JP2002508832A - 生体分子相互作用を検出するためのタンパク質断片相補性アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 in vivo及びin vitroにおける生体分子間の相互作用を検出するためのタンパク質−断片相補性アッセイ（PCA）をデザイン及び実用化するための方法を開示する。この方法の実用性と広い適用範囲は、多数の酵素を用いて具体的に説明されており、特にマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）について詳細に説明されている。GCN4ロイシンジッパー配列に融合したマウスDHFRのＮとＣ末端断片を含む融合ペプチドが、内因性DHFR活性がトリメトプリムによって阻害された最少培地で増殖した大腸菌内で共発現させられた。相補的融合生成物の共発現によりコロニー形成が復活された。生存は、DHFR断片が存在することとロイシンジッパー形成配列を含んでいることの両方が満たされた場合にのみ発生し、これは酵素活性の再構成にはロイシンジッパー形成の援助が必要であることを示している。DHFR断片−界面点突然変異体（IleからVal、Ala及びGly）がひどくなるにつれて、E.coli倍加時間が漸進的増加したが、これは断片間の非特異的相互作用よりDHFR断片再構成の方が良好な結果が得られることを具体的に示している。このアッセイは、標的タンパク質と未知のタンパク質の結合についてcDNAライブラリーをスクリーニングするため、又は生物学的活性について小有機分子のライブラリーをスクリーニングするために、タンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質−RNA、タンパク質−炭水化物及びタンパク質−小分子の相互作用を含む分子相互作用の平衡及び動態の態様を試験するために使用することができる。ここで適用した選択及びデザイン基準はクローン選択、比色、蛍光光度法及びその他のそれらの産物を測定できる酵素に基づくアッセイの莫大な数の例に対して開発されている。そうしたアッセイシステムの開発は単純であることが示されており、種々のタンパク質断片相補性の適用例を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 生体分子相互作用を検出するためのタンパク質断片相補性アッセイ発明の分野 本発明は、新規な遺伝子産物の機能のアッセイに関する。本発明はさらに、タ ンパク質断片相補性アッセイ（PCA:Protein fragment Complementation Assays ）に関する。PCAは、多種多様なタンパク質−タンパク質、タンパク質−RNA、タ ンパク質−DNA、タンパク質−炭水化物又はタンパク質−有機小分子間の相互作 用を、そうした相互作用の研究に適した様々な細胞状況において検出できるよう にする。発明の背景 転写、翻訳、及び代謝若しくはシグナル形質導入経路を含む生物学における数 多くのプロセスは非共有的に結合した多酵素複合体によって媒介されている^{1,10 1} 。複数タンパク質又はタンパク質−核酸複合体の形成は最も効率的な化学機構 を作り出す。現代の生物学的研究の多くは、細胞プロセスに含まれるタンパク質 を同定することと、それらの機能を決定することと、そしてそれらがどのように 、いつ、そしてどこで特異的経路に含まれている他のタンパク質と相互作用する のかに関心を持っている。さらに、ゲノム・シークエンシング・プロジェクトに おける急速な進歩に伴って、タンパク質の機能的アッセンブリーを作り上げるタ ンパク質相互作用の詳細な明細目録である「タンパク質連鎖地図(protein linka ge map)」を定義するための方法の開発が必要である^2,3。生物学的プロセスにお けるタンパク質アッセンブ リーを理解することが重要であるにもかかわらず、in vivoでのタンパク質−タ ンパク質相互作用を調べるための便利な方法は少ない^4,5。そのためのアプロー チには、化学的架橋結合試薬と染料結合タンパク質問の共鳴エネルギー移動の使 用を含む^102,103。強力で一般的に使用されている方法である酵母の二ハイブリ ッドシステム（two-hybrid system）は、新規のタンパク質−タンパク質相互作 用を同定するためと、特異的タンパク質相互作用のアミノ酸決定因子を調べるた めに使用されている^4,6,8。このアプローチを使用すると、cDNAライブラリーを 含む極めて多数のクローンを迅速にスクリーニングすることができる。だがこの 方法には、相互作用が特異的な環境（S.Cerevisiae「サッカロミセス・セレビシ エ」の核）下で行われなければならないという限界を含んでいるので、一般には 誘導した対構成性相互作用を識別するために使用することはできない。 近年、Johnsson and Varshavsky¹⁰⁸によってユビキチン・ベースド分断タンパ ク質センサー（USPS）⁹と呼ばれるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する ための新規な方法が証明された。この方法は、ユビキチンの三次構造を認識する サイトゾルプロテアーゼ（ユビキチナーゼ）によるユビキチンへのＮ末端融合を 伴うタンパク質の開裂に基づいている。この方法は、相補的なＮ及びＣ末端断片 からのタンパク質ユビキチンの三次構造の再構成に加え、さらに重要なのは、こ れらの断片に融合したオリゴマー化ドメインによりこの再構成を強化することに 依存している。再構成は、サイトゾルプロテアーゼ（ユビキチナーゼ）による構 成した生成物の特異的タンパク質分解として検出される。この著者らは、リポー タータンパク質−ユビキチンＣ末端断片の融合は、Ｃ末端断片に相補的であるユ ビキチンのＮ末 端断片と共発現させた場合にのみ、ユビキチナーゼによって同様に開裂させられ ることを証明した。観察可能なユビキチナーゼ活性の再構成は、Ｎ及びＣ末端断 片がGCN4ロイシンジッパーを通して結合している場合にしか発生しなかった^{109, 110} 。そこでこの著者らは、この「分断遺伝子」方法をタンパク質−タンパク質 相互作用に対するin vivoアッセイと細胞内のタンパク質アッセンブリー動態の 解析法としての使用を提案した。残念ながら、この方法を行うには付加的な細胞 因子（この場合にはユビキチナーゼ）が必要とされるので、この検出法はcDNAラ イブラリーの高速なスクリーニングには役立たなかった。 Rossi,F.,C.A.CharltonとH.M.Blau(1997)（Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)94,8405- 8410）は、ｂ−ガラクトシダーゼ（b-gal）のａとｗ断片の古典的相補性と、形 質導入されたC2C12菌芽細胞系中におけるラパマイシンによるタンパク質FKBP12 とラパマイシンの哺乳類標的の誘導オリゴマー化による相補性の誘導とに基づい たアッセイについて報告している。b-gal活性の再構成は、数種の蛍光検出アッ セイを使用して、基質蛍光のジ-b-D-ガラクトピラノシドを用いて検出される。 このアッセイは本発明と一部の類似性を有しているが、幾つかの重大かつ明確な 相違点がある。第１に、この特定相補性アプローチは、タンパク質−タンパク質 相互作用の検出を含む広範囲の応用において30年間以上に渡って使用されてきた 。Krevolin,M.and D.Kates(1993)（米国特許出願第5,362,625号）は、タンパク 質−タンパク質相互作用を検出するためにこの相補性検定を使用することを開示 している。さらに哺乳類細胞におけるb-gal相補性の達成も又以前に報告されて いる(Moosmann,P.and S.Rusconi(1996)Nucl.Acids Res.24,1171-1172)。だがここに提示する個々独立のPCAは完全に新規にデザイン された相互作用検出アッセイであって、出願人の研究所から発表された出版物以 外には出願前にいかなる方法でも記載されていない。第２に、本出願には、全て が新規にデザインされたアッセイであって、極めて多数の酵素若しくはタンパク 質検出体からの分子相互作用アッセイを開発するための一般的な方法を記載して いるに対し、b-galアッセイは新規ではなく、また、いままでよく記録された応 用に一般的な方法として採用されていなく進歩も与えられていない。 USPSと同様に、酵母の二ハイブリッド方法も、検出のために特異的細胞コンパ ートメントにしか存在しない付加的な細胞機構を必要とする。従って、活性を検 出するために他のタンパク質を必要とせずに、アッセイ自体として、断片からの 特異的酵素活性の再構成を使用する検出システムが必要とされている。好ましく は、このアッセイはそれらの活性を検出するために他のタンパク質を必要としな い単量体又は多量体酵素の断片のオリゴマー化支持相補性を含むのであろう。さ らにその上、酵素の構造が既知である場合は、再構成断片が活性であることを確 保するため、そして再構成の検出のストリンジェンシーを変化させる目的で突然 変異を誘発するために酵素の断片をデザインすることが可能であろう。しかし、 下記で説明するように、構造に関するの知識は相補的断片のデザインにとっての 前提条件ではない。このようなアプローチのデザインにおいて許される柔軟性は 、他の検出システムではおそらく適しないであろう環境下でも適するであろう。 ヒトゲノム研究における近年の進歩は、新規遺伝子の同定に急速の進歩をもた らしてきた。生物学的と製薬学的研究の応用においては、例えば、疾患表現型に 含まれていることが証明されている遺伝子に対 して、新規遺伝子産物の機能を決定することに関する差し迫った必要性がある。 それはゲノムを基礎とする製薬学的研究の動きが停滞する問題の解決において、 単純かつ自動化可能な機能アッセイの開発が前進する必要があるからである。新 規遺伝子の機能を定義する際の第１のステップは、適切な環境において他の遺伝 子産物との相互作用を決定することであり、つまり、タンパク質が機能的アッセ ンブリーの一部として他のタンパク質若しくは他の生体高分子と特異的に相互作 用するので、新規遺伝子の機能を調査するための適切な方法は、他の遺伝子産物 との物理的関係を調べることである。 酵母の「二ハイブリッドシステム」のようなタンパク質相互作用についてのス クリーニング法は、分子生物学を変化させてきたが、狭く限定された細胞とコン パートメント状況と複雑な細胞機構（転写）の働きが必要な状況において、構成 的に相互作用するタンパク質の特異的なタイプ若しくはタンパク質と他の分子と の相互作用を研究するためにしか使用できない。特異的な問題の状況下でのタン パク質相互作用に対し合理的にスクリーニングするためには、もっと柔軟なアプ ローチが必要とされている。特に、分子相互作用を検出するだけでなく、これら の相互作用を特異的に及び生物学的に重要であると検証するためにも必要な基準 を満たすアッセイが必要である。 そうした基準を満たすアッセイの特徴を下記にのリストした。 １）in vivo又はin vitroでのタンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA/RNA又 はタンパク質−薬物相互作用の検出ができるようにすること。 ２）例えば特異的生物、細胞の種類、細胞コンパートメント又はオルガネラ（細 胞小器官）内のような適切な状況におけるこれらの相互作 用の検出ができるようにすること。 ３）誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用（細胞増殖又は阻害因子に よるような）の検出ができるようにすること。 ４）アッセイの感受性を調節することによって、非特異的タンパク質−タンパク 質相互作用に対する特異性を識別できること。 ５）細胞内におけるタンパク質アッセンブリーの動態の検出ができるようにする こと。 ６）分子相互作用についてcDNA、有機小分子、又はDNA若しくはRNAライブラリー をスクリーニングできるようにすること。発明の概要 本発明は、先行技術においてほとんど研究されていない上記の必要性を満たす ことを目的とする。本発明は、他のタンパク質を含む他のバイオポリマー、核酸 、炭水化物とのタンパク質相互作用を検出するための、または、潜在的な治療的 価値を持つ化合物についての小分子ライブラリーをスクリーニングするための一 般的な方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、それらの活性を検出 するために他のタンパク質を必要としない単量体酵素断片のオリゴマー化により 支援された相補性あるいは相補化（oligomerization-assisted complementation ）を提供することを試みる。そうした実施態様の１つでは、本発明によってE.co li中に定義された酵素断片の相補性によるジヒドロ葉酸還元酵素活性の再構成に 基づくタンパク質断片相補性アッセイ（PCA）が提供される。このアッセイは特 異的タンパク質−タンパク質相互作用（つまり、ロイシンジッパーの相互作用） を検出するために付加的な内因性因子を必要とせず、分子間相互作用についてcD NA、核酸、小分子若しくはタンパク質デザインライブラリ ーをスクリーニングするために便利に拡張することができる。さらに、本アッセ イはあらゆる細胞環境若しくはコンパートメントにおけるタンパク質相互作用の 検出に適したものであり、さらに原核系及び真核系の両方において、誘導(induc ed)タンパク質相互作用と構成性(constituitive)タンパク質相互作用とを識別す るために使用することができる。 タンパク質相補性アッセイ（PCA）をデザインするための１つの特定方法は、 下記の特徴の利用に基づいている。すなわち、１）比較的に小さく単量体である タンパク質若しくは酵素であること、２）その構造と機能の情報に関して非常に 多くの文献があること、３）それについて、in vivoとin vitroの両方において 、タンパク質の再構成若しくは酵素の活性について単純なアッセイ法が存在する こと、４）それについて、真核と原核細胞における過剰発現が証明されているこ とである。これらの基準が満たされれば、酵素の構造は下記の基準に基づいて遺 伝子を２つに分断するためのポリペプチド鎖における最良の位置を決定するのに 使用される。すなわち、１）断片が連続ポリペプチドのサブドメインに存在する 結果になければならなく、つまり、結果としての断片はタンパク質のサブドメイ ン構造を破壊しないこと、２）１つの断片内に触媒性とコファクター結合部位全 部が含まれていなければならないこと、及び３）結果として生じる新しいＮ及び Ｃ末端は、長いペプチドリンカーの必要を回避するため、そしてタンパク質結合 の方向依存性についての試験ができるように、タンパク質の同一面上になければ ならないことである。 本発明を適正に実施するのに上記の基準全てが満たされる必要はないことが理 解されなければならない。酵素は、小さく、好ましくは 10-40kDaであることが好ましい。単量体酵素が好ましいが、多量体酵素も本発明 の範囲内に含まれると考えられる。本アッセイでは、二量体タンパク質チロシナ ーゼを使用することができる。PCAをデザインする上で、酵素の構造に関する情 報は付加的な長所であるが、必ずしも必要とはされない。実際に、酵素アミノグ リコシドキナーゼへの応用においてエキソヌクレアーゼ分解生成タンパク質断片 （exomuclease digestion-generated protein）の組合せとそれに続く方向性タ ンパク質の展開に基づくPCAを開発するための付加的な方法が役立っている。原 核細胞における過剰発現が生じることが好ましいが、これは必要条件ではない。 当業者であれば、（選択された酵素の）酵素触媒部位が同一分子上で絶対的には 必要とされないことを理解できるであろう。 本特許出願は、PCAにおいて特定酵素を使用するための合理的理由及び基準を 説明している。図１は、PCAの一般的説明を示している。タンパク質若しくは酵 素に対する遺伝子は、合理的に２個以上の断片に分割される。分子生物学的技術 を用いて、選択された断片がサブクローニングされ、さらに各々の5'末端へ、相 互作用することが既知であるか相互作用すると思われるタンパク質を融合させる 。その後、これらのDNA構造体の細胞内へのコトランスフェクション若しくは形 質転換が実行される。この断片からのプローブタンパク質若しくは酵素の再構成 は、テストタンパク質の相互への結合によって触媒され、再構成は幾つかのアッ セイを用いて観察される。これらのアッセイは、融合した相互作用するタンパク 質が酵素の再構成を触媒した場合にしか働かないであろうことを理解することが 重要である。つまり、再構成された酵素活性が観察されることは融合したタンパ ク質の 相互作用の尺度でなければならない。 本発明の好ましい実施態様は、酵素のジヒドロ葉酸還元酵素に基づくPCAに焦 点を当てている。真核細胞におけるアッセイ、ライブラリースクリーニング、及 びシグナル導入経路のような統合的な生化学的経路の研究に関する問題への特異 的適用を含むように、この方法が拡張できることが提示されている。優性若しく は劣性の薬物選択又は代謝サルベージ経路としての機能ができる酵素に基づくも のを含む付加的なアッセイが開示されている。さらに、着色若しくは蛍光産物を 産生する酵素類に基づくPCAも又開示されている。本発明は、新規な遺伝子の機 能テスト、薬理学的活性についての天然産物若しくは化合物ライブラリーのスク リーニング、及びDNA、RNA若しくは炭水化物と相互作用する新規な遺伝子産物の 同定のためのPCA方法をどのようにして一般化かつ自動化にするかを開示してい る。本発明はさらに、そうした分子相互作用を阻害若しくは活性化できる潜在的 な治療的価値を有する化合物ライブラリーから天然産物若しくは小分子を同定す るためにPCA法をどのように適用するか、そして酵素基質及び酵素の小分子の阻 害剤をどのように同定するかについても開示する。最後に、本発明は、産業上利 用できる酵素若しくは生物学的活性を備えたペプチドのデザインを通してタンパ ク質工学の実験を行うために、どのようにPCA法を使用できるかについて開示す る。 ここでは、in vivoでのタンパク質相互作用を検出するためのアッセイをデザ イン及び実行するための単純な方法が開示されている。我々は、最少培地で増殖 したE.coliにおいて共発現させたときに２個の断片を発現するクローンの生存が できるようにする、天然mDHFR（murine dihydrofolate reductase）の相補的断 片をデザイ ンしたが、この場合に内因性細菌DHFR（dihydrofolate reductase）の基礎活性 は競合的阻害であるトリメトプリムによって阻害される(図３)。活性の再構成は DHFRのＮ及びＣ末端断片の両方がGCN4ロイシンジッパー配列へのＣ末端融合とし て共発現させられたときにしか発生しなかったが、これは断片の再構成にはＮ及 びＣ末端融合ぺプチド間でのロイシンジッパーの形成が必要であることを示して いる。アッセンブリー界面（Ile114からVal、Ala若しくはGlyへ）における不安 定化突然変異から生じた細胞倍増時間の連続的な増加は、選択的条件下で観察さ れた細胞生存が、Z-F[3]とZ-F[1,2]との非特異的相互作用とは反対に、mDHFR断 片[1,2]と断片[3]との間の特異的なロイシンジッパーにより支援された会合の結 果であることを証明している。下記に幾つかの詳細な、そして多数の追加の実施 例を示す。 以前にユビキチン・ベースド分断タンパク質センサー（USPS）⁹を用いて証明 されているように、タンパク質−断片相補性法はin vivoでのタンパク質−タン パク質相互作用の平衡及び動態の状況を研究するために使用できる。しかし、DH FR及びその他のPCAはより単純なアッセイである。それらは完全システムであり 、付加的な内因性因子を必要とせず、相補性の結果はそれ以上の操作を必要とせ ずに直接的に観察される。このため、ここに記載されたE.coli細胞生存アッセイ は、タンパク質−タンパク質相互作用についてcDNAライブラリーをスクリーニン グするために特に有用である。細胞中におけるmDHFR発現はDHFRに対する蛍光高 親和性基質の類似体との結合によって監視できる²⁶。 PCAにはさらに、in vivoでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するため の他の全ての方法（USPSを除く）から区別する幾つか の特徴がある。我々は、アッセイのストリンジェンシーの調節をできるようにし 、２つのタンパク質の会合に対して動態及び平衡状態定数の推定値を入手するた めに使用できるであろう酵素の相補的断片をデザインした。例えば、DHFRにおい て野生型酵素Ile114からVal、Ala若しくはGlyへの点突然変異（point mutations ）はDHFR活性の再構成のストリンジェンシーを変化させる。特異的なタンパク質 −タンパク質相互作用についての平衡状態及び動態パラメーターの推定値を定め るには、野生型若しくは不安定化突然変異体のDHFR断片を用いて、既知の親和性 で相互作用する２つのタンパク質を用いた一連のDHFRのPCA実験を実行できるで あろう。DHFRのPCAに対して、未知の相互作用を使用した比率とこのモデルシス テムでの細胞増殖率との比較で、未知の相互作用の強度推定値が得られるのであ ろう。 これは、本発明のタンパク質相補性アッセイはこれらの実施態様に限られない ので、本発明がここに提示されたDHFR又は他のPCAに限定すべきではないと理解 されなければならない。さらに、PCAはそれらを使用できる状況に限定されるべ きではない。シグナル発生ペプチド配列を添加することによって細胞中の特異的 コンパートメントへのPCA融合に標的を定めるように構造体をデザインできるで あろう^27,28。構成性タンパク質−タンパク質相互作用に対する誘導は、生化学 的イベントによって誘発される相互作用の場合に、PCAの真核バージョンによっ て識別できよう。同様に、このシステムは標的タンパク質と発現ライブラリーと 間の新規な誘導性タンパク質−分子会合をスクリーニングするのに使用するため に適するであろう。 本発明はさらに、下記のステップを含む生体分子相互作用を検出するための方 法に関する。 （ａ） 適切なリポーター分子を選択するステップと、 （ｂ） 断片化がリポーター機能の可逆的な消失を生じさせるように前記リポ ーター分子の前記断片化を実行するステップと、 （ｃ） 前記リポーター分子の断片を他の分子へ個別に融合若しくは付着させ るステップと、次いで、 （ｄ） 前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片 を再会合させるステップ。 本発明はさらに、分子の別個の断片の再構成を含む分子相互作用を検出するた めの分子断片相補性アッセイを提供するが、前記断片の再構成は他の分子プロセ スから独立して、前記分子の各断片に融合した分子ドメインの相互作用によって 行われる。 別の態様では、本発明は下記のステップを含む生体分子相互作用をテストする 方法に関する。 ａ） ｉ） 第１分子の第１断片と、 ｉｉ） 前記第１分子とは相違若しくは同一の第２分子、 を含む第１融合産物を生成するステップと、 ｂ） ｉ） 前記第１分子の第２断片と、 ｉｉ） 前記第１分子若しくは第２分子とは相違若しくは同一の第３分子、 を含む第２融合産物を生成するステップと、 ｃ） 第１及び第２融合産物を相互に接触させるようにするステップと、 ｄ） 第１分子の再結合した断片の会合によって再獲得された活性 について試験するステップであって、前記再会合が第２及び第３分子の相互作用 によって仲介されるステップ。 別の新規特徴では、本発明は、第１分子の断片が第２分子へ融合させられ、そ して断片の連合が第１分子の活性の再構成によって検出されるアッセイを含む方 法に関する。 本発明はさらに、下記を含むグループから選択された生成物を含む組成物を提 供する。 （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる第１分 子の第１断片と、 ２） （ａ）の（１）の断片に結合できる第２分子と を含む第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と ２） （ｂ）の（１）の断片に結合できる第３分子と を含む第２融合生成物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方。 本発明はさらに、各々が第２分子の別個の断片に融合されている、第１分子の 相補的断片を含む組成物を提供する。 本主題の発明者らはさらに、ある融合生成物をコードする核酸分子を含む組成 物を提供するが、その分子は下記の生成物を含むグループから選択された生成物 をコードする配列を含んでいる。 （ａ） １） 連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の 断片と、 ２） 第１分子の断片に融合している第２分子と を含む第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と、 ２） 第２若しくは第３分子と を含む第２融合産物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方。 本発明はさらに、（ａ）連合しているときに断片が検出可能な活性を提示でき る第１分子の相補的断片、又は（ｂ）第２若しくは第３分子からの２つのタンパ ク質−タンパク質相互作用ドメインの結合と連合した生体分子相互作用について の試験方法であって、前記方法が下記ステップを含んでなる方法に関する。 １） （ａ） 連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の 第１断片と、 （ｂ） 第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと の融合を生成するステップ、 ２） （ａ） 前記第１分子の第２断片と、 （ｂ） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第 ２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと の融合を生成するステップと、 ３） １）及び２）の融合を相互に接触させるようにするステップと、 ４） 前記活性について試験するステップ。 本発明はさらに、下記生成物を含むグループから選択された生成物を含む組成 物を提供する。 （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる（第１ ）分子の第１断片と、 ２） 第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と、 ２） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第 ２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第２融合生成物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方。 本発明は又、ある融合生成物をコードする核酸分子を含む組成物に関し、その 分子は下記のいずれかをコードする配列を含んでいる。 （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる分子の 第１断片と、 ２） 第１タンパク質-タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第１融合生成合産物、或いは、 （ｂ） １） 前記分子の第２断片と、 ２） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第 ２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第２融合生成物、或いは、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方。 本発明はさらに又、タンパク質アッセンブリーの動態を検出して、PCAを実行 することを含むcDNAライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。 別の実施態様では、本発明はさらに化合物に対して、前記化合物の存在下でＰ ＣＡを実行すること及び任意の阻害と前記（化合物の）存在を相関させることを 含むＰＣＡにおける分子相互作用を阻害する可能性をテストする方法を提供する 。 又別の実施態様では、本発明は生きている生物及び／又は細胞内におけるタン パク質−タンパク質相互作用を検出する方法を提供するが、その方法は、 （ａ） 酵素をコードする遺伝子を少なくとも２個の断片に分けることによっ て優勢選択を可能にする酵素からプローブタンパク質断片を合成するステップと 、 （ｂ） 相互作用について試験される１以上の分子との融合タンパク質を構成 するステップと、 （ｃ） （ｂ）で入手したタンパク質を１以上のプローブ断片と融合させるス テップと、 （ｄ） 融合タンパク質を共発現させるステップと、 （ｅ） 酵素活性の再構成を検出するステップと を含むものである。 本発明はさらに、 （ａ） 適切なリポーター分子を選択するステップと、 （ｂ） 前記リポーター分子の断片化を実行するステップと、 （ｃ） 前記リポーター分子の断片を他の分子へ個別に融合若しく は付着させるステップと、次いで、 （ｄ） 前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片 を再会合させるステップと を含んでなる生体分子相互作用の検出方法を提供する。 最後に、本発明はさらに上記アッセイと組成物を提供するステップを含む、遺 伝子療法に影響を及ぼす新規方法を提供する。 本発明は、ハイレベルの単純性及び適用範囲の広さを示している初めてのタン パク質相補性アッセイであり、先駆的である。例として示されている実施態様は 、mDHFRに基づくタンパク質−断片相補性アッセイ（PCA）であり、このときロイ シンジッパーがDHFR活性の再構成を引き起こす。この活性は、実際的かつ安価で あるE.coliの生存アッセイによって検出される。このシステムは、ロイシンジッ パー二量体形成の検出におけるmDHFR断片相補性の使用を具体的に示しているが 、in vivoでの未知の特異的タンパク質−分子相互作用の検出にも適するであろ う。 本発明は、本発明の内容に従って数多くの他の酵素類を選択して使用できるの で、ここに提示されているPCAに限定されないと理解されなければならない。そ うしたマーカーの例は、Kaufman（1987Genenetic Eng.9:155-198）及びその中に 所見される引用文献並びに本出願の表１に見出すことができる。 当業者には、本発明には２つの相互作用する分子としてのロイシンジッパーの 使用に限定されないことは明白なはずである。事実上、数多くの他の種類のタン パク質−分子相互作用を使用することができ、それらは本発明の内容に従って同 定することができる。タンパク質−分子相互作用に含まれる既知の種類のモチー フは当分野においてよく 知られている。 本出願は数多くの先行技術文書に関しており、ここではその全体を引用するこ とにより本明細書の一部をなすものとする。 本発明のその他の特徴と長所は、下記の好ましい実施態様の説明と添付された 実施例と請求項から明白であろう。図面の簡単な説明 図１は、PCAの一般的説明を示している。分子生物学の技術を用いて、選択さ れた酵素（をコードする遺伝子）の断片がサブクローニングされ、さらに各々の 5'末端に相互作用することが既知であるか、相互作用すると思われるタンパク質 を融合させる。その後細胞内へのこれらのDNA構造体のコトランスフェクション 又は形質転換を実行し、数種のアッセイを用いて再構成が観察される。 図２は、本発明の実施態様の１つにおいて使用される融合構造体のスキームで ある。ヘキサヒスチジンペプチド(6His)、ホモ二量体形成GCN4ロイシンジッパー （Zipper）及びmDHFR断片（１、２及び３）が示されている。構造体のラベルは 、DNA構造体及びこれらの構造体から発現されたタンパク質の両方を同定するた めに使用されている。 図３の（Ａ）は、最少培地プレート上のE.coli生存アッセイを示している。コ ントロールはプレートの左側でpQE-30を含んでいるE.coli(挿入図なし)。右列は 天然mDHFRをコードするpQE-16を含んでいるE.coliである。パネルＩの各プレー トの左側が構造体Z-F[1,2]を用いての形質転換で、各プレートの右側が構造体Z- F[3]を用いての形質転換である。パネルＩＩは構造体Z-F[1,2]とZ-F[3]を用いて の形質転換である。パネルＩＩＩは構造体コントロール−F[1,2] とZ-F[3]を用いての形質転換である。全プレートは0.5mg/mlのトリメトロプリム を含有している。ＩからＩＩＩのパネルにおいて、右側のプレートは1mMのIPTG を含有している。 （Ｂ）は、不安定化したDHFR突然変異体を用いるE.coliの生存アッセイである 。パネルＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Ille 114Val]を用いてのE.coliの形質転換である 。パネルＩＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Ille 114Ala]を用いての形質転換である。挿入 図は、右側プレートの５倍の拡大図である。パネルＩＩＩはZ-F[1,2]とZ-F[3:Il le 114Gly]を用いての形質転換である。全プレートは0.5mg/mlのトリメトロプリ ムを含有している。右側のプレートは1mMのIPTGを含有している。 図４は、mDHFR断片の共発現を描出している。（Ａ）は、プラスミドDNAのHinc II分解から生じた制限パターンのアガロースゲル解析である。レーン１は構造体 F[1,2]とZ-F[3]を用いてコトランスフォームされたE.coliから単離されたDNAを 含有している。レーン２と３は各々構造体Z-F[3]と構造体F[1,2]を用いてコトラ ンスフォームされたE.coliから単離されたDNAを含有している。フラグメント移 動（単位：bp）は右側に示されている。 （Ｂ）は、mDHFR断片発現のSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアミド ゲル電気泳動法）解析である。レーン１から５は、形質転換されていないE.coli （レーン１）の粗溶解液、Z-F[1,2]を発現しているE.coli(20.8kDa、レーン２) 、Z-F[3](18.4kD、レーン３)、コントロールのF[1,2](14.2kDa、レーン４)、及 びZ-F[1,2]＋Z-F[3](レーン５)を示している。レーン６は2mlの共精製されたF[1 ,2]とZ-F[3]を除いた40mLを示している。矢印は重要なタンパク質を指している 。分子量マーカーの移動（単位：kDa）は右側に示さ れている。 図５は、DHFRのPCAのような生存アッセイに基づくPCAの一般的特徴を例示して いる。このアッセイは細菌又は哺乳類細胞環境で使用できる。挿入された標的DN Aは、重要なタンパク質（若しくはタンパク質ドメイン）をコードする既知の配 列であっても、又はcDNAライブラリーであってもよい。 図６は、30分間の³⁵S-Met-Cysパルス標識化後のCOS細胞溶解液のオートラジオ グラフを表している。発現パターンは本質的にE.coliにおいて観察される発現パ ターンと同一である(図４参照)。細胞内に形質転換（若しくはコトランスフェク ト）されたDNAは各レーンの上に示されている。 図７は、mDHFR細菌PCAのタンパク質工学への応用の結果を示している。２つの セミ−ランダムロイシンジッパーライブラリーが創製され(本文で説明されてい るように)、各々がmDHFR断片の１つのＮ末端へ挿入された。E.coliにおいて結果 として生じたジッパー−DHFR断片ライブラリーのコトランスフォーメーション及 び選択的培地上でのプレーティングが、良好に相互作用するロイシンジッパーを 含むクローンの生存をできるようにした。14個のクローンが単性極若しくは中性極：中性極）又は反発対合（電荷：電荷）を有していることに ついて各クローンに対してスコア付けされた各タイプの相互作用の数に従って分 類された。各クローンに対する相互作用の総数は６であり、相互作用はヒストグ ラム上に総計されている。 本発明に含まれるその他の目的、長所及び特徴は、下記の一例と見 なして本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない添付の図面を、参照 しながら好ましい実施態様の非制限的説明を読めばより明白になるであろう。 好ましい実施態様の説明 PCA のためのmDHFRの選択 タンパク質−断片相補性検定（PCA）をデザインする際に、我々は下記が当て はまる酵素を同定することを試みた。１）相当に小さく単量体であること、２） それに対して構造及び機能の情報が存在すること、３）それに対してin vivo及 びin vitro測定の両方について単純なアッセイが存在すること、及び４）それに 対して真核及び原核細胞における過剰発現が証明されている酵素であること。マ ウスDHFR（mDHFR）は上記に列挙したPCAに対する基準全てを満たす。原核及び真 核のDHFRは、細胞１炭素代謝にとっての中心（酵素）であり、原核生物及び真核 生物の両方において細胞生存のために絶対的に必要とされる。詳細には、それは セリン、メチオニン、プリン類及びチミジレートの生合成のために必要とされる １炭素単位のトランスファーにおいて使用するためにジヒドロ葉酸からテトラヒ ドロ葉酸への還元を触媒する。DHFRは小さな（17kD〜21kD）単量体タンパク質で ある。種々の細菌及び真核生物起源からのDHFRの結晶構造は既知であり、基質結 合部位及び活性部位残基は決定されており^111-114、タンパク質断片の合理的デ ザインができる。数多くのDHFRのフォールディング(折り畳み)、触媒作用及び動 態は広範に調査されている^115-119。酵素活性は、in vitroでは単純な分光光度 アッセイ¹²⁰によって、若しくはin vivoでは最終産物DHFRの不在で増殖した細胞 中の細胞生存によって監視することができる。DHFRは特に抗葉酸 薬であるトリメトプリムによって阻害される。哺乳類のDHFRは細菌のDHFRに比較 して、トリメトプリムに対する親和性が12,000分の１の低さであるので¹²¹、細 菌にとって致死的レベルのトリメトプリムの存在下でも、mDHFRを発現ができる 細菌の増殖は、活性酵素内としてのmDHFR断片の再構成を選択するための有効な 手段である。mDHFRのハイレベルの発現はトランスフォームされた原核細胞又は トランスフェクトされた真核細胞において証明されている^122-126。デザインに関する考察 mDHFRはヒトDHFR（hDHFR）配列とは高度の配列同一性を共有しており(91％同 一性)、E.coli酵素とは高度に同族であるので(29％同一性、68％相同)、これら の配列は視覚的にスーパーインポーズ可能な三次構造を共有している¹¹¹。mDHFR とhDHFRの結晶構造の比較は、それらの活性部位が本質的に同一であることを示 唆している^127,128。DHFRは、アデニン結合部位（残基47〜105＝断片[2]）及び 不連続ドメイン（残基1〜46＝断片[1]及び106〜186[3]；数字はマウス配列順序 に従っている）の２つのドメイン^129,130を形成している、３つの構造断片から 形成されていると説明されてきた。葉酸結合ポケット及びNADPH結合溝は、主と して断片[1]及び[2]に属する残基によって形成されている。断片[3]は触媒作用 には直接的に関係しない。 断片[2]及び断片[3]の接合部位でのhDHFRの101から108の残基は、タンパク質 の両末端と同一面上に存在する不規則なループを形成している。我々は、活性部 位とNADPHコファクター結合部位の最小の破壊を引き起こすように、断片[1,2]と [3]の間の残基107でmDHFRを開裂させることを選択した。mDHFRの天然Ｎ末端と開 裂によって創製された新規Ｎ末端は酵素の同一面上で発生し^112,128、これによ り本試験で使用されたロイシンジッパーのような会合断片への各断片のＮ末端の 容易な共有付着が可能になった。このシステムを用いることにより、我々は活性 酵素としてのmDHFR断片のロイシンジッパー支持アッセンブリーを入手した。 実施例１ 実験プロトコール DNA 構造体 変異原性及びシークエンシングオリゴヌクレオチド類をギブコ社（Gibco BRL ）から購入した。制限エンドヌクレアーゼ類及びDNA修飾酵素類をファルマシア 社(Pharmacia)及びニューイングランド・バイオラブ（New England Biolabs）か ら入手した。独自のフレーム内停止コドンを持っているmDHFR断片を、ヘキサヒ スチジンペプチド及びGCN4ロイシンジッパーを用いてフレームから下流及びフレ ーム内でpQE-32（Qiagen製）内にサブクローニングした(図１、図２)。全ての最 終構造体は、誘導プロモーター−オペレーターエレメント(tac)、コンセンサス リボソーム結合部位、開始コドン及びへキサヒスチジンペプチドをコードするヌ クレオチド類を含有しているQiagen製pQEシリーズのベクターに基づいていた。 全長mDHFRはpQE-16（Qiagen製）から発現される。GCN4 ロイシンジッパーを含んでいる発現ベクター GCN4ロイシンジッパーの235から281の残基(Sall/BamHI 254bpフラグメント)を 酵母発現プラスミドpRS16⁹から入手した。BamHI部位での凹み末端（recessed te rminus）にはクレノウポリメラーゼ(Klenow polymerase)(のコード遺伝子)を挿 入し、断片は SalI/HindIII（filled-in）を用いて線形化されたpQE-32へ連結された。その産 物である構造体Ｚは、GCN4ロイシンジッパー残基に先行するヘキサヒスチジンta g及び13個の残基がその後に続いている配列Met-Arg-Gly-Serをコードしているオ ープンリーディングフレームを持っている。DHFR 断片の精製 真核細胞の一時的の発現ベクターのpMT3（pMT2に由来）¹⁶を、断片[1,2]及び 断片[3]のサブクローニング及び個別発現を許容する特徴を含んでいるmDHFRのPC R生成を行うための鋳型として使用した。全長590bpの産物を生成するためにPCR 突然変異誘発のメガプライマー法²⁹を使用した。mDHFRのＮ及びＣ末端をコード しており、さらにコーディング配列外で新規BspE1部位を含有しているヌクレオ チド配列に相補的なオリゴヌクレオチド類を使用し、並びに断片[1,2]の後に新 規停止コドンを創製するためにオリゴヌクレオチドを使用し、その後に断片[3] をサブクローニングするのに使用するために新規SpeI部位が続いた。新規の複数クローニング領域の構築及びDHFR断片[1,2]及び[3]のサブクローニン グ 新規制限部位のSnaBI、NheI、SpeI及びBspEIを含有する相補的オリゴヌクレオ チド類は一緒にハイブリダイズされてEcoRIに相補的な5'及び3'オーバーハング を生じ、ユニークなEcoRI部位でpMT3内に挿入された。590bpのPCR産物（上記） をBspEIを用いて分解し、BspEIで線形化されたpMT3内へ挿入し、構造体[1,2,3] を産生した。610bpのBspEI/EcoNI断片(DHFR断片[1,2]をコードしており、新規停 止(コドン)及びEcoNIまで断片[3]が続く)をEcoNI で挿入し、BspEIl/HpaIを用いて開かれたpMT3内へサブクローニングして構造体F [1,2]を産生した。DHFR断片[3](in-frame停止コドンなし)をコードする構造体[1 ,2,3]の250bpのSpeI/BspEI断片を同一酵素を用いて開かれたpMT3内へサブクロー ニングした。pMT3における断片[3]から下流の野生型DHFR配列の停止コドンを次 のように挿入した。インサートされた断片[3]及び野生型断片[3]の両方に存在す るEcoNIを用いての開裂、683bp介在配列の除去及びベクターの再連結は断片[3] と野生型停止コドンとの構造体である構造体F[3]を産生した。発現構造体の精製 構造体F[1,2]及びF[3]各々の1051bp及び958bpのSnaBI/XbaI断片をBgIII(fille d-in)/NheIを用いて開かれた構造体ｚ内へサブクローンニングし、構造体Z-F[1, 2]及びZ-F[3]が産生した(図２)。コントロール発現構造体については、ジッパー をコードする180bpのXmaI/BspEI断片が構造体Z-F[1,2]から取り除かれ、構造体 コントロール−F[1,2]が産生した(図２)。安定性ミュータントの精製 Ile114（野生型mDHFRの番号）でミュータントを生じさせるために部位指向性 突然変異誘発³⁰を実施した。突然変異誘発反応を、新規BamHI部位を産生するサ イレント突然変異をコードするオリゴヌクレオチド類を用いて、pBluescript SK +（Stratagene）内へサブクローニングされた構造体Z-F[3]のKpnI/BamHI断片上 で実施した。制限酵素によって同定された推定ミュータントの206bpのNheI/EcoN I断片をZ-F[3]内へ逆にサブクローニングした。突然変異をDNAシークエンシング によって確認した。E.coli 生存アッセイ プラスミドpRep4(lacレプレッサーの構成性発現のために、Qiagenから)を含ん でいるE.coli株BL21は反応力を持たされ、適切なDNA構造体を用いてトランスフ ォームされ、50mg/mlカナマイシン、100mg/mlアンピシリン及び0.5mg/mlトリメ トプリムを含有する最少培地プレート上でプレーティングする前に最少培地を用 いて２回洗浄された。各形質転換混合液の半分が1mMのIPTGの不在下で、そして 残り半分が存在下でプレーティングされた。全プレートは66時間に渡り37℃に置 かれた。E.coli 増殖曲線 コトランスフォーメーションから入手したコロニーを増殖させ、アンピシリン 、カナマイシン並びに指示された場合はIPTG（1mM）及びトリメトプリム（1mg/m l）を補給された最少培地10mlに接種するために使用された。Ｌ−アーガー（＋ カナマイシン及びアンピシリン）上でトランスフォーメーション混合液をプレー ティングし、制限解析によって２種の構造体の存在をスクリーニングすることに よって、Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Gly]のコトランスフォーマント（共形質転換体 ）を非選択的条件下で入手した。全増殖曲線の入手を３回実施した。高額密度を 測定するためにアリコートを定期的に抜き出した。倍増時間は早期対数増殖につ いて計算された(0.02と0.2の間のOD600)。タンパク質過剰発現及び精製 細菌は約1.0のOD600に対する適切な抗生物質の存在下でTerrific Broth³¹中で 増殖させられた。発現を、1mMのIPTGの添加及びさらに３時間のインキュベーシ ョンによって誘発した。粗抽出物の解析 のため、誘導細胞150mlからのペレットが負荷染料中で煮沸させることによって 溶解させられた。溶解液は微小遠心分離によって明澄化され、SDS-PAGE32によっ て解析された。タンパク質精製のために、構造体Z-F[1,2]及びZ-F[3]を用いてコ トランスフォームされた50mlの誘導E.coliからの細胞ペレットを超音波処理で溶 解させ、不溶性ペレットの変性精製を製造業者の説明の通りにNi-NTA（Qiagen） を用いて行った。タンパク質を段階的イミダゾール勾配を用いて溶出した。生じ た分画をSDS-PAGEによって解析した。 結果 PCA のためのmDHFR断片のデザイン mDHFRは、ヒトDHFR（hDHFR）配列と高度の配列同一性を共有している。マウス 結晶構造の座標は入手できなかったので、我々はhDHFR構造についてのデザイン 考察を基礎に置いた。DHFRは、アデニン結合ドメイン（F[2]）及び不連続ドメイ ン（F[1]及びF[3]）の２つのドメインを形成している３つの構造断片を含んでい ると説明されている^13,18。葉酸結合ポケット及びNADPH結合溝は、主としてF[1] 及びF[2]に属する残基によって形成されている。hDHFRの残基101から108は、両 方の末端とタンパク質の同一面に存在する不規則なループを形成している。この ループはF[2]とF[3]の間の接合部で発生する。残基107でmDHFRを開裂させること により、我々はF[1,2]及びF[3]を創製し、従って活性部位及び基質結合部位の最 小の破壊を引き起こした。mDHFRの天然Ｎ末端及び開裂によって創製された新規 Ｎ末端はGCN4ロイシンジッパーのＣ末端へ共有的に付着させられた(図１)。E.coli 生存アッセイ 図２は、発現された構造体の一般的機能及び本試験で使用された術語を示して いる。図３（パネルＡ）は、トリメトプリムの存在下での細菌とZ-F[1,2]及びZ- F[3]をコードする構造体とのコトランスフォーメーションの結果を示しており、 明らかに選択的環境下でのコロニー増殖がmDHFRの両方の断片を発現する細胞に おいてしか可能でないことを証明している。Z-F[1,2]若しくはZ-F[3]のいずれか 単独の存在下では増殖は見られない。コロニー増殖にとってIPTGを用いてのタン パク質発現の誘導は必須である(図３Ａ)。mDHFRの両方の断片上におけるロイシ ンジッパーの存在は、唯一ロイシンジッパーを持っているmDHFR断片をコードす る両方のベクターとの細菌のコトランスフォーメーションによって例示されるよ うに不可欠である(図３Ａ)。全長mDHFRを用いて形質転換されたコントロールE.c oliの増殖は非誘導細胞中では発現のレベルが低いためにIPTGの不在下で可能で あることに注目しなければならない。 トリメトプリムと一緒に増殖できる細菌中に両方のプラスミドが存在すること の確認を、単離されたコロニーから精製されたプラスミドDNAの制限解析から行 った。図４（Ａ）は、構造体Z-F[1,2]からの1200bpのHinclI制限断片並びに構造 体Z-F[3]からの599bpのHinclI制限断片の存在を明らかにしている。同様に存在 するのはpRep4の935bpのHinclI断片である。融合タンパク質の過剰発現は図４（ Ｂ）に示されている。全部の場合において、予想分子量のタンパク質の過剰発現 は粗溶解液のSDS-PAGE上で明白である。変性条件下で共発現されたタンパク質の 精製は、Coomassie染色SDS-PAGEによる解析で明白になる均質性の２本のバンド を生じさせた(図４Ｂ)。突然変異体の安定性 出願人らは、断片アッセンブリーによるmDHFR活性の再構成が特異的であるか どうかを試験するためにF[3]の突然変異体を生成した。タンパク質安定性は、タ ンパク質の疎水性コア中の側鎖量を変化させることによって低下させることがで きる^9,22-25。mDHFRの残基IIel14は、活性部位から単離されたF[1,2]とF[3]の界 面でのコアb-ストランドにおいて発生する。Ile114は、F[1,2]ではIle51及びLeu 93とファンデルワールス接触している。我々はIle114をVal、Ala又はGlyへ突然 変異させた。図３（パネルＢ）は、E.coliと構造体Z-F[1,2]及び突然変異Z-F[3] 構造体とのコトランスフォーメーションの結果を示している。Z-F[3:Ile114Ala] とのコトランスフォーメーションから入手したコロニーはZ-F[3]若しくはZ-F[3: Ile114Val]とコトランスフォームしたコロニーより緩徐に増殖した。入手した形 質転換体の数は、コロニーが観察された場合には統計的有意に相違していなかっ たが、これはZ-F[1,2]及びZ-F[3]、Z-F[3:Ile114Val]若しくはZ-F[3:Ile114Ala] のいずれかと一緒にコトランスフォームされた細胞が等価の生存率を有している ことを意味している。突然変異体Z=F[3:Ile114X]の過剰発現は、クーマシー（Co omassie）染色SDS-PAGEによって測定されたように、Z-F[3]と同一範囲内であっ た(データは示されていない)。 我々はさらに液体培地中のコトランスフォーマントの倍増時間を測定すること によってmDHFR断片の再構成の相対効率を比較した。 最少培地中の倍増時間は全ての形質転換体について一定であった(データは示さ れていない)。IPTGの不在下でのトリメトプリムによる選択的環境は、非誘導細 胞中での発現レベルが低いために全長DHFRをコードするpQE-16を用いて形質転換 された場合を除いてE.coli の増殖を防止した。IPTGを用いてのmDHFR断片発現の誘導はコトランスフォーム された細胞の生存を許容したが(Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Gly]の場合を除いて)、 倍増時間はトリメトプリムの不在下での増殖に比較して統計的無視できないよう に増加した。Z-F[1,2]＋Z-F[3]、Z-F[1,2]＋Z-F[3:Ile114Val]及びZ-F[1,2]＋Z- F[3:Ilel14Ala]を発現する細胞について測定された倍増時間は、トリメトプリム 及びIPTGの不在下でpQE-16を発現するE.coliの倍増時間に比較して各々1.6倍、1 .9倍及び4.1倍高かった。IPTGの存在は、全長MDHFRを用いて形質転換されたE.co liの増殖を予想外に妨害した。増殖は葉酸代謝最終産物であるチミン、アデニン 、パントテン酸塩、グリシン及びメチオニンの添加によって部分的に回復した（ データは示されていない）。これは、mDHFRの誘導過剰発現は、酵素へ結合する ことによる葉酸プールの欠失の結果として最少培地で増殖させたときにE.coliに とって致死性であることを示唆している。 別の実施態様では、出願人はそれに対して直接平衡及び動態パラメーターが既 知であるZ-F[1,2]及びZ-F[3]のGCN4ロイシンジッパーにおいてこれらの既知の数 値をPCAから誘導されたパラメーターと相関させることによって転突然変異を発 生させる(Pelletier and Michnick、準備中)。このモデルシステムにおける細胞 増殖率と未知のものを使用したDHFRのPCAについての増殖率とを比較すると、未 知の相互作用の強度に関する推定値が得られるであろう。これは、特異的タンパ ク質−タンパク質相互作用に対する平衡及び動態パラメーターの推定値の決定を 可能にするはずである。 本発明は、mDHFRに基づくタンパク質−断片相補性アッセイ（PCA）を具体的に 説明しているが、このときロイシンジッパーは DHFR活性の再構成を指示する。活性は実際的かつ安価であるE.coli生存アッセイ によって検出された。このシステムは、ロイシンジッパー二量体形成の検出にお けるmDHFR断片相補性の使用を例示しており、in vivoでの未知の特異的なタンパ ク質−タンパク質相互作用の検出に適用できるであろう。E.coli アミノグリコシドキナーゼ：エキソヌクレアーゼー分子進化方法を用いた PCAの最適化及びデザイン 出願人らは、相補的酵素断片を産生するために上記で説明した工学技術／デザ イン方法を使用できることを証明したが、そうした断片が溶解性、フォールディ ング能(迅速なフォールディング)、プロテアーゼ耐性、若しくは酵素活性を含む 最高の物理的特性を持つことが期待されるような方法でタンパク質が進化しなか ったことは明白である。工学技術／デザイン方法の好ましい実施態様は、エンド ヌクレアーゼ／進化アプローチである。この方法はそれだけで使用することも、 若しくは工学技術／デザイン方法と結合して使用することもできる。このアプロ ーチの長所は、原則として、タンパク質構造に関する事前の知識は必要ではない こと、PCAにとって最適な断片が選択されること、そしてこれらの断片も又最適 な特徴を持っていることにある。最適な相補的断片の選択後、これらの断片は複 数回の無作為突然変異誘発に暴露される。突然変異誘発は、化学的突然変異誘発 と結合した準最適のPCR若しくはDNAシャッフリングによって達成される(Stemmer ,W.P.C.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,10747-10751)。下記では、E.coliのよ うな原核細胞又は酵母若しくは哺乳類細胞系のような真核細胞の優性選択のため に使用できる抗生物質耐性マーカーの例であるアミノグリコシドキナーゼ（AK） の場合の総 合的な方法について記載する。AKの構造は既によく知られておいるので、方法（ １）は可能であろうが、しかし我々は上記でDHFRについて定義された方法（１） を方法（２）と結合することを選択した。 実験プロトコール 最適化／選択方法は次の通りである。エキソヌクレアーゼ分解産物に基づくAK断片のライブラリーの生成 欠失の組み重ねセットをAK遺伝子の5'及び3'端で精製しる。一方向欠失を精製 するためには、AK遺伝子の隣に位置する領域にユニークな制限部位を導入する。 5'及び3'末端では、PCRによって突起状の3'末端を備えた「外側の」付着部位（ 各々、SphI及びKpnI）及び凹み状の3'末端を備えた「内側の」付着部位（各々、 BglII及びSalI）が付加される。SphI及びBglII（又はKpnI及びSalI）での開裂は フランキング配列へ戻させる突起状の末端及びAK遺伝子内に導く凹み状の末端の 精製を生じさせる。E.coliエキソヌクレアーゼIII及びS1ヌクレアーゼを用いて の分解（Henikoff,S.(1987)Methods in Enzymology 155,156-165）は、凹み状の 末端だけからの１セットの組み重ねの欠失を産生する。従って、10mgのDNAをSph I及びBglII（又はKpnI及びSalI）を用いて分解し、フェノール−クロロホルムで 抽出し、12.5UのエキソヌクレアーゼIIIが添加する。10分間に渡って30sec間隔 でアリコートを採取し、２UのS1ヌクレアーゼを含む溶液内に入れる。新たに精 製された末端にT4のDNAポリメラーゼ（１サンプル当たり0.1U）を添加し、ベク ターのセットを平滑末端連結（１サンプル当たり10Uのリガーゼ）によって再び 閉鎖する。各時点での欠失の平均長をセットの制限解析によって決定する。これ は5'若しくは3'末端から欠失したAK遺伝子のセット を生じさせる。この操作は、活性スクリーニングにおいて産物を直接に使用でき るように、pQE-32−ジッパー構造体において直接に行われる。AK 活性についてのスクリーニング 断片相補性の要件を決定するときの第１ステップとして、我々は単独で活性で あるAKの最小のＮ末端及びＣ末端断片を決定しなければならない。欠失のセット は個々にE.coliのBL21細胞内に個別に形質転換され、AK断片の発現はIPTGによっ て誘導される。G418の存在下で有意な数のコロニーが現れるセットは、活性を保 持しているＮ及びＣ末端AK断片の適切な長さを示すのに役立つ。このため断片相 補性はこれらの限度内から採取された断片を用いて行われなければならない。ジ ッパー指向性断片相補性は次のように検出される。適切な欠失のセット、若しく はセットのプールがBL21内にコトランスフォームされ、IPTGを用いて発現が誘導 され、相違する濃度のG418の存在下における増殖が監視される。最も効果的な相 補的産物を生じさせるので、高濃度のG418の存在下で増殖する大きなコロニーが 選択される。「DNAシャッフリング」を用いた最適AK断片の指向性進化 最適な断片が選択された後、個々の断片は5'及び3'定常部プライミング領域が AKのＮ若しくはＣ末端相補的断片の隣に位置することを許容するSphI及びKpnIで の制限分解によって取り除かれる。これらのオリゴヌクレオチド類（2-4mg）をD naseI（0.005units/uL、100uL）を用いて分解し、10〜50ヌクレオチドの断片を 低融点アガロースから抽出する。その後PCRが、0.2mM dNTP、2.2mM Mg2Cl(若し くは最適以下PCRのためには0mM)、50mM KCl、10mMト リスHCl、pH9.0、0.1％ TritonX-100を含有するPCR混合液中のTaqポリメラーゼ （2.5units/ul）を使用して、断片化されたDNAを用いて実施される。PCR計画は9 4C/60秒、94C/30秒、55C/30秒、72C/30秒、30〜50回、72C ５分である。サンプ ルは、アガロースケル上で再構成された完全断片の外観を監視するために、25サ イクル後に５サイクル毎に採取される。プライマーレスPCR生成物をその後１：4 0若しくは１：60に希釈し、さらに20サイクルに対するプライマーとしての5'及 び3'相補的定常部領域オリゴと一緒にPCRのための鋳型として使用する。最終生 成物をSphI及びKpnIを用いて制限分解し、発現プラスミドの最終ライブラリーを 生じさせるために産物をpQE32−ジッパー内へ逆にサブクローニングする。以前 と同様に、E.coliBL21細胞は連続的に109の推定効率でＣ末端若しくはＮ末端相 補的断片発現ベクターを用いて連続的にトランスフォームされ、最終的に細胞は 相補的断片を用いてコトランスフォームされる。E.coliは1mg/mlのG418を含むア ガロースプレート上で増殖させられ、16時間後に最大コロニーが選択され、G418 の濃度を上昇させて液体培地中で増殖させられる。G418への最大耐性を示してい るクローンがその後選択され、最大耐性以上に達すると進化が終了される。さも なければDNAシャッフリング法が繰り返される。最後に、最適断片がシークエン シングされ、物理的特性及び酵素活性が評価される。この最適化AKのPCAはこれ で酵母及び哺乳類細胞系を含むあらゆる他の細胞種類において優性選択について 試験する準備が整う。この方法は、薬物若しくは毒素又は着色若しくは蛍光産物 を生じさせる酵素に優性若しくは劣性選択を与える酵素に基づく何らかのPCAを 開発するために使用することができる。後者の２つの場合には、進 化プロセスのエンドポイントは少なくとも、無傷の野生型酵素に対するシグナル の再達成又はシグナルの増強である。この方法は酵素が単量体、二量体若しくは 多量体構造であるかどうかという酵素構造の知識が欠如している場合にも使用す ることができる。しかし、酵素構造の知識は、下記に記載するのと同様にこの方 法を適用することを妨害はしない。 認識できるように、酵素構造の知識はPCAをデザインするために分子の進化を 使用する方法をより効果的にするために使用できる。この場合には、酵素構造は DHFRについて実施されたように、問題のタンパク質の最小ドメインを定義するた めに使用される。Ｎ若しくはＣ末端断片に対して完全に無作為の長さの断片を発 生させる代わりに、我々はエキソヌクレアーゼ期中に少なくとも２つのドメイン 中１つをコードする断片を選択する。例えば、AKの場合は、２つの明らかにに定 義されたドメインをＮ末端における1〜94残基及びＣ末端における95〜267残基を 含んでいる構造において認識することができる。エンドヌクレアーゼ分解は上記 と同様に実施されるが、少なくとも２つのドメイン中１つをコードする反応産物 が選択される。これらはその後、上記で説明したように断片選択及び進化サイク ルの開始点となる。ヘテロマー酵素PCA 本発明のさらに別の実施態様は、全ての触媒機構が１つの独立したフォールデ ィングサブユニット内に含まれており、他のサブユニットがその酵素的サブユニ ットに安定性及び／又はコフォクターを提供するヘテロ二量体若しくはヘテロ多 量体酵素を用いることに基づくPCAに関する。このPCAの実施態様では、調節サブ ユニットが相補 的断片に分裂し、相互作用するタンパク質に融合させられる。これらの断片は酵 素サブユニットと一緒に細胞内へコトランスフォーム／トランスフェクトされる 。DHFR及びAKについて記載された単一酵素PCAを用いる場合と同様に、酵素活性 の再構成及び検出はその天然トポロジー内への調節サブユニットの再構成内への オリゴマー化ドメイン−支持再構成に依存している。しかし、再構成されたサブ ユニットはその後無傷酵素サブユニットと相互作用して活性を産生する。このア プローチは、この場合には酵素が構成性細胞酵素ではなく、むしろ外因性遺伝子 産物であるという長所を持っていることを除けば、USPSシステムを思い出させる 。宿主細胞からのバックグラウンド活性について問題がないものとして、この酵 素は天然遺伝子より高いレベルで発現させることができ、さらに特異的細胞下の コンパートメントへ向けるように修飾することができる(酵素のＮ若しくはＣ末 端及びサブユニット断片上へコンパートメント特異的シグナルペプチドをサブク ローニングすることによって)。このアプローチの特別な利点は、単一酵素の方 法は準最適の酵素活性をもたらすことがあるが、このアプローチでは酵素は独立 してフォールディングし、実際にそのリフォールディングを助けるように断片化 された調節サブユニットへのシャペロンとして機能する可能性がある。さらに、 断片のフォールディングは酵素の調節を与えるために完全である必要はないかも 知れない。このアプローチは、我々がStreptomyces tyrosinase（ストレプトマ イセス・チロシナーゼ）に基づいて開発した比色／蛍光光度法アッセイによって 実現される。この酵素はチロシンからデオキシフェニルアラニン（DOPA）への転 換を触媒する。この反応はフルオロシニル−チロシンからDOPA形への転換によっ て測定できる。この活 性酵素は、触媒ドメイン（Melc2）と銅結合ドメイン（Melc1）の２つのサブユニ ットから構築される。Melc1はMelc2活性のために絶対的に必要とされる14kDの小 さなタンパク質である。我々が開発中のアッセイでは、Melc1タンパク質はPCAの 相補性部分として役立つ２個の断片に分割させられる。オリゴマー化ドメインに 融合しているこれらの断片はMelc2を用いて共発現させられ、さらにこのアッセ イの基礎はMelc2活性がMelc1断片の相補性に依存していることにある。タンパク 質複合体の化学量論も又下記のように取り扱うことができる(つまり、複合体が ２若しくは３個のタンパク質から構成されているかどうか)。２個のタンパク質 を２個のMelc1断片に、３個目は無傷Melc2へ融合させる。従って、チロシナーゼ の最小相補的活性複合体は、全３つのコンパートメントを要求する、従って三量 体が必要であることを証明できる。このアプローチの重要な態様は、過剰発現し たMelc1断片−タンパク質融合のバックグラウンドにおいてそれを過小発現させ ることにより他のコンポーネントに依存している１つのコンポーネント、特にタ ンパク質−Melc2融合触媒サブユニットを作ることによって我々が容易に特異的 相互作用を証明できることである。多量体分裂に基づくPCA 出願人らはPCAを構成するものとして無傷タンパク質、タンパク質ドメイン又 はサブユニットの断片相補性だけを説明してきたが、好ましい実施態様は、例え ば触媒活性のためにサブユニットの安定性連結を必要とする二量体酵素間の界面 の分裂に基づくPCAに関する。そうした場合には、サブユニット界面での選択的 又は無作為突然変異誘発は相互作用を中断させるであろう、そしてこのアッセイ の基礎は、 サブユニットへ融合したオリゴマー化ドメインが機能的酵素内へサブユニットを 一緒に持ち込むために必要な結合エネルギーを提供することにあるであろう。PCA へ適用するときのベクターのデザイン 従ってこれまでに列挙したPCA方法は相補的断片を発現させるために２プラス ミド形質転換方法を使用してきた。このアプローチは、例えば形質添加若しくは トランスフェクトされた細胞中での遺伝子の最適取り込み又は細菌内への相補的 プラスミドの最適形質転換及び種々のプロモーターを用いてのPCA断片の発現レ ベルの制御に対して選択するために種々の薬物耐性マーカーを使用することのよ うな幾つかの長所を持っている。しかし、単一プラスミド方法には形質転換／ト ランスフォーメーションに関して長所がある。タンパク質発現レベルは種々の方 法で制御できるが、薬物選択は２つの方法のうち１つで達成できる。例えばAKの ようにそれ自体が薬物耐性マーカーである酵素を用いる生存アッセイに基づくPC Aの場合、又は例えばDHFRのような酵素が代謝経路を補足する場合には、発現プ ラスミドにおいて追加の薬物耐性遺伝子が取り込まれる必要はない。しかしPCA が着色若しくは蛍光産物を産生する酵素に基づいている場合は、プラスミドから 追加の薬物耐性遺伝子が発現されなければならない。PCA相補的断片及び融合cDN Aライブラリー／標的遺伝子の発現は個別誘導性若しくは構成性プロモーターの 制御下で個別オペロンとしての単一プラスミド上で構築することができる、又は 多シストロン性に発現させることができる。E.coliでは多シストロン性発現は既 知のインターコーティング領域配列を用いて達成できるので、我々が例えば強力 な（tac）プロモーターの制御下でE.coliにおいてハイレベルで 発現することを証明したチロシナーゼmelc1-melc2遺伝子をそこから引き出したm elオペロンにおける領域を使用する。遺伝子はさらに又tac及びアラビノースの ような独立プロモーターから発現及び誘導することができよう。哺乳類発現シス テムに対しては、単一プラスミドシステムは一過性又は安定性両方の細胞系発現 のため及び構成性若しくは誘導性発現のために使用できる。さらに、相補的断片 融合の１つ、通常はbait融合断片の発現の弁別コントロールは、発現を最小限に 抑えるようにコントロールすることができる。これはバックグラウンドの非特異 的相互作用を減少させるときに重要であろう。相補的断片発現の弁別コントロー ルの例には下記の方法が含まれる。 i）一過性若しくは安定性の多シストロン性発現において、第２遺伝子の発現 は必ずより有効性が低くなり、その結果これ自体が相補的断片の１つの量を制限 するのに役立つであろう。或いは又、上流ドナー／スプライス部位の突然変異に よって第１遺伝子産物を発現において制限でき、他方第２遺伝子は発現を強化す るためのECMVのようにレトロウイルス内部開始部位の制御下に置くことができる 。 ii）個々の相補的断片融合対も又、Tet−反応性PhCMV^*-1プロモーター、及び ／又はステロイド受容体反応エレメントに基づくものを含む全て市販で入手でき る誘導性プロモーターのコントロール下に置くことができる。そうしたシステム では、２個の相補的断片遺伝子を刺激することができ、発現レベルはこれらの場 合にはテトラサイクリン及びステロイドホルモンであるインデューサーを用いて 用量依存性発現によってコントロールできる。 実施例２ 生化学的経路における新規遺伝子産物を検出し、そうした経路をマッ ピングするためのPCA方法の適用 他の分子と相互作用のスクリーニング法より優れているPCAの長所の中でも最 大の長所は、それらがin vivo及びあらゆる種類の細胞の両方で実施できるよう にデザインされる点である。この特徴は、この方法を適用する目標がライブラリ ーから新規相互作用を同定すること、そして同時に観察されたその相互作用が生 物学的に重要かどうかを決定できることである場合は極めて重要である。下記に 示す詳細な実施例及び本章の最後に記載されているもう１つの実施例は、PCAを 用いての相互作用の検証がどのように可能であるかを具体的に説明している。基 本的に、これは下記のように達成される。ホルモンレセプター媒介性シグナル発 生のような生化学的経路においては、酵素媒介化学反応のカスケードは、膜表面 レセプターへのホルモン結合によるような幾つかの分子イベントによって誘発さ れる。その後に、タンパク質性基質との酵素相互作用及び酵素修飾基質とのタン パク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸相互作用が発生する。そうした生 化学的シグナル発生カスケードは、これらのプロセスを試験するためには特異的 な細胞種類及びモデル細胞系でしか発生しない。このため、まだ同定されていな いタンパク質を含む経路における既知のタンパク質とのような誘導性相互作用を 検出するためには、明らかに適切なモデル細胞系及び正しい細胞コンパートメン トにおいてそうしたスクリーニングを実施する必要がある。これを行う一般的方 法において使用できるのはPCA方法だけである。酵母の二−又は三−ハイブリッ ド法のようなタンパク質−分子相互作用法は、酵母における核相互作用若しくは 誘発されない相互作用の限定された場合を除いて、そうしたイベントが発生する 状況において実施することはできない。誘発され たタンパク質相互作用を検出することができるかも知れない哺乳類の二−ハイブ リッド法が存在はするが、これも同様に関係しているタンパク質を同時に活性化 し、核に輸送し、それらのパートナーと相互作用させることができる場合にしか 可能ではない。PCAには、特異的コンパートメントでしか利用できない追加の細 胞機構を必要としないので、これらの制限を受けない。もう１つのポイントは、 適切なモデルの細胞種類においてPCA方法を実施することによって、特定経路を 試験するために適切な陽性及び陰性コントロールを導入することもできる点であ る。例えば、ホルモンシグナル発生経路については、おそらくホルモンシグナル 発生アゴニスト及びアンタゴニスト又はシグナル発生カスケードタンパク質の優 性−陰性突然変異体は既知であり、上流にある、又はPCAで試験されているイベ ントの平行して機能すると思われる。これらの試薬はPCAによって検出された新 規相互作用が生物学的に重要であるかどうかを決定するために使用できよう。一 般に、ホルモンが導入された場合にだけ検出され、アンタゴニストが同時に導入 された場合には所見されない相互作用は試験下のプロセスにとって重要な相互作 用を表していると仮説を立てることができよう。 下記ではこれらのポイントを具体的に説明しているDHFR適用の詳細な説明並び にPCA方法を使用できる別の例を記載する。成長因子媒介性シグナルトランスダクション経路のマッピングへのDHFRのPCAの 適用 成長因子活性化細胞増殖において最も早期に検出できるイベントの１つは、40 SリボソームサブユニットのS6タンパク質のセリンリン酸化である。特異的にS6 をリン酸化するセリン／トレオニンキナー ゼの発見は、新規マイトジェン媒介性シグナルトランスダクション経路を同定す ることに相当に大きく役立ってきた。セリン／トレオニンキナーゼp70S6kは特異 的S6ホスホリラーゼであると同定されている^131-136。p70S6kは、血清飢餓細胞 中の血清、インスリン及びPDSFを含む成長因子、及びホルボールエステルのよう なマイトジェンを含む数種のマイトジェンシグナルに反応して特異的部位でセリ ン及びトレオニンリン酸化によって活性化される。最近５年間に渡って、p70/p8 5S6kがマイトジェンに反応してどのように活性化されるかを決定するために相当 に大きな努力が払われてきた。p70S6k活性化には、１つはホスファチジルイノシ トール−３−キナーゼ（Pl(3)k）と関連しており、もう１つはPl(3)k同族mTORと 関連している２つのレセプター媒介性経路が結び付けられてきた^133-144。この 提案を理解するための鍵は、p70S6kの活性化においてこれらの酵素が果たす役割 がリン酸化及び酵素活性に２種の天然産物が及ぼす作用によって決定されたとい う事実にある。これは、間接的にmTOR活性を阻害するラパマイシン、及びPl(3)k 活性を直接的に阻害するワートマニンである。現在までにp70S6kの直接的上流に あるキナーゼ類又は他の調節タンパク質類が同定されていないということに注目 することも又重要である。 p70S6kとその既知の基質S6との相互作用は、E.coli及び哺乳類細胞系における DHFRのPCAに対するテストシステムとして研究することができる。さらにこの重 要な酵素がどのように調節されるかについての新規の洞察をもたらすであろうこ の酵素との新規相互作用を同定することを試みることもできる。さらに、この酵 素の活性化は特異的薬物を用いて選択的に阻害できる複数の経路によって媒介さ れる ので、これは誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用を同定するための 方法としてPCAを研究するための理想的なシステムである。ａ）E.coli生存アッセイの試験：p70S6kとS6との相互作用 この試験は、S6タンパク質に対するp70S6kの見掛けのKm（＝250nM）¹⁴⁵が我々 のテストシステムで使用したGCN4からのロイシンジッパー形成ペプチドに対する Kdとほぼ同一であるので理想的である。しかし、我々のテストのためにはこの酵 素の構成的に活性な形を使用しなければならないであろう。酵素D77-p70S6kのＮ 末端の断端形は構成的に活性であり、これらの試験に使用されるであろう¹⁴⁷。 方法としては、D77-p70S6k-F[1,2]融合及びD77-p70S6k-F[3]融合、又はF[1,2]及 びD77-p70S6k-F[3]融合(コントロールとして)をE.coli内へコトランスフォーム し、細胞をトリメトプリムの存在下で最少培地中で増殖させる。40Sリボソーム サブユニットに対するキナーゼ活性の解析及び２種のタンパク質を共発現させる ためにコロニーが選択され、拡大させられる。ｂ）ライブラリースクリーニングのための細菌生存アッセイの修飾：新規相互作 用タンパク質の同定 下記のステップが含まれていれば、特定標的（この場合にはp70S6k-D77）との 相互作用について発現ライブラリーをスクリーニングすることは、このテストシ ステムでは簡単であろう。これは、１−mDHFR断片[3]との融合としての融合−発 現ライブラリーの構築と、２−pRep4を含んでいるE.coli BL21におけるライブラ リーの形質転換（lacレプレッサーの構成性発現のため、これはタンパク質産物 が細胞にとって毒性の場合に必要とされる）及び融合、p70S6k- D77-[1,2]をコードするプラスミド、３−トリメトプリム及びIPTGの存在下にお ける最少培地上でのプレーティング、４−増殖するあらゆるコロニーの選択、プ ラスミドDNAの増殖及び単離、その後にDNAインサートのシークエンシング、５− HexaHis-tagによる未知の融合産物の生成及びSDS-PAGE上でのサイジングである 。方法： 総合方法は図５に具体的に示されている。１−指向性融合−発現ライブラリー の構築、ｉ−cDNA産生であり、poly(A)⁺RNAをBA/F3細胞（Ｂ-リンパ球）から単 離することはできるか、これはこれらの細胞がラパマイシン感受性p70S6k活性化 カスケードの試験において使用されて良好な結果が得られているためである¹³⁹ 。全長のmRNAを強化するためには、我々はCAPture法¹⁴⁸による5'キャップ構造を 通してmRNAをアフィニティー精製する。逆転写を「リンカープライマー」によっ て開始する。リンカープライマーはpoly(A)mRNAテールから開始するためにpoly( T)テールを持っており、断片の指向性サブクローニングにおいて後で使用するた めにXhoI部位を持っている。第１鎖はその後メチル化される。第２鎖合成及び産 物の平滑化の後、「EcoRIアダプター」が付加され、EcoRI及びXhoIを用いてのリ ンカーの産生分解（インサートはメチル化によって保護される）はEcoRI及びXho Iを用いて開かれたベクターにおける指向性挿入に準備の整った全長のcDNAを産 生する。ライブラリースクリーニングの成功は産生したcDNAの質に大きく左右さ れるので、一貫して高品質のcDNAライブラリーを産生することが証明されている ので我々は上記の方法を使用するであろう。ii−ベクター内へのcDNAの挿入であ り、我々がBL21細胞においてこのベクターからmDHFR 融合のハイレベルの発現を入手しているので、ライブラリーはベクターpQE-32(Q iagen)内でmDHFR F[3]へのＣ末端融合として構築されるであろう。我々が工学的 に作り出した新規ポリクローニング部位（先に方法の腔の下で記載されている） である3'末端で相違しており、追加の０、１、若しくは２個のヌクレオチドいず れかを持っているそうした３種のベクターが作り出されるであろう。これは全３ つの翻訳リーディングフレームにおけるライブラリー断片内へのF[3]からのリー ドスルーを可能にする。cDNA断片は一度に全３つのベクターにおいてEcoRI及びC hoI部位で指向性に挿入されるであろう。２、３、４及び５−ライブラリー挿入 のベクター配列フランキング部位に特異的なシークエンシングプライマーを使用 して同定されたクローンの最終シークエンシングを行うことを除いて、これらの ステップは結果の項で以前に説明されている。タンパク質精製についても又、Ni -NTA(Qiagen)上での１ステップ精製によって以前に記載されている。産物のサイ ズがDHFRコンポーネント（450bp以上のcDNAインサートと等価）の分子量より15k DA以上大きい場合は、我々はシェルドン・バイオテクノロジーセンター（Sheldo n Biotechnology Center：McGill大学）でインサートをシークエンシングしても らうであろう。ｃ）真核細胞アッセイの開発 上述の系のトランスフォーメーションは、真核細胞において使用するために等 価のアッセイを作り出すために有用である。このアッセイの基本原理は同一であ る。即ち、mDHFRの断片が会合ドメインに融合させられ、ドメイン会合が真核細 胞中のDHFR活性の再構成によって検出される(図５)。 ・発現構造体の精製：GCN4−ジッパー−mDHFR断片融合をコードするDNA断片は真 核過渡発現ベクター¹²⁶であるpMT3内に１ピースとして挿入された。COS細胞中の 融合タンパク質の発現は35[S]Metラベリング後にはSDS-PAGE上で明白であった。 ・真核細胞内での生存アッセイ：mDHRF再構成の検出には２つの系を平行して使 用できる。即ち、ｉ−CHO-DUKXのB11細胞（DHRF活性が不足しているチャイニー ズ・ハムスター卵巣細胞系）はGCN4−ジッパー−mDHFR断片融合を用いてコトラ ンスフェクトされる。細胞はヌクレオチドの不在下で増殖し、再構成されたDHFR を持っている細胞だけが正常な細胞分割及びコロニー形成を受けるであろう。ii −COS及び293細胞のような構成性DHFR活性を有している細胞をトランスフェクト することを目標に、mDHFRのメトトレキセート（MTX）耐性突然変異体を精製する 。我々は、有意にKi(MTX)を増加させる５回の突然変異各々を、一度に１つ取り 込むためにF[1,2]を突然変異させた。それは、Gly15Trp、Leu22Phe、Leu22Arg、 Phe31Ser及びPhe34Ser（ナンバリングは野生型mDHFR配列に従っている）である 。これらの突然変異は活性部位及びF[3]に比較して相違する位置で発生し、それ らが存在した全長の哺乳類酵素のKm(DHF)、Km(NADPH)及びVmax上に相違する作用 をもたらす。突然変異体Z-F[1,2:Leu22Phe]、Z-F[1,2:Leu22Arg]及びZ-F[1,2:Ph e31Ser]は全部Z-F[3]を用いてコトランスフォームされたときに高い成長率で細 菌生存を許容した(結果は示されていない)。５つの突然変異体は、天然酵素の活 性のためにバックグラウンドを排除するであろうMTXの選択的環境を受けながらC OS若しくは293細胞増殖を維持できる酵素を産生するために真核細胞においてmDH FR断片の再構成で試 験されるであろう。突然変異は活性酵素の再構成に関する明白な短所を提示せず に、選択における長所を提供する。生存アッセイのいずれかにおいて産生する再 構成されたmDHFRが野生型酵素を用いた場合の増殖より無視できないように緩徐 な真核細胞増殖を許容する場合は、ヌクレオチドの欠如によって提供される選択 的環境を部分的に緩和するために増殖培地にチミジレートが添加されるであろう 。ｄ）真核細胞生存アッセイの試験 まず最初に、p70S6kとの誘導相互作用を検出できるかどうかを試験することが 必要である。E.coli試験系について上記で説明したものと同一の試験系を使用で きる。それは、p70S6kとS6タンパク質の会合の誘導である。方法： mDHFRのLeu22Phe突然変異体S6-F[1,2]及びp70S6k-F[3]、若しくはF[1,2]及びp 70S6k-F[3]（コントロールとして）がCOS細胞内にコトランスフェクトされ、細 胞は48時間に渡って血清飢餓にされ、その後血清及びMTX中において低密度で細 胞のリプレーティングが行われる。40Sリボソームサブユニットに対するキナー ゼ活性の解析及び２種のタンパク質の共発現のためにコロニーが選択されて拡大 させられる。ワートマニン及びラパマイシンとのタンパク質会合の阻害について さらにコントロール試験が実行される。ｅ）ライブラリースクリーニングための真核細胞生存アッセイの修飾 Stratagen製「cDNA合成キット」によって産生するEcoRI/XhoI指向性cDNAはStr atagene Zap Expressベクター内に指向性で直接にインサートできるので、真核 細胞において使用するためのライブラリーを創製するときに必要とされる仕事の 重要な部分は既に遂行され ているであろう。方法： ステップ１から５は、細菌ライブラリースクリーニング（上記）のステップと 同様である。即ち、１−同様に、ライブラリーがmDHFRのF[3]へのＣ末端融合と して構築される。F[3]（停止コドンなし）はZap Expressにおいてフレーム内に 挿入され、その後に全て３つのリーディングフレーム（上記）における挿入の発 現を許容する新規ポリリンカーの挿入、及びEcoRI/XhoI指向性cDNAが続く。この バクテリオファージライブラリーは、融合インサートを持っている真核発現ファ ージミドベクター（pBK-CMV）を働かせるStratagene製ヘルパーファージを用い て増殖及び処理されるであろう。２−真核細胞におけるライブラリーとp70S6k-F [1,2]構造体のコトランスフェクション、つまり、我々はこのスクリーニングをC OS又は293細胞において実施するが、それはこれらがp70S6kシグナル発生経路を 活性化するときに血清に応答性であるからである。選択実験は上記でS6試験系に ついて記載された通りに実施される。３−挿入DNAの増殖、単離及びシークエン シングが行われる。４−クローンされた融合タンパク質は35S-Met/Cysラベリン グの後に直接視認によってSDS-PAGE上で、又は市販のmDHFRへのポリクローナル 抗体を使用したウェスタンブロッティングによってサイジングされる。方法の一般化： タンパク質p70S6kに対するパートナーを検出するためのスキーム は、あらゆる生きている生物におけるあらゆる生化学的経路の試験に適用できる 。そうした経路は又疾患プロセスに関連している可能性がある。疾患関連経路は 、病理がそこから発生している細胞の、例えば遺伝子の突然変異、欠失又は過小 若しくは過剰発現のよ うな内因性プロセスである可能性がある。或いは又、生化学的経路は病原微生物 又は宿主侵襲のメカニズムに特異的な経路の場合がある。この場合、そうしたプ ロセスのコンポーネントタンパク質は、病原微生物に特異的な生化学的経路にお ける微生物若しくはコンポーネント酵素による侵襲を阻害する薬物の開発のよう な、治療方法の目標となることがある。 これら両方の例に関係する適切な例は炎症性疾患である。炎症性組織への白血 球の付着を媒介するタンパク質−タンパク質相互作用が、血管細胞付着分子−１ （VCAM-1）のようなタンパク質、及び炎症中に産生するIL-6及びIL-8のような一 定のサイトカイン類を含んでいることは知られている。しかし、炎症性反応の開 始に関係するタンパク質の多くは依然として不明である。さらに、細胞外会合に よって誘発される細胞内シグナル発生経路はほとんど理解されていない。PCAは 、炎症の開始並びにそれに引き続くシグナル発生下のメカニズムを説明するとき に使用することができよう。例えば、IL-1、IL-6、IL-8及び腫瘍壊死によって媒 介されるような炎症に関連するシグナル発生経路は幾らか詳細に試験されており 、多くの直接的及び下流レギュレーターは知られている。これらのレギュレータ ーは薬物開発のための標的でもある他のシグナル発生若しくは調節タンパク質を 同定するためのためのＰＣＡスクリーニングにおいて起点標的として使用できる 。 現在は、特発性腸疾患を特徴付ける腸炎症の発生において腸内病原菌による感 染症の高いリスクが存在する。この場合により明らかに理解する必要のある、そ してPCAによって取り扱うことのできる２つのメカニズムがある。 まず、ｉ−上記のような炎症の細胞機構、及びii−病原微生物が認 識してそれと会合する特異的細胞表面リガンドの発見である。病原菌によって産 生する分泌タンパク質は、上皮細胞の基底側部膜へ結合できる(エルシニア偽結 核菌[Yersinia pseudotuberculosis]感染症における場合のように)又は腸上皮細 胞内へトランスロケートさせられ(サルモネラ[Salmonella]感染症)、感染性及び ／又は感染症への生理学的応答を促進する。しかし、ほとんどの場合、病原タン パク質と上皮細胞との相互作用は知られていない。 次に、細胞付着及び神経系の再生である。つまり、細胞付着に関連する例には 、神経系の発達及び再生に関係するプロセスが含まれる。 カドヘレンは、カルシウム依存性細胞−細胞付着をメディエートする膜タンパク 質である。そのように行うためには、カテニンと呼ばれる他のクラスの細胞質タ ンパク質を必要とする。それらはカドヘリンと細胞骨格との間に橋を作り出す。 カテニンは又、分化特異的遺伝子を制御する調節遺伝子でもある。例えば、タン パク質Ｂ−カテニンは一定の状況において転写因子（lef-1）と相互作用してlef -1によってトランス活性化される多数の遺伝子を抑制する核内にトランスロケー トさせられる(分化)。このプロセスは、APC（細胞質アダプタータンパク質）の 不活化の後に変性を許容するGSK3Bの不活化によって、Wntシグナル発生経路（シ ョウジョウバエ[drosophila]におけるwingless経路と相同）によって調節される 。PCA方法はこれらのプロセスの調節に含まれる新規タンパク質を同定するため に使用できよう。 ウイルス統合プロセスに含まれるタンパク質は、PCA方法を使用してインヒビ ターについて試験できる標的の例である。HIVウイルスについての例は下記を含 んでいる。 i）インテグラーゼ又は統合前複合体：タンパク質Ma若しくはvprの輸送の阻害、 ii）断片化の誘導を引き起こすvprによるG2における細胞周期の阻害(サイクリン Ｂによる相互作用)、 iii）フリンを用いてのgp160（膜タンパク質の前駆体）の相互作用の阻害 治療標的としてのHIVのアクセサリータンパク質： i）Vpr：核局在配列(標的)：vprとホスファターゼＡとの相互作用部位、 ii）vif：ビメンチン（細胞骨格会合タンパク質）との相互作用、 ii）Vpu：Vpuの細胞質テールによりメディエートされたREにおけるCd4の変性、 iii）nef：Nefのミリストイル化シグナル。 実施例３ その他のタンパク質断片相補性検定の実施例 その他のアッセイの実施例をここで具体的に示す。これらのアッセイを作り出 す理由は、アッセンブリーの平衡若しくは動態の側面を試験するような特異的タ ンパク質会合問題に適切と思われる代替PCA方法を提供することにある。さらに 、一定の状況（例えば、特異的な細胞種類）又は一定の適用のためには、特異的 PCAは機能しないが、代替法が機能することがあり得る。下記では、その他のPCA の実施態様１つ１つについて簡略に説明する。 １)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)：偏虫Schistosoma japonicum （日本住血吸虫）からのGSTは、原核細胞及び真核細胞の両方で発現され得る小 さな(28kD)、単量体の可溶性タンパク質で ある。高分解能結晶構造が解明されており、PCAをデザインするための開始点と して役立つ。GST活性についての単純かつ安価な比色アッセイは、光り輝く黄色 産物である1−クロロ−2,4−ジニトロベンジン（CNDB）との還元グルタチオンの 還元共役を含めて開発されてきた。我々は、オリゴマー化ドメインとしてGCN4ロ イシンジッパーを使用してDHFRのPCAを開発するために類似の構造的基準に基づ いてPCAをデザインした。ジッパー−GST−断片融合のコトランスフォーマントが アーガープレート上のE.coli中で発現させられ、コロニーはニトロセルロース・ ペーパーへ移される。断片相補性の検出は、グルタチオン−CDNB反応混合液がニ トロセルロース上にエーロゾルとして塗布されるアッセイで検出され、GSTの共 発現断片を発現しているコロニーが黄色イメージとして検出される。 ２）緑色蛍光タンパク質(GFP)：発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）からの GFPは遺伝子発現のための最もポピュラーなタンパク質マーカーの１つになりつ つある。これは、この小さな単量体の238アミノ酸長のタンパク質が残基Ser65と Gly67の間のポリペプチドバックボーンの自己触媒性環化及びTyr66の結合の酸化 の結果として生じる内部発色団が存在するために内因性蛍光性であるためである 。GFP発色団は395nmで最高に光を吸収するが、さらに470nmでも第２吸収極大を 有している。この２相の特異的吸収は、その相対集団が発色団の局所環境に依存 する発色団の２つの低エネルギーコンフォーマー（配座異性体）が存在すること を示唆している。異性化（488nmでの単一吸収極大）を排除する突然変異体Ser65 Thrは野生型に比べて４〜６倍強力な蛍光を生じさせる。最近、GFPの構造は２つ の研究グループによって解明され、現在では我々が開発し始め た構造に基づくPCAデザインの候補になりつつある。GSTアッセイを用いた場合と 同様に、我々はオリゴマー化ドメインとしてのGCN4ロイシンジッパー形成配列を 用いてE.coliにおける我々の初期の開発全てを実施している。広範囲UV光線下で の視覚的観察による蛍光の直接検出が使用されるであろう。我々はさらに、蛍光 活性化細胞ソーティング（FACS）を用いてコトランスフェクタントに対して選択 することにより、COS細胞においてこの試験系を試験するであろう。 ３）ホタル（Firefly）ルシフェラーゼ：ホタルルシフェラーゼは、ヘテロサイ クルルシフェリンの酸化を触媒する62kDaのタンパク質である。この産物は生物 発光反応に対する最高量子収率の１つを有している。酸化されたルシフェリン分 子１つに対して１個の光子が放出される。ルシフェラーゼの構造は最近解明され 、PCAの構造に基づく開発が可能になった。我々のGSTアッセイを用いた場合と同 様に、細胞はニトロセルロース基質上で増殖させられる。ニトロセルロースの表 面でのルシフェリンの付着は、細胞質膜全体への拡散を許容し、ホトルミネセン ス反応を誘発する。検出は写真フィルム上で即時に行われる。ルシフェラーゼは PCAにとって理想的候補であり、検出アッセイは、迅速、安価、極めて高感受性 であり、さらに市販で入手できる非放射性基質を利用する。ルシフェラーゼの基 質であるルシフェリンは細胞質膜全体に拡散でき(酸性pH下で)、無傷細胞中のル シフェラーゼの検出を可能にする。この酵素は、現在は様々な発現系におけるリ ポーター遺伝子として利用されている。このタンパク質の発現は細菌、哺乳類細 胞及び植物細胞において著明に特徴付けられているが、これは可転性PCAを提供 することを示唆している。 ４）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (XGPRT)。E.coli酵素XGPRTはキサンチンをGMPの前駆体であるキサンチンモノホ スフェート（XMP）へ転換させる。哺乳類酵素であるヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）は基質としてヒポキサンチン及び グアニンしか使用できないので、キサンチンの存在下での細胞増殖のためにPCA にとっての優性選択アッセイとして細菌XGPRTを使用することができる。XGPRTを 発現するベクターは、アデニン、キサンチン及びミコフェノール酸を含有する選 択的培地中で哺乳類細胞が増殖する能力を授ける。ミコフェノール酸の機能は、 IMPからXMPへの転換を遮断することによってGMPの新規合成を阻害することであ る(Chapman A.B.,(1983)Molec.& Cellul.Biol.3,1421-1429)。その後産生する唯 一のGMPは、細菌XGPRTによって触媒されてキサンチンからXMPへの転換から生じ る。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを用いた場合と同様に、XGPRT の断片は試験オリゴマー化ドメインとしてGCN4ロイシンジッパーへ融合された断 片を用いる上記で説明したデザイン進化方法を用いて既知の構造（表１参照）に 基づいて生成させることができる。相補的融合はコトランスフェクトされ、COS- 7細胞中で一過性に発現した、若しくはCHO細胞中で安定性に発現したタンパク質 は選択培地で増殖させられる。CHO細胞の場合は、コロニーが収集され、高濃度 で融合を効果的に発現する細胞集団を強化するために選択的化合物の濃度を上昇 させながら連続的に再培養される。 ５）アデノシンデアミナーゼ：アデノシンデアミナーゼ（ADA）は、全ての哺乳 類細胞中において実質的に痕跡量で存在する。細胞成長のための必須酵素ではな いが、ADAは優先選択的アッセイにおいて使 用できる。細胞が生存するためにADAを必要とする成長条件を確定することは可 能である。ADAは細胞毒性アデニンヌクレオシド類からそれらの各自に非毒性イ ノシン類似体への比可逆性転換を触媒する。細胞毒性濃度のアデノシン若しくは 9−b−D−キシリフラノシルアデニンのような細胞毒性アデノシン類似体を細胞 に添加することにより、ADAは細胞毒性剤を解毒するために細胞成長にとって必 要とされる。その後、ADA遺伝子を取り込んでいる細胞をADAのタイト ルマイシンの存在下で増幅させるために選択することができる。ADAはその後、 細胞生存に基づくPCAのために使用できる（Kaufman,R.J.Et al.(1986)Proc.Of t he Nat.Acad.Sci.(USA)83,3136-3140)。 上記で説明した他の試験系を用いた場合と同様に、テストオリゴマー化ドメイン としてのGCN4ロイシンジッパーに融合した断片を用いて上記で説明したデザイン 進化方法を使用して、既知の構造（表１参照）に基づいてADAの断片を生成させ ることができる。相補的融合はコトランスフェクトされ、タンパク質はCOS-7細 胞内で一過性に 培地で増殖したCHO細胞中で安定性に発現させられる。CHO細胞の場合は、コロニ ーが収集され、高濃度で融合を効果的に発現する細 を上昇させながら連続的に再培養される。 ６）ブレオマイシン結合タンパク質(ゼオシン耐性遺伝子)：抗生物質のブレオマ イシン／フレオマイシンファミリーの一員であるゼオシンは、細菌、真菌、植物 及び哺乳類細胞にとって毒性である。ゼオシン耐性遺伝子の発現はブレオマイシ ン／ゼオシンへの耐性を授ける。 このタンパク質は、薬物に結合してこれを分離する、従ってDNAの会合及び加水 分解を防止することによって耐性を授ける（Berdy,J.(1980)In Amino Acid and Peptide Antibiotics,J.Berdy,ed.(Boca Raton,FL:CRC Press),pp.459-497;Muls ant,P.,Tiraby,G.，Kallerhoff,J.,and Perret,J.(1988 Somat.Cell.Mol.Genet. 14,243-252))。ブレオマイシン結合タンパク質（BBP）はその後細胞生存に基づ くPCAのために使用できよう。上記で説明した他の試験系を用いた場合と同様に 、試験オリゴマー化ドメインとしてのGCN4ロイシンジッパーに融合した断片を用 いて上記で説明したデザイン進化方法を使用して、既知の構造（表１参照）に基 づいてADAの断片を生成させることができる。BBPは、サブユニットインターフェ ース結合部位を通して薬物に結合する小さな（8kD）二量体である。このため、 デザインは最初のものとは幾分相違したものになり、二量体の単一鎖形は２個の サブユニット間で導入された単純なポリペプチドリンカーをコードする短い配列 を持つ２個のBBP遺伝子を融合させることによって生成されるであろう。この場 合の断片はサブユニットモジュールの１つの短い配列に基づくであろうが、もう １つの断片はサブユニットの残りの配列に他のサブユニットをプラスしたものか ら構成されるであろう。相補性及び選択実験は、選択的薬物としてブレオマイシ ン又はゼオシンを使用した上記の実施例について説明した通りに実施されるであ ろう。 ７）ヒグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ：抗生物質であるヒグロマ イシンＢはトランスロケーションを中断させてミスリーディング（誤読）を促進 することによってタンパク質合成を阻害するアミノシクリトールである。E.coli 酵素であるヒグロマイシンB− ホスホトランスフェラーゼはヒグロマイシンＢをリン酸化することによって細胞 を解毒する。哺乳類細胞中で発現すると、ヒグロマイシンB−ホスホトランスフ ェラーゼはヒグロマイシンＢへ耐性を授けることができる(Grits,L.,and Davies ,J.(1983)Gene 25,179-188)。この酵素は優性選択性マーカーであり、細胞生存 に基づくPCAのために使用できよう。この酵素の構造はまだ分かっていないが、 この酵素はアミノグリコシドキナーゼと相同であることが疑われている(Shaw,et a.,(1993)Microbiol.Rev.57,138-163)。このため、この酵素を用いてPCAを作製 し、ヒグロマイシンＢの濃度を増加させながらの選択を用いて哺乳類細胞中での 優性選択を実行する結合デザイン／進化方法を使用することが可能である。 ８）Ｌ−ヒスチジノールNAD+オキシドレダクターゼ：ネズミチフス菌（Salmonel la typhimurium）のHisのＤ遺伝子は、ヒスチジノールをヒスチジンへ転換する Ｌ−ヒスチジノールNAD+オキシドレダクターゼをコードする。ヒスチジンは欠如 するがヒスチジノールを含有している培地中で増殖した哺乳類細胞は、HisのＤ 遺伝子の発現について選択することができる（Hartman,S.C.,R.C.Mulligan(1988 )Proc．Of the Nat.Acad.Sci.(USA)85,8047-8051)。優性選択においてHisのＤ遺 伝子を使用するもう１つの利点は、ヒスチジノール自体が毒性であり、内因性ヒ スチジル−tRNAシンテターゼの活性を阻害することにある。ヒスチジノールは安 価でもあり、容易に細胞内に浸透する。Ｌ−ヒスチジノールNAD+オキシドレダク ターゼの構造は末知であり、従ってこの酵素に基づくPCAの開発は完全にエキソ ヌクレアーゼ断片／進化方法に基づいている。 下記の表では他のPCAリポーターを使用した代替実施態様が列挙 されている。表中の略語の種類において、Ｄは優性選択マーカーで、Ｒが劣性選 択マーカーである。構造において４文字のコード＝タンパク質データ銀行（PDB ）登録記号で、Ｋが既知であるがPDBには保管されていない、Ｕが不明である。 モノ／オリゴにおいて、Ｍが単量体で、Ｄが二量体で、tetraが四量体である。 表１．他の可能性のあるPCAリポーター候補のリスト Ａ−優性又は劣性選択に基づくアッセイ ii−ウイルスプラークアッセイＢ−細胞死アッセイ Ｃ−比色／蛍光光度アッセイＤ−ヘテロマー酵素方法 実施例４ 複数のタンパク質／タンパク質-DNA/タンパク質−RNA/タンパク質−薬物複合体 を検出するためのPCAの変種の実施例 現在まで、タンパク質対相互作用へのPCAの適用については特殊な例しか作製 されていなかった。しかし、PCAはマルチタンパク質、タンパク質−RNA、タンパ ク質−DNA又はタンパク質−小分子相互作用に適用することができる。そうした システムを達成するためには２つの一般的スキームがある。マルチ−サブユニッ トPCA：PCAシ グナルが観察されるために２つのタンパク質が相互作用する必要はなく、パート ナータンパク質又はタンパク質複合体が２つのタンパク質に同時に結合すれば、 そうした３タンパク質複合体を検出することが可能である。マルチサブユニット PCAは、40kDのホモ二量体である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK） の例を用いて考案されている。この考案では、TK構造はアルファ/ベータ（残基1 〜223）とアルファ−ヘリカルドメイン（224〜374）から構成され、明らかに定 義された２つのドメインを含んでいる。テストシステムとして、我々は４ヘリッ クス束ホモ二量体であるRop1二量体を使用する。TKの２個の断片はPCRによって 抽出されて過渡トランスフェクションベクターpMT3内に、第１の断片は第１ATG への３分節系リーダー3'であるアデノウイルス主要後期プロモーターへ縦列で、 そして第２断片はECMV内部開始部位の下流にサブクローニングされる。第１及び 最終ATGの間に以前に導入された制限部位は、２つのATGの下流のBamHI/KpnI及び PstI/EcoRIクローニング部位内へサブクローニングされる。これらは２種の相違 するベクター内へRop1サブユニットのPCR生成断片をサブクローニングするため に使用される。引き続いて、Ltk−細胞が２個のプラスミドとのリポフェクショ ンによってコトランスフェクトされ、生存している細胞のコロニーが濃度を上昇 させながらHAT（ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン）を含有している培 地中で連続的に選択される。４つのRop1へ融合したTKの相補的断片を発現する細 胞はこの選択的環境下で増殖するか、さもなければ死ぬ。この考案を使用する特 殊な例は、細胞内で一過性又は構成的に形成されるマルチタンパク質複合体の構 成成分を決定することであろう。 PCAの利用はタンパク質−タンパク質相互作用を検出することに限定されてお らず、タンパク質とDNA、RNA又は小分子との相互作用を検出することにも適用で きる。この考案では、２種のタンパク質はPCA相補的断片に融合されるか、これ ら２種のタンパク質は相互には相互作用しない。相互作用は、パートナーの一方 若しくは両方におけるコンフォメーションの変化を惹起することによって２個の タンパク質に同時に結合する若しくは２個のタンパク質間の相互作用を誘導する 何らかの分子であり得る第３の実体によって誘発されなければならない。我々の 研究所では、E.coliにおいてmDHFRのPCAを用いて２つの実施例が証明されている 。第１の場合には、天然産物である免疫抑制薬ラパマイシンが、レセプターFKBP 12とパートナータンパク質mTOR（ラパマイシンの哺乳類ターゲット）の間の相互 作用を誘導するために使用される。我々はこれをトリメトプリム（上記に説明） 及びラパマイシン（0〜10nM）の存在下又は不在下で増殖させたE.coli内へのFKB P若しくはmTORへ融合させたDHFR断片のコトランスフォーメーションによって検 出する。我々は、コロニー形成によって検出される成長の支援が完全にラパマイ シンの添加に依存していることを証明したが、これはmDHFRのPCAがFKBP12−mTOR のラパマイシン誘導性アッセンブリー及び引き続いてのDHFR活性の再構成を検出 することを示唆している。これはタンパク質間の相互作用を誘導できる小分子に ついてテストするためのPCA方法の使用例の１つである。一般的適用は、タンパ ク質間の相互作用を誘導する、いずれか若しくは両方のタンパク質の活性を阻害 できる、又は成長因子媒介性レセプター二量体形成のような他のイベントによっ て媒介される特異的細胞プロセスを活性化させる分子につ いての小分子結合化合物ライブラリーをスクリーニングする形で治療的開発を行 うことであろう。そうした小分子の発見は広範囲のヒトの疾患を治療するために 経口投与可能な薬物の開発をもたらすことができよう。 我々がDHFRのPCAを用いて試験してきた誘導相互作用のもう１つの例は、発癌 遺伝子GTPaseのp21rasとその直接下流標的であるセリン／トレオニンキナーゼra fの相互作用である。この相互作用は、GTPaseがGTP結合形である場合にのみ発生 するが、GTPからGDPへのターンオーバー（転換）は複合体の放出をもたらす。FK BP-mTOR複合体の場合と同様に、我々はこのE.coli.のPCAにおける誘導相互作用 をそうした誘導相互作用をテストするため、そして病理的状態でこれらの相互作 用を放出若しくは防止する化合物をスクリーニングするために一般的な方法で使 用できることを証明している。ras-raf相互作用自体が治療的介入の標的であろ う。rasの発癌遺伝子形はGTPを転換させることのできない突然変異体から構成さ れているので、持続的に活性化されたrasと会合したままでいる。これは一部で は発癌を生じさせる構成性に制御されない増殖シグナルを生じさせる。このプロ セスを阻害する化合物をPCAによって同定することはガンの広範な治療において 重要であろう。PCAの多分子適用のその他の例には新規DNA若しくはRNA結合タン パク質の同定が含まれるであろう。この極めて単純な考案において、我々は既知 のDNA若しくはRNA結合モチーフ、例えば各々レチノン酸レセプター亜鉛フィンガ ー、若しくはIF-1のような単純なRNA結合タンパク質を使用する。PCAの半分は、 PCA断片の１つ（コントロール断片）に融合したDNA若しくはRNAタンパク質結合 ドメインから構 成される。相補的断片はcDNAライブラリーに融合している。第３の実体であるコ ントロールタンパク質及びそれから第２の推定上若しくは既知の調節エレメント に結合することが分かっているエレメントを含有している配列をコードする遺伝 子はこの配列後にコードされる。テストシステムは、HIV遺伝子の転写／翻訳に おいて伸長を制御するtat/tarエレメントから構成される。適用例は、真核細胞 ゲノム内に存在すると提案されており、HIV遺伝子と同一若しくは類似の方法で 遺伝子を調節する可能性のあるtat結合エレメントの同定であろう(SenGupta D.J .Et al.(1996)Proc.Natl.Acad.USA 6,8496-8501)。 実施例５ 薬物スクリーニングへのPCA適用例：タンパク質−タンパク質／タンパク質−RNA ／タンパク質−DNA複合体を阻害若しくは誘導する薬物についての化合物のスク リーニング結合ライブラリー Ａ）薬物スクリーニング タンパク質−タンパク質／タンパク質−RNA／タンパク質−DNA複合体を阻害若 しくは誘導する薬物についての化合物のスクリーニング結合ライブラリー。PCA 方法は、有機分子の結合ライブラリーに含まれる潜在的治療分子を同定するため に直接的に適用できる。タンパク質−タンパク質相互作用若しくはタンパク質− DNA/RNA相互作用を阻害若しくは誘導する化合物についてスクリーンするために そうしたライブラリーのハイスループット・スクリーニングを実行することが可 能である(上記で考案したように)。さらに又、基質が下記で考案するように他の タンパク質、DNA、RNA若しくは炭水化物である酵素を阻害する化合物についてス クリーニングすることも可能であ る。この適用では、タンパク質／タンパク質性基質対と相互作用する、若しくは PCA相補的断片及びこれらの対を含んでいるプラスミドへ融合されているDNA/RNA 結合タンパク質−酵素対を制御するタンパク質は、そのケースの必要に応じて第 ３のDNA若しくはRNAエレメントと一緒に細胞内へトランスフォーム／トランスフ ェクトされる。トランスフォーム／トランスフェクトされた細胞は、各ウェルに 一連の結合的に合成された化合物からの単一化合物が接種されているマルチウェ ルプレート内の液体培地中で増殖させられる。反応の解読は、化合物の作用に依 存する。化合物がタンパク質相互作用を阻害する場合は、陰性反応が存在する(P CAシグナルが発生しない場合は陽性反応である)。化合物の非特異的作用につい てのコントロールには下記が含まれる。つまり、１）その化合物がPCA酵素自体 に影響を及ぼさない(PCAプローブとして使用された野生型無傷酵素を用いてトラ ンスフェクトされた細胞に対する試験)、そして細胞生存アッセイの場合にはそ の化合物がトランスフォーム／トランスフェクトされていない細胞に対して非毒 性であるという証明。化合物の生物学的活性に対するハイスループットアッセイ を提供すると同時に、PCAはさらに活性化合物の細胞膜透過性についての試験で あるというin vitroアッセイより優れた長所を提供する。我々の研究所で薬物ス クリーニングのために特異的に証明されたPCAの例には、治療的に重要な標的を 阻害する化合物を検出することへのE.coliにおけるDHFRのPCAの適用が含まれる 。これらにはBax/BCl2 fkbp12/torras/raf、HIV-1カプシドタンパク質のカルボ キシル末端二量体化ドメイン、IkBキナーゼIKK-1及びIKK-2二量体化ドメイン（ ロイシンジッパー及びヘリックス−ロープ−ヘリックスドメイン）が含まれ る。各ケースにおいて、２個のタンパク質は上記の通りにF[1,2]又はF[3]のいず れかの5'上流でサブクローニングされる。相補的断片を含んでいるプラスミドは BL21細胞内にコトランスフォームされる。IPTG及びトリメトプリムを含有する最 少培地プレートからのコロニーが採取され、同一選択条件下の液体培地で増殖さ せられ、冷凍ストックが作製される。単一スクリーニングサイクルのためには、 LB培地中で冷凍ストックから急速一夜培養（priming overnight culture）が増 殖させられる。トリメトプリム、アンピシリン、IPTGを含有している選択的最少 培地が384ウェルプレートの各ウェル内へ25mlずつのアリコートとして充填され る。各ウェルはその後最終濃度10μＭを生じさせるために化合物アレイ（ArQule Inc.）からの個別サンプル1μＬが接種される。各ウェルにはその後2mLの一夜 培養が接種され、プレートは３７℃で特別に適合した振とう浴中でインキュベー トされる。２時間間隔で、プレートは８時間に渡ってPC及び600nmでのスプレッ ドシートソフトウエア（散乱）へ結合された光吸収分光分析プレートリーダー上 を読み取られる。増殖率は各ウェルに対する個々の時間示度から計算され、標準 曲線と比較される。「ヒット」は、個々の化合物が増殖率を試験プレート内の全ウ ェルで観察された増殖率についての標準偏差に基づく95％信頼区間より下に減少 した場合であると定義されている。「ニアヒット」は、増殖率が95％信頼区間の 範囲内にある場合であると定義されている。ヒット若しくはニアヒットの各々に ついて、下記のコントロールがその後実施される。つまり、空ベクター(及びト リメトプリムなし)、全長mDHFR遺伝子を含んでいるベクター、又はタンパク質発 現がIPTGによって誘導されない場合はコトランスフェクトされた細胞を用いてト ランスフォーム されているBL21細胞を用いて同一実験が実施される。これら全ての場合において 化合物が作用を全く有していない場合は、それは試験されているタンパク質−タ ンパク質相互作用を特別に破壊していると結論付けることができる。このように 妥当性が確認されたヒット若しくはニアヒットはその後個々の化合物について1p Mから1mMまでの10桁相違する濃度を用いて用量反応曲線を確定するために再試験 される。化合物スクリーニングのためのPCA方法は上記の通りに多タンパク質の タンパク質−RNA/DNAの場合に適用することができ、さらにE.coliにおけるDHFR 若しくはその他のPCA又は同一PCAの酵母バージョンに容易に適合させることがで きる。そうしたスクリーニングは標的が既知の酵素／基質対に対する他のタンパ ク質若しくは核酸である酵素へ、又は下記で説明するように同定された新規酵素 基質対へも又適用できる。 ウイルス統合プロセスに含まれるタンパク質は、PCA方法を用いてインヒビタ ーに対して試験できる標的の例である。HIVウイルスに対する例には下記が含ま れる。 i）インテグラーゼ又は統合前複合体：タンパク質Ma若しくはvprの輸送の阻害と 、 ii）断片化の誘導を引き起こすvprによるG2における細胞周期の阻害（サイクリ ンＢによる相互作用）と、 iii）フリンを用いてのgp160（膜タンパク質の前駆体）の相互作用の阻害。 治療標的としてのHIVのアクセサリータンパク質には下記が含まれる。 i）Vpr：核局在配列（ターゲット）：vprとホスファターゼＡとの相 互作用部位と、 ii）vif：ビメンチン（細胞骨格会合タンパク質）との相互作用と、 ii）Vpu：Vpuの細胞質テールによりメディエートされたREにおけるCd4の変性と 、 iii）nef：Nefのミリストイル化シグナル。 その他の薬物スクリーニングに対する一般的標的には、アルファーシヌクレイ ンに対するようなタンパク質連関性神経変性疾患が含まれるであろう。このタン パク質はパーキンソン病の早期開始と連関しており、アルツハイマー病に関係し ている。さらに、アルツハイマー病に連関しているｂ−アミロイドタンパク質も 存在する。 薬物スクリーニングの標的であろうタンパク質−炭水化物相互作用の例には、 一般に炎症に関係しているセレクチン類が含まれる。これらの細胞表面グリコプ ロテイン類は血管外遊出に直接的に含まれている。 作用がタンパク質−タンパク質相互作用によって媒介される数多くの主要サプ レッサー遺伝子は潜在的抗癌化合物のためにスクリーニングできるであろう。こ れらには、harmatomasの形成に直接関係している主要サプレッサーであるPTENが 含まれる。さらにこれは遺伝性乳癌及び甲状腺癌にも関係している。その他の興 味深い腫瘍サプレッサー遺伝子にはp53、Rb及びBARC1が含まれる。 実施例６ 酵素／基質相互作用を検出するためのPCA方法の適用例 上記の実施例は、単に相互に結合する分子を含む新規分子相互作用を同定する ために使用される。しかし、下記に示すように酵素の基質を検出することも又、 PCA方法と完全に適合する。 i）タンパク質性基質と一緒にタイトな複合体を形成する、又は効果的なPCA断片 アッセンブリーを誘導する酵素、又は ii）突然変異残基が求核攻撃及び／又は産物放出に関係しているために、基質に タイトに結合するが産物放出は行わないミュータント酵素(基質のトラッピング) 。 酵素はそれらの基質とのタイトな複合体を形成することがある(Kd〜１−10mM) 。これらの場合、PCAはそうした相互作用を検出するために十分に効果的であろ う。しかし、これが当てはまらない場合でさえ、PCAはもっと弱い相互作用を検 出するために働く可能性がある。一般に、触媒作用及び産物放出の速度がPCA相 補的断片のフォールディング再構成の速度より緩徐な場合は、PCAリポーター活 性の効果的に不可逆性のフォールディング及び再構成が発生していたであろう。 このため、たとえ酵素及び基質がもはや相互作用しない場合でさえ、PCAシグナ ルは検出される。従って、PCAを用いた新規酵素基質の検出は、有効な基質のKd 又は産物放出の速度とは無関係に可能な場合がある。産物の放出がPCA断片アッ センブリー／フォールディングよりはるかに速い場合は、試験酵素の「基質トラ ッピング」突然変異体を発生させることによって好ましいアプローチが提供され る。このアプローチの１例はタンパク質チロシンホスファターゼPTP1Bへ適用さ れたが、この場合は酵素を触媒的には死んでいるが既知の基質、EGFレセプター 及び他の未知のタンパク質とのタイトな複合体を形成できるようにさせて求核ア スパラギン酸¹⁸¹をアラニンへ突然変異させることによって基質トラッピングミ ュータントが発生されられている(Flint,A.J.Et al.(1996)Proc.Natl.Acad．USA 941680-1685)。PTP1Bの相互作用パートナーについてスクリーニン グするためにPCAを使用する適用を下記に示す。我々は過剰的にトランスフェク トされたCOS又は293細胞においてアミノグリコシドキナーゼ（AK）に基づくPCA を使用する。PTP1Bの基質トラップ突然変異体触媒性ドメインはAKのＮ末端相補 的断片に融合させられ、他のAK断片のＣ末端はcDNAライブラリーへ融合させられ る。細胞は相補的AK対を用いてコトランスフェクトされ、選択的濃度のG418中で 増殖させられる。72時間後、生存している細胞のコロニーが採取され、cDNAコー ディング領域の3'及び5'フランキング領域へアニールするようにデザインされた プライマーを用いてin situのPCRが実施される。その後、PCR増幅産物は遺伝子 を同定するために5'シークエンシングされる。 下記のいずれかを用いて酵素−PROTEIN基質複合体を阻害するものについての 化合物の酵素インヒビター・スクリーニング結合ライブラリー、 i）タンパク質性基質とタイトな複合体を形成する酵素、又は、 ii）基質にタイトに結合するが、突然変異のために産物放出を行わない突然変異 体酵素。 実施例７ タンパク質の工学的作製／進化に対するPCA方法の適用 現在はファージディスプレイテクノロジーを用いて行われているのと同様に、 PCA方法は治療的価値を持っている可能性のある新規結合特性を備えたペプチド 又はタンパク質を生成するために使用できる。さらに又、工業用酵素開発のため に新規基質若しくは物理的特性を備えた酵素を開発することも可能である。これ らの最終目的にPCA方法を適用した２つの詳細な実施例を下記に記載し、さらに 追加の適用 を挙げる。 １）高親和性のヘテロ二量体形成ロイシンジッパー配列の選択（J.Pelletier,K. Amdt,A.Pluechthun and S.Michnick,manuscript in preparation） 上記のmDHFR PCAが、効果的にヘテロ二量体形成しているようにデザインされ たロイシンジッパーを選択するためのスキームで使用 の塩橋の形成はロイシンジッパー形成を安定化させるために重要であると提案さ れているが、この見解には異議が唱えられている。ｅ及びｇ位置での塩橋形成の 重要性を定義するのに役立つように、２つのロイシンジッパーライブラリーが作 られた。どちらもGCN4ロイシンジッパー配列に基づいているが、ヘテロ二量体形 成対を創製するためにJun若しくはFosジッパーのいずれかに特異的な配列情報を 含んでいる。同様に、各ライブラリーにおけるe-1からe-4及びg-1からg-4の位置 は正若しくは負に荷電している残基、又は中性極残基をコードするように無作為 化された。これらのライブラリーはPCRによって増幅され、GCN4ジッパー配列が 取り除かれているZ-F[1,2]若しくはZ-F[3]構造体(上記)内へサブクローニングさ れた。細菌mDHFRのPCA選択は先に述べたように選択的固形培地上で実施された。 コロニーが採取され、シークエンシングされた。配列順序解析は、e-g対での荷 電若しくは中性残基の分布は無作為ではなく、同一荷電対合よりむしろ反対荷電 の対合に向かって、又は荷電残基と中性残基の対合に向かって偏っていることを 明らかにしている(図７参照)。我々はより優れたジッパー対合はDHFR−断片相補 性の効率における上昇をもたらし、その結果としてより速い細菌倍加時間が生じ るのであ ると理由付けし(mDHFR PCAの説明における表１参照)、下記の通りにGCN4に比較 して新規ジッパーの選択／増強を行った。DHFRF[1,2]若しくはF[3:l114A]へのＮ 末端融合として発現したデザインされたジッパーライブラリーはコトランスフォ ームされ、クローンが採取され、増殖させられ、選択的液体培地中で混合され、 その混合物はZ-F[1,2]+Z-F[3:l114A]（オリジナルのGCN4ロイシンジッパー）を クローニングするために１：1,000,000の比で添加された。この混合物が複数継 代に渡って選択的液体培地中で増殖された。制限解析は、４継代内で、GCN4−発 現細菌の集団が新規ジッパー配列に比較して減少していることを示しており(デ ータは示されていない)、これはデザインされたジッパーを含有するクローンの 一部がGCN4を含有するクローンより高速で増殖することを示唆している。後期継 代からの細菌が選択的培地上でプレーティングされ、最も良好な結果が得られる デザインされたジッパ一対の同一性を解明するために個々のクローンがシークエ ンシングされた(データは示されていない)。 ２）酵素の機能及びデザインへのPCAの適用 PCAの開発、つまり、アデノシンデアミナーゼ（ADA）は上記に列挙したPCAに とっての基準全てを満たしている。ADAは小さく(〜40kD)、容易に精製される単 量体亜鉛金属酵素であり、マウスADAの構造は解明されている。UV分光光度法及 びストップトフロー蛍光光度法を含む数種のin vitroでのADA活性アッセイが開 発されている。E.coli ADAは、細胞毒性アデニンヌクレオシドから非毒性イノシ ンへの不可逆的転換を触媒する。 細胞毒性濃度のアデノシン又はアデノシン類似体の存在下で増殖した真核又は 原核細胞は、これらの化合物を除毒するためにADAを必 要とする。これが哺乳類細胞において特異的遺伝子を発現する細胞を選択するた めに使用される優性選択方法の基礎である。ADA遺伝子は、さらに内因性ADAをコ ードする遺伝子の欠如したSF3834 E.coli細胞において発現させられている。ADA をコードする遺伝子がADA−細菌DNA内に導入されると、ADAを発現する細胞は高 濃度のアデノシンが添加されても生存でき、発現しない細胞は死ぬ。これがin v ivoでのADA活性アッセイの基礎を成している。 我々がADAを選択したのは、特に遺伝子が破壊されてしまっている哺乳類及び 再菌細胞における優性選択的マーカーとして使用できるためである。我々が優性 選択的遺伝子を選択した理由は、新規タンパク質−タンパク質相互作用について スクリーニングするときに、特に数百万個の独立遺伝子のライブラリーに対して 既知のタンパク質の相互作用を試験するときに、選択が特異的タンパク質−タン パク質相互作用と何の関係もない理由から陽性反応を示す可能性のある細胞を濾 過するために役立つからである。我々は、ロイシンジッパー形成配列、タンパク 質rafとp21及び誘導オリゴマー化システム含む相互作用するタンパク質、FK506 結合タンパク質（FKBP）及び大環状免疫抑制性化合物であるラパマイシンを通し て相互作用するmTORの３つのテストシステムを使用するであろう。これらの試験 系全部に対して、我々はE.coli及び哺乳類過渡トランスフェクションプラスミド を構築し、テスト用タンパク質をADA相補的断片への融合としてサブクローニン グするであろう。主要アッセイは、毒性濃度のアデノシンの存在下において試験 オリゴマー化タンパク質へ融合した相補的ADA断片を用いて形質転換されているS F3834のE.coli細胞の生存であろう。我々はその後下記で説明するようにコロニ ーから融合タン パク質を精製してADA活性のin vitroアッセイを実施するであろう。試験物質と 相互作用する新規タンパク質を同定するための方法としてのADAのPCAの有益性は 、ADA断片の１つに融合したFKBP及び10⁶個の独立遺伝子を含有する正常ヒト脾臓 からのcDNAライブラリーに融合したもう１つの断片を用いて過渡的にトランスフ ェクトされた哺乳類COS-7及びHEK-293T細胞において発揮されるであろう。E.col iアッセイを用いた場合と同様に、毒性濃度のADAを含有する培地中で生存してい る細胞が採取され、単離されたプラスミドがPCR増幅及び連鎖増殖−停止法によ って相互作用するタンパク質について遺伝子を同定するために試験されるであろ う。 タンパク質機能のために必要とされる構造的モチーフ ADAの酵素機能のために必要とされる構造的エレメントの決定は、酵素断片の 構造の変化を通して調査される。まず最初に、ADAは２つの別個のドメインに切 断される。つまり、１つは基質結合（残基１〜210）を担い、もう１つは触媒作 用を担う(残基211〜352)。これらの別個のピースはロイシンジッパー（上記の実 施例１参照）のような既知のアッセンブリードメインに付着させられる。再構成 は、酵素反応を観察するためにUV分光光度法及びストップトフロー蛍光光度法を 使用して、再構成された酵素の結合及び触媒作用の詳細なin vitro導体解析を通 して評価される活性を回復するであろう。この試験系は酵素機構研究のための強 力なツールを提供する酵素活性の操作にもう１つの手がかりを提供する。例えば 、基質の存在下で再構成された酵素と比較して（結合ドメインによって既に基質 が結合されている場合）基質との混合で再構成された酵素の動態学的行動におけ る相違は触媒作用に及ぼす結合エネルギーの重要性に関するハイレベルの 洗練された試験を可能にする。タンパク質の機能的若しくはアッセンブリードメ インへの引き続いての点突然変異はその後、極めて僅かな摂動及び結合エネルギ ーと触媒作用の関連の詳細な定量化を許容するであろう。酵素の別個の機能的ド メインの構造及びアッセンブリーに渡るこの精密な制御は、極めて洗練された酵 素構造機能試験、構造的モチーフの定義及び触媒作用においてそれらが果たす役 割の理解を許容するであろう。 新規タンパク質触媒デザイン：触媒作用についての構造的必要条件の測定を通 して得られた酵素機構に関する詳細な知識は、その後これ る基質結合及び触媒作用に対して責任を負っている機能的モチーフとの結合を通 して開発され、新規タンパク質触媒の生成が可能になる。 例えば、ADAからの触媒モチーフはサイチジン結合モチーフへ修飾され、潜在的 に有用な触媒特性を備えた新規酵素が精製される。これらの新規酵素の活性はPC Aシステムに類似のin vivoアッセイ法を通して、又はin vitro活性アッセイを通 して容易に評価できる。さらに、このシステムを用いて可能な結果として生じる 酵素の詳細な機構的調査は各々の引き続いての合理的デザインの触媒を生成する ことを許容するであろう。 実施例８ 全ての生物中の分子相互作用を検出するためのPCA方法の適用例 それは、上記のPCA適用の説明を例えばショウジョウバエ(drosophila)、ネマ トデス(nematodes)、ゼブラフィッシュ(zebrafish)及びパファーフィッシュ（pu ffer fish）のような全てのモデル生物におけるこれらの技術の有益性へ論理的 に拡大したものである。 列挙した他の実施例との唯一の相違は、使用されるベクターが相違していなけれ ばならないこと(例えばレトロウイルスベクター)、及びPCAによって必要とされ るあらゆる基質が生体内利用性である必要がある、又は検出がin situで実施さ れる必要がある点である。 実施例９ 遺伝子療法へのPCA方法の適用例 本発明のもう１つの重要な実施態様は、哺乳類疾患に対する遺伝子療法のため の手段及び方法を提供することである。特に興味深いのは、癌治療に対するPCA の治療的使用である。前記PCA遺伝子療法の１つの実施態様では、PCAは例えばシ ュードモナス内毒素、ジフテリア毒素及び植物毒素ゲロニンのようなタンパク質 毒素又はその他の同様の分子に由来する断片（基本タンパク質単位）を使用して 開発される。例えば乳癌治療のためには、まず最初にerbB2発癌遺伝子発現に対 するプロモーターの制御下で選択された毒素の１断片を導入する哺乳類、レトロ ウイルス、アデノウイルス若しくは真核細胞人工染色体（EAC）の遺伝構造体が 調製される。erbB2発癌遺伝子が乳癌及び腺癌細胞中で過剰発現することはよく 知られている（D.J.Slamon et.Al.,Science,1989,244,707)。HER2/neu（c-erB2 ）癌原遺伝子は、サブクラス１の185kDaトランスメンブランタンパク質チロシン キナーゼ成長因子レセプターp185^HER2をコードする。さらに、ヒトerbB2癌遺伝 子は17番染色体、q21領域に位置して4,480塩基対を含んでおり、p185^HER2はヒト 乳癌細胞系によって分泌された30kDaグリコプロテイン成長因子に対するレセプ ターとして役立つ(R.Lupu et al.,Science,1990,249,1152)。 トランス遺伝子は、例えばレトロウイルス、アデノウイルス若しく はEACによって重要な座位内にトランス遺伝子を挿入するための相同組換えのよ うな当業者に既知の方法を使用してターゲット細胞内に「in vivo」若しくは「e x vivo」で導入される。本発明において記載されているPCAプロセスによって発 見されたerbB2発癌遺伝子と相互作用する相互作用タンパク質及び毒素分子の「 第２」断片をコードするターゲットDNAを含んでいる融合遺伝子から構成される 第２遺伝構造体。この構造体は参照してその全体の内容がここに組み込まれる米 国特許第5,399,346号及び第5,585,237号に示されているように、技術において知 られている方法によって患者に送達される。記載されたerbB2発癌遺伝子−毒素 断片のトランス遺伝子発現は、現在では構成性発癌遺伝子プロモーターの制御下 にあるであろう。従って腫瘍細胞を増殖させるとerbB2発癌遺伝子への融合とし て付着した１ピースの毒素を産生するであろう。PCAによって発見された相互作 用するerbB2発癌遺伝子を発現する第２遺伝構造体の存在下では、「相互作用す るタンパク質−毒素断片」構造体それから、erbB2発癌遺伝子−毒素断片A、相互 作用するタンパク質−毒素断片Ｂが創製され、タンパク質断片相補性を通して活 性毒素の創製を通して標的腫瘍細胞の死を誘発し、さらに従って前記疾患の有効 かつ効率的治療法を提供するであろう。 これは本発明で記載かつ具体化された技術を使用して他の疾患及び他の毒素に 拡大することができる。 実施例10 In vitro における分子相互作用を検出するためのPCA方法の適用例 上記で説明したPCA方法はいずれもin vitro検出に適合させることができよう 。しかし、in vivo PCAとは相違して、検出は精製され たPCA断片−融合タンパク質を用いて実施されるであろう。PCAのそうした使用は 診断用キットにおいて使用できる可能性がある。例えば相互作用するドメインが FKBP12とTORである上記に説明した試験DHFRアッセイは、ラパマイシンを用いて 治療される患者において用量を監視するときに使用するための薬剤濃度の診断試 験として使用できよう。 上記で示されたように、本発明は下記を提供する。 １）in vivo又はin vitroでのタンパク質−タンパク質相互作用の検出を許容す ることと、 ２）特異的生物、細胞種類、細胞コンパートメント又はオルガネラ内のような適 切な状況でのタンパク質−タンパク質相互作用の検出を許容することと、 ３）誘導性対構成性タンパク質−タンパク質相互作用（例えば細胞増殖又は阻害 因子によってのような）の検出を許容することと、 ４）アッセイの感受性を制御することによって特異的体非特異的タンパク質−タ ンパク質相互作用を区別することができることと、 ５)細胞内のタンパク質アッセンブリーの動態検出を許容することと、 ６）タンパク質−タンパク質相互作用に対するcDNAライブラリーのスクリーニン グを許容することである。 本発明のさらに別の態様は、酵素p70S6kの調節及び別個のシグナル発生カスケ ードがこの酵素にどのように集中するのかを測定するために、この酵素との新規 相互作用を同定することによって証明できる。 PCA法は、細胞内のタンパク質アッセンブリーの動態を検出するために特に有 用である。タンパク質アッセンブリーの動態は蛍光タンパク質システムを用いて 測定できる。 本発明のさらに別の実施態様では、PCAは薬物スクリーニングのために使用で きる。PCAの技術は、有用な薬理学的特性を有している製品を同定するための注 意深く目標を定めて制御された方法を許容することによって、細胞内の特異的生 化学的経路を遮断する薬物をスクリーニングするために使用される。 本発明は上記に好ましい実施態様を用いて記載されてはいるが、添付の請求の 範囲に定義されている通りに本発明の技術的思想及び性質から逸脱することなく 修飾することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｐ 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ペルティエ，ジョエル・ニーナ カナダ国、エイチ３ワイ ３ケイ４ ケベ ック、ウェストマウント、ローズマウン ト・アヴェニュー 10、アパートメント ＃611 (72)発明者 レミー，イングリッド カナダ国、エイチ２ピー ２ジー４ ケベ ック、モントリオール、ベリ 8526 【要約の続き】 パク質と未知のタンパク質の結合についてcDNAライブラ リーをスクリーニングするため、又は生物学的活性につ いて小有機分子のライブラリーをスクリーニングするた めに、タンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タ ンパク質−RNA、タンパク質−炭水化物及びタンパク質 −小分子の相互作用を含む分子相互作用の平衡及び動態 の態様を試験するために使用することができる。ここで 適用した選択及びデザイン基準はクローン選択、比色、 蛍光光度法及びその他のそれらの産物を測定できる酵素 に基づくアッセイの莫大な数の例に対して開発されてい る。そうしたアッセイシステムの開発は単純であること が示されており、種々のタンパク質断片相補性の適用例 を提供する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ある分子の別個の断片を再構成することを含む分子相互作用を検出する ための分子断片相補性アッセイであって、前記断片の再構成は他の分子プロセス から独立して、前記分子の各断片に融合された分子ドメインの相互作用によって 行われることを特徴とする分子断片相補性アッセイ。 ２． （ａ） 適切なリポーター分子を選択するステップと、 （ｂ） 断片化がリポーター機能の可逆的な消失になるように前記リポーター 分子の断片化を実行するステップと、 （ｃ） 前記リポーター分子の断片を他の分子と個別に融合若しくは付着させ るステップと、次いで、 （ｄ） 前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片 を再会合させるステップと を含んでなる生体分子相互作用を検出するための方法。 ３． 前記リポーター分子が多量体タンパク質であることを特徴とする請求項 ２に記載の方法。 ４． 前記リポーター分子が多量体酵素であることを特徴とする請求項２に記 載の方法。 ５． 前記リポーター分子が多量体レセプターであることを特徴とする請求項 ２に記載の方法。 ６． 前記リポーター分子が多量体結合タンパク質であることを特徴とする請 求項２に記載の方法。 ７． 前記リポーター分子が触媒分子であることを特徴とする請求項２に記載 の方法。 ８． 前記リポーター分子がエネルギー転移分子であることを特徴 とするである請求項２に記載の方法。 ９． 前記リポーター分子が蛍光タンパク質若しくはルミネセントタンパク質 若しくはリン光タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の方法。 １０． 前記検出される分子が核酸若しくはリボザイムであることを特徴とす る請求項２に記載の方法。 １１． 前記検出される分子が脂質若しくはオリゴ糖であることを特徴とする 請求項２に記載の方法。 １２． 前記検出される分子がリガンドであることを特徴とする請求項２に記 載の方法。 １３． 前記検出される分子が核酸であることを特徴とする請求項２に記載の 方法。 １４． 前記検出される分子がペプチドであることを特徴とする請求項２に記 載の方法。 １５． 前記検出される分子が炭水化物であることを特徴とする請求項２に記 載の方法。 １６． 前記断片化が遺伝的操作、合成化学若しくは新規合成、光化学的若し くは酵素的開裂、及びタンパク分解若しくは加水分解化学からなる群から選択さ れた方法によって行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。 １７． リポーター分子断片の前記再会合が前記断片に融合若しくは付着した 分子によって実行されることを特徴とする請求項２に記載の方法。 １８． ａ） ｉ） 第１分子の第１断片と、 ｉｉ） 前記第１分子に相違するか若しくは同一である第２分子、 を含む第１融合産物を生成するステップと、 ｂ） ｉ） 前記第１分子の第２断片と、 ｉｉ） 前記第１分子若しくは第２分子に相違するか若しくは同一である第 ３分子と、 を含む第２融合産物を生成するステップと、 ｃ） 第１及び第２融合産物を相互に接触させるようにするステップと、 ｄ） 第１分子の再結合した断片の会合によって再獲得された活性について試 験するステップであって、前記再会合が第２及び第３分子の相互作用によって仲 介されるステップと を含んでなる生体分子相互作用を試験するための方法。 １９． 前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つがタンパク質である ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２０． 前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つが酵素であることを 特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２１． 前記第２若しくは前記第３分子の少なくとも１つが核酸であることを 特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２２． 第１分子の断片が第２分子に融合しており、断片の会合が第１分子の 活性の再形成によって検出されるアッセイを含む方法。 ２３． （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる第１分 子の第１断片と、 ２） （ａ）の１）の断片に結合できる第２分子と を含む第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と ２） （ｂ）の（１）の断片に結合できる第３分子と を含む第２融合生成物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方と からなるグループから選択された生成物を含む組成物。 ２４． 別個の分子に各々が融合している第１分子の相補的断片を含む組成物 。 ２５． 第１分子が、多量体タンパク質、多量体レセプター、多量体結合タン パク質、触媒性分子、エネルギー転移分子、蛍光若しくはルミネセント若しくは リン光タンパク質を含む群から選択されていることを特徴とする請求項２４に記 載の組成物。 ２６． 第１分子が多量体酵素であることを特徴とする請求項２４に記載の組 成物。 ２７． 第２及び第３分子が相互に結合できることを特徴とする請求項２４に 記載の組成物。 ２８． （ａ） １） 連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の 断片と、 ２） 第１分子の断片に融合している第２分子と を含む第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と、 ２） 第２若しくは第３分子と を含む第２融合産物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方と からなるグループから選択された生成物をコードする配列を含む、融合生成物を コードする核酸分子を含んでなる組成物。 ２９． 請求項２４若しくは請求項２８のいずれかに記載の組成物を含む宿主 細胞。 ３０． 請求項２４若しくは請求項２８のいずれかに記載の組成物の使用又は 請求項２９に記載の宿主細胞の使用を含むアッセイ。 ３１． （ａ）連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分 子の相補的断片、又は（ｂ）第２若しくは第３分子からの２つのタンパク質−タ ンパク質相互作用ドメインの結合と連合した生体分子相互作用についての試験方 法であって、前記方法が １） （ａ） 連合しているときに断片が検出可能な活性を提示できる第１分子の 第１断片と、 （ｂ） 第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと の融合を生成するステップ、 ２） （ａ） 前記第１分子の第２断片と、 （ｂ） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第 ２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと の融合を生成するステップと、 ３） １）及び２）の融合を相互に接触させるようにするステップと、 ４） 前記活性について試験するステップと を含んでなる方法。 ３２． 前記第１分子の断片の活性が断片の一部を変化させることによって制 御され、それらの連合する能力を増加若しくは低下させることを特徴とする請求 項１、２、１８、２２又は３１のいずれか１つに記載の方法。 ３３． （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる（第１ ）分子の第１断片と、 ２） 第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第１融合生成物と、 （ｂ） １） 前記第１分子の第２断片と、 ２） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結合できる第 ２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第２融合生成物と、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方と を含む群から選択された生成物を含む組成物。 ３４． （ａ） １） 連合しているときにその断片が検出可能な活性を提示できる分子の 第１断片と、 ２） 第１タンパク質-タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第１融合生成合産物、或いは、 （ｂ） １） 前記分子の第２断片と、 ２） 前記第１タンパク質−タンパク質相互作用ドメインに結 合できる第２タンパク質−タンパク質相互作用ドメインと を含んでなる第２融合生成物、或いは、 （ｃ） （ａ）及び（ｂ）の両方と の何れかをコードする配列を含む、融合生成物をコードする核酸分子を含んで なる組成物。 ３５． 請求項３３又は請求項３４のいずれかに記載の組成物を含む宿主細胞 。 ３６． 請求項３３又は請求項３４に記載のいずれかの組成物の使用又は請求 項３５に記載の宿主細胞の使用を含むアッセイ。 ３７． ＰＣＡを実行することを含むタンパク質アッセンブリーの動態を検出 する方法。 ３８． 請求項１、２、１８、２２又は３１のいずれか１つに記載の方法を含 む、タンパク質アッセンブリーの動態を検出する方法。 ３９． ＰＣＡを実行することを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング する方法。 ４０． 請求項１、２、１８、２２又は３１のいずれか１つに記載の方法を含 む、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするする方法。 ４１． 色素産生、蛍光産生、酵素的、又はその他の光学的に検出可能なシグ ナルを発生させることを特徴とする請求項１、２、１８、２２、３１、３９又は ４０のいずれか１つに記載の方法。 ４２． シグナル発生システムの一部としてジヒドロ葉酸還元酵素が使用され ることを特徴とする請求項１、２、１８、２２、３１、３９又は４０のいずれか １つに記載の方法。 ４３． 請求項１、２、１８、２２、３１、３９又は４０のいずれか１つに記 載のアッセイを実行することを含む２つ以上の相互作用ド メインの少なくとも１つの最小距離を決定する方法。 ４４． 請求項１、２、１８、２２、３１、３９又は４０のいずれか１つに記 載の任意のアッセイを実行することを含む、分子複合体が２以上の相互作用ドメ インを含んでいるかどうかを決定する方法。 ４５． 前記第２及び第３分子の相互作用を誘発する他の少なくとも１つの分 子が存在することを特徴とする請求項１、２、１８、２２、３１、３９又は４０ のいずれか１つに記載の方法。 ４６． 相互作用を仲介する少なくとも１つの他の分子の存在のために第１又 は第２分子の部分間での相互作用が存在することを特徴とする請求項３９又は４ ０のどちらかに記載の方法。 ４７． 化合物に対して、前記化合物の存在下でＰＣＡを実行すること及び任 意の阻害と前記（化合物の）存在を相関させることを含むＰＣＡにおける分子相 互作用を阻害する可能性をテストする方法。 ４８．（ａ） 酵素をコードする遺伝子を少なくとも２個の断片に分けること によって優勢選択を可能にする酵素からプローブタンパク質断片を合成するステ ップと、 （ｂ） 相互作用について試験される１以上の分子との融合タンパク質を構成 するステップと、 （ｃ） （ｂ）で入手したタンパク質を１以上のプローブ断片と融合させるス テップと、 （ｄ） 融合タンパク質を共発現させるステップと、 （ｅ） 酵素活性の再構成を検出するステップと を含んでなる、生きている微生物及び／又は細胞におけるタンパク質−タンパ ク質相互作用を検出する方法。 ４９． 酵素がマウスジヒドロ葉酸還元酵素であることを特徴とす る請求項４８に記載の方法。 ５０． 融合タンパク質が前記マウスジヒドロ葉酸還元酵素のＮとＣ末端断片 を含むペプチドを有しており、ＧＣＮ４ロイシンジッパー配列に融合されている ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。 ５１． 相補的融合タンパク質の共発現が試験タンパク質の相互への結合によ って触媒されることを特徴とする請求項４８に記載の方法。 ５２． 新規薬物標的を同定するために請求項４８に記載の方法を利用するこ とを特徴とする、タンパク質−タンパク質相互作用を誘発若しくは阻害する化合 物に対して組み合わせたライブラリーをスクリーニング又は高スループットスク リーニングする方法。 ５３． 標的が生物学的に活性なタンパク質である請求項５２に記載の方法。 ５４． 前記生物学的に活性なタンパク質がレセプター、阻害剤、酵素又はイ オンチャネルを含む群から選択されることを特徴とする請求項５３に記載の方法 。 ５５． （ａ） 適切なリポーター分子を選択するステップと、 （ｂ） 前記リポーター分子の断片化を実行するステップと、 （ｃ） 前記リポーター分子の断片を他の分子へ個別に融合若しくは付着させ るステップと、次いで、 （ｄ） 前記断片に融合している分子の相互作用を通して前記リポーター断片 を再会合させるステップと を含んでなる生体分子相互作用を検出するための方法。 ５６． 前記第１分子が、多量体タンパク質、多量体レセプター、多量体結合 タンパク質、触媒性分子、エネルギー転移分子、蛍光若しくはルミネセント若し くはリン光タンパク質を含む群から選択されて いることを特徴とする請求項５５に記載の組成物。 ５７． 前記第１分子が多量体酵素であることを特徴とする請求項５５に記載 の組成物。 ５８． 遺伝子療法を実施する方法において、請求項２の方法を実施すること を含むステップ。