ES2247673T3 - Ensayos de complementacion de fragmentos proteicos para detectar interacciones biomoleculares. - Google Patents
Ensayos de complementacion de fragmentos proteicos para detectar interacciones biomoleculares.Info
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Abstract
DESBRIBIMOS UNA ESTRATEGIA PARA EL DISEÑO E IMPLEMENTACION DE ENSAYOS POR COMPLEMENTACION DE FRAGMENTOS PROTEICOS (PCAS) PARA DETECTAR INTERACCIONES BIOMOLECULARES IN VIVO E IN VITRO. EL DISEÑO, IMPLEMENTACION Y ENORMES APLICACIONES DE ESTA ESTRATEGIA SE ILUSTRAN CON UN GRAN NUMERO DE ENZIMAS, PRESTANDO ESPECIAL ATENCION AL EJEMPLO DE DIHIDROFOLATO REDUCTASA DE MURINO (DHFR). SE EXPRESARON PEPTIDOS DE FUSION QUE CONSISTEN EN FRAGMENTOS N Y C - TERMINALES DE DHFR DE MURINO FUSIONADOS A SECUENCIAS DE CREMALLERA DE LEUCINA GCN4 EN ESCHERICHIA COLI CULTIVADA EN UN MEDIO MINIMO, EN QUE LA ACTIVIDAD DHFR ENDOGENA SE INHIBIO CON TRIMETROPRIMA. LA COEXPRESION DE LOS PRODUCTOS DE FUSION COMPLEMENTARIOS RESTUARO LA FORMACION DE COLONIAS. LA SUPERVIVENCIA SOLO OCURRIO CUANDO LOS DOS FRAGMENTOS DHFR SE ENCONTRABAN PRESENTES Y CONTENIAN SECUENCIAS FORMADORAS DE CREMALLERAS DE LEUCINA, DEMOSTRANDO QUE LA RECONSTITUCION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA REQUIERE LA AYUDA DE LA FORMACION DE CREMALLERAS DE LEUCINA. LAS MUTACIONES PUNTUALES FRAGMENTO DHFR - INTERFAZ DE SEVERIDAD CRECIENTE (ILE A VAL, ALA Y GLY) DIERON COMO RESULTADO UN AUMENTO SECUENCIAL DE LOS TIEMPOS DE DUPLICACION DE E. COLI LO QUE ILUSTRA LA REAGRUPACION ACERTADA DE FRAGMENTOS DHFR EN LUGAR DE INTERACCIONES NO ESPECIFICAS ENTRE FRAGMENTOS. ESTE ENSAYO SE PUDO UTILIZAR PARA ESTUDIAR EL EQUILIBRIO Y LOS ASPECTOS CINETICOS DE INTERACCIONES MOLECULARES INCLUIDAS LAS INTERACCIONES PROTEINA - PROTEINA, PROTEINA - ADN, PROTEINA - ARN, PROTEINA - HIDRATO DE CARBONO Y PROTEINA - MOLECULA PEQUEÑA, PARA SELECCIONAR LIBRERIAS DE CADN PARA LA UNION DE UNA PROTEINA DIANA CON PROTEINAS CONOCIDAS O LIBRERIAS DE PEQUEÑAS MOLECULAS ORGANICAS PARA OBTENER UNA ACTIVIDAD BIOLOGICA. LA SELECCION Y DISEÑO DE LOS CRITERIOS APLICADOS EN LA PRESENTE INVENCION SE DESARROLLARON PARA NUMEROSOS EJEMPLOS DE ENSAYOS DE SELECCION CLONAL, COLOROMETRICOS, FLUOROMETRICOS Y OTROS ENSAYOS BASADOS EN ENZIMAS CUYOS PRODUCTOS SE PUEDEN MEDIR. EL DESARROLLO DE TALES SISTEMAS DE ENSAYO DEMOSTRO SER SENCILLO Y PERMITE UNA SERIE DIVERSA DE APLICACIONES POR COMPLEMENTACION DE FRAGMENTOS PROTEICOS.
Description
Ensayos de complementación de fragmentos
proteicos para detectar interacciones biomoleculares.
La presente invención se refiere a la
determinación de la función de nuevos productos génicos. La
invención también se refiere a ensayos de complementación de
fragmentos proteicos (ECP). Los ECP permiten detectar una gran
variedad de tipos de interacciones
proteína-proteína, proteína-ARN,
proteína-ADN, proteína-carbohidrato
o proteína-molécula orgánica pequeña en diferentes
contextos celulares apropiados para estudiar tales
interacciones.
Muchos procesos biológicos, tales como la
transcripción, la traducción y las rutas metabólicas o de
transducción de señales, son mediados por complejos
multienzimáticos asociados de forma no covalente^{1, 101}. La
formación de complejos multiproteicos o proteína-ácido nucleico
constituye la maquinaria química más eficaz. Muchas de las
investigaciones biológicas modernas están relacionadas con la
identificación de proteínas implicadas en procesos celulares, con
la determinación de sus funciones y con cómo, cuándo y dónde
interactúan con otras proteínas implicadas en rutas específicas.
Además, en vista del rápido avance en los proyectos de
secuenciación del genoma, existe la necesidad de desarrollar
estrategias para definir "mapas de unión de proteínas",
inventarios detallados de interacciones entre proteínas que forman
ensamblajes funcionales de proteínas^{2,3}. A pesar de lo
importante que es comprender el ensamblaje de proteínas en procesos
biológicos, existen pocos procedimientos convenientes para estudiar
las interacciones proteína-proteína in
vivo^{4,5}. Los planteamientos incluyen el uso de reactivos
químicos de entrecruzamiento y transferencia de energía de
resonancia entre proteínas acopladas a un colorante^{102, 103}.
Una estrategia potente y usada comúnmente, el sistema de doble
híbrido en levadura, se usa para identificar nuevas interacciones
proteína-proteína y para examinar los aminoácidos
determinantes de las interacciones proteicas
específicas^{4,6-8}. El planteamiento permite el
cribado rápido de un gran número de clones, incluidas las librerías
de ADNc. Las limitaciones de esta técnica incluyen el hecho de que
la interacción ha de ocurrir en un contexto específico (el núcleo
de S. cerevisiae), y generalmente no se puede usar para
distinguir entre interacciones inducidas o constitutivas.
Recientemente, Johnsson y Varshavsky^{108} han
mostrado una nueva estrategia para detectar interacciones
proteína-proteína, la denominada técnica de sensor
de proteínas escindidas basado en ubiquitina (USPS)^{9}.
La estrategia se basa en la escisión de proteínas que presentan
extremos N-terminales fusionados con ubiquitina
mediante proteasas citosólicas (ubiquitinasas) que reconocen su
estructura terciaria. La estrategia depende del reensamblaje de la
estructura terciaria de la proteína ubiquitina a partir de
fragmentos N- y C-terminales complementarios y,
sobre todo, de la potenciación de este reensamblaje mediante
dominios de oligomerización fusionados con estos fragmentos. El
reensamblaje se detecta mediante la proteolisis específica del
producto ensamblado por proteasas citosólicas (ubiquitinasas). Los
autores demostraron que también la fusión de una proteína
reportera-fragmento C-terminal de
ubiquitina se podía escindir mediante ubiquitinasas, pero sólo si
se coexpresaba con un fragmento N-terminal de la
ubiquitina complementario al fragmento C-terminal.
La reconstitución de la actividad ubiquitinasa observable se
producía únicamente si los fragmentos N- y
C-terminales se unían a través de cremalleras de
leucina de GCN4^{109,110}. Los autores sugirieron que esta
estrategia del "gen escindido" se podía usar como ensayo in
vivo de las interacciones proteína-proteína y
para el análisis de la cinética de ensamblaje de proteínas en
células. Desafortunadamente, esta estrategia requiere factores
celulares adicionales (en este caso ubiquitinasas), y el
procedimiento de detección no se presta a un cribado de alto
rendimiento de librerías de ADNc.
Rossi, F., C.A. Charlton y H.M. Blau (1997, Proc.
Nat. Acad. Sci. (USA) 94, 8405-8410) informaron de
un ensayo basado en la complementación clásica de los fragmentos
\alpha y \omega de la \beta-galactosidasa
(\beta-gal) y la inducción de la complementación
mediante la oligomerización inducida por rapamicina de las proteínas
FKBP12 y la diana mamífera de rapamicina en líneas celulares de
mioblastos C2C12 transfectadas. La reconstitución de la actividad
\beta-gal se detecta usando como sustrato
fluoresceína
di-\beta-D-galactopiranósido
y usando diversos ensayos de detección de fluorescencia. Aunque
este ensayo presenta un cierto parecido con la presente invención,
existen varias diferencias distintivas significativas. En primer
lugar, este planteamiento de complementación concreto se ha estado
usando durante más de treinta años en un gran número de
aplicaciones, que incluyen la detección de interacciones
proteína-proteína. Krevolin, M. y D. Kates (1993,
patente de Estados Unidos nº 5.362.625) muestran el uso de esta
complementación para detectar interacciones
proteína-proteína. Asimismo se ha comunicado
previamente el logro de la complementación de
\beta-gal en células de mamífero (Moosmann, P. y
S. Rusconi (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1171-1172).
Los ECP individuales presentados en esta memoria son ensayos para
la detección de interacciones de diseño completamente nuevo, no
descritos previamente de manera alguna salvo para publicaciones
surgidas del laboratorio del solicitante. En segundo lugar, esta
solicitud describe una estrategia general para desarrollar ensayos
de interacciones moleculares a partir de un gran número de
detectores de enzimas o proteínas, todos ellos ensayos de diseño
nuevo, mientras que el ensayo de \beta-gal no es
nove-
doso ni constituye una estrategia general o ventaja frente a las aplicaciones existentes, bien documentadas previamente.
doso ni constituye una estrategia general o ventaja frente a las aplicaciones existentes, bien documentadas previamente.
Al igual que en el USPS, la estrategia de doble
híbrido en levadura requiere para la detección una maquinaria
celular adicional que únicamente existe en compartimentos celulares
específicos. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de
detección que use la reconstitución de una actividad enzimática
específica a partir de fragmentos como ensayo mismo, sin necesidad
de usar otras proteínas para la detección de la actividad.
Preferentemente, el ensayo debe implicar una complementación
asistida por una oligomerización de fragmentos de enzimas
monoméricas o multiméricas que no precisen de otras proteínas para
la detección de su actividad. Además, si la estructura de una enzima
es conocida, es posible diseñar fragmentos de la enzima para
asegurar que los fragmentos reensamblados son activos e introducir
mutaciones con el fin de alterar el poder de detección del
reensamblaje. Sin embargo, el conocimiento de la estructura no es un
requisito previo para diseñar fragmentos complementarios, como se
explicará más adelante. La flexibilidad permitida en el diseño de un
planteamiento de este tipo puede hacerlo aplicable a situaciones en
las que pueden no ser adecuados otros sistemas de detección.
Los recientes avances en la investigación del
genoma humano han conducido a un rápido progreso en la
identificación de genes nuevos. En la aplicación a la investigación
biológica y farmacéutica existe ahora una necesidad urgente para
determinar las funciones de los productos génicos nuevos; por
ejemplo, para genes en los que se ha demostrado su implicación en
fenotipos patológicos. Consiste en solucionar problemas funcionales
en los que la investigación farmacéutica basada en el genoma se
queda atascada, y ahora existe la necesidad de avanzar en el
desarrollo de ensayos funcionales sencillos y automatizables. Un
primer paso para definir la función de un gen nuevo consiste en
determinar sus interacciones con otros productos génicos en un
contexto apropiado; es decir, puesto que las proteínas interactúan
específicamente con otras proteínas u otros biopolímeros como parte
de ensamblajes funcionales, una forma apropiada para examinar la
función de un gen nuevo consiste en determinar sus relaciones
físicas con los productos de otros genes.
Las técnicas de cribado para identificar
interacciones entre proteínas, tales como el sistema de "doble
híbrido" en levadura, han transformado la biología molecular,
pero únicamente se pueden usar para estudiar tipos específicos de
proteínas que interactúan entre sí de forma constitutiva o
interacciones de proteínas con otras moléculas en contextos
celulares y compartimentales estrechamente definidos y requieren una
maquinaria celular compleja (transcripción) para funcionar. Para
realizar un cribado racional respecto a interacciones entre
proteínas en el contexto de un problema específico se requieren
planteamientos más flexibles: concretamente, ensayos que cumplan los
criterios necesarios no sólo para la detección de interacciones
moleculares sino también para la validación de estas interacciones
como específicas y biológicamente relevantes.
Una lista de las características del ensayo que
cumplen tales criterios es la siguiente:
1) Permitir la detección de interacciones
proteína-proteína, proteína-ADN/ARN
o proteína-fármaco in vivo o in
vitro.
2) Permitir la detección de estas interacciones
en contextos apropiados, tales como en un organismo, tipo celular,
compartimento celular u orgánulo específico.
3) Permitir la detección de interacciones
proteína-proteína inducidas frente a constitutivas
(por ejemplo, mediante un factor de crecimiento o inhibidor
celular).
4) Ser capaz de distinguir entre interacciones
proteína-proteína específicas e inespecíficas
controlando la sensibilidad del ensayo.
5) Permitir la determinación de la cinética del
ensamblaje de proteínas en las células.
6) Permitir el cribado de librerías de ADNc,
moléculas orgánicas pequeñas o de ADN o ARN para identificar
interacciones moleculares.
La presente invención pretende cubrir las
necesidades antes mencionadas en las que la técnica anterior
fracasa. La presente invención proporciona una estrategia general
para detectar interacciones de proteínas con otros biopolímeros, que
incluyen otras proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o para
cribar librerías de moléculas pequeñas para identificar compuestos
con un posible valor terapéutico. En una realización preferida, la
presente invención pretende proporcionar una complementación de
fragmentos de enzimas monoméricas asistida por una oligomerización
que no requiera otras proteínas para detectar su actividad. En una
realización de este tipo, se proporciona un ensayo de
complementación de fragmentos proteicos (ECP) basado en la
reconstitución de la actividad de la dihidrofolato reductasa por
complementación de fragmentos definidos de la enzima en E.
coli. Este ensayo no requiere factores endógenos adicionales
para detectar interacciones proteína-proteína
específicas (es decir, interacciones de tipo cremallera de leucina)
y se puede aplicar convenientemente para el cribado de librerías
diseñadas de ADNc, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas o proteínas
respecto a interacciones moleculares. Además, el ensayo también se
puede adaptar para la detección de interacciones entre proteínas en
cualquier contexto o compartimento celular, y se puede usar para
distinguir entre interacciones proteicas inducidas y constitutivas
en sistemas tanto eucarióticos como procarióticos.
En un primer aspecto, la invención proporciona un
ensayo de complementación de fragmentos proteicos para la detección
de interacciones moleculares que comprende el reensamblaje de
fragmentos separados de una proteína, en el que el reensamblaje de
los fragmentos proteicos se efectúa a través de la interacción de
dominios moleculares fusionados con cada fragmento proteico, en el
que el reensamblaje de los fragmentos proteicos es independiente de
otros procesos moleculares y en el que dicho reensamblaje se detecta
por medio de la reconstitución de la actividad de dicha
proteína.
Preferentemente, la proteína es una proteína
monomérica; más preferentemente, la proteína es una enzima; aún más
preferentemente, la enzima es una enzima monomérica. El peso
molecular preferido para la enzima se encuentra en el intercalo de
10 a 40 kDa.
La enzima usada en el ensayo de acuerdo con el
primer aspecto de la invención se puede seleccionar del grupo
formado por glutatión-S-transferasa,
dihidrofolato reductasa, luciferasa, xantina-guanina
fosforribosil transferasa, adenosina desaminasa,
higromicina-B-fosfotransferasa y
L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa. En una
realización preferida, la dihidrofolato reductasa está mutada en el
residuo de aminoácido 114.
La proteína usada en el ensayo de acuerdo con el
primer aspecto de la invención se puede seleccionar del grupo
formado por la proteína fluorescente verde y una proteína de unión a
bleomicina (gen de resistencia a zeocina). En una realización
preferida, la proteína fluorescente verde está mutada en el residuo
de aminoácido 65.
En otro aspecto más, la invención proporciona un
procedimiento para la detección de interacciones
proteína-proteína en organismos vivos no humanos
y/o en células no humanas y/o en células humanas aisladas y/o
cultivadas, comprendiendo el procedimiento los siguientes pasos:
(a) Síntesis de fragmentos proteicos sonda de una
enzima que permita la selección dominante por división del gen que
codifica la enzima en al menos dos fragmentos;
(b) construcción de proteínas de fusión formadas
por los fragmentos proteicos sonda unidos a dominios moleculares que
se han de ensayar respecto a sus interacciones;
(c) coexpresión de las proteínas de fusión; y
(d) detección de la reconstitución de la
actividad enzimática usando el ensayo de acuerdo con el primer
aspecto de la invención.
En una realización preferida, la coexpresión de
las proteínas de fusión complementarias es catalizada por la unión
de dichos dominios moleculares entre sí.
En el procedimiento de acuerdo con el segundo
aspecto de la invención, la enzima es preferentemente la
dihidrofolato reductasa.
En otra realización preferida de la invención,
las proteínas de fusión presentan péptidos formados por los
fragmentos N- y C-terminales de dicha dihidrofolato
reductasa y están fusionadas con secuencias de la cremallera de
leucina de GCN4.
La invención proporciona adicionalmente un
procedimiento para el cribado de una librería de expresión, que
comprende la realización de un ensayo de complementación de
proteínas de acuerdo con el primer aspecto de la invención en el que
el medio de detección de dicho ensayo es la reconstitución de la
actividad proteica. Preferentemente, en este procedimiento de
cribado existe una interacción entre partes de una primera o una
segunda molécula debido a la presencia de al menos una molécula
distinta que media la interacción.
Una estrategia particular para diseñar un ensayo
de complementación de proteínas (ECP) está basada en el cumplimiento
de las siguientes características: 1) Una proteína o enzima que sea
relativamente pequeña y monomérica, 2) sobre la cual exista una
amplia bibliografía con información estructural y funcional, 3) para
la cual existan ensayos sencillos para la reconstitución de la
proteína o de la actividad enzimática, tanto in vivo como
in vitro, y 4) para la cual se haya demostrado una
sobreexpresión en células eucarióticas y procarióticas. Si estos
criterios se cumplen, se usa la estructura de la enzima para decidir
cuál es la mejor posición en la cadena polipeptídica para dividir el
gen en dos partes, basándose en los siguientes criterios: 1) Los
fragmentos deben dar como resultado subdominios polipeptídicos
continuos; es decir, los fragmentos resultantes no deben romper la
estructura de los subdominios de la proteína, 2) los sitios
catalíticos y de unión a cofactores deben estar contenidos todos
ellos en un mismo fragmento y 3) los extremos N- y
C-terminales nuevos deben estar en la misma cara de
la proteína para evitar tener que usar conectores peptídicos largos
y permitir la realización de estudios sobre la dependencia de la
unión proteica de la orientación.
Debe entenderse que no tienen que cumplirse todos
los criterios antes mencionados para que la presente invención
funcione adecuadamente. Es una ventaja que la enzima sea pequeña,
preferentemente de 10 a 40 kDa. Aunque se prefieren enzimas
monoméricas, también se pueden prever enzimas multiméricas dentro
del alcance de la presente invención. En el presente ensayo se puede
usar la proteína tirosinasa dimérica. La información sobre la
estructura de la enzima proporciona una ventaja adicional a la hora
de diseñar el ECP, pero no es necesaria. De hecho, se presenta una
estrategia adicional para desarrollar un ECP, basada en una
combinación de fragmentos proteicos generados mediante la digestión
con exonucleasas seguida de una evolución dirigida de la proteína
aplicando a la enzima la aminoglucósido quinasa. Se prefiere la
sobreexpresión en células procarióticas, pero no es una necesidad.
El experto en la técnica entenderá que no es absolutamente necesario
que el sitio catalítico enzimático (de la enzima elegida) esté en la
misma molécula.
La presente solicitud explica la razón y los
criterios para usar una enzima concreta en un ECP. La Figura 1
muestra una descripción general de un ECP. El gen de una proteína o
enzima se divide de forma racional en dos o más fragmentos. Los
fragmentos elegidos se subclonan usando técnicas de biología
molecular, y a los extremos 5' de cada uno se fusionan proteínas que
se sabe o se cree que interactúan. Después se realiza la
cotransfección o cotransformación de estas construcciones de ADN en
células. El reensamblaje de la proteína o enzima sonda a partir de
sus fragmentos es catalizado por la unión de las proteínas de ensayo
entre sí, y la reconstitución se observa con cualquier ensayo. Es
esencial entender que estos ensayos únicamente funcionarán si las
proteínas fusionadas que interactúan catalizan el reensamblaje de la
enzima. Es decir, la observación de la actividad enzimática
reconstituida debe ser una medida de la interacción de las proteínas
fusionadas.
Una realización preferida de la presente
invención se centra en un ECP basado en la enzima dihidrofolato
reductasa. Se presenta una ampliación de la estrategia en el sentido
de incluir ensayos en células eucarióticas, el cribado de librerías
y una aplicación específica a problemas relacionados con el estudio
de rutas bioquímicas integradas, tales como vías de transducción de
señales. Se describen ensayos adicionales, incluidos aquellos que
están basados en enzimas y que pueden actuar como selección
dominante o recesiva de fármacos o como recuperación de rutas
metabólicas. Asimismo se describen ECP basados en enzimas que
producen un producto de color o fluorescente. La presente invención
enseña cómo la estrategia de los ECP se puede generalizar y
automatizar para el análisis funcional de genes nuevos, el cribado
de productos naturales o de librerías de compuestos respecto a su
actividad farmacológica y la identificación de productos génicos
nuevos que interactúan con ADN, ARN o carbohidratos. También enseña
cómo la estrategia de los ECP se puede aplicar para identificar, a
partir de librerías de compuestos con un posible valor terapéutico,
productos naturales o moléculas pequeñas que pueden inhibir o
activar tales interacciones moleculares y cómo se pueden identificar
los sustratos enzimáticos y los inhibidores de molécula pequeña de
las enzimas. Finalmente, enseña cómo la estrategia de los ECP se
puede usar para llevar a cabo experimentos de ingeniería de
proteínas que pueden conducir al diseño de enzimas con aplicaciones
industriales o de péptidos con actividad biológica.
En la presente memoria se describen estrategias
sencillas para diseñar e implementar ensayos para la detección de
interacciones de proteínas in vivo. Los autores diseñaron
fragmentos complementarios de la DHFRm nativa que, cuando se
coexpresan en E. coli cultivado en medio mínimo, permiten la
supervivencia de los clones que expresan los dos fragmentos, estando
inhibida la actividad basal de la DHFR bacteriana endógena mediante
el inhibidor competitivo trimetoprim (Fig. 3). La reconstitución de
la actividad se producía únicamente cuando los dos fragmentos N- y
C-terminales de la DHFR se coexpresaban en forma de
fusiones C-terminales con secuencias de tipo
cremallera de leucina de GCN4, lo que indica que el reensamblaje de
los fragmentos requiere la formación de una cremallera de leucina
entre los péptidos de fusión N- y C-terminales. El
aumento secuencial de los tiempos de duplicación de las células,
resultante de las mutaciones desestabilizantes dirigidas en la
interfase de ensamblaje (Ile 114 a Val, Ala o Gly), demuestra que la
supervivencia celular observada en condiciones selectivas es el
resultado de la asociación específica, asistida por cremalleras de
leucina, del fragmento[1,2] con el fragmento[3] de la
DHFRm, al contrario que las interacciones inespecíficas de
Z-F[3] con Z-F[1,2].
Se proporcionan numerosos ejemplos adicionales detallados.
Como se demostró previamente con la técnica de
sensor de proteínas escindidas basado en ubiquitina
(USPS)^{9}, se puede usar una estrategia de complementación
de fragmentos proteicos para estudiar el equilibrio y los aspectos
cinéticos de las interacciones proteína-proteína
in vivo. Sin embargo, el ensayo con la DHFR y otros ECP son
ensayos más sencillos. Son sistemas completos; no son necesarios
otros factores endógenos adicionales, y los resultados de la
complementación se observan directamente, sin más manipulación. Por
lo tanto, el ensayo de supervivencia de las células de E.
coli descrito en la presente memoria es especialmente útil para
el cribado de librerías de ADNc para identificar interacciones
proteína-proteína. La expresión de la DHFRm en
células se puede monitorizar mediante la unión de análogos
fluorescentes y de alta afinidad del sustrato de la DHFR^{26}.
Existen varios aspectos adicionales de los ECP
que los distinguen de todas las demás estrategias para estudiar las
interacciones proteína-proteína in vivo
(excepto USPS). Los autores han diseñado fragmentos complementarios
de enzimas que permiten controlar el poder del ensayo y que se
pueden usar para estimar la cinética y las constantes de equilibrio
para la asociación de dos proteínas. Por ejemplo, en el caso de la
DHFR, las mutaciones puntuales de la enzima silvestre Ile 114 a Val,
Ala o Gly alteran el poder de reconstitución de la actividad de la
DHFR. Para estimar el equilibrio y los parámetros cinéticos para una
interacción proteína-proteína específica, se puede
llevar a cabo una serie de experimentos ECP de la DHFR con dos
proteínas que interactúan con una afinidad conocida, usando los
fragmentos silvestres o mutantes desestabilizantes de la DHFR. La
comparación de las tasas de crecimiento en este sistema modelo con
las tasas de un ECP con la DHFR usando desconocidos proporcionará
una estimación del poder de la interacción desconocida.
Debe entenderse que la presente invención no está
limitada a la DHFR o a otros ECP presentados, puesto que éstos son
sólo realizaciones no limitantes del ensayo de complementación de
proteínas de la presente invención. Más aún, los ECP no deben estar
limitados respecto al contexto en el que se pueden usar. Las
construcciones se pueden diseñar para dirigir las fusiones del ECP a
compartimentos específicos de la célula añadiendo secuencias
peptídicas de señalización^{27,28}. Las interacciones
proteína-proteína inducidas se pueden distinguir de
las constitutivas mediante una versión eucariótica del ECP en el
caso de una interacción que es provocada por un acontecimiento
bioquímico. Asimismo, el sistema se puede adaptar para el uso en el
cribado de nuevas asociaciones moleculares y proteicas inducidas
entre una proteína diana y una librería de expresión.
La presente invención es pionera en cuanto a que
es el primer ensayo de complementación de proteínas que muestra tal
nivel de simplicidad y versatilidad. Las realizaciones
ejemplificadas representan ensayos de complementación de fragmentos
proteicos (ECP) basados en la DHFRm, en los que una cremallera de
leucina dirige la reconstitución de la actividad de la DHFR. La
actividad se detecta mediante un ensayo de supervivencia de E.
coli que es tanto práctico como económico. Este sistema ilustra
el uso de la complementación de fragmentos de DHFRm en la detección
de la dimerización por cremallera de leucina y se puede aplicar a la
detección de interacciones moleculares y proteicas específicas
desconocidas in vivo.
Debe entenderse que la presente invención no está
limitada a los ECP presentados en esta memoria, puesto que se pueden
seleccionar y usar numerosas enzimas diferentes de acuerdo con las
enseñanzas de la presente invención. Ejemplos de tales marcadores se
pueden encontrar en Kaufman (1987, Genetic Eng.
9:155-198) y en las referencias allí citadas, así
como en la Tabla 1 de esta solicitud.
Asimismo debe quedar claro para el experto en la
técnica al que concierne la presente invención que la invención no
está limitada al uso de cremalleras de leucina para las dos
moléculas que interactúan. De hecho, se pueden usar e identificar
numerosos tipos distintos de interacciones
proteína-molécula de acuerdo con la enseñanza de la
presente invención. Los motivos conocidos implicados en las
interacciones proteína-molécula son conocidos en la
técnica.
Otras características y ventajas de la presente
invención serán evidentes a partir de la descripción siguiente de
sus realizaciones preferidas, los ejemplos adjuntos y las
reivindicaciones exigidas.
La Fig. 1 proporciona una descripción general de
un ECP. Usando técnicas de biología molecular se subclonan los
fragmentos elegidos de la enzima, y a los extremos 5' de cada uno se
fusionan proteínas que se sabe o se cree que interactúan. Después se
lleva a cabo la cotransfección o transformación de estas
construcciones de ADN en células y se observa la reconstitución con
cualquier ensayo.
La Fig. 2 es un esquema de las construcciones de
fusión usadas en una de las realizaciones de la invención. Se
ilustran el péptido hexahistidina (6His), la cremallera de leucina
homodimerizante de GCN4 (Cremallera) y fragmentos de DHFRm (1, 2 y
3). El marcador de las construcciones se usa para identificar tanto
las construcciones de ADN como las proteínas expresadas a partir de
estas construcciones.
La Fig. 3 (A) muestra el ensayo de supervivencia
de E. coli en placas con medio mínimo. Control: Lado
izquierdo de la placa: E. coli que porta
pQE-30 (sin inserto); lado derecho: E. coli
que porta pQE-16 que codifica la DHFRm nativa. Panel
I: Lado izquierdo de cada placa: Transformación con la construcción
Z-F[1,2]; lado derecho de cada placa:
Transformación con la construcción Z-F[3].
Panel II: Cotransformación con las construcciones
Z-F[1,2] y Z-F[3].
Panel III: Cotransformación con las construcciones
Control-F[1,2] y
Z-F[3]. Todas las placas contienen 0,5 mg/ml
de trimetoprim. En los paneles I a III, las placas del lado derecho
contienen IPTG 1 mM.
(B) Ensayo de supervivencia de E. coli
usando mutantes desestabilizantes de la DHFR. Panel I:
Cotransformación de E. coli con las construcciones
Z-F[1,2] y
Z-F[3:Ile114Val]. Panel II: Cotransformación
con Z-F[1,2] y
Z-F[3:Ile114Ala]. El recuadro es un aumento
de 5 veces de la placa del lado derecho. Panel III: Cotransformación
con Z-F[1,2] y
Z-F[3:Ile114Gly]. Todas las placas contienen
0,5 mg/ml de trimetoprim. Las placas del lado derecho contienen IPTG
1 mM.
La Fig. 4 representa la coexpresión de los
fragmentos de la DHFRm.
(A) Análisis en gel de agarosa del patrón de
restricción resultante de la digestión del ADN plasmídico con
HincII. El carril 1 contiene ADN aislado de E. coli
cotransformado con las construcciones
Z-F[1,2] y Z-F[3]. Los
carriles 2 y 3 contienen ADN aislado de E. coli transformado
con la construcción Z-F[3] y la construcción
Z-F[1], respectivamente. La migración de los
fragmentos (en pb) se indica a la derecha.
(B) Análisis por electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) de la expresión de
los fragmentos de la DHFRm. Los carriles 1 a 5 muestran el lisado
bruto de E. coli no transformado (carril 1) o de E.
coli que expresa Z-F[1,2] (20,8 kDa;
carril 2), Z-F[3] (18,4 kDa; carril 3),
Control-F[1,2] (14,2 kDa; carril 4) y
Z-F[1,2] + Z-F[3]
(carril 5). El carril 6 muestra 40 ml procedentes de 2 ml de
Z-F[1,2] y Z-F[3]
copurificados. Las puntas de flecha señalan las proteínas de
interés. La migración de los marcadores del peso molecular (en kDa)
se indica a la derecha.
La Fig. 5 ilustra las características generales
de un ECP basado en un ensayo de supervivencia, tal como el ECP de
la DHFR. El ensayo se puede usar en un contexto bacteriano o
mamífero. El ADN diana insertado puede ser una secuencia conocida
que codifica una proteína (o un dominio de una proteína) de interés,
o puede ser una librería de ADNc.
La Fig. 6 representa una autorradiografía de un
lisado de células COS después del marcado por pulsos con
^{35}S-Met-Cys durante 30 min. El
patrón de expresión es esencialmente idéntico al que se observa en
E. coli (véase la Fig. 4). El ADN transfectado en las células
(o cotransfectado) se indica en la parte superior de los carriles
respectivos.
La Fig. 7 ilustra los resultados de una
aplicación del ECP bacteriano de la DHFRm a la ingeniería de
proteínas. Se crearon dos librerías semialeatorias de cremalleras de
leucina (como se describe en el texto) y cada una se insertó en el
extremo N-terminal de uno de los fragmentos de
DHFRm. La cotransformación de las librerías resultantes de
fragmentos cremallera-DHFR en E. coli y el
cultivo en placas con medio selectivo permitió la supervivencia de
los clones que portaban cremalleras de leucina que interactúan con
éxito. Se aislaron catorce clones y se secuenciaron las cremalleras
para identificar los residuos en las posiciones "e" y "g".
Los pares "e-g" se clasificaron en función de
la presencia de un apareamiento atractivo (carga:carga, carga:neutro
polar o neutro polar:neutro polar) o de un apareamiento repulsivo
(carga:carga) y del número de cada tipo de interacción registrado
para cada clon. El número total de interacciones para cada clon es
6; las interacciones se representan en el histograma.
Otras ventajas y características de la presente
invención se harán más evidentes después de leer la descripción
siguiente de las realizaciones preferidas con referencia a los
dibujos adjuntos, que constituyen ejemplos y no deben interpretarse
como limitantes del alcance de la presente invención.
A la hora de diseñar un ensayo de complementación
de fragmentos proteicos (ECP), los autores trataron de identificar
una enzima para la cual fuera válido lo siguiente: 1) Una enzima que
sea relativamente pequeña y monomérica, 2) sobre la cual exista
información estructural y funcional, 3) para la cual existan ensayos
sencillos para realizar mediciones tanto in vivo como in
vitro y 4) para la cual se haya demostrado la sobreexpresión en
células eucarióticas y procarióticas. La DHFR murina (DHFRm) cumple
todos los criterios expuestos anteriormente para un ECP. Las DHFR
procariótica y eucariótica son esenciales para el metabolismo
celular de un solo carbono y son absolutamente necesarias para la
supervivencia celular en procariotas y eucariotas. Específicamente,
cataliza la reducción del dihidrofolato al tetrahidrofolato para
usarlo en la transferencia de unidades de un solo carbono, necesaria
para la biosíntesis de serina, metionina, purinas y timidilato. Las
DHFR son proteínas monoméricas pequeñas (17 kDa a 21 kDa). Las
estructuras cristalinas de la DHFR procedente de diferentes fuentes
bacterianas y eucarióticas son conocidas y se han determinado los
sitios de unión al sustrato y los residuos presentes en los sitios
activos^{111-114}, lo que permite realizar un
diseño racional de los fragmentos proteicos. Se han estudiado
extensamente el plegado, la catálisis y la cinética de numerosas
DHFR^{115-119}. La actividad enzimática se puede
monitorizar in vitro mediante un sencillo ensayo
espectrofotométrico^{120} o in vivo mediante la
supervivencia celular de células cultivadas en ausencia de los
productos finales de la DHFR. La DHFR es inhibida específicamente
por el fármaco anti-folato trimetoprim. Puesto que
la DHFR de mamíferos presenta una afinidad 12.000 veces menor por el
trimetoprim que la DHFR bacteriana^{121}, el crecimiento de
bacterias que expresan la DHFRm en presencia de niveles de
trimetoprim letales para las bacterias es un medio eficaz para
seleccionar el reensamblaje de los fragmentos de la DHFRm que da
lugar a una enzima activa. Se ha demostrado un alto nivel de
expresión de la DHFRm en células procarióticas transformadas o
eucarióticas transfectadas^{122-126}.
La DHFRm comparte una elevada identidad de
secuencia con la secuencia de la DHFR humana (DHFRh) (91% de
identidad) y es altamente homóloga a la enzima de E. coli
(29% de identidad, 68% de homología), y estas secuencias comparten
una estructura terciaria visualmente superponible^{111}. La
comparación de las estructuras cristalinas de la DHFRm y la DHFRh
sugiere que sus sitios activos son esencialmente
idénticos^{127,128}. Se ha descrito que la DHFR está formada por
tres fragmentos estructurales que forman dos dominios^{129,130},
el dominio de unión a adenina (residuos 47 a 105 =
fragmento[2]) y un dominio discontinuo (residuos 1 a 46 =
fragmento[1] y 106 a 186 [3]; numeración de acuerdo con la
secuencia murina). La cavidad de unión a folato y el surco de unión
a NADPH están formados principalmente por residuos pertenecientes a
los fragmentos[1] y [2]. El fragmento[3] no está
implicado directamente en la catálisis.
Los residuos 101 a 108 de la DHFRh, en el punto
de unión entre el fragmento[2] y el fragmento[3],
forman un bucle desordenado que está situado en la misma cara de la
proteína que ambos extremos terminales. Los autores decidieron
cortar la DHFRm en los fragmentos [1,2] y [3], en el residuo 107,
para afectar mínimamente el sitio activo y los sitios de unión al
cofactor NADPH. El extremo N-terminal nativo de la
DHFRm y el extremo N-terminal nuevo creado por el
corte se encuentran en la misma superficie de la enzima^{112,
128}, permitiendo con facilidad la unión covalente
N-terminal de cada fragmento con los fragmentos a
los que se ha de asociar, tales como las cremalleras de leucina
usadas en este estudio. Usando este sistema, los autores obtuvieron
un ensamblaje de los fragmentos de la DHFRm asistido por cremalleras
de leucina que proporcionó la enzima activa.
Los oligonucleótidos mutagénicos y de
secuenciación fueron suministrados por Gibco BRL. Las endonucleasas
de restricción y las enzimas modificadoras de ADN provinieron de
Pharmacia y New England Biolabs. Los fragmentos de la DHFRm, que
portaban su propio codón de terminación dentro del marco de lectura,
se subclonaron en pQE-32 (Qiagen), cadena abajo y
dentro del marco de lectura del péptido de hexahistidina y una
cremallera de leucina de GCN4 (Fig. 1, Fig. 2). Todas las
construcciones finales estaban basadas en la serie de vectores pQE
de Qiagen, que contienen un elemento
promotor-operador inducible (tac), un sitio de
unión consenso a ribosomas, un codón de iniciación y nucleótidos que
codifican un péptido de hexahistidina. pQE-16
(Qiagen) expresa la DHFRm en su longitud completa.
Los residuos 235 a 281 de la cremallera de
leucina de GCN4 (un fragmento SalI/BamHI de 254 pb) se
obtuvieron a partir de un plásmido de expresión pRS316 de
levaduras^{9}. El extremo escindido en el sitio BamHI se rellenó
con la polimerasa Klenow y el fragmento se ligó en
pQE-32 linealizado con SalI/HindIII
(relleno). El producto, la construcción Z, lleva un marco de lectura
abierto que codifica la secuencia
Met-Arg-Gly-Ser,
seguida de un marcador de hexahistidina y 13 residuos que preceden a
los residuos de la cremallera de leucina de GCN4.
Como molde para la generación de la DHFRm por PCR
se usó el vector eucariótico de expresión transitoria, pMT3
(derivado de pMT2)^{16}, que reunía las características que
permitían la subclonación y la expresión separada del
fragmento[1,2] y del fragmento[3]. Se usó el
procedimiento del megacebador de la mutagénesis por PCR^{29} para
generar un producto de 590 pb de longitud completa. Se usaron
oligonucleótidos complementarios a la secuencia nucleotídica que
codifica los extremos N- y C-terminales de la DHFRm
y que contiene un nuevo sitio BspEI fuera de la secuencia
codificante, así como un oligonucleótido usado para crear un nuevo
codón de terminación detrás del fragmento[1,2], seguido de un
nuevo sitio SpeI usado para la subclonación del
fragmento[3].
Se hibridaron juntos los oligonucleótidos
complementarios que contenían los nuevos sitios de restricción:
SnaBI, NheI, SpeI y BspEI, obteniéndose
en 5' y 3' extremos sobresalientes complementarios a EcoRI, y
se insertaron en pMT3 en un único sitio EcoRI. El producto de
PCR, de 590 pb (descrito anteriormente), se digirió con BspEI
y se insertó en pMT3 linealizado en BspEI, proporcionando la
construcción [1,2,3]. El fragmento BspEI/EcoNI, de 610
pb (que codifica el fragmento [1,2] de la DHFR seguido de una nueva
terminación y el fragmento[3] hasta EcoNI) se rellenó
en EcoNI y se subclonó en pMT3 abierto con
BspEI/HpaI, proporcionando la construcción
F[1,2]. El fragmento SpeI/BspEI, de 250 pb, de
la construcción [1,2,3] que codifica el fragmento[3] de la
DHFR (con codón de terminación dentro del marco de lectura) se
subclonó en pMT3 abierto con las mismas enzimas. El codón de
terminación de la secuencia de DHFR silvestre, cadena abajo del
fragmento[3] en pMT3, se insertó de la siguiente manera: El
corte con EcoNI, presente tanto en el fragmento[3]
insertado como en el fragmento[3] silvestre, la eliminación
de la secuencia intermedia, de 683 pb, y el religado del vector
proporcionaron una construcción del fragmento[3] con el codón
de terminación silvestre, la construcción F[3].
Los fragmentos SnaBI/XbaI de 1051
pb y de 958 pb de las construcciones F[1,2] y F[3],
respectivamente, se subclonaron en la construcción Z abierta con
BglII(relleno)/NheI, proporcionando las
construcciones Z-F[1,2] y
Z-F[3] (Fig. 2). Para la construcción de
expresión control, se eliminó de la construcción
Z-F[1,2] el fragmento
XmaI/BspEI, de 180 pb, que codifica la cremallera,
proporcionando la construcción Control-F[1,2]
(Fig. 2).
Se realizó una mutagénesis dirigida^{30} para
producir mutantes en Ile114 (numeración de la DHFRm silvestre). La
reacción de mutagénesis se llevó a cabo en el fragmento
KpnI/BamHI de la construcción
Z-F[3] subclonada en pBluescript SK+
(Stratagene) usando oligonucleótidos que codifican una mutación
silenciosa que genera un nuevo sitio BamHI. El fragmento
NheI/EcoNI, de 206 pb, de los mutantes putativos
identificados por restricción se volvió a subclonar en
Z-F[3]. Las mutaciones se confirmaron
mediante la secuenciación del ADN.
La cepa de E. coli BL21, que lleva el
plásmido pRep4 (de Qiagen, para la expresión constitutiva del
represor lac), se hizo competente, se transformó con las
construcciones de ADN adecuadas y se lavó dos veces con medio mínimo
antes de sembrarla en placas con medio mínimo que contenía 50 mg/ml
de kanamicina, 100 mg/ml de ampicilina y 0,5 mg/ml de trimetoprim.
La mitad de cada mezcla de transformación se cultivó en ausencia y
la otra mitad en presencia de IPTG 1 mM. Todas las placas se
mantuvieron a 37ºC durante 66 h.
Se propagaron colonias obtenidas de la
cotransformación y se usaron para inocular 10 ml de medio mínimo
suplementado con ampicilina, kanamicina, así como con IPTG (1 mM) y
trimetoprim (1 mg/ml) como se indicó. Los cotransformantes de
Z-F[1,2] +
Z-F[3:Ile114Gly] se obtuvieron en condiciones
no selectivas sembrando la mezcla de transformación en placas de
L-agar (+ kanamicina y ampicilina) y cribándolas
respecto a la presencia de las dos construcciones mediante el
análisis de restricción. Todas las curvas de crecimiento se
realizaron por triplicado. Se retiraron periódicamente alícuotas
para medir la densidad óptica. Se calculó el tiempo de duplicación
para el crecimiento logarítmico temprano (DO 600 entre 0,02 y
0,2).
Las bacterias se propagaron en caldo de cultivo
Terrific Broth^{31} en presencia de los antibióticos apropiados
hasta una DO600 de aproximadamente 1,0. La expresión se indujo
mediante la adición de IPTG 1 mM y la incubación posterior durante 3
h. Para el análisis del extracto bruto, los sedimentos de 150 ml de
células inducidas se lisaron por ebullición en colorante de carga.
Los lisados se clarificaron por microcentrifugación y se analizaron
mediante SDS-PAGE^{32}. Para la purificación de
las proteínas, se lisó por sonicación un sedimento celular de 50 ml
de E. coli inducidas, cotransformadas con las construcciones
Z-F[1,2] y Z-F[3], y
se efectuó una purificación desnaturalizante del sedimento insoluble
usando Ni-NTA (Qiagen) según las instrucciones del
fabricante. Las proteínas se eluyeron con un gradiente escalonado de
imidazol. Las fracciones se analizaron mediante
SDS-PAGE.
La DHFRm comparte una elevada identidad de
secuencia con la DHFR humana (DHFRh). Puesto de las coordenadas de
la estructura cristalina murina no estaban disponibles, los autores
basaron sus consideraciones de diseño en la estructura de la DHFRh.
Se ha descrito que la DHFR comprende tres fragmentos estructurales
que forman dos dominios: el dominio de unión a adenina (F[2])
y un dominio discontinuo (F[1] y F[3])^{13,18}. La
cavidad de unión a folato y el surco de unión a NADPH están formados
principalmente por residuos pertenecientes a F[1] y
F[2]. Los residuos 101 a 108 de la DHFRh forman un bucle
desordenado que está situado en la misma cara de la proteína que los
dos extremos terminales. Este bucle se produce en la unión entre
F[2] y F[3]. Al cortar la DHFRm en el residuo 107, los
autores crearon F[1,2] y F[3], afectando así
mínimamente el sitio activo y los sitios de unión al sustrato. El
extremo N-terminal nativo de la DHFRm y el nuevo
extremo N-terminal creado por el corte se unieron
covalentemente a los extremos C-terminales de las
cremalleras de leucina de GCN4 (Fig. 1).
La Figura 2 ilustra las características generales
de las construcciones expresadas y la nomenclatura usada en este
estudio. La Figura 3 (panel A) ilustra los resultados de la
cotransformación de bacterias con las construcciones que codifican
Z-F[1,2] y Z-F[3] en
presencia de trimetoprim, que demuestran claramente que el
crecimiento de las colonias bajo presión selectiva únicamente es
posible en el caso de las células que expresan ambos fragmentos de
la DHFRm. No hay crecimiento en presencia de
Z-F[1,2] o Z-F[3]
solos. La inducción de la expresión de proteínas con IPTG es
esencial para el crecimiento de las colonias (Fig. 3A). La presencia
de la cremallera de leucina en ambos fragmentos de la DHFRm es
esencial, como se ilustra mediante la cotransfección de bacterias
con ambos vectores que codifican los fragmentos de DHFRm de los
cuales sólo uno lleva una cremallera de leucina (Fig. 3A). Cabe
destacar que el crecimiento de E. coli control transformado
con la DHFRm de longitud completa es posible en ausencia de IPTG
debido a los bajos niveles de expresión en células no inducidas.
La confirmación de que ambos plásmidos están
presentes en bacterias capaces de crecer con trimetoprim se obtuvo
mediante el análisis de restricción del ADN plasmídico purificado de
colonias aisladas. La Figura 4 (A) revela la presencia del fragmento
de restricción HincII, de 1200 pb, de la construcción
Z-F[1,2], así como de los fragmentos de
restricción HincII, de 487 y 599 pb, de la construcción
Z-F[3]. Asimismo está presente el fragmento
HincII de pRep4, de 935 pb. En la Figura 4 (B) se ilustra la
sobreexpresión de las proteínas de fusión. En todos los casos se
observa en la SDS-PAGE del lisado bruto la
sobreexpresión de una proteína del peso molecular esperado. La
purificación de las proteínas coexpresadas en condiciones
desnaturalizantes proporcionó dos bandas de homogeneidad evidente en
el análisis por SDS-PAGE teñido con azul de
Coomassie (Fig. 4B).
Los solicitantes generaron mutantes de
F[3] para analizar si la reconstitución de la actividad de la
DHFRm mediante el ensamblaje de los fragmentos era específica. La
estabilidad de las proteínas se puede reducir cambiando el volumen
de cadenas laterales en el núcleo hidrófobo de una proteína^{9,
22-25}. El residuo Ile114 de la DHFRm se encuentra
en una cadena \beta en el núcleo, en la interfase entre
F[1,2] y F[3], aislado del sitio activo. Ile114
presenta un contacto de van der Waals con Ile51 y Leu93 en
F[1,2]^{11}. Los autores mutaron la Ile114 a Val,
Ala o Gly. La Figura 3 (panel B) ilustra los resultados de la
cotransformación de E. coli con la construcción
Z-F[1,2] y las construcciones
Z-F[3] mutadas. Las colonias obtenidas a
partir de la cotransformación con
Z-F[3:Ile114Ala] crecieron más lentamente
que las cotransformadas con Z-F[3] o
Z-F[3:Ile114Val] (véase el recuadro en la
Fig. 3B). No se observó crecimiento de colonias en las células
cotransformadas con Z-F[3Ile114Gly]. El
número de transformantes obtenido no fue significativamente
diferente en el caso en el que se observaron colonias, lo que
implica que las células cotransformadas con
Z-F[1,2] y Z-F[3],
Z-F[3:Ile114Val] o
Z-F[3:Ile114Ala] presentan la misma tasa de
supervivencia. La sobreexpresión de los mutantes
Z-F[3:Ile114X] se encontraba en el mismo
intervalo que la de Z-F[3], como se determinó
mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie
(datos no mostrados).
Los autores también compararon la eficacia
relativa del reensamblaje de los fragmentos de la DHFRm midiendo el
tiempo de duplicación de los transformantes en medio líquido. El
tiempo de duplicación en medio mínimo fue constante para todos los
transformantes (datos no mostrados). La presión selectiva con
trimetoprim en ausencia de IPTG impidió el crecimiento de E.
coli excepto cuando se transformaron con pQE-16,
que codifica la DHFR de longitud completa, debido a los bajos
niveles de expresión en células no inducidas. La inducción de la
expresión de los fragmentos de la DHFRm con IPTG permitió la
supervivencia de las células cotransformadas (excepto en el caso de
Z-F[1,2] +
Z-F[3:Ile114Gly]), aunque los tiempos de
duplicación aumentaron significativamente respecto al crecimiento en
ausencia de trimetoprim. El tiempo de duplicación medido para las
células que expresaban Z-F[1,2] +
Z-F[3], Z-F[1,2] +
Z-F[3:Ile114Val] y
Z-F[1,2] +
Z-F[3:Ile114Ala] fue, respectivamente, 1,6
veces, 1,9 veces y 4,1 veces mayor que el tiempo de duplicación de
E. coli que expresaba pQE-16 en ausencia de
trimetoprim e IPTG. La presencia de IPTG impidió, inesperadamente,
el crecimiento de E. coli transformado con DHFRm de longitud
completa. El crecimiento se restableció parcialmente mediante la
adición de los productos finales del metabolismo de folato, timina,
adenina, pantotenato, glicina y metionina (datos no mostrados). Esto
sugiere que la sobreexpresión inducida de la DHFRm fue letal para
E. coli cuando se cultivó en medio mínimo como resultado del
agotamiento de la reserva de folato por la unión a la enzima.
En otra realización, los solicitantes realizaron
mutaciones puntuales en la cremallera de leucina de GCN4 de
Z-F[1,2] y Z-F[3],
para la cual se conocen el equilibrio directo y los parámetro
cinéticos, y estos valores conocidos se correlacionaron con
parámetros derivados del ECP (Pelletier y Michnick, en preparación).
La comparación de las tasas de crecimiento celular en este sistema
modelo con las tasas de un ECP con la DHFR usando desconocidos
proporcionará una estimación del poder de la interacción
desconocida. Esto debería permitir estimar el equilibrio y los
parámetros cinéticos para una interacción
proteína-proteína específica.
La presente invención ha ilustrado y demostrado
un ensayo de complementación de fragmentos proteicos (ECP) basado en
la DHFRm, en el que una cremallera de leucina dirige la
reconstitución de la actividad de la DHFR. La actividad se detectó
mediante un ensayo de supervivencia de E. coli que es
práctico y económico. Este sistema ilustra el uso de la
complementación de fragmentos de la DHFRm en la detección de la
dimerización mediante cremalleras de leucina y se podrá aplicar a la
detección de interacciones proteína-proteína
específicas desconocidas.
Aunque los solicitantes han demostrado que la
estrategia de ingeniería/diseño antes descrita se puede usar para
producir fragmentos enzimáticos complementarios, es obvio que las
proteínas no evolucionaron para poder esperar que tales fragmentos
presentaran características físicas óptimas, incluidas la
solubilidad, la plegabilidad (plegado rápido), la resistencia a
proteasas o la actividad enzimática. Una realización alternativa de
esta estrategia de ingeniería/diseño consiste en el planteamiento de
endonucleasa/evolución. Esta estrategia se puede usar sola o junto
con la estrategia de ingeniería/diseño. Las ventajas de este
planteamiento residen en que, en principio, no es necesario conocer
previamente la estructura de la proteína, en que se eligen los
fragmentos óptimos para el ECP y en que estos fragmentos también
presentarán características óptimas. Una vez seleccionados los
fragmentos complementarios óptimos, los fragmentos se exponen a
múltiples ciclos de mutagénesis aleatoria. La mutagénesis se
consigue mediante una PCR subóptima combinada con una mutagénesis
química o mezclando ADN (Stemmer, W.P.C. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91, 10747-10751). La estrategia general se
describe para el caso de la aminoglucósido quinasa (AK), un ejemplo
de marcador de resistencia a antibióticos que se puede usar para la
selección dominante de células procarióticas, tales como E.
coli, o de células eucarióticas, tales como levadura o líneas
celulares de mamíferos. La estructura de la AK es conocida, de
manera que sería posible usar la estrategia (1), pero los autores
eligieron combinar la estrategia (1), como se definió anteriormente
para la DHFR, con la estrategia (2).
El procedimiento se optimización/selección es el
siguiente:
Se crean conjuntos de deleciones anidadas en los
extremos 5' y 3' del gen de la AK. Con el fin de crear deleciones
unidireccionales, se introducen sitios de restricción únicos en las
regiones flanqueantes del gen de la AK. En los extremos 5' y 3' se
añaden por PCR un sitio cohesivo "exterior", con un extremo 3'
protuberante (Sph I y Kpn I, respectivamente), y un
sitio cohesivo "interior", con un extremo 3' entrante
(Bgl II y Sal I, respectivamente). La escisión con
Sph I y Bgl II (o Kpn I y Sal I) da como
resultado la creación de un extremo protuberante orientado hacia
atrás, a la secuencia flanqueante, y un extremo entrante orientado
hacia el gen de la AK. La digestión con la exonucleasa III y la
nucleasa S1 de E. coli (Henikoff, S. (1987) Methods in
Enzymology 155, 156-165) proporciona un conjunto de
deleciones anidadas únicamente a partir del extremo entrante. Por lo
tanto, se digieren 10 mg de ADN con Sph I y Bgl II (o
Kpn I y Sal I), se extraen con
fenol-cloroformo y se añaden 12,5 U de exonucleasa
III. Se toman alícuotas a intervalos de 30 s durante 10 min y se
introducen en una solución con 2 U de nucleasa S1. Los extremos
recién creados se rellenan con la ADN polimerasa de T4 (0,1 U por
muestra), y el conjunto de vectores se vuelve a cerrar mediante la
ligación de extremos romos (10 U de ligasa por muestra). La longitud
media de la deleción en cada momento se determina mediante un
análisis de restricción de los conjuntos. Esto proporciona conjuntos
de genes de la AK delecionados a partir de los extremos 5' o 3'.
Esta manipulación se realiza directamente en las construcciones de
cremallera de pQE-32, de manera que los productos se
pueden usar directamente en el cribado respecto a la actividad.
Como primer paso para determinar los requisitos
necesarios para la complementación de fragmentos, los autores deben
determinar los fragmentos N-terminal y
C-terminal mínimos de la AK que son activos por sí
solos. Los conjuntos de deleciones se transforman individualmente en
células BL21 de E. coli, y la expresión de los fragmentos de
AK se induce mediante IPTG. Los conjuntos en los que aparece un
número significativo de colonias en presencia de G418 sirven para
indicar la longitud aproximada de los fragmentos N- y
C-terminales de la AK que conservan actividad. Por
lo tanto, la complementación de fragmentos se ha de realizar con
fragmentos escogidos entre estos límites. La complementación de
fragmentos dirigida por la cremallera se detecta de la siguiente
manera: se cotransforman BL21 con conjuntos apropiados de
deleciones, o con mezclas de conjuntos, se induce la expresión con
IPTG y se monitoriza el crecimiento en presencia de concentraciones
variables de G418. Se seleccionan las colonias grandes que crecen en
presencia de altas concentraciones de G418, puesto que producen los
productos de complementación más eficaces.
Una vez seleccionados los fragmentos óptimos, los
fragmentos individuales se eliminan por digestión de restricción con
Sph I y Kpn I, proporcionando regiones cebadoras 5' y
3' constantes que flanquean los fragmentos complementarios N- o
C-terminales de la AK. Estos oligonucleótidos (2 a 4
mg) se digieren con DNasa I (0,005 unidades/\mul, 100 \mul) y a
partir de agarosa de bajo punto de fusión se extraen fragmentos de
10 a 50 nucleótidos. Después se lleva a cabo una PCR con el ADN
fragmentado usando la polimerasa Taq (2,5 unidades/\mul) en una
mezcla para PCR que contiene dNTP 0,2 mM, Cl_{2}Mg 2,2 mM (o 0 mM
para una PCR subóptima), KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9,0, 0,1% de
TritonX-100. Un programa de PCR de 60 s a 94ºC; 30 s
a 94ºC; 30 s a 55ºC; 30 s a 72ºC, 30 a 50 veces; 5 min a 72ºC. Se
toman muestras cada 5 ciclos después de 25 ciclos para controlar la
aparición de fragmentos completos reensamblados en gel de agarosa.
El producto de PCR sin cebador se diluye después 1:40 ó 1:60 y se
usa como molde para la PCR, con oligonucleótidos 5', 3'
complementarios a la región constante como cebadores para otros 20
ciclos. El producto final se digiere por restricción con Sph
I y Kpn I, y los productos se vuelven a clonar en pQE32 con
cremallera para proporcionar la librería final de plásmidos de
expresión. Igual que antes, las células BL21 de E. coli se
transforman sucesivamente con vectores de expresión de fragmentos
C-terminales o N-terminales
complementarios, con una eficacia estimada de 109, y, finalmente,
las células se cotransforman con el fragmento complementario. E.
coli se cultiva en placas de agarosa que contienen 1 mg/ml de
G418, y al cabo de 16 horas se seleccionan las colonias más grandes
y se cultivan en medio líquido a concentraciones crecientes de G418.
Después se seleccionan aquellos clones que muestran la máxima
resistencia a G418 y, cuando se alcanza la resistencia máxima o
mayor, la evolución ha concluido. De lo contrario, se repite el
procedimiento de mezclado de ADN. Finalmente, los fragmentos óptimos
se secuencian, y se valoran las propiedades físicas y la actividad
enzimática. Este ECP de AK optimizado está ahora listo para la
selección dominante en cualquier otro tipo celular, incluidas las
levaduras y las líneas celulares de mamíferos. Esta estrategia se
puede usar para desarrollar cualquier ECP basado en enzimas que
confieren selección dominante o recesiva a un fármaco o una toxina,
o a enzimas que producen un producto teñido o fluorescente. En los
dos últimos casos, el punto final del proceso de evolución consiste
en el mínimo, en obtener de nuevo la señal para la enzima silvestre
intacta o en potenciar la señal. Esta estrategia también se puede
usar sin conocer la estructura de la enzima, independientemente de
si la enzima presenta una estructura mono-, di- o multimérica. Sin
embargo, el conocimiento de la estructura de la enzima tampoco
impide aplicar esta estrategia, como se describirá más adelante.
Como se puede apreciar, el conocimiento de la
estructura de la enzima se puede usar para proporcionar una forma
más eficaz de usar la evolución molecular para diseñar un ECP. En
este caso, la estructura de la enzima se usa para definir dominios
mínimos de la proteína en cuestión, como se hizo para la DHFR. En
lugar de generar fragmentos de longitud totalmente aleatoria para
los fragmentos N- o C-terminales, los autores
seleccionan, durante la fase de la exonucleasa, aquellos fragmentos
que como mínimo codifican uno de los dos dominio. Por ejemplo, en el
caso de la AK se pueden distinguir en la estructura dos dominios
bien definidos que constan de los residuos 1 a 94 en el extremo
N-terminal y de los residuos 95 a 267 en el extremo
C-terminal. Las digestiones con las endonucleasas se
realizan como anteriormente, pero se seleccionan los productos de
reacción que codifican como mínimo uno de los dos dominios. Éstos
constituyen entonces los puntos de partida para la selección de
fragmentos y los ciclos de evolución descritos anteriormente.
Otra realización más de la invención se refiere a
un ECP basado en el uso de enzimas heterodiméricas o
heteromultiméricas en las que toda la maquinaria catalítica está
contenida en una subunidad que se pliega independientemente y la
otra subunidad proporciona estabilidad y/o un cofactor para la
subunidad enzimática. En esta realización del ECP, la subunidad
reguladora se divide en fragmentos complementarios y se fusiona con
proteínas que interactúan. Estos fragmentos se
cotransforman/cotransfectan en células junto con la subunidad
enzimática. Al igual que en los ECP de enzimas sencillas descritos
para la DHFR y la AK, la reconstitución y detección de la actividad
enzimática depende del reensamblaje, asistido por el dominio de
oligomerización, de la subunidad reguladora a su topología nativa.
Sin embargo, la subunidad reconstituida interactúa después con la
subunidad enzimática intacta para producir actividad. Este
planteamiento recuerda al sistema USPS, excepto por que presenta la
ventaja de que la enzima no es en este caso una enzima celular
constitutiva sino más bien un producto génico exógeno. Puesto que no
hay problemas con la actividad de fondo de la célula huésped, la
enzima se puede expresar en niveles más altos que un gen natural, y
también se puede modificar para ser dirigida a compartimentos
subcelulares específicos (subclonando péptidos de señalización
específicos de compartimento en los extremos N- o
C-terminales de la enzima y de fragmentos de la
subunidad). La ventaja específica de este planteamiento reside en
que, mientras la estrategia de la enzima sencilla puede producir una
actividad enzimática subóptima, en este planteamiento la enzima se
pliega independientemente y puede actuar de hecho como chaperona
para la subunidad reguladora fragmentada, ayudándola a plegarse de
nuevo. Además, el plegado de los fragmentos puede no tener que ser
completo para conferir regulación a la enzima. Este planteamiento se
realiza mediante un ensayo colorimétrico/fluorimétrico desarrollado
por los autores, que se basa en la tirosinasa de
Streptomyces. Esta enzima cataliza la conversión de la
tirosina en desoxifenilalanina (DOPA). La reacción se puede medir
mediante la conversión de fluorocinil-tirosina en la
forma de DOPA. La enzima activa consta de dos subunidades, el
dominio catalítico (Melc2) y un dominio de unión a cobre (Melc1).
Melc1 es una proteína pequeña de 14 kDa que es absolutamente
necesaria para la actividad de Melc2. En el ensayo que los autores
están desarrollando, la proteína Melc1 se divide en dos fragmentos
que sirven de parte complementaria del ECP. Estos fragmentos,
fusionados a los dominios de oligomerización, se coexpresan con
Melc2, y la base del ensayo consiste en que la actividad de Melc2
depende de la complementación de los fragmentos de Melc1. También se
pueden abordar las estequiometrías de complejos proteicos (es decir,
si un complejo consta de dos o tres proteínas) de la siguiente
manera. Se fusionan dos proteínas a los dos fragmentos de Melc1 y
una tercera a Melc2 intacta. De este modo se puede demostrar que el
complejo activo complementario mínimo de la tirosinasa requerirá los
tres componentes y, por lo tanto, es necesario un trímero. Un
aspecto clave de este planteamiento reside en que se pueden
demostrar fácilmente interacciones específicas haciendo que un
componente, específicamente la subunidad catalítica de fusión
proteína-Melc2, dependa de los demás componentes
mediante su infraexpresión en segundo plano respecto a las fusiones
fragmento de Melc1-proteína sobreexpresadas.
Aunque los solicitantes únicamente han descrito
un ECP que comprende la complementación de fragmentos de proteínas
intactas, dominios proteicos o subunidades, una realización
alternativa se refiere a ECP basados en la ruptura de la interfase
entre, por ejemplo, una enzima dimérica que requiere una asociación
estable de las subunidades para poseer actividad catalítica. En
estos casos, una mutagénesis selectiva o aleatoria en la interfase
de las subunidades interrumpiría la interacción, y la base del
ensayo consistiría en que los dominios de oligomerización fusionados
a las subunidades proporcionaran la energía de unión necesaria para
juntar las subunidades en una enzima funcional.
En las estrategias del ECP expuestas se han usado
hasta ahora estrategias de transformación de dos plásmidos para la
expresión de los fragmentos complementarios. Este planteamiento
presenta algunas ventajas, tales como el uso de diferentes
marcadores de resistencia a fármacos para seleccionar la
incorporación óptima de genes, por ejemplo en células transformadas
o transfectadas, o la transformación óptima de los plásmidos en
bacterias y el control de los niveles de expresión de los fragmentos
del ECP usando diferentes promotores. Sin embargo, las estrategias
de un solo plásmido presentan ventajas en cuanto a la simplicidad de
la transfección/transformación. Los niveles de expresión de
proteínas se pueden controlar de diferentes maneras, mientras que la
selección de fármacos se puede lograr de una de las dos maneras: En
el caso de los ECP basados en un ensayo de supervivencia en el que
se usan enzimas que son ellas mismas marcadores de resistencia a
fármacos, tales como la AK, y cuando la enzima complementa una ruta
metabólica, tal como la DHFR, no es necesario incorporar genes de
resistencia a fármacos adicionales en los plásmidos de expresión.
Si, por el contrario, el ECP está basado en una enzima que produce
un producto teñido o fluorescente, tal como la tirosinasa o la
luciferasa de luciérnaga, el plásmido ha de expresar un gen de
resistencia a fármacos adicional. La expresión de fragmentos
complementarios del ECP y de las librerías de ADNc/genes diana
fusionados se puede reunir en un solo plásmido en forma de operones
individuales que están bajo el control de promotores inducibles o
constitutivos separados, o se pueden expresar policistrónicamente.
En E. coli, la expresión policistrónica se puede lograr
usando secuencias de regiones intercodificantes conocidas; por
ejemplo, los autores usan la región del operón mel, a partir del
cual derivaron los genes melc1 y melc2 de la tirosinasa que han
demostrado expresarse en altos niveles en E. coli bajo el
control de un promotor fuerte (tac). Los genes también se pueden
expresar e inducir a partir de promotores independientes, tales como
tac y arabinosa. Para los sistemas de expresión mamíferos, los
sistemas de un solo plásmido se pueden usar para la expresión tanto
transitoria como estable en líneas celulares y para la expresión
constitutiva o inducible. Asimismo se puede realizar un control
diferencial de la expresión de una de las fusiones de fragmentos
complementarios, normalmente del fragmento fusionado a un cebo, para
minimizar la expresión. Esto será importante para reducir el fondo
de interacciones inespecíficas. Ejemplos del control diferencial de
la expresión de fragmentos complementarios incluyen las siguientes
estrategias:
i) En la expresión policistrónica, la expresión,
transitoria o estable, del segundo gen será forzosamente menos
eficaz y, por lo tanto, puede servir por sí mismo para limitar la
cantidad de uno de los fragmentos complementarios. De forma
alternativa, la expresión del primer producto génico se puede
limitar mediante una mutación en un sitio donador/de ayuste cadena
arriba, mientras que el segundo gen se puede disponer bajo el
control de un sitio de iniciación interno retroviral, tal como el
del ECMV, para potenciar la expresión.
ii) Las parejas de fragmentos complementarios
fusionados individuales también se pueden disponer bajo el control
de promotores inducibles, disponibles todos ellos en el mercado,
incluidos aquellos que están basados en el promotor de PhCMV*-1 que
responde a Tet, y/o de elementos de respuesta a receptores
esteroideos. En un sistema de este tipo se pueden activar los dos
genes de fragmentos complementarios, y los niveles de expresión se
pueden controlar mediante la expresión dependiente de la dosis del
inductor, en estos casos la tetraciclina y las hormonas
esteroideas.
Una de las ventajas más importantes de los ECP
frente a otros procedimientos de cribado para identificar
interacciones moleculares reside en que están diseñados para
realizarlos tanto in vivo como en cualquier tipo celular.
Esta característica es crucial si el objetivo de la aplicación de
una técnica es identificar nuevas interacciones a partir de
librerías y, simultáneamente, ser capaz de determinar si las
interacciones observadas son biológicamente relevantes. El ejemplo
detallado expuesto a continuación y otros ejemplos al final de esta
sección ilustran la manera en que resulta posible validar
interacciones con un ECP. Esencialmente, se logra de la siguiente
manera. En las rutas bioquímicas, tales como la señalización mediada
por receptores de hormonas, una cascada de reacciones químicas
mediadas por enzimas se dispara a causa de algún acontecimiento, tal
como la unión de una hormona a su receptor en la superficie de la
membrana. Entonces se producen interacciones de enzimas con
sustratos proteicos e interacciones
proteína-proteína o proteína-ácido nucleico con
sustratos modificados por enzimas. Estas cascadas de señalización
bioquímicas sólo se producen en tipos celulares específicos y en
líneas celulares modelo para el estudio de estos procesos. Por lo
tanto, para detectar interacciones inducidas, por ejemplo con
proteínas conocidas en una ruta con proteínas aún no identificadas,
obviamente es necesario realizar tal cribado en líneas celulares
modelo apropiadas y en el compartimento celular correcto. Para
realizarlo, únicamente se puede usar de forma general la estrategia
del ECP. Las técnicas de interacción
proteína-molécula, tales como las técnicas de doble
o triple híbrido en levaduras, no pueden usarse en un contexto en el
que se producen tales acontecimientos, excepto en el caso límite de
la interacción nuclear en levaduras o en las interacciones que no se
disparan. Existen técnicas de doble híbrido en mamíferos con las que
es posible detectar interacciones de proteínas inducibles, pero, de
nuevo, únicamente si las proteínas implicadas se pueden activar
simultáneamente, transportar al núcleo e interactuar con sus
parejas. Los ECP no presentan estas limitaciones dado que no
requieren una maquinaria celular adicional, disponible únicamente en
compartimentos específicos. Un punto adicional consiste en que, al
usar la estrategia del ACP en tipos celulares modelo apropiados,
también es posible introducir controles positivos y negativos
apropiados para estudiar una ruta concreta. Por ejemplo, para una
ruta de señalización mediada por hormonas, es probable que se
conozcan los agonistas y antagonistas de la señalización mediada por
hormonas o mutantes dominantes negativos de las proteínas de la
cascada de señalización que se encuentran cadena arriba o actúan en
paralelo a los acontecimientos que se estén examinando en el ECP.
Estos reactivos se pueden usar para determinar si las nuevas
interacciones detectadas en el ECP son biológicamente relevantes. En
general, pues, las interacciones que se detectan únicamente si se
introduce la hormona pero no se observan cuando se introduce
simultáneamente un antagonista, podrían permitir la hipótesis de que
representan interacciones relevantes para el proceso que se está
estudiando.
A continuación se describe en detalle una
aplicación de la DHFR que ilustra estos puntos, así como ejemplos
adicionales en los que se puede usar la estrategia del ECP.
Uno de los acontecimientos que más temprano se
pueden detectar en la proliferación celular activada por factores de
crecimiento es la fosforilación de serina en la proteína S6 de la
subunidad ribosómica 40S. El descubrimiento de las serina/treonina
quinasas que fosforilan específicamente la S6 ha contribuido
considerablemente a la identificación de nuevas rutas de
transducción de señales mediadas por mitógenos. La serina/treonina
quinasa p70S6k se ha identificado como una fosforilasa específica de
S6^{131-136}. La p70S6k es activada por la
fosforilación de serina y treonina en sitios específicos en
respuesta a diversas señales mitogénicas, que incluyen suero en
células privadas de suero, factores de crecimiento que incluyen
insulina y PDGF, y por mitógenos tales como ésteres de forbol. En
los últimos cinco años se ha realizado un considerable esfuerzo para
determinar cómo se activa la p70/p85S6k en respuesta a mitógenos. En
la activación de la p70S6k se han implicado dos rutas mediadas por
receptores, una asociada con la
fosfatidilinositol-3-quinasa
(PI(3)k) y la otra con la mTOR homóloga a la
PI(3)k^{137-144}. La clave para
entender esta propuesta reside en el hecho de que el papel que
desempeñan estas enzimas en la activación de la p70S6k se determinó
por medio de los efectos ejercidos por dos productos naturales sobre
la fosforilación y la actividad enzimática: La rapamicina, que
inhibe indirectamente la actividad de mTOR, y la wortmanina, que
inhibe directamente la actividad de la PI(3)k.
Asimismo es importante señalar que hasta la fecha no se ha
identificado ninguna quinasa directa corriente arriba ni otras
proteínas reguladoras de la p70S6k.
Las interacciones de la p70S6k con su sustrato
conocido S6 se pueden estudiar como sistema de prueba para el ECP de
la DHFR en E. coli y en líneas celulares de mamíferos.
También se puede tratar de identificar nuevas interacciones con esta
enzima que proporcionen nuevas ideas acerca de cómo se regula esta
importante enzima. Puesto que la activación de la enzima es mediada
por múltiples rutas que se pueden inhibir selectivamente con
fármacos específicos, éste también es un sistema ideal para probar
los ECP como procedimientos para distinguir entre interacciones
proteína-proteína inducidas y constitutivas.
Esta prueba es ideal puesto que la Km aparente (=
250 nM) de la p70S6k para la proteína S6^{145} es aproximadamente
igual a la Kd para los péptidos formadores de cremalleras de leucina
de GCN4 usados en el sistema de ensayo de los autores. Sin embargo,
los autores tendrán que usar una forma constitutivamente activa de
la enzima para sus pruebas. Una forma de la enzima, truncada en el
extremo N-terminal, D77-p70S6k, es
constitutivamente activa y se usará en estos estudios^{147}.
Metodología: La fusión
D77-p70S6k-F[1,2] y la fusión
D77-p70S6k-F[3], o
F[1,2] y la fusión
D77-p70S6k-F[3] (como
control) se contransforman en E. coli y las células se
cultivan en medio mínimo en presencia de trimetoprim. Las colonias
se seleccionan y se expanden para analizar la actividad kinasa
frente a las subunidades ribosómicas 40S y coexpresar las dos
proteínas.
El cribado de una librería de expresión para
identificar interacciones con una diana dada
(p70S6k-D77 en este caso) resultará sencillo con
este sistema, dado que los únicos pasos implicados son: 1.
Construcción de la librería de expresión de fusiones en forma de una
fusión con el fragmento[3] de la DHFRm; 2. transformación de
la librería en E. coli BL21 que porta pRep4 (para la
expresión constitutiva del represor de lac; es necesario en el caso
en que un producto proteico sea tóxico para las células) y un
plásmido que codifica la fusión p70S6k-D77-[1,2]; 3.
cultivo en medio mínimo en presencia de trimetoprim e IPTG; 4.
selección de todas las colonias crecidas, propagación y aislamiento
del ADN plasmídico, seguido de la secuenciación de los insertos de
ADN; 5. purificación de los productos de fusión desconocidos
mediante el marcador hexaHis y determinación del tamaño en
SDS-PAGE.
En la Figura 5 se ilustra la estrategia general.
1. Construcción de una librería de expresión direccional de
fusiones:
(i) Producción de ADNc: Se puede aislar
poli(A)+ ARN a partir de células BA/F3 (células linfoides B)
puesto que estas células se han usado con éxito en el estudio de la
cascada de activación de p70S6k sensible a rapamicina^{139}. Para
enriquecer el ARNm de longitud completa, los autores purifican el
ARNm por afinidad a través de la estructura 5' cap usando el
procedimiento CAPture^{148}. Como cebador para la transcripción
inversa se usa un "cebador conector": presenta una cola de
poli(T) que sirve de cebador para la cola de ARNm
poli(A) y un sitio XhoI para el uso posterior en la
clonación direccional de los fragmentos. La primera cadena se
metila. Después de sintetizar la segunda cadena y hacer los
productos romos, se añaden "adaptadores de EcoRI". La
digestión de los conectores con EcoRI y XhoI (los
insertos están protegidos por metilación) proporciona ADNc de
longitud completa listo para la inserción direccional en un vector
abierto con EcoRI y XhoI. Puesto que el éxito del
cribado de la librería depende en gran medida de la calidad del ADNc
producido, los autores usan los procedimientos anteriores dado que
han demostrado producir sistemáticamente librerías de ADNc de alta
calidad.
(ii) Inserción del ADNc en los vectores: La
librería se construye en forma de fusión C-terminal
con F[3] de la DHFRm en el vector pQE-32
(Qiagen), puesto que con este vector se obtuvieron altos niveles de
expresión de las fusiones de DHFRm en células BL21. Se crean tres
vectores de este tipo que difieren en su extremo 3', que es el nuevo
sitio de policlonación que crearon los autores (descrito
anteriormente, en el punto Procedimientos) y que lleva 0, 1 ó 2
nucleótidos adicionales. Esto permite leer de principio a fin, desde
F[3] hasta los fragmentos de la librería, en los 3 marcos de
lectura traduccionales. Los fragmentos de ADNc se insertan
direccionalmente en los tres vectores a la vez, en los sitios
EcoRI y XhoI.
2, 3, 4 y 5: Estos pasos se describieron con
anterioridad, en el punto Resultados, excepto la secuenciación final
de los clones identificados usando cebadores de secuenciación
específicos para las secuencias vectoriales que flanquean los sitios
de inserción de la librería. La purificación de las proteínas
también se realiza según se describió anteriormente, mediante una
purificación de un solo paso en Ni-NTA (Qiagen). Si
el tamaño del producto superaba en más de 15 kDa el peso molecular
del componente DHFR (igual a un inserto de ADNc de más de 450 pb),
los autores secuenciaron los insertos en el Sheldon Biotechnology
Center (McGill University).
La transformación del sistema antes descrito
resulta útil para desarrollar un ensayo equivalente para uso en
células eucarióticas. El principio básico del ensayo es el mismo:
los fragmentos de la DHFRm se fusionan con dominios que se asocian,
y la asociación de los dominios se detecta mediante la
reconstitución de la actividad de la DHFR en células eucarióticas
(Figura 5).
Creación de las construcciones de
expresión: Los fragmentos de ADN que codifican las fusiones
cremallera de GCN4-fragmento de DHFRm se insertaron
enteros en pMT3, un vector eucariótico de expresión
transitoria^{126}. La expresión de las proteínas de fusión en
células COS quedó clara en SDS-PAGE después del
marcado con ^{35}[S]Met.
Ensayos de supervivencia de células
eucarióticas: Se pueden usar dos sistemas en paralelo para
detectar el reensamblaje de la DHFRm:
(i) Se cotransfectan células
CHO-DUKX B11 (línea celular de ovario de hámster
chino con actividad DHFR deficiente) con las fusiones cremallera de
GCN4-fragmento de DHFRm. Las células se cultivan en
ausencia de nucleótidos; únicamente las células que llevan la DHFR
reconstituida efectuarán una división celular y formarán colonias
normales.
(ii) Se crearon mutantes de la DHFRm resistentes
a metotrexato (MTX) con el fin de transfectar células que presentan
una actividad DHFR constitutiva, tales como las células COS y 293.
Los autores mutaron el F[1,2] con el fin de incorporar, de
una en una, cada una de las cinco mutaciones que aumentan
significativamente la Ki (MTX): Gly15Trp, Leu22Phe, Leu22Arg,
Phe31Ser y Phe34Ser (numeración de acuerdo con la secuencia de la
DHFRm silvestre). Estas mutaciones aparecen en distintas posiciones
respecto al sitio activo y al F[3], y presentan diferentes
efectos en la Km (DHF), la Km (NADPH) y la Vmax de las enzimas
completas de mamíferos en las que están. Los mutantes
Z-F[1,2: Leu22Phe],
Z-F[1,2: Leu22Arg] y
Z-F[1,2: Phe31Ser] permiten todos la
supervivencia bacteriana con altas tasas de crecimiento cuando se
cotransforman con Z-F[3] (resultados no
mostrados). Los cinco mutantes se ensayan en células eucarióticas en
cuanto a la reconstitución de los fragmentos de la DHFRm para
producir una enzima que puede mantener el crecimiento de las células
COS o 293 bajo la presión selectiva de MTX, que elimina el fondo
debido a la actividad de la enzima nativa. Las mutaciones ofrecen
una ventaja en la selección, mientras que no presentan ningún
inconveniente aparente respecto al reensamblaje de la enzima activa.
Si la DHFRm reconstituida producida en cualquiera de los ensayos de
supervivencia permite el crecimiento de las células eucarióticas,
que es significativamente más lento que el crecimiento con la enzima
silvestre, se añade timidilato al medio de cultivo para aliviar
parcialmente la presión selectiva ejercida por la falta de
nucleótidos.
En primer lugar es necesario comprobar si se
pueden detectar las interacciones con p70S60k inducidas. Se puede
usar el mismo sistema de prueba que el sistema de prueba de E.
coli antes descrito: Inducción de la asociación de p70S60k con
la proteína S6.
Se cotransfectan el mutante Leu22Phe de DHFR
S6-F[1,2] y
p70S6k-F[3], o F[1,2] y
p70S6k-F[3] (como control), en células COS y
las células se privan de suero durante 48 horas, después de lo cual
las células se vuelven a cultivar a baja densidad en suero y MTX.
Las colonias se seleccionan y se expanden para el análisis de la
actividad quinasa frente a las subunidades ribosómicas 40S y para la
coexpresión de las dos proteínas. Se realizan controles adicionales
respecto a la inhibición de la asociación de las proteínas con
wortmanina y rapamicina.
Se ha realizado ya una parte importante del
trabajo requerido para la creación de una librería para el uso en
células eucarióticas, puesto que el ADNc direccional
EcoRI/XhoI producido por el "Kit de síntesis de
ADNc" de Stratagene se puede insertar directamente en el vector
Zap Express® de Stratagene (Zap Express® es una marca registrada de
Stratagene Corporation, La Jolla, CA, EE.UU.).
Los pasos 1 a 5 son paralelos a los del cribado
de librerías bacterianas (anteriormente). 1. De nuevo, la librería
se construye en forma de fusión C-terminal con el
F[3] de DHFRm. El F[3] (sin codón de terminación) se
inserta en Zap Express®dentro del marco de lectura, seguido de la
inserción de los nuevos policonectores que permiten las expresión de
los insertos en los tres marcos de lectura (antes descrito) y del
ADNc direccional EcoRI/XhoI. Esta librería de
bacteriófagos se propaga y se trata con el fago auxiliar de
Stratagene para escindir un vector de expresión fagómido eucariótico
(pBK-CMV) que lleva los insertos de fusión. 2.
Cotransfección de la librería y las construcciones
p70S6k-F[1,2] en células eucarióticas: Los
autores realizan el cribado en células COS o 293, ya que éstas
responden al suero activando la vía de señalización de la p70S6k.
Los experimentos de selección se llevan a cabo según se describió en
el sistema de prueba de S6 anterior. 3. Se efectúa la propagación,
el aislamiento y la secuenciación del ADN insertado. 4. El tamaño de
las proteínas de fusión clonadas se determina en
SDS-PAGE mediante la visualización directa tras el
marcado con ^{35}S-Met/Cys o mediante
transferencia Western usando un anticuerpo policlonal comercial para
la DHFRm.
Generalización de la estrategia: El
esquema para la detección de parejas para la proteína p70S6k se
puede aplicar a estudios de cualquier ruta bioquímica en cualquier
organismo vivo. Estas rutas también se pueden relacionar con
procesos patológicos. La ruta relacionada con una enfermedad puede
ser un proceso intrínseco de las células en los seres humanos en los
que la patología resulta, por ejemplo, de la mutación, deleción o
infra- o sobreexpresión de un gen. De forma alternativa, la ruta
bioquímica puede ser específica de un organismo patógeno o el
mecanismo de invasión del huésped. En este caso, las proteínas
componentes de tales procesos pueden constituir dianas para una
estrategia terapéutica, tal como el desarrollo de fármacos que
inhiben la invasión por el organismo o una enzima componente de una
ruta bioquímica específica del organismo patógeno.
Las enfermedades inflamatorias representan un
caso que puede comprender ambos ejemplos. Se sabe que las
interacciones proteína-proteína que median la
adhesión de leucocitos a tejidos inflamados implican proteínas tales
como la molécula de adhesión a células vasculares 1
(VCAM-1) y ciertas citocinas, tales como la
IL-6 y la IL-8, que son producidas
durante la inflamación. Sin embargo, muchas de las proteínas
implicadas en la aparición de la respuesta inflamatoria siguen
siendo desconocidas; además, las vías de señalización intracelular
disparadas por la asociación extracelular no están muy claras. Los
ECP se podrían usar para elucidar los mecanismos subyacentes a la
aparición de la inflamación, así como la señalización subsiguiente.
Por ejemplo, las vías se señalización asociadas con inflamación,
tales como las que son mediadas por IL-1,
IL-6, IL-8 y el factor de necrosis
tumoral, se han estudiado con cierto detalle, y se conocen muchos
reguladores directos y corriente abajo. Estos reguladores se pueden
usar como dianas de partida en un cribado con un ECP para
identificar otras proteínas de señalización o moduladoras que puedan
constituir también dianas para el desarrollo de fármacos.
Existe un mayor riesgo de infección por agentes
patógenos entéricos en el caso de la inflamación intestinal que
caracteriza las enfermedades intestinales idiopáticas. Hay dos
mecanismos que faltan por entender y que se pueden abordar mediante
el ECP:
(i) Los mecanismos celulares de inflamación como
se describió anteriormente y
(ii) el descubrimiento de los ligandos
específicos en la superficie celular que reconocen los organismos
patógenos y con los que se asocian. Las proteínas secretadas
producidas por el agente patógeno se pueden unir a la membrana
basolateral de las células epiteliales (como en el caso de una
infección por Yersinia pseudotuberculosis) o translocarse al
interior de células epiteliales intestinales (infección por
Salmonella), provocando infectividad y/o respuestas
fisiológicas frente a la infección. Sin embargo, en la mayoría de
los casos, las interacciones entre la proteína patógena y las
células epiteliales son desconocidas.
Adhesión celular y regeneración del sistema
nervioso: Un ejemplo relacionado de la adhesión celular incluye
los procesos implicados en el desarrollo y la regeneración del
sistema nervioso. Las cadherinas son proteínas de membrana que
median la adhesión célula-célula dependiente de
calcio. Para ello necesitan otra clase de proteínas citoplasmáticas,
denominadas cateninas. Éstas forman un puente entre las cadherinas y
el citoesqueleto. Las cateninas también son genes reguladores que
controlan los genes específicos de la diferenciación. Por ejemplo,
la proteína \beta-catenina puede interactuar en
ciertas situaciones con un factor de transcripción
(lef-1) y translocarse al interior del núcleo, en el
que restringe el número de genes transactivados por
lef-1 (diferenciación). Este proceso es regulado por
la vía de señalización Wnt (homóloga a la ruta sin alas en
drosófila) mediante la inactivación de GSK3B, que permite la
degradación posterior de APC (una proteína adaptadora
citoplasmática). Las estrategias del ECP se podrían usar para
identificar nuevas proteínas implicadas en la regulación de estos
procesos.
Las proteínas implicadas en procesos de
integración vírica son ejemplos de dianas que se podrían ensayar
para identificar inhibidores usando las estrategias del ECP. Los
ejemplos para el virus VIH incluyen:
i) Inhibición de la integrasa o del transporte
del complejo de preintegración: proteína Ma o vpr.
ii) Inhibición del ciclo celular en G2 mediante
vpr (interacción mediante la ciclina B), causando la inducción de la
apoptosis.
iii) Inhibición de la interacción de la gp160
(precursor de las proteínas de membrana) con furina.
Proteínas accesorias de VIH como diana
terapéutica:
i) Vpr: Secuencia de localización nuclear
(diana): Sitio de interacción de vpr con las fosfatasas A.
ii) vif: Interacción con vimentina (proteína
asociada al citoesqueleto).
iii) Vpu: Degradación de CD4 en el RE mediada por
la parte citoplasmática de Vpu.
iv) nef: Señal de miristoilación de Nef.
En este ejemplo se ilustran otros ejemplos de
ensayos. La razón para desarrollar estos ensayos reside en
proporcionar estrategias de ECP alternativas que sean apropiadas
para problemas específicos de la asociación de proteínas, tales como
el estudio del equilibrio o de los aspectos cinéticos del
ensamblaje. Asimismo es posible que, en ciertos contextos (por
ejemplo, en tipos celulares específicos) o para ciertas
aplicaciones, no funcione un ECP específico pero sí uno alternativo.
A continuación se encuentran breves descripciones de cada una de las
realizaciones de ECP alternativas.
1)
Glutatión-S-transferasa
(GST). La GST del gusano plano Schistosoma japonicum es una
proteína monomérica pequeña (28 kDa) soluble que se puede expresar
en células tanto procarióticas como eucarióticas. Se esclareció una
estructura cristalina de alta resolución que sirvió de punto de
partida para el diseño de un ECP. Se desarrolló un ensayo
colorimétrico sencillo y económico para la actividad de la GST, que
consistía en la conjugación reductora de glutatión reducido con
1-cloro-2,4-dinitrobencina
(CNDB), un producto amarillo brillante. Los autores diseñaron un ECP
basado en criterios estructurales similares a los que se usaron para
desarrollar el ECP de la DHFR, usando cremalleras de leucina de GCN4
como dominios de oligomerización. Los cotransformantes de las
fusiones cremallera-fragmento de GST se expresan en
E. coli en placas de agar y las colonias se transfieren a
papel de nitrocelulosa. La detección de la complementación de
fragmentos se lleva a cabo mediante un ensayo en el que una mezcla
de reacción de glutatión-CDNB se aplica en forma de
aerosol sobre la nitrocelulosa y las colonias que expresan los
fragmentos de GST coexpresados se detectan como imágenes
amarillas.
2) Proteína fluorescente verde (GFP). La
GFP de Aequorea victoria se ha convertido en uno de los
marcadores de proteínas más popular para la expresión de genes. Esto
se debe a que la proteína monomérica pequeña, de 238 aminoácidos, es
intrínsecamente fluorescente a causa de la presencia de un cromóforo
interno que resulta de la ciclación autocatalítica del esqueleto
polipeptídico entre los residuos Ser65 y Gly67 y la oxidación del
enlace de Tyr66. El cromóforo de la GFP absorbe la luz óptimamente a
395 nm y posee también un segundo máximo de absorción a 470 nm. Esta
absorción biespecífica sugiere la existencia de dos conformómeros
del cromóforo de baja energía cuya población relativa depende del
entorno local del cromóforo. Un mutante, Ser65Thr, que elimina la
isomerización (único máximo de absorción a 488 nm) emite una
fluorescencia de 4 a 6 veces más intensa que el tipo silvestre.
Recientemente, dos grupos han esclarecido la estructura de la GFP,
convirtiéndola ahora en un candidato para el diseño de un ECP basado
en la estructura que los autores ya han comenzado a desarrollar. Al
igual que con el ensayo de la GST, todo el desarrollo inicial se
realiza en E. coli, con secuencias formadoras de cremalleras
de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización. Se usa una
detección directa de la fluorescencia mediante la observación visual
bajo luz UV de amplio espectro. Los autores también probarán este
sistema en células COS, seleccionando cotransfectantes mediante la
clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
3) Luciferasa de luciérnaga. La luciferasa
de luciérnaga es una proteína de 62 kDa que cataliza la oxidación de
la luciferina heterocíclica. El producto posee uno de los mayores
rendimientos cuánticos para las reacciones de bioluminiscencia: se
emite un fotón por cada molécula de luciferina oxidada. La
estructura de la luciferasa se ha esclarecido recientemente,
permitiendo el desarrollo de un ECP basado en la estructura. Al
igual que con el ensayo de la GST, las células se cultivan en una
matriz de nitrocelulosa. La adición de la luciferina a la superficie
de la nitrocelulosa permite su difusión a través de las membranas
citoplasmáticas y dispara la reacción de fotoluminiscencia. La
detección se realiza inmediatamente sobre una película fotográfica.
La luciferasa es un candidato ideal para un ECP: Los ensayos de
detección son rápidos, económicos y muy sensibles, y utilizan un
sustrato no radiactivo disponible en el mercado. El sustrato de la
luciferasa, la luciferina, es capaz de difundir a través de la
membrana citoplasmática (a pH ácido), permitiendo la detección de la
luciferasa en células intactas. Esta enzima se usa actualmente como
gen reportero en una diversidad de sistemas de expresión. La
expresión de esta proteína está bien caracterizada en células
bacterianas, mamíferas y vegetales, lo que sugiere que
proporcionaría un ECP versátil.
4) Xantina-guanina
fosforribosil transferasa (XGPRT). La enzima XGPRT de E.
coli convierte la xantina en el monofosfato de xantina (XMP), un
precursor de GMP. Puesto que la enzima de mamíferos
hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa
(HGPRT) únicamente es capaz de usar hipoxantina y guanina como
sustratos, se puede usar la XGPRT bacteriana como ensayo de
selección dominante para un ECP para células cultivadas en presencia
de xantina. Los vectores que expresan la XGPRT confieren a las
células de mamíferos la capacidad de crecer en medio selectivo que
contiene adenina, xantina y ácido micofenólico. La función del ácido
micofenólico consiste en inhibir la síntesis de novo de GMP
bloqueando la conversión de IMP a XMP (Chapman A.B. (1983) Molec.
& Cellul. Biol. 3, 1421-1429). El único GMP
producido proviene entonces de la conversión de xantina en XMP
catalizada por la XGPRT bacteriana. Al igual que con la
aminoglucósido fosfotransferasa, se pueden generar fragmentos de la
XGPRT en base a la estructura conocida (véase la Tabla 1) usando la
estrategia de diseño-evolución antes descrita, con
fragmentos fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como
dominios de oligomerización de ensayo. Se cotransfectan las fusiones
complementarias, y las proteínas se expresan de forma transitoria en
células COS-7 o se expresan de forma estable en
células CHO cultivadas en el medio selectivo. En el caso de las
células CHO, las colonias se recogen y se vuelven a cultivar
sucesivamente a concentraciones crecientes de los compuestos
selectivos, con el fin de enriquecer las poblaciones de células que
expresan eficazmente las fusiones a altas concentraciones.
5) Adenosina desaminasa. La adenosina
desaminasa (ADA) está presente en cantidades mínimas en
prácticamente todas las células de mamíferos. La ADA se puede usar
en un ensayo de selección dominante aunque no sea una enzima
esencial para el crecimiento celular. Es posible establecer
condiciones de crecimiento en las que las células precisan de la ADA
para sobrevivir. La ADA cataliza la conversión irreversible de
nucleósidos de adenina citotóxicos en sus respectivos análogos de
inosina no tóxicos. Cuando se añaden a las células concentraciones
citotóxicas de adenosina o de análogos de adenosina citotóxicos,
tales como
9-\beta-D-xilofuranosiladenina,
la ADA es necesaria para el crecimiento celular para destoxificar
el agente citotóxico. Las células que incorporan el gen de la ADA se
pueden seleccionar después para la amplificación en presencia de
bajas concentraciones de 2'-desoxicoformicina, un
inhibidor de la ADA análogo al estado de transición de unión fuerte.
La ADA se pueden usar, pues, para un ECP basado en la supervivencia
celular (Kaufman, R.J. y col. (1986) Proc. of the Nat. Acad. Sci.
(USA) 83, 3136-3140). Al igual que con los demás
sistemas descritos anteriormente, se pueden generar fragmentos de
ADA en base a la estructura conocida (véase la Tabla 1) usando la
estrategia de diseño-evolución antes descrita, con
los fragmentos fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como
dominios de oligomerización de ensayo. Se cotransfectan las fusiones
complementarias, y las proteínas se expresan de forma transitoria en
células COS-7 o se expresan de forma estable en
células CHO cultivadas en el medio selectivo que contiene
2'-desoxicoformicina. En el caso de las células CHO,
las colonias se recogen y se vuelven a cultivar sucesivamente a
concentraciones crecientes de 2'-desoxicoformicina,
con el fin de enriquecer las poblaciones de células que expresan
eficazmente las fusiones a altas concentraciones.
6) Proteína de unión a bleomicina (gen de
resistencia a zeocina). La zeocina, un miembro de la familia de
antibióticos bleomicina/fleomicina, es tóxica para bacterias,
hongos, plantas y células de mamíferos. La expresión del gen de
resistencia a zeomicina confiere resistencia a bleomicina/zeocina.
La proteína confiere resistencia uniéndose al fármaco y
secuestrándolo, previniendo así su asociación y la hidrólisis del
ADN. Berdy, J. (1980) en Amino Acid and Peptide Antibiotics,
J. Berdy, ed. (Boca Raton, FL: CRC Press), págs.
459-497; Mulsant, P., Tiraby, G., Kallerhoff, J. y
Perret, J. (1989 Somat. Cell. Mol. Genet. 14,
243-252). La proteína de unión a bleomicina (BBP) se
puede usar entonces para un ECP basado en la supervivencia celular.
Al igual que con los demás sistemas descritos anteriormente, se
pueden generar fragmentos de ADA en base a la estructura conocida
(véase la Tabla 1) usando la estrategia de
diseño-evolución antes descrita, con los fragmentos
fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de
oligomerización de ensayo. La BBP es un dímero pequeño (8 kDa) que
se une a los fármacos a través de un sitio de unión en la interfase
de las subunidades. Por esta razón, el diseño sería algo diferente
en cuanto a que primero se generaría una forma de cadena sencilla
del dímero fusionando dos genes de BBP con una corta secuencia que
codifica un conector polipeptídico sencillo introducido entre las
dos subunidades. En este caso, los fragmentos están basados en una
corta secuencia de uno de los módulos de una subunidad, mientras que
el otro fragmento está compuesto por la secuencia restante de la
subunidad más la otra subunidad. Los experimentos de complementación
y selección se realizan como se describió para los ejemplos
anteriores, usando bleomicina o zeocina como fármacos
selectivos.
7)
Higromicina-B-fosfotransferasa.
El antibiótico higromicina B es un aminociclitol que inhibe la
síntesis de proteínas interrumpiendo la translocación y provocando
errores de lectura. La enzima
higromicina-B-fosfotransferasa de
E. coli destoxifica las células fosforilando la higromicina
B. Cuando se expresa en células de mamífero, la
higromicina-B-fosfotransferasa es
capaz de conferir resistencia a la higromicina B (Gritz, L. y
Davies, L. (1983) Gene 25, 179-188). La enzima es un
marcador de la selección dominante y se puede usar para un ECP
basado en la supervivencia celular. Aunque no se conoce la
estructura de la enzima, se sospecha que esta enzima es homóloga a
la aminoglucósido quinasa (Shaw y col. (1993) Microbiol. Rev. 57,
138-163). Por lo tanto, es posible usar la
estrategia combinada de diseño/evolución para desarrollar un ECP con
esta enzima y realizar una selección dominante en células de
mamífero seleccionando a concentraciones crecientes de higromicina
B.
8) L-Histidinol NAD^{+}
oxidorreductasa. El gen hisD de Salmonella typhimurium
codifica la L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa,
que convierte el histidinol en histidina. Las células de mamífero
cultivadas en medios que carecen de histidina pero contienen
histidinol se pueden seleccionar respecto a la expresión de hisD
(Hartman, S.C., R.C. Mulligan (1988) Proc. of the Nat. Acad. Sci.
(USA) 85, 8047-8051). Una ventaja adicional del uso
de hisD en la selección dominante reside en que el histidinol es
tóxico por sí mismo, inhibiendo la actividad de la
histidil-tRNA sintetasa endógena. El histidinol
también es económico y penetra fácilmente en las células. La
estructura de la histidinol NAD^{+} oxidorreductasa es desconocida
y, de este modo, el desarrollo de un ECP basado en esta enzima se
basa enteramente en la estrategia de fragmentos de
exonucleasa/evolución.
La siguiente tabla enumera las realizaciones
alternativas en las que se usan otros reporteros para el ECP.
Abreviaturas en la tabla: Tipo: D, marcador de selección dominante;
R, marcador de selección recesiva. Estructura: Códigos de cuatro
letras = entradas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB); K,
conocida pero no depositada en el PDB; U, desconocida. Mono/oligo:
M, monómero; D, dímero; tetra, tetrámero.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Lista de otros posibles
candidatos para reporteros en el ECP
A -
Ensayos basados en la selección dominante o
recesiva
\newpage
ii - Ensayos de placas
virales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B - Ensayos de muerte
celular
C - Ensayo
colorimétrico/fluorimétrico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
D - Estrategias con
enzimas
heteroméricas
Hasta este momento únicamente se han
proporcionado ejemplos específicos de las aplicaciones del ECP a
interacciones entre parejas de proteínas. Sin embargo, es posible
aplicar el ECP a interacciones multiproteicas,
proteína-ARN, proteína-ADN o
proteína-molécula pequeña. Existen dos esquemas
generales para lograr tales sistemas. ECP para múltiples
subunidades: No es necesario que interactúen dos proteínas para que
se observe una señal en el ECP; si una proteína pareja o un complejo
proteico se une a dos proteínas simultáneamente, es posible detectar
un complejo de tres proteínas de este tipo. Un ECP para múltiples
subunidades se concibe en el ejemplo de la timidina quinasa (TK), un
homodímero de 40 kDa, del virus del herpes simple. En esta
concepción, la estructura de la TK contiene dos dominios bien
definidos que constan de un dominio alfa/beta (residuos
1-223) y de uno en alfa-hélice
(224-374). Como sistema de ensayo los autores usaron
el dímero Rop1, un homodímero de cuatro haces helicoidales. Los dos
fragmentos de la TK se extrajeron por PCR y se subclonaron en el
vector pMT3 de transfección transitoria, el primero en tándem
respecto al principal promotor tardío de adenovirus, líder
tripartito 3' respecto al primer ATG, y el segundo cadena abajo de
un sitio de iniciación interno de ECMV. Los sitios de restricción
introducidos previamente entre el primero y el último ATG se
subclonan en los sitios de clonación BamHI/KpnI y
PstI/EcoRI cadena abajo de los dos ATGs. Éstos se usan
para subclonar los fragmentos generados por PCR de las subunidades
de Rop1 en dos vectores diferentes. Seguidamente se cotransfectan
células Ltk con los dos plásmidos mediante lipofección, y las
colonias de células supervivientes se seleccionan en serie en medio
que contiene concentraciones crecientes de HAT (hipoxantina/
aminopterina/ timidina). Las células que expresan los fragmentos
complementarios de la TK fusionados con los cuatro Rop1 proliferarán
bajo esta presión selectiva o, de no ser así, morirán. Ejemplos
específicos del uso de este concepto consistirían en la
determinación de los constituyentes de complejos multiproteicos que
se forman de manera transitoria o constitutiva en las células.
La utilidad del ECP no está limitada a la
detección de interacciones proteína-proteína, sino
que se puede adaptar a la detección de interacciones de proteínas
con ADN, ARN o moléculas pequeñas. En esta concepción, se fusionan
dos proteínas con los fragmentos complementarios del ECP, pero las
dos proteínas no interactúan entre sí. La interacción ha de ser
desencadenada por una tercera entidad, que puede ser cualquier
molécula que se una simultáneamente a las dos proteínas o que
induzca una interacción entre las dos proteínas provocando un cambio
conformacional en una o ambas parejas. En el laboratorio de los
autores se demostraron dos ejemplos usando el ECP de la DHFRm en
E. coli. En el primer caso se usa un producto natural, el
fármaco inmunosupresor rapamicina, para inducir una interacción
entre su receptor FKBP12 y una proteína pareja TORm (diana de
rapamicina en mamíferos). Los autores la detectan por
cotransformación de los fragmentos de la DHFR fusionados con FKBP o
TORm en E. coli cultivado en presencia o ausencia de
trimetoprim (como se describió anteriormente) y rapamicina (0 a 10
nM). Los autores demostraron que el mantenimiento del crecimiento,
detectado mediante la formación de colonias, depende absolutamente
de la adición de rapamicina, lo que sugiere que el ECP de la DHFRm
detecta un ensamblaje de FKBP12-TORm inducido por
rapamicina y la reconstitución siguiente de la actividad DHFR. Este
es un ejemplo del uso de la estrategia del ECP para ensayar
moléculas pequeñas que pueden inducir interacciones entre proteínas.
Se puede aplicar de forma general al desarrollo terapéutico, en
forma del cribado de librerías de compuestos combinatoriales de
moléculas pequeñas respecto a moléculas que induzcan interacciones
entre proteínas capaces de inhibir las actividades de una o ambas
proteínas o de activar procesos celulares específicos que son
iniciados por otros acontecimientos, tales como la dimerización del
receptor mediada por un factor de crecimiento. El descubrimiento de
tales moléculas pequeñas podría conducir al desarrollo de fármacos
de administración oral para el tratamiento de un amplio espectro de
enfermedades humanas.
Otro ejemplo de una interacción inducida que se
ha estudiado con el ECP de la DHFR es la interacción del oncogen
GTPasa p21 ras con su diana directa cadena abajo, la serina/treonina
quinasa raf. Esta interacción se produce únicamente cuando la GTPasa
está en la forma unida a GTP, mientras que el cambio de GTP a GDP
provoca la liberación del complejo. Al igual que con el complejo
FKBP-TORm, los autores demostraron esta interacción
inducida en E. coli. El ECP se puede usar de manera general
para estudiar tales interacciones inducidas y para el cribado
respecto a compuestos que liberen o impidan estas interacciones en
estados patológicos. La interacción ras-raf misma
podría representar una diana para una intervención terapéutica. Las
formas oncogénicas de ras consisten en mutantes que son incapaces de
renovar el GTP y que, por lo tanto, permanecen asociados
permanentemente con ras activado. Esto provoca una señal
constitutiva de crecimiento incontrolado que, en parte, tiene como
resultado la oncogénesis. La identificación, mediante el ECP, de
compuestos que inhiban este proceso sería de gran valor en el
tratamiento amplio de cánceres. Otros ejemplos de aplicaciones
multimoleculares del ECP pueden incluir la identificación de nuevas
proteínas de unión a ADN o ARN. En su concepción más simple, se usa
un motivo conocido de unión a ADN o ARN, por ejemplo el dedo de cinc
del receptor de ácido retinoico, o una proteína sencilla de unión a
ARN, tal como IF-1, respectivamente. Una parte del
ECP consta del dominio de unión de la proteína al ADN o ARN
fusionado con uno de los fragmentos del ECP (fragmento control). El
fragmento complementario se fusiona con una librería de ADNc. Una
tercera entidad la constituye el gen que codifica una secuencia que
contiene un elemento que se sabe se une a la proteína control, y
detrás de esta secuencia se codifica un segundo posible o conocido
elemento regulador. Un sistema de ensayo consta de elementos tat/tar
que controlan la elongación en la transcripción/traducción de los
genes del VIH. Un ejemplo de aplicación consistiría en la
identificación de elementos de unión a tat, que se ha propuesto
existen en genomas eucarióticos y son capaces de regular genes de
una manera igual o similar a la de los genes del VIH (SenGupta, D.
J. y col. (1996) Proc. Natl. Acad. USA 6,
8496-8501).
Cribado de librerías combinatoriales de
compuestos respecto a aquellos que inhiben o inducen la formación de
complejos proteína-proteína/
proteína-ARN/ proteína-ADN. La
estrategia del ECP se puede aplicar directamente para identificar
moléculas potencialmente terapéuticas contenidas en librerías
combinatoriales de moléculas orgánicas. Es posible realizar un
cribado de alto rendimiento de tales librerías para identificar
compuestos que inhiban o induzcan interacciones
proteína-proteína o interacciones
proteína-ADN/ARN (como se comentó anteriormente).
Además, también es posible cribar respecto a compuestos que inhiban
enzimas cuyos sustratos son otras proteínas, ADN, ARN o
carbohidratos, como se comentará a continuación. En esta aplicación,
las proteínas que interactúan/ parejas de sustratos proteicos o
parejas de proteína-enzima control que se unen a
ADN/ARN se fusionan con los fragmentos complementarios del ECP, y
los plásmidos que portan estas parejas se transforman/transfectan en
una célula junto con un tercer elemento de ADN o ARN, según lo
requiera el caso. Las células transformadas/ transfectadas se
cultivan en medio de cultivo líquido, en placas de microvaloración
en las que cada pocillo se inocula con un único compuesto de una
serie de compuestos sintetizados de forma combinatorial. La lectura
de una respuesta depende del efecto del compuesto. Si el compuesto
inhibe una interacción de proteínas, se obtiene una respuesta
negativa (ninguna señal en el ECP es la respuesta positiva). Si el
compuesto induce una interacción de proteínas, la respuesta es una
señal positiva en el ECP. Los controles para los efectos
inespecíficos de los compuestos incluyen: 1) La demostración de que
el compuesto no afecta a la enzima del ECP misma (ensayo frente a
células transfectadas con la enzima intacta silvestre usada como
sonda para el ECP) y, en el caso de un ensayo de supervivencia
celular, de que el compuesto no es tóxico para las células que no se
han transformado/transfectado. Además de proporcionar un ensayo de
alto rendimiento para la actividad biológica de compuestos, el ECP
también ofrece la ventaja frente a los ensayos in vitro de
que es un ensayo para la permeabilidad de la membrana celular para
compuestos activos. Ejemplos específicos demostrados del ECP para el
cribado de fármacos en el laboratorio de los autores incluyen la
aplicación del ECP de la DHFR en E. coli a la detección de
compuestos que inhiben dianas terapéuticamente relevantes. Éstas
incluyen Bax/Bcl2, fkbp12/tor, ras/raf, el dominio de dimerización
carboxilo terminal de la proteína de la cápsida del
VIH-1, los dominios de dimerización de las lkB
quinasas IKK-1 e IKK-2 (cremalleras
de leucina y dominios
hélice-bucle-hélice). En cada caso,
las dos proteínas se subclonan 5' cadena arriba de F[1,2] o
F[3] como se describió anteriormente. Los plásmidos que
portan los fragmentos complementarios se cotransforman en células
BL21. Se escogen las colonias de las placas con medio mínimo que
contiene IPTG y trimetoprim y se cultivan en medio líquido en las
mismas condiciones selectivas, y los caldos concentrados se
congelan. Para un solo ciclo de cribado, se cultiva durante la noche
en medio LB un cultivo preparado a partir de los caldos concentrados
congelados. A cada pocillo de una placa de 384 pocillos se añaden
alícuotas de 25 ml de un medio mínimo selectivo que contiene
trimetoprim, ampicilina e IPTG. Después se inocula cada pocillo con
1 \mul de una muestra individual de una serie de compuestos
(ArQuie Inc.) para obtener una concentración final de 10 \muM.
Después se inocula cada pocillo con 2 ml del cultivo crecido durante
la noche, y las placas se incuban a 37ºC en un baño agitador
especialmente adaptado. Las placas se leen a intervalos de 2 horas
en un lector de placas espectroscópico de absorción óptica acoplado
a un ordenador con software para hojas de cálculo a 600 nm
(dispersión) durante un periodo de 8 horas. Las tasas de crecimiento
se calculan para cada pocillo a partir de las lecturas realizadas en
cada momento individual y se comparan con una curva patrón. Un
"éxito" se define como el caso en el que un compuesto
individual reduce la tasa de crecimiento a un valor inferior al
intervalo de confianza del 95% en base a la desviación típica para
las tasas de crecimiento observadas en todos los pocillos de la
placa de ensayo. Los "casi éxitos" se definen como aquellos
casos en los que las tasas de crecimiento se encuentran dentro del
intervalo de confianza del 95%. Para cada uno de los éxitos o casi
éxitos se realizan los siguientes controles: El mismo experimento se
lleva a cabo con células BL21 que se transforman con el vector vacío
(y sin trimetoprim) o con el vector que porta el gen completo de la
DHFRm, o con células cotransfectadas en las que la expresión de
proteínas no es inducida por IPTG. Si en todos estos casos el
compuesto no tiene efecto alguno, se puede concluir que rompe
específicamente la interacción proteína-proteína que
se está ensayando. Estos éxitos o casi éxitos validados se vuelven a
ensayar después para establecer una curva de
dosis-respuesta para el compuesto individual,
variando las concentraciones de 1 pM a 1 mM en órdenes de magnitud
de 10. La estrategia del ECP para el cribado de compuestos también
se puede aplicar a los casos multiproteicos de
proteína-ARN/ADN como se describió anteriormente, y
se puede adaptar fácilmente al ECP de la DHFR o a cualquier otro ECP
en E. coli o en versiones de los mismos ECP en levaduras.
Este cribado también se puede aplicar a enzimas cuyas dianas son
otras proteínas o ácidos nucleicos, para identificar parejas
enzima/sustrato conocidas o parejas enzima/sustrato nuevas como se
describe a continuación.
Las proteínas implicadas en los procesos de
integración vírica son ejemplos de dianas que se pueden ensayar para
identificar inhibidores usando las estrategias del ECP. Los ejemplos
para el virus VIH incluyen:
i) Inhibición de la integrasa o del transporte
del complejo de preintegración: proteína Ma o vpr.
ii) Inhibición del ciclo celular en G2 mediante
vpr (interacción mediante la ciclina B), causando la inducción de la
apoptosis.
iii) Inhibición de la interacción de la gp160
(precursor de las proteínas de membrana) con furina.
Proteínas accesorias de VIH como diana
terapéutica:
i) Vpr: Secuencia de localización nuclear
(diana): Sitio de interacción de vpr con las fosfatasas A.
ii) vif: Interacción con vimentina (proteína
asociada al citoesqueleto).
iii) Vpu: Degradación de CD4 en el RE mediada por
la parte citoplasmática de Vpu.
iv) nef: Señal de miristoilación de Nef.
Otras dianas generales para el cribado de
fármacos pueden incluir proteínas relacionadas con enfermedades
neurodegenerativas, tales como la alfa-sinucleína.
Esta proteína se ha relacionado con el inicio temprano de la
enfermedad de Parkinson, y actualmente también se ha implicado en la
enfermedad de Alzheimer. También existen proteínas
\beta-amiloides relacionadas con la enfermedad de
Alzheimer.
Un ejemplo de las interacciones
proteína-carbohidrato que constituirían una diana
para el cribado de fármacos incluye las selectinas, que están
implicadas generalmente en inflamaciones. Estas glicoproteínas de la
superficie celular están implicadas directamente en la
diapedesis.
Se pueden cribar numerosos genes supresores de
tumores cuyas acciones son mediadas por interacciones
proteína-proteína, para identificar posibles
compuestos anticancerígenos. Éstos incluyen PTEN, un supresor de
tumores implicado directamente en la formación de hamartomas.
También está implicado en el cáncer de mama y de tiroides congénito.
Otros genes interesantes supresores de tumores incluyen p53, Rb y
BARC1.
Los ejemplos antes descritos se usan para
identificar nuevas interacciones moleculares que implican moléculas
que meramente se unen entre sí. Sin embargo, la detección de los
sustratos de enzimas también es completamente compatible con la
estrategia del ECP, como se muestra a continuación:
i) Enzimas que forman complejos fuertes con
sustratos proteicos o inducen un ensamblaje eficaz de los fragmentos
del ECP o
ii) enzimas mutantes que se unen fuertemente al
sustrato pero que no liberan el producto debido a que los residuos
mutados están implicados en el ataque nucleofílico y/o en la
liberación del producto (retención del sustrato).
Las enzimas pueden formar complejos fuertes con
sus sustratos (Kd \sim1-10 mM). En estos casos, el
ECP puede ser suficientemente eficaz para detectar tales
interacciones. Sin embargo, incluso cuando esto no sea cierto, el
ECP puede funcionar para detectar interacciones más débiles. En
general, si la velocidad de catálisis y de liberación del producto
es más baja que la velocidad del plegado/reensamblaje de los
fragmentos complementarios del ECP, se habrá producido eficazmente
un plegado y una reconstitución irreversibles de la actividad
reportera del PCA. Por lo tanto, se detecta la señal del ECP incluso
cuando la enzima y el sustrato ya no están interactuando. Por lo
tanto, puede ser posible detectar nuevos sustratos de enzimas usando
el ECP, independientemente de la Kd efectiva del sustrato o la
velocidad de liberación del producto. En los casos en los que la
liberación del producto es mucho más rápida que el
ensamblaje/plegado de los fragmentos del ECP, se proporciona un
planteamiento alternativo que consiste en generar mutantes "que
retienen el sustrato" de la enzima de ensayo. Un ejemplo de este
planteamiento se ha aplicado a la proteína tirosina fosfatasa PTP1B,
para la cual se han generado mutantes que retienen el sustrato
mediante la mutación del aspartato 181 nucleofílico a alanina,
proporcionando una enzima catalíticamente inactiva pero capaz de
formar complejos fuertes con un sustrato conocido, el receptor del
EGF y otras proteínas desconocidas (Flint, A.J. y col. (1996) Proc.
Natl. Acad. USA 94, 1680-1685). A continuación se
proporciona una aplicación del uso del ECP para el cribado de
parejas que interactúan con la PTP1B. Los autores usan el ECP basado
en la aminoglucósido quinasa (AK) en células COS o 293 transfectadas
de forma transitoria. El dominio catalítico de la PTP1B, mutado para
retener el sustrato, se fusiona con el fragmento complementario
N-terminal de la AK, mientras que se realiza una
fusión C-terminal del otro fragmento de la AK con
una librería de ADNc. Las células se cotransfectan con parejas
complementarias de AK y se cultivan a concentraciones selectivas de
G418. Al cabo de 72 horas, se escogen las colonias de células
supervivientes y se realiza una PCR in situ usando cebadores
diseñados para alinearse con las regiones flanqueantes 3' y 5' de la
región codificante del ADNc. Después se secuencian en dirección 5'
los productos amplificados mediante la PCR para identificar el
gen.
Inhibidores de enzimas: Cribado de librerías
combinatoriales de compuestos para identificar a aquéllos que
inhiben los complejos enzima-sustrato PROTEICO
con:
i) Enzimas que forman complejos fuertes con
sustratos proteicos o
ii) enzimas mutantes que se unen fuertemente al
sustrato pero que no libera el producto debido a la mutación.
La estrategia del ECP se puede usar para generar
péptidos o proteínas con nuevas propiedades de unión que pueden
tener un valor terapéutico, como se está haciendo en la actualidad
con la tecnología de exposición en fagos. También es posible
desarrollar enzimas con nuevas propiedades físicas o de sustrato
para el desarrollo industrial de enzimas. A continuación se
proporcionan dos ejemplos detallados de la aplicación de la
estrategia del ECP a estas finalidades, con aplicaciones adicionales
expuestas a continuación.
1) Selección de secuencias de cremalleras de
leucina heterodimerizantes de alta afinidad (J. Pelletier, K.
Arndt, A. Plueckthun y S. Michnick, manuscrito en preparación). Se
usó el ECP de la DHFRm antes descrito en un esquema para la
selección de cremalleras de leucina diseñadas, eficaces en la
heterodimerización. Se ha propuesto que la formación de puentes
salinos entre residuos de carga positiva y negativa en las
posiciones de complementación "e" y "g" es importante para
estabilizar la formación de las cremalleras de leucina, aunque se ha
disputado esta opinión. Con el fin de ayudar a definir la
importancia de la formación de puentes salinos en las posiciones
"e" y "g", se construyeron dos librerías de cremalleras de
leucina. Ambas se basan en la secuencia de la cremallera de leucina
de GCN4 pero contienen información de secuencia específica para las
cremalleras de Jun o Fos con el fin de crear parejas
heterodimerizantes. Asimismo, las posiciones e-1 a
e-4 y g-1 a g-4 de
cada librería se aleatorizaron para codificar residuos de carga
positiva o negativa o residuos neutros polares. Estas librerías se
amplificaron por PCR y se subclonaron en las construcciones
Z-F[1,2] o Z-F[3]
(antes descritos) de las cuales se eliminaron las secuencias de la
cremallera de GCN4. Se realizó la selección mediante el ECP
bacteriano con DHFRm en medios sólidos selectivos como se describió
anteriormente. Se escogieron las colonias y se secuenciaron; el
análisis de las secuencias reveló que la distribución de los
residuos cargados o neutros en las parejas e-g no es
aleatoria sino que se inclina hacia el apareamiento de cargas
opuestas o el apareamiento de un residuo cargado con uno neutro en
lugar de hacia el apareamiento de cargas iguales (véase la Figura
7). Los autores siguieron el razonamiento de que un mejor
apareamiento de la cremallera conduciría a un aumento en la eficacia
de la complementación de los fragmentos de la DHFR, dando como
resultado unos tiempos de duplicación bacteriana más cortos (véase
la Tabla 1 en la descripción del ECP con la DHFRm), y llevaron a
cabo una selección/enriquecimiento de las cremalleras nuevas
respecto a las de GCN4 de la siguiente manera. Se cotransformaron
las librerías de cremalleras diseñadas, expresadas como fusiones
N-terminales con el F[1,2] o F[3] de
la DHFR, se escogieron los clones, se propagaron y se mezclaron en
un medio de cultivo líquido selectivo, y la mezcla se añadió al clon
Z-F[1,2] +
Z-F[3:I114A] (cremalleras de leucina
originales de GCN4) en una relación de 1:1.000.000. La mezcla se
propagó en un medio de cultivo líquido selectivo durante múltiples
pasadas. El análisis de restricción muestra que en 4 pasadas la
población de las bacterias que expresan GCN4 disminuye en relación
con las nuevas secuencias de cremallera (datos no mostrados), lo que
indica que algunos de los clones que contienen cremalleras diseñadas
se propagan a una velocidad mayor que los que contienen GCN4. Las
bacterias de pasadas posteriores se cultivaron en placas en medio
selectivo, y se secuenciaron clones individuales para revelar la
identidad de las parejas de cremalleras diseñadas de mayor éxito
(datos no mostrados).
2) Aplicación del ECP a la función y el diseño
enzimáticos. Desarrollo del ECP: La adenosina desaminasa
(ADA) cumple todos los criterios antes expuestos para un ECP. La ADA
es una metaloenzima monomérica con cinc pequeña (\sim40 kDa) y
fácilmente purificable, y se ha esclarecido la estructura de la ADA
murina. Se han desarrollado diversos ensayos in vitro de la
actividad de la ADA, que implican espectrofotometría UV y
fluorimetría de flujo detenido. La ADA de E. coli cataliza la
conversión irreversible de nucleósidos de adenina citotóxicos en
inosinas no tóxicas.
Las células eucarióticas o procarióticas
propagadas en presencia de concentraciones citotóxicas de adenosina
o de análogos de adenosina requieren la ADA para destoxificar estos
compuestos. Esta es la base de una estrategia de selección dominante
usada para seleccionar células que expresan un gen específico en
células de mamífero. El gen de la ADA también se ha expresado en
células de E. coli SF3834, que carecen del gen que codifica
la ADA endógena. Cuando el gen que codifica la ADA se introduce en
ADN bacteriano, las células que expresan la ADA son capaces de
sobrevivir a altas concentraciones de adenosina añadida; las que no
lo hacen, mueren. Esto constituye la base para un ensayo de la
actividad de ADA in vivo.
Los autores eligieron la ADA principalmente
porque se puede usar como marcador de selección dominante en células
bacterianas y de mamífero en las que el gen se ha eliminado. La
razón por la que los autores eligieron genes de selección dominante
reside en que en el cribado respecto a nuevas interacciones
proteína-proteína, concretamente en el ensayo de las
interacciones de una proteína conocida frente a una librería de
millones de clones independientes, la selección sirve de filtro para
las células que pueden mostrar una respuesta positiva por otros
motivos que no tienen nada que ver con una interacción
proteína-proteína específica. Los autores usaron
tres sistemas de ensayo para proteínas que interactúan, que incluyen
las secuencias que forman la cremallera de leucina, las proteínas
raf y p21 y el sistema de oligomerización inducida, la proteína de
unión a FK506 (FKBP) y TORm, que interactúan a través del compuesto
macrocíclico inmunosupresor rapamicina. Para todos estos sistemas
los autores construyeron plásmidos de transfección transitoria en
E. coli y células de mamífero y subclonaron las proteínas de
ensayo en forma de fusiones con fragmentos complementarios de la
ADA. El ensayo primario consiste en la supervivencia de las células
de E. coli SF3834 que han sido transformadas con los
fragmentos complementarios de ADA fusionados con las proteínas de
oligomerización de ensayo en presencia de concentraciones tóxicas de
adenosina. Después se purifican las proteínas de fusión a partir de
las colonias y se llevan a cabo ensayos in vitro de la
actividad de la ADA como se describe a continuación. La utilidad del
ECP con ADA como procedimiento para identificar proteínas nuevas que
interactúan con un cebo de ensayo se muestra en las células de
mamífero COS-7 y HEK-293T
transfectadas de forma transitoria con la FKBP fusionada con uno de
los fragmentos de la ADA y el otro fragmento fusionado con una
librería de ADNc procedente de bazo humano normal que contiene
10^{6} clones independientes. Al igual que con el ensayo en E.
coli, se recogen las células que sobreviven en un medio que
contiene concentraciones tóxicas de ADA y los plásmidos aislados se
ensayan para identificar el gen de la proteína que interactúa
mediante técnicas de amplificación por PCR y terminación de
cadena.
Motivos estructurales necesarios para la
función de la proteína: La determinación de los elementos
estructurales necesarios para la función enzimática de la ADA se
realiza alterando las estructuras de los fragmentos de la enzima. En
primer lugar, la ADA se corta en dos dominios separados, uno de
ellos responsable de la unión al sustrato (residuos 1 a 210) y el
otro responsable de la catálisis (residuos 211 a 352). Estos trozos
separados se unen a dominios de ensamblaje conocidos, tales como
cremalleras de leucina (véase el ejemplo 1 anterior). El
reensamblaje restablece la actividad, la cual se valora mediante un
análisis cinético detallado in vitro de las propiedades de
unión y catalíticas de la enzima reensamblada, usando
espectrofotometría UV y fluorimetría de flujo detenido para observar
las reacciones enzimáticas. Este sistema constituye otra posibilidad
para manipular la actividad enzimática, que proporcionará una
poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos enzimáticos.
Por ejemplo, la diferencia en el comportamiento cinético entre la
enzima reensamblada después de mezclarla con el sustrato y la enzima
reensamblada en presencia del sustrato (donde el sustrato puede
estar unido ya al dominio de unión) permitirá realizar un estudio
sofisticado sobre la importancia de la energía de unión en la
catálisis. Mutaciones puntuales posteriores en los dominios
funcionales o de ensamblaje de las proteínas permitirá entonces
obtener perturbaciones muy sutiles y una cuantificación detallada de
la relación entre la energía de unión y la catálisis. Este control
preciso de la estructura y el ensamblaje de dominios funcionales
separados de la enzima permitirá realizar estudios muy sofisticados
sobre la estructura y función enzimáticas, definir motivos
estructurales y comprender su papel en la catálisis.
Diseño de nuevos catalizadores proteicos:
El conocimiento detallado del mecanismo enzimático adquirido a
partir de la determinación de los requisitos estructurales para la
catálisis se puede explotar mediante la combinación de estos
"bloques constructivos" funcionales con los motivos funcionales
responsables de la unión al sustrato y de la catálisis en otras
enzimas, lo que permite la generación de nuevos catalizadores
proteicos. Por ejemplo, el motivo catalítico de la ADA se modifica
para dar un motivo de unión a citidina, creando una enzima nueva con
propiedades catalíticas potencialmente útiles. La actividad de estas
nuevas enzimas se puede valorar fácilmente mediante ensayos in
vivo similares a los del sistema de ECP o mediante ensayos de
actividad in vitro. Además, la investigación detallada del
mecanismo de las enzimas resultantes, posiblemente con este sistema,
permitirá realizar un diseño racional de cada una de las
generaciones siguientes de catalizadores.
Resulta lógico extender las descripciones de las
aplicaciones anteriores del ECP a la utilidad de estas técnicas en
organismos modelo completos, tales como, por ejemplo, drosófila,
nemátodos, pez cebra y pez globo. Las únicas diferencias respecto a
los otros ejemplos expuestos reside en que los vectores usados
tendrán que ser diferentes (por ejemplo, vectores retrovíricos) y en
que cualquier sustrato necesario para el ECP tendrá que estar
biodisponible o la detección tendrá que realizarse in
situ.
Otra realización importante de la invención
consiste en proporcionar un medio y un procedimiento para la terapia
génica de enfermedades en mamíferos. De especial interés es el uso
terapéutico del ECP para el tratamiento del cáncer. En una
realización de dicha terapia génica con el ECP, se desarrolla un ECP
que usa fragmentos (unidades proteicas modulares) procedentes de una
toxina proteica, por ejemplo: la exotoxina de Pseudomonas, la
toxina diftérica y la toxina vegetal gelonina, u otras moléculas
similares. Para el tratamiento del cáncer de mama, por ejemplo, se
prepara en primer lugar una construcción génica cromosómica
artificial eucariótica (EAC), de mamífero, de retrovirus o de
adenovirus que introduce un fragmento de la toxina seleccionada bajo
el control del promotor para la expresión del oncogen erbB2.
Se sabe que el oncogen erbB2 está sobreexpresado en el cáncer
de mama y en las células de adenocarcinoma (D.J. Slamon y col.,
Science, 1989, 244, 707). El protooncogen HER2/neu
(c-erbB-2) codifica un receptor
transmembranal de factor de crecimiento con actividad proteína
tirosina quinasa, de 185 kDa, de la subclase 1, la p185^{HER2}.
Asimismo, el oncogen erbB2 humano está situado en el
cromosoma 17, región q21, y comprende 4.480 pares de bases, y la
p185^{HER2} sirve de receptor para un factor de crecimiento
glicoproteico de 30 kDa secretado por las líneas celulares de cáncer
de mama humano (R. Lupu y col., Science, 1990, 249, 1152).
El transgen se introduce in vivo o ex
vivo en las células diana usando procedimientos conocidos para
los expertos en la técnica, por ejemplo recombinación homóloga para
insertar el transgen en el locus de interés por vía retroviral,
adenoviral o EAC. Una segunda construcción génica comprende un gen
de fusión que contiene un ADN diana que codifica una proteína que
interactúa con el oncogen erbB2, descubierta mediante el
proceso de ECP descrito en esta invención, y el "segundo"
fragmento de la molécula de la toxina. Esta construcción se
administra al paciente por medio de procedimientos conocidos en la
técnica, por ejemplo como se muestra en las patentes de Estados
Unidos nº 5.399.346 y 5.585.237, cuyo contenido completo se
incorpora en la presente memoria por referencia. La expresión del
transgen oncogen erbB2-fragmento de toxina
descrito se encuentra ahora bajo el control del promotor
constitutivo del oncogen. Las células tumorales que proliferan
producirán, pues, un trozo de la toxina fusionado al oncogen
erbB2. En presencia de la segunda construcción génica, que
expresa la "proteína que interactúa con el oncogen erbB2
descubierta mediante el ECP - fragmento de toxina", se creará
oncogen erbB2-fragmento de toxina A:proteína
que interactúa-fragmento de toxina B que induce la
muerte de las células tumorales objetivo a través de la creación de
una toxina activa mediante la complementación de fragmentos
proteicos, proporcionando así un tratamiento eficaz y eficiente para
dicha enfermedad.
Esto se puede extender a otras enfermedades y a
otras toxinas, usando las técnicas descritas y realizadas en esta
invención.
Cualquiera de las estrategias del ECP antes
descritas se pueden adaptar a la detección in vitro. Sin
embargo, a diferencia de los ECP in vivo, la detección se
realiza con proteínas de fusión de fragmentos del ECP purificadas.
Estos usos del ECP presentan un potencial para el uso en kits
diagnósticos. Por ejemplo, el ensayo con la DHFR antes descrito, en
el que los dominios de interacción son FKBP12 y TOR, se puede usar
como prueba diagnóstica de las concentraciones de rapamicina para
monitorizar la dosificación en pacientes tratados con este
fármaco.
Como se mostró anteriormente, la presente
invención:
1) Permite la detección de interacciones
proteína-proteína in vivo o in
vitro.
2) Permite la detección de interacciones
proteína-proteína en contextos apropiados, tales
como en un organismo, tipo celular, compartimento celular u orgánulo
específico.
3) Permite la detección de interacciones
proteína-proteína inducidas frente a constitutivas
(por ejemplo, mediante un factor de crecimiento o inhibidor
celular).
4) Es capaz de distinguir entre interacciones
proteína-proteína específicas e inespecíficas
controlando la sensibilidad del ensayo.
5) Permite la determinación de la cinética del
ensamblaje de proteínas en las células.
6) Permite el cribado de librerías de ADNc para
identificar interacciones proteína-proteína.
Se pueden demostrar aspectos adicionales de la
invención mediante la identificación de nuevas interacciones con la
enzima p70S6k, para determinar su regulación y la manera en que
diferentes cascadas de señalización convergen en esta enzima.
El procedimiento del ECP es especialmente útil
para la determinación de la cinética del ensamblaje de proteínas en
células. La cinética del ensamblaje de proteínas se puede determinar
usando sistemas proteicos fluorescentes.
En una realización adicional de la invención, el
ECP se puede usar para el cribado de fármacos. Las técnicas del ECP
se usan para identificar fármacos que bloqueen rutas bioquímicas
específicas en las células, proporcionando un procedimiento
cuidadosamente dirigido y controlado para la identificación de
productos que presentan propiedades farmacológicas útiles.
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fragmentos proteicos; DHFRm, dihidrofolato reductasa murina; DHFRh,
dihidrofolato reductasa humana; Z-F[1,2],
cremallera de leucina de GCN4-fragmento[1,2]
de la DHFRm; USPS, técnica de sensor de proteínas escindidas basado
en ubiquitina; IPTG,
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido;
PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo; SDS-PAGE,
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.
Claims (22)
1. Un ensayo de complementación de fragmentos
proteicos para la detección de interacciones moleculares que
comprende el reensamblaje de fragmentos separados de una proteína,
en el que el reensamblaje de los fragmentos proteicos se efectúa
mediante la interacción de dominios moleculares fusionados con cada
fragmento proteico, en el que el reensamblaje de los fragmentos
proteicos es independiente de otros procesos moleculares y en el que
dicho reensamblaje se detecta por medio de la reconstitución de la
actividad de dicha proteína.
2. El ensayo según la reivindicación 1, en el que
la proteína es una proteína monomérica.
3. El ensayo según la reivindicación 1, en el que
la proteína es una enzima.
4. El ensayo según la reivindicación 3, en el que
la enzima es una enzima monomérica.
5. El ensayo según la reivindicación 3 ó 4, en el
que la enzima presenta un peso molecular de 10 a 40 kDa.
6. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la
glutatión-S-transferasa.
7. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la dihidrofolato
reductasa.
8. El ensayo según la reivindicación 7, en el que
la dihidrofolato reductasa se muta en el residuo de aminoácido
114.
9. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la luciferasa.
10. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la
xantina-guanina fosforribosil transferasa.
11. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es una adenosina
desaminasa.
12. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es una
higromicina-B-fosfotransferasa.
13. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la
L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa.
14. El ensayo según la reivindicación 2, en el
que la proteína es una proteína fluorescente verde.
15. El ensayo según la reivindicación 14, en el
que la proteína fluorescente verde se muta en el residuo de
aminoácido 65.
16. El ensayo según la reivindicación 2, en el
que la proteína es una proteína de unión a bleomicina (gen de
resistencia a zeomicina).
17. Un procedimiento para la detección de
interacciones proteína-proteína en organismos vivos
no humanos y/o en células no humanas y/o en células humanas que se
aíslan y/o cultivan, comprendiendo el procedimiento los siguientes
pasos:
(a) Síntesis de fragmentos proteicos sonda de una
enzima que permita la selección dominante por división del gen que
codifica la enzima en al menos dos fragmentos;
(b) construcción de proteínas de fusión que
consisten en los fragmentos proteicos sonda unidos a dominios
moleculares que se han de ensayar respecto a sus interacciones;
(c) coexpresión de las proteínas de fusión; y
(d) detección de la reconstitución de la
actividad enzimática usando el ensayo de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 13.
18. El procedimiento según la reivindicación 17,
en el que la coexpresión de las proteínas de fusión complementarias
es catalizada por la unión de dichos dominios moleculares entre
sí.
19. El procedimiento según la reivindicación 17 ó
18, en el que la enzima es la dihidrofolato reductasa.
20. El procedimiento según la reivindicación 19,
en el que las proteínas de fusión presentan péptidos que consisten
en los fragmentos N- y C-terminales de dicha
dihidrofolato reductasa y están fusionadas con las secuencias de la
cremallera de leucina de GCN4.
21. Un procedimiento para el cribado de una
librería de expresión, que comprende la realización de un ensayo de
complementación de proteínas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 en el que el medio de detección de dicho
ensayo es la reconstitución de la actividad de la proteína.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
en el que existe una interacción entre partes de una primera o una
segunda molécula debido a la presencia de al menos una molécula
adicional que media la interacción.
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