ- ζITAMおよびVP16 TADをコードするプラスミドを含む細胞はSEAPを産生すること ができない。 従って、異種細胞系において、正常ではＴ細胞中で起こる縦列ZAP SH2:hITAM 相互作用が再現され、これら２つの分子間の相互作用の程度を監視するための簡 便で鋭敏な手段が本発明により提供された。 これら２種類の分子の相互作用の指標としてSEAP産生を利用することにより、 ZAP SH2ドメイン依存性相互作用を特異的に阻害することができる化合物を同定 することが可能となる。宿主細胞の培養時に、細胞を試験化合物に暴露する。試 験化合物がZAP SH2とζITAMとの間の相互作用をどれだけうまく阻止するかの程 度が、SH2阻害剤の存在を示す。 上記のように組み立てられたアッセイでは、ZAP SH2依存性相互作用を阻害す る分子についてスクリーニングする際の潜在的な１つの欠点は、このツーハイブ リッドスクリーンの相互作用成分の構成的発現により、構成的なZAP SH2-ζITAM 複合体生成を生ずる可能性があることである。従って、この態様のアッセイは、 ツーハイブリッド形成を効率的に妨害する化合物だけを同定する。実施例４：転写誘導されたツーハイブリッド形成：ZAPSH2ドメイン機能を阻害す る化合物用の哺乳類細胞スクリーンとしての別のツーハイブリッドアッセイ 本発明のアッセイの別の態様において、阻害性かもしれない試験化合物に細胞 を暴露し、ついでその会合を阻害すべきタンパク質間の相互作用を誘導する。こ の態様のアッセイは、細胞中でζITAMと縦列ZAP SH2の両方の融合タンパク質の 産生のためのプラスミドを使用する（実施例２に述べたように）ことに依存し、 このプラスミドは構成的な（即ち、SV40ウイルス系）転写調節配列ではなく、誘 導的な転写調節配列を持つ。 誘導性転写調節配列の例として、マウス乳癌ウイルス(MMTV)デキサメタゾン誘 導プロモーターがある。他の既知の調節配列もここで有用である。従って、例え ば、GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-ζITAM融合タンパク質をコードする配列をMMTV誘導 性調節配列に結合させたとすると、融合タンパク質産生はデキサメタゾン依存性 となろう。このリポーター細胞系を次いで、阻害性かもしれない化合物に暴露し 、デキサメタゾンを用いてツーハイブリッド形成を誘導させる。この態様では、 SH2ドメイン結合が阻害性化合物により影響を受けない場合に、ζITAM-縦列ZAP SH2ツーハイブリッド形成が起こる。 哺乳類G5-IL2 HT1080繊維肉腫細胞系（実施例２）をリポフェクションにより 次の２つのエフェクタープラスミドでトランスフェクションする： （1）一方のプラスミドはTAD-ZAP縦列SH2の発現を構成的に生じさせる。 （2）他方のプラスミドは、デキサメタゾン(Dex)誘導性MMTVプロモーターを用 いて発現される融合タンパク質GAL4DBD-vSrcキナーゼドメイン-ζITAMをコード する。 トランスフェクションされた哺乳類細胞を96ウェル皿に接種し、試験化合物の 連続希釈液を各ウェルに加える。培地にDexを添加する。Dexの添加によりリン酸 化ζITAM融合タンパク質が細胞中に蓄積する。24時間のインキュベーション後、 培地を96ウェル皿から取り出し、第２の96ウェル皿に移して、SEAPについて比色 (chromogenic)または蛍光分析を行う。SEAP分析は96ウェルプレート読み取り機 を用いて測定する。培地中に放出されたSEAPの量は、比色または蛍光分析のい ずれかを用いて定量化することができる。 融合タンパク質がZAP SH2ドメインに結合することにより、TADがSEAPプロモー ターにもたらされ、SEAPが産生する。リン酸化h-ITAMのdex誘導産生が起こる前 にZAP SH2ドメインに結合するように化合物が細胞中に存在しよう。ZAP SH2機能 を阻止する化合物はSEAP産生を低減させる。SEAP産生を低減させた化合物を、ZA P SH2依存的にSEAPを発現する細胞を用いて分析することにより、その化合物がZ AP:SH2-ζITAM複合体形成に対して特異的効果を持っていることを確認する。実施例５：ツーハイブリッドアッセイで哺乳類細胞中のβITAM-Src SH2ドメイン 依存性ツーハイブリッド形成を検出 SrcチロシンキナーゼSH2ドメイン依存性相互作用を検出するのに有用なツーハ イブリッドアッセイを次のようにして行う。 G5-IL2 HT1080細胞（実施例２）を下記のプラスミドDNAでトランスフェクショ ンした： （a）pMSB(実施例1K:GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-βITAM); （b）pMSBおよびpMAS2(実施例1N:VP16-Src SH2);または （c）pMSBおよびpMAZ22(実施例1E:VP16-縦列ZAP SH2)。 これらのトランスフェクションされた哺乳類細胞を96ウェル皿に接種する。ト ランスフェクションから48時間後に、培地中に放出されたSEAPの量を蛍光分析を 用いて定量した。 結果を図６に示す。１欄は、pMSB(GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-IgE受容体βITAM融 合タンパク質）がそれ単独では転写アクティベーターの能力をもたないことを示 している。しかし、細胞中にpMAS2（VP16-Src SH2融合タンパク質）も存在する と、転写が誘導される(２欄を参照）。これに対し、VP16-縦列ZAP SH2はGAL4 DB D-vSrcキナーゼ-βITAM融合タンパク質とは効率的に相互作用してSEAP産生を誘 導することはない（３欄を参照）。 pMAS2を、HT1080繊維肉腫の指標細胞系中でGAL4 DBD-vSrcキナーゼ-ζITAMと 共発現させた場合には、SEAP産生は認められなかった（データは示さず）。β ITAM残基をζITAM残基で置換すると、このような条件を用いたツーハイブリッド 形成（SEAP産生）は見られない。９ 実施例４と５の両者をまとめると、ツーハイブリッド形成はITAMおよびSH2ド メインに特異的であるようである。縦列ZAP SH2ドメインはζITAMに結合するが （図２および３）、βITAMには結合しない（図６、３欄）。Src SH2ドメインは βTTAMに効率的に結合するが（図６）、ζITAM残基にはそうではない。ZAP SH2 ドメインとζITAMを用いた場合に見られるように、Src SH2依存性ツーハイブリ ッド形成は、次に述べるように、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン残基 を用いて誘導性にすることができる。実施例６：転写後誘導ツーハイブリッド形成：哺乳類細胞用のステロイド依存性 ツーハイブリッドアッセイ Ａ．哺乳類細胞におけるζITAM−縦列ZAP SH2依存性ツーハイブリッド形成の エストロゲン調節（一時的トランスフェクション） 哺乳類G5-IL2 HT1080繊維肉腫細胞系（実施例２）をリポフェクションにより 次の２つのエフェクタープラスミドでトランスフェクションする： 1）pMerSZ(実施例1F)は、哺乳類細胞中でGAL4 DBD-ER l.b.d.-vSrcキナーゼ- ζITAM融合タンパク質の産生を生じさせる。 2）pMAZ22、VP16 TAD-縦列ZAP SＨ2(実施例1E)。 対照および比較として、担体DNAだけで、またはpMSZだけで、またはpMSZおよびp MAZ22で、またはpMerSZだけで、G5-IL2 HT1080細胞をトランスフェクションした 。 これらのトランスフェクションした哺乳類細胞をそれぞれ６ウェル皿に接種し 、試験化合物の連続希釈液をウェルに添加する。トランスフェクションから24時 間後、もう１つの皿(duplicate dish)の細胞を10nMエストロゲンの存在下で培養 した。 トランスフェクションから48時間後に、全ての皿からの培地の一部を６ウェル 皿から取り出し、96ウェル皿に移してSEAP活性を測定するために比色または蛍光 分析を行った。 図３はこの分析結果を示す：担体DNAでトランスフェクションされた細胞系は １欄と２欄に、pMSZ（実施例1D）でトランスフェクションされたものは３欄と４ 欄に、またpMSZとpMAZ22の両方でトランスフェクションされたものは５欄と６欄 に報告されている。７欄と８欄は、プラスミドpMerSZだけでトランスフェクショ ンされた細胞系の結果である。９欄と10欄は、上記のようにpMerSZとpMAZ22の両 方でトランスフェクションされた細胞系の結果である。 GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-ζITAM融合タンパク質へのエストロゲン受容体l.b.d. 残基の添加は、ツーハイブリッド形成をエストロゲン依存性にする（図３の９欄 と10欄を比較）。即ち、外来添加したエストロゲンの不存在下では、融合タンパ ク質(GAL4-DBD-ER l.b.d.-vSrcキナーゼ-g-ITAM)は機能しない。実際は、図３の ９欄は、ごく低レベルのSEAPが培地中に検出されたことを示している。これは、 恐らくは血清中に存在する低レベルのエストロゲンに起因するものである。エス トロゲンを含まない規定合成培地中で細胞の培養を行えば、低レベルのSEAPは認 められない。プラスミドpMerSZとpMAZ22を細胞中で一緒に発現させた場合、エス トロゲンが培地中に存在する（10欄）のでなければ、ツーハイブリッド形成（リ ポーター遺伝子転写）は起こらないことになる（９欄）。これらのトランスフェ クションした細胞を10nMエストロゲンに露出すると、多量のSEAPが培地中に放出 された。 エストロゲン受容体l.b.d.が融合タンパク質を発現するいずれかのプラスミド 中に存在しないと、エストロゲンはツーハイブリッド形成に著しくは影響しなか った（５欄と６欄）。また、エストロゲン受容体l.b.d.残基は、GAL4 DBD-vSrc キナーゼ-ζITAM融合タンパク質それ自体を転写アクティベーターにするもので はない（図３、７欄と８欄）。 SEAP誘導は時間依存性であり、SEAPの大部分は細胞をエストロゲンに暴露し後 12〜18時間で産生した（安定にトランスフェクションされた細胞による類似の結 果については図５を参照）。 Ｂ．哺乳類細胞におけるβITAM−Src SH2依存性ツーハイブリッド形成のエス トロゲン調節（一時的トランスフェクション） ζITAM作成物について上述したのと同様の方法で、G5-IL2 HT1080細胞を次の ２つのプラスミドDNAでトランスフェクションした（皿は２組づつ）：pMerSB、 またはpMerSBとpMAS2。トランスフェクションから24時間後、１枚の皿の細胞を1 0nMエストロゲンの存在下で培養した。さらに24時間後、全ての皿からの培地の 一部をSEAP活性について分析した。 図７に示すように、エストロゲンの存在(+)および不存在(-)が示され、各欄は pMerSB（実施例1L）でトランスフェクションされた細胞（１欄と２欄）またはpM erSBとpMAS2(実施例1N)とでトランスフェクションされた細胞（３欄と４欄）を 表している。GAL4 DBD-vSrcキナーゼ-βITAM融合タンパク質へのエストロゲン受 容体l.b.d.残基の付加は、ツーハイブリッド形成をエストロゲン依存性にする（ ３欄と４欄を比較）。これに対し、エストロゲン受容体l.b.d.残基は、GAL4DBD- vSrcキナーゼ-βITAM融合タンパク質それ自体を転写アクティベーターにしない （１欄と２欄）。 Ｃ．哺乳類細胞中でGAL4 DBD-エストロゲン受容体l.b.d.-Srcキナーゼ-g-ITAM およびZAP-SH2活性化ドメインを構成的に発現する安定な細胞系 組込まれたGAL4依存性SEAPリポーター遺伝子を含んでいるG5-IL2 HT1080細胞 （実施例２）を、pBabeNeo（ネオマイシン選択）とpMerVP（実施例10）とでトラ ンスフェクションし、そしてGAL4 DBD-エストロゲン受容体l.b.d.-vSrcキナーゼ -ζITAMとVP16TAD-縦列ZAP SH2の構成的産生を生じさせる２つのエフェクタープ ラスミド、即ち、それぞれpMerSZ（実施例1F）とpMAZ22（実施例1E）をこの細胞 中にネオマイシンと共にトランスフェクションした。 ハイグロマイシンとネオマイシンの両方で選択した後、該リポーター遺伝子（ ハイグロマイシン選択）および両方のエフェクタープラスミド（ネオマイシン選 択）を含有する細胞系を得た。個々のコロニーを分離し、拡張させた。一組の細 胞を10nMエストロゲンに露出した。両方の組の細胞をエストロゲン誘導（＋誘導 物質）SEAP活性について分析した。SEAP産生を著しく誘導したものをさらに分析 するため拡張させた。 分析したMerSZおよびMAZ22を含んでいる12のコロニーのうち、５つのコロニー がエストロゲン暴露後に高レベルのSEAP活性を示した（図４）。これらのクロー ンの２つ（クローンＡおよびクローンＤ）が非常に高レベルのエストロゲン誘 導SEAP遺伝子発現を示した。培地中のSEAPの量は、10nMエストロゲンの添加後に 200倍（細胞系#3）および600倍（細胞系#6）を誘導した。エストロゲン調節性Me rUPを組合わせた安定な細胞系も得られた（実施例6D）。 誘導的ζITAM-縦列ZAP SH2依存性ツーハイブリッド活性を持つこの安定な細胞 系のSEAP産生の時間経過を次のように検討した。クローンＤ（図４）を10nMエス トロゲンの存在下で培養し、エストロゲン添加後の異なる時点で培地をSEAP活性 の存在について分析した。図５に示すように、SEAP産生の大部分は12時間までに 起こる。クローンＤ細胞は、エストロゲンを培地に外から添加した時には、認め うる量のSEAPを産生しない（図４を参照）。また、親細胞（G5-IL2 HT1080細胞 ）は、10nMエストロゲンの存在下で24時間培養した時にSEAPを産生しない（図５ の-E，+E欄を比較）。 Ｄ．対照細胞系 SH2依存性ツーハイブリッド形成（SEAP産生）をブロックする化合物について スクリーニングする際に、非特異的効果を持つ化合物も同定されることになる。 このような化合物としては、細胞毒性のもの、転写、翻訳または分泌に影響を及 ぼすもの、GAL4 DNA結合またはエストロゲン受容体リガンド結合ドメインに影響 を及ぼすものが挙げられる。従って、SH2依存性アッセイを用いて同定される化 合物を、GAL4 DBD-エストロゲン受容体l.b.d.-VP16融合タンパク質を構成的に発 現する細胞系を用いて試験する。 エストロゲンの存在下(+)または不存在下(-)で誘導性GAL4-エストロゲン受容 体l.b.d.-VP16転写アクティベーターを含むあるクローン（細胞系６）で得られ た結果を図８に示す。上記のように非特異的効果を発揮する化合物は、この細胞 系を用いた時に陽性の評点を与えよう。実施例７：本発明の方法により同定された阻害剤の結合活性の特性決定方法 本発明の方法により同定された阻害剤の結合活性を特性決定するいくつかの方 法（例、逆スクリーン）を、PBDが興味あるSH2ドメインである場合について次に 説明する。 １．競合的結合アッセイ： 表面プラスモン共鳴[Malmqvist，M.，Curr ．Opin．Immunol.，５，282-286(1 ウェイ、ニュージャージー）で行われるように結合を競合により測定する。SH2 タンパク質、例えば、pp60src、pp70ZAP、またはpp72syk、を各種濃度の試験化 合物と一緒にプレインキュベーションし、試験化合物のホスホペプチドリガンド への結合の競合的阻害能力を測定する。結果を、競合物質の不存在下で測定され た結合と比較し、阻害率（％）として表す。 IC50値は、結合を50％だけ減少させるのに必要な阻害剤の濃度を意味する。個 々のアッセイの詳細は以下に述べる。全てのアッセイは、10mM HEPES（pH7.4）/ 150mM NaCl/3.4mM EDTA/0.05％界面活性剤P20からなるHEPES緩衝化食塩水中で、 25℃および５μL/minの流量で行われる。 ａ．縦列Sykアッセイの詳細 ヒトFceRIのγ鎖ITAMに対応するpp72sykペプチドリガンド[DGVY(PO4)TGLSTRNQ ETY(PO4)ETLK(配列番号17)]を、より大きなペプチド[Ac-CGGDGVY(PO4)TGLSTRNQE TY-(PO4)ETLK-NH2(配列番号18)]の一部として合成し、Syk感受性バイオセンサー 表面を形成するために使用した。具体的には、バイオセンサーチップCM5を200mM エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩(EDC)/50mM n-ヒ ドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化させて、第一級アミンに反応性の表面を 形成し；エチレンジアミンで処理して第一級アミンに富む表面を形成し；m-マレ イミドベンゾイル-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル(sulfo-MBS；25mM NaHC O3中50mM)で活性化させて、遊離チオールに反応性の表面を形成し；そして該ITA MペプチドをＮ末端のシステインを介して固定した。未反応部位をb-メルカプト エタノールでブロックし、6Mグアニジン塩酸塩を用いた洗浄によりチップから非 共有結合ペプチドを除去した。アッセイは、HBS中、20nM pp72syk(1-265)+/-試 験阻害剤を用いて行った。 b.C-Sykアッセイの詳細 ヒトFceRIのヘミリン酸化γ鎖ITAMに対応するpp72sykペプチドリガンド[DGVY( PO4)TGLSTRNQETYETLK(配列番号19)]を、より大きなペプチド[Ac-CGGDGVY(PO4)TG LSTRNQETYETLK-NH2(配列番号20)]の一部として合成し、縦列sykに対して 上述したようにC-Syk感受性バイオセンサー表面を形成するために使用した。ア ッセイは、HBS中270nM pp72syk(163-265)+/-試験阻害剤を用いて行った。 ｃ．縦列ZAPアッセイの詳細 ヒトＴ細胞受容体のζ鎖ITAM-1に対応するpp70ZAPペプチドリガンド[NQLY(PO4 )NELNIGRREEY(PO4)DVLD(配列番号21)]を、より大きなペプチド[Ac-KGGNQLY(PO4) NELNIGRREEY-(PO4)DVLD-NH2(配列番号22)]の一部として合成し、ZAP感受性バイ オセンサー表面を形成するために使用した。具体的には、バイオセンサーチップ CM5を200mM EDC/50mM NHSで活性化させて、第一級アミンに反応性の表面を形成 し；そして該ITAMペプチドをＮ末端のリシンを介して固定した。未反応部位をエ タノールのアミン(1M水中)でブロックし、6Mグアニジン塩酸塩を用いた洗浄によ りチップから非共有結合ペプチドを除去した。アッセイは、HBS中、10nM pp70ZA P(1-259)+/-試験阻害剤を用いて行った。 ｄ．Srcアッセイの詳細 ハムスター・ミドルＴ抗原に対応するp60srcペプチドリガンド[QY(PO4)EEIPI( 配列番号23)]をより大きなペプチド[Ac-KGGQY(PO4)EEIPI-NH2(配列番号24)]の一 部として合成し、縦列ZAPに対して上述したようにsrc感受性バイオセンサー表面 を形成するために使用した。アッセイは、HBS中、270nM pp60src(144-251)+/-試 験阻害剤を用いて行った。実施例８：酵母系ツーハイブリッドスクリーニングアッセイ 哺乳類細胞を用いてここで説明した構成的ならびに誘導的Src SH2およびZAPSH 2依存性ツーハイブリッドシステムは、酵母細胞でも有用である。GAL4依存性で あるプロモーターに連結されたβ−ガラクトシダーゼからなる組込まれたリポー ター遺伝子を含んでいる酵母株で実証した。ツーハイブリッド形成はβ−ガラク トシダーゼを誘導し、これは酵母アッセイを用いて、または酵素を産生する細胞 をX-GALに露出した時に生ずる青色から検出することができる。哺乳類細胞の場 合と同様に、酵母中でのSH2依存性ツーハイブリッド形成は、エストロゲン受容 体リガンド結合ドメインを用いてエストロゲン依存性にすることができる。 srb1遺伝子中に突然変異を含んでいるもののような酵母株をツーハイブリッド アッセイに対して使用する。srb1のtslアレレを含んでいる細胞は増大したエン ドサイト−シスを示し、一般に増大した透過性を持つ。細胞を、ツーハイブリッ ドスクリーンに用いたプラスミドを選択的に増殖させることができるように遺伝 子工学操作する。 a）HIS3-1,2,4-トリアゾールアッセイ このアッセイでは、ヒスチジンに対して栄養要求性の細胞を、LexA DNA結合部 位を含むプロモーターにより制御されるHIS3遺伝子で形質転換する。ZAPの縦列S H2ドメインを、このLexA DBDに連結させて細胞中で発現させる。この融合タンパ ク質はDNAに結合するが、転写アクティベーターの能力はもたない。TCRζITAM配 列も、核局在化配列、Lckチロシンキナーゼ触媒ドメインおよび転写活性化ドメ インを包含するハイブリッドタンパク質の一部として、該細胞中で発現させる。 Lckキナーゼドメインは、cisまたはtransのいずれかでζITAM配列のチロシン残 基をリン酸化する可能性を持って、核内にあって活性であるべきである。 ZAP SH2ドメイン-LexAタンパク質とのリン酸化ζITAM-転写活性化ドメイン融 合タンパク質の相互作用は、HIS3転写を活性化させ、ヒスチジンが欠失した培地 中で増殖できる細胞を生ずる。リン酸化ζITAMとのZAP SH2ドメインの相互作用 を妨害する化合物は、HIS3転写のレベルを低減させよう。この相互作用を効率的 にブロックする化合物は、ヒスチジンが欠失した培地中での酵母増殖を妨げる。 しかし、ZAP SH2−ζITAM会合の阻害が弱い化合物は、該細胞によるヒスチジン 産生を急激に低下させて生存性に影響するにちがいないので検出されない。 このアッセイの感度は、ZAP SH2−ζITAM会合を弱くブロックする分子も検出 できるように適合させることができる。ヒスチジンの競合的阻害剤である3-アミ ノ-1,2,4-トリアゾールの存在下で細胞を増殖させる。細胞の培養は、細胞生存 性に影響を生ずるのに必要な量よりわずかに低い3-アミノ-1,2,4-トリアゾール の濃度を用いて行う。影響を受けた細胞はもはや増殖しないので、HIS3転写のわ ずかな低減しか発動させない化合物も同定される。 上記アッセイで評点を得た化合物が、ZAP SH2−ζITAM会合に特異的に影響す ることによって増殖に対するそれらの効果を発揮するかどうかを評価するのに有 用 な逆スクリーンが２つある。１つの逆スクリーンでは、細胞をヒスチジンの存在 下で培養する。ZAP SH2阻害剤はこの条件下では細胞の増殖に影響を及ぼさない 。第２の逆スクリーンでは、同じ酵母株を確立させるが、但し該活性化ドメイン に遺伝子的に融合させたLexA DBDのモノマーによりHIS3の転写を生じさせ、こう してHIS3遺伝子の転写はZAP SH2-ζITAM会合に依存性ではなくなるようにする。 具体的には、対数期増殖中の酵母宿主細胞を、ヒスチジンを含まず、3-アミノ -1,2,4-トリアゾールを含む培地中で96ウェル皿に接種する（細胞0.1ml）。化合 物の連続希釈液をウェルに添加する。培養液を振盪台上にて30℃で１〜２日イン キュベーションする。増殖に対する化合物の影響を96ウェルプレート読み取り機 を用いて評価する。 このアッセイの読みは増殖阻害（ツーハイブリッド依存性HIS3転写の妨害）に 依存する。陽性と評価された化合物が酵母に対して毒性ではないことを確認する ため二次アッセイを行うべきである。 b）URA3/5-FOAアッセイ 酵母中でのZAP SH2結合を阻害する分子を同定するための第２の手法は、ZAPツ ーハイブリッド依存性細胞死をブロックする能力に基づいて阻害性化合物を試験 するものである。このアッセイでは、LexA DBDに融合して酵母中で縦列ZAP SH2 ドメインを発現させ、ζITAM-Lckドメインを上記作成物におけるのと同様に転写 活性化に融合させる。しかし、このアッセイでは、LexA DBDにより調節されるリ ポーター遺伝子はURA3遺伝子である。 URA3遺伝子産物を発現する細胞は、5-フルオロオロト酸(5-FOA)に暴露すると 死滅する。URA3遺伝子の産物は、5-FOAをフルオロデオキシウリジンに転化させ 、フルオロデオキシウリジンはチミジル酸シンセターゼの強力な阻害剤である。 従って、5-FOAは細胞に対して条件つきで毒性である。縦列ZAP SH2-ζITAM複合 体形成を妨害する化合物は、URA3遺伝子産物の量を減少させる。細胞中の「ツー ハイブリッド」転写アクティベーターの量を慎重に滴定し、なお細胞を殺す範囲 で最低の5-FOA濃度を使用すると、ZAP SH2-ζITAM相互作用を妨げる化合物を同 定する条件が作られる。このような分子は、URA3遺伝子産物レベル（従って、フ ルオロデオキシウリジン濃度）を、毒性量のフルオロデオキシウリジン濃度が生 成するレベルより下に低減させる。 上記8Aのアッセイとは異なり、細胞生存性アッセイである”URA3/5-FOA”スク リーニングを使用した時には毒性化合物は得点がない。実施例９：in vivoでのSRCタンパク質とチロシンリン酸化タンパク質の会合 いくつかのタンパク質が、vSrc形質転換細胞の抽出物からvSrcと共沈降するこ とが報告されている［Kanner，S.B．et al.，EMBO J.，10:1689-1698(1991)；Ko ch，C.A.，Mol ．Cell．Biol.，12:1366-1374(1992)］。高アフィニティーSrc SH 2結合ペプチド［EPQpYEEIPI、ここではYEEI（配列番号25）と表示］がSH2ドメイ ン依存性相互作用をブロックする能力をこのアッセイで実証する。 このアッセイでは、Balb/c 3T3およびSRD-3T3細胞（V-Src形質転換3T3細胞） をRIPA緩衝液中で溶解し、Srcタンパク質をSH2およびSH3結合ペプチドの存在下 および不存在下でSrcのアミノ末端に対するモノクローナル抗体で免疫沈降させ た。試料をニトロセルロースに移し、ブロットをホスホチロシンに対するモノク ローナルでプローブした。２つの主要なチロシンリン酸化タンパク質がSRD 3T3 細胞からv-Srcと共遊走(co-migrate)した。その１つはSrc SH3ドメインに結合し た62kDaチロシンリン酸化タンパク質と共遊走し、もう１つはMr130,000のタンパ ク質と共遊走した。この後者のタンパク質は、恐らくはv-Src免疫沈降物中に既 に検出されている130,000kDaのタンパク質[Koch，C.A.，Mol ．Cell.Biol.，12:1 366-1374(1992)]である。 62kDaタンパク質へのSrcの結合は、抽出物を”Src-Pro”ペプチドまたはリン 酸化YEEI（配列番号25）ペプチドと一緒にインキュベーションすることにより著 しく低減したが、ポリプロリンや非リン酸化YEEI（配列番号25）ペプチドと一緒 では低減しなかった。これは、このタンパク質とSrcとの安定な会合にはSrcのSH 2とSH3の両ドメインが必要であることを示唆している。このタンパク質は全細胞 SH3結合タンパク質中で同定されたp62タンパク質であると決定されたことはなか った。これは、p62抗体がこれらの条件下でSrcと会合する少量の62kDaタンパク 質を認識するのに十分なほど敏感ではないからである。”Src-Pro”ペプ チドおよびYEEI（配列番号25）ペプチドは、Srcへのp130結合の50％を阻害する ことができるだけであるのに対し、両方のペプチドを使用するとp130結合の90％ の阻害が認められた。これは、SH2またはSH3ドメインのいずれかでSrcとのある 程度のp130会合に十分であることを示唆している。 本発明はここに説明した特定の態様に範囲が制限されるものではない。実際、 ここに説明したものに加えて本発明の各種の変更が以上の説明から当業者には明 らかとなろう。このような変更も本発明の範囲内に包含されるものである。 ここに引用した特許、特許出願および刊行物は、その全体を参考として援用す る。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月２５日（１９９７．９．２５） 【補正内容】 請求の範囲 １．下記(a)および(b)の２つの融合タンパク質をコードする組換えDNA分子を含 み、かつ発現することができる細胞であって、 (a)転写活性化ドメインとホスホペプチド結合対の一方のメンバーのそれぞれ １もしくは２以上のコピーを含む第１の融合タンパク質、 (b)DNA結合ドメインと該ホスホペプチド結合対のもう一方のメンバーのそれぞ れ１もしくは２以上のコピーを含む第２の融合タンパク質、 該ホスホペプチド結合対は、(i)１もしくは２以上のチロシン残基を含むペプ チドリガンドと、(ii)このペプチドリガンドのチロシン残基の１もしくは２以上 がリン酸化されると該ペプチドリガンドに結合することができるホスホペプチド 結合ドメインとを含み、 該細胞はさらに、該第２の融合タンパク質が結合することができるDNA配列に 連結されたリポーター遺伝子を含み、このリポーター遺伝子は該トランスジーン を転写活性化ドメインへの接近により活性化させた時に発現する検出可能な遺伝 子産物をコードし、 該細胞が哺乳類細胞であって、該ホスホペプチド結合対がホスファターゼドメ インとそのリガンドまたはPTBホスホペプチド結合ドメインとそのリガンドのい ずれかを含有し、および／または融合タンパク質の一方が１つのキナーゼドメイ ン、２つのホスホペプチド結合ドメインまたは１つのホルモン結合ドメインを含 むことを特徴とする細胞。 ２．該ホスホペプチド結合対が、SH2ドメインとそのリガンド、ホスファターゼ ドメインとそのリガンド、またはPTBホスホペプチド結合ドメインとそのリガン ドを含む請求の範囲第１項記載の細胞。 ３．組換えDNA分子が、 (a)転写活性化ドメインとホスホペプチド結合ドメインの１もしくは２以上の コピーを含む第１の融合タンパク質、および (b)DNA結合ドメインと、リン酸化されると、該ホスホペプチド結合ドメインに 結合することができるペプチドリガンドの１もしくは２以上のコピーを含む第２ の融合タンパク質、 をコードする請求の範囲第１項記載の細胞。 ４．第２の融合タンパク質がさらにキナーゼドメインを含む請求の範囲第３項記 載の細胞。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/47 7/08 19/00 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/06 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下記(a)および(b)の２つの融合タンパク質をコードする組換えDNA分子を含 み、かつ発現することができる細胞であって、 （a）転写活性化ドメインとホスホペプチド結合対の一方のメンバーのそれぞ れ１もしくは２以上のコピーを含む第１の融合タンパク質、 （b）DNA結合ドメインとホスホペプチド結合対のもう一方のメンバーのそれぞ れ１もしくは２以上のコピーを含む第２の融合タンパク質、 該ホスホペプチド結合対は、(i)１もしくは２以上のチロシン残基を含むペプ チドリガンドと、(ii)このペプチドリガンドのチロシン残基の１もしくは２以上 がリン酸化されると該ペプチドリガンドに結合することができるホスホペプチド 結合ドメインとを含み、 該細胞はさらに、該第２の融合タンパク質が結合することができるDNA配列に 連結されたリポーター遺伝子を含み、このリポーター遺伝子は該トランスジーン を転写活性化ドメインへの接近により活性化させた時に発現する検出可能な遺伝 子産物をコードする、 ことを特徴とする細胞。 ２．該ホスホペプチド結合対が、SH2ドメインとそのリガンド、ホスファターゼ ドメインとそのリガンド、またはPTBホスホペプチド結合ドメインとそのリガン ドを含む請求の範囲第１項記載の細胞。 ３．組換えDNA分子が、 （a）転写活性化ドメインとホスホペプチド結合ドメインの１もしくは２以上 のコピーを含む第１の融合タンパク質、および （b）DNA結合ドメインと、リン酸化されると、該ホスホペプチド結合ドメイン に結合することができるペプチドリガンドの１もしくは２以上のコピーを含む第 ２の融合タンパク質、 をコードする請求の範囲第１項記載の細胞。 ４．第２の融合タンパク質がさらにキナーゼドメインを含む請求の範囲第３項記 載の細胞。 ５．第１の融合タンパク質が２つのホスホペプチド結合ドメインを含む請求の範 囲第３項記載の細胞。 ６．２つの融合タンパク質の一方が、その融合タンパク質の調節的封鎖が可能な ホルモン結合ドメインをさらに含む請求の範囲第１項記載の細胞。 ７．哺乳類細胞である請求の範囲第１項記載の細胞。 ８．さらに内在性キナーゼドメインを含む、請求の範囲第１項記載の細胞。 ９．下記工程を含む、ホスホペプチド結合対の結合阻害剤の試験物質中における 存在を同定する方法： （a）培養すると測定可能な量の該検出可能な遺伝子産物を産生することがで きる請求の範囲第４項または第８項の細胞を用意し、 （b）この細胞を試験物質の存在下および不存在下で培養し、そして （c）試験物質の存在下で検出可能な遺伝子産物の産生が減少したか否かを判 定する。 10．該細胞が哺乳類細胞である請求の範囲第９項記載の方法。 11．DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、分離できるDNA結合および転 写活性化ドメインを有する転写アクティベーターに由来する、請求の範囲第９項 記載の方法。 12．DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、転写アクティベーターGAL4 、GCN4およびADR1よりなる群から選ばれたものである、請求の範囲第11項記載の 方法。 13．DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインが異なる転写アクティベーター に由来する請求の範囲第９項記載の方法。 14．該ホスホペプチド結合対が、SH2ドメインとそのリガンド、ホスファターゼ ドメインとそのリガンド、またはPIDホスホペプチド結合ドメインとそのリガン ドを含む請求の範囲第９項記載の方法。 15．第１の融合タンパク質が２つのホスホペプチド結合ドメインを含む請求の範 囲第９項記載の方法。 16．２つの融合タンパク質の一方が、その融合タンパク質の調節的封鎖が可能な ホルモン結合ドメインをさらに含む請求の範囲第９項記載の方法。 17．該試験物質が１または２以上の試験ペプチドの混合物から選択され、この混 合物が複数の合成ペプチドのライブラリーの形態または各種ペプチドを発現する ファージライブラリーの形態で提供される請求の範囲第９項記載の方法。 18．該ポリペプチドリガンドが免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)である 請求の範囲第９項記載の方法。 19．該ITAMがTCR ζITAMである請求の範囲第18項記載の方法。 20．請求の範囲第９項記載の方法により同定された阻害剤。
JP9530305A 1996-02-23 1997-02-21 細胞によるアッセイ Pending JP2000506007A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1221896P 1996-02-23 1996-02-23
US60/012,218 1996-02-23
PCT/US1997/002635 WO1997031113A1 (en) 1996-02-23 1997-02-21 Cell-based assay

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2000506007A true JP2000506007A (ja) 2000-05-23

Family

ID=21753915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9530305A Pending JP2000506007A (ja) 1996-02-23 1997-02-21 細胞によるアッセイ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6303319B1 (ja)
EP (1) EP0882128A1 (ja)
JP (1) JP2000506007A (ja)
AU (1) AU2053197A (ja)
CA (1) CA2246300A1 (ja)
WO (1) WO1997031113A1 (ja)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846722A (en) * 1996-10-16 1998-12-08 Terrapin Technologies, Inc. System to detect small molecule/peptide interaction
US6015709A (en) * 1997-08-26 2000-01-18 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Transcriptional activators, and compositions and uses related thereto
JP2001514007A (ja) * 1997-08-27 2001-09-11 アリアド ジーン セラピューティクス インコーポレイテッド キメラ転写アクチベーター、ならびにそれに関連する組成物および使用
US7105307B2 (en) 1997-08-30 2006-09-12 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for screening for modulators of enzymatic activity
US6114111A (en) * 1998-03-30 2000-09-05 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Mammalian protein interaction cloning system
US6316223B1 (en) 1998-03-30 2001-11-13 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Mammalian protein interaction cloning system
CA2335107C (en) * 1998-07-28 2010-01-19 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Leptin-mediated gene-induction
FR2787119A1 (fr) * 1998-12-09 2000-06-16 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage en levure d'inhibiteurs de proteines kinases specifiques de cellules humaines et de mammiferes
CA2369855A1 (en) * 1999-05-28 2001-01-04 Sangamo Biosciences, Inc. Molecular switches
US6790607B1 (en) 1999-10-07 2004-09-14 Hybrigen, Inc. Adjustable sensitivity, genetic molecular interaction systems, including protein-protein interaction systems for detection and analysis
IL148967A0 (en) * 1999-10-07 2002-11-10 Hybrigen Inc Adjustable sensitivity, genetic molecular interaction systems, including protein-protein interaction systems for detection and analysis
AU2001229741A1 (en) 2000-01-24 2001-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York An in vivo screen using chemical inducers of dimerization
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
JP2001352992A (ja) * 2000-04-07 2001-12-25 Sumitomo Chem Co Ltd エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用
AU8178401A (en) * 2000-05-22 2001-12-03 Vlaams Interuniv Inst Biotech Receptor-based interaction trap
GB0015119D0 (en) * 2000-06-20 2000-08-09 Angeletti P Ist Richerche Bio Methods and means for regulation of gene expression
JP2005501217A (ja) * 2000-10-10 2005-01-13 ディベルサ コーポレーション 生体活性または生体分子のハイスループットスクリーニングまたはキャピラリーに基づくスクリーニング
US6964039B2 (en) * 2000-12-13 2005-11-08 Esmertec Ag Method to create optimized machine code through combined verification and translation of JAVA™ bytecode
WO2003004643A2 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Reversed mammalian protein-protein interaction trap
CA2442367A1 (en) * 2001-03-30 2002-10-24 Clontech Laboratories, Inc. Method for detecting multiple dna binding protein and dna interactions in a sample, and devices, systems and kits for practicing the same
US7083918B2 (en) 2002-04-24 2006-08-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bacterial small-molecule three-hybrid system
US20050095241A1 (en) * 2003-08-26 2005-05-05 Vadlamudi Ratna K. Estrogen receptor modulators and uses thereof
EP1812038A1 (en) * 2004-11-18 2007-08-01 VIB vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
US20060248130A1 (en) * 2005-04-22 2006-11-02 Steffen Grarup Process and system for real-time relocation of objects during garbage collection
WO2007101225A2 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to identify inhibitors of the unfolded protein response
GB201509413D0 (en) * 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
CN116875518A (zh) * 2018-07-06 2023-10-13 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统
EP4087830A4 (en) * 2020-01-08 2024-04-17 Univ Colorado Regents DISCOVERY AND DEVELOPMENT OF BIOLOGICALLY ACTIVE METABOLITES

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
CA2054602C (en) 1991-10-31 2003-04-22 Anthony Pawson Method for assaying for a substance that affects an sh2-phosphorylated ligand regulatory system
AU5136093A (en) 1992-09-25 1994-04-26 Warner-Lambert Company Peptide antagonists of sh2 binding and therapeutic uses thereof
US6211334B1 (en) * 1992-10-16 2001-04-03 Cold Spring Harbor Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto
EP0750630A4 (en) * 1994-03-11 1998-01-07 Ariad Pharma Inc METHOD AND MATERIALS FOR IDENTIFYING INHIBITORS OF MOLECULAR INTERACTIONS, WHICH ARE BROUGHT BY THE SH3 DOMAINS
WO1996003501A1 (en) * 1994-07-22 1996-02-08 Ciba-Geigy Ag Dual hybrid system
US6280964B1 (en) * 1995-04-14 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Binding sites for phosphotyrosine binding domains

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997031113A1 (en) 1997-08-28
EP0882128A1 (en) 1998-12-09
CA2246300A1 (en) 1997-08-28
US6303319B1 (en) 2001-10-16
AU2053197A (en) 1997-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2000506007A (ja) 細胞によるアッセイ
JP3537141B2 (ja) 新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム
Van Criekinge et al. Yeast two-hybrid: state of the art
Whiteway et al. Association of the yeast pheromone response G protein βγ subunits with the MAP kinase scaffold Ste5p
Waters et al. Interactions with LC3 and polyubiquitin chains link nbr1 to autophagic protein turnover
Krapp et al. S. pombe cdc11p, together with sid4p, provides an anchor for septation initiation network proteins on the spindle pole body
WO1995024419A1 (en) Methods and materials for identifying inhibitors of molecular interactions mediated by sh3 domains
Cen et al. Identification of UNC119 as a novel activator of SRC-type tyrosine kinases
CA2303405A1 (en) 53bp2 complexes
JP2001501097A (ja) レセプターエフェクターを同定する方法及び組成物
JPH06503713A (ja) スクリーニング・アッセイ
JPH11514225A (ja) 哺乳動物の細胞周期の新規調節物質ＡＲＦ−ｐ１９
Yu et al. A cytoskeletal localizing domain in the cyclase-associated protein, CAP/Srv2p, regulates access to a distant SH3-binding site
JP2002540814A (ja) 転移性前立腺腫瘍の診断および処置のための方法
Kittanakom et al. CHIP-MYTH: A novel interactive proteomics method for the assessment of agonist-dependent interactions of the human β2-adrenergic receptor
US5986055A (en) CDK2 interactions
Perez-Villar et al. Nuclear localization of the tyrosine kinase Itk and interaction of its SH3 domain with karyopherin α (Rch1α)
Schaefer et al. Functional interaction of Jun and homeodomain proteins
JP2003523723A (ja) ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法
Dockendorff et al. Cloning of karyopherin-α3 from Drosophila through its interaction with the nuclear localization sequence of germ cell-less protein
JP2004516848A (ja) 細胞内化合物を標的とした修飾
JP2002523016A (ja) タンパク質機能の決定およびそのモジュレーターの同定のための方法および組成物
US7144711B2 (en) AGS proteins and nucleic acid molecules and uses therefor
AU2985701A (en) Cell-based assay
US7786275B2 (en) Identification of a unique core domain of Par-4 sufficient for selective apoptosis induction in cancer cells