TW202132340A - 治療白血病之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於使用與人類CD33和人類CD3特異性結合的雙特異性抗體構建體的白血病治療方法。特別地，本發明關於在有需要的患者中治療骨髓性白血病，包括復發/難治性骨髓性白血病之方法，該方法包括向該患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中每個起始週期和維持週期包括根據特定劑量方案投與該雙特異性抗體構建體。還揭露了用於在本方法中使用的包含該等雙特異性抗體構建體的藥物組成物。

Description

治療白血病之方法
本發明關於免疫腫瘤學和生物藥劑學領域。特別地，本發明關於藉由在至少一個起始週期和一個維持週期中投與與CD33和CD3特異性結合之雙特異性抗體構建體來治療骨髓性白血病之方法，其中該起始週期和維持週期各自包括根據具體給藥方案投與該雙特異性抗體構建體。
急性骨髓性白血病（AML）係美國（US）成年人中最常見的急性白血病形式，其發病率上升可能是由於人口老齡化，環境暴露增加、以及以前暴露於化學療法和治療性放射的癌症倖存者人數增加。2016年，在美國估計有19,950例新的AML病例，其中約10,430例死於該疾病（美國癌症協會，2016）。
大多數AML患者的預後仍然很差（Burnett等人, J. Clin. Oncol. [臨床腫瘤學雜誌], 第29卷: 487-494, 2011）。特別地，在大多數患者中復發的疾病與不滿意的預後相關（Ravandi, Best Pract. Res. Clin. Haematol. [臨床血液學最佳實踐和研究], 第26卷: 253-259, 2013）。儘管大多數AML患者最初會達到完全緩解（CR），但超過60%的患者將在不同的緩解期後最終復發。使用傳統的細胞毒性化學療法方案，獲得第二CR的可能性很低，特別是如果第一CR的持續時間短（Estey等人, Blood [血液], 第88卷: 756, 1996）。對於患有原發性難治性疾病但從未達到形態反應的患者尤其如此。例如，對一個療程的高劑量含阿糖胞苷（HiDAC）方案難治的AML患者的中位總生存期僅為3.8個月（Ravandi等人, Blood [血液], 第116卷: 5818-5823, 2010）。傳統上，最初CR持續時間超過1年的患者已經接受過含HiDAC的挽救方案的治療，但是只有少數患者獲得了第二CR，並且許多人都不是潛在治癒性同種異體造血幹細胞移植的候選人（Estey, Leukemia, 第14卷: 476-479, 2000）。除了第一CR的持續時間外，首次復發的其他預測因素包括年齡、細胞遺傳學以及患者是否在第一CR中接受了同種異體造血幹細胞移植（Breems等人, J. Clin. Oncol. [臨床腫瘤學雜誌], 第23卷: 1969-1978, 2005）。然而，在Breems等人（2005）的研究報告中，只有少數首次復發的AML患者具有成功的長期預後，而大多數復發或難治性AML患者的長期預後仍然不利。
分化簇33（CD33）為治療AML患者提供了有用的靶抗原，因為它在平均抗原密度非常高的AML患者的80%以上白血病分離株的細胞表面表現（Tanimoto等人, Leukemia [白血病], 第3卷: 339-348, 1989; Scheinberg等人, Leukemia [白血病], 第3卷: 440-445, 1989）。它在造血系統以外的組織上不表現，是否由正常的多能造血幹細胞表現一直係爭論的焦點（Taussig等人, Blood [血液], 第106卷: 4086-4092, 2005；Pearce等人, Cell Cycle [細胞週期], 第5卷: 271-273, 2006）。已經顯示出針對CD33的原型未軛合單株抗體HuM195在結合CD33抗原後迅速內在化到靶細胞中（Caron等人, Cancer [癌症], 第73卷: 1049-1056, 1994）。將卡奇黴素（Calicheamicin）（一種有效的抗腫瘤抗生素）與CD33抗體偶聯，所得的奧-吉妥珠單抗（Gemtuzumab ozogamicin）（GO）在首次復發時可在約30%的AML老年患者（＞ 60歲）中有效產生應答（Sievers等人, Blood [血液], 第93卷: 3678-3684, 1999）。這導致該藥物被加速批准用做相同人群的單一藥劑。然而，未能在證實性試驗中證明其臨床益處，以及對靜脈阻塞性疾病風險增加的擔憂，導致製造商自願將其撤出市場（Ravandi, J. Clin. Oncol. [臨床腫瘤學雜誌], 第29卷: 349-351, 2011）。然而，在許多隨機化的歐洲試驗中已證明了其低劑量與化學療法組合時的功效，證明CD33係AML治療性藥物開發的重要靶標（Castaigne等人, Lancet [柳葉刀], 第379卷: 1508-1516, 2012；Ravandi等人, J. Clin. Oncol. [臨床腫瘤學雜誌], 第30卷: 3921-3923, 2012；Burnett等人, J. Clin. Oncol. [臨床腫瘤學雜誌], 第29卷: 369-377, 2011）。
因此，仍然需要新穎有效的療法，例如靶向CD33的療法，用於治療骨髓性白血病和其他骨髓性惡性腫瘤，特別是對於長期預後較差的復發或難治性AML患者。
本發明部分地基於抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的治療方案的鑒定，該治療方案有效治療骨髓性白血病，特別是復發性或難治性急性骨髓性白血病。因此，在一個實施方式中，本發明提供了一種在有需要的患者中治療骨髓性白血病之方法，該方法包括向該患者投與至少一個起始週期和至少一個維持週期的特異性結合CD33和CD3的雙特異性抗體構建體。
在某些實施方式中，起始週期包括在第一時間段（例如約5天至約30天，或約7天至約14天）內以1天至4天的間隔以一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在一些實施方式中，起始週期包括在第一時間段內每天（例如每天一次）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體，例如每天一次持續7天或每天一次持續14天。在其他實施方式中，起始週期包括在第一時間段（例如14天）內每隔一天（例如Q2D）或每三天一次（例如Q3D）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在仍其他實施方式中，起始週期包括每四天一次（例如Q4D）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體，持續7天或14天。
在起始週期內投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的一個或多個劑量可以在每個給藥間隔為約18 μg至約480 μg，例如在每個給藥間隔約36 μg至約480 μg、約72 μg至約480 μg、約110 μg至約360 μg、約18 μg至約240 μg、或約100 μg至約180 μg。在某些實施方式中，在起始週期期間投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量在每個間隔係相同的（例如，整個週期的固定劑量）。在替代實施方式中，在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量從一個給藥間隔到隨後的給藥間隔變化。例如，在一個實施方式中，在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量在該週期期間在一個或多個間隔增加至少一次（例如階梯給藥）。
在起始週期期間採用階梯給藥方案的一些實施方式中，該起始週期包括以第一劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第二劑量大於第一劑量。可以使用一個或多個劑量增加或劑量階梯，例如2、3、4、5、6或7或更多個劑量階梯。例如，在使用兩個劑量階梯（即，投與三個不同劑量）的此類實施方式中，起始週期包括以第一劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第三劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在一些實施方式中，使用三個劑量階梯（即，投與四個不同劑量），在這種情況下，起始週期可以包括以第一劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第三劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第四劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在某些實施方式中，使用四個劑量階梯（即，投與五個不同劑量），在這種情況下，起始週期可以包括以第一劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第三劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔投與，隨後以第四劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第五劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在某些其他實施方式中，使用五個劑量階梯（即，投與六個不同劑量），在這種情況下，起始週期可以包括以第一劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第三劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第四劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第五劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第六劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第六劑量大於第五劑量，第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在起始週期中採用的階梯給藥方案的給藥間隔可以是每天、每兩天一次、每三天一次或每四天一次。在一個特定的實施方式中，在起始週期期間採用的階梯給藥方案的給藥間隔係每天（例如每天一次）。
抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的階梯劑量可以是本文所述之起始週期內投與範圍內的任何劑量，例如約18 μg至約480 μg、約36 μg至約480 μg、約72 μg至約480 μg、約110 μg至約360 μg、約18 μg至約240 μg、或約100 μg至約180 μg。在某些實施方式中，第一劑量為約18 μg至約150μg，第二劑量為約110 μg至約240 μg，其中第二劑量大於第一劑量。在其他實施方式中，第一劑量為約18 μg至約110 μg，第二劑量為約72 μg至約160 μg，其中第二劑量大於第一劑量。在一個實施方式中，第一劑量為約36 μg，第二劑量為約72 μg。在採用兩個劑量階梯的實施方式中（即在起始週期中投與三個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約150 μg，第二劑量可以為約110 μg至約240 μg，並且第三劑量可以為約150 μg至約360 μg，其中第三劑量大於第二劑量且第二劑量大於第一劑量。在採用三個劑量階梯的其他實施方式中（即在起始週期中投與四個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約150 μg，第二劑量可以為約110 μg至約240 μg，第三劑量可以為約150 μg至約360 μg，並且第四劑量可以為約180 μg至約480 μg，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在採用三個劑量階梯的某些其他實施方式中（即在起始週期中投與四個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約110 μg，第二劑量可以為約36 μg至約160 μg，第三劑量可以為約72 μg至約240 μg，並且第四劑量可以為約110 μg至約480 μg，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在一個特定的實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，並且第四劑量為約110 μg。
在採用四個劑量階梯的一些實施方式中（即在起始週期中投與五個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約110 μg，第二劑量可以為約36 μg至約160 μg，第三劑量可以為約72 μg至約240 μg，第四劑量可以為約110 μg至約360 μg，並且第五劑量可以為約160 μg至約480 μg，其中第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在一個這樣的實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，第四劑量為約110 μg，第五劑量為約160 μg。在採用五個劑量階梯的實施方式中（即在起始週期中投與六個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約72 μg，第二劑量可以為約36 μg至約110 μg，第三劑量可以為約72 μg至約160 μg，第四劑量可以為約110 μg至約240 μg，第五劑量可以為約160 μg至約360 μg，並且第六劑量可以為約240 μg至約480 μg，其中第六劑量大於第五劑量，第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在某些此類實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，第四劑量為約110 μg，第五劑量為約160 μg，第六劑量為約240 μg。
在本發明之方法的某些實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次（例如每週一次或每週兩次）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續第二時間段時間，例如約14天至約60天、約15天至約30天、或約14天至約28天。根據本發明之方法，在起始週期之後投與維持週期。在一個較佳的實施方式中，在完成起始週期後的第二天啟動維持週期，例如在起始週期和維持週期之間沒有無治療時間段。患者可以接受多個維持週期，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個或更多個維持週期。在一些實施方式中，向患者投與維持週期，直到患者對治療作出反應，例如達到完全緩解。
在維持週期期間，在本發明之方法的一些實施方式中，每週一次或每週兩次向患者投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量可以為約36 μg至約480 μg、約72 μg至約200 μg、約72 μg至約360 μg、約100 μg至約180 μg、或約110 μg至約240 μg。在某些實施方式中，在維持週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量與在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的最高劑量相同。在一個實施方式中，維持週期包括每7天一次（例如每週一次）投與雙特異性抗體構建體的劑量持續14天或持續28天。在另一個實施方式中，維持週期包括每7天兩次（例如每週兩次）投與雙特異性抗體構建體的劑量持續14天或持續28天。
在一些實施方式中，根據本發明之方法待治療的骨髓性白血病係急性骨髓性白血病。因此，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有急性骨髓性白血病。在一個實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有復發性急性骨髓性白血病。在另一個實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有難治性急性骨髓性白血病。在其他實施方式中，根據本發明之方法待治療的骨髓性白血病係慢性骨髓性白血病。因此，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有慢性骨髓性白血病。
根據本發明之方法待治療的骨髓性白血病患者可能已經接受了一種或多種先前的骨髓性白血病治療。在一些實施方式中，患者已接受一種或多種化學療法方案，例如含阿糖胞苷的方案。另外地或可替代地，患者已經接受了同種異體或自體造血幹細胞移植。在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者可以是對於先前療法難治性的或從先前療法中復發的。
在本文所述之方法的某些實施方式中，將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體腸胃外，較佳的是靜脈內投與給患者。靜脈內投與可以是靜脈內輸注，例如約30分鐘至約3小時或更較佳的是約30分鐘至約90分鐘的靜脈內輸注。在一些實施方式中，在起始週期和/或維持週期期間投與的雙特異性抗體構建體的每個劑量以靜脈內輸注的形式投與。
在一些實施方式中，本發明之方法可以進一步包括在起始週期和/或維持週期期間在投與一種或多種（或全部）劑量的雙特異性抗體構建體之前向患者投與一種或多種前驅用藥。前驅用藥可包括抗組胺藥（例如苯海拉明）、糖皮質激素（例如地塞米松）、和IL6受體拮抗劑（例如托珠單抗）。
在本文揭露之方法的任何實施方式中，向患者投與的雙特異性抗體構建體特異性結合CD33和CD3，較佳的是人類CD33和人類CD3。因此，雙特異性抗體構建體包含與CD33特異性結合的第一結合結構域和與CD3特異性結合的第二結合結構域。在某些實施方式中，第一結合結構域特異性結合人類CD33，並且第二結合結構域特異性結合人類CD3ε。結合結構域可以源自抗體或其抗原結合片段，例如重鏈和輕鏈可變區。在一個實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的一個或兩個結合結構域係單鏈可變片段（scFv）。在本文所述之方法的一些實施方式中，雙特異性抗體構建體進一步包含具有一個或多個免疫球蛋白Fc區的第三結構域。在此類實施方式中，第三結構域可以是單鏈Fc結構域。
在某些實施方式中，根據本發明之方法向患者投與的雙特異性抗體構建體以胺基至羧基的順序包含：(i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域，(ii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域，和 (iii) 包含兩個Fc單體的第三結構域，每個單體包含免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域，其中該兩個Fc單體經由肽連接子（linker）彼此融合。在一個實施方式中，第一結構域包含第一免疫球蛋白重鏈可變區（VH1）和第一免疫球蛋白輕鏈可變區（VL1），該VH1包含具有SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 13的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3，該VL1包含具有SEQ ID NO: 6的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 8序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3。在相關的實施方式中，第二結構域包含第二免疫球蛋白重鏈可變區（VH2）和第二免疫球蛋白輕鏈可變區（VL2），該VH2包含具有SEQ ID NO: 38的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 44的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 49的序列的CDRH3，該VL2包含具有SEQ ID NO: 32的序列的CDRL1，具有SEQ ID NO: 33的序列的CDRL2和具有序列SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3。在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體的第一結構域包含含有SEQ ID NO: 28的序列的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 20的序列的輕鏈可變區。在該等和其他實施方式中，雙特異性抗體構建體的第二結構域包含含有SEQ ID NO: 61的序列的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 59的序列的輕鏈可變區。
根據本發明之方法投與於患者的雙特異性抗體構建體可以包含 (i) 與人類CD33特異性結合並具有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的第一結構域，(ii) 與人類CD3特異性結合並具有SEQ ID NO: 101的胺基酸序列的第二結構域，和 (iii) 包含兩個各自具有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的Fc單體的第三結構域，並且所述兩個Fc單體經由肽連接子彼此融合。在相關的實施方式中，雙特異性抗體構建體的第三結構域包含SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體係單鏈抗體構建體。因此，本文表6中描述的任何單鏈抗體構建體均適用於在本發明之方法中使用。在一個較佳的實施方式中，根據本發明之方法向患者投與的雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列。
本發明還提供了用於在本文所述方法中使用的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物。藥物組成物可以包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑，包括緩衝液、表面活性劑和穩定劑。在某些實施方式中，藥物組成物包含抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體、緩衝液、表面活性劑和穩定劑。在一個實施方式中，藥物組成物包含在pH約4.0至約4.4下的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體（例如，包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列）、麩胺酸鹽緩衝液、聚山梨酯20或聚山梨酯80以及蔗糖。在一些實施方式中，可以將藥物組成物凍乾並在向患者投與之前重構。
在一些實施方式中，本發明還提供了套組（kit），其包含本文揭露的藥物組成物和使用該藥物組成物遞送治療有效劑量的說明書，例如藉由靜脈內輸注用於治療有需要的患者的骨髓性白血病。在以凍乾或乾粉形式提供藥物組成物的實施方式中，套組可包含稀釋劑和用於在投與前重構藥物組成物的說明書。在某些實施方式中，套組可進一步包含一個或多個靜脈內溶液穩定劑（IVSS）的小瓶，和在將藥物組成物稀釋以遞送給患者之前使用IVSS進行靜脈輸液袋預處理的說明。
特別考慮了抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體在本文揭露的任何方法中之用途或根據本文揭露的任何方法的用於製備用於投與的藥物之用途。例如，本發明包括與CD33和CD3特異性結合的雙特異性抗體構建體，用於在有需要的患者中治療骨髓性白血病之方法中使用，其中該方法包括向患者投與雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以約18 μg至約480 μg的一個或多個劑量以1天至4天的間隔投與雙特異性抗體構建體持續第一時間段，其中維持週期包括以約36 μg至約480 μg的劑量每7天一次或兩次投與雙特異性抗體構建體持續第二時間段，並且其中在起始週期之後投與維持週期。本發明還包括與CD33和CD3特異性結合的雙特異性抗體構建體在製備用於治療有需要的患者中的骨髓性白血病的藥物中之用途，其中該治療包括向患者投與雙特異性抗體構建體至少一次起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以約18 μg至約480 μg的一個或多個劑量以1天至4天的間隔投與雙特異性抗體構建體持續第一時間段，其中維持週期包括以約36 μg至約480 μg的劑量每7天一次或兩次投與雙特異性抗體構建體持續第二時間段，並且其中在起始週期之後投與維持週期。
相關申請的交叉引用
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雙特異性T細胞接合劑分子係正在開發的用於治療各種癌症的新免疫療法。該等分子通常具有至少一個對癌細胞上表現的細胞表面抗原具有特異性的結合結構域和至少另一個對分化簇3（CD3）（T細胞上表現的T細胞受體複合物的亞基）具有特異性的結合結構域。雙特異性T細胞接合劑分子被設計為將T細胞與靶癌細胞連接，並有效激活T細胞針對靶癌細胞的固有溶細胞潛力。由於少於一天的半衰期，通常藉由連續靜脈內輸注來投與第一代雙特異性T細胞接合劑分子（參見，例如，WO 99/54440、WO 2005/040220和WO 2008/119567）。已經設計了第二代雙特異性T細胞接合劑分子（至少參見WO 2013/128027、WO 2014140358、WO 2014/144722、WO 2014/151910、WO 2017/134140），以至少部分地增加分子的血清半衰期，從而可以實現不關於連續投與的給藥方式。
因為雙特異性T細胞接合劑分子的作用機制涉及T細胞激活，所以該等分子的潛在副作用係細胞介素釋放綜合症（CRS）。當大量T細胞被激活並釋放出炎性細胞介素時，就會發生CRS。為了最小化細胞介素升高和CRS發生的影響，可以以較低劑量或藉由使用抗組胺藥或皮質類固醇預治療劑來投與雙特異性T細胞接合劑分子。在第二代雙特異性T細胞接合劑分子的情況下，由於較長的血清半衰期，該分子的作用（包括不良副作用）可能會延長，因此重要的是開發一種給藥策略，使患者能夠儘快暴露於有效劑量，同時限制或避免與細胞介素迅速升高相關的副作用，例如CRS。本發明藉由提供用於治療骨髓性白血病的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的新穎給藥方案來滿足該需求。因此，一方面，本發明提供了一種在有需要的患者中治療骨髓性白血病之方法，該方法包括在如本文進一步所述之至少一個起始週期和至少一個維持週期中向該患者投與與CD33和CD3特異性結合的雙特異性抗體構建體。
白血病係一組影響血液和骨髓的癌症。白血病通常始於骨髓，並導致大量異常祖細胞，該等祖細胞尚未完全發育，被稱為胚細胞（或成髓細胞）或白血病細胞。白血病的主要特徵係慢性或急性以及淋巴細胞性或髓細胞性。淋巴細胞性白血病係指變成淋巴細胞的異常的骨髓祖細胞，而髓細胞性或骨髓性白血病係指成熟為包括紅血球、一些白血球（例如嗜中性粒細胞和單核細胞）和血小板在內的骨髓性細胞系細胞的異常骨髓祖細胞。
白血病的體征和症狀會根據白血病的特定類型和階段而有所不同並且可以包括但不限於流感樣症狀（例如發燒和發冷）、虛弱、疲勞、牙齦腫脹或出血、頭痛、肝臟或脾臟腫大、扁桃體腫脹、骨骼或關節疼痛、皮膚上有針頭大小的紅色斑點、面色蒼白和體重減輕。白血病的存在和類型通常是根據骨髓瘤和急性白血病WHO分類標準，藉由對來自懷疑患有或發展白血病的受試者或患者的樣本（例如血液、骨髓和/或淋巴結樣本）進行的一項或多項測試來診斷的（參見Arber等人, Blood [血液], 第127卷: 2391-2405, 2016的表1）。樣本可以是從人類患者獲得的任何生物樣本，並且可以包括體液，例如血液、血清、血漿、尿液、和唾液、以及組織（例如骨髓或淋巴結）。
在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有骨髓性白血病（也稱為髓細胞性白血病）。在一些實施方式中，獲自受試者或患者的血液樣本、骨髓活檢和/或骨髓抽吸物係較佳的以診斷骨髓性白血病的類型。在一些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有急性骨髓性白血病（也稱為急性髓細胞性白血病）。被診斷患有急性骨髓性白血病的患者通常血液中的紅血球和血小板水平低於預期水平，並且血液和/或骨髓中存在白血病胚細胞。可以藉由血液或骨髓中20%或更多的白血病胚細胞（成髓細胞），骨髓中存在具有與急性骨髓性白血病相關的某些復發性遺傳異常（即染色體改變）的白血病胚細胞，或存在表現特定表面蛋白（例如CD13或CD33）的白血病胚細胞來診斷急性骨髓性白血病。可以藉由基因表現譜、細胞遺傳學、核型分析或免疫表型來補充診斷，以確認初步診斷和/或鑒定急性骨髓性白血病的亞型。急性骨髓性白血病的診斷較佳的是由具有白血病診斷經驗的血液病理學家進行，較佳的是藉由應用WHO骨髓性腫瘤和急性白血病的分類方法（參見Arber等人的表1, Blood [血液], 第127卷: 2391-2405, 2016）。
在其他實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有慢性骨髓性白血病（也稱為慢性髓細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病和慢性髓系白血病）。患有慢性骨髓性白血病的患者最初可能沒有上述任何白血病症狀，但由於血液中白血球水平異常升高而被懷疑患有這種疾病。對患有以下疾病的患者進行慢性骨髓性白血病的診斷：血液樣本中白血球計數增加、紅血球計數減少以及血小板水平增加或減少；血液或骨髓中存在白血病胚細胞；和/或骨髓中具有染色體異常的細胞（例如費城染色體）之存在（BCR-ABL1 融合）。細胞遺傳學分析、螢光原位雜交（FISH）或聚合酶鏈反應（PCR）係所有可用於評估從懷疑患有慢性骨髓性白血病的患者的血液或骨髓樣本獲得的細胞中染色體異常之方法。慢性骨髓性白血病的診斷較佳的是由具有白血病診斷經驗的血液病理學家進行，較佳的是藉由應用WHO骨髓性腫瘤和急性白血病的分類方法（參見Arber等人的表1, Blood [血液], 第127卷: 2391-2405, 2016）。
在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者患有或被診斷患有復發和/或難治性骨髓性白血病，特別是復發和/或難治性急性骨髓性白血病。如本文所用，術語「復發性骨髓性白血病」係指患者經歷了疾病的緩解後，髓樣白血病，特別是急性骨髓性白血病的體征和症狀的再出現，例如骨髓中白血病胚細胞的再出現和正常血細胞的下降。例如，在採用抗白血病療法（例如標準化學療法方案（例如阿糖胞苷和/或蒽環類）和/或造血幹細胞移植）進行初始治療後，骨髓性白血病患者可能會緩解而無任何白血病體征或症狀，但隨後復發，伴隨白血病細胞再出現，再次需要骨髓性白血病的治療。如果在緩解期後滿足以下一項或多項標準，則可以認為患者已復發骨髓性白血病：(i) 骨髓中白血病胚細胞為5%或更高的復發，(ii) 外周血中白血病胚細胞的復發，(iii) 髓外部位（即骨髓外）的白血病復發，(iv) 形態增生異常的治療前特徵性體征的復發，或 (v) 骨髓細胞或血細胞中的奧氏小體（Auer rods）（大的透明的細胞質內含物小體）復發。在某些實施方式中，骨髓性白血病患者在首次緩解的持續時間小於一年之後復發，例如第一次緩解的持續時間為約3個月至約11個月。在其他實施方式中，骨髓性白血病患者在首次緩解的持續時間大於一年之後復發。
如本文所用，術語「難治性骨髓性白血病」係指針對骨髓性白血病的抗白血病療法，例如化學療法和/或造血幹細胞移植不反應或僅部分反應的骨髓性白血病，特別是急性骨髓性白血病。因此，在骨髓性白血病的治療過程後檢測到白血病疾病（例如骨髓或外周血中的白血病胚細胞）存在的患者被認為患有難治性骨髓性白血病。
本文所述之方法也適用於其他類型的骨髓惡性腫瘤，其係造血幹細胞或祖細胞中產生的選殖性疾病。可以根據本發明之方法治療的其他類型的骨髓性惡性腫瘤包括但不限於骨髓增生異常綜合症、真性紅血球增多症、原發性血小板增多症、原發性骨髓纖維化、急性嗜鹼性粒細胞白血病、急性嗜酸性粒細胞白血病、慢性嗜酸性粒細胞白血病、慢性嗜中性粒細胞白血病、急性巨核細胞白血病、急性紅白血病、嗜酸性粒細胞增多綜合症、肥大細胞病、急性全骨髓性白血病和骨髓性肉瘤。因此，本發明還提供了藉由使用本文所述之任何劑量方案將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體投與於有需要的患者來治療任何上述骨髓性惡性腫瘤之方法。
根據本發明之方法投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體係用於治療骨髓性白血病或其他骨髓性惡性腫瘤。如本文所用，術語「治療（treatment或treat）」係指將雙特異性抗體構建體應用或投與於患有或被診斷患有骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤，具有骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的症狀，具有發展為骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的風險，或對於骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的易感性的患者，目的是醫治（curing）、治癒（healing）、緩解（alleviating）、減輕（relieving）、改變（altering）、改善（ameliorating）、或改進（improving）骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤、骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的一種或多種症狀、發展為骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的風險、或對於骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的易感性。術語「治療」涵蓋患者的疾病的任何改善，包括減慢或停止患者骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤的進展，降低骨髓性白血病或骨髓惡性腫瘤症狀的數量或嚴重程度，或增加患者無骨髓性白血病或骨髓性惡性腫瘤症狀的頻率或持續時間。術語「患者」包括人類患者。
在本發明之方法的某些實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與使患者骨髓中的白血病胚細胞（成髓細胞）的百分比相對於在治療開始之前（即，在投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體之前）骨髓中白血病胚細胞的百分比降低至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%、或約100%。在一些實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與使患者骨髓中白血病胚細胞（成髓細胞）的百分比相對於在治療開始之前骨髓中白血病胚細胞的百分比降低50%或更多。在其他實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與使患者骨髓中白血病胚細胞（成髓細胞）的百分比相對於在治療開始之前骨髓中白血病胚細胞的百分比降低了80%或更多。評估來自患者的骨髓樣本中白血病胚細胞百分比之方法係熟悉該項技術者已知的，並且可以包括用於診斷骨髓性白血病的類似方法。
在本發明之方法的一些實施方式中，投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體誘導至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%的骨髓性白血病患者中的疾病完全緩解。在本發明之上下文中，完全緩解（CR）係指具有以下所有特徵的病症：(i) 骨髓中少於5%的白血病胚細胞，(ii) 不存在帶有奧氏小體的白血病胚細胞，以及 (iii) 不存在髓外白血病疾病。完全緩解可包括血液學恢復完全緩解，在這種情況下，除上述標準外，患者表現出的中性細胞絕對計數 ≥ 1,000個細胞/μL，血小板計數 ≥ 100,000個細胞/μL，並且不需要紅血球輸注。在一些實施方式中，在患者中投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體誘導完全緩解，伴隨血液學不完全或部分恢復。完全緩解伴隨不完全血液學恢復（CRi）係指藉由上述三個標準表徵的完全緩解，但患者具有殘餘嗜中性粒細胞減少症（例如，中性粒細胞絕對計數 ＜ 1,000個細胞/μL）和/或殘餘血小板減少症（例如血小板計數 ＜ 100,000個細胞/μL）。完全緩解伴隨部分血液學恢復（CRh）係指藉由上述三個標準表徵的完全緩解，但患者表現出的嗜中性粒細胞絕對計數 ＞ 500個細胞/μL，血小板計數 ＞ 50,000個細胞/μL。
還可以根據對治療的反應時間、對治療的反應持續時間或白血病疾病的進展時間來評估本文所述之治療方案的功效。例如，在一些實施方式中，與對於標準化學療法方案（例如阿糖胞苷和/或蒽環類）觀察到的反應時間相比，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與減少了反應時間。如本文所用，「反應時間」係指從治療起始到伴隨血液學恢復的CR、CRi、CRh或骨髓中白血病胚細胞減少至少50%之間的時間段。在其他實施方式中，與對於標準化學療法方案（例如阿糖胞苷和/或蒽環類）觀察到的對治療的反應持續時間相比，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與增加了對治療的反應持續時間。如本文所用，術語「反應持續時間」係指從緩解（CR、具有血液學恢復的CR、CRi或CRh）到如本文所述之白血病疾病復發的時間段。因此，在一些實施方式中，根據本發明之方法投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體可預防或延遲患者白血病疾病的復發。
在某些實施方式中，與對於標準化學療法方案（例如阿糖胞苷和/或蒽環類）觀察到的白血病疾病的進展時間相比，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與增加了患者白血病疾病的進展時間。如果發生以下任何一種情況，則認為白血病正在進展：(i) 先前評估的骨髓中白血病胚細胞增加50%以上，骨髓中白血病胚細胞為至少20%，(ii) 先前評估外周血中的白血病胚細胞增加50%以上，外周血中絕對白血病胚細胞計數至少為1000個細胞/μL，或 (iii) 髓外白血病疾病或其他位置的髓外白血病疾病的發展。「白血病疾病的進展時間」係指從治療起始到如以上標準所述之認為白血病疾病進展的時間之間的時間段。在一些實施方式中，根據本發明之方法的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與預防或延遲了患者的白血病疾病的進展。
在一些方面，本發明之方法包括向患者投與藥物組成物，該藥物組成物包含治療有效量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。「治療有效量」係指足以治療或改善骨髓性白血病或一種或多種其症狀，特別是與骨髓性白血病相關的狀態或症狀，或以其他方式預防、阻礙、延緩或逆轉骨髓性白血病或任何與骨髓性白血病相關的其他不良症狀進展之量。本文更詳細地描述了針對每個起始和維持週期的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的合適劑量。在某些實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的治療有效量係足以在患者中誘導骨髓性白血病完全緩解之量。在該等和其他實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的治療有效量係足以預防或延遲患者骨髓性白血病復發之量。在仍其他實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的治療有效量係足以預防或延遲患者骨髓性白血病進展之量。
通常，本發明之方法包括在一個或多個治療週期中向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。「治療週期」或「週期」係指以特定劑量和給藥間隔投與雙特異性抗體構建體的時間段。根據本發明之方法，患者可以接受多個治療週期（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個週期）。可以連續向患者投與治療週期，而在兩個週期之間沒有中斷或不投與雙特異性抗體構建體。可替代地，可以在治療週期之間採用不投與雙特異性抗體構建體的時期（例如「無治療時間段」或「中斷」）。可以基於患者的特徵和/或對治療的反應來調整無治療時間段的長度。例如，比如，如果患者表現出嗜中性粒細胞減少症、血小板減少症或貧血，則可以採用無治療時間段來使患者從血液細胞計數低或抑制中恢復。
在一個較佳的實施方式中，本發明之方法包括以至少一個起始週期和至少一個維持週期向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。如本文所用，「起始週期」係其中雙特異性抗體構建體以設計用於快速增加患者對治療有效劑量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的暴露的給藥頻率投與的治療週期。當患者開始用抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的療程時，較佳的是將起始週期作為第一治療週期向患者投與。當患者重新開始用抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的療程時，例如在無治療時間段或白血病疾病復發之後，也可以向患者投與起始週期。儘管通常投與一個起始週期就足夠了，但是在本發明方法的一些實施方式中，可以考慮投與兩個或更多個起始週期。
在本發明之方法的某些實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約15 μg至約1000 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。例如，起始週期包括在每個給藥間隔以以下的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體：約18 μg至約480 μg、約36 μg至約480 μg、約72 μg至約200 μg、約100 μg至約180 μg、約110 μg至約240 μg、約110 μg至約360 μg、約72 μg至約480 μg、約18 μg至約240 μg、約36 μg至約240 μg、約150 μg至約360 μg、約180 μg至約480 μg、約150 μg至約480 μg、約100 μg至約800 μg、或約200 μg至約600 μg。在一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約18 μg至約480 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在另一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約36 μg至約480 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在另一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約110 μg至約360 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在又另一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約100 μg至約180 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在仍另一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約72 μg至約480 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在另一個實施方式中，起始週期包括在每個給藥間隔以約18 μg至約240 μg的一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。
在一些實施方式中，在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量在每個給藥間隔可以是相同的（例如，整個週期的固定劑量）。因此，最初投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的特定劑量，並且在所有隨後的投與以規定的給藥間隔持續起始週期的整個過程。舉例來說，如果給藥間隔係每天，則根據該實施方式的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與將需要在起始週期期間每天一次投與特定劑量（例如110 μg）。
在替代實施方式中，在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量可以從一個給藥間隔到下一給藥間隔改變。例如，在一些實施方式中，在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量在該週期期間在一個或多個間隔增加至少一次（即階梯給藥）。階梯給藥係指在治療週期內投與增加劑量的藥物，例如以控制患者暴露於藥物以避免或限制不利影響。在起始週期中採用的階梯給藥方案可以包括一個或多個劑量階梯（例如，一個或多個劑量增加）。例如，在一個實施方式中，起始週期包括以第一劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，隨後以第二劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第二劑量大於第一劑。在相關的實施方式中，可採用第二劑量階梯，使得起始週期進一步包括在投與第二劑量後以第三劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第三劑量大於第二劑量。在另一個實施方式中，採用第三劑量階梯，使得起始週期進一步包括在投與第三劑量後以第四劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第四劑量大於第三劑量。在又另一個實施方式中，採用第四劑量階梯，使得起始週期進一步包括在投與第四劑量後以第五劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第五劑量大於第四劑量。在仍另一個實施方式中，採用第五劑量階梯，使得起始週期進一步包括在投與第五劑量後以第六劑量投與雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中第六劑量大於第五劑量。可以使用一個或多個劑量階梯，例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多個劑量階梯。在一些實施方式中，在起始週期中採用的階梯給藥方案可以包括多達六個劑量階梯（即投與的七個不同劑量），例如1、2、3、4、5或6個劑量階梯。在其他實施方式中，在起始週期中採用的階梯給藥方案可以包括多達七個劑量階梯（即，投與的八個不同劑量），例如1、2、3、4、5、6或7個劑量階梯。
抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的階梯劑量可以是在起始週期內在上述指定的投與範圍內的任何劑量。例如，階梯劑量可以在約15 μg至約1000 μg的範圍內，例如約18 μg至約480 μg、約36 μg至約480 μg、約110 μg至約360 μg、約100 μg至約180 μg、約72 μg至約480 μg、約18 μg至約240 μg、約36 μg至約240 μg、或約150 μg至約480 μg。在一些實施方式中，階梯劑量可以在該範圍內成比例地增加。在替代實施方式中，階梯劑量可以在該範圍內以較小或較大的階梯增加，例如，較早的階梯劑量為小階梯，而較晚的階梯劑量為大階梯。在起始週期中採用階梯給藥方案的某些實施方式中，向患者投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約18 μg至約150 μg，而第二劑量為約110 μg至約240 μg，其中第二劑量大於第一劑量。在起始週期中採用階梯給藥方案的其他實施方式中，向患者投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約36 μg至約150 μg，第二劑量為約110 μg至約240 μg，其中第二劑量大於第一劑量。在起始週期中採用階梯給藥方案的仍其他實施方式中，向患者投與的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約18 μg至約110 μg，第二劑量為約72 μg至約160 μg，其中第二劑量大於第一劑量。在一個這樣的實施方式中，第一劑量為約36 μg，第二劑量為約72 μg。
在階梯給藥方案包括兩個劑量階梯的實施方式中（即投與三個不同劑量），抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約18 μg至約150 μg，第二劑量為約110 μg至約240 μg，並且第三劑量為約150 μg至約360 μg，其中第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在階梯給藥方案包括兩個劑量階梯的其他實施方式中（即投與三個不同劑量），抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約36 μg至約150 μg，第二劑量為約110 μg至約240 μg，並且第三劑量為約150 μg至約360 μg，其中第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在階梯給藥方案包括三個劑量階梯的某些實施方式中（即投與四個不同劑量），抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約18 μg至約150 μg，第二劑量為約110 μg至約240 μg，第三劑量為約150 μg至約360 μg，並且第四劑量為約180 μg至約480 μg，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在階梯給藥方案包括三個劑量階梯的某些其他實施方式中（即投與四個不同劑量），抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約36 μg至約150 μg，第二劑量約110 μg至約240 μg，第三劑量約150 μg至約360 μg，並且第四劑量約180 μg至約480 μg，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在階梯給藥方案包括三個劑量階梯的又其他實施方式中（即投與四個不同劑量），抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的第一劑量為約18 μg至約110 μg，第二劑量為約36 μg至約160 μg，第三劑量為約72 μg至約240 μg，並且第四劑量為約110 μg至約480 μg，其中第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在一個特定的實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，並且第四劑量為約110 μg。
在階梯給藥方案包括四個劑量階梯的一些實施方案中（即投與五個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約 110 μg，第二劑量可以為約36 μg至約160 μg，第三劑量可以為約72 μg至約240 μg，第四劑量可以為約110 μg至約360 μg，並且第五劑量可以為約160 μg至約480 μg，其中第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在一個這樣的實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，第四劑量為約110 μg，第五劑量為約160 μg。在階梯給藥方案包括五個劑量階梯的實施方式中（即投與六個不同劑量），第一劑量可以為約18 μg至約72 μg，第二劑量可以為約36 μg至約110 μg，第三劑量可以為約72 μg至約160 μg，第四劑量可以為約110 μg至約240 μg，第五劑量可以為約160 μg至約360 μg，並且第六劑量可以為約240 μg至約480 μg，其中第六劑量大於第五劑量，第五劑量大於第四劑量，第四劑量大於第三劑量，第三劑量大於第二劑量，並且第二劑量大於第一劑量。在某些此類實施方式中，第一劑量為約18 μg，第二劑量為約36 μg，第三劑量為約72 μg，第四劑量為約110 μg，第五劑量為約160 μg，第六劑量為約240 μg。
在起始週期期間投與的本文所述之任何劑量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體可以以1天至4天的間隔投與。例如，在一個實施方式中，起始週期包括每天一次投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量（例如每天，QD給藥）。在另一個實施方式中，起始週期包括每隔一天一次投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量（例如，Q2D給藥）。在又另一個實施方式中，起始週期包括每三天一次投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量（例如，Q3D給藥）。在仍另一個實施方式中，起始週期包括每四天一次投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量（例如，Q4D給藥）。在起始週期中採用階梯給藥方案的一些實施方式中，可以在每個給藥間隔增加劑量。例如，對於每天一次（例如每天一次）的給藥間隔，階梯給藥方案可以包括在第1天（D1）投與第一劑量，在第2天（D2）投與第二更高的劑量，在第3天（D3）投與第三更高的劑量，依此類推。在起始週期中採用階梯給藥方案的其他實施方式中，劑量可以保持恒定持續兩個或更多個給藥間隔，並且隨後在以後的給藥間隔中增加。在一個這樣的實施方式中，對於每天一次（例如每天一次）的給藥間隔，階梯給藥方案可以包括在D1和D2投與第一劑量，在D3和第4天（D4）投與第二更高劑量，在第5天（D5）和第6天（D6）投與第三更高劑量，依此類推。在另一個這樣的實施方式中，對於每天一次（例如每天一次）的給藥間隔，階梯給藥方案可以包括在D1投與第一劑量，在D2和D3投與第二更高劑量，在D4和D5投與第三更高劑量，依此類推。在一些實施方式中，當在起始週期中採用階梯給藥方案時，較佳的是每天給藥間隔（例如每天一次）。
在本發明之方法的某些實施方式中，起始週期（例如第一時間段）的持續時間為約5天至約30天，例如，約7天至約28天、約7天至約14天、約14天至約28天、或約5天至約15天。因此，在一些實施方式中，起始週期包括以1天至4天的間隔以本文所述之一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續第一時間段，其中第一時間段為約7天至約14天。在其他實施方式中，起始週期包括在第一時間段內以1天至4天的間隔以本文所述之一個或多個劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體，其中第一時間段為約14天至約28天。在本發明之方法的一個實施方式中，起始週期包括每天一次（例如每天）以本文所述之一個或多個劑量投與雙特異性抗體構建物持續7天。在另一個實施方式中，起始週期包括每天一次（例如每天）以本文所述之一個或多個劑量投與雙特異性抗體構建體持續14天。在又另一個實施方式中，起始週期包括每隔一天一次（例如Q2D）以本文所述之一個或多個劑量投與雙特異性抗體構建體持續14天。在仍另一個實施方式中，起始週期包括每三天一次（例如Q3D）以本文所述之一個或多個劑量投與雙特異性抗體構建體持續14天。在另一個實施方式中，起始週期包括每四天一次（例如Q4D）以本文所述之一個或多個劑量投與雙特異性抗體構建體持續7天（例如，在一週內在D1和D5兩次投與抗體構建體）。
在某些實施方案中，本發明之方法包括在投與一個或多個起始週期後向患者投與至少一個維持週期的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。如本文所用，「維持週期」係其中雙特異性抗體構建體以設計用於維持抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的暴露閾值水平在患者的治療水平的給藥頻率投與的治療週期。在一個較佳的實施方式中，維持週期中採用的給藥頻率低於起始週期中採用的給藥頻率（即維持週期中的給藥間隔大於起始週期中的給藥間隔）。在某些實施方式中，在一個或多個起始週期完成後立即投與維持週期，以維持患者暴露於抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。因此，在這樣的實施方式中，在起始週期的結束與維持週期的開始之間沒有無治療時間段或中斷。在一個這樣的實施方式中，在完成起始週期後的第二天啟動維持週期。
可以根據患者所需的治療持續時間，對該患者投與多個維持週期（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期）。例如，患者可以接受抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的維持週期，直到患者達到期望的反應水平，例如白血病的完全緩解。在一些實施方式中，向患者投與兩個或更多個維持週期。在其他實施方式中，向患者投與四個或更多個維持週期。在仍其他實施方式中，向患者投與六至十二個維持週期。在較佳的實施方式中，連續地投與維持週期，在維持週期之間沒有無治療時間段。如果需要中斷治療，理想情況下，無治療時間段的持續時間應不大於維持週期中所用給藥間隔的兩倍。舉例來說，如果在維持週期中採用的給藥間隔係每週一次（例如每週一次），則無治療時間段將較佳的是約14天或更短。
在本發明之方法的某些實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次（例如每週一次或每週兩次）以約30 μg至約1000 μg的劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。例如，維持週期包括每7天一次或兩次以以下劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體：約36 μg至約480 μg、約72 μg至約200 μg、約72 μg至約360 μg、約100 μg至約180 μg、約110 μg至約240 μg、約110 μg至約360 μg、約72 μg至約480 μg、約36 μg至約240 μg、約150 μg至約360 μg、約180 μg至約480 μg、約150 μg至約480 μg、約100 μg至約800 μg、或約200 μg至約600 μg。在一個實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次以約36 μg至約480 μg的劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在另一個實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次以約110 μg至約240 μg的劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在又另一個實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次以約72 μg至約360 μg的劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。在某些實施方式中，在維持週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量與在起始週期期間投與的雙特異性抗體構建體的最高劑量相同。在起始週期中採用階梯給藥方案的一些實施方式中，在維持週期中投與的劑量與在起始週期中投與的最後的階梯劑量相同。在一些實施方式中，在維持週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量在每週一次或每週兩次的給藥間隔可以是相同的（例如，整個維持週期的固定劑量）。在該等和其他實施方式中，從一個維持週期到下一個維持週期，在維持週期期間投與的雙特異性抗體構建體的劑量和給藥頻率係相同的。在本發明之方法的一個特定實施方式中，維持週期包括每週一次（例如，每7天一次，每週一次或QW給藥）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量。在另一個特定的實施方式中，維持週期包括每週兩次（例如每7天兩次）投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的劑量。
根據本發明之方法的一些實施方式，維持週期的持續時間（例如第二時間段）為約14天至約60天，例如約14天至約28天、約28天至約56天、約14天至約21天、約15天至約30天、或約30天至約60天。因此，在一些實施方式中，維持週期包括每7天一次或兩次以本文所述之劑量投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體持續第二時間段，其中第二時間段為約14天至約28天。在本發明之方法的一個實施方式中，維持週期包括每7天一次（例如每週一次，QW）以本文所述之劑量投與雙特異性抗體構建體持續14天。在另一個實施方式中，維持週期包括每7天一次（例如每週一次，QW）以本文所述之劑量投與雙特異性抗體構建體持續28天。在又另一個實施方式中，維持週期包括每7天兩次（例如每週兩次）以本文所述之劑量投與雙特異性抗體構建體持續14天。在仍另一個實施方式中，維持週期包括每7天兩次（例如每週兩次）以本文所述之劑量投與雙特異性抗體構建體持續28天。
在一些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以110 μg至約360 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每四天一次持續七天，其中維持週期包括以約110 μg至約360 μg劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次持續14天，其中在起始週期後7-9天投與維持週期。根據該等實施方式的示例性給藥方案包括在7天起始週期的第1天（D1）和第5天（D5）投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如110 μg），隨後是7天的無治療時間段，隨後在14天維持週期的第1天（D1）和第8天（D8）投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如110 μg）。因此，根據該給藥方案，在從起始週期的第一劑量開始的28天期間，將在D1、D5、第15天（D15）和第22天（D22）向患者投與雙特異性抗體構建體。
在某些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg至約480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續7天或14天，其中維持週期包括以約72 μg至約480 μg劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次（例如每週）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。根據該等實施方式的示例性給藥方案包括在7天起始週期的D1至第7天（D7）的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量，隨後在14天維持週期的D1和D8投與雙特異性抗體構建體的劑量。因此，根據該給藥方案，在包括7天起始週期和14天維持週期的21天期間，將在D1至D7、D8和D15的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。根據該等實施方式的另一個示例性給藥方案包括在14天起始週期的D1至第14天（D14）的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量，隨後在14天維持週期的D1和D8投與雙特異性抗體構建體的劑量。根據該給藥方案，在包括14天起始週期和14天維持週期的28天期間，將在D1至D14、D15和D22的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。
在其他實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg至約480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續7天或14天，其中維持週期包括以約72 μg至約480 μg劑量投與雙特異性抗體構建體每7天兩次（例如每週兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。根據該等實施方式的示例性給藥方案包括在7天起始週期的D1至D7的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量，隨後在14天維持週期的D1、D4、D8、和第11天（D11）投與雙特異性抗體構建體的劑量。因此，根據該給藥方案，在包括7天起始週期和14天維持週期的21天期間，將在D1至D7、D8、D11、D15和第18天（D18）的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。根據該等實施方式的另一個示例性給藥方案包括在14天起始週期的D1至D14的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量，隨後在14天維持週期的D1、D4、D8、和D11投與雙特異性抗體構建體的劑量。根據該給藥方案，在包括14天起始週期和14天維持週期的28天期間，將在D1至D14、D15、D18、D22和D25的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。
在替代實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg至約480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續7天或14天，其中維持週期包括以約72 μg至約480 μg劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次（例如每週）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。根據該等實施方式的示例性給藥方案包括在7天起始週期的D1至第7天（D7）的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg），隨後在14天維持週期的D1和D8投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg）。因此，根據該給藥方案，在包括7天起始週期和14天維持週期的21天期間，將在D1至D7、D8和D15的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。根據該等實施方式的另一個示例性給藥方案包括在14天起始週期的D1至第14天（D14）的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg），隨後在14天維持週期的D1和D8投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg）。根據該給藥方案，在包括14天起始週期和14天維持週期的28天期間，將在D1至D14、D15和D22的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。
在某些其他實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg至約480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續7天或14天，其中維持週期包括以約72 μg至約480 μg劑量投與雙特異性抗體構建體每7天兩次（例如每週兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。根據該等實施方式的示例性給藥方案包括在7天起始週期的D1至D7的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg），隨後在14天維持週期的D1、D4、D8、和第11天（D11）投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg）。因此，根據該給藥方案，在包括7天起始週期和14天維持週期的21天期間，將在D1至D7、D8、D11、D15和第18天（D18）的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。根據該等實施方式的另一個示例性給藥方案包括在14天起始週期的D1至D14的每一天每天一次投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg），隨後在14天維持週期的D1、D4、D8、和D11投與雙特異性抗體構建體的劑量（例如72 μg）。根據該給藥方案，在包括14天起始週期和14天維持週期的28天期間，將在D1至D14、D15、D18、D22和D25的每一天向患者投與雙特異性抗體構建體。
在一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以36 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以72 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續12天，其中維持週期包括以72 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以36 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以72 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以110 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續10天，其中維持週期包括在以110 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在又另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以110 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續11天，其中維持週期包括在以110 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在仍另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以110 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以160 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續10天，其中維持週期包括在以160 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在某些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以110 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以160 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以240 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續9天，其中維持週期包括在以240 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在其他實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以110 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以160 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以240 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以360 μg的第七劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續8天，其中維持週期包括在以360 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在一些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以110 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以160 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以240 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以360 μg的第七劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續1天，隨後以480 μg的第八劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續7天，其中維持週期包括在以480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在上述實施方式或本文所述之其他實施方式中的任何一個中，其中在起始週期期間採用階梯給藥方案，階梯給藥可以以一個以上的給藥間隔（例如，保持恒定持續兩個或更多個給藥間隔）來投與，以延遲靶劑量的首次投與（即週期內投與的最高劑量）。對於每個階梯劑量，步驟的持續時間可以是不同的，使得在第一給藥間隔投與一次第一劑量，並且在接下來的兩個或更多個給藥間隔中的每個投與另一個階梯劑量。藉由舉例說明，在一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以18 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續1天，隨後以36 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以72 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以110 μg的第四劑量（例如該實施方式的靶劑量）投與雙特異性抗體構建體每天一次持續9天，其中維持週期包括在以110 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在某些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續12天，其中維持週期包括在以110 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以150 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續10天，其中維持週期包括在以150 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在又另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以150 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以180 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續8天，其中維持週期包括在以180 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在仍另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以150 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以180 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續6天，其中維持週期包括在以240 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在某些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以150 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以180 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以360 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續4天，其中維持週期包括在以360 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在其他實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以150 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以180 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以360 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以480 μg的第七劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，其中維持週期包括在以480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以160 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續10天，其中維持週期包括在以160 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在又另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以160 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續8天，其中維持週期包括在以240 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在仍另一個實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以160 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以360 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續6天，其中維持週期包括在以360 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在一些實施方式中，本發明之方法包括向患者投與抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體至少一個起始週期和至少一個維持週期，其中起始週期包括以72 μg的第一劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次（例如每天）持續2天，隨後以110 μg的第二劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以160 μg的第三劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以240 μg的第四劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以360 μg的第五劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續2天，隨後以480 μg的第六劑量投與雙特異性抗體構建體每天一次持續4天，其中維持週期包括在以480 μg的劑量投與雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次（例如，每週一次或兩次）持續14天，其中在完成起始週期後第二天投與維持週期。
在本發明之方法的某些實施方式中，可以在起始週期中在投與第一劑量的雙特異性抗體構建體之前向患者投與一種或多種前驅用藥。在一些實施方式中，在起始週期中在投與每劑量的雙特異性抗體構建體之前向患者投與該前驅用藥。在維持週期中，在投與雙特異性抗體構建體的一個劑量或多個劑量之前，也可以對患者投與該前驅用藥。在特定的實施方式中，在起始週期和一個或多個維持週期期間，在投與每劑量的雙特異性抗體構建體之前向患者投與前驅用藥，即在投與任何劑量的雙特異性抗體之前向患者投與前驅用藥。設想，在此特定上下文中，「在……之前」意指在開始投與雙特異性抗體構建體24小時、18小時、十二小時、六小時、五小時、四小時或三小時之內，並且較佳的是在120、90、60或30分鐘之內。前驅用藥法可以例如在開始投與雙特異性抗體構建體之前30-120分鐘或30-60分鐘投與。可以投與前驅用藥以例如預防或降低與輸注相關的反應的嚴重性和/或預防或降低細胞介素釋放綜合症或其症狀的嚴重性。
在一些實施方式中，該前驅用藥係抗組胺藥。抗組胺藥可以口服或靜脈內投與，並且可以以相當於苯海拉明50 mg iv的劑量投與。可以作為前驅用藥的合適的抗組胺藥包括但不限於口服、腸胃外或直腸途徑的抗組胺藥，例如：阿紮他定（azatadine）（最大劑量例如4 mg/天）、溴苯那敏（brompheniramine）（最大劑量例如30 mg/天）、西替利𠯤（cetirizine）（最大劑量例如15 mg/天）、氯苯吡胺（chlorpheniramine）（最大劑量例如30 mg/天）、克立馬丁（clemastine）（最大劑量例如10 mg/天）、賽庚啶（cyproheptadine）（最大劑量例如15 mg/天）、地氯雷他定（desloratadine）（最大劑量例如7 mg/天）、右旋氯苯吡胺（dexchlorpheniramine）（最大劑量例如15 mg/天）、苯海拉明（最大劑量例如350 mg/天）、抗敏安（doxylamine）（最大劑量例如180 mg/天）、非索非那定（fexofenadine）（最大劑量例如200 mg/天）、氯雷他定（loratadine）（最大劑量例如15 mg/天）、和苯茚胺（phenindamine）（最大劑量例如180 mg/天）。
在其他實施方式中，該前驅用藥係糖皮質激素。糖皮質激素係一類皮質類固醇，這類皮質類固醇係一類類固醇激素。糖皮質激素係與糖皮質激素受體結合的皮質類固醇。不太常見的同義詞係糖皮質類固醇（glucocorticosteroid）。皮質醇（當用作藥物時稱為氫化可的松（hydrocortisone））係最重要的人糖皮質激素。已經創造了多種合成的糖皮質激素（一些比皮質醇要有效的多）用於治療用途。皮質醇係糖皮質激素效力的比較標準。通常開具的替代類固醇等效物的一個實例可以是強的松（5 mg）= 可的松（cortisone）（25 mg）= 地塞米松（0.75 mg）= 氫化可的松（20 mg）= 甲基潑尼松龍（methylprednisolone）（4 mg）。該等劑量指示全身性糖皮質激素的等效藥理劑量。糖皮質激素可以口服或靜脈內投與，並且可以以4-20 mg地塞米松iv的劑量當量投與。（當量係指糖皮質激素的效力）。每次投與時（即每次投與糖皮質激素前驅用藥時）糖皮質激素的劑量可以相同。可替代地，如果在先前投與雙特異性抗體構建體之後沒有或僅有極少的輸注反應和/或CRS症狀的體征，則在隨後的投與中可以減少糖皮質激素的劑量，例如減少先前劑量的50%。
用作前驅用藥的糖皮質激素的實例包括但不限於可的松、氫化可的松、強的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松（betamethasone）、倍氯米松（beclomethasone）、布地奈德（budesonide）、去炎松（triamcinolone）、氯潑尼醇（cloprednol）、地夫可特（deflazacort）、氟可龍（fluocortolone）、可的伐唑（cortivazol）、帕拉米松（paramethasone）、氟替卡松（fluticasone）、氟替卡松丙酸酯、曲安奈德（triamcinolone acetonide）、以及其組合和/或藥學上可接受的衍生物。不同的糖皮質激素可單獨或組合使用。地塞米松、強的松和潑尼松龍係較佳的糖皮質激素，用作根據本發明之方法的前驅用藥。在本發明之方法的某些實施方式中，在起始週期和/或維持週期期間投與一個或多個（或全部）劑量的雙特異性抗體構建體之前向患者投與的糖皮質激素係地塞米松。地塞米松可以以每次投與約4-20 mg、6-18 mg、8-16 mg、約16 mg或約8 mg的劑量投與。
在某些實施方式中，該前驅用藥可以是IL-6受體拮抗劑，例如托珠單抗。據報導，托珠單抗可有效減輕或逆轉由T細胞接合療法誘導的CRS症狀。參見例如，Maude等人, Cancer J. [癌症雜誌], 第20卷: 119-122, 2014。托珠單抗可以約8 mg/kg至約12 mg/kg體重的劑量投與。托珠單抗可以每週一次或每兩週一次作為前驅用藥投與。因此，在起始週期和/或維持週期中，在每個劑量的雙特異性抗體構建體之前不需要給予托珠單抗前驅用藥。舉例來說，對於每個14天的起始和維持週期，可在起始週期中（例如在第1天）在雙特異性抗體構建體的第一劑量之前投與托珠單抗，然後在第一維持週期（例如在第15天）在雙特異性抗體構建體的第一劑量之前投與托珠單抗。
可以根據本發明之方法治療患者持續一段設定的治療期。「治療期」始於在起始週期中投與第一劑量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體，並終止於維持週期中投與最終劑量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。治療期可以是約3個月至約36個月，約12個月至約24個月，或約6個月至約12個月。例如，治療期可以是約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月、約15個月、約18個月、約21個月、約24個月、約27個月、約30個月、約33個月、或約36個月。在一些實施方式中，治療期係約6個月。在其他實施方式中，治療期係約9個月。在又其他實施方式中，治療期係約12個月。可以根據患者對治療的反應來調整每個患者的治療期。在一個特定的實施方式中，根據本發明之方法治療患者，直到患者達到完全緩解或直到在患者中無法檢測到白血病。
在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者先前已經接受了一種或多種針對急性骨髓性白血病的先前治療，例如一種或多種化學療法方案。用於治療急性骨髓性白血病的標準化學療法方案通常包括阿糖胞苷（也稱為胞嘧啶阿糖苷或ara-C）和蒽環類藥物（如柔紅黴素、阿黴素或伊達比星）的組合。急性骨髓性白血病的其他治療方法包括 (i) 米哚妥林與阿糖胞苷和柔紅黴素組合，(ii) 維奈托克與氮雜胞苷或地西他濱或低劑量阿糖胞苷組合，和 (iii) 格拉吉布（glasdegib）與低劑量阿糖胞苷組合。在一些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者對先前的急性骨髓性白血病療法沒有反應或難以治療。在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者對一種或多種化學療法方案，特別是含阿糖胞苷的方案沒有反應或難以治療。在其他實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者在用一種或多種化學療法方案，特別是含阿糖胞苷的方案治療後已經復發。
在某些實施方式中，根據本發明之方法待治療的患者先前已經接受了造血幹細胞移植。造血幹細胞移植可能是同種異體或自體造血幹細胞移植。在一個特定的實施方式中，根據本發明方法待治療的患者在接受造血幹細胞移植後已經復發。
本文所述之方法包括向患者投與特異性結合CD33和CD3的雙特異性抗體構建體。術語「抗體構建體」係指其中結構和/或功能係基於抗體（例如全長免疫球蛋白分子）或其抗原結合片段的結構和/或功能的分子。因此，抗體構建體特異性結合其靶標或抗原，和/或抗體構建體包含衍生自或為抗體或其片段的重鏈可變區（VH）和/或輕鏈可變區（VL）的結構域。根據本發明之抗體構建體通常包含一個或多個結合結構域，每個結合結構域通常將包含允許特異性靶標結合的抗體的最低結構要求。例如，可以藉由存在至少三個輕鏈「互補決定區」或CDR（即VL區的CDRL1、CDRL2和CDRL3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDRH1、CDRH2和CDRH3）來定義此最低要求，較佳的是來自輕鏈和重鏈可變區的所有六個CDR。根據本發明之抗體構建體所基於的抗體包括例如單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體。
較佳的是，本發明之方法中使用的抗體構建體係蛋白質，並包含一個或多個多肽鏈。如本文所用的多肽係指包含至少50個胺基酸，較佳的是至少100個胺基酸的胺基酸聚合物。在一些實施方式中，根據本發明之方法投與的抗體構建體係單鏈多肽。在其他實施方式中，根據本發明之方法投與的抗體構建體包含兩條或更多條多肽鏈，例如是多肽二聚體或多聚體。在某些實施方式中，根據本發明之方法投與的抗體構建體包含四個多肽鏈，並且可以例如具有抗體或免疫球蛋白的形式。
如本文所使用，術語「抗體」通常是指包含兩個輕鏈多肽（各自約25 kDa）和兩個重鏈多肽（各自約50-70 kDa）的四聚免疫球蛋白。術語「輕鏈」或「免疫球蛋白輕鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）和單一免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL）的多肽。免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL）可以為人類κ或人類λ恒定結構域。術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白重鏈可變區（VH）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（CH1）、免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（CH2）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（CH3）和視需要免疫球蛋白重鏈恒定結構域4（CH4）的多肽。重鏈分類為mu（μ）、delta（Δ）、gamma（γ）、alpha（α）、和epsilon（ε）鏈，且其分別將抗體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG類別和IgA類別的抗體進一步細分為數個亞類，即分別為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗體中的重鏈具有三個恒定結構域（CH1、CH2和CH3），而IgM和IgE抗體中的重鏈具有四個恒定結構域（CH1、CH2、CH3和CH4）。免疫球蛋白重鏈恒定結構域可以來自任何免疫球蛋白同種型，包括亞型。抗體鏈係經由在CL結構域與CH1結構域之間（即，在輕鏈與重鏈之間）和在兩條抗體重鏈的鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。
免疫球蛋白鏈的可變區一般展現相同總體結構，包含由三個高變區（更通常稱為「互補性決定區」或CDR）連接的相對保守的構架區（FR）。來自每個重鏈和輕鏈對的兩條鏈的CDR通常藉由框架區對齊以形成與靶蛋白（例如CD33或CD3）上的特定表位特異性結合的結構。自N末端至C末端，天然存在的輕鏈和重鏈可變區典型地遵循該等元件的以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。編號系統係將編號指派給在該等結構域的每一個中佔據位置的胺基酸來獲得。此編號系統定義於以下文獻中：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學感興趣的蛋白質序列]（1987及1991, 美國國家衛生研究院（NIH）, 貝塞斯達（Bethesda）, 馬里蘭州（MD））；或Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342: 878-883。給定抗體的互補決定區（CDR）和框架區（FR）可以使用此系統標識。用於免疫球蛋白鏈中的胺基酸的其他編號系統包括IMGT® （國際ImMunoGeneTics資訊系統；Lefranc等人，Dev. Comp. Immunol. [發展與比較免疫學] 29: 185-203; 2005）和AHo（Honegger和Pluckthun, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 309 (3): 657-670; 2001）。
本發明之方法中使用的抗體構建體係雙特異性抗體構建體。術語「雙特異性抗體構建體」係指能夠特異性結合兩種不同抗原的分子。在本發明之背景下，此類雙特異性抗體構建體特異性結合靶細胞的細胞表面上的CD33（例如人類CD33）和T細胞的細胞表面上的CD3（例如人類CD3）。術語「抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體」在本文中指與CD33和CD3特異性結合的雙特異性抗體構建體。當抗原結合蛋白在類似結合測定條件下對靶抗原的結合親和力明顯高於其對其他不相關蛋白質的親和力且因此能夠相區分時，該抗體構建體或結合結構域「特異性結合至」該抗原。特異性結合抗原的抗體構建體或其結合結構域可以以平衡解離常數（KD ）≤ 1 x 10-6 M結合至抗原。當KD ≤ 1 x 10-8 M時，抗體構建體或其結合結構域以「高親和力」特異性結合抗原。在一個實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 5 × 10-9 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在另一實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 1 × 10-9 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在又另一實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 5 × 10-10 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在另一實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 1 × 10-10 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在某些實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 5 × 10-11 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在另外的實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 1 × 10-11 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在一個具體的實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 5 × 10-12 M結合至人類CD33和/或人類CD3。在另一個具體的實施方式中，本發明之方法中使用的抗體構建體或其結合結構域以KD ≤ 1 × 10-12 M結合至人類CD33和/或人類CD3。
使用多種技術確定親和力，其中一個實例係親和力ELISA測定。在各種實施方式中，藉由表面電漿共振測定（例如，基於BIAcore® 的測定）確定親和力。使用此方法，可以測量締合速率常數（以M-1 s-1 表示的ka ）和解離速率常數（以s-1 表示的kd ）。平衡解離常數（KD ，以M表示）則可以由動力學速率常數的比率（kd /ka ）計算。在一些實施方式中，藉由動力學方法，例如Rathanaswami等人，Analytical Biochemistry [分析生物化學]，第373卷：52-60, 2008中所描述的動力學排除測定（KinExA）確定親和力。使用KinExA測定，可以測量平衡解離常數（以M表示的KD ）和締合速率常數（以M-1 s-1 表示的ka ）。解離速率常數（以s-1 表示的kd ）可以由該等值計算（KD x ka ）。在其他實施方式中，藉由生物膜層干涉法，例如Kumaraswamy等人，Methods Mol. Biol. [分子生物學方法]，第1278卷：165-82, 2015中所描述且用於Octet®系統（佛特比奧公司（Pall ForteBio））中之方法確定親和力。動力學常數（ka 和kd ）和親和力常數（KD ）可以使用生物膜層干涉法即時計算。在一些實施方式中，本文所述之抗體構建體或其結合結構域表現出期望的特性，例如藉由Kd （解離速率常數）測量的對於人類CD33和/或人類CD3的約10-2 、10-3 、10-4 、10-5 、10-6 、10-7 、10-8 、10-9 、10-10 s-1 或更低的結合親合力（更低的值表示更高的結合親合力）、和/或藉由KD （平衡解離常數）測量的對於人類CD33和/或人類CD3約10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、10-12 M或更低的結合親和力（更低的值表示更高的結合親和力）。
在一些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體可以是抗體並且具有全長免疫球蛋白的一般結構。例如，該雙特異性抗體構建體可以包含兩個全長抗體重鏈和兩個全長抗體輕鏈。在特定的實施方式中，雙特異性抗體構建體係異二聚抗體（在此可與「異免疫球蛋白」或「異Ig」互換使用），其指的是包含兩個不同輕鏈和兩個不同重鏈的抗體。例如，在一些實施方式中，異二聚體抗體包含來自抗CD33抗體的輕鏈和重鏈以及來自抗CD3抗體的輕鏈和重鏈。
本發明之方法中採用的雙特異性抗體構建體可以包含全長抗體的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、輕鏈（VL-CL）、Fd（VH-CH1）、重鏈、Fab、Fab’、F(ab')2或「r IgG」（由重鏈和輕鏈組成的「半抗體」）。根據本發明之雙特異性抗體構建體還可以包含抗體的修飾的片段，也稱為抗體變體或抗體衍生物。實例包括但不限於單鏈可變片段（scFv）、di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、單鏈Fab（scFab）、Fab2 、Fab3 、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體（Tandab）、串聯di-scFv、串聯tri-scFv、「微型抗體」（其由如下結構示例：(VH-VL-CH3)2 、(scFv-CH3)2 、((scFv)2 -CH3 + CH3)、((scFv)2 -CH3)或(scFv-CH3-scFv)2 ）、多體抗體如三抗體（triabody）或四抗體（tetrabody）、和單結構域抗體（如奈米抗體或僅包含一個可變區的單可變結構域抗體，該結構域可以是VHH、VH或VL，它獨立於其他可變區或結構域而特異性結合抗原或靶標）。
在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體係多價的。抗體構建體的價表示抗體構建體內單個抗原結合結構域的數量。例如，在本發明之上下文中，關於抗體構建體的術語「單價」、「二價」和「四價」係指分別具有一個、兩個和四個抗原結合結構域的抗體構建體。因此，多價抗體構建體包含兩個或更多個抗原結合結構域。抗體構建體可以具有比特異性更多的抗原結合結構域（例如，更高的價）。例如，具有針對第一靶標（例如CD33）的兩個抗原結合結構域和針對第二靶標（CD3）的一個抗原結合結構域（反之亦然）的抗體構建體被認為係三價的（三個抗原結合結構域）和雙特異性的（與兩種抗原結合）。在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體係二價的。因此，這種雙特異性、二價抗體構建體包含兩個抗原結合結構域：針對（例如人類CD33）CD33的一個抗原結合結構域和針對CD3（例如人類CD3）的一個抗原結合結構域。
在一些實施方式中，在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含與CD33（例如人類CD33）特異性結合的第一結合結構域和與CD3（例如人類CD3）特異性結合的第二結合結構域。如本文所用，術語「抗原結合結構域」可與「結合結構域」互換使用，係指抗體構建體的區域，該區域含有與抗原相互作用並賦予抗體構建體對抗原的特異性和親和力的胺基酸殘基。在某些實施方式中，抗體構建體的結合結構域可以衍生自抗體或其抗原結合片段。例如，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的結合結構域可以包含與人類CD33和/或人類CD3特異性結合的抗體輕鏈和重鏈可變區的一個或多個互補決定區（CDR）。在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含本文所述之抗CD33抗體的重鏈和輕鏈可變區的所有六個CDR，並且雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含本文所述之抗CD3抗體的重鏈和輕鏈可變區的所有六個CDR。在一些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的結合結構域（抗CD33結合結構域、抗CD3結合結構域或兩者）包括Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、單鏈可變片段（scFv）或奈米抗體。在一個實施方式中，兩個結合結構域皆為Fab片段。在另一個實施方式中，一個結合結構域係Fab片段，另一個結合結構域係scFv。在又另一個實施方式中，兩個結合結構域皆為scFv。
在本發明之上下文中，「抗原結合片段」與「結合片段」或「片段」在本文中可互換使用，指抗體中不含全長重鏈和/或輕鏈中存在的胺基酸的至少一部分，但仍能夠特異性結合至抗原的部分。抗原結合片段包括但不限於單鏈可變片段（scFv）、奈米抗體（例如駱駝科重鏈抗體的VH結構域；VHH片段，參見Cortez-Retamozo等人, Cancer Research [癌症研究], 第64卷: 2853-57, 2004）、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv片段、Fd片段和互補決定區（CDR）片段，並且可以衍生自任何哺乳動物來源，例如人、小鼠、大鼠、兔或駱駝科動物。抗原結合片段可以與完整抗體競爭結合靶抗原且該等片段可以藉由修飾完整抗體（例如酶或化學裂解）或使用重組DNA技術或肽合成從頭合成獲得。在一些實施方式中，抗原結合片段包含至少一個來自結合至抗原的抗體的CDR，例如來自結合至抗原的抗體的重鏈CDR3。在其他實施方式中，抗原結合片段包含來自結合至抗原的抗體的重鏈的全部三個CDR或來自結合至抗原的抗體的輕鏈的全部三個CDR。在又其他實施方式中，抗原結合片段包含來自結合至抗原的抗體的全部六個CDR（三個來自重鏈且三個來自輕鏈）。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段均具有一個抗原結合位點，而一個殘留的「Fc」片段則包含免疫球蛋白重鏈恒定區的第一個結構域以外的所有結構域。Fab片段包含來自輕鏈和重鏈的可變結構域，以及輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域（CH1）。因此，「Fab片段」由一個免疫球蛋白輕鏈（輕鏈可變區（VL）和恒定區（CL））以及一個免疫球蛋白重鏈的CH1結構域和可變區（VH）構成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。「Fd片段」包含來自免疫球蛋白重鏈的VH和CH1結構域。Fd片段代表Fab片段的重鏈組分。
免疫球蛋白的「Fc片段」或「Fc區」一般包含兩個恒定結構域，即CH2結構域和CH3結構域，且視需要包含CH4結構域。在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含來自免疫球蛋白的Fc區。Fc區可以是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含來自人類IgG1或人類IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3結構域。Fc區可以保持效應子功能，例如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和吞噬作用。在其他實施方式中，Fc區可以修飾成降低或消除效應子功能。
「Fab'片段」係在CH1結構域的C末端具有一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸殘基的Fab片段。
「F(ab')2 片段」係包含兩個Fab'片段的二價片段，該兩個Fab'片段藉由在鉸鏈區的重鏈之間的二硫橋連接。
「Fv」片段係包含來自抗體的完整抗原識別和結合位點的最小片段。該片段由一個免疫球蛋白重鏈可變區（VH）和一個免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）緊密非共價結合的二聚體組成。正係在這種構型中，每個可變區的三個CDR相互作用，以在VH-VL二聚體表面定義抗原結合位點。單個輕鏈或重鏈可變區（或僅包含三個對抗原特異的CDR的Fv片段的一半）具有識別和結合抗原的能力，儘管其親和力低於包含VH和VL的整個結合位點。
「單鏈可變片段」或「scFv片段」包含抗體的VH和VL區，其中該等區存在於單個多肽鏈中，並且視需要包含VH和VL區域之間的肽連接子，該肽連接子使Fv能夠形成用於抗原結合的所需結構（參見例如，Bird等人, Science [科學], 第242: 423-426, 1988；和Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院報], 第85卷: 5879-5883, 1988）。
「奈米抗體」係重鏈抗體的重鏈可變區。這類可變結構域係這類重鏈抗體中最小的全功能抗原結合片段，分子量僅為15 kDa。參見Cortez-Retamozo等人,Cancer Research [癌症研究] 64: 2853-57, 2004。不含輕鏈的功能性重鏈抗體天然存在於某些動物物種中，例如護士鯊、沃比貢鯊和駱駝科，例如駱駝、單峰駱駝、羊駝和美洲駝。在該等動物中，抗原結合位點被減少為單一結構域，即VHH結構域。該等抗體僅使用重鏈可變區形成抗原結合區，即，該等功能性抗體係僅具有結構H2 L2 的重鏈同二聚體（稱為「重鏈抗體」或「HCAb」）。據報導，駱駝化的VHH與IgG2和IgG3恒定區重組，該等恒定區含有鉸鏈、CH2和CH3結構域並且缺少CH1結構域。已發現駱駝化VHH結構域以高親和力與抗原結合（Desmyter等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌], 卷276: 26285-90, 2001）並在溶液中具有高穩定性（Ewert等人, Biochemistry [生物化學], 第41卷: 3628-36, 2002）。用於產生具有駱駝化重鏈的抗體之方法在例如美國專利公開號2005/0136049和2005/0037421中描述。可替代的支架可以由更接近於鯊魚V-NAR支架的人可變樣結構域製成，並且可能提供用於長穿透環結構的框架。
在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的結合結構域包含與期望的抗原特異性結合的抗體或抗體片段的免疫球蛋白重鏈可變區（VH）和免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）。例如，本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含來自抗CD33抗體（例如本文所述之任何抗CD33抗體或其片段）的VH區和VL區，並且抗CD3結合結構域包含來自抗CD3抗體（例如本文所述之任何抗CD3抗體或其片段）的VH區和VL區。與人類CD33或人類CD3特異性結合的結合結構域可以衍生自針對該等抗原的已知抗體或衍生自藉由使用抗原蛋白或其片段藉由頭免疫方法、藉由噬菌體展示或其他本文描述的或本領域已知之方法獲得的新抗體或抗體片段，或。衍生出雙特異性抗體構建體的結合結構域的抗體可以是單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。在某些實施方式中，衍生結合結構域的抗體係單株抗體。在該等和其他實施方式中，抗體係人抗體或人源化抗體，並且可以是IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-型。
本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的第一結合結構域特異性結合CD33，較佳的是人類CD33。該結合結構域在本文中稱為抗CD33結合結構域。CD33（分化簇33；也稱為結合唾液酸的Ig樣凝集素3（Siglec-3）、gp67或p67）係在骨髓譜系細胞上表現的跨膜受體。更較佳的是，第一結合結構域結合靶細胞表面上的CD33。「靶細胞」可以是在其表面表現CD33的任何原核或真核細胞；較佳的是，靶細胞係人類或動物體的一部分的細胞，例如特異性表現CD33的癌細胞或腫瘤細胞。此外，設想雙特異性抗體構建體的第一結合結構域結合至人類CD33，較佳的是結合至靶細胞表面上的人類CD33。還設想第一結合結構域結合至獼猴CD33，較佳的是結合至靶細胞表面上的獼猴CD33。下表1中提供了人類CD33和獼猴CD33的成熟多肽和細胞外結構域的示例性胺基酸序列。 [表 1 ]. 人類和獼猴 CD33 多肽的序列
多肽 序列
人類CD33 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ（SEQ ID NO: 1）
獼猴CD33 DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGAIGGAGVTVLLALCLCLIFFTVKTHRRKAARTAVGRIDTHPATGPTSSKHQKKSKLHGATETSGCSGTTLTVEMDEELHYASLNFHGMNPSEDTSTEYSEVRTQ（SEQ ID NO: 2）
人類CD33的細胞外結構域 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGV VH（SEQ ID NO: 3）
獼猴CD33的細胞外結構域 DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGAI（SEQ ID NO: 4）
在WO 2008/119567中（該文獻藉由引用以其整體結合在此）描述了抗CD33結合結構域的實例，從中可以構建或衍生出本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的第一結合結構域。表2A和2B分別列出了可衍生或構建雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域的示例性抗人類CD33抗體的輕鏈和重鏈可變區以及相關的CDR。 [表 2A ]. 示例性抗人類 CD33 抗體輕鏈可變區胺基酸序列
抗體ID. VL 組 VL 胺基酸序列 CDRL1 CDRL2 CDRL3
01、02、03、04 LV-01 DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 15) KSSQSVLDSSKNKNSLA (SEQ ID NO: 5) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
05 LV-02 DIVMTQSPDSMTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLDIK (SEQ ID NO: 16) KSSQSVLDSSTNKNSLA (SEQ ID NO: 6) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
06 LV-03 DIVMTQSPDSLSVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 17) KSSQSVLDSSTNKNSLA (SEQ ID NO: 6) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
07 LV-04 DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSNNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDGLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 18) KSSQSVLDSSNNKNSLA (SEQ ID NO: 7) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
08    LV-05 DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 19) KSSQSVLDSSTNKNSLA (SEQ ID NO: 6) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
09 LV-06 DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKS (SEQ ID NO: 20) KSSQSVLDSSTNKNSLA (SEQ ID NO: 6) WASTRES (SEQ ID NO: 8) QQSAHFPIT (SEQ ID NO: 9)
[表 2B ]. 示例性抗人類 CD33 抗體重鏈可變區胺基酸序列
抗體ID. VH 組 VH 胺基酸序列 CDRH1 CDRH2 CDRH3
01 HV-01 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMSSDTSTSTAYLEINSLRSDDTAIYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 21) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 11) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
02 HV-02 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYLELHNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 22) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 11) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
03 HV-03 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRNDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 23) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 11) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
04 HV-04 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYMEISSLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 11) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
05、06 HV-05 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGETNYADKFQGRVTFTSDTSTSTAYMELRNLKSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 25) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGETNYADKFQG (SEQ ID NO: 12) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
07 HV-06 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADKFQG (SEQ ID NO: 13) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
08    HV-07 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 27) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADKFQG (SEQ ID NO: 13) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
09 HV-08 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 28) NYGMN (SEQ ID NO: 10) WINTYTGEPTYADKFQG (SEQ ID NO: 13) WSWSDGYYVYFDY (SEQ ID NO: 14)
適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的與人類CD33特異性結合的結構域（例如抗CD33結合結構域）可以包含表2A和2B分別顯示的輕鏈CDR（即CDRL）和/或重鏈了CDR（即CDRH）中一個或多個。例如，在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含選自SEQ ID NO: 5至7的序列的CDRL1；含SEQ ID NO: 8的序列的CDRL2；含SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3；含SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1；含選自SEQ ID NO: 11至13的序列的CDRH2；和含SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3。
在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 5、8和9的序列；(b) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 6、8和9的序列；或 (c) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 7、8和9的序列。在該等和其他實施方式中，雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含重鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、11和14的序列；(b) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、12和14的序列；或 (c) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、13和14的序列。
在某些實施方式中，適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區和含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中： (a) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 5、8和9的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、11和14的序列； (b) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 6、8和9的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、12和14的序列； (c) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 7、8和9的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、13和14的序列；或 (d) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 6、8和9的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 10、13和14的序列。在一個較佳的實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含 (i) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO: 6的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 8的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3，和 (ii) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 13的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3。
在一些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含來自與人類CD33特異性結合的抗體（例如本文所述之抗體）的免疫球蛋白重鏈可變區（VH）和免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）。「可變區」在本文中與「可變結構域」可互換使用（輕鏈可變區（VL）、重鏈可變區（VH）），直接參與抗體與抗原的結合的輕鏈和重鏈免疫球蛋白各自的區域。如上文所論述，可變輕鏈和重鏈的區域具有相同的一般結構且各區域包含由三個CDR連接的四個構架（FR）區，其序列高度保守。構架區呈β-折疊構形且CDR可以形成連接該β-折疊結構的環。各鏈中的CDR藉由構架區保持其三維結構，且與來自另一鏈的CDR一起形成抗原結合位點。因此，在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域可包含選自LV-01至LV-06（SEQ ID NO: 15-20）的輕鏈可變區（如表2A所示）和/或選自HV-01至HV-08（SEQ ID NO: 21-28）的重鏈可變區（如表2B所示）以及該等輕鏈和重鏈可變區的結合片段、衍生物和變體。
表2A中所列輕鏈可變區各自可以與表2B中所列重鏈可變區中的任一個組合形成根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域。此類組合的實例包括但不限於：(i) LV-01和HV-01；(ii) LV-01和HV-02；(iii) LV-01和HV-03；(iv) LV-01和HV-04；(v) LV-02和HV-05；(vi) LV-03和HV-05；(vii) LV-04和HV-06；(viii) LV-05和HV-07；和 (ix) LV-06和HV-08。
在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 15的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 21的序列的重鏈可變區。在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 15的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 22的序列的重鏈可變區。在其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 15的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 23的序列的重鏈可變區。在仍其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 15的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 24的序列的重鏈可變區。在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 16的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 25的序列的重鏈可變區。在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 17的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 25的序列的重鏈可變區。在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 18的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 26的序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 19的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 27的序列的重鏈可變區。在一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包含含SEQ ID NO: 20的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 28的序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與表2A中的輕鏈可變區序列，即，選自LV-01至LV-06的VL在僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處差異的連續胺基酸的序列的輕鏈可變區，其中此類序列差異各自獨立地為一個胺基酸的缺失、插入或取代，且該等缺失、插入和/或取代相對於前述可變結構域序列引起不超過15個胺基酸變化。一些抗CD33結合結構域中的輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15至20（即，表2A中的輕鏈可變區）的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 15-20的序列至少90%相同的序列的輕鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 15-20的序列至少95%相同的序列的輕鏈可變區。在又另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含選自SEQ ID NO: 15-20的序列的輕鏈可變區。
在該等和其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與表2B中的重鏈可變區序列，即，選自HV-01至HV-08的VH在僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處差異的連續胺基酸的序列的重鏈可變區，其中此類序列差異各自獨立地為一個胺基酸的缺失、插入或取代，且該等缺失、插入和/或取代相對於前述可變結構域序列引起不超過15個胺基酸變化。一些抗CD33結合結構域中的重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 21至28（即，表2B中的重鏈可變區）的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 21-28的序列至少90%相同的序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 21-28的序列至少95%相同的序列的重鏈可變區。在又另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域包括含選自SEQ ID NO: 21-28的序列的重鏈可變區。
如本文所使用，術語「同一性」係指如藉由比對並比較兩個或兩個以上多肽分子或者兩個或多個核酸分子的序列所確定的該等序列之間的關係。如本文所使用，「同一性百分比」意謂在所比較的分子中胺基酸或核苷酸之間一致殘基的百分比，且以所比較的最小分子的大小為基準計算。對於該等計算，須利用特定數學模型或計算器程式（即，「演算法」）解決比對中的空位（若存在的話）。可以用於計算所比對的核酸或多肽的同一性之方法包括以下中所描述之方法：Computational Molecular Biology [計算分子生物學], (Lesk, A. M. 編輯), 1988, New York: Oxford University Press [紐約：牛津大學出版社]；Biocomputing Informatics and Genome Projects [生物計算資訊學和基因組計畫], (Smith, D. W. 編輯), 1993, New York: Academic Press [紐約：學術出版社]；Computer Analysis of Sequence Data [序列數據的電腦分析], Part I [第I部分], (Griffin, A. M. 和Griffin, H. G. 編輯), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje [新澤西：胡瑪納出版社], von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology [分子生物學中的序列分析], New York: Academic Press [紐約：學術出版社]；Sequence Analysis Primer [序列分析入門], (Gribskov, M. 和Devereux, J. 編輯), 1991, New York: M. Stockton Press [紐約：M. Stockton出版社]；以及Carillo等人, 1988, SIAM J. Applied Math. [工業與應用數學學會] 48: 1073。例如，可以藉由常用於比較兩個多肽的胺基酸位置相似性的標準方法確定序列同一性。使用計算器程式，例如BLAST或FASTA，將兩個多肽或兩個多核苷酸比對以實現其各自殘基的最佳匹配（沿一個或兩個序列的全長，或沿一個或兩個序列的預定部分）。該等程式提供預設開放罰分和預設空位罰分，和評分矩陣，例如PAM 250（Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白質序列和結構圖集]，第5卷，第3增刊, 1978），或者可以將BLOSUM62（Henikoff等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國科學院院報] 89: 10915-10919）與計算器程式結合使用。例如，同一性百分比接著可以計算如下：一致匹配的總數乘以100且接著除以匹配範圍內較長序列的長度與引入該等較長序列中以便比對兩個序列的空位數量的總和。在計算同一性百分比時，以實現各序列間最大匹配的方式比對所比較的序列。
GCG套裝程式係可以用於測定同一性百分比的計算器程式，該套裝程式包括GAP（Devereux等人，1984, Nucl. Acid Res. [核酸研究] 12: 387；Genetics Computer Group [遺傳學電腦組], University of Wisconsin [威斯康辛大學], Madison [麥迪森], WI [威斯康辛洲]）。計算器演算法GAP係用於比對待確定序列同一性百分比的兩個多肽或兩個多核苷酸。比對序列以使它們各自的胺基酸或核苷酸達到最佳匹配（提供演算法確定的「匹配範圍」）。空位開放罰分（以3x對角線平均值計算，其中「對角線平均值」係所用比較矩陣的對角線的平均值；「對角線」係由特定比較矩陣賦予每個完美胺基酸匹配的評分或數字）和空位延伸罰分（通常為空位開放罰分的1/10倍）以及比較矩陣，例如PAM 250或BLOSUM 62，係與該演算法結合使用。在某些實施方式中，該演算法還使用標準比較矩陣（關於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白質序列和結構圖譜] 5: 345-352；關於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 89: 10915-10919）。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推薦參數包括以下： 演算法：Needleman等人, 1970, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48: 443-453； 比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人, 1992, 同上文； 空位罰分：12（但是末端空位無罰分） 空位長度罰分：4 相似性閾值：0
用於比對兩個胺基酸序列的某些比對方案可以使這兩個序列中僅較短區域匹配，且此較小比對區可以具有極高序列同一性，即使該兩個全長序列之間並無明顯關係。因此，必要時，可以調整所選比對方法（GAP程式）以在靶多肽的至少50個連續胺基酸範圍內進行比對。
本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的第二結合結構域特異性結合CD3，較佳的是人類CD3。該結合結構域在本文中稱為抗CD3結合結構域。「CD3」（分化簇3）係由四條鏈組成的T細胞共受體。在哺乳動物中，CD3蛋白複合物含有CD3γ（伽馬）鏈、CD3δ（德爾塔）鏈和兩條CD3ε（伊蒲賽龍）鏈。這四條鏈與T細胞受體（TCR）和所謂的ζ（截塔）鏈締合以形成「T細胞受體複合物」並在T淋巴細胞中生成激活訊號。CD3γ（伽馬）、CD3δ（德爾塔）和CD3ε（伊蒲賽龍）鏈係免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白，並且每個含有單一細胞外免疫球蛋白結構域。CD3分子的細胞內尾含有對於TCR的傳訊能力所必需的單一保守模體，稱為基於免疫受體酪胺酸的激活模體（ITAM）。CD3ε分子係多肽，該多肽在人中由位於染色體11上的CD3E 基因編碼。
重定向裂解靶細胞（經由抗體構建體募集T細胞）通常涉及細胞溶解突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送，該抗體構建體結合T細胞上的CD3和靶細胞（例如髓樣細胞）上的靶蛋白（例如CD33）。接合的T細胞能夠連續靶細胞溶解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制的影響；參見例如，WO 2007/042261。
在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的第二結合結構域與T細胞表面上的CD3特異性結合，更較佳的是與T細胞表面上的人類CD3特異性結合。在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體的第二結合結構域特異性結合CD3ε，較佳的是人類CD3ε，例如T細胞表面上的人類CD3ε。人類CD3ε的胞外結構域的示例性胺基酸序列在下面以SEQ ID NO: 29提供： 1    QDGNEEMGGI TQTPYKVSIS GTTVILTCPQ YPGSEILWQH NDKNIGGDED DKNIGSDEDH 61  LSLKEFSELE QSGYYVCYPR GSKPEDANFY LYLRARVCEN CMEMD（SEQ ID NO: 29）
在WO 2007/042261和WO 2008/119567（兩者的內容藉由引用以其整體結合在此）中描述了抗CD3結合結構域的實例，從中可以構建或衍生出本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的第二結合結構域。表3A和3B分別列出了可衍生或構建雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域的示例性抗人類CD3抗體的輕鏈和重鏈可變區以及相關的CDR。 [表 3A ]. 示例性抗人類 CD3 抗體輕鏈可變區胺基酸序列
抗體ID. VL 組 VL 胺基酸序列 CDRL1 CDRL2 CDRL3
101、102、103、104、106、108 LV-101 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 57) GSSTGAVTSGYYPN (SEQ ID NO: 30) GTKFLAP (SEQ ID NO: 33) ALWYSNRWV (SEQ ID NO: 35)
105、107 LV-102 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 58) RSSTGAVTSGYYPN (SEQ ID NO: 31) ATDMRPS (SEQ ID NO: 34) ALWYSNRWV (SEQ ID NO: 35)
109、110 LV-103 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 59) GSSTGAVTSGNYPN (SEQ ID NO: 32) GTKFLAP (SEQ ID NO: 33) VLWYSNRWV (SEQ ID NO: 36)
[表 3B ]. 示例性抗人類 CD3 抗體重鏈可變區胺基酸序列
抗體ID. VH 組 VH 胺基酸序列 CDRH1 CDRH2 CDRH3
101    HV-101 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 60) IYAMN (SEQ ID NO: 37) RIRSKYNNYATYYADSVKS (SEQ ID NO: 43) HGNFGNSYVSFFAY (SEQ ID NO: 48)
102、110 HV-102 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 61) KYAMN (SEQ ID NO: 38) RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 44) HGNFGNSYISYWAY (SEQ ID NO: 49)
103 HV-103 EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 62) SYAMN (SEQ ID NO: 39) RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) HGNFGNSYLSFWAY (SEQ ID NO: 50)
104 HV-104 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63) RYAMN (SEQ ID NO: 40) RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 45)    HGNFGNSYLSYFAY (SEQ ID NO: 51)
105 HV-105 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64) VYAMN (SEQ ID NO: 41) RIRSKYNNYATYYADSVKK (SEQ ID NO: 46) HGNFGNSYLSWWAY (SEQ ID NO: 52)
106 HV-106 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) KYAMN (SEQ ID NO: 38) RIRSKYNNYATYYADSVKS (SEQ ID NO: 43) HGNFGNSYTSYYAY (SEQ ID NO: 53)
107 HV-107 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) GYAMN (SEQ ID NO: 42) RIRSKYNNYATYYADSVKE (SEQ ID NO: 47)    HRNFGNSYLSWFAY (SEQ ID NO: 54)
108 HV-108 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67) VYAMN (SEQ ID NO: 41) RIRSKYNNYATYYADSVKK (SEQ ID NO: 46) HGNFGNSYISWWAY (SEQ ID NO: 55)
109 HV-109 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 68) SYAMN (SEQ ID NO: 39) RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) HGNFGNSYVSWWAY (SEQ ID NO: 56)
適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的與人類CD3特異性結合的結構域（例如抗CD3結合結構域）可以包含表3A和3B分別顯示的輕鏈CDR（即CDRL）和/或重鏈了CDR（即CDRH）中一個或多個。例如，在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含選自SEQ ID NO: 30至32的序列的CDRL1；含SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34的序列的CDRL2；含SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3；含選自SEQ ID NO: 37至42的序列的CDRH1；含選自SEQ ID NO: 43至47的序列的CDRH2；和含選自SEQ ID NO: 48至56的序列的CDRH3。
在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列；(b) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 31、34和35的序列；或 (c) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 32、33和36的序列。在該等和其他實施方式中，雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含重鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 37、43和48的序列；(b) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 38、44和49的序列；(c) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 39、45和50的序列；(d) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 40、45和51的序列；(e) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 41、46和52的序列；(f) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 38、43和53的序列；(g) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 42、47和54的序列；(h) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 41、46和55的序列；或 (i) CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 39、45和56的序列。
在某些實施方式中，適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區和含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中： (a) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 37、43和48的序列； (b) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 38、44和49的序列； (c) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 39、45和50的序列； (d) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 40、45和51的序列； (e) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 31、34和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 41、46和52的序列； (f) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 38、43和53的序列； (g) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 31、34和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 42、47和54的序列； (h) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 30、33和35的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 41、46和55的序列； (i) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 32、33和36的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 39、45和56的序列；或 (j) CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO: 32、33和36的序列，且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO: 38、44和49的序列。在一個較佳的實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含 (i) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO: 32的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 33的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3，和 (ii) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO: 38的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 44的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 49的序列的CDRH3。
根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域可包含選自LV-101至LV-103（SEQ ID NO: 57-59）的輕鏈可變區（如表3A所示）和/或選自HV-101至HV-109（SEQ ID NO: 60-68）的重鏈可變區（如表3B所示）以及該等輕鏈和重鏈可變區的結合片段、衍生物和變體。表3A中所列輕鏈可變區各自可以與表3B中所列重鏈可變區中的任一個組合形成根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域。此類組合的實例包括但不限於：(i) LV-101和HV-101；(ii) LV-101和HV-102；(iii) LV-101和HV-103；(iv) LV-101和HV-104；(v) LV-101和HV-106；(vi) LV-101和HV-108；(vii) LV-102和HV-105；(viii) LV-102和HV-107；(ix) LV-103和HV-109；和 (x) LV-103和HV-102。
在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 60的序列的重鏈可變區。在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 61的序列的重鏈可變區。在其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 62的序列的重鏈可變區。在仍其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 63的序列的重鏈可變區。在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 58的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 64的序列的重鏈可變區。在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 65的序列的重鏈可變區。在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 58的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 66的序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 57的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 67的序列的重鏈可變區。在一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 59的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 61的序列的重鏈可變區。在另一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包含含SEQ ID NO: 59的序列的輕鏈可變區和含SEQ ID NO: 68的序列的重鏈可變區。
在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與表3A中的輕鏈可變區序列，即，選自LV-101至LV-103的VL在僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處差異的連續胺基酸的序列的輕鏈可變區，其中此類序列差異各自獨立地為一個胺基酸的缺失、插入或取代，且該等缺失、插入和/或取代相對於前述可變結構域序列引起不超過15個胺基酸變化。一些抗CD3結合結構域中的輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 57至59（即，表3A中的輕鏈可變區）的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 57-59的序列至少90%相同的序列的輕鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 57-59的序列至少95%相同的序列的輕鏈可變區。在又另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含選自SEQ ID NO: 57-59的序列的輕鏈可變區。
在該等和其他實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與表3B中的重鏈可變區序列，即，選自HV-101至HV-109的VH在僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處差異的連續胺基酸的序列的重鏈可變區，其中此類序列差異各自獨立地為一個胺基酸的缺失、插入或取代，且該等缺失、插入和/或取代相對於前述可變結構域序列引起不超過15個胺基酸變化。一些抗CD3結合結構域中的重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 60至68（即，表3B中的重鏈可變區）的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 60-68的序列至少90%相同的序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含與選自SEQ ID NO: 60-68的序列至少95%相同的序列的重鏈可變區。在又另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD3結合結構域包括含選自SEQ ID NO: 60-68的序列的重鏈可變區。
根據某些實施方式，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的一個或多個結合結構域呈scFv的形式。在scFv中，VH區和VL區以VH-VL或VL-VH的順序排列（從N末端至C末端）。設想第一結構域和/或第二結合結構域的VH區和VL區經由連接子（較佳的是肽連接子）連接。在第一結構域和/或第二結合結構域的一個實施方式中，VH區位於連接子的N末端，並且VL區位於連接子的C末端。連接子較佳的是肽連接子、更較佳的是短肽連接子。合適的連接子的實例包括但不限於： •    GGGG (SEQ ID NO: 69) •    GGGGS (SEQ ID NO: 70) •    GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71) •    GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 72) •    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 73) •    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 74) •    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 75) •    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 76) •    GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 77) •    PGGGGS (SEQ ID NO: 78) •    PGGDGS (SEQ ID NO: 79) •    SGGGGS (SEQ ID NO: 80) •    GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 81) •    GGGGQ (SEQ ID NO: 82)
在本發明之上下文中，「短」連接子具有在2個與50個之間的胺基酸，較佳的是在3個與35個之間、在4個與30個之間、在5個與25個之間、在6個與20個之間或在6個與17個之間的胺基酸。一個結合結構域的兩個可變區之間的連接子可以具有與兩個結合結構域之間的連接子不同的長度（例如，可以更長）。例如，一個或兩個結合結構域的兩個可變區之間的連接子可以具有8與16個胺基酸之間、較佳的是10與15個胺基酸之間的長度，並且兩個結合結構域之間的連接子可以具有3與10個胺基酸之間、較佳的是5與8之間的長度。進一步設想肽連接子係甘胺酸/絲胺酸連接子，如SEQ ID NO: 70-81中所描繪的那些。在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體的抗CD33結合結構域和/或抗CD3結合結構域係scFv，其從N末端到C末端包含VH區-肽連接子-VL區域，其中肽連接子包含甘胺酸-絲胺酸連接子，例如SEQ ID NO: 72所示的連接子。在相關的實施方式中，抗CD33和抗CD3結合結構域（例如scFv結構域）之間的肽連接子係SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 80所示的連接子。下表4中列出了適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的抗CD33和抗CD3結合結構域的示例性scFv結構域。 [表 4 ]. 示例性單鏈可變片段結合結構域
名稱 SEQ ID NO. 胺基酸序列
抗CD33 scFv 結構域
CD33 scFv-01 83 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMSSDTSTSTAYLEINSLRSDDTAIYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-02 84 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYLELHNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-03 85 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRNDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-04 86 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYMEISSLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-05 87 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGETNYADKFQGRVTFTSDTSTSTAYMELRNLKSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSMTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLDIK
CD33 scFv-06 88 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGETNYADKFQGRVTFTSDTSTSTAYMELRNLKSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLSVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-07 89 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSNNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDGLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-08 90 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
CD33 scFv-09 91 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIK
抗CD3 scFv 結構域
CD3 scFv-01 92 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-02 93 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-03 94 EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-04 95 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-05 96 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-06 97 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-07 98 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-08 99 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-09 100 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3 scFv-10 101 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
在某些實施方式中，適用於在本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含與人類CD33特異性結合並具有選自SEQ ID NO: 83-91中任一項的胺基酸序列的第一結合結構域，以及與人類CD3特異性結合並具有選自SEQ ID NO: 92-101中任一項的胺基酸序列的第二結合結構域。在一個較佳的實施方式中，雙特異性抗體構建體的第一結合結構域包含SEQ ID NO: 91的胺基酸序列。在另一個較佳的實施方式中，雙特異性抗體構建體的第二結合結構域包含SEQ ID NO: 101的胺基酸序列。
根據本發明之雙特異性抗體構建體可以包含表4中列出的任何抗CD33 scFv結合結構域與表4中列出的任何抗CD3 scFv結合結構域的組合。例如，在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體包含表4的抗CD33 scFv結合結構域和表4的抗CD3 scFv結合結構域，其中抗CD33 scFv結合結構域藉由肽連接子（例如本文描述的肽連接子）連接至抗CD3 scFv結合結構域。在某些實施方式中，雙特異性抗體構建體以胺基至羧基順序包含抗CD33 scFv結合結構域、肽連接子和抗CD3 scFv結合結構域。在一些這樣的實施方式中，肽連接子包含SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 80的序列。
根據本發明之雙特異性抗體構建體還可包含其他結構域，其例如可調節分子的藥物動力學特徵。例如，雙特異性抗體構建體可進一步包含免疫球蛋白Fc區，衍生自血清白蛋白（例如人類血清白蛋白）的結構域或白蛋白結合結構域（例如包含人類白蛋白結合肽），和/或與聚乙二醇鏈軛合以增加雙特異性抗體構建體的血清半衰期。在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體進一步包含一個或多個免疫球蛋白Fc區。每個免疫球蛋白Fc區或「Fc單體」通常至少包含來自免疫球蛋白分子的CH2結構域和CH3結構域。Fc單體可包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的CH2和CH3結構域。例如，CH2結構域包含IgG1免疫球蛋白的胺基酸231至340，並且CH3結構域包含IgG1免疫球蛋白的胺基酸341至446，其中胺基酸編號根據以下所述之EU編號系統進行：Edelman等人, Proc. Natl. Acad. USA [美國國家科學院院刊], 第63卷: 78-85 (1969) 和Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白的序列], 第5版Public Health Service, National Institutes of Health [美國國立衛生研究院公共衛生服務部] 公開號91-3242, 貝塞斯達，馬里蘭州 (1991)。CH2和CH3結構域的邊界可能從一個IgG同種型到另一個IgG同種型略有不同，但是IgG2、IgG3和IgG4中的CH2和CH3結構域可以藉由與IgG1中的CH2和CH3結構域進行比對來確定。
在一些實施方式中，Fc單體可包含免疫球蛋白鉸鏈區或其部分。免疫球蛋白鉸鏈區通常是由IgG免疫球蛋白的胺基酸216至231（根據EU編號系統）定義的區域。在某些實施方式中，Fc單體包含來自IgG1免疫球蛋白或其部分的鉸鏈區。在一些這樣的實施方式中，IgG1鉸鏈區包含胺基酸序列DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 102）或EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 103）。在其他實施方式中，Fc單體包含具有序列ERKCCVECPPCP（SEQ ID NO: 104）的IgG2鉸鏈區，具有序列ELKTPLDTTHTCPRCP（SEQ ID NO: 105）、EPKSCDTPPPCPRCP（SEQ ID NO: 106）、或ELKTPLGDTTHTCPRCP（SEQ ID NO: 107）的IgG3鉸鏈區，或具有序列ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 108) 的IgG4鉸鏈區。在某些實施方式中，Fc單體以胺基至羧基順序包含免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白CH2結構域、和免疫球蛋白CH3結構域。
在某些實施方式中，雙特異性抗體構建體包含具有一個Fc單體的結構域。在替代實施方式中，雙特異性抗體構建體包含具有兩個或更多個Fc單體的結構域。例如，在一個實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含具有兩個Fc單體的結構域。兩個Fc單體可以存在於分開的多肽鏈上並且締合形成二聚體，例如經由非共價相互作用和/或二硫鍵（例如在Fc單體的鉸鏈區中的半胱胺酸殘基之間）。在一個較佳的實施方式中，兩個Fc單體經由肽連接子，較佳的是長度足以允許Fc單體締合併形成鏈內二聚體的連接子彼此融合。兩個Fc單體的融合以形成單個多肽鏈在本文中稱為單鏈Fc結構域（scFc結構域），並且在下面更詳細地描述。
Fc單體彼此融合形成單鏈Fc結構域的肽連接子較佳的是包含至少25個胺基酸殘基（例如25、26、27、28、29、30或更多個）。更較佳的是，該肽連接子包含至少30個胺基酸殘基（例如30、31、32、33、34、35或更多）。在一些實施方式中，連接子包含多達40個胺基酸殘基，更較佳的是多達35個胺基酸殘基，甚至更較佳的是恰好30個胺基酸殘基。在某些實施方式中，肽連接子包含甘胺酸-絲胺酸殘基，例如胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO: 70）的重複。在此類實施方式中，肽連接子包含(Gly4 Ser)x ，其中x係5或更大的整數（例如，6、7或8）。該整數較佳的是6或7，該整數更較佳的是6。在一個特定的實施方式中，用於連接兩個Fc單體以形成單鏈Fc結構域的肽連接子包含SEQ ID NO: 75的序列。
相對於天然CH2或CH3免疫球蛋白胺基酸序列，Fc單體可含有一個或多個胺基酸取代，例如以調節效應子功能，改變糖基化或增強穩定性。例如，在一個實施方式中，藉由用不同的胺基酸取代根據EU編號的CH2結構域中在胺基酸位置297處的天冬醯胺殘基來去除該位置處的糖基化位點。在一些實施方式中，較佳的是N297G取代。增強穩定性的突變包括用半胱胺酸殘基取代CH2和/或CH3結構域中的一個或多個胺基酸，以促進二硫鍵的形成。較佳的是，特定殘基對經半胱胺酸取代以使其優先彼此形成二硫鍵，由此限制或防止二硫鍵混亂。較佳的殘基對包括但不限於A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C以及V323C和I332C，其中胺基酸位置根據EU編號系統編號。在一個特定的實施方式中，摻入雙特異性抗體構建體的第三結構域的一個或多個Fc單體包含N297G、R292C和V302C取代，其中胺基酸位置根據EU編號系統編號。
在某些較佳的實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含第三結構域，其係單鏈Fc結構域。因此，在某些此類實施方式中，第三結構域包含兩個Fc單體，每個單體包含免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白CH2結構域和免疫球蛋白CH3結構域，其中該兩個Fc單體經由本文所述肽連接子彼此融合。下表5中提供了Fc單體和單鏈Fc（scFc）結構域的示例性胺基酸序列。在一些實施方式中，第三結構域的每個Fc單體具有與選自SEQ ID NO: 109-116的序列至少90%相同的胺基酸序列。在其他實施方式中，第三結構域的每個Fc單體具有選自SEQ ID NO: 109-116的胺基酸序列。在一個較佳的實施方式中，第三結構域的每個Fc單體包含SEQ ID NO: 109的胺基酸序列。在另一個較佳的實施方式中，第三結構域的每個Fc單體包含SEQ ID NO: 110的胺基酸序列。 [表 5 ]. 示例性 Fc 單體和單鏈 Fc 結構域
名稱 SEQ ID NO. 胺基酸序列
Fc 單體
Fc單體-1 109 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc單體-2 110 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Fc單體-3 111 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc單體-4 112 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Fc單體-5 113 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc單體-6 114 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
Fc單體-7 115 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc單體-8 116 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
單鏈Fc 結構域
scFc-1 117 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFc-2 118 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
scFc-3 119 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFc-4 120 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
scFc-5 121 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFc-6 122 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
scFc-7 123 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scFc-8 124 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體的第三結構域可以是表5中列出的任何scFc結構域或該等scFc結構域的變體。在一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體包含第三結構域，其包含與選自SEQ ID NO: 117-124的序列至少90%相同的胺基酸序列。在另一個實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體包含第三結構域，其包含與選自SEQ ID NO: 117-124的胺基酸序列。在一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體包含第三結構域，其包含SEQ ID NO: 117的胺基酸序列。在另一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體包含第三結構域，其包含SEQ ID NO: 118的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體以胺基至羧基的順序包含： (i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域，該第一結構域包含第一免疫球蛋白重鏈可變區（VH1）和第一免疫球蛋白輕鏈可變區（VL1）； (ii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域，該第二結構域包含第二免疫球蛋白重鏈可變區（VH2）和第二免疫球蛋白輕鏈可變區（VL2）；以及 (iii) 包含兩個Fc單體的第三結構域。
在一些實施方式中，雙特異性抗體構建體以胺基至羧基的順序包含： (i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域，該第一結構域包含VH1和VL1，該VH1包含具有SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1、具有選自SEQ ID NO: 11-13的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3，該VL1包含具有選自SEQ ID NO: 5-7的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 8的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3； (ii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域，該第二結構域包含VH2和VL2，該VH2包含具有選自SEQ ID NO: 37-42的序列的CDRH1、具有選自SEQ ID NO: 43-47的序列的CDRH2和具有選自SEQ ID NO: 48-56的序列的CDRH3，該VL2包含具有選自SEQ ID NO: 30-32的序列的CDRL1，具有SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34的序列的CDRL2和具有序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3；以及 (iii) 包含兩個Fc單體的第三結構域，每個單體包含免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個單體經由肽連接子彼此融合。在這樣的實施方式中，VH1包含選自SEQ ID NO: 21-28的序列，並且VL1包含選自SEQ ID NO: 15-20的序列。在該等和其他實施方式中，VH2包含選自SEQ ID NO: 60-68的序列，並且VL2包含選自SEQ ID NO: 57-59的序列。在一個實施方式中，VH1包含SEQ ID NO: 28的序列，並且VL1包含SEQ ID NO: 20的序列。在一個相關的實施方式中，VH2包含SEQ ID NO: 61的序列，並且VL2包含SEQ ID NO: 59的序列。
在一個較佳的實施方式中，雙特異性抗體構建體以胺基至羧基的順序包含： (i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域，該第一結構域包含VH1和VL1，該VH1包含具有SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 13的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3，該VL1包含具有SEQ ID NO: 6的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 8的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3； (ii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域，該第二結構域包含VH2和VL2，該VH2包含具有SEQ ID NO: 38的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 44的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 49的序列的CDRH3，該VL2包含具有SEQ ID NO: 32的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 33的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3；以及 (iii) 包含兩個Fc單體的第三結構域，每個單體包含免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個單體經由肽連接子彼此融合。
在某些實施方式中，諸如本文所述之肽連接子將第一結構域連接至第二結構域和/或將第二結構域連接至第三結構域。因此，在一些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體以胺基至羧基順序包含： (i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域； (ii) 具有選自SEQ ID NO: 70-72和80的胺基酸序列的第一肽連接子； (iii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域； (iv) 具有選自SEQ ID NO: 69-72和78-80的胺基酸序列的第二肽連接子； (v) 第一Fc單體； (vi) 具有選自SEQ ID NO: 74-77的胺基酸序列的第三肽連接子；以及 (vii) 第二Fc單體。
在某些實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體以胺基至羧基順序包含： (i) 具有選自SEQ ID NO: 83-91的胺基酸序列的第一結構域； (ii) 具有選自SEQ ID NO: 70-72和80的胺基酸序列的第一肽連接子； (iii) 具有選自SEQ ID NO: 92-101的胺基酸序列的第二結構域； (iv) 具有選自SEQ ID NO: 69-72和78-80的胺基酸序列的第二肽連接子； (v) 具有選自SEQ ID NO: 109-116的胺基酸序列的第一Fc單體； (vi) 具有選自SEQ ID NO: 74-77的胺基酸序列的第三肽連接子；以及 (vii) 具有選自SEQ ID NO: 109-116的胺基酸序列的第二Fc單體。
在一個較佳的實施方式中，根據本發明之雙特異性抗體構建體以胺基至羧基順序包含： (i) 具有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的第一結構域； (ii) 具有SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 80胺基酸序列的第一肽連接子； (iii) 具有SEQ ID NO: 101的胺基酸序列的第二結構域； (iv) 具有SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的第二肽連接子； (v) 具有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的第一Fc單體； (vi) 具有SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76的胺基酸序列的第三肽連接子；以及 (vii) 具有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的第二Fc單體。
在某些實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體係單鏈抗體構建體。如本文所用，「單鏈抗體構建體」係指僅由一條多肽鏈組成的抗體構建體，即抗體構建體中的所有結構域都視需要經由肽連接子連接在一起以形成單個多肽鏈。在本發明之上下文中，這種單鏈抗體構建體的一個實例係單鏈多肽，其以胺基至羧基的順序包含抗CD33 scFv結構域、第一肽連接子、抗CD3 scFv結構域、第二肽連接子和scFc結構域。本發明之方法中使用的示例性抗CD33 x 抗CD3雙特異性單鏈抗體構建體描述於WO 2017/134140中，其藉由引用以其整體結合在此，並且也列於下表6中。 [表 6 ].示例性抗 CD33 x 抗 CD3 雙特異性單鏈抗體構建體
名稱 SEQ ID NO. 胺基酸序列
scAb -1 125 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -2 126 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
scAb -3 127 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMSSDTSTSTAYLEINSLRSDDTAIYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -4 128 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYLELHNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -5 129 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRNDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -6 130 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTSDTSTSTAYMEISSLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSKNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -7 131 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGETNYADKFQGRVTFTSDTSTSTAYMELRNLKSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSMTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -8 132 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGETNYADKFQGRVTFTSDTSTSTAYMELRNLKSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLSVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -9 133 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLRSDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSNNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDGLQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -10 134 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -11 135 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
scAb -12 136 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -13 137 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -14 138 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
scAb -15 139 QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在某些實施方式中，根據本發明之方法投與於患者的雙特異性抗體構建體包含選自SEQ ID NO: 125-139的胺基酸序列。在一個實施方式中，雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 126的胺基酸序列。在另一個實施方式中，雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 134的胺基酸序列。在另一個實施方式中，雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 135的胺基酸序列。在一個較佳的實施方式中，本發明之方法中使用的雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列。
本發明方法中使用的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體可以是表6中所示的單鏈抗體構建體的變體，並且包含與SEQ ID NO: 125-139的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一個實施方式中，雙特異性抗體構建體包含與選自SEQ ID NO: 125-139的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在另一個實施方式中，雙特異性抗體構建體包含與選自SEQ ID NO: 125-139的胺基酸序列至少98%相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，序列變異性發生在肽連接子區和/或單鏈Fc結構域中。
用於在本發明之方法中使用的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體可以藉由許多常規技術中的任何一種來製備。例如，本文所述之抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體可以使用本領域已知的任何技術藉由重組表現系統產生。參見例如Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses [單株抗體，雜交瘤：生物分析的新維度], Kennet等人（編輯）綜合出版社（Plenum Press）, 紐約 (1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual [抗體：實驗室手冊], Harlow及Lane（編輯）, 冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）, 冷泉港, 紐約 (1988)。
抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體或其組分（例如Fv片段、Fc單體）可以在雜交瘤細胞系或雜交瘤以外的細胞系中表現。可將編碼雙特異性抗體構建體的表現構建體用於對哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞進行轉化。可使用將多核苷酸引入宿主細胞中的任何已知方法來進行轉化，包括例如將多核苷酸包封於病毒或噬菌體中且藉由本領域中已知的轉染程序用構建體轉導宿主細胞，如美國專利案號4,399,216、4,912,040、4,740,461、4,959,455中所例示。所使用的最佳轉化程序將取決於正在對何種類型的宿主細胞進行轉化。用於將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在本領域中是眾所周知的，且包括但不限於聚葡萄糖介導的轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸封裝於脂質體中、混合核酸與帶正電脂質及向細胞核中直接顯微注射DNA。
重組表現構建體典型地包含編碼多肽的核酸分子，該多肽包含以下各項中的一個或多個：本文中所提供的一個或多個CDR；輕鏈恒定區；輕鏈可變區；重鏈恒定區（例如，CH1，CH2和/或CH3）；重鏈可變區；抗CD33抗體或抗CD3抗體的鉸鏈區、Fc區和/或另一個支架部分。使用標準連結技術將該等核酸序列插入適當表現載體中。在雙特異性抗體構建體係單鏈抗體構建體的實施方式中，重組表現載體中包含的核酸通常將編碼全長抗體構建體（例如，全長融合蛋白）。典型地選擇在所採用的特定宿主細胞中具有功能性的載體（即，該載體與宿主細胞機構相容，從而允許可發生基因的擴增和/或表現）。在一些實施方式中，所使用的載體採用使用例如二氫葉酸還原酶的蛋白質報導序列的蛋白質片段互補測定（參見例如美國專利案號6,270,964，該專利藉由引用結合在此）。適合的表現載體可購自例如英傑生命科技公司（Invitrogen Life Technologies）或BD生物科學公司（BD Biosciences）（原「克羅泰克公司（Clontech）」）。用於選殖及表現抗體構建體及片段的其他適用載體包括Bianchi及McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. [生物技術與生物工程] 84: 439-44中所描述的那些，該參考文獻藉由引用結合在此。其他適合的表現載體論述於例如Methods Enzymol. [酶學方法], 第185卷（D. V. Goeddel編）, 1990, 紐約: 學術出版社（Academic Press）中。
典型地，用於任何宿主細胞中的表現載體均將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源核苷酸序列的序列。此類序列統稱為「側接序列」，在某些實施方式中，典型地將包括以下核苷酸序列中的一個或多個：啟動子、一個或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、編碼用於多肽分泌的前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現的多肽的核酸的多連接子區和可選擇標記物元件。該等序列分別於下文論述。
視需要，載體可以包含「標籤」-編碼序列，即位於抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體編碼序列的5′或3′末端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚His（例如六聚His），或存在針對其的市售抗體的另一「標籤」，例如FLAG®、HA（血球凝集素流感病毒）或myc。在表現多肽後，此標籤典型地與多肽融合，並且可以用作一種從宿主細胞親和純化或檢測抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的手段。親和純化可以藉由例如柱層析法，使用針對標籤的抗體作為親和基質來實現。視需要，隨後可以藉由各種手段，例如使用某些肽酶切割，從純化的抗體構建體移除標籤。
側接序列可以為同源的（即，來自與宿主細胞相同的物種和/或品系）、異源的（即，來自與宿主細胞物種或品系不同的物種）、混合的（即，來自超過一種來源的側接序列的組合）、合成的或天然的。因此，側接序列的來源可以為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或非脊椎動物生物體，或任何植物，只要該側接序列在宿主細胞機器中起作用且可以經宿主細胞機器活化。
可藉由本領域中眾所周知的若干方法中的任一種來獲得適用於載體中的側接序列。典型地，可用於本文中的側接序列將預先藉由定位和/或藉由限制性核酸內切酶消化鑒別且因此可以使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，側接序列的完全核苷酸序列可能為已知的。在此，可使用本文中所描述的用於核酸合成或選殖之方法來合成側接序列。
無論已知側接序列的全部抑或僅一部分，其均可使用聚合酶鏈反應（PCR）和/或藉由用適合探針，例如來自相同或另一物種的寡核苷酸和/或側接序列片段篩選基因組文庫來獲得。若側接序列未知，則可以自可能含有例如編碼序列或甚至另外一個或多個基因的較大DNA片段分離含有側接序列的DNA片段。可以藉由限制性核酸內切酶消化產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®柱層析法（加利福尼亞州查茨沃斯（Chatsworth, CA））或熟練技術人員已知的其他方法分離來實現分離。熟悉該項技術者將易於瞭解實現此目的的適合酶的選擇。
複製起點典型地是可商購的原核表現載體的一部分，且該起點有助於在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含複製起點，則可以基於已知序列以化學方式合成，並將其連接到載體中。例如，來自質體pBR322（麻塞諸塞州貝芙麗的新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, Beverly, MA））的複製起點適合大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒起點（例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水皰性口炎病毒（VSV），或乳頭瘤病毒，例如HPV或BPV）可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分（例如，通常僅使用SV40起點，因為其還含有病毒早期啟動子）。
轉錄終止序列典型地位於多肽編碼區的3′端且用於終止轉錄。通常，原核細胞中的轉錄終止序列為富G-C片段，繼之以聚T序列。儘管該序列易於自文庫選殖或甚至作為載體的一部分商購獲得，但其還可使用核酸合成方法容易地合成。
可選擇標記物基因編碼使選擇性培養基中生長的宿主細胞存活和生長所需的蛋白質。典型的選擇標記基因編碼如下蛋白質：(a) 賦予針對抗生素或其他毒素（例如，對於原核宿主細胞，胺苄青黴素、四環素或康黴素）的抗性；(b) 補充細胞的營養缺陷；或 (c) 提供不可得自複雜培養基或限定培養基的重要營養物。特定的可選擇標記物為康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因及四環素抗性基因。有利地，新黴素抗性基因還可用於在原核及真核宿主細胞二者中進行選擇。
可以使用其他可選擇基因擴增有待表現的基因。擴增係使生長或細胞存活必要的蛋白質產生所需的基因在連續數代重組細胞的染色體內串聯性複製的過程。適用於哺乳動物細胞的可選擇標記物的實例包括二氫葉酸還原酶（DHFR）和無啟動子胸苷激酶基因。使哺乳動物細胞轉化株處於選擇壓力下，其中由於載體中存在可選擇基因，所以僅轉化株唯一適於存活。藉由在連續增加培養基中選擇劑的濃度的條件下培養經轉化細胞，由此使可選擇基因和編碼另一基因（例如抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體）的DNA擴增來施加選擇壓力。因此，由經擴增的DNA合成增加量的多肽（例如抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體）。
核糖體結合位點通常是mRNA翻譯起始所必需的，且以夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列（原核生物）或科紮克（Kozak）序列（真核生物）表徵。該元件典型地位於啟動子的3'端且在待表現的多肽編碼序列的5'端。
在一些情況下，例如在真核宿主細胞表現系統中需要糖基化時，可操縱各種前序列或前序列以改良糖基化或產率。舉例而言，可改變特定訊息肽的肽酶裂解位點，或添加還可影響糖基化的前序列。最終蛋白質產物可以在-1位（相對於成熟蛋白質的第一個胺基酸）具有一個或多個易於表現的另外的胺基酸，該等胺基酸可能未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一或兩個與胺基末端附接的在肽酶裂解位點發現的胺基酸殘基。可替代地，當酶在成熟多肽內的此類區域切割時，使用一些酶裂解位點可能產生所需多肽的略微截短的形式。
表現和選殖載體典型地將含有被宿主生物體識別且可操作地連接至編碼抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的分子的啟動子。啟動子為位於控制結構基因轉錄的結構基因起始密碼子（一般在約100至1000 bp內）上游（即，5'）的非轉錄序列。啟動子通常分組為兩種類別中的一個：誘導型啟動子及組成型啟動子。誘導型啟動子起始處於其控制下的DNA響應於培養條件的某種變化（諸如營養素的存在或不存在，或者溫度變化）以提高的水平轉錄。另一方面，組成型啟動子一致地轉錄其可操作地連接的基因，即，對基因表現具有極小控制或無控制。許多由多種潛在宿主細胞識別的啟動子係眾所周知的。藉由藉由限制性內切酶消化從源DNA中去除啟動子並將所需的啟動子序列插入載體中，將合適的啟動子可操作地連接至編碼抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體或其組分的核酸。
適用於酵母宿主的適合啟動子還是本領域中熟知的。酵母增強子宜與酵母啟動子一起使用。用於哺乳動物宿主細胞的適合啟動子係眾所周知的，且包括但不限於獲自病毒基因組的那些啟動子，該等病毒為諸如多形瘤病毒、傳染性上皮瘤病毒、腺病毒（諸如腺病毒2）、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40（SV40）。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
可以將增強子序列插入載體中以增加高等真核細胞中編碼抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體或其組分的核酸的轉錄。增強子為DNA的順式作用元件，長度通常為約10-300 bp，作用於啟動子以增加轉錄。增強子在方向及位置方面為相對獨立的，已見於轉錄單元的5'及3'位置。已知可得自哺乳動物基因的若干增強子序列（例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素）。然而，典型地使用來自於病毒的增強子。本領域中已知的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子和腺病毒增強子係用於活化真核啟動子的例示性強化元件。儘管增強子可以定位於載體中編碼序列的5'或3'，但其典型地位於啟動子5'的位點處。可將編碼適當天然或異源訊息序列（前導序列或訊息肽）的序列併入表現載體中，以促進抗體構建體的細胞外分泌。訊息肽或前導序列的選擇取決於待產生抗體構建體的宿主細胞的類型，且異源訊息序列可替換天然訊息序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性的訊息肽的實例包括以下：美國專利案號4,965,195中所描述的介白素7（IL-7）訊息序列；Cosman等人, 1984, Nature [自然] 312: 768中所描述的白介素-2受體的訊息序列；歐洲專利案號0367 566中所描述的白介素-4受體訊息肽；美國專利案號4,968,607中所述之I型白介素-1受體訊息肽；EP專利案號0 460 846中所述之II型白介素-1受體訊息肽。
可以從起始載體例如可商購的載體構建用於重組生產本文所述之抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的表現載體。該等載體可含有或可不含所有所需側接序列。在載體中不存在一個或多個本文所描述的側接序列的情況下，其可以獨立地獲得且連接到載體中。用於獲得各側接序列之方法係熟悉該項技術者熟知的。
構建載體並將編碼抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體或其組分的核酸分子插入載體的適當位點後，可以將完整的載體插入合適的宿主細胞中進行擴增和/或多肽表現。可以藉由以下熟知之方法完成將多肽的表現載體轉化到所選的宿主細胞中，該等方法包括：轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或其他已知的技術。所選擇之方法將與待使用的宿主細胞類型的部分有關。該等方法及其他適合之方法對於技術人員係眾所周知的，並且闡述於例如Sambrook等人, 2001,同上 中。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成抗體構建體，該抗體構建體隨後可從培養基（如果宿主細胞將其分泌到培養基中）中收集或直接從產生它的宿主細胞中收集（如果其未被分泌）。合適的宿主細胞的選擇將取決於各種因素，例如所需的表現水平、活性所需或必需的多肽修飾（例如糖基化或磷酸化）以及易於折疊成生物活性分子。
示例性宿主細胞包括原核生物細胞、酵母或高等真核細胞。原核宿主細胞包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科（Enterobacteriaceae ）像埃希氏桿菌屬（Escherichia ），例如大腸桿菌（E. coli ）、腸桿菌屬（Enterobacter ）、歐文氏菌屬（Erwinia ）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella ）、變形桿菌屬（Proteus ）、沙門氏菌屬（Salmonella ），例如鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium ）、沙雷氏菌屬（Serratia ），例如如黏質沙雷氏菌（Serratia marcescans ）、和志賀氏桿菌（Shigella ）、還有芽孢桿菌屬（Bacillus ），例如枯草桿菌（B. subtilis ）和地衣芽孢桿菌（B. licheniformis ）、假單胞菌屬（Pseudomonas ）、和鏈黴菌屬（Streptomyces ）。真核微生物（如絲狀真菌或酵母）係用於重組多肽的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。不過，多種其他屬、種和菌株係常用的且可用於本文中，例如畢赤酵母屬（Pichia ），例如巴斯德畢赤酵母（P. pastoris ）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）；克魯維酵母屬（Kluyveromyces ），耶氏酵母屬（Yarrowia ）；假絲酵母屬（Candida ）；瑞氏木黴（Trichoderma reesia ）；粗糙脈孢菌；許旺酵母屬（Schwanniomyces ），例如西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis ）；和絲狀真菌，例如脈孢菌屬（Neurospora ）、青黴菌屬（Penicillium ）、木黴菌屬（Tolypocladium ）和麯黴屬（Aspergillus ）宿主，例如構巢麯黴（A. nidulans ）和黑麯黴（A. niger ）。
用於表現糖基化蛋白質的宿主細胞可以來源於多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及來自以下宿主的相應的許可性昆蟲宿主細胞，例如草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda ）（毛蟲），埃及伊蚊（Aedes aegypti ）（蚊子），白紋伊蚊（Aedes albopictus ）（蚊子），黑腹果蠅（Drosophila melanogaster ）（果蠅）和家蠶（Bombyx mori ）。用於轉染此類細胞的多種病毒株係公開可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica ）NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株。
脊椎動物宿主細胞也可以是合適的宿主，並且來自該等細胞的抗體構建體的重組產生已成為常規程序。可用作表現的宿主的哺乳動物細胞系係本領域熟知的，並且包括但不限於可從美國種質保存中心（ATCC）獲得的永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，包括CHOK1細胞（ATCC CCL61）、DXB-11、DG-44和中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77: 4216, 1980）；由SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚胎腎系（293細胞或亞選殖用於在懸浮培養中生長的293細胞（Graham等人, J. Gen Virol. [普通病毒學雜誌] 36: 59, 1977）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；小鼠塞托利細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. [生殖生物學]23: 243-251, 1980）；猴腎細胞（CV1、ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）；人宮頸癌細胞（HELA, ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝癌細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562, ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等人, Annals N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 383: 44-68, 1982）；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞，以及許多其他的細胞系。在一些實施方式中，CHO細胞係較佳的宿主細胞，用於表現抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體。
用上述表現載體轉化或轉染宿主細胞以產生抗體構建體，並在適當改進用於誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼所需序列的基因的常規營養培養基中培養。用於產生抗體構建體的宿主細胞可以在多種培養基中培養。以下可商購的培養基適用於培養宿主細胞：Ham's F10（西格瑪公司（Sigma））、極限必需培養基（MEM，西格瑪公司）、RPMI-1640（西格瑪公司）和達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM，西格瑪公司）。另外，在Ham等人, Meth. Enz. [酶學方法] 58: 44, 1979；Barnes等人, Anal. Biochem. [分析生物化學] 102: 255, 1980；美國專利案號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；或WO 87/00195中描述的任何培養基可以用作宿主細胞的培養基。必要時，該等培養基中的任一種可以補充有激素和/或其他生長因子（例如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩衝液（例如HEPES）、核苷酸（例如腺苷和胸苷）、抗生素（例如健他黴素（Gentamycin™）藥物）、微量元素（定義為通常以在微莫耳濃度範圍內的最終濃度存在的無機化合物）和葡萄糖或等效能量來源。還可以按熟悉該項技術者已知的適當濃度包含任何其他必需的補充劑。培養條件（例如溫度，pH等）係先前與選擇用於表現的宿主細胞一起使用的那些條件，並且對於熟悉該項技術者將是顯而易見的。
在培養宿主細胞後，抗體構建體可以在細胞內、周質間隙中產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體構建體在細胞內產生，作為第一步，裂解宿主細胞（例如，藉由機械剪切、滲透壓休克、或酶促方法），並且例如藉由離心、微濾或超濾去除例如顆粒碎片（例如，宿主細胞和裂解的片段）。如果抗體構建體分泌到培養基中，可以藉由離心或微濾，並視需要隨後藉由超濾將抗體構建體與宿主細胞分離。可以使用例如，一個或多個層析步驟，例如親和層析（例如，蛋白質A或蛋白質G親和層析）、陽離子交換層析、陰離子交換層析、羥磷灰石層析、疏水性相互作用層析、或混合式層析將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體進一步純化或部分純化。
通常將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體以藥物組成物的形式投與於患者，該藥物組成物可包括藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。「藥學上可接受的」係指在投與人時採用的劑量和濃度下對人類接受者無毒和/或在投與人時不產生過敏或不良反應的分子、化合物和組成物。在某些實施方式中，藥物組成物可含有配製物物質以調節、維持或保留例如組成物的pH值、滲透性、黏度、澄明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透。在此類實施方式中，合適的配製物材料包括（但不限於）胺基酸（諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸）；抗微生物劑；抗氧化劑（如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）；緩衝液（如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸）；膨脹劑（如甘露醇或甘胺酸）；螯合劑（如乙二胺四乙酸（EDTA））；錯合劑（如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）；填充劑；單糖；二糖；和其他糖類（如葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白質（如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；著色劑、調味劑、和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物（如聚乙烯吡咯啶酮）；低分子量多肽；成鹽抗衡離子（如鈉）；防腐劑（如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫）；溶劑（如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇（如甘露醇或山梨糖醇）；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑（如普朗尼克類（pluronic）、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯（如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）、曲通（triton）、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊）；穩定性增強劑（如蔗糖或山梨糖醇）；張力增強劑（如鹼金屬鹵化物、較佳的是氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨糖醇）；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑和/或藥用佐劑。用於配製用於治療用途的分子之方法和適合的材料在製藥領域中是已知的，並進行了描述，例如，在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明頓的藥物科學], 第18版, (A.R. Genrmo, 編輯), 1990, 馬克出版公司（Mack Publishing Company）。包含根據本發明之方法投與的雙特異性抗體構建體的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾的組成物。
如果藥物組成物已被凍乾，則在投與之前將凍乾材料在適當液體中重構。可以將凍乾物質在例如抑菌注射用水（BWFI）、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或與冷凍乾燥前蛋白質所處於的相同配製物中重構。
在一些實施方式中，摻入藥物組成物中的載劑和賦形劑的選擇影響雙特異性抗體構建體的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。在某些實施方式中，藥物組成物中的主要媒劑或載劑可以是水性或非水性的。例如，合適的媒劑或載劑可以是注射用水、生理鹽水溶液，可能補充有用於腸胃外給予的組成物中常見的其他物質或賦形劑。
在本文所述之方法的某些實施方式中，將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體（例如，包含抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物）腸胃外投與於患者。腸胃外投與係指藉由胃腸道以外的途徑進行分子的投與，並且可以包括腹膜內、肌內、靜脈內、動脈內、皮內、皮下、腦內、腦室內和鞘內投與。在一些實施方式中，根據本發明方法的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的投與係靜脈內的。
腸胃外投與或靜脈內投與可以藉由注射（例如使用針和注射器）或藉由輸注（例如藉由導管和泵系統）進行。設想根據本發明之投與係經由靜脈內注射或經由靜脈內輸注。通常，靜脈內（IV）輸注經由線、端口或導管（小的柔性管））投與，如中央靜脈內通路、或中央靜脈內導管（CVC，其係放置在大靜脈內中的導管）、或外周靜脈內導管（PVC，係放置在外周靜脈內中的導管）。一般來說，導管或線可以放置在頸部（頸內靜脈內）、胸腔（鎖骨下靜脈內或腋靜脈內）、腹股溝（股靜脈內）或通過胳膊中的靜脈內（也稱為PICC線，或外周插入的中央導管）。中央IV線具有導管，藉由靜脈內前進並流入大中央靜脈內（通常是上腔靜脈內、下腔靜脈內或甚至是心臟的右心房）。周圍靜脈內（PIV）線用於外周靜脈內（手臂、手、腿和腳的靜脈內）。端口係沒有外部連接器的中央靜脈內線；相反，它具有用矽橡膠覆蓋並植入皮膚下的小儲庫。藉由放置小針穿過皮膚、刺穿矽膠、進入儲庫，間歇地投與藥物。當針頭撤回時，儲庫蓋自行重新密封。該蓋在其使用壽命期間可以接受數百針。
在某些實施方式中，將抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體作為短的靜脈內輸注投與於患者，其通常是經至多三小時的時間段投與的小體積輸注（例如20 mL至100 mL）。較佳的是，在根據本發明之方法的起始週期和/或維持週期期間向患者投與的雙特異性抗體構建體的每劑量以約30 min至約3小時、約30 min至約90 min、或約30 min至約60 min的靜脈內輸注投與。
在輸注雙特異性抗體構建體的實施方式中，可以使用輸注泵將雙特異性抗體構建體輸注到患者的循環系統中。泵通常是靜脈內使用的，儘管也可以使用具有泵的動脈和硬膜外輸注。用於輸注的溶液可以在袋中製備用於IV輸注並藉由輸注線遞送。用於遞送靜脈內輸注的泵系統係本領域已知的。也可以僅使用重力提供的壓力來投與輸注。
在某些實施方式中，藥物組成物包含治療有效量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體和一種或多種賦形劑。賦形劑可用於多種目的，如調整配製物的物理、化學或生物特性，如調整黏度和/或穩定此類配製物以防止例如由於在製造、運輸、存儲、使用前準備、和投與期間發生的壓力而導致的降解和腐壞。
在一些實施方式中，包含根據本發明之方法向患者投與的治療有效量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物包含緩衝液。使用緩衝液將組成物維持在生理pH值或稍低的pH值，通常pH值範圍為從約4.0至約6.5。適合的緩衝液包括，但不限於麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、乙酸鹽、Tris、檸檬酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽、和磷酸鹽緩衝液。在某些實施方式中，根據本文所述之方法投與的藥物組成物包含麩胺酸鹽緩衝液，特別是L-麩胺酸鹽緩衝液。包含麩胺酸鹽緩衝液的藥物組成物可具有約4.0至約5.5的pH、約4.0至約4.4的pH、或約4.2至約4.8的pH。
包含治療有效量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物可以進一步包含表面活性劑。如本文使用的，術語「表面活性劑」係指用於降低溶解在其中的液體的表面張力的物質。出於各種目的（包括例如防止或控制液體配製物中的聚集、顆粒形成和/或表面吸附，或在凍乾配製物的凍乾和/或重構過程中防止或控制該等現象）可以將表面活性劑包括在藥物組成物中。表面活性劑包括，例如，在有機溶劑和水溶液中均顯示出部分溶解性的兩親性有機化合物。表面活性劑的一般特徵包括它們降低水的表面張力、降低油和水之間的介面張力以及形成膠團的能力。可摻入本發明之方法中使用的藥物組成物中的表面活性劑包括非離子表面活性劑和離子表面活性劑。適合的非離子表面活性劑包括但不限於烷基聚(環氧乙烷)、烷基多葡糖苷（例如，辛基葡糖苷和癸基麥芽糖苷）、脂肪醇（例如，鯨蠟醇和油醇）、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA和椰油醯胺TEA。非離子表面活性劑的具體的實例包括聚山梨醇酯，包括例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85等；泊洛沙姆包括例如泊洛沙姆188（也稱為泊洛沙姆或聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)）、泊洛沙姆407或聚乙烯-聚丙二醇等，以及聚乙二醇（PEG）。適合的離子表面活性劑包括例如陰離子、陽離子和兩性離子表面活性劑。陰離子表面活性劑包括但不限於磺酸鹽基或羧酸鹽基表面活性劑，例如肥皂、脂肪酸鹽、十二烷基硫酸鈉（SDS）、月桂基硫酸銨和其他烷基硫酸鹽。陽離子表面活性劑包括但不限於基於季銨基表面活性劑，例如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、其他烷基三甲基銨鹽、十六烷基吡啶氯化物、聚乙氧基化牛脂胺（POEA）和苯紮氯銨。兩性離子或兩性表面活性劑包括，例如，十二烷基甜菜鹼、十二烷基二甲基氧化胺、椰油醯胺丙基甜菜鹼、和椰油兩性甘胺酸鹽。在某些實施方式中，根據本文所述之方法投與的藥物組成物包含非離子表面活性劑。在一個實施方式中，該非離子表面活性劑係聚山梨醇酯20。在另一個實施方式中，該非離子表面活性劑係聚山梨醇酯80。
在某些實施方式中，包含治療有效量的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物進一步包含穩定劑。如本文所用，術語「穩定劑」係指穩定多肽或抗體構建體的天然構象和/或防止或減少多肽或抗體構建體的物理或化學降解的賦形劑。適合的穩定劑包括但不限於多元醇（例如，山梨糖醇、甘油、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇和蘇糖醇），糖（例如，果糖、葡萄糖、甘油醛、乳、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、核糖、鼠李糖，半乳糖麥芽糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、三氯蔗糖、松三糖和棉子糖）和胺基酸（例如，甘胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸或麩胺酸）。在一些實施方式中，該藥物組成物包含糖作為穩定劑。在該等和其他實施方式中，該糖係蔗糖。
在WO 2018/141910中描述了包含雙特異性抗體構建體的示例性藥物組成物，該雙特異性抗體構建體包括抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體，該參考文獻藉由引用以其整體結合在此。在某些實施方式中，根據本文所述之方法可用於治療骨髓性白血病的藥物組成物包含約0.5 mg/ml至約2 mg/ml的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體、約5 mM至約20 mM的L-麩胺酸，約0.005%至約0.015%重量/體積（w/v）的聚山梨酯（例如聚山梨酯20或聚山梨酯80）和約7%至約12%（w/v）的蔗糖。在其他實施方式中，藥物組成物包含約0.5 mg/ml至約1 mg/ml的抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體、約8 mM至約12 mM的L-麩胺酸、約0.008%至約0.012%（w/v）的聚山梨酯（例如聚山梨酯20或聚山梨酯80），和約8%至約10%（w/v）的蔗糖。該等組成物的pH係在約4.0至約4.4的範圍中（例如，pH為約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、或約4.4）。
在投與於患者之前，可以將包含本文所述之抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的任何藥物組成物凍乾並用例如無菌注射用水重構。重構體積將取決於凍乾後的蛋白質含量和重構溶液中雙特異性抗體構建體的所需濃度，但可以為約0.5 ml至約5 ml。重構後的溶液可以在適當地投與於患者之前用稀釋劑（例如鹽水和/或靜脈內溶液穩定劑（IVSS））進一步稀釋，以便根據本發明之方法投與本文所述之劑量。
可以將本文所述之任何抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體（包括表6中所述之單鏈抗體構建體）摻入上述的任何藥物組成物中，並根據本文所述之方法投與於患者。在一個較佳的實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 125的胺基酸序列。在另一個較佳的實施方式中，抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 126的胺基酸序列。
本發明還包括用於在有需要的患者中治療骨髓性白血病的套組。在一個實施方式中，套組包含本文所述之抗CD33 x 抗CD3雙特異性抗體構建體的藥物組成物和提供有關藥物組成物使用說明的包裝材料。套組的藥物組成物可以存在於諸如小瓶的容器中。藥物組成物可以以溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體、晶體或脫水或凍乾粉劑提供。在以凍乾粉劑形式提供藥物組成物的實施方式中，套組還可包含重構藥物組成物所需的稀釋劑（例如注射用無菌水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、配製物緩衝液）以及製備用於投與的組成物的說明書。在某些實施方式中，套組可進一步包含一個或多個靜脈內溶液穩定劑（IVSS）的小瓶，和在將藥物組成物稀釋以遞送給患者之前使用IVSS進行靜脈輸液袋預處理的說明。IVSS不包含活性藥物成分，並且通常是緩衝的、無防腐劑的溶液。在一個實施方式中，IVSS包含檸檬酸（例如20-30 mM）、離胺酸鹽酸鹽（例如1-3M）和聚山梨酯80（0.05%-0.15%（w/v））（pH 7.0）。在一個特定的實施方式中，IVSS包含25 mM檸檬酸、1.25M離胺酸鹽酸鹽和0.1%（w/v）聚山梨酯80（pH 7.0）。
以下實例，包括進行的實驗和實現的結果，僅提供解釋說明目的，並且不應被解釋為限制所附請求項的範圍。實例 實例 1. 評估 AMG 673 在患有復發 / 難治性急性骨髓性白血病患者中的安全性、耐受性、藥物動力學、藥效動力學和功效的 1 期研究
AMG 673係半衰期延長（HLE）的BiTE® （雙特異性T細胞接合劑）構建體，其結合CD33和CD3二者並包含單鏈IgG Fc區。AMG 673的胺基酸序列在SEQ ID NO: 125中列出。AMG 673將T細胞重定向至CD33+ 細胞，誘導的鄰近性導致T細胞介導的針對急性骨髓性白血病（AML）胚細胞的細胞毒性。這項1期研究的目的是評估AMG 673在 ≥ 18歲的復發/難治性（R/R）AML患者中的安全性、耐受性、藥物動力學（PK）、藥效學（PD）和初步功效。藉由對AMG 673治療產生反應的患者數量和比例、反應持續時間、進展時間和反應時間來評估AMG 673的抗白血病活性。反應定義為以下任何一項：完全緩解（CR），具有不完全血液學恢復的CR（CRi）或無形態性白血病的狀態（均符合國際工作組修訂反應標準），或具有部分血液學恢復的CR（CRh）。
簽署知情同意書後，患者進入篩選期（約14天），在此期間評估患者的資格。符合條件的患者包括 ≥ 18歲的成年人，患有世界衛生組織分類（參見，例如，Arber等人, Blood [血液], 第127卷: 2391-2405, 2016）中定義的AML，在1次或多次治療療程後持續或復發並且骨髓中成髓細胞超過5%。
在R/R AML成人患者的每個14天治療週期的第1天（D1）和第5天（D5），AMG 673以短期靜脈內（IV）輸注（約30分鐘至3小時）以0.05 μg至360 μg的劑量範圍投與。劑量遞增群組的劑量水平（每次輸注劑量）為：0.05 μg、0.15 μg、0.45 μg、1.5 μg、4.5 μg、7 μg、9 μg、18 μg、36 μg、72 μg、110 μg、160 μg、240 μg、和360 μg。在AMG 673輸注的第1天和第5天之前1小時，所有患者均接受了8 mg劑量的IV地塞米松預處理。患者接受了AMG 673的治療週期，直到疾病進展或出現不可接受的毒性。藉由驗證測定評估了患者血液中的T細胞活化、細胞介素和AMG 673水平。藉由給藥組描述性地總結了結果，並評估了PK、PD、安全性和初步功效之間的潛在關聯。
迄今為止，已經完成了十個群組。三十例患者入選了10個群組，並接受AMG 673治療（劑量範圍，每劑量0.05 μg -72 μg IV）。中位年齡為67.5歲（範圍：25.0-84.0）歲；20/30（67%）的患者先前接受過 ≥ 4次抗AML治療，進入研究時基線骨髓抑制很常見（≥ 3級嗜中性粒細胞減少症21/30 [70%]、血小板減少症25/30 [83%]、白血球減少症14/30 [47%]），以及7/30（23%）的患者在參加該研究之前已經接受了造血幹細胞移植（HSCT）。
患者接受了AMG 673的中位1.5個週期（範圍：1.0-6.0）；27/30（90%）的患者由於疾病進展（n = 21）、患者要求（n = 2）、方案指定標準（n = 2）或不良事件（AE；n = 2）而中止治療。在數據分析時，共有3例患者正在接受AMG 673。最常見的與治療相關的AE係在15/30（50%）的患者中報告的細胞介素釋放綜合症（CRS）（1級，n = 6；2級，n = 5；3級，n = 4；無4級CRS）。據報導有11/30（37%）的患者出現與治療有關的嚴重AE，有15/30（50%）的患者經歷了 ≥ 3級的與治療相關的AE，最常見的是肝酶異常（n = 5，17%）、CRS（n = 4，13%）、白血球減少症（n = 4，13%）、血小板減少症（n = 2，7%）和發熱性嗜中性粒細胞減少症（n = 2，7%）。在最後一次給藥後第19和28天有兩例與AMG 673無關的死亡報告。根據探索性評估，CRS的嚴重程度與血清細胞介素水平、基線時較高的白血病負擔以及暴露於AMG 673有關。具體而言，CRS的嚴重程度與第一個週期的血清中細胞介素（腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）和白介素10（IL-10））的最高水平相關（圖1A-1D）。3級CRS與血清中TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的最高水平有關。CRS係一種急性毒性，並且臨床症狀的發作與細胞介素在循環中釋放的時間有關。在群組8-10中，在投與18 μg、36 μg或72 μg AMG 673後6小時，血清中觀察到最大的細胞介素水平（圖2）。
對接受治療的患者進行的骨髓評估顯示，在可評估的患者中，有12/27（44%）例的胚細胞減少，其中有6例與基線相比，胚細胞減少 ≥ 50%（圖3）。一名患者以36 µg的劑量實現了完全緩解，伴隨不完全血液系統恢復（CRi），骨髓胚細胞減少了85%，並橋接到同種異體造血幹細胞移植物中。在第1週期中，較高血清暴露於AMG 673的患者中，觀察到胚細胞數量減少（圖4）。
表7顯示了在劑量遞增階段的14天治療週期的D1和D5投與時，對於高達72 μg給藥群組觀察到的AMG 673暴露。在AMG 673輸注後，觀察到Cmax 和AUC中劑量相關的增加（下表7）。AMG 673初步半衰期估計較規範抗CD33 x 抗CD3BiTE® 分子（即分子缺乏單鏈Fc區）觀察到的半衰期更長。在單獨的患者群組中評估了在第1週期中增加AMG 673暴露的替代性給藥方案（參見實例2）。 [表 7 ]. AML 患者中觀察到的 AMG 673 藥物動力學參數
AMG 673劑量 （μg/劑量） 平均AUC（ng*hr/ml） 平均Cmax （ng/ml）
0.05 0.62 0.01
0.15 1.67 0.03
0.45 2.08 0.04
1.50 2.31 0.02
4.50 8.17 0.26
7.0 28.2 0.62
9.0 9.10 0.87
18.0 29.2 1.11
36.0 47.0 1.85
72.0 65.2 2.68
在較高劑量下觀察到T細胞亞群上T細胞活化標記CD25和CD69的上調以及輸注後細胞介素的釋放（圖5A-5C）。已經評估了AMG 673暴露、T細胞活化、安全性和臨床反應之間的初步關聯。在較高的暴露水平下觀察到藉由CD8+ T細胞中CD69表現所測量的T細胞活化（圖5A）。在較高的暴露水平下，血清中的細胞介素（IFN-γ和TNF-α）水平增加（圖5B和5C）。
以高達72 µg給藥的AMG 673的初步數據提供了該分子可接受的安全性譜、藥物耐受性和抗白血病活性的早期證據。在較高AMG 673暴露下觀察到與AMG 673的生物學活性相一致的PK/PD關係與觀察到的骨髓中AML胚細胞減少的關聯。該等初步結果支持R/R AML患者進一步AMG 673的劑量遞增。
在上述數據快照之後（其中包括前十個群組的30名患者），群組11和12中的另外8名患者（每個群組中有4名患者）接受了AMG 673治療。在群組11（110 μg劑量）的4名接受治療的患者中，有2名患者出現了劑量限制性毒性，從而確定了72 μg（群組10）為最大耐受起始劑量（MTD-1）。在群組12中啟動了劑量階梯，以減輕CRS的嚴重性並允許進一步的劑量遞增。在每個14天的治療週期中，群組12中的四名患者在第1天（D1）接受36 μg劑量的AMG 673，在第4天（D4）接受72 μg劑量的AMG 673。從第二個數據快照起，已經在12個不同的劑量組中對38名患者進行了AMG 673治療。該等患者的人口統計學和基線特徵在下表8中描述。 [表 8 ]. 患者人口統計和基線特徵
特徵 N = 38
中位年齡，歲 67.5（25-84）
男性， n （ % ） 20（53）
AML 類型， n （ % ）   
具有復發性遺傳異常的AML 15（39）
AML，未另作說明 12（32）
具有骨髓增生異常相關改變的AML 8（21）
與治療有關的骨髓瘤 3（8）
基線骨髓抑制（ ≥ 3 級）， n （ % ）   
血小板減少症 32（84）
嗜中性粒細胞減少症 26（68）
白血球減少症 17（45）
先前療法， n （ % ）   
1 4（10）
2 3（8）
3 6（16）
≥ 4 25（66）
先前的造血幹細胞移植， n （ % ） 7（18）
在34/38（90%）患者中報導與治療有關的AE。CRS係在24/38（63%）患者中觀察到的最常見的治療相關AE。據報導，在26/38（68%）的患者中發生與治療有關的嚴重AE，有20/38（53%）的患者經歷過 ≥ 3級的與治療相關的AE。在16/38（42%）的患者中觀察到胚細胞減少，其中6名患者經歷與基線相比胚細胞減少 ≥ 50%。群組9（36 µg劑量）中的一名患者獲得CRi，骨髓胚細胞減少85%，並橋接到同種異體造血幹細胞移植物。在0.05 μg至110 μg的測試劑量範圍內觀察到AMG 673暴露中劑量相關的增加，包括群組12中的劑量階梯（36 μg至72 μg）。在較高的AMG 673暴露下，可觀察到骨髓中AML胚細胞的減少。
AMG 673的該等其他數據確定了110 μg的起始劑量限制水平，從而引入了階梯劑量計畫以實現進一步的劑量遞增。初步評估顯示出可接受的安全性譜，並有抗白血病活性的證據。該等更新的結果支持進一步評估R/R AML患者中的改變的給藥計畫和AMG 673持續劑量遞增。實例 2. 評估 AMG 673 在復發 / 難治性急性骨髓性白血病患者中的安全性、耐受性和功效的 1 期研究
這項研究的主要目的是評估在治療的初始週期中向患有復發和/或難治性AML的成人患者按每日頻率投與時AMG 673（HLE BiTE® 構建體（SEQ ID NO: 125））的安全性、耐受性、抗白血病活性、和藥物動力學（PK）。如實例1所述，通常在第1週期期間在較高的AMG 673暴露下觀察到骨髓胚細胞減少。由於基於食蟹猴（cynomolgus monkey）PK參數的異速縮放比例，觀察到的AMG 673暴露量低於第一組給藥群組的預期暴露水平，因此調整了給藥計畫以最大程度地減少暴露中斷並在儘快增加第1週期有效劑量的暴露同時不觸發不良影響，例如CRS。
這項研究係開放標籤的1期連續劑量遞增研究。AMG 673被評估為患有復發和/或難治性AML的成年患者的短期靜脈（IV）輸注。劑量遞增群組評估了AMG 673的最大耐受劑量（MTD）、安全性、耐受性、PK和藥效學（PD）。劑量遞增群組的劑量水平（每次輸注劑量）如下：72 μg、110 μg、150 μg、180 μg、240 μg、360 μg、480 μg以及如果未達到MTD，則給予更高劑量。在劑量遞增群組完成後，將有另外的患者加入劑量擴展群組，以獲取用AMG 673治療的患者的更多臨床經驗、安全性和功效數據。
獲得書面知情同意書後，患者進入篩選期（約14天），在此期間評估患者的資格。符合條件的患者包括 ≥ 18歲的成年人，患有世界衛生組織分類（參見，例如，Arber等人, Blood [血液], 第127卷: 2391-2405, 2016）中定義的AML，在1次或多次治療療程後持續或復發並且骨髓中成髓細胞超過5%。認為合格的患者參加了試驗。治療開始的第1天（第1週期第1天；D1）為向患者投與第一次AMG 673靜脈輸注。
第一群組的起始劑量為在14天的週期中（例如，在D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13和D14）每天短時間IV輸注投與72 μg（約30分鐘至3小時），隨後從第二天開始第二週期的投與，每週兩次投與劑量持續14天的治療週期（例如，在D1、D4、D8和D11投與每一劑量）。使用較低的起始劑量（例如18 μg或36 μg）持續長達前兩個劑量。第3週期及之後的週期與第2週期相同。劑量水平審查小組（DLRT）建議在群組1之後的群組中進行給藥，如下文更詳細描述，並且給藥可以根據新出現的數據進行調整。在第1天AMG 673的第一劑量之前，在第1週期AMG 673的每次遞增劑量之前，以及在第2週期及以後週期的AMG 673的所有劑量之前1小時，對所有患者進行8-mg IV地塞米松的預處理。在第1週期和第2週期之間沒有無治療間隔（即第2週期第1天係第1週期第14天之後的那天）。在第2週期後的治療週期中，根據治療反應和血細胞計數的恢復，可以在治療週期之間採用1到14天的無治療間隔。
將如下為每個群組中的患者給藥： •      群組1：每天一次72 μg持續14天（例如，在D1至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次72 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組2：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續12天（例如，在D3至D14中的每一天給藥），隨後立即每州兩次110 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組3：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續2天（例如，在D3和D4中的每一天給藥），隨後每天一次150 μg持續10天（例如，在D5至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次150 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組4：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續2天（例如，在D3和D4中的每一天給藥），隨後每天一次150 μg持續2天（例如，在D5和D6中的每一天給藥），隨後每天一次180 μg持續8天（例如，在D7至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次180 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組5：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續2天（例如，在D3和D4中的每一天給藥），隨後每天一次150 μg持續2天（例如，在D5和D6中的每一天給藥），隨後每天一次180 μg持續2天（例如，在D7和D8中的每一天給藥），隨後每天一次240 μg持續6天（例如，在D9至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次240 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組6：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續2天（例如，在D3和D4中的每一天給藥），隨後每天一次150 μg持續2天（例如，在D5和D6中的每一天給藥），隨後每天一次180 μg持續2天（例如，在D7和D8中的每一天給藥），隨後每天一次240 μg持續2天（例如，在D9和D10中的每一天給藥），隨後每天一次360 μg持續4天（例如，在D11至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次360 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥） •      群組7：每天一次72 μg持續2天（例如，在D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次110 μg持續2天（例如，在D3和D4中的每一天給藥），隨後每天一次150 μg持續2天（例如，在D5和D6中的每一天給藥），隨後每天一次180 μg持續2天（例如，在D7和D8中的每一天給藥），隨後每天一次240 μg持續2天（例如，在D9和D10中的每一天給藥），隨後每天一次360 μg持續2天（例如，在D11和D12中的每一天給藥），隨後每天一次480 μg持續2天（例如，在D13和D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次480 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥）
每個群組招募多達4名可評估患者。每個群組中第一名和第二名患者開始治療之間至少有7天（168小時）間隔（即，以相同的劑量和計畫進行治療）。在此間隔的第7天，評估所治療患者的所有可用安全性和實驗室數據，並就劑量限制毒性（DLT）的發生/未發生做出書面確認。僅在收到此確認後，才開放該群組中的下一個患者的招募。劑量遞增持續，直到 (i) 在研究中未觀察到DLT或 (ii) 在研究中觀察到DLT，並且以劑量水平治療了至少6名患者或入選了最多40名患者。
藉由對AMG 673治療產生反應的患者數量和比例、反應持續時間、進展時間和反應時間來評估AMG 673的抗白血病活性。疾病反應評估基於細胞遺傳學、骨髓穿刺/活檢和外周血細胞計數的回顧。反應定義為以下任何一種：完全緩解（CR），具有不完全血液學恢復的CR（CRi）或無形態性白血病的狀態（均符合國際工作組修訂反應標準），或具有部分血液學恢復的CR（CRh），如下所述。 CR •   骨髓中胚細胞少於5% •   不存在帶有奧氏小體的胚細胞 •   沒有髓外疾病 •   絕對嗜中性粒細胞計數（ANC）≥ 1,000/μl •   血小板計數 ≥ 100,000/μl •   無需紅血球輸注 CRi •   所有CR標準，除外周血細胞計數不完全恢復（殘餘嗜中性粒細胞減少症[＜ 1,000個/μl]或血小板減少症 [＜ 100,000個/μl]） 形態學無白血病狀態 •   骨髓中成髓細胞少於5% •   不存在帶有奧氏小體的胚細胞 •   沒有髓外疾病 •   無需血液學恢復 CRh •   骨髓中胚細胞少於5% •   沒有疾病跡象 •   外周血細胞計數的部分恢復：血小板計數 ＞ 50,000/μl，且 •   ANC ＞ 500/μl •   沒有髓外疾病
在整個研究過程中進行不良事件和嚴重不良事件以及與疾病相關的事件評估，並將其評估並記錄在原始檔案中。除非另有說明，否則所有事件的嚴重程度均根據CTCAE 4.0版進行分級。以下情況除外：CRS根據Lee等人, Blood [血液], 第124卷: 188-195, 2014所引用的分級系統來分級。
群組1招募了五名患者。在入選前，前兩天的起始劑量調整為36 μg，然後在第1週期的其餘時間內增加至72 μg（表10）。因此，群組1的患者根據以下給藥方案接受AMG 673短期IV輸注（約30分鐘至3小時）：每天一次36 μg持續2天（例如，在第1週期D1和D2中的每一天給藥），隨後每天一次72 μg持續12天（例如，在第1週期D3至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次72 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥）。第3週期和後續週期與第2週期相同。在第1個週期的第1天36 μg的第一劑量後，兩名患者退出研究。一名這樣的患者患有2級CRS，另一名這樣的患者患有3級CRS，包括3級轉胺酶升高，被歸類為DLT。在群組1入選的其餘三名患者中，在第1週期僅觀察到1級CRS。在3/5的患者（60%）中觀察到胚細胞減少，其中2名患者表現出減少大於50%。參見以下表9。 [表 9 ]. 群組 1 中 AML 患者的骨髓胚細胞變化
有緩解的患者 自基線到最佳反應的骨髓胚細胞百分比變化
患者1* —
患者2* 130.5
患者3 -17.6
患者4 -75.0
患者5 -99.1
*患者1和2在接受第一劑量後退出研究，並且未接受72 μg的靶劑量
患者4，一位67歲的女性，先前針對AML接受過的兩個療法線，在完成AMG 673治療的第1週期後，達到了CRi，伴隨骨髓胚細胞減少75%，並橋接至同種異體造血幹細胞移植物。患者5，一位76歲的女性，先前針對AML接受過三個療法線，在完成AMG 673治療的第3週期後，達到CRh，伴隨骨髓胚細胞減少99.1%。該患者在完成第1週期後顯示骨髓胚細胞中自基線降低91%，並且在完成AMG 673治療的第2週期後達到了CRi。在該患者中AMG 673治療的第三週期的投與改善血液計數並達到CRh。此外，患者5在AMG 673治療的第2和第3週期中未經歷任何級別的CRS，並且在第1週期中僅經歷了1級CRS事件。
AMG 673暴露較高的患者中觀察到胚細胞數量減少。基於來自一名患者的可用PK數據，初步建模結果顯示，在第14天的每天（QD）給藥時，AMG 673的最終半衰期約為2.5天，相比之下，採用實例1中所述之D1/D5給藥方案的第5天的最終半衰期約為1天。
該研究的第一群組患者的結果表明，在治療的前14天內AMG 673的暴露量得到了充分增加，使得與接受表1中所述之較低頻率給藥計畫的AMG 673的患者相比，更大比例的患者表現出的骨髓胚細胞減少。在第1週期中，AMG 673的每日劑量似乎導致反應率提高以及CRS事件嚴重性降低。
基於參加群組1的患者的結果，在隨後的群組中調整劑量，以允許在第1週期的第1天使用較低的起始劑量，並以更快的速度達到靶劑量。具體來說，參加群組2的患者根據以下給藥方案接受AMG 673短期IV輸注（約30分鐘至3小時）：在第1天每天一次18 μg持續一天（例如，在第1週期的D1給藥），隨後在第2天每天一次36 μg持續一天（例如，在第1週期的D2給藥），隨後在第3天每天一次72 μg持續一天（例如，在第1週期的D3給藥），隨後在第1週期的剩餘時間每天一次110 μg持續11天（例如，在第1週期的D4至D14中的每一天給藥），隨後立即每週兩次110 μg持續14天（例如，在第2週期D1、D4、D8和D11中的每一天給藥）。下表10中列出了每個給藥組中的修改的第1週期給藥的摘要。在第1週期（14天治療週期）的指定日期，每天一次（QD）投與每個劑量。劑量以微克（μg）給出。在第1天的AMG 673劑量之前和週期1的每次遞增劑量的AMG 673之前的1小時，所有患者均應接受8-mg劑量的IV地塞米松預處理。劑量階梯的持續時間可以延長到5天，在這種情況下，週期的持續時間可以從14天延長到28天。例如，在增加到下一階梯劑量或靶劑量之前，可以僅一天給予初始劑量（18 μg），而其他劑量階梯可以給予2天。 [表 10 ]. 群組的第 1 週期給藥的每日給藥計畫
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
群組 1 36 36 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72
群組 2 18 36 72 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110 110
群組 3 18 36 72 110 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160
群組 4 18 36 72 110 160 240 240 240 240 240 240 240 240 240
群組 5 18 36 72 110 160 240 360 360 360 360 360 360 360 360
群組 6 18 36 72 110 160 240 360 480 480 480 480 480 480 480
第2週期和所有後續週期由在14天週期的第1天、第4天、第8天和第11天以靶劑量（第1週期中接受的最大劑量）輸注四次AMG 673組成（參見下表11，其中劑量以微克（μg）表示）。如果患者可能會獲得另外的益處，則可以在啟動第2週期計畫之前重複第1週期計畫。如果不重複第1週期，則第2週期應在第1週期後立即開始，且沒有無劑量間隔（例如，在第1週期中第一劑量AMG 673後的第15天 = 第2週期的第1天）。基於新出現的PK、安全性和PD數據，可以減少第2週期和後續週期中的輸注次數，以使AMG 673以每週一次的頻率（例如，在每個14天治療週期的第1天和第8天）投與。在第2個週期的第1天及以後週期的第一個劑量的AMG 673之前1小時，靜脈注射投與地塞米松8 mg。 [表 11 ]. 群組的第 2 週期給藥 1
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
群組 1 72       72          72       72         
群組 2 110       110          110       110         
群組 3 160       160          160       160         
群組 4 240       240          240       240         
群組 5 360       360          360       360         
群組 6 480       480          480       480         
1 第3週期和後續週期的劑量與第2週期相同
本文討論和引用的所有出版物、專利和專利申請均藉由引用以其整體結合在此。應理解，揭露的發明不限於所描述的特定方法、方案和材料，因為該等可以變化。還應理解，本文使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，並且不意圖限制所附請求項的範圍。
熟悉該項技術者只使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文描述發明的具體實施方式的許多等效形式。此類等效物旨在由以下請求項所涵蓋。
無
[圖 1A ]係用AMG 673治療的復發/難治性急性骨髓性白血病患者的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）血清水平與患者經歷的細胞介素釋放綜合症（CRS）等級之間之關係圖。TNF-α血清水平以中位數 ± 四分位數範圍作圖。
[圖 1B ]係用AMG 673治療的復發/難治性急性骨髓性白血病患者的介白素-2（IL-2）血清水平與患者經歷的CRS等級之間之關係圖。IL-2血清水平以中位數 ± 四分位數範圍作圖。
[圖 1C ]係用AMG 673治療的復發/難治性急性骨髓性白血病患者的介白素-6（IL-6）血清水平與患者經歷的CRS等級之間的關係圖。IL-6血清水平以中位數 ± 四分位數範圍作圖。
[圖 1D ]係用AMG 673治療的復發/難治性急性骨髓性白血病患者的介白素-10（IL-10）血清水平與患者經歷的CRS等級之間之關係圖。IL-10血清水平以中位數 ± 四分位數範圍作圖。
[圖 2 ]係在治療週期1的第1天和第5天投與AMG 673後指定的時間點復發/難治性急性骨髓性白血病患者中細胞介素（干擾素-γ（IN-γ）、IL-10、IL-6和TNF-α）血清濃度之線型圖。顯示了群組8-10中的患者的數據，該等患者在每次輸注時分別接受18 μg、36 μg或72 μg的劑量。
[圖 3 ]係瀑布圖，顯示了用AMG 673治療的復發/難治性急性骨髓性白血病患者的骨髓胚細胞自基線到最佳反應之百分比變化。*該患者的胚細胞自基線的百分變化係469。在14天的治療週期的第1天和第5天，藉由靜脈內輸注投與AMG 673。對於群組1-10，每次輸注時投與的劑量分別為0.05 μg、0.15 μg、0.45 μg、1.5 μg、4.5 μg、7 μg、9 μg、18 μg、36 μg或72 μg。
[圖 4 ]顯示了在治療的第1週期期間，藉由曲線下面積（AUC）測量的AMG 673在復發/難治性急性骨髓性白血病患者中之血清暴露，在整個給藥群組1-10中使用AMG 673治療後，該等患者的骨髓胚細胞減少超過20%或骨髓胚細胞減少少於20%或沒有減少。
[圖 5A ]顯示了CD69+ CD8+ T細胞百分比隨給藥群組之變化。對於群組1-10，每次輸注時投與的劑量分別為0.05 μg、0.15 μg、0.45 μg、1.5 μg、4.5 μg、7 μg、9 μg、18 μg、36 μg或72 μg。
[圖 5B ]顯示了干擾素-γ（IFN-γ）血清水平隨給藥群組的倍數變化。給藥群組與圖5A描述的給藥群組相同。
[圖 5C ]顯示了腫瘤壞死因子-α（TNF-α）血清水平隨給藥群組之倍數變化。給藥群組與圖5A描述的給藥群組相同。
無
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Claims (53)

  1. 特異性結合CD33和CD3的雙特異性抗體構建體在製備用於治療有需要的患者的骨髓性白血病的藥物中之用途，其中該治療包括向該患者投與至少一個起始週期和至少一個維持週期的該雙特異性抗體構建體， 其中該起始週期包括以1天至4天的間隔以約18 μg至約480 μg的一個或多個劑量投與該雙特異性抗體構建體持續第一時間段， 其中該維持週期包括以約36 μg至約480 μg的劑量投與該雙特異性抗體構建體每7天一次或兩次持續第二時間段，並且 其中在該起始週期之後投與該維持週期。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該第一時間段為約7天至約14天。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括每天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續7天。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括每天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續14天。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括每隔一天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續14天。
  6. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括每三天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續14天。
  7. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括每四天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續7天或14天。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該起始週期包括以約100 μg至約180 μg的一個或多個劑量投與該雙特異性抗體構建體。
  9. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該起始週期包括以約18 μg至約240 μg的一個或多個劑量投與該雙特異性抗體構建體。
  10. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中在該起始週期內該雙特異性抗體構建體的劑量在每個間隔相同。
  11. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中在該起始週期期間投與的該雙特異性抗體構建體的劑量在該週期期間在一個或多個間隔增加至少一次。
  12. 如請求項1所述之用途，其中該起始週期包括以第一劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，並且隨後以第二劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中該第二劑量大於該第一劑量。
  13. 如請求項12所述之用途，其中該起始週期進一步包括在該第二劑量投與後以第三劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中該第三劑量大於該第二劑量。
  14. 如請求項13所述之用途，其中該起始週期進一步包括在該第三劑量投與後以第四劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中該第四劑量大於該第三劑量。
  15. 如請求項14所述之用途，其中該起始週期進一步包括在該第四劑量投與後以第五劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中該第五劑量大於該第四劑量。
  16. 如請求項15所述之用途，其中該起始週期進一步包括在該第五劑量投與後以第六劑量投與該雙特異性抗體構建體持續一個或多個間隔，其中該第六劑量大於該第五劑量。
  17. 如請求項12至16中任一項所述之用途，其中該間隔係每天。
  18. 如請求項12所述之用途，其中該第一劑量為約18 μg至約150 μg，並且該第二劑量為約110 μg至約240 μg。
  19. 如請求項13所述之用途，其中該第一劑量為約18 μg至約150 μg，該第二劑量為約110 μg至約240 μg，並且該第三劑量為約150 μg至約360 μg。
  20. 如請求項14所述之用途，其中該第一劑量為約18 μg至約150 μg，該第二劑量為約110 μg至約240 μg，該第三劑量為約150 μg至約360 μg，並且該第四劑量為約180 μg至約480 μg。
  21. 如請求項12所述之用途，其中該第一劑量為約36 μg，該第二劑量為約72 μg，並且其中該間隔為每天。
  22. 如請求項14所述之用途，其中該第一劑量為約18 μg，該第二劑量為約36 μg，該第三劑量為約72 μg，並且該第四劑量為約110 μg，並且其中該間隔為每天。
  23. 如請求項15所述之用途，其中該第一劑量為約18 μg，該第二劑量為約36 μg，該第三劑量為約72 μg，該第四劑量為約110 μg，並且該第五劑量為約160 μg，並且其中該間隔為每天。
  24. 如請求項16所述之用途，其中該第一劑量約為18 μg，該第二劑量約為36 μg，該第三劑量約為72 μg，該第四劑量約為110 μg，該第五劑量約為160 μg，並且該第六劑量約為240 μg，並且其中該間隔為每天。
  25. 如請求項1所述之用途，其中在該維持週期期間投與的該雙特異性抗體構建體的劑量與在該起始週期期間投與的該雙特異性抗體構建體的最高劑量相同。
  26. 如請求項1所述之用途，其中在該維持週期期間投與的該雙特異性抗體構建體的劑量為約110 μg至約240 μg。
  27. 如請求項1所述之用途，其中在該維持週期期間投與的該雙特異性抗體構建體的劑量為約72 μg至約360 μg。
  28. 如請求項1或2所述之用途，其中該第二時間段為約14天至約28天。
  29. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該維持週期包括每7天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續14天。
  30. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該維持週期包括每7天一次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續28天。
  31. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該維持週期包括每7天兩次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續14天。
  32. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該維持週期包括每7天兩次投與該雙特異性抗體構建體的劑量持續28天。
  33. 如請求項1所述之用途，其中在該起始週期和/或該維持週期中投與的該雙特異性抗體構建體的劑量中的每個以約30 min至約90 min的靜脈內輸注的形式投與。
  34. 如請求項1或2所述之用途，其中在完成該起始週期後的第二天啟動該維持週期。
  35. 如請求項1所述之用途，其中向該患者投與了兩個或更多個維持週期。
  36. 如請求項35所述之用途，其中向該患者投與了六至十二個維持週期。
  37. 如請求項1所述之用途，該用途進一步包括在該起始週期和/或維持週期期間，在投與該雙特異性抗體構建體的每個劑量之前，向該患者投與糖皮質激素。
  38. 如請求項37所述之用途，其中該糖皮質激素係地塞米松。
  39. 如請求項1所述之用途，其中該骨髓性白血病係急性骨髓性白血病。
  40. 如請求項39所述之用途，其中該急性骨髓性白血病係復發和/或難治性急性骨髓性白血病。
  41. 如請求項1所述之用途，其中該骨髓性白血病係慢性骨髓性白血病。
  42. 如請求項39至41中任一項所述之用途，其中該患者先前已接受一個或多個化學療法方案。
  43. 如請求項39至41中任一項所述之用途，其中該患者已接受造血幹細胞移植。
  44. 如請求項1所述之用途，其中該雙特異性抗體構建體以胺基至羧基的順序包含： (i) 與人類CD33特異性結合的第一結構域，該第一結構域包含第一免疫球蛋白重鏈可變區（VH1）和第一免疫球蛋白輕鏈可變區（VL1），該VH1包含具有SEQ ID NO: 10的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 13的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 14的序列的CDRH3，該VL1包含具有SEQ ID NO: 6的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 8的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 9的序列的CDRL3； (ii) 與人類CD3特異性結合的第二結構域，該第二結構域包含第二免疫球蛋白重鏈可變區（VH2）和第二免疫球蛋白輕鏈可變區（VL2），該VH2包含具有SEQ ID NO: 38的序列的CDRH1、具有SEQ ID NO: 44的序列的CDRH2和具有SEQ ID NO: 49的序列的CDRH3，該VL2包含具有SEQ ID NO: 32的序列的CDRL1、具有SEQ ID NO: 33的序列的CDRL2和具有SEQ ID NO: 36的序列的CDRL3；以及 (iii) 包含兩個Fc單體的第三結構域，每個單體包含免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個單體經由肽連接子彼此融合。
  45. 如請求項44所述之用途，其中VH1包含SEQ ID NO: 28的序列，並且VL1包含SEQ ID NO: 20的序列。
  46. 如請求項44或45所述之用途，其中VH2包含SEQ ID NO: 61的序列，並且VL2包含SEQ ID NO: 59的序列。
  47. 如請求項44至46中任一項所述之用途，其中該第一和第二結合結構域係單鏈可變片段（scFv）結構域。
  48. 如請求項44所述之用途，其中該第一結合結構域包含SEQ ID NO: 91的序列。
  49. 如請求項44所述之用途，其中該第二結合結構域包含SEQ ID NO: 101的序列。
  50. 如請求項44所述之用途，其中該第三結構域的所述Fc單體的每個包含SEQ ID NO: 109的序列。
  51. 如請求項44所述之用途，其中該第三結構域包含SEQ ID NO: 117的序列。
  52. 如請求項44所述之用途，其中該雙特異性抗體構建體係單鏈抗體構建體。
  53. 如請求項52所述之用途，其中該雙特異性抗體構建體包含SEQ ID NO: 125的序列。
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