JP2003500051A - 相互作用活性化タンパク質 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
クラスAβラクタマーゼ(E. coliのTEM-1)断片対が、それらの親タンパク質への機能的再組み立てが断片対の切断点末端に遺伝工学的または化学的に接合させてある異種ポリペプチドまたは他の分子の相互作用に依存するものとして開示される。さらに、親機能タンパク質へと最適に組み立てられる断片対を検出する方法が提供される。分子相互作用依存性酵素を含む断片対の用途は(1)2以上の独立結合部位をもつ任意の検体を対象とする均質検定法およびバイオセンサー、(2)がん、慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、アミロイド症、感染症、移植拒絶反応、およびその他病理の早期発見・治療のための治療用および造影用試薬の組織局在的な生体内活性化、(3)標的経路のアゴニスト／アンタゴニストの高効率高性能スクリーニングのための代謝またはシグナル伝達経路の活性化または阻害を検出する細胞系センサー、(4)細胞、組織および病原体のプロテオーム内および間の対単位のタンパク質-タンパク質相互作用の高性能マッピング、(5)目的タンパク質に特異的に結合する抗体断片または他の結合タンパク質の迅速な選択、(6)抗細胞および抗組織抗体に対応する抗原の迅速な検出、(7)抗体に対応するエピトープの迅速な検出、(8)任意のタンパク質-タンパク質相互作用の阻害物質の高性能選択のための細胞系スクリーンなどである。
Description
【０００１】
はじめに
技術分野
本発明はタンパク質間相互作用の検出に関連する。この検出は、直接検出可能
なタンパク質へと再び組み立てられることになる断片対の一方の断片をもコード
する融合体配列の一部として相互作用タンパク質を発現させることによって行わ
れる。本発明の相互作用依存性酵素会合(IdEA)システムの代表例は細菌性βラク
タマーゼ類である。これは構造的に関連し合う一大酵素群であり、構造相同性と
基質特異性に応じて数群に細分される。 背景 ほとんどの生理プロセスは、細胞表面での多タンパク質複合体のリガンド依存
性組み立てから複雑に入り組んだ細胞内シグナル伝達カスケードを経て特定遺伝
子のプロモーター上での転写調節複合体の組み立てに至るまで、主としてタンパ
ク質間の特異的認識を通じて互いにまたそれぞれの環境と相互作用する細胞の複
雑なネットワークに依存する。したがって、ほとんどの病理状態にはタンパク質
-タンパク質相互作用が役立ち、また診断治療のための多様な標的を提供してく
れる。そこで、 (1)疾病で果たす役割の研究を目的とした主要関係物質の天然リ
ガンドを検出し (2)診断治療のための代用リガンドを開発するための、新方法や
改良方法が絶えず求められている。多数の方法がこれまでに開発されてきた。目
的タンパク質と相互作用する天然タンパク質を検出するために最も広く使用され
ている方法は一般にcDNA発現ライブラリーのスクリーニングに関係する。目的タ
ンパク質のリガンドに対応する少数の遺伝子は、抗体プロービングの場合のよう
に、標識付けした目的タンパク質と結合させるためのフィルター上でcDNA発現ラ
イブラリーを直接スクリーニングして単離されてきた(Blackwood and Eisenman,
Science(1991) 251:1211; Defeo-Jones et al., Nature(1991) 352:251)。しか
し、きわめて多数の重要なタンパク質相互作用は、相互作用条件が自然とは程遠
いこうした方法の荒々しさに耐えうるほど堅固ではない。また、これらの方法は
偽陽性頻度も高い。標的タンパク質をプローブと接触させるために固定化処理し
た細胞内には変性タンパク質が存在するためである。
なタンパク質へと再び組み立てられることになる断片対の一方の断片をもコード
する融合体配列の一部として相互作用タンパク質を発現させることによって行わ
れる。本発明の相互作用依存性酵素会合(IdEA)システムの代表例は細菌性βラク
タマーゼ類である。これは構造的に関連し合う一大酵素群であり、構造相同性と
基質特異性に応じて数群に細分される。 背景 ほとんどの生理プロセスは、細胞表面での多タンパク質複合体のリガンド依存
性組み立てから複雑に入り組んだ細胞内シグナル伝達カスケードを経て特定遺伝
子のプロモーター上での転写調節複合体の組み立てに至るまで、主としてタンパ
ク質間の特異的認識を通じて互いにまたそれぞれの環境と相互作用する細胞の複
雑なネットワークに依存する。したがって、ほとんどの病理状態にはタンパク質
-タンパク質相互作用が役立ち、また診断治療のための多様な標的を提供してく
れる。そこで、 (1)疾病で果たす役割の研究を目的とした主要関係物質の天然リ
ガンドを検出し (2)診断治療のための代用リガンドを開発するための、新方法や
改良方法が絶えず求められている。多数の方法がこれまでに開発されてきた。目
的タンパク質と相互作用する天然タンパク質を検出するために最も広く使用され
ている方法は一般にcDNA発現ライブラリーのスクリーニングに関係する。目的タ
ンパク質のリガンドに対応する少数の遺伝子は、抗体プロービングの場合のよう
に、標識付けした目的タンパク質と結合させるためのフィルター上でcDNA発現ラ
イブラリーを直接スクリーニングして単離されてきた(Blackwood and Eisenman,
Science(1991) 251:1211; Defeo-Jones et al., Nature(1991) 352:251)。しか
し、きわめて多数の重要なタンパク質相互作用は、相互作用条件が自然とは程遠
いこうした方法の荒々しさに耐えうるほど堅固ではない。また、これらの方法は
偽陽性頻度も高い。標的タンパク質をプローブと接触させるために固定化処理し
た細胞内には変性タンパク質が存在するためである。
【０００２】
cDNAスクリーニングの方法論は、スクリーニング可能または選択可能な細胞表
現型を生きた細胞内の所望のタンパク質相互作用に依存させるよう改変すること
を可能にしたシステムの開発に伴い大きく前進した(Fields and Song, Nature (
1989) 340:245; Chien et al., Proc Natl Acad Sci (1991) 88:9578; Zervos e
t al., Cell(1993) 72:223; Vojtek et al., Cell(1993) 74:205; Luban et al.
, Cell (1993) 73:1067)。なかでも最も広く使用されているのは前掲Fields and
Song (1989)の酵母「ツーハイブリッド」システムである。このシステムはタン
パク質中の多数の機能的ドメインの「モジュール性」を利用して諸機能の連結を
操作しうるようにしている。これは特に転写アクチベーターの場合に言えるが、
そこではコア転写複合体と相互作用する活性化ドメインが配列特異的DNA結合ド
メインにより特定の遺伝子へと「誘導」される。多数の転写アクチベーターの場
合、これらのドメインは独立に機能することができるし、また実際にはしばしば
別個の、相互作用サブユニットをなす。酵母ツーハイブリッドシステムでは、「
餌」タンパク質はシスエレメント配列特異的DNA結合ドメインとの融合体として
発現し、またcDNAは転写活性化ドメインとの融合体として発現する。これら2つ
のドメインがcDNA産物と「餌」タンパク質の相互作用により引き合わされると、
またそのときに限って、レポーター遺伝子の発現が可能になる。というのは、そ
の転写はシスエレメントからの転写活性化に依存するからである。レポーターは
スクリーニング可能(色を指標とするβガラクトシダーゼなど)、選択可能(ヒス
チジン不在下での増殖能を指標とするHIS3など)のいずれでもよい。
現型を生きた細胞内の所望のタンパク質相互作用に依存させるよう改変すること
を可能にしたシステムの開発に伴い大きく前進した(Fields and Song, Nature (
1989) 340:245; Chien et al., Proc Natl Acad Sci (1991) 88:9578; Zervos e
t al., Cell(1993) 72:223; Vojtek et al., Cell(1993) 74:205; Luban et al.
, Cell (1993) 73:1067)。なかでも最も広く使用されているのは前掲Fields and
Song (1989)の酵母「ツーハイブリッド」システムである。このシステムはタン
パク質中の多数の機能的ドメインの「モジュール性」を利用して諸機能の連結を
操作しうるようにしている。これは特に転写アクチベーターの場合に言えるが、
そこではコア転写複合体と相互作用する活性化ドメインが配列特異的DNA結合ド
メインにより特定の遺伝子へと「誘導」される。多数の転写アクチベーターの場
合、これらのドメインは独立に機能することができるし、また実際にはしばしば
別個の、相互作用サブユニットをなす。酵母ツーハイブリッドシステムでは、「
餌」タンパク質はシスエレメント配列特異的DNA結合ドメインとの融合体として
発現し、またcDNAは転写活性化ドメインとの融合体として発現する。これら2つ
のドメインがcDNA産物と「餌」タンパク質の相互作用により引き合わされると、
またそのときに限って、レポーター遺伝子の発現が可能になる。というのは、そ
の転写はシスエレメントからの転写活性化に依存するからである。レポーターは
スクリーニング可能(色を指標とするβガラクトシダーゼなど)、選択可能(ヒス
チジン不在下での増殖能を指標とするHIS3など)のいずれでもよい。
【０００３】
このシステムの変種は多数の重要なタンパク質-タンパク質相互作用を検出す
るために首尾よく使用されてきた(Chien et al., 1991, supra; Zervos et al.,
1993, supra; Vojtek et al., 1993, supra; Luban et al., 1993, supra; Bar
tel et al., Nature Genetics (1996) 2:72; Fromont-Racine et al., Nature G
enetics (1997) 3:277; Xu et al., Proc Natl Acad Sci (1997) 94:12473)。し
かしその成功にもかかわらず、原初のツーハイブリッドシステムには、ゲノミッ
クスからの製剤標的の回収を加速するためのハイスループット用途向けとしては
重大な欠点がある。このシステムの根本的な限界は試験相互作用から選択可能表
現型の生成までに多数のステップが必要とされる点にある。そうしたステップの
たびに偽陽性バックグラウンドを生じさせる非特異的相互作用や真の相互作用因
子の見落としを招く解離のリスクが生れる。転写機構の高度の組み合わせ性や、
転写アクチベーター結合プロモーターを含む転写開始複合体の1以上の成分と相
互作用しかねないcDNAライブラリー中にコード化されたタンパク質ドメインの多
さなど、偽陽性問題を悪化させる要因もある(Bartel et al., BioTechniques (1
993) 14:920)。原初のツーハイブリッドシステムには、一般に分泌または膜タン
パク質には対応できず、細胞質タンパク質が酵母核内で安定的でなければならな
いという限界もある。
るために首尾よく使用されてきた(Chien et al., 1991, supra; Zervos et al.,
1993, supra; Vojtek et al., 1993, supra; Luban et al., 1993, supra; Bar
tel et al., Nature Genetics (1996) 2:72; Fromont-Racine et al., Nature G
enetics (1997) 3:277; Xu et al., Proc Natl Acad Sci (1997) 94:12473)。し
かしその成功にもかかわらず、原初のツーハイブリッドシステムには、ゲノミッ
クスからの製剤標的の回収を加速するためのハイスループット用途向けとしては
重大な欠点がある。このシステムの根本的な限界は試験相互作用から選択可能表
現型の生成までに多数のステップが必要とされる点にある。そうしたステップの
たびに偽陽性バックグラウンドを生じさせる非特異的相互作用や真の相互作用因
子の見落としを招く解離のリスクが生れる。転写機構の高度の組み合わせ性や、
転写アクチベーター結合プロモーターを含む転写開始複合体の1以上の成分と相
互作用しかねないcDNAライブラリー中にコード化されたタンパク質ドメインの多
さなど、偽陽性問題を悪化させる要因もある(Bartel et al., BioTechniques (1
993) 14:920)。原初のツーハイブリッドシステムには、一般に分泌または膜タン
パク質には対応できず、細胞質タンパク質が酵母核内で安定的でなければならな
いという限界もある。
【０００４】
最近、他タイプのタンパク質機能をもタンパク質-タンパク質相互作用レポー
トシステムとして使用する方向へとツーハイブリッドのコンセプトが拡張された
。たとえば選択感染性ファージ(SIP)システムでは、線状ファージに感染力を付
与する機能を果たすタンパク質を断片化して、断片が異種相互作用因子へと融合
する場合に限ってそのタンパク質が機能するようにしてある(Krebber et al., J
Mol Biol (1997) 268:607)。そこで、相互作用因子コード化ファージに選択可
能表現型を感染によって受容細胞へと導入すること許す働きからこの相互作用を
モニターする。しかし、この方法もまた標的相互作用から受容細胞による選択可
能表現型の発現までの間に多数の低効率ステップを必要とするという難点がある
。このシステムもツーハイブリッドシステムと同様に、大部分の天然タンパク質
-タンパク質相互作用がｍＭレンジで親和性をもち、その半減期は秒単位である
という事実から、効率の低下に見舞われる。相互作用とシグナル生成のタイムラ
グがこの半減期を上回ると−このシステムでは現にそうであるが−、相互作用検
出効率は急低下する。
トシステムとして使用する方向へとツーハイブリッドのコンセプトが拡張された
。たとえば選択感染性ファージ(SIP)システムでは、線状ファージに感染力を付
与する機能を果たすタンパク質を断片化して、断片が異種相互作用因子へと融合
する場合に限ってそのタンパク質が機能するようにしてある(Krebber et al., J
Mol Biol (1997) 268:607)。そこで、相互作用因子コード化ファージに選択可
能表現型を感染によって受容細胞へと導入すること許す働きからこの相互作用を
モニターする。しかし、この方法もまた標的相互作用から受容細胞による選択可
能表現型の発現までの間に多数の低効率ステップを必要とするという難点がある
。このシステムもツーハイブリッドシステムと同様に、大部分の天然タンパク質
-タンパク質相互作用がｍＭレンジで親和性をもち、その半減期は秒単位である
という事実から、効率の低下に見舞われる。相互作用とシグナル生成のタイムラ
グがこの半減期を上回ると−このシステムでは現にそうであるが−、相互作用検
出効率は急低下する。
【０００５】
さらに最近になって、タンパク質-タンパク質相互作用から直接、標的相互作
用とシグナル生成の間にほとんどまたはまったくステップを介在させずに、選択
可能表現型を付与しうるタンパク質に適合させたツーハイブリッドコンセプトが
現れている。たとえば、相互作用因子を近づけると検出可能な蛍光共鳴エネルギ
ー転移(FRET)を起こすAequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質(GFP)の変種
に相互作用因子を融合させることができる(Cubitt et al., Trends Biochem (19
95) 20:448)。選択可能またはスクリーニング可能な表現型を細胞に付与する一
部の酵素もまたツーハイブリッド型のタンパク質-タンパク質相互作用検出に適
合させることができる(Rossi et al., Proc Natl Acad Sci (1997) 94:8405; Pe
lletier et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:12141)。この変法では相互作
用タンパク質を酵素断片と融合させる。これらの酵素断片はそれ自体では不活性
であるが、融合相手のタンパク質ドメインの相互作用によって引き合わされると
会合し、酵素の選択可能活性を復活させることができる。これが相互作用依存性
酵素活性化(IdEA)の一例であり、図解すると図1のようになる。IdEA、GFP FRET
両システムには従来版のツーハイブリッドコンセプトに比していくつかの強みが
ある。たとえば、選択可能シグナルは所望の相互作用から直接、在来システムの
非効率の主因となっているステップを一切介在させずに、生成される。こうした
効率面、バックグラウンド面の改善はこれらの方法をハイスループット用途にな
じみやすくするはずである。しかし、IdEA、GFP FRETどちらのシステムも理論的
には、相互作用を天然環境内でモニターできるように原核、真核両細胞で、また
細胞質中でも分泌経路中でも構築しうるが、実際にはそうなっていない。今日ま
でに報告されているIdEAシステムはどれも細胞質酵素を利用しているだけであり
、また細胞質環境で有効であるにすぎない(Rossi et al., 1997, supra; Pellet
ier et al., 1998, supra; Karimova et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5
752)。実は、報告されているこれらのシステムはその設計のせいで、分泌経路内
または細菌ペリプラズム内では機能しないと見込まれよう。したがって、分泌タ
ンパク質の相互作用のモニタリングに有効であるとはみなされない。
用とシグナル生成の間にほとんどまたはまったくステップを介在させずに、選択
可能表現型を付与しうるタンパク質に適合させたツーハイブリッドコンセプトが
現れている。たとえば、相互作用因子を近づけると検出可能な蛍光共鳴エネルギ
ー転移(FRET)を起こすAequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質(GFP)の変種
に相互作用因子を融合させることができる(Cubitt et al., Trends Biochem (19
95) 20:448)。選択可能またはスクリーニング可能な表現型を細胞に付与する一
部の酵素もまたツーハイブリッド型のタンパク質-タンパク質相互作用検出に適
合させることができる(Rossi et al., Proc Natl Acad Sci (1997) 94:8405; Pe
lletier et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:12141)。この変法では相互作
用タンパク質を酵素断片と融合させる。これらの酵素断片はそれ自体では不活性
であるが、融合相手のタンパク質ドメインの相互作用によって引き合わされると
会合し、酵素の選択可能活性を復活させることができる。これが相互作用依存性
酵素活性化(IdEA)の一例であり、図解すると図1のようになる。IdEA、GFP FRET
両システムには従来版のツーハイブリッドコンセプトに比していくつかの強みが
ある。たとえば、選択可能シグナルは所望の相互作用から直接、在来システムの
非効率の主因となっているステップを一切介在させずに、生成される。こうした
効率面、バックグラウンド面の改善はこれらの方法をハイスループット用途にな
じみやすくするはずである。しかし、IdEA、GFP FRETどちらのシステムも理論的
には、相互作用を天然環境内でモニターできるように原核、真核両細胞で、また
細胞質中でも分泌経路中でも構築しうるが、実際にはそうなっていない。今日ま
でに報告されているIdEAシステムはどれも細胞質酵素を利用しているだけであり
、また細胞質環境で有効であるにすぎない(Rossi et al., 1997, supra; Pellet
ier et al., 1998, supra; Karimova et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5
752)。実は、報告されているこれらのシステムはその設計のせいで、分泌経路内
または細菌ペリプラズム内では機能しないと見込まれよう。したがって、分泌タ
ンパク質の相互作用のモニタリングに有効であるとはみなされない。
【０００６】
細胞外タンパク質-タンパク質相互作用検出用の最も広く使用されている現行
システム、すなわちウィルスまたは細胞ディスプレーシステムは本質的に、高ス
トリンジェシー選択および／または高バックグラウンドのin vitro法である。し
たがって、ハイスループット用途にはあまり向かない。これらのシステムはまた
通常、既知の精製済み異種相互作用因子ドメインまたは「餌タンパク質」の使用
を必要とし、したがってタンパク質結合対のいずれの異種相互作用因子ドメイン
も先験的に知られていないような多重用途、すなわちすべてのタンパク質結合対
の相互作用の同時検出を目的とした2タンパク質ライブラリー相互の組み合わせ
相互反応には向かない。細胞外相互作用の検出に餌の精製を必要としないシステ
ムの1つにE. coli二量体検出システム(EDDS; Small Molecule Therapeutics, In
c., Monmouth Junction, NJ)がある。このシステムのための餌タンパク質は、単
一の膜貫通領域をもちシグナル生成に単純二量体化を必要とするＩ型膜受容体に
限られる。餌受容体のエクトドメインは膜貫通領域とE. coliのエンドドメイン
に融合している。この融合タンパク質が細菌ペリプラズム内で発現ベクターと同
時発現するときに、受容体に対応するリガンドを、受容体を二量体化し選択可能
表現型の発現を誘発するその能力によって検出することができる。しかしこのシ
ステムには酵母ツーハイブリッドシステムやSIPシステムと同じ限界、すなわち
相互作用と表現型の間の多数のステップが高い偽陽性および偽陰性率のために重
大な効率低下を招くという限界がある。
システム、すなわちウィルスまたは細胞ディスプレーシステムは本質的に、高ス
トリンジェシー選択および／または高バックグラウンドのin vitro法である。し
たがって、ハイスループット用途にはあまり向かない。これらのシステムはまた
通常、既知の精製済み異種相互作用因子ドメインまたは「餌タンパク質」の使用
を必要とし、したがってタンパク質結合対のいずれの異種相互作用因子ドメイン
も先験的に知られていないような多重用途、すなわちすべてのタンパク質結合対
の相互作用の同時検出を目的とした2タンパク質ライブラリー相互の組み合わせ
相互反応には向かない。細胞外相互作用の検出に餌の精製を必要としないシステ
ムの1つにE. coli二量体検出システム(EDDS; Small Molecule Therapeutics, In
c., Monmouth Junction, NJ)がある。このシステムのための餌タンパク質は、単
一の膜貫通領域をもちシグナル生成に単純二量体化を必要とするＩ型膜受容体に
限られる。餌受容体のエクトドメインは膜貫通領域とE. coliのエンドドメイン
に融合している。この融合タンパク質が細菌ペリプラズム内で発現ベクターと同
時発現するときに、受容体に対応するリガンドを、受容体を二量体化し選択可能
表現型の発現を誘発するその能力によって検出することができる。しかしこのシ
ステムには酵母ツーハイブリッドシステムやSIPシステムと同じ限界、すなわち
相互作用と表現型の間の多数のステップが高い偽陽性および偽陰性率のために重
大な効率低下を招くという限界がある。
【０００７】
したがって、ハイスループット用途で細胞外および細胞内タンパク質間の多重
相互作用の同時検出を可能にするようなIdEAシステムを開発することが重要であ
る。 関連文献 USPN 5,585,245は、結合対の二つの既定タンパク質の結合がユビキチナーゼに
よるユビキチンの特異的タンパク質分解として検出されるユビキチン系タンパク
質センサー相補システムについて開示している。PCT公開WO 98/44350はβガラク
トシダーゼサブユニットの融合タンパク質を使用するレポーターサブユニット相
補システムについて開示している。PCT公開WO 98/34120はジヒドロ葉酸を使用す
るタンパク質断片相補システムについて開示している。 要約 相互作用依存性タンパク質会合システムを使用してポリペプチド間の相互作用
を検出するための組成物と方法を提供する。このシステムは、直接検出可能なシ
グナル、たとえば明確な表現型の変化または抗生物質耐性などを備えるマーカー
タンパク質へと機能的に再組み立てされる第1および第2要素から成る断片対の使
用を特徴とする。本発明の断片対相補システムは第1および第2オリゴペプチドの
宿主細胞内での同時発現を伴うが、各オリゴペプチドはマーカータンパク質断片
対の一方の要素との、フレキシブルポリペプチドリンカーで隔てられた融合タン
パク質である。第1オリゴペプチドと第2オリゴペプチドが結合すると断片対がマ
ーカータンパク質へと機能的に再構成される結果となり、また第1および第2オリ
ゴペプチドの相互作用は、マーカータンパク質の存在のしるしとなる直接検出可
能シグナルを示すプラスミドを宿主細胞から単離し配列決定することにより検出
される。マーカータンパク質への断片対の機能的再構成は、断片対要素の切断点
末端またはその近傍の3〜12個のアミノ酸から成るシステイン残基またはランダ
ムコード化ペプチドなどのようなエレメントを加えて、または断片対要素をコー
ドする核酸配列内に1〜3個のコドン変更を導入して、増進することができる。本
発明はまた、三次または二次構造情報を用いたフレキシブルループ内の機能的切
断点の特定に関係するマーカータンパク質の機能的断片対を見つけ出す効率的な
方法を提供する。本発明の相互作用依存性タンパク質活性化システムは免疫グロ
ブリンエピトープ、細胞外タンパク質に結合するポリペプチド配列、およびリン
酸化調節シグナル伝達タンパク質の検出に使用できる。このシステムはまた、多
様な形質に対応する遺伝子や、誘導抗腫瘍プロドラッグの標的化、局在化された
活性化に対応する遺伝子などを発現するよう形質転換した細胞の単一抗生物質に
よる選択を可能にする方法にも使用できる。 個別実施態様の簡単な説明 第1タンパク質と第2標的タンパク質の相互作用の検出に有効な相互作用依存性
タンパク質活性化システムのための方法および組成物が提供される。この方法は
第1の既知または未知相互作用因子ドメインと第2の未知相互作用因子ドメインの
相互作用を、マーカータンパク質の断片対の両要素を引き合わせて、この親マー
カータンパク質が、異種相互作用因子ドメインの事前の相互作用を前提に再び組
み立てられて元の機能を回復するようにすることにより検出する。このシステム
は、直接検出可能な、下流ステップでの認識を必要としないシグナルを提供する
ようなマーカータンパク質に由来し、またそうしたマーカータンパク質へと再び
機能的に組み立てることができる断片対を構成する要素としてのN末端断片およ
びC末端断片を特徴とする。たとえば、本発明にとって関心の的になるマーカー
タンパク質は自ら、明確な表現型の変化または抗生物質耐性などのような選択可
能シグナルを生み出す機能を果たす。
相互作用の同時検出を可能にするようなIdEAシステムを開発することが重要であ
る。 関連文献 USPN 5,585,245は、結合対の二つの既定タンパク質の結合がユビキチナーゼに
よるユビキチンの特異的タンパク質分解として検出されるユビキチン系タンパク
質センサー相補システムについて開示している。PCT公開WO 98/44350はβガラク
トシダーゼサブユニットの融合タンパク質を使用するレポーターサブユニット相
補システムについて開示している。PCT公開WO 98/34120はジヒドロ葉酸を使用す
るタンパク質断片相補システムについて開示している。 要約 相互作用依存性タンパク質会合システムを使用してポリペプチド間の相互作用
を検出するための組成物と方法を提供する。このシステムは、直接検出可能なシ
グナル、たとえば明確な表現型の変化または抗生物質耐性などを備えるマーカー
タンパク質へと機能的に再組み立てされる第1および第2要素から成る断片対の使
用を特徴とする。本発明の断片対相補システムは第1および第2オリゴペプチドの
宿主細胞内での同時発現を伴うが、各オリゴペプチドはマーカータンパク質断片
対の一方の要素との、フレキシブルポリペプチドリンカーで隔てられた融合タン
パク質である。第1オリゴペプチドと第2オリゴペプチドが結合すると断片対がマ
ーカータンパク質へと機能的に再構成される結果となり、また第1および第2オリ
ゴペプチドの相互作用は、マーカータンパク質の存在のしるしとなる直接検出可
能シグナルを示すプラスミドを宿主細胞から単離し配列決定することにより検出
される。マーカータンパク質への断片対の機能的再構成は、断片対要素の切断点
末端またはその近傍の3〜12個のアミノ酸から成るシステイン残基またはランダ
ムコード化ペプチドなどのようなエレメントを加えて、または断片対要素をコー
ドする核酸配列内に1〜3個のコドン変更を導入して、増進することができる。本
発明はまた、三次または二次構造情報を用いたフレキシブルループ内の機能的切
断点の特定に関係するマーカータンパク質の機能的断片対を見つけ出す効率的な
方法を提供する。本発明の相互作用依存性タンパク質活性化システムは免疫グロ
ブリンエピトープ、細胞外タンパク質に結合するポリペプチド配列、およびリン
酸化調節シグナル伝達タンパク質の検出に使用できる。このシステムはまた、多
様な形質に対応する遺伝子や、誘導抗腫瘍プロドラッグの標的化、局在化された
活性化に対応する遺伝子などを発現するよう形質転換した細胞の単一抗生物質に
よる選択を可能にする方法にも使用できる。 個別実施態様の簡単な説明 第1タンパク質と第2標的タンパク質の相互作用の検出に有効な相互作用依存性
タンパク質活性化システムのための方法および組成物が提供される。この方法は
第1の既知または未知相互作用因子ドメインと第2の未知相互作用因子ドメインの
相互作用を、マーカータンパク質の断片対の両要素を引き合わせて、この親マー
カータンパク質が、異種相互作用因子ドメインの事前の相互作用を前提に再び組
み立てられて元の機能を回復するようにすることにより検出する。このシステム
は、直接検出可能な、下流ステップでの認識を必要としないシグナルを提供する
ようなマーカータンパク質に由来し、またそうしたマーカータンパク質へと再び
機能的に組み立てることができる断片対を構成する要素としてのN末端断片およ
びC末端断片を特徴とする。たとえば、本発明にとって関心の的になるマーカー
タンパク質は自ら、明確な表現型の変化または抗生物質耐性などのような選択可
能シグナルを生み出す機能を果たす。
【０００８】
断片対は、第1および第2オリゴペプチド配列の同時発現を伴う方法に使用され
るが、この場合、第1オリゴペプチド配列は翻訳方向に、切断点末端を介してフ
レキシブルポリペプチドリンカーへと融合されたN末端断片と第1相互作用因子ド
メインから成り、また第2オリゴペプチド配列は翻訳方向に、第2相互作用因子ド
メインと切断点末端を介してC末端断片へと融合されたフレキシブルポリペプチ
ドリンカーから成る。フレキシブルポリペプチドリンカーは相互作用因子ドメイ
ンから断片ドメインを分け隔て、それらの独立した折りたたみを可能にする。リ
ンカーは最適には長さがアミノ酸数で15または60 Å (残基当たり〜4 Å)であり
、長いほうではアミノ酸数30でもよいが、好ましくはアミノ酸数20以下とし、短
いほうではアミノ酸数3ほど少なくてもよいが、好ましくはアミノ酸数6以上とす
る。フレキシビリティーを確保するために、また断片ドメインと相互作用因子ド
メインの独立した折りたたみを妨げかねない立体障害の導入を防ぐためにも、リ
ンカーはGly、Ala、Valなどのような小さな、好ましくは中性の残基から成るの
がよいが、SerやMetなどのようなヘテロ原子を持つ極性残基を含んでも、また電
荷型残基を含んでもよい。
るが、この場合、第1オリゴペプチド配列は翻訳方向に、切断点末端を介してフ
レキシブルポリペプチドリンカーへと融合されたN末端断片と第1相互作用因子ド
メインから成り、また第2オリゴペプチド配列は翻訳方向に、第2相互作用因子ド
メインと切断点末端を介してC末端断片へと融合されたフレキシブルポリペプチ
ドリンカーから成る。フレキシブルポリペプチドリンカーは相互作用因子ドメイ
ンから断片ドメインを分け隔て、それらの独立した折りたたみを可能にする。リ
ンカーは最適には長さがアミノ酸数で15または60 Å (残基当たり〜4 Å)であり
、長いほうではアミノ酸数30でもよいが、好ましくはアミノ酸数20以下とし、短
いほうではアミノ酸数3ほど少なくてもよいが、好ましくはアミノ酸数6以上とす
る。フレキシビリティーを確保するために、また断片ドメインと相互作用因子ド
メインの独立した折りたたみを妨げかねない立体障害の導入を防ぐためにも、リ
ンカーはGly、Ala、Valなどのような小さな、好ましくは中性の残基から成るの
がよいが、SerやMetなどのようなヘテロ原子を持つ極性残基を含んでも、また電
荷型残基を含んでもよい。
【０００９】
第1相互作用因子ドメインは、未知のタンパク質またはタンパク質断片である
第2標的相互作用因子ドメインと直接または間接に結合する既知または未知のタ
ンパク質またはタンパク質断片であり、また第1および第2相互作用因子ドメイン
の一方または両方はあるライブラリーの要素でありうる。相互作用因子ドメイン
ライブリーは好ましくはcDNAから構築するが、たとえば合成DNA、RNAおよびゲノ
ムDNAから構築してもよい。第1および第2オリゴペプチド配列を結合する場合、N
末端およびC末端断片のマーカータンパク質への再構成は、第1および第2相互作
用因子ドメインの事前の相互作用を必要とする。結合相互作用因子ドメインは機
能的に再構成されたマーカータンパク質を発現することによって検出され、次い
で結合相互作用因子ドメインをコードするヌクレオチド配列または結合相互作用
因子ドメイン自体が電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ヌクレオチドおよ
びアミノ酸の配列決定などのような方法によって特性を解明される。
第2標的相互作用因子ドメインと直接または間接に結合する既知または未知のタ
ンパク質またはタンパク質断片であり、また第1および第2相互作用因子ドメイン
の一方または両方はあるライブラリーの要素でありうる。相互作用因子ドメイン
ライブリーは好ましくはcDNAから構築するが、たとえば合成DNA、RNAおよびゲノ
ムDNAから構築してもよい。第1および第2オリゴペプチド配列を結合する場合、N
末端およびC末端断片のマーカータンパク質への再構成は、第1および第2相互作
用因子ドメインの事前の相互作用を必要とする。結合相互作用因子ドメインは機
能的に再構成されたマーカータンパク質を発現することによって検出され、次い
で結合相互作用因子ドメインをコードするヌクレオチド配列または結合相互作用
因子ドメイン自体が電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ヌクレオチドおよ
びアミノ酸の配列決定などのような方法によって特性を解明される。
【００１０】
本発明の先行断片相補システムと比べた場合の利点は、再組み立てに際して直
接検出可能なシグナルをもたらすレポータータンパク質および1×10-6以下のバ
ックグラウンドレベルなどである。さらに本発明は、融合オリゴペプチドに対す
る合理的に組み込まれた増進的改変を提供して、断片の折りたたみと親タンパク
質への再組み立てを改善する一方で再組み立て面での相互作用因子ドメインへの
依存性は維持することにより再構成タンパク質の機能活性を野生型レベルにまで
高めるようにする。
接検出可能なシグナルをもたらすレポータータンパク質および1×10-6以下のバ
ックグラウンドレベルなどである。さらに本発明は、融合オリゴペプチドに対す
る合理的に組み込まれた増進的改変を提供して、断片の折りたたみと親タンパク
質への再組み立てを改善する一方で再組み立て面での相互作用因子ドメインへの
依存性は維持することにより再構成タンパク質の機能活性を野生型レベルにまで
高めるようにする。
【００１１】
本発明の相互作用依存性酵素活性化システムを使用すれば、in vitroタンパク
質相互作用(細胞溶解物中のタンパク質相互作用など)または宿主細胞の細胞内ま
たは細胞外タンパク質の相互作用を検出することができる。細胞外タンパク質の
相互作用を評価するには、第1および第2オリゴペプチドをシグナルペプチドと共
に発現させることができる。たとえば細菌宿主細胞では、N末端シグナルペプチ
ドは融合オリゴペプチドのペリプラズムへの転位を導くことができる。結合後の
N末端断片とC末端断片は削除切断点の周辺残基と不連続であっても、隣接的であ
っても、また反復切断点の周辺残基と重複していてもよく、結果的に親タンパク
質の全長の90%〜110%を含むことになろう。切断点末端は本書ではN末端断片のC
末端およびC末端断片のN末端として定義される。
質相互作用(細胞溶解物中のタンパク質相互作用など)または宿主細胞の細胞内ま
たは細胞外タンパク質の相互作用を検出することができる。細胞外タンパク質の
相互作用を評価するには、第1および第2オリゴペプチドをシグナルペプチドと共
に発現させることができる。たとえば細菌宿主細胞では、N末端シグナルペプチ
ドは融合オリゴペプチドのペリプラズムへの転位を導くことができる。結合後の
N末端断片とC末端断片は削除切断点の周辺残基と不連続であっても、隣接的であ
っても、また反復切断点の周辺残基と重複していてもよく、結果的に親タンパク
質の全長の90%〜110%を含むことになろう。切断点末端は本書ではN末端断片のC
末端およびC末端断片のN末端として定義される。
【００１２】
本発明は再組み立て後の親タンパク質の性能の増進を、次の改変を含む改変の
うち少なくとも1つを導入することによってもたらす。i)各断片の切断点末端と
フレキシブルポリペプチドリンカーの間のアミノ酸数3〜12のランダムコード化
ペプチド、ii)介在型フレキシブルリンカーをもつチオレドキシンN末端への融合
体として別個に発現するアミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチド、iii)断
片対要素間にジスルフィド結合が形成されうるよう、5アミノ酸位置または位置
内に、および各断片の切断点末端とフレキシブルポリペプチドリンカーの間に、
コード化されるシステイン残基、およびvi)機能的に再構成されたマーカータン
パク質の折りたたみ安定性を向上させるために、たとえば断片対要素をコードす
るヌクレオチド配列の、誤りがちの条件下でのPCR増幅によって導入される、断
片対要素内の1〜3個のコドン変更。
うち少なくとも1つを導入することによってもたらす。i)各断片の切断点末端と
フレキシブルポリペプチドリンカーの間のアミノ酸数3〜12のランダムコード化
ペプチド、ii)介在型フレキシブルリンカーをもつチオレドキシンN末端への融合
体として別個に発現するアミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチド、iii)断
片対要素間にジスルフィド結合が形成されうるよう、5アミノ酸位置または位置
内に、および各断片の切断点末端とフレキシブルポリペプチドリンカーの間に、
コード化されるシステイン残基、およびvi)機能的に再構成されたマーカータン
パク質の折りたたみ安定性を向上させるために、たとえば断片対要素をコードす
るヌクレオチド配列の、誤りがちの条件下でのPCR増幅によって導入される、断
片対要素内の1〜3個のコドン変更。
【００１３】
本発明はまた、断片ドメインと相互作用因子ドメインからなる融合オリゴペプ
チドを発現させるように構築した発現カセットを収めたプラスミドに関連する。
N末端およびC末端断片対要素用の発現カセットはその構成要素と共に異なる順序
で切断する。C末端断片対要素用の発現カセットは作動可能に連結された構成要
素として、転写方向に、(i)宿主細胞内で機能するプロモーター、(ii)ポリペプ
チド相互作用因子ドメイン、(iii)フレキシブルポリペプチドリンカーおよび(iv
)直接選択可能な表現型をもたらすマーカータンパク質のC末端断片、をそれぞれ
コードするヌクレオチド配列を含むことになろう。N末端断片対要素用の発現カ
セットは作動可能に連結された構成要素として、転写方向に、(i) 宿主細胞内で
機能するプロモーター、(ii)ポリペプチド相互作用因子ドメイン、(iii)フレキ
シブルポリペプチドリンカーおよび(iv)直接選択可能な表現型をもたらすマーカ
ータンパク質のN末端断片、をそれぞれコードするヌクレオチド配列を含むこと
になろう。本発明はまた、前述の発現カセットの配列をもつプラスミド入れた宿
主細胞に関連する。
チドを発現させるように構築した発現カセットを収めたプラスミドに関連する。
N末端およびC末端断片対要素用の発現カセットはその構成要素と共に異なる順序
で切断する。C末端断片対要素用の発現カセットは作動可能に連結された構成要
素として、転写方向に、(i)宿主細胞内で機能するプロモーター、(ii)ポリペプ
チド相互作用因子ドメイン、(iii)フレキシブルポリペプチドリンカーおよび(iv
)直接選択可能な表現型をもたらすマーカータンパク質のC末端断片、をそれぞれ
コードするヌクレオチド配列を含むことになろう。N末端断片対要素用の発現カ
セットは作動可能に連結された構成要素として、転写方向に、(i) 宿主細胞内で
機能するプロモーター、(ii)ポリペプチド相互作用因子ドメイン、(iii)フレキ
シブルポリペプチドリンカーおよび(iv)直接選択可能な表現型をもたらすマーカ
ータンパク質のN末端断片、をそれぞれコードするヌクレオチド配列を含むこと
になろう。本発明はまた、前述の発現カセットの配列をもつプラスミド入れた宿
主細胞に関連する。
【００１４】
本発明の実施に適した宿主細胞には、真核細胞(哺乳類、酵母および植物細胞
など)と原核細胞(細菌細胞など)の両方が含まれる。本発明の融合オリゴペプチ
ドを発現させるには種々の原核生物発現系を使用することができる。転写調節用
のプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結因子を収めた発現ベクタ
ーの構築が可能である。この目的のために適したE.coliの調節領域の例は、Yano
fsky (1984) J. Bacteriol., 158:1018-1024が記述しているようなE. coliトリ
プトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域、それにHerskowi
tz and Hagen (1980) Ann. Rev. Genet., 14:399-445が記述しているようなファ
ージλ(Pλ)の左方プロモーターなどである。細菌宿主内での外来遺伝子の発現
に使用されるベクターは一般に、宿主細胞内で機能するプロモーターに対応する
配列を含むであろう。細菌の形質転換に有効なプラスミドはpBR322 (Bolivar et
al. (1977) Gene 2:95-113)、pUC (Messing (1983) Meth. Enzymol. 101:20-77
; Vieira and Messing (1982) Gene 19:259-268)、pCQV2 (Queen, ibid.)および
それらの派生体などである。プラスミドはウィルスと細菌の両要素を収めること
ができる。生物活性形態のタンパク質を回収する方法はU.S. Patent Nos. 4,966
,963および4,999,422に記載されており、これらの文献は参照指示により本書に
組み込まれる。他の原核生物発現系の詳細はSambrook et al.(In Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor)を参照。
など)と原核細胞(細菌細胞など)の両方が含まれる。本発明の融合オリゴペプチ
ドを発現させるには種々の原核生物発現系を使用することができる。転写調節用
のプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結因子を収めた発現ベクタ
ーの構築が可能である。この目的のために適したE.coliの調節領域の例は、Yano
fsky (1984) J. Bacteriol., 158:1018-1024が記述しているようなE. coliトリ
プトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域、それにHerskowi
tz and Hagen (1980) Ann. Rev. Genet., 14:399-445が記述しているようなファ
ージλ(Pλ)の左方プロモーターなどである。細菌宿主内での外来遺伝子の発現
に使用されるベクターは一般に、宿主細胞内で機能するプロモーターに対応する
配列を含むであろう。細菌の形質転換に有効なプラスミドはpBR322 (Bolivar et
al. (1977) Gene 2:95-113)、pUC (Messing (1983) Meth. Enzymol. 101:20-77
; Vieira and Messing (1982) Gene 19:259-268)、pCQV2 (Queen, ibid.)および
それらの派生体などである。プラスミドはウィルスと細菌の両要素を収めること
ができる。生物活性形態のタンパク質を回収する方法はU.S. Patent Nos. 4,966
,963および4,999,422に記載されており、これらの文献は参照指示により本書に
組み込まれる。他の原核生物発現系の詳細はSambrook et al.(In Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor)を参照。
【００１５】
真核生物での発現の場合には、本発明の実施に使用される宿主細胞は哺乳類、
鳥類、植物、昆虫および菌類などの細胞である。たとえば植物の場合、プロモー
ターの選択は一つには、構成的発現または誘導的発現のどちらが望ましいか、ま
た植物発育の特定段階および／または特定組織での発現が望ましいかどうかに左
右される。発現は特定の調節配列、たとえばUSPN 5,463,174; 4,943,674; 5,106
,739; 5,175,095; 5,420,034; 5,188,958および5,589,379に記載されている調節
配列を用いて、宿主植物内の特定の場所、たとえば種子、葉、果実、花および根
などを標的にすることができる。
鳥類、植物、昆虫および菌類などの細胞である。たとえば植物の場合、プロモー
ターの選択は一つには、構成的発現または誘導的発現のどちらが望ましいか、ま
た植物発育の特定段階および／または特定組織での発現が望ましいかどうかに左
右される。発現は特定の調節配列、たとえばUSPN 5,463,174; 4,943,674; 5,106
,739; 5,175,095; 5,420,034; 5,188,958および5,589,379に記載されている調節
配列を用いて、宿主植物内の特定の場所、たとえば種子、葉、果実、花および根
などを標的にすることができる。
【００１６】
宿主細胞が酵母細胞である場合には、酵母細胞内で機能しうるような、特に宿
主種由来の転写および翻訳領域が準備される。転写開始調節領域は、たとえばア
ルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GDP)、ホスホグ
ルコイソメラーゼなどのような解糖経路内の遺伝子または酸ホスファターゼ、ラ
クターゼ、メタルチオネイン、グルコアミラーゼなどのような調節可能遺伝子か
ら得られる。多数の調節配列のうち任意のものを特定の状況化で、構成的発現と
誘導的発現のいずれが望ましいか、関心の的になる読み取り枠との関連で見た特
定のプロモーター効率、強いプロモーターを誘導転写を許容する別のプロモータ
ーに由来する制御領域と結合させる能力、構築のしやすさなどに応じて使用する
ことができる。特に重要なのはガラクトースの存在下で活性化されるプロモータ
ーである。ガラクトース誘導プロモーター(GAL1、GAL7およびGAL10)は酵母中で
の高レベルのタンパク質の調節発現に広く利用されてきた(Lue et al. (1987) M
ol. Cell. Biol. 7:3446; Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51: 458)。
主種由来の転写および翻訳領域が準備される。転写開始調節領域は、たとえばア
ルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GDP)、ホスホグ
ルコイソメラーゼなどのような解糖経路内の遺伝子または酸ホスファターゼ、ラ
クターゼ、メタルチオネイン、グルコアミラーゼなどのような調節可能遺伝子か
ら得られる。多数の調節配列のうち任意のものを特定の状況化で、構成的発現と
誘導的発現のいずれが望ましいか、関心の的になる読み取り枠との関連で見た特
定のプロモーター効率、強いプロモーターを誘導転写を許容する別のプロモータ
ーに由来する制御領域と結合させる能力、構築のしやすさなどに応じて使用する
ことができる。特に重要なのはガラクトースの存在下で活性化されるプロモータ
ーである。ガラクトース誘導プロモーター(GAL1、GAL7およびGAL10)は酵母中で
の高レベルのタンパク質の調節発現に広く利用されてきた(Lue et al. (1987) M
ol. Cell. Biol. 7:3446; Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51: 458)。
【００１７】
本発明はまた、断片対ライブラリーの獲得を目的に溶媒暴露ループ内または三
次または二次構造解析によって定義されるフレキシブルループ内に切断点末端を
もつきわめて多数の断片対要素を作製することにより、目的マーカータンパク質
の機能的断片対を検出する効率的な方法を提供する。断片対要素をきわめて多数
の宿主細胞内で発現させ、マーカータンパク質に付随する直接検出可能シグナル
を示す宿主細胞を、マーカータンパク質を機能的に再構成する断片対要素を含む
ものとして単離する。次いで、断片対要素をコードする発現カセットを収めたプ
ラスミドを配列解析にかけて機能的断片対を検出する。マーカータンパク質の機
能的断片対の検出を容易にするには、断片対要素を、ロイシンジッパー相互作用
を通じて会合するfosおよびjun転写因子などのような互いに結合し合うことがわ
かっている相互作用因子ドメインをもつ融合タンパク質として発現させることが
できる。この目的のためには、fosおよびjun転写因子の異種二量体化ヘリックス
をコードする配列が有効な相互作用因子ドメインとして十分に使用できる。
次または二次構造解析によって定義されるフレキシブルループ内に切断点末端を
もつきわめて多数の断片対要素を作製することにより、目的マーカータンパク質
の機能的断片対を検出する効率的な方法を提供する。断片対要素をきわめて多数
の宿主細胞内で発現させ、マーカータンパク質に付随する直接検出可能シグナル
を示す宿主細胞を、マーカータンパク質を機能的に再構成する断片対要素を含む
ものとして単離する。次いで、断片対要素をコードする発現カセットを収めたプ
ラスミドを配列解析にかけて機能的断片対を検出する。マーカータンパク質の機
能的断片対の検出を容易にするには、断片対要素を、ロイシンジッパー相互作用
を通じて会合するfosおよびjun転写因子などのような互いに結合し合うことがわ
かっている相互作用因子ドメインをもつ融合タンパク質として発現させることが
できる。この目的のためには、fosおよびjun転写因子の異種二量体化ヘリックス
をコードする配列が有効な相互作用因子ドメインとして十分に使用できる。
【００１８】
本発明のシステムおよび方法は特に、免疫グロブリン分子によって認識される
エピトープ、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインに結合するポリペプチド配列、
リン酸化調節シグナル伝達タンパク質の阻害物質、および2つの異なるプロテオ
ームのオリゴペプチド間の相互作用の検出に使用できる。エピトープの検出では
断片ドメインと相互作用因子ドメインからなる第1および第2融合オリゴペプチド
を宿主細胞内で発現させるが、その場合、第1融合オリゴペプチドの相互作用因
子ドメインはチオレドキシンタンパク質の活性部位に挿入されたランダムコード
化ペプチドから成り、また第2融合オリゴペプチドの相互作用因子ドメインは一
本鎖可変領域(scFv)または抗体L鎖可変領域(VL)から成る。膜貫通タンパク質の
細胞外ドメインと相互作用するポリペプチド配列の検出でも同様の戦略が用いら
れるが、その場合、第1相互作用因子ドメインはチオレドキシンタンパク質の活
性部位に挿入されたランダムコード化ペプチドから成り、また第2融合オリゴペ
プチドの相互作用因子ドメインは膜貫通タンパク質から成る。リン酸化調節シグ
ナル伝達タンパク質の阻害物質の特定は、Her-2/neuなどのようなリン酸化調節
シグナル伝達タンパク質から成る第1相互作用因子ドメインをもつ第1融合オリゴ
ペプチド、および非リン酸化シグナル伝達タンパク質とだけ結合するscFvまたは
LVから成る第2相互作用因子ドメインをもつ第2融合オリゴペプチドの発現を必要
とする。阻害化合物はβラクタマーゼ色原基質の存在下で色を変える宿主細胞か
ら検出する。2つの異なるプロテオームの要素間のポリペプチド-ポリペプチド相
互作用の検出またはモニタリングでは、第1および第2細胞性発現ライブラリーの
要素はそれぞれ、融合オリゴペプチドの第1および第2相互作用因子ドメインを含
む。この発現ライブラリーは好ましくはcDNAライブラリーであるが、ランダム生
成ポリペプチドのスクリーニングを目的に合成ヌクレオチドから構築してもよい
。本発明向けの特定用途ライブラリーは目的プロテオームの全タンパク質要素を
示すのがよい。ヌクレオチド配列に由来するライブラリーでは、目的とする全タ
ンパク質集合(すなわちプロテオーム)の全要素が原核または真核細胞などのよう
な宿主細胞から、またはウィルス宿主からも、単離されよう。腫瘍遺伝子をコー
ドするウィルス宿主は特に興味深い。哺乳類の腫瘍細胞、免疫細胞および内皮細
胞もまた本発明にとって特に興味深いプロテオームを提供する。
エピトープ、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインに結合するポリペプチド配列、
リン酸化調節シグナル伝達タンパク質の阻害物質、および2つの異なるプロテオ
ームのオリゴペプチド間の相互作用の検出に使用できる。エピトープの検出では
断片ドメインと相互作用因子ドメインからなる第1および第2融合オリゴペプチド
を宿主細胞内で発現させるが、その場合、第1融合オリゴペプチドの相互作用因
子ドメインはチオレドキシンタンパク質の活性部位に挿入されたランダムコード
化ペプチドから成り、また第2融合オリゴペプチドの相互作用因子ドメインは一
本鎖可変領域(scFv)または抗体L鎖可変領域(VL)から成る。膜貫通タンパク質の
細胞外ドメインと相互作用するポリペプチド配列の検出でも同様の戦略が用いら
れるが、その場合、第1相互作用因子ドメインはチオレドキシンタンパク質の活
性部位に挿入されたランダムコード化ペプチドから成り、また第2融合オリゴペ
プチドの相互作用因子ドメインは膜貫通タンパク質から成る。リン酸化調節シグ
ナル伝達タンパク質の阻害物質の特定は、Her-2/neuなどのようなリン酸化調節
シグナル伝達タンパク質から成る第1相互作用因子ドメインをもつ第1融合オリゴ
ペプチド、および非リン酸化シグナル伝達タンパク質とだけ結合するscFvまたは
LVから成る第2相互作用因子ドメインをもつ第2融合オリゴペプチドの発現を必要
とする。阻害化合物はβラクタマーゼ色原基質の存在下で色を変える宿主細胞か
ら検出する。2つの異なるプロテオームの要素間のポリペプチド-ポリペプチド相
互作用の検出またはモニタリングでは、第1および第2細胞性発現ライブラリーの
要素はそれぞれ、融合オリゴペプチドの第1および第2相互作用因子ドメインを含
む。この発現ライブラリーは好ましくはcDNAライブラリーであるが、ランダム生
成ポリペプチドのスクリーニングを目的に合成ヌクレオチドから構築してもよい
。本発明向けの特定用途ライブラリーは目的プロテオームの全タンパク質要素を
示すのがよい。ヌクレオチド配列に由来するライブラリーでは、目的とする全タ
ンパク質集合(すなわちプロテオーム)の全要素が原核または真核細胞などのよう
な宿主細胞から、またはウィルス宿主からも、単離されよう。腫瘍遺伝子をコー
ドするウィルス宿主は特に興味深い。哺乳類の腫瘍細胞、免疫細胞および内皮細
胞もまた本発明にとって特に興味深いプロテオームを提供する。
【００１９】
本発明はまた、宿主細胞への多重遺伝形質の導入の単一マーカーによる検出に
も応用できる。この場合、機能的に再組み立てされたマーカータンパク質の検出
可能な発現が個別形質をコードする多重遺伝子の宿主内同時発現のしるしとなる
。最後に、本発明は宿主内の標的器官の近傍において誘導プロドラッグを特異的
に活性化させるための方法に治療上の効用をもたらすが、その場合、マーカータ
ンパク質断片対の各要素は、標的タンパク質上の隣接(ただし非重複)エピトープ
を認識する個別免疫グロブリン分子との融合タンパク質として発現する。標的タ
ンパク質に対する両抗体の結合はマーカータンパク質の機能的再構成を可能にし
、再構成されたマーカータンパク質は後に投与されるプロドラッグを標的器官の
近傍でだけ活性化する。
も応用できる。この場合、機能的に再組み立てされたマーカータンパク質の検出
可能な発現が個別形質をコードする多重遺伝子の宿主内同時発現のしるしとなる
。最後に、本発明は宿主内の標的器官の近傍において誘導プロドラッグを特異的
に活性化させるための方法に治療上の効用をもたらすが、その場合、マーカータ
ンパク質断片対の各要素は、標的タンパク質上の隣接(ただし非重複)エピトープ
を認識する個別免疫グロブリン分子との融合タンパク質として発現する。標的タ
ンパク質に対する両抗体の結合はマーカータンパク質の機能的再構成を可能にし
、再構成されたマーカータンパク質は後に投与されるプロドラッグを標的器官の
近傍でだけ活性化する。
【００２０】
本発明の代表例は抗生物質耐性酵素のTEM-1βラクタマーゼであるが、抗生物
質耐性をもたらす他酵素、たとえばアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
類、特にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ、およびBackman and Boyer (Gene (1983) 26:197)が記述
しているテトラサイクリン耐性タンパク質などの断片対もまた本発明に包摂され
る。色の変化または蛍光放出などのような明確な表現型の変化を直接誘発するこ
とができる他のタンパク質もまた本発明に適用可能である。そうしたタンパク質
の例はβガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質(GFP)、または他の関連蛍
光タンパク質などである。
質耐性をもたらす他酵素、たとえばアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
類、特にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ、およびBackman and Boyer (Gene (1983) 26:197)が記述
しているテトラサイクリン耐性タンパク質などの断片対もまた本発明に包摂され
る。色の変化または蛍光放出などのような明確な表現型の変化を直接誘発するこ
とができる他のタンパク質もまた本発明に適用可能である。そうしたタンパク質
の例はβガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質(GFP)、または他の関連蛍
光タンパク質などである。
【００２１】
E. coliのTEM-1βラクタマーゼはプラスミドpBR322 (Sutcliffe, 1978, supra
)のアンピシリン耐性遺伝子の264アミノ酸産物であり、そのヌクレオチド配列お
よびコード化アミノ酸配列は図2に示すとおりである。TEM-1は同属クラスAβラ
クタマーゼ類、すなわちペニシリナーゼ類の典型的なメンバーである。その三次
元構造は図3に示すとおりである(Jelsch et al., Proteins Struct Funct (1993
) 16: 364ff)。クラスAβラクタマーゼは2ドメインから成る。1つのドメインα-
ωはN末端およびC末端配列から成り、ストランド5本の平板βシートに対してパ
ッケージされた逆平行2ヘリックスバンドルを形成する。シートの内面は他ドメ
イン(μ)、すなわち2本の延長ループと2つの小β構造を備えた7ヘリックスバン
ドルにパッケージされている。βシートの外側ストランドは触媒求核試薬Ser70
の反対の位置にある基質結合ポケットに隣接し、また基質結合残基に寄与してい
る。活性部位残基の残りはSer70を含めて、μドメインの寄与を受けている。こ
れら2ドメインは2本のループ、すなわちR61-R65とD214-W229で結合されている。
)のアンピシリン耐性遺伝子の264アミノ酸産物であり、そのヌクレオチド配列お
よびコード化アミノ酸配列は図2に示すとおりである。TEM-1は同属クラスAβラ
クタマーゼ類、すなわちペニシリナーゼ類の典型的なメンバーである。その三次
元構造は図3に示すとおりである(Jelsch et al., Proteins Struct Funct (1993
) 16: 364ff)。クラスAβラクタマーゼは2ドメインから成る。1つのドメインα-
ωはN末端およびC末端配列から成り、ストランド5本の平板βシートに対してパ
ッケージされた逆平行2ヘリックスバンドルを形成する。シートの内面は他ドメ
イン(μ)、すなわち2本の延長ループと2つの小β構造を備えた7ヘリックスバン
ドルにパッケージされている。βシートの外側ストランドは触媒求核試薬Ser70
の反対の位置にある基質結合ポケットに隣接し、また基質結合残基に寄与してい
る。活性部位残基の残りはSer70を含めて、μドメインの寄与を受けている。こ
れら2ドメインは2本のループ、すなわちR61-R65とD214-W229で結合されている。
【００２２】
本発明はまた、直接検出可能シグナルをもたらす親タンパク質中の最適切断点
を検出する方法を提供する。両断片の切断点末端がAP-1転写因子のc-fosおよびc
-junサブユニットに由来する異種二量体化ヘリックスへと遺伝子的に融合された
ときに限って相補して活性を示すことができる断片対を検出するために、TEM-1
βラクタマーゼの「断片スペース」の調査が行われた(Karin et al., Curr Opin
Cell Biol (1997) 9: 240)。調査のために、この酵素の可能なN末端およびC末
端断片を網羅する一連のライブラリーが、完全コード化配列の両末端からの漸進
的ヌクレオチド鎖分解性消化によって生成された。アミノ酸数25未満の断片は有
望でないと考えられた。これらのライブラリーを相性の良いベクターで構築した
ときは、断片配列を同じE. coli細胞内で同時発現させて、各細胞がN末端および
C末端断片の単一対を発現し、可能な対がことごとく代表されるようにした。た
とえば100 kDa酵素では可能なN末端およびC末端断片対は106に限られるため、大
部分の酵素の断片スペースについて取り扱いやすい大きさのライブラリーで包括
的な調査を行うことができよう。この方法により、E. coli TEM-1βラクタマー
ゼの2つのαヘリックスの間に(ヘリックス7と8の間のおよそThr195〜Ala202の)
露出ループが検出されたが、そこでは鎖を切断することにより、fosおよびjunヘ
リックスと融合した場合に限り相補して活性を示すことができる断片を作り出せ
る。Glu197とLeu198に隣接切断点末端をもつ代表的な断片はα197(N末端断片)お
よびω198(C末端断片)と命名され、後に、切断点末端に融合された多様な異種ド
メイン[たとえば一本鎖抗体Fv断片(scFv)、抗体L鎖(LC)、活性部位に12量体ペプ
チドを挿入したチオレドキシン、およびB細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメイン(
CD40ED)など]間の相互作用に伴いE. coliペリプラズム中で選択可能活性を生み
出すことが証明された。α197とω198の相補による活性化はまた、受容体などの
ような第3のポリペプチドをもつ異種ドメインの相互作用に依存させることもで
きる。目的E. coli TEM-1βラクタマーゼの隣接切断点末端にはE197/L198に加え
て、アミノ酸残基N52/S53、E63/E64、Q99/N100、P174/N175、K215/V216、A227/G
228およびG253/K254の間のアミド結合による結合部などもある。結合後の断片対
は不連続や重複があってもよいが、親タンパク質の全長の90%〜110%を含むもの
とし、また実際の切断点は検出された機能的隣接切断点結合部からいずれの方向
にも10アミノ酸残基以内とすることができよう。再構成された酵素の特異的活性
は、天然ポリペプチド骨格の完全な状態を回復することになる切断点末端での相
互作用依存性ジスルフィド形成によって野生型に近いレベルまで高めることがで
きる。
を検出する方法を提供する。両断片の切断点末端がAP-1転写因子のc-fosおよびc
-junサブユニットに由来する異種二量体化ヘリックスへと遺伝子的に融合された
ときに限って相補して活性を示すことができる断片対を検出するために、TEM-1
βラクタマーゼの「断片スペース」の調査が行われた(Karin et al., Curr Opin
Cell Biol (1997) 9: 240)。調査のために、この酵素の可能なN末端およびC末
端断片を網羅する一連のライブラリーが、完全コード化配列の両末端からの漸進
的ヌクレオチド鎖分解性消化によって生成された。アミノ酸数25未満の断片は有
望でないと考えられた。これらのライブラリーを相性の良いベクターで構築した
ときは、断片配列を同じE. coli細胞内で同時発現させて、各細胞がN末端および
C末端断片の単一対を発現し、可能な対がことごとく代表されるようにした。た
とえば100 kDa酵素では可能なN末端およびC末端断片対は106に限られるため、大
部分の酵素の断片スペースについて取り扱いやすい大きさのライブラリーで包括
的な調査を行うことができよう。この方法により、E. coli TEM-1βラクタマー
ゼの2つのαヘリックスの間に(ヘリックス7と8の間のおよそThr195〜Ala202の)
露出ループが検出されたが、そこでは鎖を切断することにより、fosおよびjunヘ
リックスと融合した場合に限り相補して活性を示すことができる断片を作り出せ
る。Glu197とLeu198に隣接切断点末端をもつ代表的な断片はα197(N末端断片)お
よびω198(C末端断片)と命名され、後に、切断点末端に融合された多様な異種ド
メイン[たとえば一本鎖抗体Fv断片(scFv)、抗体L鎖(LC)、活性部位に12量体ペプ
チドを挿入したチオレドキシン、およびB細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメイン(
CD40ED)など]間の相互作用に伴いE. coliペリプラズム中で選択可能活性を生み
出すことが証明された。α197とω198の相補による活性化はまた、受容体などの
ような第3のポリペプチドをもつ異種ドメインの相互作用に依存させることもで
きる。目的E. coli TEM-1βラクタマーゼの隣接切断点末端にはE197/L198に加え
て、アミノ酸残基N52/S53、E63/E64、Q99/N100、P174/N175、K215/V216、A227/G
228およびG253/K254の間のアミド結合による結合部などもある。結合後の断片対
は不連続や重複があってもよいが、親タンパク質の全長の90%〜110%を含むもの
とし、また実際の切断点は検出された機能的隣接切断点結合部からいずれの方向
にも10アミノ酸残基以内とすることができよう。再構成された酵素の特異的活性
は、天然ポリペプチド骨格の完全な状態を回復することになる切断点末端での相
互作用依存性ジスルフィド形成によって野生型に近いレベルまで高めることがで
きる。
【００２３】
βラクタマーゼα197およびω198断片は細菌ペリプラズム内で選択活性を協調
的に生み出す。それは両断片の切断点末端に融合した異種ドメイン間の特異的相
互作用に厳密に依存するという形をとるが、細胞膜を通過して細胞外区画内へと
分泌転位を起こし、したがって細胞外タンパク質間の相互作用を正確に検出する
ことができる酵素系分子相互作用センサーの例に見られるものである。
的に生み出す。それは両断片の切断点末端に融合した異種ドメイン間の特異的相
互作用に厳密に依存するという形をとるが、細胞膜を通過して細胞外区画内へと
分泌転位を起こし、したがって細胞外タンパク質間の相互作用を正確に検出する
ことができる酵素系分子相互作用センサーの例に見られるものである。
【００２４】
本発明の相互作用依存性酵素会合システムは、人間の疾病治療、診断および予
知分野の様々な用途や製剤標的および製剤の発見・検証のためのハイスループッ
トスクリーニングシステムに使用できる。
知分野の様々な用途や製剤標的および製剤の発見・検証のためのハイスループッ
トスクリーニングシステムに使用できる。
【００２５】
一特定用途は不活性または低活性化合物の局部的な、制御された活性化に関連
する。たとえば薬剤、発色団、蛍光団などのような多数の有用化合物は、ヒドロ
キシル基またはアミノ基などのような化合物上の必須成分をエステル、アミド、
カルバミン酸塩、リン酸塩、グリコシドまたはグルクロニドなどのような酵素加
水分解基質と接合させることによって不活性化することができる(Jungheim and
Shepherd, Chem Rev (1994) 94:1553)。この種の接合体は次いでエステラーゼ、
カルボキシペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、グリコシダーゼ、グルクロ
ニダーゼ、βラクタマーゼおよびペニシリンアミダーゼなどのような適当な加水
分解酵素によって活性化することができる。特に用途が広い一システムでは、セ
ファロスポリン類を3’位置で多種多様な離脱基を介してニトロジェンマスター
ド、メトトレキサート、アントラサイクリンおよびビンカアルカロイドなどのよ
うな様々な抗がん剤と接合させてもよい(Svensson et al., J Med Chem (1998)
41:1507; Vrudhula et al., J Med Chem (1995) 38:1380; Jungheim and Shephe
rd,1994, supra; Alexander et al., Tetrahedron Lett (1991) 32:3269; 図5も
参照)。これらはみな広域βラクタマーゼ類の優れた基質であり、また大部分が
その親ドラッグよりもずっと低活性である。したがって、これらのプロドラッグ
は抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT; Bagshawe, Drug Devel Res（1995）34
:220)への使用が見込まれる有力候補である。これらの化合物に加えて、広範囲
の抗生物質(Holbrook and Lowy, Cancer Invest (1998) 16:405)や多様な色原基
質、蛍光原基質もβラクタマーゼ用に開発され (Jones et al., J Clin Microbi
ol (1982) 15:677; Jones et al., J Clin Microbiol (1982) 15: 954; Zlokarn
ik et al., Science (1998) 279:84)、最も用途の広い既知酵素群に加えられる
に至っている。
する。たとえば薬剤、発色団、蛍光団などのような多数の有用化合物は、ヒドロ
キシル基またはアミノ基などのような化合物上の必須成分をエステル、アミド、
カルバミン酸塩、リン酸塩、グリコシドまたはグルクロニドなどのような酵素加
水分解基質と接合させることによって不活性化することができる(Jungheim and
Shepherd, Chem Rev (1994) 94:1553)。この種の接合体は次いでエステラーゼ、
カルボキシペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、グリコシダーゼ、グルクロ
ニダーゼ、βラクタマーゼおよびペニシリンアミダーゼなどのような適当な加水
分解酵素によって活性化することができる。特に用途が広い一システムでは、セ
ファロスポリン類を3’位置で多種多様な離脱基を介してニトロジェンマスター
ド、メトトレキサート、アントラサイクリンおよびビンカアルカロイドなどのよ
うな様々な抗がん剤と接合させてもよい(Svensson et al., J Med Chem (1998)
41:1507; Vrudhula et al., J Med Chem (1995) 38:1380; Jungheim and Shephe
rd,1994, supra; Alexander et al., Tetrahedron Lett (1991) 32:3269; 図5も
参照)。これらはみな広域βラクタマーゼ類の優れた基質であり、また大部分が
その親ドラッグよりもずっと低活性である。したがって、これらのプロドラッグ
は抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT; Bagshawe, Drug Devel Res（1995）34
:220)への使用が見込まれる有力候補である。これらの化合物に加えて、広範囲
の抗生物質(Holbrook and Lowy, Cancer Invest (1998) 16:405)や多様な色原基
質、蛍光原基質もβラクタマーゼ用に開発され (Jones et al., J Clin Microbi
ol (1982) 15:677; Jones et al., J Clin Microbiol (1982) 15: 954; Zlokarn
ik et al., Science (1998) 279:84)、最も用途の広い既知酵素群に加えられる
に至っている。
【００２６】
それにもかかわらず、この種の酵素はその触媒活性を選り抜きのリガンドとの
アロステリック相互作用によって積極的に調節しうるように加工できるとすれば
、効用が飛躍的に増すであろう。そうなると、これらの酵素の触媒作用は様々な
新用途に利用できるようになろう。たとえば、(1)生物試料または食品中の微量
分析物および病原体の迅速な超高感度検出、(2)人体の特定部位に的を絞った診
断治療試薬の活性化、(3)自律折りたたみドメイン(AFD)用の発現配列ライブラリ
ーの迅速な充実、(4)細胞、組織および病原体のプロテオーム内および間の、対
単位のタンパク質-タンパク質相互作用の大規模パラレルマッピング、(5) 全プ
ロテオームに対応する抗体断片または他の結合タンパク質の迅速な選択、(6)抗
細胞および抗組織抗体に対応する抗原の迅速な検出、(7)抗体に対応するエピト
ープの迅速な検出、(8)任意のタンパク質-タンパク質相互作用の阻害物質のハイ
スループットスクリーニングなどである。
アロステリック相互作用によって積極的に調節しうるように加工できるとすれば
、効用が飛躍的に増すであろう。そうなると、これらの酵素の触媒作用は様々な
新用途に利用できるようになろう。たとえば、(1)生物試料または食品中の微量
分析物および病原体の迅速な超高感度検出、(2)人体の特定部位に的を絞った診
断治療試薬の活性化、(3)自律折りたたみドメイン(AFD)用の発現配列ライブラリ
ーの迅速な充実、(4)細胞、組織および病原体のプロテオーム内および間の、対
単位のタンパク質-タンパク質相互作用の大規模パラレルマッピング、(5) 全プ
ロテオームに対応する抗体断片または他の結合タンパク質の迅速な選択、(6)抗
細胞および抗組織抗体に対応する抗原の迅速な検出、(7)抗体に対応するエピト
ープの迅速な検出、(8)任意のタンパク質-タンパク質相互作用の阻害物質のハイ
スループットスクリーニングなどである。
【００２７】
たとえば、色原基質を加水分解するために、標的分析物との結合時に限って活
性化させることができる酵素は、これらの分析物に関する比類ない感度と便利さ
を備えた検定法の土台となりうる。その種の検定法は均質的であり、2成分すな
わち酵素と基質を生物試料と混合する以外の操作をまったく必要とせず、分析物
の存在は急速な発色によって定性的に示されることになろう。現行の均質的酵素
検定法は、酵素表面に固定化された分析物またはその類似物に対する抗分析物抗
体の結合による酵素の阻害に依存する(Coty et al., J Clin Immunoassay (1994
) 17:144; Legendre et al., Nature Biotech (1999) 17:67)。遊離分析物の拮
抗的抗体排除能、したがって酵素活性可能が評価される。この種の酵素はそれゆ
え、アロステリックにではなく拮抗的に活性化される。この種の酵素を用いる検
定法では最大シグナル増分はほぼKdの試薬濃度との平衡点で見られるため、一般
に分析物分子のほんの一部分がシグナル生成に参与するだけであり、また平衡に
時間がかかるし平衡が完了しない場合さえある。しかし、分析物との直接的なア
ロステリック相互作用により活性化される酵素は過剰量を使用することができる
ため、平衡は迅速であり分析物濃度にも依存しないし、また分析物を飽和させて
すべての分子からシグナルを生成させることもできる。細菌性またはウィルス性
病原体の場合には、固有の表面マーカーが細胞または粒子当たり数百ないし数千
の単位で存在するであろうが、マーカーとの結合によって活性化されることにな
るこの種の酵素では単一細胞または粒子でさえも迅速に検出しうるようになるの
に対して、そうした分析物を対象とする平衡検定法の感度は一般にずっと低いで
あろう。
性化させることができる酵素は、これらの分析物に関する比類ない感度と便利さ
を備えた検定法の土台となりうる。その種の検定法は均質的であり、2成分すな
わち酵素と基質を生物試料と混合する以外の操作をまったく必要とせず、分析物
の存在は急速な発色によって定性的に示されることになろう。現行の均質的酵素
検定法は、酵素表面に固定化された分析物またはその類似物に対する抗分析物抗
体の結合による酵素の阻害に依存する(Coty et al., J Clin Immunoassay (1994
) 17:144; Legendre et al., Nature Biotech (1999) 17:67)。遊離分析物の拮
抗的抗体排除能、したがって酵素活性可能が評価される。この種の酵素はそれゆ
え、アロステリックにではなく拮抗的に活性化される。この種の酵素を用いる検
定法では最大シグナル増分はほぼKdの試薬濃度との平衡点で見られるため、一般
に分析物分子のほんの一部分がシグナル生成に参与するだけであり、また平衡に
時間がかかるし平衡が完了しない場合さえある。しかし、分析物との直接的なア
ロステリック相互作用により活性化される酵素は過剰量を使用することができる
ため、平衡は迅速であり分析物濃度にも依存しないし、また分析物を飽和させて
すべての分子からシグナルを生成させることもできる。細菌性またはウィルス性
病原体の場合には、固有の表面マーカーが細胞または粒子当たり数百ないし数千
の単位で存在するであろうが、マーカーとの結合によって活性化されることにな
るこの種の酵素では単一細胞または粒子でさえも迅速に検出しうるようになるの
に対して、そうした分析物を対象とする平衡検定法の感度は一般にずっと低いで
あろう。
【００２８】
別種の用途では、相互作用活性化酵素を特異的細胞表面分子への結合によって
活性化されるよう改作することができよう。これによって、酵素は体内の特定部
位で局在化、活性化され、治療用または造影用試薬の標的指定活性化が実現され
ることになろう。抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT; Bagshawe, 1995, supr
a)はがん治療のための有望な化学療法戦略であり、そこではプロドラッグ活性化
酵素のβラクタマーゼなどがそれと化学的または遺伝子工学的に接合させた腫瘍
特異的抗体によって標的腫瘍に送り込まれる。未結合の接合体が循環系から排出
された後に、アントラサイクリンセファロスポリンなどのような不活性プロドラ
ッグが投与されるが、これは腫瘍部位で腫瘍に結合した残留酵素により腫瘍破壊
性細胞毒素へと転化される。ADEPTの最大の問題は、全身細胞傷害性をできるだ
け少なくするために、未結合の接合体が循環系から排出されてからプロドラッグ
を投与しなければならないという点にある。しかし、接合体が循環系から排出さ
れる頃には90%超の腫瘍結合酵素が失われてしまう(Bagshawe, 1995, supra; Spr
inger and Niculescu-Duvaz, Anti-Cancer Drug Design (1995) 10:361)。それ
にもかかわらず、ADEPTは他のいかなる方法よりも腫瘍中の活性薬物濃度を高く
することができたし(Contributions to Oncology, Huber H and Queisser V, ed
s. pp. 208ff (Karger, Basel)所収のSedlacek et al., 1992)、臨床場面で将来
性を示してきた(Bagshawe et al., Dis Markers (1991) 9:233; Springer and N
iculescu-Duvaz, 1995, supra; Martin et al., Cancer Chemother Pharmacol (
1997) 40:189)。未結合接合体の問題は腫瘍に結合した場合に限って活性化され
るようなプロドラッグ活性化酵素により完全に予防しうるであろうから、プロド
ラッグは酵素と同時に、またはピーク腫瘍負荷時点で不活性のままの酵素にかま
わず、投与することができるようになろう。
活性化されるよう改作することができよう。これによって、酵素は体内の特定部
位で局在化、活性化され、治療用または造影用試薬の標的指定活性化が実現され
ることになろう。抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT; Bagshawe, 1995, supr
a)はがん治療のための有望な化学療法戦略であり、そこではプロドラッグ活性化
酵素のβラクタマーゼなどがそれと化学的または遺伝子工学的に接合させた腫瘍
特異的抗体によって標的腫瘍に送り込まれる。未結合の接合体が循環系から排出
された後に、アントラサイクリンセファロスポリンなどのような不活性プロドラ
ッグが投与されるが、これは腫瘍部位で腫瘍に結合した残留酵素により腫瘍破壊
性細胞毒素へと転化される。ADEPTの最大の問題は、全身細胞傷害性をできるだ
け少なくするために、未結合の接合体が循環系から排出されてからプロドラッグ
を投与しなければならないという点にある。しかし、接合体が循環系から排出さ
れる頃には90%超の腫瘍結合酵素が失われてしまう(Bagshawe, 1995, supra; Spr
inger and Niculescu-Duvaz, Anti-Cancer Drug Design (1995) 10:361)。それ
にもかかわらず、ADEPTは他のいかなる方法よりも腫瘍中の活性薬物濃度を高く
することができたし(Contributions to Oncology, Huber H and Queisser V, ed
s. pp. 208ff (Karger, Basel)所収のSedlacek et al., 1992)、臨床場面で将来
性を示してきた(Bagshawe et al., Dis Markers (1991) 9:233; Springer and N
iculescu-Duvaz, 1995, supra; Martin et al., Cancer Chemother Pharmacol (
1997) 40:189)。未結合接合体の問題は腫瘍に結合した場合に限って活性化され
るようなプロドラッグ活性化酵素により完全に予防しうるであろうから、プロド
ラッグは酵素と同時に、またはピーク腫瘍負荷時点で不活性のままの酵素にかま
わず、投与することができるようになろう。
【００２９】
同様に、相互作用活性化酵素は炎症またはアテローム発生部位などのような他
タイプの病変組織の、さらには健全組織の、細胞上の表面マーカーによって活性
化の標的とすることもできる。次いでこの標的局在化・活性化酵素を用いて、細
胞毒素だけでなく、生物反応修飾物質の低分子アゴニストまたはアンタゴニスト
などのような他タイプの治療薬や目的の病変表現型等をもつ組織の精密定位のた
めの造影用試薬をも活性化することができる。たとえば、標的活性化型酵素は(1
)免疫促進剤を腫瘍に、(2)免疫抑制剤を慢性炎症部位または移植臓器に、(3)抗
生物質を特定病原体に、(4)細胞毒素や抗ウィルス薬をウィルス感染細胞に、(5)
ホルモンや他の多面作用剤を特定細胞／組織に、または(6)神経伝達物質や他の
神経修飾物質を特定の神経または組織に、それぞれ送り込むために使用すること
ができよう。要するに相互作用活性化酵素を使用すれば、適当な基質との接合に
よって不活性化させうる任意の低分子細胞毒素、ホルモン、ステロイド、プロス
タグランジン、神経伝達物質、またはペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカ
インなどアゴニスト／アンタゴニストなどを任意の組織に送達することができる
。
タイプの病変組織の、さらには健全組織の、細胞上の表面マーカーによって活性
化の標的とすることもできる。次いでこの標的局在化・活性化酵素を用いて、細
胞毒素だけでなく、生物反応修飾物質の低分子アゴニストまたはアンタゴニスト
などのような他タイプの治療薬や目的の病変表現型等をもつ組織の精密定位のた
めの造影用試薬をも活性化することができる。たとえば、標的活性化型酵素は(1
)免疫促進剤を腫瘍に、(2)免疫抑制剤を慢性炎症部位または移植臓器に、(3)抗
生物質を特定病原体に、(4)細胞毒素や抗ウィルス薬をウィルス感染細胞に、(5)
ホルモンや他の多面作用剤を特定細胞／組織に、または(6)神経伝達物質や他の
神経修飾物質を特定の神経または組織に、それぞれ送り込むために使用すること
ができよう。要するに相互作用活性化酵素を使用すれば、適当な基質との接合に
よって不活性化させうる任意の低分子細胞毒素、ホルモン、ステロイド、プロス
タグランジン、神経伝達物質、またはペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカ
インなどアゴニスト／アンタゴニストなどを任意の組織に送達することができる
。
【００３０】
さらに別種の用途では、相互作用活性化酵素を、発現配列ライブラリー、一本
鎖抗体断片(scFv)ライブラリー、および足場付きペプチドライブラリーを含めた
、細胞内タンパク質間のきわめて多数の相互作用の効率的な同時検出が行えるよ
う改作することができる。たとえば酵素系相互作用トラップは、新しい薬剤標的
の迅速な検出と検証を目的とした、ヒト細胞、組織および病原体のプロテオーム
内および間の、対単位のタンパク質-タンパク質相互作用の総合的なマッピング
を可能にしよう。これはまた、一本鎖抗体断片(scFv)ライブラリーからの、また
は足場付きペプチドライブラリーからの結合分子の迅速な選択を可能にし、そう
した結合分子を機能的ゲノミックス研究における試薬として、または天然リガン
ドおよびエピトープの相同性による検出のために、使用できるようにしよう。相
互作用依存性βラクタマーゼ類を使用して検出される標的相互作用はそのまま、
これらの酵素の大きな基質多様性を利用して極性を逆転させることにより相互作
用阻害物質のスクリーニングに使用することができよう。βラクタマーゼの相互
作用依存性活性化はβラクタム系抗生物質の存在下で宿主細胞に選択増殖性を付
与するために使用できるが、βラクタム前駆抗生物質の存在下で宿主細胞に選択
細胞傷害性を付与するためにも使用できる。後者の場合、基質は相互作用活性化
酵素によるβラクタム部分の加水分解があって初めて細胞傷害性を帯びるので、
選択増殖性を宿主細胞に付与するその能力によって相互作用阻害物質を選択する
のに役立てられる。
鎖抗体断片(scFv)ライブラリー、および足場付きペプチドライブラリーを含めた
、細胞内タンパク質間のきわめて多数の相互作用の効率的な同時検出が行えるよ
う改作することができる。たとえば酵素系相互作用トラップは、新しい薬剤標的
の迅速な検出と検証を目的とした、ヒト細胞、組織および病原体のプロテオーム
内および間の、対単位のタンパク質-タンパク質相互作用の総合的なマッピング
を可能にしよう。これはまた、一本鎖抗体断片(scFv)ライブラリーからの、また
は足場付きペプチドライブラリーからの結合分子の迅速な選択を可能にし、そう
した結合分子を機能的ゲノミックス研究における試薬として、または天然リガン
ドおよびエピトープの相同性による検出のために、使用できるようにしよう。相
互作用依存性βラクタマーゼ類を使用して検出される標的相互作用はそのまま、
これらの酵素の大きな基質多様性を利用して極性を逆転させることにより相互作
用阻害物質のスクリーニングに使用することができよう。βラクタマーゼの相互
作用依存性活性化はβラクタム系抗生物質の存在下で宿主細胞に選択増殖性を付
与するために使用できるが、βラクタム前駆抗生物質の存在下で宿主細胞に選択
細胞傷害性を付与するためにも使用できる。後者の場合、基質は相互作用活性化
酵素によるβラクタム部分の加水分解があって初めて細胞傷害性を帯びるので、
選択増殖性を宿主細胞に付与するその能力によって相互作用阻害物質を選択する
のに役立てられる。
【００３１】
最後に、酵素系相互作用センサーを使用してシグナル伝達経路における主要分
子相互作用の活性化または阻害を迅速に検出することもできるが、それはこれら
の経路の阻害物質または活性化物質のハイスループット細胞スクリーニングを可
能にする。たとえば、レセプターチロシンキナーゼのアゴニストまたはアンタゴ
ニストをスクリーニングするには通常、レセプター連結反応を、新規の遺伝子発
現に由来する選択可能表現型に結びつける必要がある。そうした複数ステップの
シグナル生成機構は酵母ツーハイブリッドシステムと同様に高頻度の偽陽性また
は偽陰性選択を招きやすく、したがってハイスループットスクリーニングにはあ
まり適さない。しかし、相互作用依存性βラクタマーゼ類をホスホチロシン感受
性相互作用によって活性化されるように用意して、受容体連結反応のすぐ下流で
選択可能表現型が生成されるようにすることができる。受容体チロシンキナーゼ
基質と結合ペプチドの間の相互作用はリン酸化に依存するかまたは阻害されるよ
うに設計して、受容体アゴニストかまたは受容体アンタゴニストが選択されるよ
うにすることができる。 高性能酵素断片相補システムを作製するための一般戦略 本発明は、触媒として堅牢な複合体の形成を可能にする安定した酵素断片を得
ることを目的とした異種相互作用因子、切断点ジスルフィド、ランダムトリペプ
チドライブラリーおよび突然変異誘発の一般的な使用戦略を提供する。任意の酵
素についてその種の断片対を検出することは、問題の酵素に関する可能な断片対
をことごとく調べるだけで可能なのではないかと示唆されたことがある(Osterme
ier et al., Proc Natl Acad Sci (1999) 96:3562)。しかし実際には、そうした
試みの成否は選択の厳密さに、すなわち効率的に選択可能な表現型を出現させる
には発現断片によってどれだけ多くの機能的酵素を産生させなければならないか
に、強く依存する。効率的に選択可能な表現型とは、バックグラウンド頻度また
は偽陽性率が断片ライブラリー中の所望断片の頻度よりもあまり高くないような
表現型である。
子相互作用の活性化または阻害を迅速に検出することもできるが、それはこれら
の経路の阻害物質または活性化物質のハイスループット細胞スクリーニングを可
能にする。たとえば、レセプターチロシンキナーゼのアゴニストまたはアンタゴ
ニストをスクリーニングするには通常、レセプター連結反応を、新規の遺伝子発
現に由来する選択可能表現型に結びつける必要がある。そうした複数ステップの
シグナル生成機構は酵母ツーハイブリッドシステムと同様に高頻度の偽陽性また
は偽陰性選択を招きやすく、したがってハイスループットスクリーニングにはあ
まり適さない。しかし、相互作用依存性βラクタマーゼ類をホスホチロシン感受
性相互作用によって活性化されるように用意して、受容体連結反応のすぐ下流で
選択可能表現型が生成されるようにすることができる。受容体チロシンキナーゼ
基質と結合ペプチドの間の相互作用はリン酸化に依存するかまたは阻害されるよ
うに設計して、受容体アゴニストかまたは受容体アンタゴニストが選択されるよ
うにすることができる。 高性能酵素断片相補システムを作製するための一般戦略 本発明は、触媒として堅牢な複合体の形成を可能にする安定した酵素断片を得
ることを目的とした異種相互作用因子、切断点ジスルフィド、ランダムトリペプ
チドライブラリーおよび突然変異誘発の一般的な使用戦略を提供する。任意の酵
素についてその種の断片対を検出することは、問題の酵素に関する可能な断片対
をことごとく調べるだけで可能なのではないかと示唆されたことがある(Osterme
ier et al., Proc Natl Acad Sci (1999) 96:3562)。しかし実際には、そうした
試みの成否は選択の厳密さに、すなわち効率的に選択可能な表現型を出現させる
には発現断片によってどれだけ多くの機能的酵素を産生させなければならないか
に、強く依存する。効率的に選択可能な表現型とは、バックグラウンド頻度また
は偽陽性率が断片ライブラリー中の所望断片の頻度よりもあまり高くないような
表現型である。
【００３２】
実際には、任意の酵素に対して最も有用な断片相補システムは、無支援型の相
補を最ももたらしやすい野生型配列の断片であるとは必ずしも限らず、むしろ最
も有用な断片相補システムは、前述のような遺伝子工学的手法を用いた場合に、
より個別的な性能要件を満たすように作製することができる断片を含む。たとえ
ば、天然型タンパク質は一般に断片安定性と複合体安定性の間にほぼ逆の相関関
係を示すものと見込まれる。これは相互転換のエネルギーコストのためである。
断片安定性が高ければ高いほど複合体の形成に要するエネルギーはますます多く
なるし、その逆もまた真である。その結果、最高の比活性を生み出しうる断片は
見逃されるか棄却されるというおそれがある。というのは、その種の断片は断片
不安定性のために選択可能なレベルの活性を生み出すのを妨げられかねないから
である。こうした落とし穴を回避するためには、断片対ライブラリーをランダム
トリペプチドライブラリーと同時に発現させて、すべての断片対が断片安定化ト
リペプチドの存在下で機能する機会を与えられるようにし、もって断片安定性に
対する表現型の依存を最小限に抑えるようにすることができる。この戦略は、断
片対に融合された異種ドメインの相互作用に対する活性化の依存が望ましい場合
には、特に有効である。構成的活性化が望ましい場合には、断片ライブラリーを
誤りがちのPCRで増幅して、断片不安定性と複合体不安定性の両方を緩和しうる
ことがβラクタマーゼの例で判明している折りたたみ加速突然変異の導入を図る
ことができる。
補を最ももたらしやすい野生型配列の断片であるとは必ずしも限らず、むしろ最
も有用な断片相補システムは、前述のような遺伝子工学的手法を用いた場合に、
より個別的な性能要件を満たすように作製することができる断片を含む。たとえ
ば、天然型タンパク質は一般に断片安定性と複合体安定性の間にほぼ逆の相関関
係を示すものと見込まれる。これは相互転換のエネルギーコストのためである。
断片安定性が高ければ高いほど複合体の形成に要するエネルギーはますます多く
なるし、その逆もまた真である。その結果、最高の比活性を生み出しうる断片は
見逃されるか棄却されるというおそれがある。というのは、その種の断片は断片
不安定性のために選択可能なレベルの活性を生み出すのを妨げられかねないから
である。こうした落とし穴を回避するためには、断片対ライブラリーをランダム
トリペプチドライブラリーと同時に発現させて、すべての断片対が断片安定化ト
リペプチドの存在下で機能する機会を与えられるようにし、もって断片安定性に
対する表現型の依存を最小限に抑えるようにすることができる。この戦略は、断
片対に融合された異種ドメインの相互作用に対する活性化の依存が望ましい場合
には、特に有効である。構成的活性化が望ましい場合には、断片ライブラリーを
誤りがちのPCRで増幅して、断片不安定性と複合体不安定性の両方を緩和しうる
ことがβラクタマーゼの例で判明している折りたたみ加速突然変異の導入を図る
ことができる。
【００３３】
均質検定法、バイオセンサーおよび標的活性化試薬などのようなin vitro用途
では断片安定性が特に重要であるが、断片安定性と複合体安定性の逆相関関係か
ら予測されるように、最も安定した断片でも安定した複合体を支援なしに生み出
せなければ選択不能かもしれない。そこで、切断点にジスルフィドを備え切断点
末端に異種相互作用因子を融合させた断片ライブラリーをE. coliペリプラズム
内に発現させることができよう。これらの手段は断片を結合させ、折りたたみを
加速し、また活性複合体を安定させるための機構を提供する。βラクタマーゼで
示したように、断片対の相当な部分はこの種の分子補欠によって細菌ペリプラズ
ム内に堅牢な選択可能活性を生み出すように製作することができる。
では断片安定性が特に重要であるが、断片安定性と複合体安定性の逆相関関係か
ら予測されるように、最も安定した断片でも安定した複合体を支援なしに生み出
せなければ選択不能かもしれない。そこで、切断点にジスルフィドを備え切断点
末端に異種相互作用因子を融合させた断片ライブラリーをE. coliペリプラズム
内に発現させることができよう。これらの手段は断片を結合させ、折りたたみを
加速し、また活性複合体を安定させるための機構を提供する。βラクタマーゼで
示したように、断片対の相当な部分はこの種の分子補欠によって細菌ペリプラズ
ム内に堅牢な選択可能活性を生み出すように製作することができる。
【００３４】
断片対の親タンパク質への機能的再構成を増進する手段として説明した以上の
4手段、すなわち異種相互作用因子、切断点ジスルフィド、安定化トリペプチド
および突然変異誘発はいずれも、単独でまた他は組み合わせて使用して、所望用
途に最適の断片が確実に選択されるように、また所望用途用として選択された断
片対の性能が改善され最適化されるようにすることができる。例示するように、
各手段は異なる機構で性能を増進するので、複数手段の効果は一般に相加的であ
る。異種相互作用因子は断片を引き合わせて活性複合体への再折りたたみを促す
。切断点ジスルフィドは切断点でポリペプチド骨格の完全な状態を復旧させるこ
とにより活性折りたたみを安定化することができる。係留または遊離トリペプチ
ドは断片の凝集を、活性複合体への折りたたみを妨害することなく防止する。突
然変異誘発は活性複合体への折りたたみを加速することによって断片を保護する
ことができる。
4手段、すなわち異種相互作用因子、切断点ジスルフィド、安定化トリペプチド
および突然変異誘発はいずれも、単独でまた他は組み合わせて使用して、所望用
途に最適の断片が確実に選択されるように、また所望用途用として選択された断
片対の性能が改善され最適化されるようにすることができる。例示するように、
各手段は異なる機構で性能を増進するので、複数手段の効果は一般に相加的であ
る。異種相互作用因子は断片を引き合わせて活性複合体への再折りたたみを促す
。切断点ジスルフィドは切断点でポリペプチド骨格の完全な状態を復旧させるこ
とにより活性折りたたみを安定化することができる。係留または遊離トリペプチ
ドは断片の凝集を、活性複合体への折りたたみを妨害することなく防止する。突
然変異誘発は活性複合体への折りたたみを加速することによって断片を保護する
ことができる。
【００３５】
高性能酵素断片相補システム開発の第1ステップは、断片対ライブラリーに各
断片を発現させるためのベクターの構築である。好都合な選択的断片ライブラリ
ー発現系を図6に示す発現系から誘導することができる。目的とする用途とは無
関係に、すべての断片対は、切断点末端に融合されたfosおよびjunヘリックスな
どのような相互作用因子によってもたらされる結合機能から潜在的に利益をうる
ことができるし、またそうした結合機能によって害されることはないであろう。
こうしてC末端、またはω断片ライブラリーはファスミドベクターpAO1中のlacプ
ロモーター(上流シストロンはもし望むなら除去できる)に由来するfosヘリック
ス(図6の相互作用因子2)に対する (Gly4Ser)3リンカーなどのようなフレキシブ
ルポリペプチドリンカーを介したN末端融合体として発現しよう。フレキシブル
ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列は重要ではないが、断片ドメインと異種相
互作用因子ドメインが独立に、支障なく折りたたまれるよう十分な長さとフレキ
シビリティーを備えていなければならない。N末端、またはα断片ライブラリー
は相性が良いpAE1ベクター中のtrcプロモーターに由来するjunヘリックス(図6の
Interactor 1)に対する(Gly4Ser)3リンカーなどのようなフレキシブルポリペプ
チドリンカーを介したC末端融合体として発現しよう。ペリプラズムへの転位が
望ましい場合には、シグナルペプチドのコード配列を含めることになろう。
断片を発現させるためのベクターの構築である。好都合な選択的断片ライブラリ
ー発現系を図6に示す発現系から誘導することができる。目的とする用途とは無
関係に、すべての断片対は、切断点末端に融合されたfosおよびjunヘリックスな
どのような相互作用因子によってもたらされる結合機能から潜在的に利益をうる
ことができるし、またそうした結合機能によって害されることはないであろう。
こうしてC末端、またはω断片ライブラリーはファスミドベクターpAO1中のlacプ
ロモーター(上流シストロンはもし望むなら除去できる)に由来するfosヘリック
ス(図6の相互作用因子2)に対する (Gly4Ser)3リンカーなどのようなフレキシブ
ルポリペプチドリンカーを介したN末端融合体として発現しよう。フレキシブル
ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列は重要ではないが、断片ドメインと異種相
互作用因子ドメインが独立に、支障なく折りたたまれるよう十分な長さとフレキ
シビリティーを備えていなければならない。N末端、またはα断片ライブラリー
は相性が良いpAE1ベクター中のtrcプロモーターに由来するjunヘリックス(図6の
Interactor 1)に対する(Gly4Ser)3リンカーなどのようなフレキシブルポリペプ
チドリンカーを介したC末端融合体として発現しよう。ペリプラズムへの転位が
望ましい場合には、シグナルペプチドのコード配列を含めることになろう。
【００３６】
前述のように、目的の用途がin vitroかin vivoかによって、またそれがin vi
voであれば細胞質内か被分泌かによって、目的の用途に合った最適の断片対が選
択される確率を極大化するために発現ベクターに1以上の性能増進手段を組み込
んでもよい。ペリプラズム発現が望ましい場合には、ジスルフィド形成を許容す
るために切断点末端にシステインをコード化するのがよい。酵素が他のシステイ
ンを含む場合には、混合ジスルフィドの形成を阻害するために、1 mM以上5 mM未
満の還元剤たとえばGSHまたはDTTを増殖培地に含めるのがよい。選択における特
異活性の比重を高める意味で断片安定化が望ましい場合には、切断点末端とフレ
キシブルポリペプチドリンカーの間に各断片融合体をはさんだランダムまたはVR
Kトリペプチドライブラリーを枠内にコード化してもよい。50断片対のライブラ
リーの各断片にVRKライブラリーを使用する場合にはトリペプチド-断片の可能な
すべての組み合わせが＜108の併合ライブラリーに収まろう。あるいは前述の要
領でトランス形の各断片対に単一トリペプチドライブラリーを使用することもで
きよう。トリペプチドライブラリーは枠内でフレキシブルポリペプチドリンカー
を介してチオレドキシンのN末端に作動可能に融合し、pAO1ファスミドベクター
の上流シストロンから発現させることになろう(図6参照)。
voであれば細胞質内か被分泌かによって、目的の用途に合った最適の断片対が選
択される確率を極大化するために発現ベクターに1以上の性能増進手段を組み込
んでもよい。ペリプラズム発現が望ましい場合には、ジスルフィド形成を許容す
るために切断点末端にシステインをコード化するのがよい。酵素が他のシステイ
ンを含む場合には、混合ジスルフィドの形成を阻害するために、1 mM以上5 mM未
満の還元剤たとえばGSHまたはDTTを増殖培地に含めるのがよい。選択における特
異活性の比重を高める意味で断片安定化が望ましい場合には、切断点末端とフレ
キシブルポリペプチドリンカーの間に各断片融合体をはさんだランダムまたはVR
Kトリペプチドライブラリーを枠内にコード化してもよい。50断片対のライブラ
リーの各断片にVRKライブラリーを使用する場合にはトリペプチド-断片の可能な
すべての組み合わせが＜108の併合ライブラリーに収まろう。あるいは前述の要
領でトランス形の各断片対に単一トリペプチドライブラリーを使用することもで
きよう。トリペプチドライブラリーは枠内でフレキシブルポリペプチドリンカー
を介してチオレドキシンのN末端に作動可能に融合し、pAO1ファスミドベクター
の上流シストロンから発現させることになろう(図6参照)。
【００３７】
高性能酵素断片相補システム開発の第2ステップは候補酵素断片対の発現ライ
ブラリーの構築である。ランダム断片対のライブラリーを生成する方法はすでに
記述されている(Ostermeier et al., 1999, supra)。しかし、大多数の断片対は
機能しないであろうから、そうしたライブラリーはきわめて非効率的である。断
片対ライブラリーの突然変異誘導またはランダムトリペプチドライブラリーとの
組み合わせスクリーニングでは、もっとずっと効率的な断片対ライブラリーが必
要であろう。様々な理由から、最も機能的な断片対は二次構造エレメント間の露
出領域におけるポリペプチド鎖の切断に対応すると想定されよう。係留異種相互
作用因子およびトリペプチドの使用には露出切断点が必要とされようし、また二
次構造エレメント内の切断はそうしたエレメントを不可逆的に不安定化する可能
性がある。目的酵素または同族体について三次元構造が得られる場合には、それ
を使用して露出ループを鎖切断の候補部位として識別することができる。代表的
な球状タンパク質では、両端から十分遠い、したがってより大きな断片が独立に
は活性を帯びないような位置にあるそうした部位は20〜25を超えないであろう。
これは、各断片対のコード配列をPCRで構築するには取り扱いやすい数である。
各切断点に対応する頭-頭プライマー対のほかに2つの末端特異的プライマーが必
要とされようが、それは露出ループのほぼ中央に位置するのがよい。三次元構造
が得られない場合は二次構造とヒドロパシーのコンピューター予測用の信頼性の
高いアルゴリズム、たとえばRost and Sander（J Mol Biol（1993）232：584；
Proteins (1994) 19:55; Proteins (1994) 20:216）がインターネットで入手で
きる。そうしたプログラムにより、大部分の露出ループを二次構造エレメント間
の親水性領域として識別することができる。この場合もまた、50断片対までなら
PCRでコード配列を調製するのはそれほどの負担にはならないであろう。
ブラリーの構築である。ランダム断片対のライブラリーを生成する方法はすでに
記述されている(Ostermeier et al., 1999, supra)。しかし、大多数の断片対は
機能しないであろうから、そうしたライブラリーはきわめて非効率的である。断
片対ライブラリーの突然変異誘導またはランダムトリペプチドライブラリーとの
組み合わせスクリーニングでは、もっとずっと効率的な断片対ライブラリーが必
要であろう。様々な理由から、最も機能的な断片対は二次構造エレメント間の露
出領域におけるポリペプチド鎖の切断に対応すると想定されよう。係留異種相互
作用因子およびトリペプチドの使用には露出切断点が必要とされようし、また二
次構造エレメント内の切断はそうしたエレメントを不可逆的に不安定化する可能
性がある。目的酵素または同族体について三次元構造が得られる場合には、それ
を使用して露出ループを鎖切断の候補部位として識別することができる。代表的
な球状タンパク質では、両端から十分遠い、したがってより大きな断片が独立に
は活性を帯びないような位置にあるそうした部位は20〜25を超えないであろう。
これは、各断片対のコード配列をPCRで構築するには取り扱いやすい数である。
各切断点に対応する頭-頭プライマー対のほかに2つの末端特異的プライマーが必
要とされようが、それは露出ループのほぼ中央に位置するのがよい。三次元構造
が得られない場合は二次構造とヒドロパシーのコンピューター予測用の信頼性の
高いアルゴリズム、たとえばRost and Sander（J Mol Biol（1993）232：584；
Proteins (1994) 19:55; Proteins (1994) 20:216）がインターネットで入手で
きる。そうしたプログラムにより、大部分の露出ループを二次構造エレメント間
の親水性領域として識別することができる。この場合もまた、50断片対までなら
PCRでコード配列を調製するのはそれほどの負担にはならないであろう。
【００３８】
断片相補が、切断点末端に融合された異種相互作用因子ドメインの直接的なま
たはリガンドを介した相互作用に依存する必要がない場合には、折りたたみ加速
突然変異もまた断片コード配列の最初の増幅に誤りがちなPCRを使用して選択す
ることができよう。突然変異誘発は、Mg++、Mn++およびヌクレオシド三リン酸の
濃度、それにサイクル数の適当な条件下で、分子当たり1〜3個の偏りのないコー
ド変化に限定することができる(PCR Primer - A Laboratory Manual, C. Dieffe
nbach and G. Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb
or, NY, pp. 583-590所収の Cadwell and Joyce, 1995)。ほとんどの突然変異は
非表現型変異なので、これは最適断片-トリペプチド組み合わせの選択適性を犠
牲にすることなく、他の性能増進手段と楽に組み合わせることができる。断片コ
ード配列の増幅、ゲル精製、およびベクターへの連結がすんだら、連結反応生成
物を脱塩、濃縮して、高電圧エレクトロポレーションによるE. coli細胞の効率
的な同時形質転換ができるようにする。トリペプチドライブラリーと突然変異誘
発の両方を使用する場合には、少なくとも108個の、また好ましくは少なくとも1
09個の形質転換細胞を集めてライブラリーの多様性が確実に丸ごと総合的に代表
されるようにする。次いでフルライブラリーを様々な非許容条件のそれぞれでプ
レートするが、最も低い厳密さ条件では宿主細胞をライブリーサイズの逆数の10
倍以下の効率でプレートする。これにより、偽陽性中の真陽性の頻度が確実に扱
いやすいものとなろう。最高の選択の厳密さ条件は、それを超えるとライブラリ
ーから何も回収されないような条件であろう。
たはリガンドを介した相互作用に依存する必要がない場合には、折りたたみ加速
突然変異もまた断片コード配列の最初の増幅に誤りがちなPCRを使用して選択す
ることができよう。突然変異誘発は、Mg++、Mn++およびヌクレオシド三リン酸の
濃度、それにサイクル数の適当な条件下で、分子当たり1〜3個の偏りのないコー
ド変化に限定することができる(PCR Primer - A Laboratory Manual, C. Dieffe
nbach and G. Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb
or, NY, pp. 583-590所収の Cadwell and Joyce, 1995)。ほとんどの突然変異は
非表現型変異なので、これは最適断片-トリペプチド組み合わせの選択適性を犠
牲にすることなく、他の性能増進手段と楽に組み合わせることができる。断片コ
ード配列の増幅、ゲル精製、およびベクターへの連結がすんだら、連結反応生成
物を脱塩、濃縮して、高電圧エレクトロポレーションによるE. coli細胞の効率
的な同時形質転換ができるようにする。トリペプチドライブラリーと突然変異誘
発の両方を使用する場合には、少なくとも108個の、また好ましくは少なくとも1
09個の形質転換細胞を集めてライブラリーの多様性が確実に丸ごと総合的に代表
されるようにする。次いでフルライブラリーを様々な非許容条件のそれぞれでプ
レートするが、最も低い厳密さ条件では宿主細胞をライブリーサイズの逆数の10
倍以下の効率でプレートする。これにより、偽陽性中の真陽性の頻度が確実に扱
いやすいものとなろう。最高の選択の厳密さ条件は、それを超えるとライブラリ
ーから何も回収されないような条件であろう。
【００３９】
断片相補が切断点末端に融合された異種相互作用因子ドメインの直接的なまた
はリガンドを介した相互作用に依存する場合には、突然変異誘発は使用しないほ
うがよい。というのは折りたたみの加速は通常、連結支援の必要を一掃するから
である。この場合には、選択した断片対をカウンタースクリーニングにかけてfo
s-jun相互作用の存在下での活性の喪失を調べなければならないし、また活性化
指数を相互作用依存性活性の相互作用非依存性活性に対する比として求めなけれ
ばならない。プロテオームライブラリー内または間の相互作用マッピングでは、
少なくともほぼ106程度の活性化指数が好ましい。というのは、まれな遺伝子は
その程度の頻度を示すと見込まれるからである。リガンド特異的または相互作用
特異的バイオセンサーでは、通常、もっと低い活性化指数が許容される。たとえ
ば、それに対する断片-バインダー融合体親和性(Kd)が10 nMレンジであるリガン
ドのナノモル濃度を検出するには、断片-バインダー融合体を10 nM濃度で使用す
るだけでリガンドを飽和させることができる。これらの条件下では、〜90%の断
片対-バインダー融合体が未結合であろう。活性化指数が>100であれば、バック
グラウンドはシグナルの<10%であろう。
はリガンドを介した相互作用に依存する場合には、突然変異誘発は使用しないほ
うがよい。というのは折りたたみの加速は通常、連結支援の必要を一掃するから
である。この場合には、選択した断片対をカウンタースクリーニングにかけてfo
s-jun相互作用の存在下での活性の喪失を調べなければならないし、また活性化
指数を相互作用依存性活性の相互作用非依存性活性に対する比として求めなけれ
ばならない。プロテオームライブラリー内または間の相互作用マッピングでは、
少なくともほぼ106程度の活性化指数が好ましい。というのは、まれな遺伝子は
その程度の頻度を示すと見込まれるからである。リガンド特異的または相互作用
特異的バイオセンサーでは、通常、もっと低い活性化指数が許容される。たとえ
ば、それに対する断片-バインダー融合体親和性(Kd)が10 nMレンジであるリガン
ドのナノモル濃度を検出するには、断片-バインダー融合体を10 nM濃度で使用す
るだけでリガンドを飽和させることができる。これらの条件下では、〜90%の断
片対-バインダー融合体が未結合であろう。活性化指数が>100であれば、バック
グラウンドはシグナルの<10%であろう。
【００４０】
選択された断片対は最大活性および／または最大活性化指数を示すように最適
化することができる。われわれの経験では、切断点ジスルフィドが断片複合体中
に最大量の本来構造を許容するため、最高の特異活性を生み出す。しかし、それ
らの活性はバックグラウンドにもあって、そのために活性化指数がしばしば低く
なるかもしれない。切断点ジスルフィドの特異活性の利点を保持しながらバック
グラウンドを低下させるには、ジスルフィド形成の速度を遅くして、無支援断片
の折りたたみ未遂時には十分な時間を与えずに起こりにくくするが、折りたたみ
が異種相互作用因子相互作用で触媒されたときには効率的に起こるようにする必
要があろう。切断点ジスルフィドの形成を制御するには次のように2つのパラメ
ーターを調節することになろう。(1)ジスルフィド形成システインの切断点に対
する近接性を調節してジスルフィド形成に対する配向性の厳密さを強める。(2)
培地の還元剤濃度を高めて、ペリプラズム中の主ジスルフィド形成酸化酵素DsbA
の有効濃度を低下させる。
化することができる。われわれの経験では、切断点ジスルフィドが断片複合体中
に最大量の本来構造を許容するため、最高の特異活性を生み出す。しかし、それ
らの活性はバックグラウンドにもあって、そのために活性化指数がしばしば低く
なるかもしれない。切断点ジスルフィドの特異活性の利点を保持しながらバック
グラウンドを低下させるには、ジスルフィド形成の速度を遅くして、無支援断片
の折りたたみ未遂時には十分な時間を与えずに起こりにくくするが、折りたたみ
が異種相互作用因子相互作用で触媒されたときには効率的に起こるようにする必
要があろう。切断点ジスルフィドの形成を制御するには次のように2つのパラメ
ーターを調節することになろう。(1)ジスルフィド形成システインの切断点に対
する近接性を調節してジスルフィド形成に対する配向性の厳密さを強める。(2)
培地の還元剤濃度を高めて、ペリプラズム中の主ジスルフィド形成酸化酵素DsbA
の有効濃度を低下させる。
【００４１】
TEM-1βラクタマーゼを使用して、安定した複合体を形成する能力に関する選
択可能な表現型をE. coli中で生み出さない他タンパク質の断片対を選択するこ
とが可能である。というのは、そうした複合体は通常、天然のコンホメーション
をとるであろうし、また機能的に活性であるはずだからである。天然に生じるタ
ンパク質はそこにおいて安定かつ活性であるような独特の最小エネルギーコンホ
メーションもつことはすでに十分に立証されている(Li et al., Science (1996)
273:666)。それ例外のコンホメーションはすべて不安定である。ゆえに、非表
現型タンパク質の断片対が相互作用依存性TEM-1βラクタマーゼ断片に対する融
合体として発現する場合には、会合し天然コンホメーションへと折りたたまれる
断片対だけが選択可能なβラクタマーゼ活性化を助長する十分な連結機能を発揮
するものと期待される。この場合、従属断片はβラクタマーゼ断片の相補を助長
するという異種相互作用因子の目的に奉仕する。しかし、断片／異種相互作用因
子融合体配列にはβラクタマーゼ断片の機能的再会合を強化するため追加の変更
を、たとえば切断点ジスルフィド、3〜12個のアミノ酸から成るランダムコード
化ペプチド、および断片ドメイン内のアミノ酸数個の突然変異誘発などをコード
化することができよう。これらの手段はすべて、断片の安定化、折りたたみの加
速、および／または活性断片複合体の安定化などにより従属断片の相補にだけ特
異的に影響を及ぼすであろう。選択された断片対は次いで、酵素活性の再生また
は親タンパク質の他機能を個別に試験することができる。こうして、真核細胞中
で活性をもつタンパク質、たとえばキナーゼまたは除草剤耐性タンパク質などに
関して多数の有用な断片相補システムを開発することができよう。
択可能な表現型をE. coli中で生み出さない他タンパク質の断片対を選択するこ
とが可能である。というのは、そうした複合体は通常、天然のコンホメーション
をとるであろうし、また機能的に活性であるはずだからである。天然に生じるタ
ンパク質はそこにおいて安定かつ活性であるような独特の最小エネルギーコンホ
メーションもつことはすでに十分に立証されている(Li et al., Science (1996)
273:666)。それ例外のコンホメーションはすべて不安定である。ゆえに、非表
現型タンパク質の断片対が相互作用依存性TEM-1βラクタマーゼ断片に対する融
合体として発現する場合には、会合し天然コンホメーションへと折りたたまれる
断片対だけが選択可能なβラクタマーゼ活性化を助長する十分な連結機能を発揮
するものと期待される。この場合、従属断片はβラクタマーゼ断片の相補を助長
するという異種相互作用因子の目的に奉仕する。しかし、断片／異種相互作用因
子融合体配列にはβラクタマーゼ断片の機能的再会合を強化するため追加の変更
を、たとえば切断点ジスルフィド、3〜12個のアミノ酸から成るランダムコード
化ペプチド、および断片ドメイン内のアミノ酸数個の突然変異誘発などをコード
化することができよう。これらの手段はすべて、断片の安定化、折りたたみの加
速、および／または活性断片複合体の安定化などにより従属断片の相補にだけ特
異的に影響を及ぼすであろう。選択された断片対は次いで、酵素活性の再生また
は親タンパク質の他機能を個別に試験することができる。こうして、真核細胞中
で活性をもつタンパク質、たとえばキナーゼまたは除草剤耐性タンパク質などに
関して多数の有用な断片相補システムを開発することができよう。
【００４２】
本発明の相互作用活性化酵素会合システムは、原核生物のβラクタマーゼで例
証されているように、以下に要約するような多数の用途に使用できる。
証されているように、以下に要約するような多数の用途に使用できる。
【００４３】
(1) 単一および多重タンパク質-タンパク質相互作用マッピング。単一とは発
現配列ライブラリーから天然相互作用因子を釣り上げることを目的とした単一餌
タンパク質の使用をいう。多重とは可能な限り多数の天然型相互作用を同時に単
離することを目的とした2つの発現配列ライブラリーの組み合わせ対単位相互作
用をいう。個別相互作用因子は核酸ハイブリダイゼーションにより容易に検出で
きる。
現配列ライブラリーから天然相互作用因子を釣り上げることを目的とした単一餌
タンパク質の使用をいう。多重とは可能な限り多数の天然型相互作用を同時に単
離することを目的とした2つの発現配列ライブラリーの組み合わせ対単位相互作
用をいう。個別相互作用因子は核酸ハイブリダイゼーションにより容易に検出で
きる。
【００４４】
(2) 相互作用依存性βラクタマーゼシステムはまた、自律折りたたみドメイ
ン(AFD)をコードする断片のランダムプライミング発現配列ライブラリーでの濃
縮に使用できる。融合パートナーによる折りたたみの妨害は、発現ライブラリー
のN末端とC末端だけにエピトープタグと異種二量体化ヘリックスをそれぞれ使用
することにより防止される。前記断片はN末端およびC末端抗タグ・バインダー、
およびパートナー異種二量体化ヘリックスを備えることになろう。ジスルフィド
スイッチは多様な相互作用ジェオメトリーに対応できる。
ン(AFD)をコードする断片のランダムプライミング発現配列ライブラリーでの濃
縮に使用できる。融合パートナーによる折りたたみの妨害は、発現ライブラリー
のN末端とC末端だけにエピトープタグと異種二量体化ヘリックスをそれぞれ使用
することにより防止される。前記断片はN末端およびC末端抗タグ・バインダー、
およびパートナー異種二量体化ヘリックスを備えることになろう。ジスルフィド
スイッチは多様な相互作用ジェオメトリーに対応できる。
【００４５】
(3) 一本鎖抗体断片(scFv)や抗体L鎖可変領域(VL)などのような結合分子の単
一および多重選択。非免疫ヒトscFvレパートリーライブラリーをTEM-1βラクタ
マーゼ相互作用依存性活性化システムと併用すれば、scFvを単一餌用に、または
同時に発現配列ライブラリー用に、単離することができる。後者の場合、個別標
的に特異的なscFvを核酸ハイブリダイゼーションによって容易に検出できる。
一および多重選択。非免疫ヒトscFvレパートリーライブラリーをTEM-1βラクタ
マーゼ相互作用依存性活性化システムと併用すれば、scFvを単一餌用に、または
同時に発現配列ライブラリー用に、単離することができる。後者の場合、個別標
的に特異的なscFvを核酸ハイブリダイゼーションによって容易に検出できる。
【００４６】
(4) ミモトープ相同性によるインタフェースマッピングおよびリガンド検出
。担体または「足場」タンパク質の表面にディスプレーされた拘束ペプチドライ
ブラリーをβラクタマーゼ相互作用依存性活性化システムと併用すれば、目的タ
ンパク質またはAFD用に代理リガンドを単離することができる。次に、任意のポ
リペプチドに対応するそうした代理リガンド群に由来するコンセンサス配列を使
用して、そのポリペプチドの天然リガンドを、またはそのポリペプチドの天然リ
ガンド上の相互作用表面を、検出することができよう。インタフェースマッピン
グの一般的な用途は抗体用のエピトープマッピングであり、抗体が結合するその
抗原表面上の特異的領域がそれによって同定される。
。担体または「足場」タンパク質の表面にディスプレーされた拘束ペプチドライ
ブラリーをβラクタマーゼ相互作用依存性活性化システムと併用すれば、目的タ
ンパク質またはAFD用に代理リガンドを単離することができる。次に、任意のポ
リペプチドに対応するそうした代理リガンド群に由来するコンセンサス配列を使
用して、そのポリペプチドの天然リガンドを、またはそのポリペプチドの天然リ
ガンド上の相互作用表面を、検出することができよう。インタフェースマッピン
グの一般的な用途は抗体用のエピトープマッピングであり、抗体が結合するその
抗原表面上の特異的領域がそれによって同定される。
【００４７】
(5) 対生物作用センサー。シグナル伝達アゴニストおよびアンタゴニスト用
の大部分のスクリーニングシステムの効率は、受容体への連結と普通は新規遺伝
子発現を必要とする選択可能表現型の生成との間に多数のステップを介在させる
必要性によって犠牲にされる。相互作用活性化βラクタマーゼは、標的シグナル
伝達経路の任意の構成要素による活性化または阻害に合わせてあつらえることに
より、選択可能な表現型を生成させるために遺伝子の発現を待つ必要もなく任意
の適当な細胞型の経路のアゴニストまたはアンタゴニストの選択を可能にする。
の大部分のスクリーニングシステムの効率は、受容体への連結と普通は新規遺伝
子発現を必要とする選択可能表現型の生成との間に多数のステップを介在させる
必要性によって犠牲にされる。相互作用活性化βラクタマーゼは、標的シグナル
伝達経路の任意の構成要素による活性化または阻害に合わせてあつらえることに
より、選択可能な表現型を生成させるために遺伝子の発現を待つ必要もなく任意
の適当な細胞型の経路のアゴニストまたはアンタゴニストの選択を可能にする。
【００４８】
(6) 均質検定。標的分子上に非重複エピトープを結合させる2個のscFvまたは
他の結合分子に相互作用依存性相補断片を融合させることにより、βラクタマー
ゼの活性化が標的リガンドへの結合に依存するよう仕向けることができる。タン
パク質から病原体に至るまでの2-エピトープ分析物を対象とする均質検定へのリ
ガンド依存性βラクタマーゼの使用は無類の感度をもたらす。これはほとんどの
検定法で要求される平衡速度論の代わりに飽和速度論が使用できるためである。
結合分子は、標的病原体のゲノムに見られる隣接配列へとアニールするようなオ
リゴヌクレオチドでもよい。こうした配列活性化βラクタマーゼは個別PCR産物
のゲル電気泳動によらない迅速な定量化にも使用できる。
他の結合分子に相互作用依存性相補断片を融合させることにより、βラクタマー
ゼの活性化が標的リガンドへの結合に依存するよう仕向けることができる。タン
パク質から病原体に至るまでの2-エピトープ分析物を対象とする均質検定へのリ
ガンド依存性βラクタマーゼの使用は無類の感度をもたらす。これはほとんどの
検定法で要求される平衡速度論の代わりに飽和速度論が使用できるためである。
結合分子は、標的病原体のゲノムに見られる隣接配列へとアニールするようなオ
リゴヌクレオチドでもよい。こうした配列活性化βラクタマーゼは個別PCR産物
のゲル電気泳動によらない迅速な定量化にも使用できる。
【００４９】
(7) 標的活性化酵素プロドラッグ療法(TAcEPT)および標的活性化酵素造影(TA
cEI)。抗体指定酵素プロドラッグ療法は、患者を腫瘍標的化抗体に接合させたβ
ラクタマーゼなどのようなプロドラッグ活性化酵素で治療する有望な化学療法戦
略である(Bagshawe, 1995, supra)。未結合の抗体-酵素接合体が循環系から排出
されたら腫瘍部位で優先的に活性化されるプロドラッグを投与することができる
。この療法の有効性は、過度の傷害性を回避するために未結合接合体が循環系か
ら排出されてからプロドラッグを投与する必要があるが、その間に大部分の結合
済み酵素は腫瘍から失われてしまうという事情により、厳しく制限される。腫瘍
活性化βラクタマーゼを使用すれば、酵素のピーク腫瘍負荷時にプロドラッグを
投与することができる。これは、酵素が循環系内では不活性であり、腫瘍と結合
したときにだけプロドラッグを活性化しうるからである。同じ戦略は腫瘍または
他の病変組織造影用の、または炎症や移植拒絶反応などのような治療指標用の試
薬の抗体指定型、部位特異的活性化にも使用できる。
cEI)。抗体指定酵素プロドラッグ療法は、患者を腫瘍標的化抗体に接合させたβ
ラクタマーゼなどのようなプロドラッグ活性化酵素で治療する有望な化学療法戦
略である(Bagshawe, 1995, supra)。未結合の抗体-酵素接合体が循環系から排出
されたら腫瘍部位で優先的に活性化されるプロドラッグを投与することができる
。この療法の有効性は、過度の傷害性を回避するために未結合接合体が循環系か
ら排出されてからプロドラッグを投与する必要があるが、その間に大部分の結合
済み酵素は腫瘍から失われてしまうという事情により、厳しく制限される。腫瘍
活性化βラクタマーゼを使用すれば、酵素のピーク腫瘍負荷時にプロドラッグを
投与することができる。これは、酵素が循環系内では不活性であり、腫瘍と結合
したときにだけプロドラッグを活性化しうるからである。同じ戦略は腫瘍または
他の病変組織造影用の、または炎症や移植拒絶反応などのような治療指標用の試
薬の抗体指定型、部位特異的活性化にも使用できる。
【００５０】
以下の実施例は本発明の限定ではなく説明のために示す。
実験
実施例1
α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化:
scFvとtrxpepの相互作用
この実施例では、一本鎖抗体Fv断片(scFv)とE. coliチオレドキシンの活性部
位に挿入されたアミノ酸数12のペプチド(trxpep; Colas et al., Nature (1996)
380:548)との特異的相互作用を検出し識別するシステムの能力を明示する。scF
vは抗体H鎖およびL鎖可変領域(VHおよびVL)を含み、両者は最も一般的には(Gly4 Ser)3リンカーにより連続ポリペプチド中に係留されており、このリンカーは最
も一般的にはVHのC末端とVLのN末端の間にコード化されている。
位に挿入されたアミノ酸数12のペプチド(trxpep; Colas et al., Nature (1996)
380:548)との特異的相互作用を検出し識別するシステムの能力を明示する。scF
vは抗体H鎖およびL鎖可変領域(VHおよびVL)を含み、両者は最も一般的には(Gly4 Ser)3リンカーにより連続ポリペプチド中に係留されており、このリンカーは最
も一般的にはVHのC末端とVLのN末端の間にコード化されている。
【００５１】
ヒト非免疫抗体レパートリーに由来するscFvをコンセンサスプライマーミック
ス使用のPCRで増幅し(Marks et al., Eur J Immunol (1991) 21:985)、pUC119系
ファスミドベクター(pAO1; 図6A参照)にサブクローニングし(Sambrook et al.,
supra)、介在(Gly4Ser)3リンカーを介したω198断片N末端への融合体としてscFv
を発現させるようにした。N末端シグナルペプチドを用意して、細菌ペリプラズ
ムへの転位を図るようにした。市販のtrxpepライブラリーを入手し、E. coliチ
オレドキシンのNおよびC末端に対し特異的なプライマーを使用してPCR増幅した(
Genbank登録no. M54881)。p15Aレプリコン(Rose, Nuc Acids Res (1988) 16:355
)にこの産物をサブクローニングし、trp-lac融合プロモーターからα197断片C末
端への融合体として発現させるようにした(pAE1;図6B参照)。この場合もまた、N
末端シグナルペプチドを用意して、ペリプラズムへの転位を図るようにした。図
7は、scFvとtrxpepの相互作用に依存したα197とω198の相補によるTEM-1の活性
化を示している。
ス使用のPCRで増幅し(Marks et al., Eur J Immunol (1991) 21:985)、pUC119系
ファスミドベクター(pAO1; 図6A参照)にサブクローニングし(Sambrook et al.,
supra)、介在(Gly4Ser)3リンカーを介したω198断片N末端への融合体としてscFv
を発現させるようにした。N末端シグナルペプチドを用意して、細菌ペリプラズ
ムへの転位を図るようにした。市販のtrxpepライブラリーを入手し、E. coliチ
オレドキシンのNおよびC末端に対し特異的なプライマーを使用してPCR増幅した(
Genbank登録no. M54881)。p15Aレプリコン(Rose, Nuc Acids Res (1988) 16:355
)にこの産物をサブクローニングし、trp-lac融合プロモーターからα197断片C末
端への融合体として発現させるようにした(pAE1;図6B参照)。この場合もまた、N
末端シグナルペプチドを用意して、ペリプラズムへの転位を図るようにした。図
7は、scFvとtrxpepの相互作用に依存したα197とω198の相補によるTEM-1の活性
化を示している。
【００５２】
浸透圧衝撃(Neu and Heppel, J Biol Chem (1965) 240:3685)によって得られ
たペリプラズム抽出物の免疫ブロット解析(Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor所収のHarlow and
Lane (1988))では、元のscFvライブラリークローンの約20%が可溶性の完全長scF
vを生み出すと推定された。そこで、機能的scFvを発現する12クローンを得るに
は約60クローンをスクリーニングしなければならなかった。scFv-ω198構築体の
これら12クローンを代表するプラスミドDNAをα197-trxpep構築体の約5×106ク
ローンを代表するDNAと、E. coli株のDH5αおよびTG1に同時導入し(Sambrook et
al., 1989, supra)、カナマイシンとクロラムフェニコールを含む固形LB培地上
にプレートして同時形質転換体の総数を求めた。分取量を25 μg/mlアンピシリ
ン(amp25)上にもプレートした。合計約1×107個の同時形質転換体から40個のア
ンピシリン耐性クローンを回収し、うち36クローンをamp25上に再プレートした
。単一無作為抽出α197-trxpep構築体の、20個のscFv-ω198構築体とのほぼ同数
の同時形質転換体はamp25上ではコロニーをまったく作らなかった。12個のscFv
はすべて36個のアンピシリン耐性クローンに包摂され、それぞれ1〜5種のtrxpep
をもっていた。12個のscFvはいずれも、もともと別のscFvによって選択されたど
のtrxpepとも交差反応しなかった。これは、各scFv-ω198構築体を別のscFvによ
って選択されたα197-trxpep群と同時形質転換させることによって判定した。し
たがって、36個の選択クローンはみな真陽性であり、独特の特異的scFv-trxpep
相互作用を示した。いかなるscFvもそのペプチドミモトープの存在下でチオレド
キシンと結合しなかったし、また選択されたいかなるtrxpepもscFv上の共通決定
基と結合しなかった。選択はE. coli宿主株TG1中でlacプロモーターの無償性抑
制解除物質すなわちイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を用いずに、転写が最
小限になるようにして行った。1 mM IPTGの存在によって転写が強められると、
さらに多数のコロニーが得られた。そのうちのいくつかは、真正の相互作用であ
ることが証明されたが、弱すぎて低発現レベルでは選択可能なアンピシリン耐性
を与えることができなかった。したがって、相互作用因子の発現レベルを調節す
ることにより選択の厳密さを調整することができる。
たペリプラズム抽出物の免疫ブロット解析(Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor所収のHarlow and
Lane (1988))では、元のscFvライブラリークローンの約20%が可溶性の完全長scF
vを生み出すと推定された。そこで、機能的scFvを発現する12クローンを得るに
は約60クローンをスクリーニングしなければならなかった。scFv-ω198構築体の
これら12クローンを代表するプラスミドDNAをα197-trxpep構築体の約5×106ク
ローンを代表するDNAと、E. coli株のDH5αおよびTG1に同時導入し(Sambrook et
al., 1989, supra)、カナマイシンとクロラムフェニコールを含む固形LB培地上
にプレートして同時形質転換体の総数を求めた。分取量を25 μg/mlアンピシリ
ン(amp25)上にもプレートした。合計約1×107個の同時形質転換体から40個のア
ンピシリン耐性クローンを回収し、うち36クローンをamp25上に再プレートした
。単一無作為抽出α197-trxpep構築体の、20個のscFv-ω198構築体とのほぼ同数
の同時形質転換体はamp25上ではコロニーをまったく作らなかった。12個のscFv
はすべて36個のアンピシリン耐性クローンに包摂され、それぞれ1〜5種のtrxpep
をもっていた。12個のscFvはいずれも、もともと別のscFvによって選択されたど
のtrxpepとも交差反応しなかった。これは、各scFv-ω198構築体を別のscFvによ
って選択されたα197-trxpep群と同時形質転換させることによって判定した。し
たがって、36個の選択クローンはみな真陽性であり、独特の特異的scFv-trxpep
相互作用を示した。いかなるscFvもそのペプチドミモトープの存在下でチオレド
キシンと結合しなかったし、また選択されたいかなるtrxpepもscFv上の共通決定
基と結合しなかった。選択はE. coli宿主株TG1中でlacプロモーターの無償性抑
制解除物質すなわちイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を用いずに、転写が最
小限になるようにして行った。1 mM IPTGの存在によって転写が強められると、
さらに多数のコロニーが得られた。そのうちのいくつかは、真正の相互作用であ
ることが証明されたが、弱すぎて低発現レベルでは選択可能なアンピシリン耐性
を与えることができなかった。したがって、相互作用因子の発現レベルを調節す
ることにより選択の厳密さを調整することができる。
【００５３】
これらの結果はいくつかの重要な意味をもつ。第1に、偽陽性率が非常に低く
なり、酵母ツーハイブリッドシステムなどのような他の細胞内相互作用センサー
の場合の報告値を大幅に下回った(Bartel et al., 1993, supra; Bartel et al.
, 1996, supra)。この特性はハイスループット用途ではきわめて重要である。第
2に、すべての機能的scFvに対応するtrxpepが回収されるため、scFvに関する偽
陰性率が非常に低くなった。これもまたハイスループット用途ではきわめて重要
である。すべてのscFvでミモトープが回収されるという事実は、このシステムを
scFvのハイスループット多重エピトープマッピングに使用することを可能にする
。最後に、このシステムは多様な2タンパク質集合間の多様な相互作用物質の同
時的、効率的回収を可能にする。結局、このシステムの高効率、すなわち低偽陽
性率と低偽陰性率からすれば、システムの処理能力を制限するものは相互作用ラ
イブラリーのサイズおよび／または手際よく扱える同時形質転換体の数だけであ
ろう。たとえばscFv、trxpepまたはcDNAでは109〜1010単位の組み換えタンパク
質ライブラリーの構築がごく普通に可能である(Hoogenboom et al., Immunotech
(1998) 4:1)。任意の2つのこうしたライブラリーを対象にした組み合わせ対単
位相互作用トラッピングには少なくとも1018〜1020クローンが必要となろうが、
定量的ファスミド感染法(Sambrook et al., 1989, supra)や自動発酵プレーティ
ング法を用いれば、この程度の処理能力は現実的に実現可能であろう。 実施例2 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: 抗体L鎖V領域(VL)とtrxpepの相互作用 この実施例では、VLプラス第1H鎖定常領域を含むFd断片にジスルフィド結合さ
れた完全長L鎖から成るFabなどのような、より大きな抗体断片にも対応しうるこ
のシステムの能力を例示する。ヒト・レパートリーライブラリーに由来するFab
のサブセットをpAO1ベクターにサブクローニングしlacプロモーター由来のジシ
ストロン転写産物からC末端ω198融合体として発現させるようにした(図6A参照)
。第1シストロンはペリプラズムへの転位のためのシグナルペプチドをもつL鎖を
コードしていた。L鎖終止コドンには短いスペーサー配列が、次いでFd断片のシ
グナルペプチドに対応する翻訳開始点から約10 bp上流のリボソーム結合部位が
続き、さらに次いで介在(Gly4Ser)3リンカーをもつω198が続いた。次にE. coli
株DH5αおよびTG1を用いてこの構築体をpAE1ベクター内のα197-trxpepライブラ
リーと同時発現させた。L鎖とペリプラズム内のFd-ω198融合タンパク質との自
然会合が機能的Fab断片を生成させるものと期待された。次いで、これがα197-t
rxpep融合体上のペプチドと結合することにより、宿主細胞に選択可能なアンピ
シリン耐性を付与するに足る量の機能的TEM-1βラクタマーゼの組み立てを助長
するものと期待された。
なり、酵母ツーハイブリッドシステムなどのような他の細胞内相互作用センサー
の場合の報告値を大幅に下回った(Bartel et al., 1993, supra; Bartel et al.
, 1996, supra)。この特性はハイスループット用途ではきわめて重要である。第
2に、すべての機能的scFvに対応するtrxpepが回収されるため、scFvに関する偽
陰性率が非常に低くなった。これもまたハイスループット用途ではきわめて重要
である。すべてのscFvでミモトープが回収されるという事実は、このシステムを
scFvのハイスループット多重エピトープマッピングに使用することを可能にする
。最後に、このシステムは多様な2タンパク質集合間の多様な相互作用物質の同
時的、効率的回収を可能にする。結局、このシステムの高効率、すなわち低偽陽
性率と低偽陰性率からすれば、システムの処理能力を制限するものは相互作用ラ
イブラリーのサイズおよび／または手際よく扱える同時形質転換体の数だけであ
ろう。たとえばscFv、trxpepまたはcDNAでは109〜1010単位の組み換えタンパク
質ライブラリーの構築がごく普通に可能である(Hoogenboom et al., Immunotech
(1998) 4:1)。任意の2つのこうしたライブラリーを対象にした組み合わせ対単
位相互作用トラッピングには少なくとも1018〜1020クローンが必要となろうが、
定量的ファスミド感染法(Sambrook et al., 1989, supra)や自動発酵プレーティ
ング法を用いれば、この程度の処理能力は現実的に実現可能であろう。 実施例2 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: 抗体L鎖V領域(VL)とtrxpepの相互作用 この実施例では、VLプラス第1H鎖定常領域を含むFd断片にジスルフィド結合さ
れた完全長L鎖から成るFabなどのような、より大きな抗体断片にも対応しうるこ
のシステムの能力を例示する。ヒト・レパートリーライブラリーに由来するFab
のサブセットをpAO1ベクターにサブクローニングしlacプロモーター由来のジシ
ストロン転写産物からC末端ω198融合体として発現させるようにした(図6A参照)
。第1シストロンはペリプラズムへの転位のためのシグナルペプチドをもつL鎖を
コードしていた。L鎖終止コドンには短いスペーサー配列が、次いでFd断片のシ
グナルペプチドに対応する翻訳開始点から約10 bp上流のリボソーム結合部位が
続き、さらに次いで介在(Gly4Ser)3リンカーをもつω198が続いた。次にE. coli
株DH5αおよびTG1を用いてこの構築体をpAE1ベクター内のα197-trxpepライブラ
リーと同時発現させた。L鎖とペリプラズム内のFd-ω198融合タンパク質との自
然会合が機能的Fab断片を生成させるものと期待された。次いで、これがα197-t
rxpep融合体上のペプチドと結合することにより、宿主細胞に選択可能なアンピ
シリン耐性を付与するに足る量の機能的TEM-1βラクタマーゼの組み立てを助長
するものと期待された。
【００５４】
事実、多数のクローンが25 μg/mlアンピシリン上で回収された。そのうちの
一部を表1に掲げる。いくつかは最高100 μg/mlで耐性を示したし、1つは最高60
0 μg/mlで耐性を示した。意外にも回収されたFabはどれもVH領域を欠失してい
た。つまり、第1H鎖定常領域(CH1)だけが付いた完全長L鎖(LC)を含んでいた。そ
の理由は次のとおりであった。元のFabライブラリーは次のような方法で構築さ
れた。まず、発現の準備が整った状態の定常領域をすでに収めたベクターにVLレ
パートリーを挿入した。この中間構築体はL鎖とω198に融合させた第1H鎖との複
合体を発現させることができた。次にこのL鎖ライブラリーからプラスミドDNAを
精製し、VHレパートリー挿入の受容DNAとして使用し、Fabライブラリーを完成さ
せた。得られたライブラリーは、中間ベクターを含む約15%のクローンで汚染さ
れていた。これらのLC-CH1複合体だけが、VL結合部位を適当なtrxpep上のペプチ
ドと結合させることによりα197-ω198相補を促進することができた。完全長Fab
が選択されなかった理由は不明であるが、Fab-trxpep複合体(〜67 kDa )のより
大きなサイズと剛直性が断片相補を立体的に阻害する一方で、LC-CH1のより小さ
なサイズと柔軟性はそのような働きをしなかったという可能性がある。 表1 選択複合対の抗体LC-CH1複合体とtrxpepの相互作用により 促進されたTEM-1βラクタマーゼα197／ω198断片相補の アンピシリン耐性効果
一部を表1に掲げる。いくつかは最高100 μg/mlで耐性を示したし、1つは最高60
0 μg/mlで耐性を示した。意外にも回収されたFabはどれもVH領域を欠失してい
た。つまり、第1H鎖定常領域(CH1)だけが付いた完全長L鎖(LC)を含んでいた。そ
の理由は次のとおりであった。元のFabライブラリーは次のような方法で構築さ
れた。まず、発現の準備が整った状態の定常領域をすでに収めたベクターにVLレ
パートリーを挿入した。この中間構築体はL鎖とω198に融合させた第1H鎖との複
合体を発現させることができた。次にこのL鎖ライブラリーからプラスミドDNAを
精製し、VHレパートリー挿入の受容DNAとして使用し、Fabライブラリーを完成さ
せた。得られたライブラリーは、中間ベクターを含む約15%のクローンで汚染さ
れていた。これらのLC-CH1複合体だけが、VL結合部位を適当なtrxpep上のペプチ
ドと結合させることによりα197-ω198相補を促進することができた。完全長Fab
が選択されなかった理由は不明であるが、Fab-trxpep複合体(〜67 kDa )のより
大きなサイズと剛直性が断片相補を立体的に阻害する一方で、LC-CH1のより小さ
なサイズと柔軟性はそのような働きをしなかったという可能性がある。 表1 選択複合対の抗体LC-CH1複合体とtrxpepの相互作用により 促進されたTEM-1βラクタマーゼα197／ω198断片相補の アンピシリン耐性効果
【００５５】
【表１】
【００５６】a
+、++、+++、+++++は25、50、100、600 μg/mlアンピシリン上での>10%プレー
ティング効率 以上の結果は、サイズが〜12 kDaにすぎないL鎖V領域だけが、断片相補による
βラクタマーゼの抗原依存性活性化に好都合なハイアフィニティー結合分子を作
りうることを示している。これを検定するために、いくつかの被選択LC-CH1に由
来するVLをサブクローニングしてω198に対するC末端融合体としてだけ発現させ
るようにした。各VLをそのパートナーのα197-trxpepと同時発現させると、約3
分の1のVLが親LC-CH1並みの選択可能なアンピシリン耐性を付与した。 実施例3 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40とtrxpepの相互作用 この実施例では、目的とする任意のタンパク質に結合し、またタンパク質上の
相互作用表面のマッピングに使用しうるうえに相同性による新リガンドの同定に
も役立ちうるようなtrxpep群を単離するこのシステムの能力を例示する。ヒトB
細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメインはE. coliペリプラズム内で確実に発現す
ることが知られている(Noelle et al., Immunol Today (1992) 13:431; Bajorat
h and Aruffo, Proteins: Struct, Funct, Genet (1997) 27:59)。T細胞表面分
子のCD40リガンド(CD40L)はCD40へと連結することによりB細胞のコアクチベータ
ーとして機能することが知られているが、他のリガンドも存在するかもしれない
。そこで、TEM-1α197/ω198断片相補を利用して一群のCD40結合trxpepを選択し
、次いでこれらのペプチドの配列について既知リガンドや他の潜在的リガンドと
の相同性を調べることにした。成熟型細胞外ドメイン(CD40ED)のコード配列を、
この成熟タンパク質のN末端および〜190残基細胞外ドメインのC末端と相同のプ
ライマーを使用するPCRによって増幅した(Genbank登録no.X60592)。次いでpAO1
ファスミドベクターにPCR産物をサブクローニングし(図6A参照)、介在(Gly4Ser) 3 リンカーを介したTEM-1ω198断片との融合体としてlacプロモーターから発現さ
せるようにした。正しい産物の発現をPAGEで確認し、次いでCD40融合ベクターを
ファージとして再利用し、前述と同じtrxpepライブラリー構築体を入れたTG1細
胞に導入した。カナマイシン上とクロラムフェニコール上の二重選択により約10 7 個の同時形質転換体が収集されたので、それを次に25μg/mlアンピシリン上に
プレートした。図8はα197とω198のtrxpep- CD40相互作用依存性相補によるTEM
-1の活性化の模式図である。
ティング効率 以上の結果は、サイズが〜12 kDaにすぎないL鎖V領域だけが、断片相補による
βラクタマーゼの抗原依存性活性化に好都合なハイアフィニティー結合分子を作
りうることを示している。これを検定するために、いくつかの被選択LC-CH1に由
来するVLをサブクローニングしてω198に対するC末端融合体としてだけ発現させ
るようにした。各VLをそのパートナーのα197-trxpepと同時発現させると、約3
分の1のVLが親LC-CH1並みの選択可能なアンピシリン耐性を付与した。 実施例3 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40とtrxpepの相互作用 この実施例では、目的とする任意のタンパク質に結合し、またタンパク質上の
相互作用表面のマッピングに使用しうるうえに相同性による新リガンドの同定に
も役立ちうるようなtrxpep群を単離するこのシステムの能力を例示する。ヒトB
細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメインはE. coliペリプラズム内で確実に発現す
ることが知られている(Noelle et al., Immunol Today (1992) 13:431; Bajorat
h and Aruffo, Proteins: Struct, Funct, Genet (1997) 27:59)。T細胞表面分
子のCD40リガンド(CD40L)はCD40へと連結することによりB細胞のコアクチベータ
ーとして機能することが知られているが、他のリガンドも存在するかもしれない
。そこで、TEM-1α197/ω198断片相補を利用して一群のCD40結合trxpepを選択し
、次いでこれらのペプチドの配列について既知リガンドや他の潜在的リガンドと
の相同性を調べることにした。成熟型細胞外ドメイン(CD40ED)のコード配列を、
この成熟タンパク質のN末端および〜190残基細胞外ドメインのC末端と相同のプ
ライマーを使用するPCRによって増幅した(Genbank登録no.X60592)。次いでpAO1
ファスミドベクターにPCR産物をサブクローニングし(図6A参照)、介在(Gly4Ser) 3 リンカーを介したTEM-1ω198断片との融合体としてlacプロモーターから発現さ
せるようにした。正しい産物の発現をPAGEで確認し、次いでCD40融合ベクターを
ファージとして再利用し、前述と同じtrxpepライブラリー構築体を入れたTG1細
胞に導入した。カナマイシン上とクロラムフェニコール上の二重選択により約10 7 個の同時形質転換体が収集されたので、それを次に25μg/mlアンピシリン上に
プレートした。図8はα197とω198のtrxpep- CD40相互作用依存性相補によるTEM
-1の活性化の模式図である。
【００５７】
13個の固有のtrxpepをコードするアンピシリン耐性クローンが回収された。い
ずれの場合にも、amp耐性はCD40EDとtrxpepのペプチド部分の存在に厳密に依存
した。CD40EDを無関係のタンパク質と置き換えると、またはtrxpepを野生型チオ
レドキシンに置き換えると、活性は見られなかった。選択されたCD40結合タンパ
ク質の配列を表2に、それらの相互間の、およびCD40Lとの相同性を含めて示す。
13個のペプチドは8つの相同群にまとめられる。すなわち、各3ペプチドから成る
2群、2ペプチドから成る1群、それに各1ペプチドから成る5群である。群1および
2はCD40Lの同じ領域に対する各群3個のペプチドの相同性によって規定される。
群1はCD40のPro217からGly234間での領域と相同的であり、群2はGly158からLeu1
68までの領域と相同的である。群3はペプチド間相同性だけによって規定され、C
D40との検出可能な相同性はもたない。群4はCD40のSer110からPro120間での領域
と相同的であり群5はPro244からGly257間での領域と相同的である。群6〜8は識
別可能な相同性をもたない。しかし、多数のペプチドが他のヒト細胞外タンパク
質、たとえばCTLA-2A、マトリックスメタロプロテナーゼ、受容体Tyrホスファタ
ーゼ、血管内皮細胞増殖阻害物質(VEGI)、トランスフェリン受容体、CD3ζ、お
よび骨形成タンパク質3B (BMP-3B)などとの顕著な相同性をもっている。これら
は、細胞外タンパク質-タンパク質相互作用のためにすでに繰り返し使用されて
きた単数または複数の相互作用モチーフを規定しているかもしれない。また、CD
40上の多重相互作用部位を示してもいるかもしれない。
ずれの場合にも、amp耐性はCD40EDとtrxpepのペプチド部分の存在に厳密に依存
した。CD40EDを無関係のタンパク質と置き換えると、またはtrxpepを野生型チオ
レドキシンに置き換えると、活性は見られなかった。選択されたCD40結合タンパ
ク質の配列を表2に、それらの相互間の、およびCD40Lとの相同性を含めて示す。
13個のペプチドは8つの相同群にまとめられる。すなわち、各3ペプチドから成る
2群、2ペプチドから成る1群、それに各1ペプチドから成る5群である。群1および
2はCD40Lの同じ領域に対する各群3個のペプチドの相同性によって規定される。
群1はCD40のPro217からGly234間での領域と相同的であり、群2はGly158からLeu1
68までの領域と相同的である。群3はペプチド間相同性だけによって規定され、C
D40との検出可能な相同性はもたない。群4はCD40のSer110からPro120間での領域
と相同的であり群5はPro244からGly257間での領域と相同的である。群6〜8は識
別可能な相同性をもたない。しかし、多数のペプチドが他のヒト細胞外タンパク
質、たとえばCTLA-2A、マトリックスメタロプロテナーゼ、受容体Tyrホスファタ
ーゼ、血管内皮細胞増殖阻害物質(VEGI)、トランスフェリン受容体、CD3ζ、お
よび骨形成タンパク質3B (BMP-3B)などとの顕著な相同性をもっている。これら
は、細胞外タンパク質-タンパク質相互作用のためにすでに繰り返し使用されて
きた単数または複数の相互作用モチーフを規定しているかもしれない。また、CD
40上の多重相互作用部位を示してもいるかもしれない。
【００５８】
選択された5つのCD40結合trxpepのそれぞれをpAO1ファスミドベクター内の第2
シストロンから、CD40-ω198複合体の下流に発現させることにより、trxpep間競
合を試験した。次に、TG1株を使用して、これらの構築体のそれぞれを、同じ5つ
の構築体、プラス追加の3つの被選択α197-trxpep融合構築体のそれぞれと同時
発現させ、25μg/mlアンピシリン上での増殖を評価した。その結果を表3に示す
。8つのtrxpepは5群に分類された。BW10-1は群2および3と中程度に競合する。p5
6-12-9A1、BW10-4およびBW10-8は互いに強く競合し、競合ぶりも類似している。
それらは、群3およびBW10-9と若干競合するBW10-8を別にすれば群3とは競合しな
い。それらの3つはみなBW10-1と競合するし、またp58-12-9A1もBW10-9と若干競
合する。p44-4-2A1とp45-7-2A3は強く競合するし、競合ぶりも似ている。それら
はBW10-1と競合するが、他とはBW10-8と若干競合する以外、まったく競合しない
。BW10-9はBW10-8およびp58-12-9A1と若干競合する。p65-2-9A1は何ものにも阻
害されない。
シストロンから、CD40-ω198複合体の下流に発現させることにより、trxpep間競
合を試験した。次に、TG1株を使用して、これらの構築体のそれぞれを、同じ5つ
の構築体、プラス追加の3つの被選択α197-trxpep融合構築体のそれぞれと同時
発現させ、25μg/mlアンピシリン上での増殖を評価した。その結果を表3に示す
。8つのtrxpepは5群に分類された。BW10-1は群2および3と中程度に競合する。p5
6-12-9A1、BW10-4およびBW10-8は互いに強く競合し、競合ぶりも類似している。
それらは、群3およびBW10-9と若干競合するBW10-8を別にすれば群3とは競合しな
い。それらの3つはみなBW10-1と競合するし、またp58-12-9A1もBW10-9と若干競
合する。p44-4-2A1とp45-7-2A3は強く競合するし、競合ぶりも似ている。それら
はBW10-1と競合するが、他とはBW10-8と若干競合する以外、まったく競合しない
。BW10-9はBW10-8およびp58-12-9A1と若干競合する。p65-2-9A1は何ものにも阻
害されない。
【００５９】
【表２】
【００６０】a
配列相同性については、下線は一致を、太字は同類置換をそれぞれ表す。群1
、2、4および5は、CD40Lとの相同性だけを示す。 b 25μg/mlアンピシリン上でCD40-ω198融合体と同時発現させた場合のプレー
ティング効率。+、>10%; ++、>50%。
、2、4および5は、CD40Lとの相同性だけを示す。 b 25μg/mlアンピシリン上でCD40-ω198融合体と同時発現させた場合のプレー
ティング効率。+、>10%; ++、>50%。
【００６１】
【表３】
【００６２】
1. “+”=阻害、 “-”=非阻害。読み方は縦／横。
【００６３】
2. “+”斜線の右側のすべてのセルについて、読み方は縦=遊離／横=α融合
体 3. “+”斜線の左側のすべてのセルについて、読み方は縦=α融合体／横=遊
離 4. (+)自己対照は実際には行われなかった。
体 3. “+”斜線の左側のすべてのセルについて、読み方は縦=α融合体／横=遊
離 4. (+)自己対照は実際には行われなかった。
【００６４】
一般に競合データは相同性データと合致するが、ただし非重複エピトープとの
同時結合は許されない場合がある。これは、p58-12-9A1とBW10-8のような非関連
配列が互いに強く競合し合い、似たような競合ぶりを示すことを可能にする。こ
れはおそらく酵素組み立ての立体障害によるものであろうし、特にBW-10-1とp58
-12-9A1に関する相同性データと競合データの不一致を説明してくれるかもしれ
ない。これらの2つはおそらく同じCD40相互作用エピトープの近くに結合し、そ
れが他の (すべてのではないが)多数のtrxpepについて断片相補を立体的に阻害
するのであろう。
同時結合は許されない場合がある。これは、p58-12-9A1とBW10-8のような非関連
配列が互いに強く競合し合い、似たような競合ぶりを示すことを可能にする。こ
れはおそらく酵素組み立ての立体障害によるものであろうし、特にBW-10-1とp58
-12-9A1に関する相同性データと競合データの不一致を説明してくれるかもしれ
ない。これらの2つはおそらく同じCD40相互作用エピトープの近くに結合し、そ
れが他の (すべてのではないが)多数のtrxpepについて断片相補を立体的に阻害
するのであろう。
【００６５】
用途によっては、βラクタマーゼの活性化を、遊離リガンドかまたは細胞表面
受容体か、別個の分子上の非重複エピトープへのα197とω198の同時結合に依存
させるのが有効であろう。競合試験で非競合的であることがすでに判明している
2つのCD40結合trxpepを使用してこの効用を試験した。一方のtrxpepはpAO1ベク
ターからC末端ω198融合体として発現させるためにサブクローニングした(図6参
照)。他方のtrxpepは前のようにpAE1ベクターからα197融合体として発現させた
。これら2構築体の同時発現を陰性対照として用いた。CD40依存性活性化を試験
するために、CD40EDコード配列を(シグナルペプチドを含めて)trxpep-ω198発現
カセットのプロモーターとtrxpep-ω198配列の間にサブクローニングした。リボ
ソーム結合部位を収めた追加の20 bpをCD40終止コドンから下流に含めて、前述
のFabの場合と同じ要領で、同じジシストロン転写産物からCD40とtrxpep-ω198
の両方を発現させるようにした。表4に示すように、CD40の発現は50μg/mlアン
ピシリンに対する耐性を誘発したが、CD40なしでは対照構築体を発現する細胞は
25μg/mlアンピシリン上でも細胞当たり10-6未満のコロニーしか生み出さなかっ
た。このように、βラクタマーゼ断片相補は三分子のタンパク質-タンパク質-タ
ンパク質相互作用によって効率的に誘発することができる。 表4 非競合的なCD40結合trxpepとCD40EDの使用による TEM-1α/ω断片相補のリガンド活性化
受容体か、別個の分子上の非重複エピトープへのα197とω198の同時結合に依存
させるのが有効であろう。競合試験で非競合的であることがすでに判明している
2つのCD40結合trxpepを使用してこの効用を試験した。一方のtrxpepはpAO1ベク
ターからC末端ω198融合体として発現させるためにサブクローニングした(図6参
照)。他方のtrxpepは前のようにpAE1ベクターからα197融合体として発現させた
。これら2構築体の同時発現を陰性対照として用いた。CD40依存性活性化を試験
するために、CD40EDコード配列を(シグナルペプチドを含めて)trxpep-ω198発現
カセットのプロモーターとtrxpep-ω198配列の間にサブクローニングした。リボ
ソーム結合部位を収めた追加の20 bpをCD40終止コドンから下流に含めて、前述
のFabの場合と同じ要領で、同じジシストロン転写産物からCD40とtrxpep-ω198
の両方を発現させるようにした。表4に示すように、CD40の発現は50μg/mlアン
ピシリンに対する耐性を誘発したが、CD40なしでは対照構築体を発現する細胞は
25μg/mlアンピシリン上でも細胞当たり10-6未満のコロニーしか生み出さなかっ
た。このように、βラクタマーゼ断片相補は三分子のタンパク質-タンパク質-タ
ンパク質相互作用によって効率的に誘発することができる。 表4 非競合的なCD40結合trxpepとCD40EDの使用による TEM-1α/ω断片相補のリガンド活性化
【００６６】
【表４】
【００６７】a
細胞当たりコロニー数で見た25μg/mlアンピシリン上のプレーティング効率
。−, <10-6; +, >10%; ++, >25%; +++, >50%。 実施例4 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40特異的scFvとCD40の相互作用 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼの活性化はscFvとtr
xpepの相互作用により効率的に促進することができたので、scFvと真のタンパク
質抗原、好ましくは細胞表面受容体の相互作用でもそれを促進しうることを立証
することが重要であった。これが特に重要なのは、Ｉ型膜貫通受容体のリガンド
結合ドメインはN末端であり、したがってC末端融合体としてのその発現が好まし
いためであった。しかし、scFv発現の好ましい方向性もまたN末端である。scFv
と抗原の両方をC末端融合体として発現させうるようにするために、scFvのω198
とのC末端融合体、CD40のfosヘリックスとのC末端融合体およびα197のjunヘリ
ックスとのC末端融合体などを含む三分子相互作用によるβラクタマーゼ活性化
を試験した。これらの発現構築体はtrxpep-断片融合体のCD40連結反応に使用さ
れたもの類似していた。CD40-fos融合体とscFv-ω198融合体をpAO1ベクター中の
ジシストロン転写産物から発現させ、α197-jun融合体をpAE1ベクターから発現
させた。fos-jun相互作用はKdが10-8Mレンジにあるので、CD40を、ペリプラズム
内にこれよりももっとずっと豊富に存在するα197に定量的に連結させるはずで
ある。scFvのCD40への結合は次いでω198をこの複合体に合体させ、断片相補を
促進するはずである。表4に示すように、CD40-fosの発現は最高の100μg/mlアン
ピシリンに対する耐性を誘発したが、この場合もまたCD40-fosを欠く対照構築体
だけを発現する細胞は25μg/mlアンピシリンでも細胞当たり10-6未満のコロニー
を発現させたにすぎない。こうして、好ましいC末端融合体内の2つの細胞外タン
パク質の三分子相互作用はβラクタマーゼ断片相補を効率的に誘発することがで
きる。 実施例5 ジスルフィド増進断片相補 α197およびω198断片の相互作用依存性相補によって生み出されるβラクタマ
ーゼ活性は同じ発現条件下での野生型酵素のそれよりもずっと低い。こうした活
性の喪失は両断片には天然のコンホメーションへと折りたたまれていないときは
凝集または反転する傾向があるためと考えられるが、これはまたゆるく係留され
た異種相互作用の、本来状態のコンホメーションを安定化させる能力の低下に起
因する比活性の喪失を反映すると考えられる。切断点へのジスルフィドの導入に
より折りたたみの反応速度と安定性の双方を改善しうるし、またこれは相互作用
依存性活性の大幅な向上にもつながりうると推論された。両断片対が異種相互作
用でドッキングされると、切断点に付加されたシステイン間のジスルフィド結合
の形成によりポリペプチド骨格の完全な状態が折りたたみ経路のどこかで回復さ
れ、それが折りたたみを加速したり活性コンホメーションを安定化したりすると
期待された。細菌ペリプラズムの高酸化性環境ではジスルフィドはきわめて急速
に形成されよう。しかし、もしも断片対がドッキングされ折りたたまれるまでは
不安定であるが、いったん折りたたまれると活性が安定になるのであれば、切断
点ジスルフィドは折りたたみ経路の遅い段階まで形成されない場合には活性にほ
とんど効果を及ぼさないという可能性がある。
。−, <10-6; +, >10%; ++, >25%; +++, >50%。 実施例4 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40特異的scFvとCD40の相互作用 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼの活性化はscFvとtr
xpepの相互作用により効率的に促進することができたので、scFvと真のタンパク
質抗原、好ましくは細胞表面受容体の相互作用でもそれを促進しうることを立証
することが重要であった。これが特に重要なのは、Ｉ型膜貫通受容体のリガンド
結合ドメインはN末端であり、したがってC末端融合体としてのその発現が好まし
いためであった。しかし、scFv発現の好ましい方向性もまたN末端である。scFv
と抗原の両方をC末端融合体として発現させうるようにするために、scFvのω198
とのC末端融合体、CD40のfosヘリックスとのC末端融合体およびα197のjunヘリ
ックスとのC末端融合体などを含む三分子相互作用によるβラクタマーゼ活性化
を試験した。これらの発現構築体はtrxpep-断片融合体のCD40連結反応に使用さ
れたもの類似していた。CD40-fos融合体とscFv-ω198融合体をpAO1ベクター中の
ジシストロン転写産物から発現させ、α197-jun融合体をpAE1ベクターから発現
させた。fos-jun相互作用はKdが10-8Mレンジにあるので、CD40を、ペリプラズム
内にこれよりももっとずっと豊富に存在するα197に定量的に連結させるはずで
ある。scFvのCD40への結合は次いでω198をこの複合体に合体させ、断片相補を
促進するはずである。表4に示すように、CD40-fosの発現は最高の100μg/mlアン
ピシリンに対する耐性を誘発したが、この場合もまたCD40-fosを欠く対照構築体
だけを発現する細胞は25μg/mlアンピシリンでも細胞当たり10-6未満のコロニー
を発現させたにすぎない。こうして、好ましいC末端融合体内の2つの細胞外タン
パク質の三分子相互作用はβラクタマーゼ断片相補を効率的に誘発することがで
きる。 実施例5 ジスルフィド増進断片相補 α197およびω198断片の相互作用依存性相補によって生み出されるβラクタマ
ーゼ活性は同じ発現条件下での野生型酵素のそれよりもずっと低い。こうした活
性の喪失は両断片には天然のコンホメーションへと折りたたまれていないときは
凝集または反転する傾向があるためと考えられるが、これはまたゆるく係留され
た異種相互作用の、本来状態のコンホメーションを安定化させる能力の低下に起
因する比活性の喪失を反映すると考えられる。切断点へのジスルフィドの導入に
より折りたたみの反応速度と安定性の双方を改善しうるし、またこれは相互作用
依存性活性の大幅な向上にもつながりうると推論された。両断片対が異種相互作
用でドッキングされると、切断点に付加されたシステイン間のジスルフィド結合
の形成によりポリペプチド骨格の完全な状態が折りたたみ経路のどこかで回復さ
れ、それが折りたたみを加速したり活性コンホメーションを安定化したりすると
期待された。細菌ペリプラズムの高酸化性環境ではジスルフィドはきわめて急速
に形成されよう。しかし、もしも断片対がドッキングされ折りたたまれるまでは
不安定であるが、いったん折りたたまれると活性が安定になるのであれば、切断
点ジスルフィドは折りたたみ経路の遅い段階まで形成されない場合には活性にほ
とんど効果を及ぼさないという可能性がある。
【００６８】
システインは切断点末端と異種相互作用因子に至るリンカーとの間でα197と
ω198の配列に付加した。fosおよびjunヘリックスを相互作用因子とすると、定
量的アンピシリン耐性(>10%プレーティング効率)は50μg/mlから100μg/ml超へ
と強まったし、25μg/mlアンピシリン上でのプレーティング効率は少なくとも2
倍上昇した。したがって、ジスルフィド形成は折りたたみを加速したり活性コン
ホメーションを安定化したりするに違いない。しかし、ジスルフィドは相互作用
因子なしでもほぼ同程度の活性を生み出した。これはジスルフィドまたは相互作
用因子の不在下での断片活性とは大違いであり、この場合のプレーティング効率
は25μg/mlアンピシリン上で10-6未満であった。これは、両断片がおそらくこれ
らの細胞内濃度では自力で容易に会合し折りたたまれるが、異種相互作用または
切断点ジスルフィドを欠くと、折りたたみが活性コンホメーションまで進行でき
ないか、または活性コンホメーションが選択可能な活性を生み出すに足るほど安
定的でないことを示唆する。無支援の折りたたみ時にチオールが近接している場
合には、ジスルフィド形成のための有限のタイミング幅が存在するに違いない。
この幅は相互作用支援折りたたみ時にはずっと広くなるはずである。したがって
、ジスルフィド形成を遅らせ、それによって異種相互作用への依存性を強めさせ
ることは可能なはずである。
ω198の配列に付加した。fosおよびjunヘリックスを相互作用因子とすると、定
量的アンピシリン耐性(>10%プレーティング効率)は50μg/mlから100μg/ml超へ
と強まったし、25μg/mlアンピシリン上でのプレーティング効率は少なくとも2
倍上昇した。したがって、ジスルフィド形成は折りたたみを加速したり活性コン
ホメーションを安定化したりするに違いない。しかし、ジスルフィドは相互作用
因子なしでもほぼ同程度の活性を生み出した。これはジスルフィドまたは相互作
用因子の不在下での断片活性とは大違いであり、この場合のプレーティング効率
は25μg/mlアンピシリン上で10-6未満であった。これは、両断片がおそらくこれ
らの細胞内濃度では自力で容易に会合し折りたたまれるが、異種相互作用または
切断点ジスルフィドを欠くと、折りたたみが活性コンホメーションまで進行でき
ないか、または活性コンホメーションが選択可能な活性を生み出すに足るほど安
定的でないことを示唆する。無支援の折りたたみ時にチオールが近接している場
合には、ジスルフィド形成のための有限のタイミング幅が存在するに違いない。
この幅は相互作用支援折りたたみ時にはずっと広くなるはずである。したがって
、ジスルフィド形成を遅らせ、それによって異種相互作用への依存性を強めさせ
ることは可能なはずである。
【００６９】
ジスルフィド形成の異種相互作用への依存性を強めさせるために2つの修飾を
加えた。第1に、増殖培地に還元剤を混ぜることによってジスルフィド形成を阻
害することができた。10 mMのジチオスレイトール(DTT)はジスルフィド支援断片
の100μg/mlアンピシリン上のプレーティング効率を相互作用の不在下で細胞当
たり<10-4コロニーへと低下させた。ちなみに、fos-jun相互作用の存在下では同
じ断片の活性はDTTの影響をほとんど受けなかった。そのため、活性化指数は>10
00倍にも上昇した。第2に、システインをそれぞれ1残基だけ切断点からβラクタ
マーゼ配列側へずらして、本来の折りたたみ状態でさらに〜8Åだけ隔てられる
ようにした。これは活性を相互作用がない場合で50μg/mlアンピシリン上のプレ
ーティング効率<10-6へと低下させ、またfos-jun相互作用がある場合の50μg/ml
アンピシリン上のプレーティング効率を〜10%へと低下させ、対応する活性化指
数を>105にした。したがって、還元剤とチオール分離を組み合わせれば、バック
グラウンドに対する相互作用依存性活性化の増分はおそらく>106へとさらに大き
くなるものと期待されよう。ジスルフィドによってもたらされる相互作用依存性
の比活性の増進は弱い相互作用や貧弱なエクスプレッサーでも細胞当たり10分子
未満の活性化酵素で選択可能なβラクタマーゼ活性を生み出せるようになるはず
である。
加えた。第1に、増殖培地に還元剤を混ぜることによってジスルフィド形成を阻
害することができた。10 mMのジチオスレイトール(DTT)はジスルフィド支援断片
の100μg/mlアンピシリン上のプレーティング効率を相互作用の不在下で細胞当
たり<10-4コロニーへと低下させた。ちなみに、fos-jun相互作用の存在下では同
じ断片の活性はDTTの影響をほとんど受けなかった。そのため、活性化指数は>10
00倍にも上昇した。第2に、システインをそれぞれ1残基だけ切断点からβラクタ
マーゼ配列側へずらして、本来の折りたたみ状態でさらに〜8Åだけ隔てられる
ようにした。これは活性を相互作用がない場合で50μg/mlアンピシリン上のプレ
ーティング効率<10-6へと低下させ、またfos-jun相互作用がある場合の50μg/ml
アンピシリン上のプレーティング効率を〜10%へと低下させ、対応する活性化指
数を>105にした。したがって、還元剤とチオール分離を組み合わせれば、バック
グラウンドに対する相互作用依存性活性化の増分はおそらく>106へとさらに大き
くなるものと期待されよう。ジスルフィドによってもたらされる相互作用依存性
の比活性の増進は弱い相互作用や貧弱なエクスプレッサーでも細胞当たり10分子
未満の活性化酵素で選択可能なβラクタマーゼ活性を生み出せるようになるはず
である。
【００７０】
TEM-1α197/ω198断片相補の活性化作用を増進する切断点ジスルフィドの能力
は、異種相互作用だけでは選択可能な活性をわずかに生み出すだけの(またはま
ったく生み出さない)多数の酵素断片対を切断点ジスルフィドで活性化しうるか
もしれないことを示唆する。異種相互作用は断片のドッキングに不可欠であろう
が、それは〜60Åリンカーで係留されるため、切断点でポリペプチド骨格の堅固
な結合を回復させることはできない。しかし、切断点をまたぐジスルフィドの形
成は骨格の完全性を回復させるはずであり、またそれによって複合体の活性部位
を安定化させるのに役立つはずである。このアイデアを試験するために、ポリペ
プチド鎖の9本の露出ループの切断に対応するさらに9個のTEM-1βラクタマーゼ
断片対をスクリーニングした。9断片対のスクリーニングは切断点ジスルフィド
だけの場合、fos-jun相互作用だけの場合、および両者を併用した場合について
、選択可能な活性を指標にして行った。その結果をまとめると表5のようになる
。
は、異種相互作用だけでは選択可能な活性をわずかに生み出すだけの(またはま
ったく生み出さない)多数の酵素断片対を切断点ジスルフィドで活性化しうるか
もしれないことを示唆する。異種相互作用は断片のドッキングに不可欠であろう
が、それは〜60Åリンカーで係留されるため、切断点でポリペプチド骨格の堅固
な結合を回復させることはできない。しかし、切断点をまたぐジスルフィドの形
成は骨格の完全性を回復させるはずであり、またそれによって複合体の活性部位
を安定化させるのに役立つはずである。このアイデアを試験するために、ポリペ
プチド鎖の9本の露出ループの切断に対応するさらに9個のTEM-1βラクタマーゼ
断片対をスクリーニングした。9断片対のスクリーニングは切断点ジスルフィド
だけの場合、fos-jun相互作用だけの場合、および両者を併用した場合について
、選択可能な活性を指標にして行った。その結果をまとめると表5のようになる
。
【００７１】
fos-jun相互作用に切断点ジスルフィドを加えると、9断片対のうち7断片対の
活性が大幅に強まったが、これはα197/ω198断片対を加えれば10断片対中8断片
対となる。この10断片対は3群に分類されよう。第1群は2個の陰性対を含む。第2
群はジスルフィドとfos-jun相互作用を合わせた場合に限って活性化される3個の
対を含む。いずれの場合でも、プレーティング効率は25μg/mlアンピシリン上で
少なくとも10%、活性化指数は少なくとも1000である。第3群はいずれも分子のC
末端側3分の1内の切断点に由来する5個の対を含み、fos-junだけでも中程度〜強
度の活性を生み出すが、fos-junとジスルフィドの両方を合わせると強力な活性
を生み出す。何よりも重要なのは、5対中4対がジスルフィドだけでは選択可能な
活性を示さない、したがってそれらの活性化指数はきわめて大きいという点にあ
る。最大活性化指数を示すのはP145/N175で、その値は100 μg/mlアンピシリン
上で〜107である。最大活性を示すのはG253/K254で、プレーティング効率は400
μg/mlアンピシリン上で>25%ある。興味深いことに、切断点ジスルフィドだけで
強い選択可能活性を生み出す対は、相互作用依存性の活性化を示すことが最初に
判明した断片対、すなわちα197/ω198にとどまっている。何対かの活性化は切
断点システインと内部システインの間での混合ジスルフィド形成によって阻害さ
れている可能性があるし、またそうした阻害は外来還元剤によって緩和されうる
という可能性もある。しかし、これらの場合には無支援の再折りたたみは切断点
ジスルフィドの効率的形成を可能にするところまで進行する前に中断されるとい
う可能性も少なくとも同程度に考えられる。
活性が大幅に強まったが、これはα197/ω198断片対を加えれば10断片対中8断片
対となる。この10断片対は3群に分類されよう。第1群は2個の陰性対を含む。第2
群はジスルフィドとfos-jun相互作用を合わせた場合に限って活性化される3個の
対を含む。いずれの場合でも、プレーティング効率は25μg/mlアンピシリン上で
少なくとも10%、活性化指数は少なくとも1000である。第3群はいずれも分子のC
末端側3分の1内の切断点に由来する5個の対を含み、fos-junだけでも中程度〜強
度の活性を生み出すが、fos-junとジスルフィドの両方を合わせると強力な活性
を生み出す。何よりも重要なのは、5対中4対がジスルフィドだけでは選択可能な
活性を示さない、したがってそれらの活性化指数はきわめて大きいという点にあ
る。最大活性化指数を示すのはP145/N175で、その値は100 μg/mlアンピシリン
上で〜107である。最大活性を示すのはG253/K254で、プレーティング効率は400
μg/mlアンピシリン上で>25%ある。興味深いことに、切断点ジスルフィドだけで
強い選択可能活性を生み出す対は、相互作用依存性の活性化を示すことが最初に
判明した断片対、すなわちα197/ω198にとどまっている。何対かの活性化は切
断点システインと内部システインの間での混合ジスルフィド形成によって阻害さ
れている可能性があるし、またそうした阻害は外来還元剤によって緩和されうる
という可能性もある。しかし、これらの場合には無支援の再折りたたみは切断点
ジスルフィドの効率的形成を可能にするところまで進行する前に中断されるとい
う可能性も少なくとも同程度に考えられる。
【００７２】
【表５】
【００７３】a
断片対はTG1細胞中で発現させ、1 mM IPTGの存在下、アンピシリン上にプレ
ートした。断片対の発現では切断点末端チオール(S-S)を付ける場合と付けない
場合があり、また切断点末端fos(α)またはjun(ω)ヘリックスを付ける場合と付
けない場合があった。b 活性は25 μg/mlアンピシリン(25amp)上のプレーティング効率(細胞当たりコ
ロニー数)で表示している。-, <10-4; +/-, 0.01; +, 0.1; ++, 0.25; +++, 0.5
0; ++++, >0.90.c HiAmpは、断片対発現細胞が>10%効率でプレートする場合の最高アンピシリン
濃度(μg/ml)を表す。
ートした。断片対の発現では切断点末端チオール(S-S)を付ける場合と付けない
場合があり、また切断点末端fos(α)またはjun(ω)ヘリックスを付ける場合と付
けない場合があった。b 活性は25 μg/mlアンピシリン(25amp)上のプレーティング効率(細胞当たりコ
ロニー数)で表示している。-, <10-4; +/-, 0.01; +, 0.1; ++, 0.25; +++, 0.5
0; ++++, >0.90.c HiAmpは、断片対発現細胞が>10%効率でプレートする場合の最高アンピシリン
濃度(μg/ml)を表す。
【００７４】
最高の活性を生み出した断片対が最高の活性化指数を示した断片対と同じでは
なくその逆もまた真であったという事実は、用途が異なればそれに最も適した断
片対も異なることを示唆する。たとえば、106以上の非相互作用断片対をバック
グラウンドに天然相互作用を検出しなければならない細胞内相互作用マッピング
では活性化指数のほうが最大活性よりも重要である。したがって細胞内相互作用
マッピングにはP174/N175が最適の断片対であろう。他方、in vitro用途では活
性化標的リガンドがつねに律速因子であろうから、活性化指数よりも最大活性の
ほうが重要である。活性を最大化するには、リガンド用として断片をそのKds値
の10倍過剰量使用すればすむので、活性化指数はSN比100に対して1000で十分で
ある。したがって、バイオセンサーや均質検定などのようなin vitro用途にはG2
53/K254が最適の断片対であろう。
なくその逆もまた真であったという事実は、用途が異なればそれに最も適した断
片対も異なることを示唆する。たとえば、106以上の非相互作用断片対をバック
グラウンドに天然相互作用を検出しなければならない細胞内相互作用マッピング
では活性化指数のほうが最大活性よりも重要である。したがって細胞内相互作用
マッピングにはP174/N175が最適の断片対であろう。他方、in vitro用途では活
性化標的リガンドがつねに律速因子であろうから、活性化指数よりも最大活性の
ほうが重要である。活性を最大化するには、リガンド用として断片をそのKds値
の10倍過剰量使用すればすむので、活性化指数はSN比100に対して1000で十分で
ある。したがって、バイオセンサーや均質検定などのようなin vitro用途にはG2
53/K254が最適の断片対であろう。
【００７５】
切断点ジスルフィドは相互作用依存性酵素断片対相補システムの重大な欠点を
克服する。そうしたシステムが広範囲にわたるタンパク質-タンパク質相互作用
により効率的に活性化されうることは、ハイスループット用途にはきわめて重要
である。言い換えると、偽陰性率を極力低く抑えるには、単一の、天然に形成さ
れるタンパク質ドメインのサイズ範囲内の、すなわちアミノ酸数〜100ないし300
の長さ範囲の2タンパク質または断片間の相互作用によってシステムを活性化し
うるのでなければならない。このサイズ範囲内の球状タンパク質は半径が〜30な
いし50Åである。これはリンカー結合点の間隔が最大で100Åになりうることを
意味するが、断片の切断点が一つになりうるためにはこの距離をリンカーで橋渡
ししなければならない。(Gly4Ser)3リンカーが選ばれたのはこうした理由による
。これは、十分な延長性と柔軟性を備え、また〜60Åの長さをもち、したがって
折りたたみ時に切断点末端の十分な接近を可能にする最高120Åの結合長さをも
たらすものと期待される。それにもかかわらず、活性コンホメーションの安定性
はきわめて微妙であり、一般に異種相互作用の立体的な大きさに反比例すると見
るのが相当である。したがって、今日までに記載されているこの種のあらゆるシ
ステムに関しては、リンカーが長ければ長いほど、再折りたたみに対応しうる相
互作用の比率は高まりうるが、活性コンホメーションの安定化に対する相互作用
の寄与は低下しうると想定されよう。
克服する。そうしたシステムが広範囲にわたるタンパク質-タンパク質相互作用
により効率的に活性化されうることは、ハイスループット用途にはきわめて重要
である。言い換えると、偽陰性率を極力低く抑えるには、単一の、天然に形成さ
れるタンパク質ドメインのサイズ範囲内の、すなわちアミノ酸数〜100ないし300
の長さ範囲の2タンパク質または断片間の相互作用によってシステムを活性化し
うるのでなければならない。このサイズ範囲内の球状タンパク質は半径が〜30な
いし50Åである。これはリンカー結合点の間隔が最大で100Åになりうることを
意味するが、断片の切断点が一つになりうるためにはこの距離をリンカーで橋渡
ししなければならない。(Gly4Ser)3リンカーが選ばれたのはこうした理由による
。これは、十分な延長性と柔軟性を備え、また〜60Åの長さをもち、したがって
折りたたみ時に切断点末端の十分な接近を可能にする最高120Åの結合長さをも
たらすものと期待される。それにもかかわらず、活性コンホメーションの安定性
はきわめて微妙であり、一般に異種相互作用の立体的な大きさに反比例すると見
るのが相当である。したがって、今日までに記載されているこの種のあらゆるシ
ステムに関しては、リンカーが長ければ長いほど、再折りたたみに対応しうる相
互作用の比率は高まりうるが、活性コンホメーションの安定化に対する相互作用
の寄与は低下しうると想定されよう。
【００７６】
切断点ジスルフィドはこの限界を克服する。というのは、もしもリンカーが十
分に長ければ切断点ジスルフィドは再折りたたみ時に容易に形成され、これがい
ったん形成されてしまえば、再構成された酵素の比活性は異種相互作用の立体的
な大きさには依存せず、そればかりか相互作用の継続的な完全性を必要ともしな
くなるはずだからである。したがって、切断点ジスルフィドは一方向スイッチと
して働き、活性化エネルギーを広範囲の異種相互作用から受け取り、相互作用因
子の適正折りたたみ能と切断点システインの十分な接近を可能にするリンカーの
長さだけに制限される。これには、天然相互作用のより大きな部分による選択可
能活性の生成を可能にする2つの重要な帰結が伴う。すなわち、より長いリンカ
ーが使えるうえに、それ自体では弱すぎて選択可能な酵素活性を支えきれないよ
うな相互作用でも「ジスルフィドスイッチを入れて」選択可能な活性を生じさせ
るようにすることができる。 実施例6 ペプチド増進断片相補 相互作用依存性酵素断片相補を増進する別の方法は、短いランダムペプチド配
列を切断点に導入し、次いでモデル相互作用を用いて活性の上昇を指標に選択す
るというものである。こうしたペプチド依存型の増進にはいくつかの機構が考え
られる。たとえば、ペプチドは互いのまたは酵素自体との相互作用により、再構
成された酵素の活性コンホメーションを安定化させるという可能性があるし、あ
るいはペプチドは断片対の一方または両方を安定化させ、それによって断片濃度
を高めて定常活性を増進させるという可能性がある。
分に長ければ切断点ジスルフィドは再折りたたみ時に容易に形成され、これがい
ったん形成されてしまえば、再構成された酵素の比活性は異種相互作用の立体的
な大きさには依存せず、そればかりか相互作用の継続的な完全性を必要ともしな
くなるはずだからである。したがって、切断点ジスルフィドは一方向スイッチと
して働き、活性化エネルギーを広範囲の異種相互作用から受け取り、相互作用因
子の適正折りたたみ能と切断点システインの十分な接近を可能にするリンカーの
長さだけに制限される。これには、天然相互作用のより大きな部分による選択可
能活性の生成を可能にする2つの重要な帰結が伴う。すなわち、より長いリンカ
ーが使えるうえに、それ自体では弱すぎて選択可能な酵素活性を支えきれないよ
うな相互作用でも「ジスルフィドスイッチを入れて」選択可能な活性を生じさせ
るようにすることができる。 実施例6 ペプチド増進断片相補 相互作用依存性酵素断片相補を増進する別の方法は、短いランダムペプチド配
列を切断点に導入し、次いでモデル相互作用を用いて活性の上昇を指標に選択す
るというものである。こうしたペプチド依存型の増進にはいくつかの機構が考え
られる。たとえば、ペプチドは互いのまたは酵素自体との相互作用により、再構
成された酵素の活性コンホメーションを安定化させるという可能性があるし、あ
るいはペプチドは断片対の一方または両方を安定化させ、それによって断片濃度
を高めて定常活性を増進させるという可能性がある。
【００７７】
合成オリゴヌクレオチドを使用して、3つのランダム化残基を各断片の切断点
残基と異種ドメイン用リンカーの間に付加した。モデル相互作用として、ω198
のN末端のc-foxヘリックスとα197のC末端のc-junヘリックスを使用した。各ラ
ンダム化位置には、最強の電荷-電荷相互作用を助長する荷電残基に偏ったアミ
ノ酸の部分集合をコードする縮重コドンを使用した。VRKコドンでは第1文字位置
にc、aまたはgが、第2文字位置にaまたはgが、第3文字位置にtまたはgがそれぞ
れ入る。コード化されているアミノ酸はHis、Gln、Arg、Asn、Lys、Ser、Asp、G
luおよびGlyである。両断片中の３つのランダム化位置には合計126=3×106の可
能なコドンの組み合わせが、また96=5.3×105の可能な異なるアミノ酸配列が対
応する。まず、1万クローンのライブラリーをアンピシリン上に、その濃度を順
次高めながら、コロニーがまったく回収されなくなるまでプレートしていった。
DH5α株で800 μg/mlアンピシリンから6つのクローンが回収され、6つともfos-j
un相互作用に対する厳密な増殖依存性を示した。実際、同じ出発104クローンの
ライブラリーでα197からjunヘリックスを除去し、これらのクローンを同濃度の
アンピシリン上にプレートしていっても200 μg/mlアンピシリン上で数コロニー
が出現しただけで、それより高い濃度ではコロニーがまったく出現しなかった。
この程度のアンピシリン耐性はfos-jun相互作用だけで生み出される耐性に相当
する。
残基と異種ドメイン用リンカーの間に付加した。モデル相互作用として、ω198
のN末端のc-foxヘリックスとα197のC末端のc-junヘリックスを使用した。各ラ
ンダム化位置には、最強の電荷-電荷相互作用を助長する荷電残基に偏ったアミ
ノ酸の部分集合をコードする縮重コドンを使用した。VRKコドンでは第1文字位置
にc、aまたはgが、第2文字位置にaまたはgが、第3文字位置にtまたはgがそれぞ
れ入る。コード化されているアミノ酸はHis、Gln、Arg、Asn、Lys、Ser、Asp、G
luおよびGlyである。両断片中の３つのランダム化位置には合計126=3×106の可
能なコドンの組み合わせが、また96=5.3×105の可能な異なるアミノ酸配列が対
応する。まず、1万クローンのライブラリーをアンピシリン上に、その濃度を順
次高めながら、コロニーがまったく回収されなくなるまでプレートしていった。
DH5α株で800 μg/mlアンピシリンから6つのクローンが回収され、6つともfos-j
un相互作用に対する厳密な増殖依存性を示した。実際、同じ出発104クローンの
ライブラリーでα197からjunヘリックスを除去し、これらのクローンを同濃度の
アンピシリン上にプレートしていっても200 μg/mlアンピシリン上で数コロニー
が出現しただけで、それより高い濃度ではコロニーがまったく出現しなかった。
この程度のアンピシリン耐性はfos-jun相互作用だけで生み出される耐性に相当
する。
【００７８】
意外にも、DH5αから回収された6つの選択クローンはみな同じトリペプチド、
Gly-Arg-Glu(GRE)をもち、またそれぞれが異なるωトリペプチドをもっていた。
ωトリペプチドを除去しても、著しい活性の低下は見られなかった。これは断片
相補を増進するGRE配列の能力がωトリペプチドの存在に依存しないことを示唆
した。したがって、GREαトリペプチドが相互作用依存活性の著しい増進をもた
らしたことになるが、それは相互作用に取って代わりうるものではない。実際、
相互作用がなければGREトリペプチドはバッググラウンドを高めるようにはまっ
たく見受けられないので、それ自体は再折りたたみを加速したり折りたたまれた
複合体を安定化したりはしない。GREトリペプチドの効果として最もありそうな
のは、無構造の凝集に伴う断片の喪失を妨げてα197断片を安定化させる効果で
ある。ω198断片はきわめて安定であるが、α197は安定性にやや劣るため、後者
が断片相補を制限すると見込まれる。したがって、α197の安定化とそれに伴う
濃度の上昇は相互作用依存酵素の定常活性を高めることになろう。GREトリペプ
チドはα197の凝集を阻害する可能性があるものの、断片複合体の再折りたたみ
を妨げなかったように見受けられる。凝集体の形成は急激に進むため、分子間会
合速度定数の小幅なシフトに対しこの上なく敏感である(Dobson, Trends Bioche
m Sci (1999) 24:329)。したがって、係留トリペプチドの相互作用表面に対する
弱い結合でさえも、分子間凝集をうまく克服することができよう。しかし、相補
断片が協調的な折りたたみによって活性複合体を形成すると、弱く結合したトリ
ペプチドはその結合部位から簡単に引き剥がされよう。これは出現途上の本来の
コンホメーション内で双方が隔てられるようになり、立体歪みを起こすからであ
る。係留小ペプチドがより大きなタンパク質をタンパク質の折りたたみを妨げる
ことなく安定化させうる訳はこのように理解されよう。
Gly-Arg-Glu(GRE)をもち、またそれぞれが異なるωトリペプチドをもっていた。
ωトリペプチドを除去しても、著しい活性の低下は見られなかった。これは断片
相補を増進するGRE配列の能力がωトリペプチドの存在に依存しないことを示唆
した。したがって、GREαトリペプチドが相互作用依存活性の著しい増進をもた
らしたことになるが、それは相互作用に取って代わりうるものではない。実際、
相互作用がなければGREトリペプチドはバッググラウンドを高めるようにはまっ
たく見受けられないので、それ自体は再折りたたみを加速したり折りたたまれた
複合体を安定化したりはしない。GREトリペプチドの効果として最もありそうな
のは、無構造の凝集に伴う断片の喪失を妨げてα197断片を安定化させる効果で
ある。ω198断片はきわめて安定であるが、α197は安定性にやや劣るため、後者
が断片相補を制限すると見込まれる。したがって、α197の安定化とそれに伴う
濃度の上昇は相互作用依存酵素の定常活性を高めることになろう。GREトリペプ
チドはα197の凝集を阻害する可能性があるものの、断片複合体の再折りたたみ
を妨げなかったように見受けられる。凝集体の形成は急激に進むため、分子間会
合速度定数の小幅なシフトに対しこの上なく敏感である(Dobson, Trends Bioche
m Sci (1999) 24:329)。したがって、係留トリペプチドの相互作用表面に対する
弱い結合でさえも、分子間凝集をうまく克服することができよう。しかし、相補
断片が協調的な折りたたみによって活性複合体を形成すると、弱く結合したトリ
ペプチドはその結合部位から簡単に引き剥がされよう。これは出現途上の本来の
コンホメーション内で双方が隔てられるようになり、立体歪みを起こすからであ
る。係留小ペプチドがより大きなタンパク質をタンパク質の折りたたみを妨げる
ことなく安定化させうる訳はこのように理解されよう。
【００７９】
同じランダムトリペプチドライブラリーをTG1株内のfos/jun依存性アンピシリ
ン耐性を指標にしてスクリーニングすると、400 μg/mlアンピシリン上で5クロ
ーンが回収された。fos-jun相互作用だけだとTG1細胞は50 μg/ml長のアンピシ
リン濃度ではプレートしないであろう。こうして前と同様、fos-jun相互作用だ
けで生み出されるアンピシリン耐性を大幅に向上させるトリペプチドが選択され
た。今回は4種類のαトリペプチドが回収されたが、それぞれが異なるωトリペ
プチドを伴った。 対 α ω FHT400-1A1, -1B1 HSE(cat agt gag) REQ(cgg gag cag) FHT400-2A1, -2B1 NGR(aat egg cgg) QGN(cag ggt aat) FHT400-4A1, -4B1 GER(ggt cgg gag) DGR(gat ggg agg) FHT400-9A1, -9B1 EKR(gag aag cgt) GRR(ggt agg agg) FHT400-10A2, -10B1 NGR(aat ggg cgg) GNS(ggt aat agt) GREはやはりαトリペプチドライブラリーから選択された。NGRはαトリペプチ
ドライブラリーから2回選択され、2つの異なるωトリペプチドを伴った。いずれ
の場合にも、活性化はfos-jun相互作用に依存し続けた。しかし、元のGREトリペ
プチドとは異なり、いずれの場合もα、ω両トリペプチドの存在下で活性が増進
された。GREトリペプチドの活性さえもω断片上のDGRトリペプチドによって増進
された。また、断片はある程度の互換性があった。種々のαトリペプチドを種々
のωトリペプチドと対にすることができた。増進され活性がなお異種相互作用に
依存していたという事実は、ペプチドの主要な効果が、最終断片複合体の生成よ
りもむしろ結合相手の断片の凝集からの保護であったことを示唆する。前者は異
種相互作用とは無関係に、構成的活性を付与するものと見込まれよう。
ン耐性を指標にしてスクリーニングすると、400 μg/mlアンピシリン上で5クロ
ーンが回収された。fos-jun相互作用だけだとTG1細胞は50 μg/ml長のアンピシ
リン濃度ではプレートしないであろう。こうして前と同様、fos-jun相互作用だ
けで生み出されるアンピシリン耐性を大幅に向上させるトリペプチドが選択され
た。今回は4種類のαトリペプチドが回収されたが、それぞれが異なるωトリペ
プチドを伴った。 対 α ω FHT400-1A1, -1B1 HSE(cat agt gag) REQ(cgg gag cag) FHT400-2A1, -2B1 NGR(aat egg cgg) QGN(cag ggt aat) FHT400-4A1, -4B1 GER(ggt cgg gag) DGR(gat ggg agg) FHT400-9A1, -9B1 EKR(gag aag cgt) GRR(ggt agg agg) FHT400-10A2, -10B1 NGR(aat ggg cgg) GNS(ggt aat agt) GREはやはりαトリペプチドライブラリーから選択された。NGRはαトリペプチ
ドライブラリーから2回選択され、2つの異なるωトリペプチドを伴った。いずれ
の場合にも、活性化はfos-jun相互作用に依存し続けた。しかし、元のGREトリペ
プチドとは異なり、いずれの場合もα、ω両トリペプチドの存在下で活性が増進
された。GREトリペプチドの活性さえもω断片上のDGRトリペプチドによって増進
された。また、断片はある程度の互換性があった。種々のαトリペプチドを種々
のωトリペプチドと対にすることができた。増進され活性がなお異種相互作用に
依存していたという事実は、ペプチドの主要な効果が、最終断片複合体の生成よ
りもむしろ結合相手の断片の凝集からの保護であったことを示唆する。前者は異
種相互作用とは無関係に、構成的活性を付与するものと見込まれよう。
【００８０】
GREトリペプチドはまた、トランス形α197を安定化させることも判明した。α
197-fosおよびjun-ω198の各融合体をE. coliペリプラズム内で、Gly4Serリンカ
ーを介してチオレドキシンのN末端に融合させたGREトリペプチドと同時発現させ
ると細胞は50 μg/mlアンピシリン上で100%の効率でプレートしたが、α197-fos
およびjun-ω198融合体を単独でGRE-trxA融合体なしで、または異なるトリペプ
チド-trxA融合体と共に発現する細胞は50 μg/mlアンピシリン上で〜1%の効率で
プレートしたにすぎない。GRE-trxA融合体は相互作用ヘリックスの存在下ではア
ンピシリン耐性をまったく付与しなかったので、それは再折りたたみ後の断片複
合体を安定化させるのではなく、むしろα197断片を安定化させるに違いない。
というのは、活性は可溶性α197の量によって制限されるからである。GREトリペ
プチドは異なる担体を使用した場合でも同じ安定化効果をα197に及ぼすので、
その活性はコンテキスト独立であるに違いない。したがって、ランダム配列ライ
ブラリーから選択されたトリペプチドで18kDaの酵素断片を少なくとも100倍安定
化させることが可能であろう。係留トリペプチドの場合と同様に、この遊離GRE
トリペプチドは断片複合体の再折りたたみを妨げる風もなくα197の凝集を阻害
することができたであろう。しかしこの場合、トリペプチドの置換は、構造エレ
メントの互いに対する相対的な有効分子内濃度がトリペプチド濃度よりもずっと
高かったであろうという事情によって大いに助長されたであろう。このようにし
て、トランス形の大きなタンパク質を安定化させるという小さなペプチドの一般
的な能力が理解されよう。この現象は広く理解されているわけではなく、実際こ
れは、トリペプチドほどの小さなものによって機能タンパク質が巧みに安定化さ
れうることの最初の例示かもしれない。 実施例7 突然変異増進断片相補 βラクタマーゼ断片を安定化し、もってTEM-1α197/ω198複合体の相互作用依
存性の活性および活性化指数の両方を高めるという能力は、断片の不安定性が大
きなネックとなるβラクタマーゼ断片相補のin vitro用途には大いに役立つはず
である。したがって、ランダム突然変異誘発および選択によって同等のα197断
片安定化が実現可能かどうかを見極めることがきわめて重要であった。これを検
定するために、誤りがちのPCR (Cadwell and Joyce, 1995, supra)によってα19
7コード配列に突然変異を誘発した。CadwellとJoyceのPCR条件は鋳型とのミスマ
ッチを偏りなく引き起こすことにより〜150ヌクレオチドごとに1回の割合で突然
変異を誘発する。α197コード配列は実際には長さが約520ヌクレオチドであり、
〜75%の突然変異がコード化されたアミノ酸に変化をもたらすので、生成される
コード変化は分子当たり3未満となるはずである。α197突然変異体ライブラリー
の約108クローンを収集し、junヘリックス融合体として野生型ω198のfosヘリッ
クスと同時発現させた。突然変異を誘発させたα197-jun融合体はpAE1ベクター
から発現させ、またfos-ω198融合体はpAO1ファスミドベクターから誘発させた(
図6参照)。DH5α株を用いて両構築体を同時発現させ、600 μg/mlアンピシリン
の存在下でコロニーを回収した。回収した3クローンのうち2クローン(FI600-1お
よび-3)は配列決定してみると、2つのコード突然変異K55E (aag→gag)およびM18
2T (atg→acg)をもつ同じ配列であった。第3のクローン(FI600-4)もまた2つのコ
ード突然変異をもち、うち1つは他の2クローンと共有されており(M182T)、もう1
つのP62S(ccc→tcc)は他クローンのもう一方の突然変異に最も近かった。
197-fosおよびjun-ω198の各融合体をE. coliペリプラズム内で、Gly4Serリンカ
ーを介してチオレドキシンのN末端に融合させたGREトリペプチドと同時発現させ
ると細胞は50 μg/mlアンピシリン上で100%の効率でプレートしたが、α197-fos
およびjun-ω198融合体を単独でGRE-trxA融合体なしで、または異なるトリペプ
チド-trxA融合体と共に発現する細胞は50 μg/mlアンピシリン上で〜1%の効率で
プレートしたにすぎない。GRE-trxA融合体は相互作用ヘリックスの存在下ではア
ンピシリン耐性をまったく付与しなかったので、それは再折りたたみ後の断片複
合体を安定化させるのではなく、むしろα197断片を安定化させるに違いない。
というのは、活性は可溶性α197の量によって制限されるからである。GREトリペ
プチドは異なる担体を使用した場合でも同じ安定化効果をα197に及ぼすので、
その活性はコンテキスト独立であるに違いない。したがって、ランダム配列ライ
ブラリーから選択されたトリペプチドで18kDaの酵素断片を少なくとも100倍安定
化させることが可能であろう。係留トリペプチドの場合と同様に、この遊離GRE
トリペプチドは断片複合体の再折りたたみを妨げる風もなくα197の凝集を阻害
することができたであろう。しかしこの場合、トリペプチドの置換は、構造エレ
メントの互いに対する相対的な有効分子内濃度がトリペプチド濃度よりもずっと
高かったであろうという事情によって大いに助長されたであろう。このようにし
て、トランス形の大きなタンパク質を安定化させるという小さなペプチドの一般
的な能力が理解されよう。この現象は広く理解されているわけではなく、実際こ
れは、トリペプチドほどの小さなものによって機能タンパク質が巧みに安定化さ
れうることの最初の例示かもしれない。 実施例7 突然変異増進断片相補 βラクタマーゼ断片を安定化し、もってTEM-1α197/ω198複合体の相互作用依
存性の活性および活性化指数の両方を高めるという能力は、断片の不安定性が大
きなネックとなるβラクタマーゼ断片相補のin vitro用途には大いに役立つはず
である。したがって、ランダム突然変異誘発および選択によって同等のα197断
片安定化が実現可能かどうかを見極めることがきわめて重要であった。これを検
定するために、誤りがちのPCR (Cadwell and Joyce, 1995, supra)によってα19
7コード配列に突然変異を誘発した。CadwellとJoyceのPCR条件は鋳型とのミスマ
ッチを偏りなく引き起こすことにより〜150ヌクレオチドごとに1回の割合で突然
変異を誘発する。α197コード配列は実際には長さが約520ヌクレオチドであり、
〜75%の突然変異がコード化されたアミノ酸に変化をもたらすので、生成される
コード変化は分子当たり3未満となるはずである。α197突然変異体ライブラリー
の約108クローンを収集し、junヘリックス融合体として野生型ω198のfosヘリッ
クスと同時発現させた。突然変異を誘発させたα197-jun融合体はpAE1ベクター
から発現させ、またfos-ω198融合体はpAO1ファスミドベクターから誘発させた(
図6参照)。DH5α株を用いて両構築体を同時発現させ、600 μg/mlアンピシリン
の存在下でコロニーを回収した。回収した3クローンのうち2クローン(FI600-1お
よび-3)は配列決定してみると、2つのコード突然変異K55E (aag→gag)およびM18
2T (atg→acg)をもつ同じ配列であった。第3のクローン(FI600-4)もまた2つのコ
ード突然変異をもち、うち1つは他の2クローンと共有されており(M182T)、もう1
つのP62S(ccc→tcc)は他クローンのもう一方の突然変異に最も近かった。
【００８１】
いずれの突然変異を発現する細胞も100 μg/mlアンピシリン上で>30%の効率で
プレートしたが、野生型α197を発現する細胞は100 μg/mlアンピシリン上では
細胞当たり<10-6コロニー／細胞で、また25 μg/mlアンピシリン上では〜30%で
プレートした。しかし、どちらの突然変異体でもプレーティング効率は異種相互
作用の不在下、すなわちjunヘリックスを除去した場合とまったく同じであるか
、それを上回った。さらに多くの突然変異を徹底的に調べても、相互作用依存活
性をもつ突然変異体は現れなかった。したがって、ランダムトリペプチドで得ら
れた、活性化が相互作用依存性を保ち続けるという結果とは大違いで、α197の
適応的突然変異は必ず相互作用依存性を解消していた。これは次のように理解さ
れよう。トリペプチドは凝集を不可逆的に妨げることにより断片を安定化した。
こうした不可逆性のゆえに、トリペプチドは折りたたみを妨げることなく凝集を
阻害することができる。しかし、突然変異はこの意味では不可逆的でない。凝集
が主に本来の折りたたみ接点の分子間形成に起因するとすれば、突然変異による
これらの接点の混乱は折りたたみを妨げると予想されるかもしれない。実際、活
性断片複合体の形成に必要とされる再折りたたみ過程を阻害することなしに突然
変異によって断片を安定させることは熱力学的に不可能であろう。というのは、
断片の本来状態の折りたたみは露出疎水性表面が大きすぎて安定し得ないからで
ある。したがって、突然変異は露出疎水性表面を最小限にするような代替折りた
たみを安定化させることによって断片を安定化させうるにすぎない。しかし、こ
れらの代替折りたたみは本来の折りたたみの経路が活性複合体へと進行する前に
ほどけなければならないが、この過程に要するエネルギーがけた外れに大きいの
であろう。
プレートしたが、野生型α197を発現する細胞は100 μg/mlアンピシリン上では
細胞当たり<10-6コロニー／細胞で、また25 μg/mlアンピシリン上では〜30%で
プレートした。しかし、どちらの突然変異体でもプレーティング効率は異種相互
作用の不在下、すなわちjunヘリックスを除去した場合とまったく同じであるか
、それを上回った。さらに多くの突然変異を徹底的に調べても、相互作用依存活
性をもつ突然変異体は現れなかった。したがって、ランダムトリペプチドで得ら
れた、活性化が相互作用依存性を保ち続けるという結果とは大違いで、α197の
適応的突然変異は必ず相互作用依存性を解消していた。これは次のように理解さ
れよう。トリペプチドは凝集を不可逆的に妨げることにより断片を安定化した。
こうした不可逆性のゆえに、トリペプチドは折りたたみを妨げることなく凝集を
阻害することができる。しかし、突然変異はこの意味では不可逆的でない。凝集
が主に本来の折りたたみ接点の分子間形成に起因するとすれば、突然変異による
これらの接点の混乱は折りたたみを妨げると予想されるかもしれない。実際、活
性断片複合体の形成に必要とされる再折りたたみ過程を阻害することなしに突然
変異によって断片を安定させることは熱力学的に不可能であろう。というのは、
断片の本来状態の折りたたみは露出疎水性表面が大きすぎて安定し得ないからで
ある。したがって、突然変異は露出疎水性表面を最小限にするような代替折りた
たみを安定化させることによって断片を安定化させうるにすぎない。しかし、こ
れらの代替折りたたみは本来の折りたたみの経路が活性複合体へと進行する前に
ほどけなければならないが、この過程に要するエネルギーがけた外れに大きいの
であろう。
【００８２】
ほとんどの凝集は折りたたみ経路内の、凝集を起こしやすい中間体によって促
進されるため、凝集速度はそうした化学種の寿命に比例する。前述の切断点ジス
ルフィドの効果は、断片が異種相互作用の不在下で会合と折りたたみの開始をな
しうるが、断片が何らかの理由で、たとえば異種相互作用によって、または切断
点ジスルフィドの形成によって、引き合わされないと、折りたたみ過程が中断さ
れることを示唆した。こうした条件を欠く場合には、折りたたみ完了前に断片が
解離する確率は折りたたみ速度に比例し、折りたたみ速度のほうは折りたたみ中
間体の寿命に比例する。したがって、突然変異による凝集阻害の機構として最も
ありうるのは折りたたみ中間体を不安定化させるような機構であるとすれば、こ
れは折りたたみを加速し、それによって折りたたみ完了前に断片解離が起こる確
率を小さくすることにもなろう。こうして、折りたたまれた複合体を安定させる
突然変異は断片を安定化させる突然変異よりも選択される可能性が大きいという
理由、および後者ではなく前者が構成的な相互作用依存活性を生じさせると見ら
れる理由が理解されよう。
進されるため、凝集速度はそうした化学種の寿命に比例する。前述の切断点ジス
ルフィドの効果は、断片が異種相互作用の不在下で会合と折りたたみの開始をな
しうるが、断片が何らかの理由で、たとえば異種相互作用によって、または切断
点ジスルフィドの形成によって、引き合わされないと、折りたたみ過程が中断さ
れることを示唆した。こうした条件を欠く場合には、折りたたみ完了前に断片が
解離する確率は折りたたみ速度に比例し、折りたたみ速度のほうは折りたたみ中
間体の寿命に比例する。したがって、突然変異による凝集阻害の機構として最も
ありうるのは折りたたみ中間体を不安定化させるような機構であるとすれば、こ
れは折りたたみを加速し、それによって折りたたみ完了前に断片解離が起こる確
率を小さくすることにもなろう。こうして、折りたたまれた複合体を安定させる
突然変異は断片を安定化させる突然変異よりも選択される可能性が大きいという
理由、および後者ではなく前者が構成的な相互作用依存活性を生じさせると見ら
れる理由が理解されよう。
【００８３】
クラスAペニシリナーゼ類の典型的なメンバーであるE. coli TEM-1βラクタマ
ーゼに関して、相補して活性酵素を形成しうるような断片をすでに特定したが、
それらの断片が相補して活性酵素を形成しうるのは、断片の「切断点」末端が、
互いに直接または好ましくは第2の分子を介して相互作用するようなタンパク質
または他の分子へと融合される場合であり、かつその場合に限られる。さらに、
本発明は新しい方法を、すなわち相互作用依存性相補をなしうる酵素断片を同定
し、切断点末端に融合された異種ドメインの相互作用に対する酵素断片活性の依
存性を付与するよう特に修飾するための方法を提供する。リガンド活性化または
相互作用活性化βラクタマーゼ類は、細菌のペリプラズム、細菌の細胞質、真核
細胞の細胞質またはin vitroなどを含む多数の場所で活性化することができる。
それらは、抗生物質、色原体、蛍光原体などのような多様な基質、さらにはβラ
クタムプロドラッグ、前駆抗生物質、前駆栄養素などに対し高活性であり、した
がって生死や発色の判別による陽性、陰性両方の選択に使用することができる。
βラクタマーゼ断片相補システムの効用は細胞表面受容体、抗体、および天然タ
ンパク質表面にディスプレーされるランダムペプチドの間の相互作用のモニタリ
ングですでに実証されている。 実施例8 ヒト末梢血リンパ球プロテオーム相互作用ライブラリー 循環免疫細胞の膜結合、分泌両タンパク質間の機能的相互作用は未発見のもの
も含めるときわめて多数にのぼる。たとえば、これまでに発見された150ほどのC
D抗原には機能やリガンドが未知のままのものもかなり多い(Ager et al., in Im
munology Today Immune Receptor Supplement, 2nd Ed. 1997)。さらに、組み合
わせの多いシグナル特異性の生成機構は、多数のシグナルタンパク質が多様な機
能的相互作用にかかわっていること、またそのうちの最もよく知られているタン
パク質にしてもリガンドや機能が未発見のままであることを示唆する。したがっ
て、免疫系循環細胞の細胞外プロテオームの機能的相互作用は、既存の相互作用
マッピング技術では容易に接近し得ない薬理学的標的の潜在的宝庫となっている
。このプロテオームは相互作用マッピング面での相互作用依存性βラクタマーゼ
断片相補システムの威力を実証するための比類ない機会を提供してくれる。多数
の重要な相互作用が未発見のままであるとはいえ、既知のものも多く、それによ
ってシステムの効率を測定することができるからである。
ーゼに関して、相補して活性酵素を形成しうるような断片をすでに特定したが、
それらの断片が相補して活性酵素を形成しうるのは、断片の「切断点」末端が、
互いに直接または好ましくは第2の分子を介して相互作用するようなタンパク質
または他の分子へと融合される場合であり、かつその場合に限られる。さらに、
本発明は新しい方法を、すなわち相互作用依存性相補をなしうる酵素断片を同定
し、切断点末端に融合された異種ドメインの相互作用に対する酵素断片活性の依
存性を付与するよう特に修飾するための方法を提供する。リガンド活性化または
相互作用活性化βラクタマーゼ類は、細菌のペリプラズム、細菌の細胞質、真核
細胞の細胞質またはin vitroなどを含む多数の場所で活性化することができる。
それらは、抗生物質、色原体、蛍光原体などのような多様な基質、さらにはβラ
クタムプロドラッグ、前駆抗生物質、前駆栄養素などに対し高活性であり、した
がって生死や発色の判別による陽性、陰性両方の選択に使用することができる。
βラクタマーゼ断片相補システムの効用は細胞表面受容体、抗体、および天然タ
ンパク質表面にディスプレーされるランダムペプチドの間の相互作用のモニタリ
ングですでに実証されている。 実施例8 ヒト末梢血リンパ球プロテオーム相互作用ライブラリー 循環免疫細胞の膜結合、分泌両タンパク質間の機能的相互作用は未発見のもの
も含めるときわめて多数にのぼる。たとえば、これまでに発見された150ほどのC
D抗原には機能やリガンドが未知のままのものもかなり多い(Ager et al., in Im
munology Today Immune Receptor Supplement, 2nd Ed. 1997)。さらに、組み合
わせの多いシグナル特異性の生成機構は、多数のシグナルタンパク質が多様な機
能的相互作用にかかわっていること、またそのうちの最もよく知られているタン
パク質にしてもリガンドや機能が未発見のままであることを示唆する。したがっ
て、免疫系循環細胞の細胞外プロテオームの機能的相互作用は、既存の相互作用
マッピング技術では容易に接近し得ない薬理学的標的の潜在的宝庫となっている
。このプロテオームは相互作用マッピング面での相互作用依存性βラクタマーゼ
断片相補システムの威力を実証するための比類ない機会を提供してくれる。多数
の重要な相互作用が未発見のままであるとはいえ、既知のものも多く、それによ
ってシステムの効率を測定することができるからである。
【００８４】
前述のように、真の相互作用を膨大な数の非相互作用タンパク質対から明確に
識別するうえでは活性化指数が相互作用依存性断片相補システムの最重要パラメ
ーターである。したがってこの用途には、切断点ジスルフィドを有するために〜
107という最高の活性化指数を示すTEM-1βラクタマーゼのP174/N175断片対(α17
4とω175)が使用されよう。それはまた比活性も堅固であるが、これは何らかの
断片安定化トリペプチドによりさらに向上させることがおそらく可能であろうか
ら、まずVRKまたはNNKトリペプチドライブラリーを発現ベクターの切断点システ
インとリンカーの間に挿入し(図6参照)、300〜800 μg/mlアンピシリン上での増
殖を指標に選択するとよい。活性化指数が犠牲にならない限り、断片安定化トリ
ペプチドにより付与される、より高い比活性は発現配列ライブラリー内の比較的
弱い、真の相互作用が選択可能な活性を付与することを可能にするはずである。
発現配列ライブラリーの質を最大限に高めるためには、完全長cDNAライブラリー
をまず正規化プロトコールにかけて、まれな配列と豊富な配列の頻度を正規化す
るとよい。次にこの正規化されたcDNAから、ランダムプライミングによるcDNAを
PCR法で調製し、>200塩基対の断片をサイズ選択して単一タンパク質ドメインの
サイズ以上の断片をコードする配列へとライブリーを濃縮する。最後に、このラ
イブラリーを折りたたみ選択プロトコールにかけて、正しい読み枠内に、かつ自
律折りたたみタンパク質ドメイン(AFD)と見当が合うように発現するコード配列
の側へと濃縮する。
識別するうえでは活性化指数が相互作用依存性断片相補システムの最重要パラメ
ーターである。したがってこの用途には、切断点ジスルフィドを有するために〜
107という最高の活性化指数を示すTEM-1βラクタマーゼのP174/N175断片対(α17
4とω175)が使用されよう。それはまた比活性も堅固であるが、これは何らかの
断片安定化トリペプチドによりさらに向上させることがおそらく可能であろうか
ら、まずVRKまたはNNKトリペプチドライブラリーを発現ベクターの切断点システ
インとリンカーの間に挿入し(図6参照)、300〜800 μg/mlアンピシリン上での増
殖を指標に選択するとよい。活性化指数が犠牲にならない限り、断片安定化トリ
ペプチドにより付与される、より高い比活性は発現配列ライブラリー内の比較的
弱い、真の相互作用が選択可能な活性を付与することを可能にするはずである。
発現配列ライブラリーの質を最大限に高めるためには、完全長cDNAライブラリー
をまず正規化プロトコールにかけて、まれな配列と豊富な配列の頻度を正規化す
るとよい。次にこの正規化されたcDNAから、ランダムプライミングによるcDNAを
PCR法で調製し、>200塩基対の断片をサイズ選択して単一タンパク質ドメインの
サイズ以上の断片をコードする配列へとライブリーを濃縮する。最後に、このラ
イブラリーを折りたたみ選択プロトコールにかけて、正しい読み枠内に、かつ自
律折りたたみタンパク質ドメイン(AFD)と見当が合うように発現するコード配列
の側へと濃縮する。
【００８５】
粗面小胞体膜に由来し、したがって分泌および膜タンパク質に対応するmRNAを
豊富に含む粗面ミクロソームを、ヒト血液プールに由来する非分画リンパ球から
ショ糖密度勾配沈降速度法で単離することになろう(Gaetani et al., Methods i
n Enzymology (1983) 96:3; Natzle et al., J Biol Chem (1986) 261:5575; Ko
pczynski et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:9973)。次いで、mRNAを粗面
ミクロソームから市販キット(たとえばPoly(A) Select; Promega, Inc., Madiso
n, WI)を用いて精製する。次いで、ランダムプライミングによるcDNAライブラリ
ーをRNA鋳型から作製し、一方向にクローニングする。第1鎖cDNAをAMV逆転写酵
素(RT)とランダム六量体プライマーで作製する(Sambrook et al., 1989, pp. 8.
11-8.21)。このプライマーはβラクタマーゼαおよびω融合体発現ベクターへの
連結に好都合な制限部位をもつユニーク5’末端付加基が収めてある。鋳型はAMV
RTのRNAseHで破壊し、また未使用プライマーはスパンカラムを使用して除去す
る。次に第2鎖を、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片および発現ベクターへの挿入
に好都合な制限部位をもつ別のユニーク5’末端付加基を収めたランダム六量体
プライマーで作製する。除プライマー後、cDNAを、各オリジナルプライマー上の
ユニーク配列だけに相当するプライマーを用いたPCRで増幅して(Dieffenbach an
d Dveksler, in PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press
, Cold Spring Harbor, NY, 1995)、大多数の増幅断片がE. coli内で正しい発現
方向をもつようにする。次に産物を、磁気ビーズ上に固定化した限定量のヒト・
ゲノムDNAとの完全ハイブリダイゼーションにより標準化する(Kopczyski et al.
, 1988, supra)。コード配列はゲノムDNA内で自然に標準化されるため、ゲノムD
NAハイブリッドから回収されるcDNAを標準化するのがよい。最終増幅後、PCR産
物をSephacryl S-400による遠心ゲルろ過でサイズ選択し、>〜200 bp断片を得る
。次いでcDNAを制限酵素で消化し、相互作用依存性βラクタマーゼα174および
ω175融合体発現ベクター(折りたたみ選択のために必要とされる若干の変更を除
けば、図6に示したものと本質的に同じ)へと連結させる。cDNAライブラリーの折
りたたみ選択および相互作用マッピングのためのベクターとプロトコールは図9
に示すとおりである。
豊富に含む粗面ミクロソームを、ヒト血液プールに由来する非分画リンパ球から
ショ糖密度勾配沈降速度法で単離することになろう(Gaetani et al., Methods i
n Enzymology (1983) 96:3; Natzle et al., J Biol Chem (1986) 261:5575; Ko
pczynski et al., Proc Natl Acad Sci (1998) 95:9973)。次いで、mRNAを粗面
ミクロソームから市販キット(たとえばPoly(A) Select; Promega, Inc., Madiso
n, WI)を用いて精製する。次いで、ランダムプライミングによるcDNAライブラリ
ーをRNA鋳型から作製し、一方向にクローニングする。第1鎖cDNAをAMV逆転写酵
素(RT)とランダム六量体プライマーで作製する(Sambrook et al., 1989, pp. 8.
11-8.21)。このプライマーはβラクタマーゼαおよびω融合体発現ベクターへの
連結に好都合な制限部位をもつユニーク5’末端付加基が収めてある。鋳型はAMV
RTのRNAseHで破壊し、また未使用プライマーはスパンカラムを使用して除去す
る。次に第2鎖を、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片および発現ベクターへの挿入
に好都合な制限部位をもつ別のユニーク5’末端付加基を収めたランダム六量体
プライマーで作製する。除プライマー後、cDNAを、各オリジナルプライマー上の
ユニーク配列だけに相当するプライマーを用いたPCRで増幅して(Dieffenbach an
d Dveksler, in PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press
, Cold Spring Harbor, NY, 1995)、大多数の増幅断片がE. coli内で正しい発現
方向をもつようにする。次に産物を、磁気ビーズ上に固定化した限定量のヒト・
ゲノムDNAとの完全ハイブリダイゼーションにより標準化する(Kopczyski et al.
, 1988, supra)。コード配列はゲノムDNA内で自然に標準化されるため、ゲノムD
NAハイブリッドから回収されるcDNAを標準化するのがよい。最終増幅後、PCR産
物をSephacryl S-400による遠心ゲルろ過でサイズ選択し、>〜200 bp断片を得る
。次いでcDNAを制限酵素で消化し、相互作用依存性βラクタマーゼα174および
ω175融合体発現ベクター(折りたたみ選択のために必要とされる若干の変更を除
けば、図6に示したものと本質的に同じ)へと連結させる。cDNAライブラリーの折
りたたみ選択および相互作用マッピングのためのベクターとプロトコールは図9
に示すとおりである。
【００８６】
折りたたみ選択の都合上、αおよびω融合体としてのライブラリー発現用両ベ
クターは相性の良いファスミドである。さらに、c-myc腫瘍遺伝子に由来する周
知の12量体(Hoogenboom et al, 1998, supra)などのようなペプチドエピトープ
タグがα融合体ベクター内のcDNAまたは発現配列(ES)ライブラリーのC末端に、
またω融合体ベクター内のESライブラリーのN末端にもコードされている。各融
合体ライブラリーは、他方のβラクタマーゼ断片に融合された抗myc 9E10 scFv(
Hoogenboom et al, 1998, supra)などのような抗タグscFvと同時発現させると、
正しい読み枠内に自律折りたたみドメイン(AFD)を発現するクローンの側へと濃
縮することができる。この選択の原理は、本来のコンホメーションへの折たたみ
が可能な断片に限りタグ-抗タグ相互作用によって促進される選択可能なレベル
のβラクタマーゼ断片相補を支えきれるだけの安定性を備えるというものである
。
クターは相性の良いファスミドである。さらに、c-myc腫瘍遺伝子に由来する周
知の12量体(Hoogenboom et al, 1998, supra)などのようなペプチドエピトープ
タグがα融合体ベクター内のcDNAまたは発現配列(ES)ライブラリーのC末端に、
またω融合体ベクター内のESライブラリーのN末端にもコードされている。各融
合体ライブラリーは、他方のβラクタマーゼ断片に融合された抗myc 9E10 scFv(
Hoogenboom et al, 1998, supra)などのような抗タグscFvと同時発現させると、
正しい読み枠内に自律折りたたみドメイン(AFD)を発現するクローンの側へと濃
縮することができる。この選択の原理は、本来のコンホメーションへの折たたみ
が可能な断片に限りタグ-抗タグ相互作用によって促進される選択可能なレベル
のβラクタマーゼ断片相補を支えきれるだけの安定性を備えるというものである
。
【００８７】
標準化されたcDNAライブラリーとベクターの連結産物は高電圧エレクトロポレ
ーションによりE. coli株TG1に導入し(Dower et al., Nucleic Acids Res (1988
) 16:6127)、さらにこれを、ライブラリーには少なくとも100倍過剰量の非AFDコ
ード化断片が見込まれるためノン相互作用因子は≦10-3の効率でプレートするこ
とが判明している最低アンピシリン濃度上にプレートする。α174/ω175システ
ムでは、推奨アンピシリン濃度は〜25 μg/mlであろう。PBL中で発現する分泌ま
たは膜タンパク質遺伝子が104を超える見込みは薄いし、発現可能なAFDの頻度は
遺伝子当たり10-2程度であろうから、発現可能なすべての細胞外AFDを確実に代
表させるためには、各ライブラリー107以上のクローンを収集するのがよい。
ーションによりE. coli株TG1に導入し(Dower et al., Nucleic Acids Res (1988
) 16:6127)、さらにこれを、ライブラリーには少なくとも100倍過剰量の非AFDコ
ード化断片が見込まれるためノン相互作用因子は≦10-3の効率でプレートするこ
とが判明している最低アンピシリン濃度上にプレートする。α174/ω175システ
ムでは、推奨アンピシリン濃度は〜25 μg/mlであろう。PBL中で発現する分泌ま
たは膜タンパク質遺伝子が104を超える見込みは薄いし、発現可能なAFDの頻度は
遺伝子当たり10-2程度であろうから、発現可能なすべての細胞外AFDを確実に代
表させるためには、各ライブラリー107以上のクローンを収集するのがよい。
【００８８】
標準化ESライブラリーをAFDコード化クローンの側へと濃縮し終えたら、ライ
ブラリーはヘルパーファージM13K07を用いて各ライブラリー108以上の細胞の高
多重度スーパー感染により糸状ファージとして再利用することができる(Sambroo
k et al., 1989, pp. 4.17- 4.19)。このライブラリーファージは浮遊培養で一
晩増殖させた後、培養液上清からポリエチレングリコール沈降法で回収し、リン
酸緩衝生理食塩水中で還元する。ライブリーファージストックは15%グリセロー
ル中に冷凍保存することができる。次いで、新鮮なE. coli TG1細胞を高多重度
の各ファージライブラリーで同時感染させ、システムの活性化指数が最大となる
ことが判明している濃度のアンピシリン上にプレートする。α174/ω175システ
ムでは、100 μg/mlアンピシリンが最適である。活性化指数が107以上、fos-jun
相互作用依存性プレーティング効率が50%以上となるからである。少なくとも101 4 形質転換単位の各融合ライブラリーファージを使用して、少なくとも1012 対数
増殖期TG1細胞に感染させて、各AFDライブラリーの106クローンの可能な対単位
組み合わせの大部分が選択前の二重感染細胞集合中に確実に存在するようにする
。109細胞／mlで1時間吸着後、細胞を洗浄し、新鮮培地に再懸濁させ、さらに1
時間静かに撹拌しながらインキュベートしてファスミド遺伝子を発現させるよう
にする。次いで細胞を濃縮し、1 mM IPTGと100μg/mlアンピシリンを加えた固形
LB培地入りの大型(150 mm径)ペトリ皿100個にプレートする。小分取量をクロラ
ムフェニコールおよびカナマイシン上にまき、同時形質転換体の数を求める。
ブラリーはヘルパーファージM13K07を用いて各ライブラリー108以上の細胞の高
多重度スーパー感染により糸状ファージとして再利用することができる(Sambroo
k et al., 1989, pp. 4.17- 4.19)。このライブラリーファージは浮遊培養で一
晩増殖させた後、培養液上清からポリエチレングリコール沈降法で回収し、リン
酸緩衝生理食塩水中で還元する。ライブリーファージストックは15%グリセロー
ル中に冷凍保存することができる。次いで、新鮮なE. coli TG1細胞を高多重度
の各ファージライブラリーで同時感染させ、システムの活性化指数が最大となる
ことが判明している濃度のアンピシリン上にプレートする。α174/ω175システ
ムでは、100 μg/mlアンピシリンが最適である。活性化指数が107以上、fos-jun
相互作用依存性プレーティング効率が50%以上となるからである。少なくとも101 4 形質転換単位の各融合ライブラリーファージを使用して、少なくとも1012 対数
増殖期TG1細胞に感染させて、各AFDライブラリーの106クローンの可能な対単位
組み合わせの大部分が選択前の二重感染細胞集合中に確実に存在するようにする
。109細胞／mlで1時間吸着後、細胞を洗浄し、新鮮培地に再懸濁させ、さらに1
時間静かに撹拌しながらインキュベートしてファスミド遺伝子を発現させるよう
にする。次いで細胞を濃縮し、1 mM IPTGと100μg/mlアンピシリンを加えた固形
LB培地入りの大型(150 mm径)ペトリ皿100個にプレートする。小分取量をクロラ
ムフェニコールおよびカナマイシン上にまき、同時形質転換体の数を求める。
【００８９】
各プレートには〜1010個の細胞がまかれるので、相互作用の頻度は十分に高く
プレートが過剰増殖になることもありうる。するとプレート当たりクローン数は
104以上となろう。この場合には選択されたクローンをすべて掻きとって回収し
、低密度に再プレートする必要があろう。大量のクローンが回収されるときは、
少なくとも100クローンをとにかく再プレートして、アンピシリンの散逸に起因
するバックグラウンド頻度を求めるのがよい。真の増殖クローンから各候補相互
作用因子を回収し、非選択パートナーとの相互作用を検定する。選択された対は
配列を決定し、BLAST検索により既知遺伝子との相同性を調べる(Altschul et al
., J Mol Biol (1990) 215: 403; Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997)
25:3389)。B細胞コアクチベーション抗原、CD40とそのT細胞リガンド、CD40L、
およびT細胞活性化抗原B7.1とB7.2およびそれらのリガンドCD28とCTLA4など、免
疫細胞の分泌および膜タンパク質間ではきわめて多数の相互作用がすでに知られ
ている。これらの既知相互では、標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションプローブを調製し、全相互作用ライブラリーのコロニーリフトをプローブ
して、期待される相互作用因子のどの程度の割合がライブラリーに代表されてい
るかを調べることができよう。陽性クローンに由来する相互作用パートナー配列
を回収し、相同性を調べて既知または新相互作用因子が検出されているかどうか
を判断することになろう。真の相互作用を発現するコロニーは増殖させ15%グリ
セロール中に−70℃でいつまでも保存し、いっそうの特性解明またはドラッグス
クリーニングなどへの使用に備えることができる。 実施例9 細胞内シグナル伝達バイオセンサーの構築 相互作用依存性βラクタマーゼ断片相補システムは、細胞内で自然に起きてい
るほぼ任意の翻訳後修飾による活性化または不活性化に適合させることができる
。結果として、それらは翻訳後修飾によって調節される任意のプロセスの活性を
モニターするバイオセンサーとして細胞内に展開されよう。そうしたプロセスの
大きな種類としてリン酸化調節シグナル伝達経路がある。細胞が遺伝子の発現を
加減することにより細胞外状態または伝令分子に応答するようなほとんどのプロ
セスではリン酸化調節中間体が必須成分となっている。細胞外シグナルに対する
細胞応答は一般に増殖、生存および分化へと三分類される。悪性形質転換の偏在
的な構成要素は増殖調節シグナルの解除であり、これにはしばしば生存シグナル
の解除も伴う。これはしばしば、リン酸化調節シグナル伝達因子の過剰発現、お
よびリン酸化依存性調節機能の突然変異による麻痺によって起こる。したがって
、大部分のいわゆる腫瘍遺伝子はリン酸化調節増殖シグナル伝達因子であり、が
ん細胞中で過剰発現または突然変異して構成的活性を生み出す。
プレートが過剰増殖になることもありうる。するとプレート当たりクローン数は
104以上となろう。この場合には選択されたクローンをすべて掻きとって回収し
、低密度に再プレートする必要があろう。大量のクローンが回収されるときは、
少なくとも100クローンをとにかく再プレートして、アンピシリンの散逸に起因
するバックグラウンド頻度を求めるのがよい。真の増殖クローンから各候補相互
作用因子を回収し、非選択パートナーとの相互作用を検定する。選択された対は
配列を決定し、BLAST検索により既知遺伝子との相同性を調べる(Altschul et al
., J Mol Biol (1990) 215: 403; Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997)
25:3389)。B細胞コアクチベーション抗原、CD40とそのT細胞リガンド、CD40L、
およびT細胞活性化抗原B7.1とB7.2およびそれらのリガンドCD28とCTLA4など、免
疫細胞の分泌および膜タンパク質間ではきわめて多数の相互作用がすでに知られ
ている。これらの既知相互では、標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションプローブを調製し、全相互作用ライブラリーのコロニーリフトをプローブ
して、期待される相互作用因子のどの程度の割合がライブラリーに代表されてい
るかを調べることができよう。陽性クローンに由来する相互作用パートナー配列
を回収し、相同性を調べて既知または新相互作用因子が検出されているかどうか
を判断することになろう。真の相互作用を発現するコロニーは増殖させ15%グリ
セロール中に−70℃でいつまでも保存し、いっそうの特性解明またはドラッグス
クリーニングなどへの使用に備えることができる。 実施例9 細胞内シグナル伝達バイオセンサーの構築 相互作用依存性βラクタマーゼ断片相補システムは、細胞内で自然に起きてい
るほぼ任意の翻訳後修飾による活性化または不活性化に適合させることができる
。結果として、それらは翻訳後修飾によって調節される任意のプロセスの活性を
モニターするバイオセンサーとして細胞内に展開されよう。そうしたプロセスの
大きな種類としてリン酸化調節シグナル伝達経路がある。細胞が遺伝子の発現を
加減することにより細胞外状態または伝令分子に応答するようなほとんどのプロ
セスではリン酸化調節中間体が必須成分となっている。細胞外シグナルに対する
細胞応答は一般に増殖、生存および分化へと三分類される。悪性形質転換の偏在
的な構成要素は増殖調節シグナルの解除であり、これにはしばしば生存シグナル
の解除も伴う。これはしばしば、リン酸化調節シグナル伝達因子の過剰発現、お
よびリン酸化依存性調節機能の突然変異による麻痺によって起こる。したがって
、大部分のいわゆる腫瘍遺伝子はリン酸化調節増殖シグナル伝達因子であり、が
ん細胞中で過剰発現または突然変異して構成的活性を生み出す。
【００９０】
Her-2/nue腫瘍遺伝子は185 kDaのＩ型膜貫通受容体チロシンキナーゼ、すなわ
ち表皮成長因子受容体(EGFR)ファミリーの一員である。この成長因子受容体は多
数の組織特に乳房の格別に侵襲性の上皮原性腺がんで過剰発現する。正常発現の
場合、Her-2/neuは他のEGFファミリー受容体と、増殖因子によって連結され異種
二量体を形成する。これは両受容体の細胞質ドメイン上の複数チロシンの交差リ
ン酸化を招く。Her-2/neu上のチロシン1068(Tyr1068)のリン酸化はホスホチロシ
ン結合補助タンパク質およびグアノシンヌクレオチド交換因子を介してp21rasの
活性化を、またしたがってMAPキナーゼカスケードを介して細胞分裂の活性化を
招く。Her-2/neuが十分に過剰発現すると、リガンド独立的なEGFR異種二量体化
のバックグラウンドレベルが、成長因子の不在下でも構成的細胞分裂シグナルを
維持するに足るレベルへと上昇し、特徴的に歯止めのない腫瘍細胞の増殖を招く
。したがって、Her-2/neuの活性化を、特に正常細胞中のEGFシグナルを遮断する
ことなく構成的シグナルを遮断しうるような形で、遮断しうるような薬剤の発見
に多大の関心が向けられている。
ち表皮成長因子受容体(EGFR)ファミリーの一員である。この成長因子受容体は多
数の組織特に乳房の格別に侵襲性の上皮原性腺がんで過剰発現する。正常発現の
場合、Her-2/neuは他のEGFファミリー受容体と、増殖因子によって連結され異種
二量体を形成する。これは両受容体の細胞質ドメイン上の複数チロシンの交差リ
ン酸化を招く。Her-2/neu上のチロシン1068(Tyr1068)のリン酸化はホスホチロシ
ン結合補助タンパク質およびグアノシンヌクレオチド交換因子を介してp21rasの
活性化を、またしたがってMAPキナーゼカスケードを介して細胞分裂の活性化を
招く。Her-2/neuが十分に過剰発現すると、リガンド独立的なEGFR異種二量体化
のバックグラウンドレベルが、成長因子の不在下でも構成的細胞分裂シグナルを
維持するに足るレベルへと上昇し、特徴的に歯止めのない腫瘍細胞の増殖を招く
。したがって、Her-2/neuの活性化を、特に正常細胞中のEGFシグナルを遮断する
ことなく構成的シグナルを遮断しうるような形で、遮断しうるような薬剤の発見
に多大の関心が向けられている。
【００９１】
Her-2/neuの活性化が遮断されるときに容易に検出可能、定量可能なシグナル
を生成するような細胞内バイオセンサーは、化学種ライブラリーのハイスループ
ットスクリーニングによる抗乳腫瘍効果をもつ化合物の検出に特に有効であろう
。そうしたバイオセンサーはβラクタマーゼ相補システムを用いて次のようにし
て用意されよう。受容体キナーゼのTyr1068基質に近接したHer-2/neuのC末端に
、フレキシブルリンカーを介してω断片を融合することができよう。次に、Tyr1
068が非リン酸化される場合に限って受容体のTyr1068領域に結合する、scFvまた
はVLなどのような結合タンパク質にα断片を融合させることができよう。Tyr106
8はHer-2/neu過剰発現細胞中では、特にEGFの存在下で大部分がリン酸化されて
いるため、βラクタマーゼの活性化は最小限に抑えられるよう。しかし、Her-2/
neu活性化阻害物質の存在下では非リン酸化Try1068の割合が上昇し、α-Tyr1068
バインダー融合体を受容体へと送り込み、そこでα-ω相補により細胞中のβラ
クタマーゼ活性が高まろう。βラクタマーゼの蛍光原基質が存在すれば、Her-2/
neu活性化阻害物質は蛍光の増大により数分足らずで容易に検出できよう。Tyr10
68の脱リン酸化はHer-2/neuキナーゼ活性の阻害に伴い急速に起こるためである
。
を生成するような細胞内バイオセンサーは、化学種ライブラリーのハイスループ
ットスクリーニングによる抗乳腫瘍効果をもつ化合物の検出に特に有効であろう
。そうしたバイオセンサーはβラクタマーゼ相補システムを用いて次のようにし
て用意されよう。受容体キナーゼのTyr1068基質に近接したHer-2/neuのC末端に
、フレキシブルリンカーを介してω断片を融合することができよう。次に、Tyr1
068が非リン酸化される場合に限って受容体のTyr1068領域に結合する、scFvまた
はVLなどのような結合タンパク質にα断片を融合させることができよう。Tyr106
8はHer-2/neu過剰発現細胞中では、特にEGFの存在下で大部分がリン酸化されて
いるため、βラクタマーゼの活性化は最小限に抑えられるよう。しかし、Her-2/
neu活性化阻害物質の存在下では非リン酸化Try1068の割合が上昇し、α-Tyr1068
バインダー融合体を受容体へと送り込み、そこでα-ω相補により細胞中のβラ
クタマーゼ活性が高まろう。βラクタマーゼの蛍光原基質が存在すれば、Her-2/
neu活性化阻害物質は蛍光の増大により数分足らずで容易に検出できよう。Tyr10
68の脱リン酸化はHer-2/neuキナーゼ活性の阻害に伴い急速に起こるためである
。
【００９２】
細胞内バイオセンサーでは最大活性と活性化指数の両方が重要であろう。しか
し、5つの最良TEM-1断片対のいずれについても活性化指数はほほ全面的にTyr対
ホスホTyrに関するバインダーの親和性の差に依存するとみられる。したがって
親和性が最も高い断片対、すなわちG253/K254(α253/ω254)が、特に細胞内用途
では切断点ジスルフィドが使用できないこともあって、選好されよう。α253/ω
254の細胞内活性は、もし望むなら、前述のように1つまたは2つの断片安定化ト
リペプチドを選ぶことによって高めることも可能であろう。
し、5つの最良TEM-1断片対のいずれについても活性化指数はほほ全面的にTyr対
ホスホTyrに関するバインダーの親和性の差に依存するとみられる。したがって
親和性が最も高い断片対、すなわちG253/K254(α253/ω254)が、特に細胞内用途
では切断点ジスルフィドが使用できないこともあって、選好されよう。α253/ω
254の細胞内活性は、もし望むなら、前述のように1つまたは2つの断片安定化ト
リペプチドを選ぶことによって高めることも可能であろう。
【００９３】
Her-2/neu不活性化バイオセンサー開発の第一歩はTyr1068結合タンパク質を得
ることであろう。これは基質ペプチドのPVPEYINQSをチオレドキシンの活性部位
に挿入することにより可能となろう。この部位はG33とP34の間にあって、PGSGG
などのような短いリンカーに挟まれている。その目的は、ペプチドがその天然リ
ガンドであるGrb2 SH2ドメインに結合するうえで剛直な構造を必要としないこと
から、ペプチド上の構造的制約を最小限に抑えることにある。次いで、このTyr1
068 trxpepを (Gly4Ser)3リンカーでω254のN末端へと融合し、さらにE. coli T
G1細胞内で、α253のC末端に(Gly4Ser)3リンカーで融合された少なくとも108ク
ローンからなるscFvライブラリーと、または106クローンからなるVLライブラリ
ーと、同時発現させることができる。このTyr1068バインダーは哺乳類細胞の細
胞質中での展開を目的に選択されるため、選択をE. coli細胞質中で行うのは慎
重かもしれない。この目的のためには、図6のベクターを、シグナルペプチドを
除去したうえで使用することができよう。次に色原基質、たとえばニトロセフィ
ン (λmax=485 nm;ε=17,420 M-1 cm-1; McManus-Munoz and Crowder, Biochemi
stry (1999) 38:1547) などを用いてTyr1068を色によって選択することになろう
。106〜108個以上の形質転換体を中〜高度の厳密さで、たとえば逓減濃度の基質
上にプレートすることにより、親和性がマイクロモル以下のバインダーを特定す
ることが可能なはずである。というのは、Tyrは高親和性タンパク質-タンパク質
界面に最も普通に見られるアミノ酸だからである。そうした親和性はTyrとホス
ホTyrを最大限識別するのに望ましいであろう。選ばれたTyr1068バインダーはTy
rのリン酸化による阻害を検定しなければならない。これは、広域チロシンキナ
ーゼを過剰発現する同遺伝子型細胞(TKX1細胞; Stratagene, Inc., La Jolla, C
A)中でベクターを発現させることにより、容易に行うことができる。
ることであろう。これは基質ペプチドのPVPEYINQSをチオレドキシンの活性部位
に挿入することにより可能となろう。この部位はG33とP34の間にあって、PGSGG
などのような短いリンカーに挟まれている。その目的は、ペプチドがその天然リ
ガンドであるGrb2 SH2ドメインに結合するうえで剛直な構造を必要としないこと
から、ペプチド上の構造的制約を最小限に抑えることにある。次いで、このTyr1
068 trxpepを (Gly4Ser)3リンカーでω254のN末端へと融合し、さらにE. coli T
G1細胞内で、α253のC末端に(Gly4Ser)3リンカーで融合された少なくとも108ク
ローンからなるscFvライブラリーと、または106クローンからなるVLライブラリ
ーと、同時発現させることができる。このTyr1068バインダーは哺乳類細胞の細
胞質中での展開を目的に選択されるため、選択をE. coli細胞質中で行うのは慎
重かもしれない。この目的のためには、図6のベクターを、シグナルペプチドを
除去したうえで使用することができよう。次に色原基質、たとえばニトロセフィ
ン (λmax=485 nm;ε=17,420 M-1 cm-1; McManus-Munoz and Crowder, Biochemi
stry (1999) 38:1547) などを用いてTyr1068を色によって選択することになろう
。106〜108個以上の形質転換体を中〜高度の厳密さで、たとえば逓減濃度の基質
上にプレートすることにより、親和性がマイクロモル以下のバインダーを特定す
ることが可能なはずである。というのは、Tyrは高親和性タンパク質-タンパク質
界面に最も普通に見られるアミノ酸だからである。そうした親和性はTyrとホス
ホTyrを最大限識別するのに望ましいであろう。選ばれたTyr1068バインダーはTy
rのリン酸化による阻害を検定しなければならない。これは、広域チロシンキナ
ーゼを過剰発現する同遺伝子型細胞(TKX1細胞; Stratagene, Inc., La Jolla, C
A)中でベクターを発現させることにより、容易に行うことができる。
【００９４】
適当なリン酸塩感受性Tyr1068バインダーがひとたび特定されたら、α253-Tyr
1068バインダー融合体をpCMV-Tagベクター(TKX1細胞; Stratagene, Inc., La Jo
lla, CA)などのような哺乳類発現ベクターにサブクローニングして、哺乳類細胞
中でサイトメガロウィルスのプロモーターから発現させるようにする。
1068バインダー融合体をpCMV-Tagベクター(TKX1細胞; Stratagene, Inc., La Jo
lla, CA)などのような哺乳類発現ベクターにサブクローニングして、哺乳類細胞
中でサイトメガロウィルスのプロモーターから発現させるようにする。
【００９５】
ω254断片はTyr1068を含むHer-2/neu細胞質ドメインのC末端への融合体として
発現させなければならない。1210残基EGF受容体(Genbank登録no. X00588; Ullri
ch et al., Nature (1984) 309: 418))のコード配列が使用されることになろう
。これはHer-2/neuと操作上同じであり、またそのTyr1068は腫瘍細胞中の同じ過
剰発現および／または成長因子連結条件下でリン酸化されるからである。35残基
ω254βラクタマーゼ断片は、EGFRのC末端に(Gly4Ser)3リンカーで融合されると
、Tyr1068から152残基しか離れていないであろう。EGFR-ω254融合体とα253-Ty
r1068バインダー融合体はどちらもジシストロンmRNA由来の同じベクターから発
現させてもよい。これはinternal ribosome entry site (IRES; Martinez-Salas
, Cur Opin Biotechnol (1999) 10:458)を上流シストロンの終止コドンと下流シ
ストロンの開始コドンの間に挿入することにより実現される。これによって、両
タンパク質は同じmRNAから同時に作製できるようになろう。腫瘍細胞株へのベク
ターの導入はリポフェクションによって、リポフェクタミン(Gibco-BRL, Gaithe
rsburg, MD)を用いて説明書記載のプロトコールにしたがって行うことができる
。バイオセンサーの動作は一過性トランスフェクト細胞を使用して試験すること
ができ、動作すると判明した場合には、長期抗生物質耐性を指標にした選択によ
り安定した形質転換体を単離することができる。βラクタマーゼ活性の連続モニ
タリングには多様な自由拡散性色原および蛍光原基質が使用できる。操作上、ω
254断片はTyr1068の近くの受容体細胞質ドメインC末端の原形質膜に固定される
ことになり、またα253断片はTyr1068バインダー融合体として細胞質内に遊離す
ることになろう。市販のATP類似チロシンキナーゼ阻害物質は阻害物質選択用の
陽性対照として、また完全活性化EGFRから完全阻害EGFR間でのシグナル増分を求
めるために、使用することができる。 実施例10 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ用の断片相補システム 酵素断片相補システムは、多様な遺伝要素を同じ細胞または有機体に同時に組
み込む場合の選択にも有効である。たとえば、分泌性IgA抗体を植物に産生させ
るには4種類の遺伝子を同じ植物に導入する必要がある。実際的な理由から、こ
の場合は少なくとも2種類の、好ましくは３種類のDNA分子を導入する必要がある
。遺伝的に安定したトランスジェニック植物を作り出すためには、各DNA分子が
独自の選択マーカーを持たなければならない。同じ形質転換体にいくつもの抗生
物質選択システムを使用するのは煩わしいし非効率的でもある。総合的な偽陽性
率、偽陰性率は個別抗生物質の偽陽性率、偽陰性率の積として変動する傾向があ
るためである。したがって、単一抗生物質に対応する2ピースまたは３ピースの
断片相補システムのほうが多重抗生物質選択よりも明らかに有利である。
発現させなければならない。1210残基EGF受容体(Genbank登録no. X00588; Ullri
ch et al., Nature (1984) 309: 418))のコード配列が使用されることになろう
。これはHer-2/neuと操作上同じであり、またそのTyr1068は腫瘍細胞中の同じ過
剰発現および／または成長因子連結条件下でリン酸化されるからである。35残基
ω254βラクタマーゼ断片は、EGFRのC末端に(Gly4Ser)3リンカーで融合されると
、Tyr1068から152残基しか離れていないであろう。EGFR-ω254融合体とα253-Ty
r1068バインダー融合体はどちらもジシストロンmRNA由来の同じベクターから発
現させてもよい。これはinternal ribosome entry site (IRES; Martinez-Salas
, Cur Opin Biotechnol (1999) 10:458)を上流シストロンの終止コドンと下流シ
ストロンの開始コドンの間に挿入することにより実現される。これによって、両
タンパク質は同じmRNAから同時に作製できるようになろう。腫瘍細胞株へのベク
ターの導入はリポフェクションによって、リポフェクタミン(Gibco-BRL, Gaithe
rsburg, MD)を用いて説明書記載のプロトコールにしたがって行うことができる
。バイオセンサーの動作は一過性トランスフェクト細胞を使用して試験すること
ができ、動作すると判明した場合には、長期抗生物質耐性を指標にした選択によ
り安定した形質転換体を単離することができる。βラクタマーゼ活性の連続モニ
タリングには多様な自由拡散性色原および蛍光原基質が使用できる。操作上、ω
254断片はTyr1068の近くの受容体細胞質ドメインC末端の原形質膜に固定される
ことになり、またα253断片はTyr1068バインダー融合体として細胞質内に遊離す
ることになろう。市販のATP類似チロシンキナーゼ阻害物質は阻害物質選択用の
陽性対照として、また完全活性化EGFRから完全阻害EGFR間でのシグナル増分を求
めるために、使用することができる。 実施例10 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ用の断片相補システム 酵素断片相補システムは、多様な遺伝要素を同じ細胞または有機体に同時に組
み込む場合の選択にも有効である。たとえば、分泌性IgA抗体を植物に産生させ
るには4種類の遺伝子を同じ植物に導入する必要がある。実際的な理由から、こ
の場合は少なくとも2種類の、好ましくは３種類のDNA分子を導入する必要がある
。遺伝的に安定したトランスジェニック植物を作り出すためには、各DNA分子が
独自の選択マーカーを持たなければならない。同じ形質転換体にいくつもの抗生
物質選択システムを使用するのは煩わしいし非効率的でもある。総合的な偽陽性
率、偽陰性率は個別抗生物質の偽陽性率、偽陰性率の積として変動する傾向があ
るためである。したがって、単一抗生物質に対応する2ピースまたは３ピースの
断片相補システムのほうが多重抗生物質選択よりも明らかに有利である。
【００９６】
2断片システムでは、異種ドメインの相互作用に対する活性化の依存性は必要
でない。しかし、三重トランスジェニックスの同時選択では酵素断片対の相補は
遊離リガンド依存性の異種相互作用に依存しなければならない。これは前述のα
197-jun、scFv-ω198およびCD40-fosの三分子相互作用によるβラクタマーゼの
活性化の場合と似ている。これらの用途では、最重要パラメーターは再構成され
た酵素の最大活性であり、それは比活性と相補効率とに規定される。各断片は単
独では基本的に検出可能な活性を示さず、バックグラウンドがゼロになるため、
活性化指数は無関係である。したがって、細胞内活性の点で最適の断片対を確実
に回収するには、fosおよびjun相互作用因子を、切断点と(Gly4Ser)3リンカーの
間の挟んだトリペプチドライブラリーと共に使用するのがよい。トリペプチドラ
イブラリーは各断片に安定化ペプチドを供給して、最大比活性を示す断片に有利
な選択が行われるようにしよう。異種相互作用が必要とされない2形質選択(すな
わち二分子選択)用途では、突然変異誘発や折りたたみ加速突然変異の選択によ
り比活性をさらに高めてもよい。3形質選択用途では、選ばれた断片対について
異種相互作用への依存性を試験する必要があろう。この場合には、活性化指数が
ある程度重要になろうが、in vitro用途の場合と同様に、クリーンな選択には指
数値が1000程度で十分すぎるだろう。
でない。しかし、三重トランスジェニックスの同時選択では酵素断片対の相補は
遊離リガンド依存性の異種相互作用に依存しなければならない。これは前述のα
197-jun、scFv-ω198およびCD40-fosの三分子相互作用によるβラクタマーゼの
活性化の場合と似ている。これらの用途では、最重要パラメーターは再構成され
た酵素の最大活性であり、それは比活性と相補効率とに規定される。各断片は単
独では基本的に検出可能な活性を示さず、バックグラウンドがゼロになるため、
活性化指数は無関係である。したがって、細胞内活性の点で最適の断片対を確実
に回収するには、fosおよびjun相互作用因子を、切断点と(Gly4Ser)3リンカーの
間の挟んだトリペプチドライブラリーと共に使用するのがよい。トリペプチドラ
イブラリーは各断片に安定化ペプチドを供給して、最大比活性を示す断片に有利
な選択が行われるようにしよう。異種相互作用が必要とされない2形質選択(すな
わち二分子選択)用途では、突然変異誘発や折りたたみ加速突然変異の選択によ
り比活性をさらに高めてもよい。3形質選択用途では、選ばれた断片対について
異種相互作用への依存性を試験する必要があろう。この場合には、活性化指数が
ある程度重要になろうが、in vitro用途の場合と同様に、クリーンな選択には指
数値が1000程度で十分すぎるだろう。
【００９７】
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(NPTII; Genbank登録no. M77786)は
、ネオマイシンやカナマイシンなどのようなアミノグリコシド系抗生物質をATP
からのリン酸化により不活性化するE. coli由来のアミノ酸数267の酵素である。
NPTIIは動植物の細胞形質転換用選択マーカーとして広く使用されている。よっ
て、NTPII用の断片相補システムは多形質トランスジェニック動植物の容易な生
成には特に有効であろう。NPTIIの三次元構造は不明であり、既知構造との相同
性も低すぎて信頼性の高い予測はしにくい。しかし、前述のように、経験的に導
き出されたニユーラルネットアルゴリズムを使用すれば、任意のタンパク質配列
について二次構造と溶媒曝露をかなり正確に予測することができる。そうしたア
ルゴリズムのなかでも最も優れているのはRost and Sander (1993, 1994, supra
)のPredictProteinプログラムである。このプログラムをNPTIIのタンパク質配列
に適用すると、図10に示すような結果が得られた。配列のなかの10領域は二次構
造が乏しく、溶媒中に曝露する、したがって生産的断片化候補部位になると予測
された。これら10領域それぞれの中心での、または比較的長い領域では2つの等
間隔部位での切断に対応する断片対は適当なプライマーを用いてPCRで生成し、
図6に示すようなベクターにサブクローニングして、リンカーを介在させたfosお
よびjunヘリックス融合体として発現させることができよう。ベクターはシグナ
ルペプチドをコードしないという点で図6に示したものとは異なろうし、またpAO
1ベクターはカナマイシン耐性ではなくアンピシリン耐性をもつことになろう。
また、ベクターは酵素断片のクローニング部位と(Gly4Ser)3リンカーの間にVRK
またはNNKランダムトリペプチドコード化配列を含むのがよいであろう。
、ネオマイシンやカナマイシンなどのようなアミノグリコシド系抗生物質をATP
からのリン酸化により不活性化するE. coli由来のアミノ酸数267の酵素である。
NPTIIは動植物の細胞形質転換用選択マーカーとして広く使用されている。よっ
て、NTPII用の断片相補システムは多形質トランスジェニック動植物の容易な生
成には特に有効であろう。NPTIIの三次元構造は不明であり、既知構造との相同
性も低すぎて信頼性の高い予測はしにくい。しかし、前述のように、経験的に導
き出されたニユーラルネットアルゴリズムを使用すれば、任意のタンパク質配列
について二次構造と溶媒曝露をかなり正確に予測することができる。そうしたア
ルゴリズムのなかでも最も優れているのはRost and Sander (1993, 1994, supra
)のPredictProteinプログラムである。このプログラムをNPTIIのタンパク質配列
に適用すると、図10に示すような結果が得られた。配列のなかの10領域は二次構
造が乏しく、溶媒中に曝露する、したがって生産的断片化候補部位になると予測
された。これら10領域それぞれの中心での、または比較的長い領域では2つの等
間隔部位での切断に対応する断片対は適当なプライマーを用いてPCRで生成し、
図6に示すようなベクターにサブクローニングして、リンカーを介在させたfosお
よびjunヘリックス融合体として発現させることができよう。ベクターはシグナ
ルペプチドをコードしないという点で図6に示したものとは異なろうし、またpAO
1ベクターはカナマイシン耐性ではなくアンピシリン耐性をもつことになろう。
また、ベクターは酵素断片のクローニング部位と(Gly4Ser)3リンカーの間にVRK
またはNNKランダムトリペプチドコード化配列を含むのがよいであろう。
【００９８】
各断片用のPCR産物は部分消化し、適当なベクターに、すなわちα断片はpAE1
タイプのベクターに、またω断片はpAO1タイプのベクターに、それぞれ連結する
。連結産物を次に高電圧エレクトロポレーションでTG1細胞に導入し、クロラム
フェニコールまたはアンピシリン上にプレートする。各断片につき少なくとも10 4 の形質転換体を収集するのがよい。また、偽陽性を防ぐうえでも、最低定量選
択カナマイシン濃度を決めるうえでも、各断片ライブラリーのカナマイシン感受
性も求めるのがよい。これは単一断片プレーティング効率が<10-6となる濃度で
ある。断片安定化ペプチドの頻度がこの程度の低さだからである。各断片対がト
リペプチドライブラリーで完全にカバーされるようにするには〜108の同時形質
転換体が必要となろうから、定量的ファージ感染を用いて各断片対につき2ライ
ブラリーを結合するのがよい。これは前述のように、M13K07ヘルパーファージを
用いて(pAO1タイプのファスミドベクター内の)ω断片ライブラリーをファージと
して再利用することにより実現される。定量的感染を容易にするには、それぞれ
がα断片ライブラリーを収めた少なくとも109個の細胞に、それぞれが対応する
ω断片ライブラリーを収めた少なくとも1011個のファージを接種するのがよい。
浮遊培地中で1〜2時間静かに撹拌しながらファージの吸着、浸透および遺伝子の
発現を図ったうえで、各断片対の細胞を遠心分離し、洗浄し、最低定量選択カナ
マイシン濃度の固形LB培地を入れた10個の150 mm径皿にプレートする。
タイプのベクターに、またω断片はpAO1タイプのベクターに、それぞれ連結する
。連結産物を次に高電圧エレクトロポレーションでTG1細胞に導入し、クロラム
フェニコールまたはアンピシリン上にプレートする。各断片につき少なくとも10 4 の形質転換体を収集するのがよい。また、偽陽性を防ぐうえでも、最低定量選
択カナマイシン濃度を決めるうえでも、各断片ライブラリーのカナマイシン感受
性も求めるのがよい。これは単一断片プレーティング効率が<10-6となる濃度で
ある。断片安定化ペプチドの頻度がこの程度の低さだからである。各断片対がト
リペプチドライブラリーで完全にカバーされるようにするには〜108の同時形質
転換体が必要となろうから、定量的ファージ感染を用いて各断片対につき2ライ
ブラリーを結合するのがよい。これは前述のように、M13K07ヘルパーファージを
用いて(pAO1タイプのファスミドベクター内の)ω断片ライブラリーをファージと
して再利用することにより実現される。定量的感染を容易にするには、それぞれ
がα断片ライブラリーを収めた少なくとも109個の細胞に、それぞれが対応する
ω断片ライブラリーを収めた少なくとも1011個のファージを接種するのがよい。
浮遊培地中で1〜2時間静かに撹拌しながらファージの吸着、浸透および遺伝子の
発現を図ったうえで、各断片対の細胞を遠心分離し、洗浄し、最低定量選択カナ
マイシン濃度の固形LB培地を入れた10個の150 mm径皿にプレートする。
【００９９】
37℃で一晩増殖させてから、すべてのカナマイシン耐性コロニーを集めて、逓
増濃度のカナマイシン上に再プレートして、最高レベルのカナマイシン耐性を示
すトリペプチド／断片対の組み合わせを特定する。最も活性の高いクローンを対
象に必要な数だけ、fos-jun相互作用に対する活性の依存性を試験するのがよい
。これは、この目的のために含めた遺伝子構築体中の部位を部分消化してヘリッ
クスのうちの1つを除去することにより、最も簡単に行うことができる。その後
、部分消化産物は再連結しTG1細胞に再導入しカナマイシン上に再プレートする
。前述のように、活性化指数は1000でも十分すぎるので、指数が1000以上の最も
活性が高い対が最適であろう。細胞質内の三分子活性化では、2つの異種二量体
化ヘリックス対を、たとえば前述のようなfosおよびjunに由来する平行結合ヘリ
ックスや酵母DNAトポイソメラーゼII(TopII; Berger et al., Nature (1996) 37
9: 225)に由来する逆平行結合ヘリックスを都合よく使用することができよう。
各ヘリックス対の一方はNPTII断片と融合させ、他の2ヘリックスは互いに融合さ
せて、２ヘリックス融合体が三分子複合体を形成するために存在するときだけNP
TII断片が引き合わされるようにする。たとえば、α-TopIIN融合体とfos-ω融合
体はjun-TopIIC融合体によってだけ引き合わされ、活性化されることができる。
そこで、3融合体のそれぞれをコードする遺伝子を、目的遺伝子をもコードする3
種類のDNA構築体に分配することができよう。こうして、真核細胞を3種類の構築
体の混合物によって形質転換し、また単一抗生物質上での増殖を指標とする選択
により同じ細胞内に3種類の遺伝子すべてが同時に存在するものを選択すること
ができる。 実施例11 標的活性化酵素プロドラッグ療法 抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT)は、酵素の触媒能を利用して腫瘍特異
抗体の細胞傷害性標的化能を増幅する有力な抗がん化学療法である。酵素は腫瘍
特異抗体の接合体として投与されると腫瘍部位で濃縮される。未結合接合体が循
環系から排出された後、腫瘍結合酵素により活性化されるまでは比較的無害であ
るプロドラッグが投与されようが、それに伴い細胞傷害性産物が主要部位に集積
し、薬剤の非経口投与によっては過剰傷害性を伴わずに達成することが不可能な
濃度になる。βラクタマーゼなどのような酵素はこれまで腫瘍標的化抗体と化学
的または遺伝子工学的に接合させ、セファロスポリンマスタードやアントラサイ
クリンなどのようなβラクタム誘導体の抗腫瘍薬と併用されてきた。しかしADEP
Tの有効性は未結合接合体を循環系から排出した後でプロドラッグを投与しなけ
ればならないという事情によって限定される。プロドラッグの全身性活性化によ
り許容レベルの傷害性が生み出される下限にまで循環接合体が減少する頃には、
腫瘍から多量の接合体が失われているため、有効性はしばしば大幅に低下する。
増濃度のカナマイシン上に再プレートして、最高レベルのカナマイシン耐性を示
すトリペプチド／断片対の組み合わせを特定する。最も活性の高いクローンを対
象に必要な数だけ、fos-jun相互作用に対する活性の依存性を試験するのがよい
。これは、この目的のために含めた遺伝子構築体中の部位を部分消化してヘリッ
クスのうちの1つを除去することにより、最も簡単に行うことができる。その後
、部分消化産物は再連結しTG1細胞に再導入しカナマイシン上に再プレートする
。前述のように、活性化指数は1000でも十分すぎるので、指数が1000以上の最も
活性が高い対が最適であろう。細胞質内の三分子活性化では、2つの異種二量体
化ヘリックス対を、たとえば前述のようなfosおよびjunに由来する平行結合ヘリ
ックスや酵母DNAトポイソメラーゼII(TopII; Berger et al., Nature (1996) 37
9: 225)に由来する逆平行結合ヘリックスを都合よく使用することができよう。
各ヘリックス対の一方はNPTII断片と融合させ、他の2ヘリックスは互いに融合さ
せて、２ヘリックス融合体が三分子複合体を形成するために存在するときだけNP
TII断片が引き合わされるようにする。たとえば、α-TopIIN融合体とfos-ω融合
体はjun-TopIIC融合体によってだけ引き合わされ、活性化されることができる。
そこで、3融合体のそれぞれをコードする遺伝子を、目的遺伝子をもコードする3
種類のDNA構築体に分配することができよう。こうして、真核細胞を3種類の構築
体の混合物によって形質転換し、また単一抗生物質上での増殖を指標とする選択
により同じ細胞内に3種類の遺伝子すべてが同時に存在するものを選択すること
ができる。 実施例11 標的活性化酵素プロドラッグ療法 抗体指定酵素プロドラッグ療法(ADEPT)は、酵素の触媒能を利用して腫瘍特異
抗体の細胞傷害性標的化能を増幅する有力な抗がん化学療法である。酵素は腫瘍
特異抗体の接合体として投与されると腫瘍部位で濃縮される。未結合接合体が循
環系から排出された後、腫瘍結合酵素により活性化されるまでは比較的無害であ
るプロドラッグが投与されようが、それに伴い細胞傷害性産物が主要部位に集積
し、薬剤の非経口投与によっては過剰傷害性を伴わずに達成することが不可能な
濃度になる。βラクタマーゼなどのような酵素はこれまで腫瘍標的化抗体と化学
的または遺伝子工学的に接合させ、セファロスポリンマスタードやアントラサイ
クリンなどのようなβラクタム誘導体の抗腫瘍薬と併用されてきた。しかしADEP
Tの有効性は未結合接合体を循環系から排出した後でプロドラッグを投与しなけ
ればならないという事情によって限定される。プロドラッグの全身性活性化によ
り許容レベルの傷害性が生み出される下限にまで循環接合体が減少する頃には、
腫瘍から多量の接合体が失われているため、有効性はしばしば大幅に低下する。
【０１００】
この問題は、相互作用依存性βラクタマーゼ断片相補システムを腫瘍標的化抗
体と併用することによって克服されよう。βラクタマーゼの断片は、腫瘍マーカ
ー上の非重複エピトープを認識する一本鎖抗体断片(scFv)へと融合されると、腫
瘍へと局部集中し、βラクタムプロドラッグから高レベルの腫瘍局在細胞傷害性
を生み出すに足るβラクタマーゼ活性を腫瘍細胞表面で回復することができる。
こうしたシステムの大きな利点は、プロドラッグの活性化が全身循環ではあるい
は腫瘍マーカーと遭遇しないいかなる場所でも、起こり得ないため、プロドラッ
グを高用量のscFv-断片融合体と同時にでも、または断片の腫瘍負荷が最高とな
る時点ででも、完全に不活性である断片の循環濃度にはかまわず投与できるとい
う点にある。
体と併用することによって克服されよう。βラクタマーゼの断片は、腫瘍マーカ
ー上の非重複エピトープを認識する一本鎖抗体断片(scFv)へと融合されると、腫
瘍へと局部集中し、βラクタムプロドラッグから高レベルの腫瘍局在細胞傷害性
を生み出すに足るβラクタマーゼ活性を腫瘍細胞表面で回復することができる。
こうしたシステムの大きな利点は、プロドラッグの活性化が全身循環ではあるい
は腫瘍マーカーと遭遇しないいかなる場所でも、起こり得ないため、プロドラッ
グを高用量のscFv-断片融合体と同時にでも、または断片の腫瘍負荷が最高とな
る時点ででも、完全に不活性である断片の循環濃度にはかまわず投与できるとい
う点にある。
【０１０１】
例として、相互依存性βラクタマーゼ断片の、ヒト乳腫瘍マーカーHer-2/neu
上の非重複エピトープを巻き込むscFvとの融合体の構築と精製について説明する
。次いで、Her-2/neu発現SKOV3ヒト卵巣がん細胞の表面上でのβラクタマーゼ活
性回復の反応速度を求めることになろう。さらに最適負荷条件下で、種々のセフ
ァロスポリンプロドラッグについて細胞傷害を、in vivo律速因子であることが
知られている濃度の関数として評価することになろう。次いで、得られる腫瘍活
性化酵素プロドラッグ療法(TAcEPT)システムについて、重篤複合免疫不全(scid)
マウスのSKOV3および他Her-2/neu発現ヒト腫瘍を軽減する効能を試験する。シス
テムの有効性と安全性が動物モデルで実証されたならば、ヒト乳がん患者を対象
に毒性および有効性試験が開始されることになろう。
上の非重複エピトープを巻き込むscFvとの融合体の構築と精製について説明する
。次いで、Her-2/neu発現SKOV3ヒト卵巣がん細胞の表面上でのβラクタマーゼ活
性回復の反応速度を求めることになろう。さらに最適負荷条件下で、種々のセフ
ァロスポリンプロドラッグについて細胞傷害を、in vivo律速因子であることが
知られている濃度の関数として評価することになろう。次いで、得られる腫瘍活
性化酵素プロドラッグ療法(TAcEPT)システムについて、重篤複合免疫不全(scid)
マウスのSKOV3および他Her-2/neu発現ヒト腫瘍を軽減する効能を試験する。シス
テムの有効性と安全性が動物モデルで実証されたならば、ヒト乳がん患者を対象
に毒性および有効性試験が開始されることになろう。
【０１０２】
βラクタマーゼ断片相補システムの治療への使用に関する要件はin vito使用
一般の要件とほぼ同じである。最重要パラメーターは比活性と断片安定性であり
、1000を超える活性化指数は追加の有効性をほとんどもたらさない。したがって
、α253/ω254がこの用途での推奨断片対となろう。相互作用依存性の比活性が
最も高いし、断片安定性もほどほどであるし、また活性化指数も十分すぎるから
である。しかしα253断片の安定性はおそらく、あつらえの断片安定化トリペプ
チドによってさらに高めることができよう。したがって、腫瘍活性化システムの
設定に先立って、まずVRKまたはNNKトリペプチドライブラリーをコードする縮重
配列をα253発現構築体に切断点システインとリンカーの間でサブクローニング
してもよいかもしれない(図6のpAE1を参照)。次いで、少なくとも104個のライブ
ラリー形質転換体を400 μg/mlから1000 μg/mlまでの逓増アンピシリン上にプ
レートすることによりα253安定化トリペプチドを選択する。α253/ω254は400
μg/ml上で安定化ペプチドなしでも定量的にプレートするが、野生型TEM-1βラ
クタマーゼはこれらの条件で発現させると1000μg/ml超ではプレートしないから
である。 11a. TEM-1βラクタマーゼH25-G253(α253)およびK254-W288 (ω254)断片の、H
er-2/neuヒト乳腫瘍マーカー上の非重複エピトープに対するscFv融合体としての
発現 これらの断片の腫瘍活性化機構にはSchier et al.(Gene (1996) 169: 147)が
記載しているような2つのscFvが使用されよう。これはヒト非免疫レパートリー
のファージディスプレーライブラリー(Marks et al., 1991)から、Her-2/neuの
細胞外ドメイン(ED)を含む組み換え断片を使用したふるい分けで得られた。これ
ら2つのscFvは非重複エピトープを認識するように見受けられる。というのは、
これらはELISA法ではHer-2/neuEDへの結合で競合しないからである。これらのsc
Fvのうち一方の親和性はin vitroでサブナノモルKdへと高められたし(Schier et
al., 1996, supra)、他方についても同じ方法で同様の改善を図ることができた
(Balint and Larrick, Gene (1993) 137:109)。scFvのコード配列は図11に示す
ように、βラクタマーゼαおよびω融合体産生ベクター、pβlacαおよびpβlac
ωへとサブクローニングすることになろう。これらのベクターはpET26b (Novage
n)から得られるが、scFvとβラクタマーゼ断片配列の両方を挿入するのに好都合
な制限部位をもつ。各融合タンパク質は、lacリプレッサーの制御下に強いファ
ージT7プロモーターから誘導的に発現させる(IPTG)。各一次翻訳産物は、細菌ペ
リプラズム中への分泌のためのpelBシグナルペプチドおよび固定化金属イオンア
フィニティークロマトグラフィー(IMAC; Janknecht et al., Proc Natl Acad Sc
i (1991) 88: 8972)による浸透圧衝撃抽出物からのワンステップ精製のためのC
末端His6タグを含む。各融合タンパク質の収量は、主に誘導物質濃度と増殖温度
の操作により最適化することができる。
一般の要件とほぼ同じである。最重要パラメーターは比活性と断片安定性であり
、1000を超える活性化指数は追加の有効性をほとんどもたらさない。したがって
、α253/ω254がこの用途での推奨断片対となろう。相互作用依存性の比活性が
最も高いし、断片安定性もほどほどであるし、また活性化指数も十分すぎるから
である。しかしα253断片の安定性はおそらく、あつらえの断片安定化トリペプ
チドによってさらに高めることができよう。したがって、腫瘍活性化システムの
設定に先立って、まずVRKまたはNNKトリペプチドライブラリーをコードする縮重
配列をα253発現構築体に切断点システインとリンカーの間でサブクローニング
してもよいかもしれない(図6のpAE1を参照)。次いで、少なくとも104個のライブ
ラリー形質転換体を400 μg/mlから1000 μg/mlまでの逓増アンピシリン上にプ
レートすることによりα253安定化トリペプチドを選択する。α253/ω254は400
μg/ml上で安定化ペプチドなしでも定量的にプレートするが、野生型TEM-1βラ
クタマーゼはこれらの条件で発現させると1000μg/ml超ではプレートしないから
である。 11a. TEM-1βラクタマーゼH25-G253(α253)およびK254-W288 (ω254)断片の、H
er-2/neuヒト乳腫瘍マーカー上の非重複エピトープに対するscFv融合体としての
発現 これらの断片の腫瘍活性化機構にはSchier et al.(Gene (1996) 169: 147)が
記載しているような2つのscFvが使用されよう。これはヒト非免疫レパートリー
のファージディスプレーライブラリー(Marks et al., 1991)から、Her-2/neuの
細胞外ドメイン(ED)を含む組み換え断片を使用したふるい分けで得られた。これ
ら2つのscFvは非重複エピトープを認識するように見受けられる。というのは、
これらはELISA法ではHer-2/neuEDへの結合で競合しないからである。これらのsc
Fvのうち一方の親和性はin vitroでサブナノモルKdへと高められたし(Schier et
al., 1996, supra)、他方についても同じ方法で同様の改善を図ることができた
(Balint and Larrick, Gene (1993) 137:109)。scFvのコード配列は図11に示す
ように、βラクタマーゼαおよびω融合体産生ベクター、pβlacαおよびpβlac
ωへとサブクローニングすることになろう。これらのベクターはpET26b (Novage
n)から得られるが、scFvとβラクタマーゼ断片配列の両方を挿入するのに好都合
な制限部位をもつ。各融合タンパク質は、lacリプレッサーの制御下に強いファ
ージT7プロモーターから誘導的に発現させる(IPTG)。各一次翻訳産物は、細菌ペ
リプラズム中への分泌のためのpelBシグナルペプチドおよび固定化金属イオンア
フィニティークロマトグラフィー(IMAC; Janknecht et al., Proc Natl Acad Sc
i (1991) 88: 8972)による浸透圧衝撃抽出物からのワンステップ精製のためのC
末端His6タグを含む。各融合タンパク質の収量は、主に誘導物質濃度と増殖温度
の操作により最適化することができる。
【０１０３】
各scFvはα、ω両融合体として発現させて、どの配置が(1)最大結合親和性を
支え、(2)最大酵素活性を支え、また(3)最大収量を支えるかを見極めるようにす
ることができる。まず、発現を銀染色PAGEの判定基準により最適化することにな
ろう。次いで融合タンパク質をIMACで浸透圧衝撃抽出物 (Neu and Heppel, 1965
, supra) から精製するのがよいだろう。精製融合タンパク質は、Her-2/neu細胞
外ドメイン(ED)の安定化免疫グロブリンドメイン(Ig)に対する固定化組み換え融
合体に対する結合性が、ELISA法により抗His6タグ抗体(Qiagen)を用いて検定さ
れることになろう。精製融合タンパク質は次いで、固定化rc-Her-2/neu ED-Ig上
でのβラクタマーゼ活性の回復を、色原基質のニトロセフィン(λmax=485 nm;ε
=17,420 M-1 cm-1; McManus-Munoz and Crowder, 1999, supra)を用いて検定す
ることになろう。固定化BSAは陰性対照として用いられよう。 11b. 固定化組み換え抗原に対するβ-lacα/ω-scFv融合体の結合による特異的
βラクタマーゼ活性化の反応速度の決定 βラクタマーゼ活性は、固定化抗原に対する融合タンパク質結合の関数として
定量的に求めることができよう。この速度は次に、既存担体、すなわち抗体-β
ラクタマーゼ接合体と比較してどれだけの活性が腫瘍上に局在化されるかを示す
指標としての、同じscFvに融合された原型のβラクタマーゼで得られる値と比較
されよう。
支え、(2)最大酵素活性を支え、また(3)最大収量を支えるかを見極めるようにす
ることができる。まず、発現を銀染色PAGEの判定基準により最適化することにな
ろう。次いで融合タンパク質をIMACで浸透圧衝撃抽出物 (Neu and Heppel, 1965
, supra) から精製するのがよいだろう。精製融合タンパク質は、Her-2/neu細胞
外ドメイン(ED)の安定化免疫グロブリンドメイン(Ig)に対する固定化組み換え融
合体に対する結合性が、ELISA法により抗His6タグ抗体(Qiagen)を用いて検定さ
れることになろう。精製融合タンパク質は次いで、固定化rc-Her-2/neu ED-Ig上
でのβラクタマーゼ活性の回復を、色原基質のニトロセフィン(λmax=485 nm;ε
=17,420 M-1 cm-1; McManus-Munoz and Crowder, 1999, supra)を用いて検定す
ることになろう。固定化BSAは陰性対照として用いられよう。 11b. 固定化組み換え抗原に対するβ-lacα/ω-scFv融合体の結合による特異的
βラクタマーゼ活性化の反応速度の決定 βラクタマーゼ活性は、固定化抗原に対する融合タンパク質結合の関数として
定量的に求めることができよう。この速度は次に、既存担体、すなわち抗体-β
ラクタマーゼ接合体と比較してどれだけの活性が腫瘍上に局在化されるかを示す
指標としての、同じscFvに融合された原型のβラクタマーゼで得られる値と比較
されよう。
【０１０４】
まず、scFv-β-lac断片融合タンパク質の1つで抗原を飽和させるための条件を
確立する。マイクロタイタープレートの穴に抗原を塗布し、ELISA信号がプラト
ーに達するまで逓増量の第1 scFv断片融合体で浸漬していく。このレベルで、す
なわち第1融合タンパク質が飽和量に達したところで、逓増量の第2融合タンパク
質を加えていく。結合と洗浄が済んだら、過剰量のニトロセフィンとの30分間の
インキュベーション後にβラクタマーゼ活性を分光定量する。この検定法を3回
行えば、Vmaxは第2融合体の濃度のほぼ一次関数となるはずである。第2融合体の
量が増していくと、Vmaxはどこかで頭打ちになるはずである。第2融合体の結合
量はELISA法で求めることができるので、断片によって再構成されたβラクタマ
ーゼについての相対比活性(kcat rel)を計算することができよう。KMは飽和量の
抗原、飽和量の第1融合体および限定量の第2融合体からなる溶液で推定すること
ができよう。一連の濃度のニトロセフィンを加えて、485 nmでの吸光度の初期変
化率を第2融合対濃度の関数として測定する。あとは、標準回帰分析からKMを計
算することになろう。
確立する。マイクロタイタープレートの穴に抗原を塗布し、ELISA信号がプラト
ーに達するまで逓増量の第1 scFv断片融合体で浸漬していく。このレベルで、す
なわち第1融合タンパク質が飽和量に達したところで、逓増量の第2融合タンパク
質を加えていく。結合と洗浄が済んだら、過剰量のニトロセフィンとの30分間の
インキュベーション後にβラクタマーゼ活性を分光定量する。この検定法を3回
行えば、Vmaxは第2融合体の濃度のほぼ一次関数となるはずである。第2融合体の
量が増していくと、Vmaxはどこかで頭打ちになるはずである。第2融合体の結合
量はELISA法で求めることができるので、断片によって再構成されたβラクタマ
ーゼについての相対比活性(kcat rel)を計算することができよう。KMは飽和量の
抗原、飽和量の第1融合体および限定量の第2融合体からなる溶液で推定すること
ができよう。一連の濃度のニトロセフィンを加えて、485 nmでの吸光度の初期変
化率を第2融合対濃度の関数として測定する。あとは、標準回帰分析からKMを計
算することになろう。
【０１０５】
原型のβラクタマーゼと比較するには、原型βラクタマーゼの第2 scFvとの融
合体を調製することになろう。次いで、その逓増量を、前述のように第1融合体
で飽和させた抗原塗布穴に加えていく。この場合もやはり、Vmaxは原型βラクタ
マーゼ融合体の量のほぼ一次関数となり、飽和点で頭打ちとなるはずである。各
点で、ELISA法で定量される原型βラクタマーゼ融合体の結合量は第2断片融合体
の結合量に匹敵するはずであり、またVmax比は原型βラクタマーゼと再構成βラ
クタマーゼの比活性の比を反映するはずである。比較のために、再構成酵素のKM を前述の要領で推定するのがよい。TEM-1α253/ω254断片複合体の最大比活性(k cat )は原型酵素のそれと近いものになると見込まれる。KMもまた同程度であると
すれば、プロドラッグ活性化ピーク時の腫瘍上の活性は在来抗体-βラクタマー
ゼ融合体の場合の最高100倍になると期待されよう。ちなみに、在来融合体では
未結合融合体がプロドラッグの投与を可能にするレベルまで循環系から排除され
た時点での残存活性はピーク活性の1%以下であろう。 11c. セファロスポリンプロドラッグのscFv依存性β-lacα/ω活性化によるHer
-2/neu発現SKOV3卵巣がん細胞傷害反応速度の決定 次に、固定化抗原上でβラクタマーゼ最大比活性を生み出すようなscFv-βラ
クタマーゼ断片結合の配置について、Her-2/neu抗原を発現するヒト腫瘍細胞の
存在下でのβラクタマーゼ活性化が試験されることになろう。細胞傷害は図5に
示す3種類のセファロスポリンプロドラッグのいずれを使用して検定してもよい
。断片再構成活性がやはり、ただし今回の場合は腫瘍細胞障害に関して、原型β
ラクタマーゼ活性と比較されよう。得られる結果は、主要標的化βラクタマーゼ
の臨床前評価の次の段階となる動物で著しい抗腫瘍効果を示すために必要とされ
るような用量範囲を示唆するはずである。
合体を調製することになろう。次いで、その逓増量を、前述のように第1融合体
で飽和させた抗原塗布穴に加えていく。この場合もやはり、Vmaxは原型βラクタ
マーゼ融合体の量のほぼ一次関数となり、飽和点で頭打ちとなるはずである。各
点で、ELISA法で定量される原型βラクタマーゼ融合体の結合量は第2断片融合体
の結合量に匹敵するはずであり、またVmax比は原型βラクタマーゼと再構成βラ
クタマーゼの比活性の比を反映するはずである。比較のために、再構成酵素のKM を前述の要領で推定するのがよい。TEM-1α253/ω254断片複合体の最大比活性(k cat )は原型酵素のそれと近いものになると見込まれる。KMもまた同程度であると
すれば、プロドラッグ活性化ピーク時の腫瘍上の活性は在来抗体-βラクタマー
ゼ融合体の場合の最高100倍になると期待されよう。ちなみに、在来融合体では
未結合融合体がプロドラッグの投与を可能にするレベルまで循環系から排除され
た時点での残存活性はピーク活性の1%以下であろう。 11c. セファロスポリンプロドラッグのscFv依存性β-lacα/ω活性化によるHer
-2/neu発現SKOV3卵巣がん細胞傷害反応速度の決定 次に、固定化抗原上でβラクタマーゼ最大比活性を生み出すようなscFv-βラ
クタマーゼ断片結合の配置について、Her-2/neu抗原を発現するヒト腫瘍細胞の
存在下でのβラクタマーゼ活性化が試験されることになろう。細胞傷害は図5に
示す3種類のセファロスポリンプロドラッグのいずれを使用して検定してもよい
。断片再構成活性がやはり、ただし今回の場合は腫瘍細胞障害に関して、原型β
ラクタマーゼ活性と比較されよう。得られる結果は、主要標的化βラクタマーゼ
の臨床前評価の次の段階となる動物で著しい抗腫瘍効果を示すために必要とされ
るような用量範囲を示唆するはずである。
【０１０６】
ヒト卵巣腺がん細胞のSK-OV-3株(ATCC)を、10%ウシ胎仔血清(FCS)を混ぜたDul
becco最小必須培地の6穴組織培養プレートに、1穴当たり3×105細胞まいて、37
℃、10% CO2条件下で密集増殖させる。両Her-2/neuエピトープの細胞上での可飽
和性を求めるには、ニトロセフィンの加水分解後に分光定量される、各scFvに融
合された原型βラクタマーゼの逓増量を用いる。次に、断片再構成酵素のVmaxを
、細胞上で、飽和量の両融合体とニトロセフィンを用いて定量する。それは、原
型βラクタマーゼの最大活性と固定化組み換え抗原上で観測されるVmax比とに基
づく予想活性と一致するものと見込まれよう。図5に示す3種類のプロドラッグの
うち任意のものに対する細胞の感受性は、本質的にMarais et al. (Cancer Rese
arch (1996) 56:4735)が記載している要領で、飽和条件下の原型βラクタマーゼ
-scFv融合体およびα/ω断片-scFv融合体を用いて、また用いないで、求められ
よう。プロドラッグは使用直前にDMSOに溶かし、一連の濃度へとDMEN/FCSで希釈
する。各穴に1 mlを加え、細胞を一晩インキュベートする。次いで、細胞を洗浄
しトリプシン処理して、色素排除試験で生存度を判定する。次に分取量を新しい
皿にまく。4日間増殖させた後に、細胞の生存度を、酸不溶性物質の液体シンチ
レーションカウンティングで決められる[3H]チミジンの組み込みによって評価す
る。結果は未処置対照細胞のパーセンテージで表示する。この場合もまた、βラ
クタマーゼ断片システムをもつプロドラッグの相対的な細胞傷害性を原型βラク
タマーゼ融合体のそれと、特に二次速度定数(kcat/KM)が重要であるような低プ
ロドラッグ濃度で比較し、in vivoでTAcEPTの有効性を在来ADEPTに比して高めら
れる余地を示すことができよう。
becco最小必須培地の6穴組織培養プレートに、1穴当たり3×105細胞まいて、37
℃、10% CO2条件下で密集増殖させる。両Her-2/neuエピトープの細胞上での可飽
和性を求めるには、ニトロセフィンの加水分解後に分光定量される、各scFvに融
合された原型βラクタマーゼの逓増量を用いる。次に、断片再構成酵素のVmaxを
、細胞上で、飽和量の両融合体とニトロセフィンを用いて定量する。それは、原
型βラクタマーゼの最大活性と固定化組み換え抗原上で観測されるVmax比とに基
づく予想活性と一致するものと見込まれよう。図5に示す3種類のプロドラッグの
うち任意のものに対する細胞の感受性は、本質的にMarais et al. (Cancer Rese
arch (1996) 56:4735)が記載している要領で、飽和条件下の原型βラクタマーゼ
-scFv融合体およびα/ω断片-scFv融合体を用いて、また用いないで、求められ
よう。プロドラッグは使用直前にDMSOに溶かし、一連の濃度へとDMEN/FCSで希釈
する。各穴に1 mlを加え、細胞を一晩インキュベートする。次いで、細胞を洗浄
しトリプシン処理して、色素排除試験で生存度を判定する。次に分取量を新しい
皿にまく。4日間増殖させた後に、細胞の生存度を、酸不溶性物質の液体シンチ
レーションカウンティングで決められる[3H]チミジンの組み込みによって評価す
る。結果は未処置対照細胞のパーセンテージで表示する。この場合もまた、βラ
クタマーゼ断片システムをもつプロドラッグの相対的な細胞傷害性を原型βラク
タマーゼ融合体のそれと、特に二次速度定数(kcat/KM)が重要であるような低プ
ロドラッグ濃度で比較し、in vivoでTAcEPTの有効性を在来ADEPTに比して高めら
れる余地を示すことができよう。
【０１０７】
本書で述べた諸々の出版物および特許出願は本発明が関係している分野におけ
る当業者の技術水準を示す。それら諸々の出版物および特許出願は、あたかも個
別に参照指示により本書に組み込まれる旨を断っているかのごとく、参照指示に
より本書に組み込まれる。
る当業者の技術水準を示す。それら諸々の出版物および特許出願は、あたかも個
別に参照指示により本書に組み込まれる旨を断っているかのごとく、参照指示に
より本書に組み込まれる。
【０１０８】
本発明について十二分に説明したいま、本発明には、添付請求項の精神または
範囲から逸脱することなく多数の変更や修飾を加えうることが当業者には自明で
あろう。
範囲から逸脱することなく多数の変更や修飾を加えうることが当業者には自明で
あろう。
【図１】
相互作用依存性酵素会合(IdEA)の機構。相互作用依存性断片相補は酵素αおよ
びω断片を必要とするが、これらの断片は、その末端に融合した異種ドメインの
相互作用によって引き合わされる場合に限って再折りたたみにより活性酵素を形
成することができる。
びω断片を必要とするが、これらの断片は、その末端に融合した異種ドメインの
相互作用によって引き合わされる場合に限って再折りたたみにより活性酵素を形
成することができる。
【図２】
成熟型TEM-1βラクタマーゼおよびコード化アミノ酸配列に対応するヌクレオ
チドコード配列(Sutcliffe, Proc Natl Acad Sci (1978) 75:3737)。プラスミド
pBR322 (SYNPBR322)、Genbank登録no. J01749より。残基Asn52/Ser53、Glu63/Gl
u64、Gln99/Asn100、Pro174/Asn175、Glu197/Leu198、Lys215/Val216、Ala227/G
ly228およびGly253/Lys254にαおよびω断片の間の切断点を示す。
チドコード配列(Sutcliffe, Proc Natl Acad Sci (1978) 75:3737)。プラスミド
pBR322 (SYNPBR322)、Genbank登録no. J01749より。残基Asn52/Ser53、Glu63/Gl
u64、Gln99/Asn100、Pro174/Asn175、Glu197/Leu198、Lys215/Val216、Ala227/G
ly228およびGly253/Lys254にαおよびω断片の間の切断点を示す。
【図３】
成熟TEM-1βラクタマーゼの三次元構造。Jelsch et al. (Proteins Struct Fu
nct (1993) 16:364ff)のX線結晶構造の模式図であり、赤と青のべた塗りリボン
はそれぞれαヘリックスとβシートを示す。分子はツードメイン(α-ωおよびμ
)構造を強調するような向きにしてある。活性部位の求核試薬Ser70は棒球モデル
で示す。
nct (1993) 16:364ff)のX線結晶構造の模式図であり、赤と青のべた塗りリボン
はそれぞれαヘリックスとβシートを示す。分子はツードメイン(α-ωおよびμ
)構造を強調するような向きにしてある。活性部位の求核試薬Ser70は棒球モデル
で示す。
【図４】
断片相補によるβラクタマーゼの相互作用依存性活性化の三次元模式図。AP-1
転写アクチベーターのfosおよびjunサブユニットに由来する異種二量体化ヘリッ
クスの相互作用によりTEM-1α197およびω198断片が結合すると、両断片は活性
コンホメーションの酵素への再折りたたみが可能になる(図3と比較せよ)。
転写アクチベーターのfosおよびjunサブユニットに由来する異種二量体化ヘリッ
クスの相互作用によりTEM-1α197およびω198断片が結合すると、両断片は活性
コンホメーションの酵素への再折りたたみが可能になる(図3と比較せよ)。
【図５】
いくつかの抗がん剤とそのセファロスポリンプロドラッグの構造。YW-200およ
びYW-285はDNA結合トリインドールおよびそのセファロスポリンプロドラッグで
ある(Wang et al., 1998; USP 5,843,937)。
びYW-285はDNA結合トリインドールおよびそのセファロスポリンプロドラッグで
ある(Wang et al., 1998; USP 5,843,937)。
【図６】
断片相補による相互作用依存性βラクタマーゼ活性化のためのTEM-1βラクタ
マーゼのα197およびω198断片への融合体としての異種タンパク質発現のための
ベクターと戦略。ベクターpAO1はジシストロン転写産物からω198融合体および
遊離型リガンドを発現させるための高コピーpUC119系プラスミドであり、高多重
度感染による宿主細胞への定量的導入用のファージとして再利用できる。ベクタ
ーpAE1は、pAO1ベクターからの発現レベルと同等以上のレベルでα197融合体を
発現させるための強いプロモーターを備えた低コピーp15Aレプリコンである。Tr
xpepsはチオレドキシンの活性部位に挿入された12-量体ペプチドである。Tripep
-trxライブラリーはチオレドキシンN末端のランダムトリペプチドであり、介在G
ly4Serリンカーを備える。scFvは一本鎖抗体Fv断片。LC-CH1はH鎖とL鎖第1定常
領域から成る抗体断片。VLは抗体L鎖可変領域。lac promはラクトースオペロン
プロモーター。SPはシグナルペプチド。(Gly4Ser)3はフレキシブル15-量体リン
カー。pUC oriとp15A oriはプラスミドの複製起点。fl oriは線状ファージの複
製起点。catはクロラムフェニコール耐性遺伝子。m.o.iは感染の多重度。trc pr
omはトリプトファンおよびラクトースオペロンからの融合プロモーター。ttは転
写終結因子。kanはカナマイシン耐性遺伝子。塩基対(bp)表示のベクターサイズ
は相互作用因子を含まない。
マーゼのα197およびω198断片への融合体としての異種タンパク質発現のための
ベクターと戦略。ベクターpAO1はジシストロン転写産物からω198融合体および
遊離型リガンドを発現させるための高コピーpUC119系プラスミドであり、高多重
度感染による宿主細胞への定量的導入用のファージとして再利用できる。ベクタ
ーpAE1は、pAO1ベクターからの発現レベルと同等以上のレベルでα197融合体を
発現させるための強いプロモーターを備えた低コピーp15Aレプリコンである。Tr
xpepsはチオレドキシンの活性部位に挿入された12-量体ペプチドである。Tripep
-trxライブラリーはチオレドキシンN末端のランダムトリペプチドであり、介在G
ly4Serリンカーを備える。scFvは一本鎖抗体Fv断片。LC-CH1はH鎖とL鎖第1定常
領域から成る抗体断片。VLは抗体L鎖可変領域。lac promはラクトースオペロン
プロモーター。SPはシグナルペプチド。(Gly4Ser)3はフレキシブル15-量体リン
カー。pUC oriとp15A oriはプラスミドの複製起点。fl oriは線状ファージの複
製起点。catはクロラムフェニコール耐性遺伝子。m.o.iは感染の多重度。trc pr
omはトリプトファンおよびラクトースオペロンからの融合プロモーター。ttは転
写終結因子。kanはカナマイシン耐性遺伝子。塩基対(bp)表示のベクターサイズ
は相互作用因子を含まない。
【図７】
代表的一本鎖抗体Fv断片(scFv)とチオレドキシンを足場とするタンパク質(Trx
)との相互作用によるTEM-1βラクタマーゼ断片相補。N末端βラクタマーゼ断片
のα197(α)は赤色で示す。C末端断片のω198(ω)は青色で示す。TEM-1、チオレ
ドキシンおよびscFvは公開構造から模式化した。ペプチドとリンカーも描き込ん
だ。
)との相互作用によるTEM-1βラクタマーゼ断片相補。N末端βラクタマーゼ断片
のα197(α)は赤色で示す。C末端断片のω198(ω)は青色で示す。TEM-1、チオレ
ドキシンおよびscFvは公開構造から模式化した。ペプチドとリンカーも描き込ん
だ。
【図８】
CD40細胞外ドメイン(CD40)とチオレドキシンを足場とするペプチド(Trx)との
相互作用によるTEM-1βラクタマーゼ断片相補。N末端βラクタマーゼ断片のα19
7(α)は赤色で示す。C末端断片のω198(ω)は青色で示す。TEM-1、チオレドキシ
ンおよびscFvは公開構造から模式化した。ペプチドとリンカーも描き込んだ。
相互作用によるTEM-1βラクタマーゼ断片相補。N末端βラクタマーゼ断片のα19
7(α)は赤色で示す。C末端断片のω198(ω)は青色で示す。TEM-1、チオレドキシ
ンおよびscFvは公開構造から模式化した。ペプチドとリンカーも描き込んだ。
【図９】
相互作用依存性βラクタマーゼ断片相補システムを用いた多重タンパク質-タ
ンパク質相互作用ライブラリー構築のためのベクターとプロトコール。発現配列
(ES)、すなわちランダムプライミング法で作製されたcDNAライブラリーをファス
ミドベクターにサブクローニングし、フレキシブルリンカー(Gly4Ser)3を介在さ
せたβラクタマーゼαおよびω断片との融合体として発現させるようにする。こ
れらのベクターはESのC末端でペプチドエピトープタグたとえば12残基Mycタグな
どをコードする。ESライブラリーは、抗myc 9E10などのような抗Tag scFvを他方
の断片と融合させたものと同時発現させると、Tag-抗Tag相互作用により促進さ
れるβラクタマーゼ活性を指標に選択することができるが、それにはこのES断片
の安定した発現が必要となろう。得られたライブラリーは、自律折りたたみドメ
イン(AFD)の安定エクスプレッサーを多く含むようにしてあり、ファージとして
再利用し雄性細胞中に同時導入して相互作用AFD対(Multiplex Interaction Libr
ary)の選択に用いてもよい。AFDライブラリーはまた、scFvライブラリー、抗体L
鎖可変領域ライブラリー(VL)またはチオレドキシン上にディスプレーされるペプ
チドライブラリー(trx-peptide)と同時導入して、各AFDの結合タンパク質の同時
選択(Multiplex Antibody/Peptide Binder Selection)に用いることもできる。
他の略語の意味については図6および10の説明を参照。
ンパク質相互作用ライブラリー構築のためのベクターとプロトコール。発現配列
(ES)、すなわちランダムプライミング法で作製されたcDNAライブラリーをファス
ミドベクターにサブクローニングし、フレキシブルリンカー(Gly4Ser)3を介在さ
せたβラクタマーゼαおよびω断片との融合体として発現させるようにする。こ
れらのベクターはESのC末端でペプチドエピトープタグたとえば12残基Mycタグな
どをコードする。ESライブラリーは、抗myc 9E10などのような抗Tag scFvを他方
の断片と融合させたものと同時発現させると、Tag-抗Tag相互作用により促進さ
れるβラクタマーゼ活性を指標に選択することができるが、それにはこのES断片
の安定した発現が必要となろう。得られたライブラリーは、自律折りたたみドメ
イン(AFD)の安定エクスプレッサーを多く含むようにしてあり、ファージとして
再利用し雄性細胞中に同時導入して相互作用AFD対(Multiplex Interaction Libr
ary)の選択に用いてもよい。AFDライブラリーはまた、scFvライブラリー、抗体L
鎖可変領域ライブラリー(VL)またはチオレドキシン上にディスプレーされるペプ
チドライブラリー(trx-peptide)と同時導入して、各AFDの結合タンパク質の同時
選択(Multiplex Antibody/Peptide Binder Selection)に用いることもできる。
他の略語の意味については図6および10の説明を参照。
【図１０】
NPTIIの二次構造と溶媒浸漬を予測するためのPredictProteinプログラムの短
縮出力(Rost and Sander, 1993, 1994)。第1行は1文字表記のアミノ酸配列を示
す。第2および第3行は二次構造予測を示し、Hはヘリカル、Eはストランド、Lは
ループを表す。第4行は信頼性の度合いを1〜10の段階で示し、10が最高である。
第5行は溶媒可触度を示し、eは露出、bは埋没を表す。最終行は溶媒可触度の信
頼性の度合いを1〜10の段階で示し、10が最高である。二次構造が乏しく、露出
していて溶媒に浸漬すると予測された10の配列領域を生産的断片化の候補部位と
して下線で示す。
縮出力(Rost and Sander, 1993, 1994)。第1行は1文字表記のアミノ酸配列を示
す。第2および第3行は二次構造予測を示し、Hはヘリカル、Eはストランド、Lは
ループを表す。第4行は信頼性の度合いを1〜10の段階で示し、10が最高である。
第5行は溶媒可触度を示し、eは露出、bは埋没を表す。最終行は溶媒可触度の信
頼性の度合いを1〜10の段階で示し、10が最高である。二次構造が乏しく、露出
していて溶媒に浸漬すると予測された10の配列領域を生産的断片化の候補部位と
して下線で示す。
【図１１】
β-lacα253およびβ-lacω254のscFvとの融合タンパク質を産生させるための
発現ベクター。矢印は翻訳開始部位を示す。T7 promはファージT7プロモーター
。SPはpelBシグナルペプチド。scFvはVH(抗体H鎖可変領域)、(Gly4Ser)3(15-量
体フレキシブルリンカー)およびVL(抗体L鎖可変領域)から成る。kanはカナマイ
シン耐性。His6は金属イオンアフィニティー精製用のヘキサヒスチジンタグ。la
cIqは高アフィニティーlacオペロンリプレッサー突然変異体。f1 oriはファージ
複製起点。
発現ベクター。矢印は翻訳開始部位を示す。T7 promはファージT7プロモーター
。SPはpelBシグナルペプチド。scFvはVH(抗体H鎖可変領域)、(Gly4Ser)3(15-量
体フレキシブルリンカー)およびVL(抗体L鎖可変領域)から成る。kanはカナマイ
シン耐性。His6は金属イオンアフィニティー精製用のヘキサヒスチジンタグ。la
cIqは高アフィニティーlacオペロンリプレッサー突然変異体。f1 oriはファージ
複製起点。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ヒト非免疫抗体レパートリーに由来するscFvをコンセンサスプライマーミック
ス使用のPCRで増幅し(Marks et al., Eur J Immunol (1991) 21:985)、pUC119系
ファスミドベクター(pAO1; 図6参照)にサブクローニングし(Sambrook et al., s
upra)、介在(Gly4Ser)3リンカーを介したω198断片N末端への融合体としてscFv
を発現させるようにした。N末端シグナルペプチドを用意して、細菌ペリプラズ
ムへの転位を図るようにした。市販のtrxpepライブラリーを入手し、E. coliチ
オレドキシンのNおよびC末端に対し特異的なプライマーを使用してPCR増幅した(
Genbank登録no. M54881)。p15Aレプリコン(Rose, Nuc Acids Res (1988) 16:355
)にこの産物をサブクローニングし、trp-lac融合プロモーターからα197断片C末
端への融合体として発現させるようにした(pAE1;図6参照)。この場合もまた、N
末端シグナルペプチドを用意して、ペリプラズムへの転位を図るようにした。図
7は、scFvとtrxpepの相互作用に依存したα197とω198の相補によるTEM-1の活性
化を示している。
ス使用のPCRで増幅し(Marks et al., Eur J Immunol (1991) 21:985)、pUC119系
ファスミドベクター(pAO1; 図6参照)にサブクローニングし(Sambrook et al., s
upra)、介在(Gly4Ser)3リンカーを介したω198断片N末端への融合体としてscFv
を発現させるようにした。N末端シグナルペプチドを用意して、細菌ペリプラズ
ムへの転位を図るようにした。市販のtrxpepライブラリーを入手し、E. coliチ
オレドキシンのNおよびC末端に対し特異的なプライマーを使用してPCR増幅した(
Genbank登録no. M54881)。p15Aレプリコン(Rose, Nuc Acids Res (1988) 16:355
)にこの産物をサブクローニングし、trp-lac融合プロモーターからα197断片C末
端への融合体として発現させるようにした(pAE1;図6参照)。この場合もまた、N
末端シグナルペプチドを用意して、ペリプラズムへの転位を図るようにした。図
7は、scFvとtrxpepの相互作用に依存したα197とω198の相補によるTEM-1の活性
化を示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
これらの結果はいくつかの重要な意味をもつ。第1に、偽陽性率が非常に低く
なり、酵母ツーハイブリッドシステムなどのような他の細胞内相互作用センサー
の場合の報告値を大幅に下回った(Bartel et al., 1993, supra; Bartel et al.
, 1996, supra)。この特性はハイスループット用途ではきわめて重要である。第
2に、すべての機能的scFvに対応するtrxpepが回収されるため、scFvに関する偽
陰性率が非常に低くなった。これもまたハイスループット用途ではきわめて重要
である。すべてのscFvでミモトープが回収されるという事実は、このシステムを
scFvのハイスループット多重エピトープマッピングに使用することを可能にする
。最後に、このシステムは多様な2タンパク質集合間の多様な相互作用物質の同
時的、効率的回収を可能にする。結局、このシステムの高効率、すなわち低偽陽
性率と低偽陰性率からすれば、システムの処理能力を制限するものは相互作用ラ
イブラリーのサイズおよび／または手際よく扱える同時形質転換体の数だけであ
ろう。たとえばscFv、trxpepまたはcDNAでは109〜1010単位の組み換えタンパク
質ライブラリーの構築がごく普通に可能である(Hoogenboom et al., Immunotech
(1998) 4:1)。任意の2つのこうしたライブラリーを対象にした組み合わせ対単
位相互作用トラッピングには少なくとも1018〜1020クローンが必要となろうが、
定量的ファスミド感染法(Sambrook et al., 1989, supra)や自動発酵プレーティ
ング法を用いれば、この程度の処理能力は現実的に実現可能であろう。 実施例2 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: 抗体L鎖V領域(VL)とtrxpepの相互作用 この実施例では、VLプラス第1H鎖定常領域を含むFd断片にジスルフィド結合さ
れた完全長L鎖から成るFabなどのような、より大きな抗体断片にも対応しうるこ
のシステムの能力を例示する。ヒト・レパートリーライブラリーに由来するFab
のサブセットをpAO1ベクターにサブクローニングしlacプロモーター由来のジシ
ストロン転写産物からC末端ω198融合体として発現させるようにした(図6参照)
。第1シストロンはペリプラズムへの転位のためのシグナルペプチドをもつL鎖を
コードしていた。L鎖終止コドンには短いスペーサー配列が、次いでFd断片のシ
グナルペプチドに対応する翻訳開始点から約10 bp上流のリボソーム結合部位が
続き、さらに次いで介在(Gly4Ser)3リンカーをもつω198が続いた。次にE. coli
株DH5αおよびTG1を用いてこの構築体をpAE1ベクター内のα197-trxpepライブラ
リーと同時発現させた。L鎖とペリプラズム内のFd-ω198融合タンパク質との自
然会合が機能的Fab断片を生成させるものと期待された。次いで、これがα197-t
rxpep融合体上のペプチドと結合することにより、宿主細胞に選択可能なアンピ
シリン耐性を付与するに足る量の機能的TEM-1βラクタマーゼの組み立てを助長
するものと期待された。
なり、酵母ツーハイブリッドシステムなどのような他の細胞内相互作用センサー
の場合の報告値を大幅に下回った(Bartel et al., 1993, supra; Bartel et al.
, 1996, supra)。この特性はハイスループット用途ではきわめて重要である。第
2に、すべての機能的scFvに対応するtrxpepが回収されるため、scFvに関する偽
陰性率が非常に低くなった。これもまたハイスループット用途ではきわめて重要
である。すべてのscFvでミモトープが回収されるという事実は、このシステムを
scFvのハイスループット多重エピトープマッピングに使用することを可能にする
。最後に、このシステムは多様な2タンパク質集合間の多様な相互作用物質の同
時的、効率的回収を可能にする。結局、このシステムの高効率、すなわち低偽陽
性率と低偽陰性率からすれば、システムの処理能力を制限するものは相互作用ラ
イブラリーのサイズおよび／または手際よく扱える同時形質転換体の数だけであ
ろう。たとえばscFv、trxpepまたはcDNAでは109〜1010単位の組み換えタンパク
質ライブラリーの構築がごく普通に可能である(Hoogenboom et al., Immunotech
(1998) 4:1)。任意の2つのこうしたライブラリーを対象にした組み合わせ対単
位相互作用トラッピングには少なくとも1018〜1020クローンが必要となろうが、
定量的ファスミド感染法(Sambrook et al., 1989, supra)や自動発酵プレーティ
ング法を用いれば、この程度の処理能力は現実的に実現可能であろう。 実施例2 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: 抗体L鎖V領域(VL)とtrxpepの相互作用 この実施例では、VLプラス第1H鎖定常領域を含むFd断片にジスルフィド結合さ
れた完全長L鎖から成るFabなどのような、より大きな抗体断片にも対応しうるこ
のシステムの能力を例示する。ヒト・レパートリーライブラリーに由来するFab
のサブセットをpAO1ベクターにサブクローニングしlacプロモーター由来のジシ
ストロン転写産物からC末端ω198融合体として発現させるようにした(図6参照)
。第1シストロンはペリプラズムへの転位のためのシグナルペプチドをもつL鎖を
コードしていた。L鎖終止コドンには短いスペーサー配列が、次いでFd断片のシ
グナルペプチドに対応する翻訳開始点から約10 bp上流のリボソーム結合部位が
続き、さらに次いで介在(Gly4Ser)3リンカーをもつω198が続いた。次にE. coli
株DH5αおよびTG1を用いてこの構築体をpAE1ベクター内のα197-trxpepライブラ
リーと同時発現させた。L鎖とペリプラズム内のFd-ω198融合タンパク質との自
然会合が機能的Fab断片を生成させるものと期待された。次いで、これがα197-t
rxpep融合体上のペプチドと結合することにより、宿主細胞に選択可能なアンピ
シリン耐性を付与するに足る量の機能的TEM-1βラクタマーゼの組み立てを助長
するものと期待された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】a
+、++、+++、+++++は25、50、100、600 μg/mlアンピシリン上での>10%プレー
ティング効率 以上の結果は、サイズが〜12 kDaにすぎないL鎖V領域だけが、断片相補による
βラクタマーゼの抗原依存性活性化に好都合なハイアフィニティー結合分子を作
りうることを示している。これを検定するために、いくつかの被選択LC-CH1に由
来するVLをサブクローニングしてω198に対するC末端融合体としてだけ発現させ
るようにした。各VLをそのパートナーのα197-trxpepと同時発現させると、約3
分の1のVLが親LC-CH1並みの選択可能なアンピシリン耐性を付与した。 実施例3 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40とtrxpepの相互作用 この実施例では、目的とする任意のタンパク質に結合し、またタンパク質上の
相互作用表面のマッピングに使用しうるうえに相同性による新リガンドの同定に
も役立ちうるようなtrxpep群を単離するこのシステムの能力を例示する。ヒトB
細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメインはE. coliペリプラズム内で確実に発現す
ることが知られている(Noelle et al., Immunol Today (1992) 13:431; Bajorat
h and Aruffo, Proteins: Struct, Funct, Genet (1997) 27:59)。T細胞表面分
子のCD40リガンド(CD40L)はCD40へと連結することによりB細胞のコアクチベータ
ーとして機能することが知られているが、他のリガンドも存在するかもしれない
。そこで、TEM-1α197/ω198断片相補を利用して一群のCD40結合trxpepを選択し
、次いでこれらのペプチドの配列について既知リガンドや他の潜在的リガンドと
の相同性を調べることにした。成熟型細胞外ドメイン(CD40ED)のコード配列を、
この成熟タンパク質のN末端および〜190残基細胞外ドメインのC末端と相同のプ
ライマーを使用するPCRによって増幅した(Genbank登録no.X60592)。次いでpAO1
ファスミドベクターにPCR産物をサブクローニングし(図6参照)、介在(Gly4Ser)3 リンカーを介したTEM-1ω198断片との融合体としてlacプロモーターから発現さ
せるようにした。正しい産物の発現をPAGEで確認し、次いでCD40融合ベクターを
ファージとして再利用し、前述と同じtrxpepライブラリー構築体を入れたTG1細
胞に導入した。カナマイシン上とクロラムフェニコール上の二重選択により約10 7 個の同時形質転換体が収集されたので、それを次に25μg/mlアンピシリン上に
プレートした。図8はα197とω198のtrxpep- CD40相互作用依存性相補によるTEM
-1の活性化の模式図である。
ティング効率 以上の結果は、サイズが〜12 kDaにすぎないL鎖V領域だけが、断片相補による
βラクタマーゼの抗原依存性活性化に好都合なハイアフィニティー結合分子を作
りうることを示している。これを検定するために、いくつかの被選択LC-CH1に由
来するVLをサブクローニングしてω198に対するC末端融合体としてだけ発現させ
るようにした。各VLをそのパートナーのα197-trxpepと同時発現させると、約3
分の1のVLが親LC-CH1並みの選択可能なアンピシリン耐性を付与した。 実施例3 α197とω198の相互作用依存性相補によるβラクタマーゼ活性化: CD40とtrxpepの相互作用 この実施例では、目的とする任意のタンパク質に結合し、またタンパク質上の
相互作用表面のマッピングに使用しうるうえに相同性による新リガンドの同定に
も役立ちうるようなtrxpep群を単離するこのシステムの能力を例示する。ヒトB
細胞活性化抗原CD40の細胞外ドメインはE. coliペリプラズム内で確実に発現す
ることが知られている(Noelle et al., Immunol Today (1992) 13:431; Bajorat
h and Aruffo, Proteins: Struct, Funct, Genet (1997) 27:59)。T細胞表面分
子のCD40リガンド(CD40L)はCD40へと連結することによりB細胞のコアクチベータ
ーとして機能することが知られているが、他のリガンドも存在するかもしれない
。そこで、TEM-1α197/ω198断片相補を利用して一群のCD40結合trxpepを選択し
、次いでこれらのペプチドの配列について既知リガンドや他の潜在的リガンドと
の相同性を調べることにした。成熟型細胞外ドメイン(CD40ED)のコード配列を、
この成熟タンパク質のN末端および〜190残基細胞外ドメインのC末端と相同のプ
ライマーを使用するPCRによって増幅した(Genbank登録no.X60592)。次いでpAO1
ファスミドベクターにPCR産物をサブクローニングし(図6参照)、介在(Gly4Ser)3 リンカーを介したTEM-1ω198断片との融合体としてlacプロモーターから発現さ
せるようにした。正しい産物の発現をPAGEで確認し、次いでCD40融合ベクターを
ファージとして再利用し、前述と同じtrxpepライブラリー構築体を入れたTG1細
胞に導入した。カナマイシン上とクロラムフェニコール上の二重選択により約10 7 個の同時形質転換体が収集されたので、それを次に25μg/mlアンピシリン上に
プレートした。図8はα197とω198のtrxpep- CD40相互作用依存性相補によるTEM
-1の活性化の模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ
1/34 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
1/48 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ
33/50 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36
4B024 AA01 AA11 BA11 CA03 CA04
CA07 DA01 DA03 DA06 EA02
EA04 GA13 GA14 HA01 HA11
HA17
4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ08 QQ36
QR07 QR10 QR48 QR56 QR58
QR68 QS03 QS05 QS38
4B065 AA26X AA88X AA93X AA93Y
AB01 AC10 BA02 BA03 BA05
CA24 CA44 CA46
【要約の続き】
よび抗組織抗体に対応する抗原の迅速な検出、(7)抗体
に対応するエピトープの迅速な検出、(8)任意のタンパ
ク質-タンパク質相互作用の阻害物質の高性能選択のた
めの細胞系スクリーンなどである。
Claims (62)
- 【請求項１】 タンパク質中の機能的断片を検出する方法において、 マーカータンパク質の断片を、各断片が前記マーカータンパク質の溶媒暴露ル
ープ内に切断点末端を有し各CまたはN末端のNまたはC末端残基がそれぞれ前記切
断点末端を構成するように調製して、マーカー断片のライブラリーが得られるよ
うにすること 前記マーカー断片ライブラリーの要素を非常に多数の宿主細胞中で発現させる
こと 機能的に再構成された前記マーカータンパク質をすでに形成している断片対の
第1要素と第2要素を含む細胞の指標として前記マーカータンパク質を発現する宿
主細胞を単離し、もって前記の機能的断片対が検出されるようにすること を含む方法。 - 【請求項２】 機能的に再構成されたマーカータンパク質が直接選択可能な
シグナルを与える請求項1記載の方法。 - 【請求項３】 断片対の第1および第2要素が共にマーカータンパク質の不連
続、連続または重複配列の1つを含み、また前記マーカータンパク質の全長の約9
0〜110%を占める請求項1記載の方法。 - 【請求項４】 第1要素と第2要素がそれぞれさらに、切断点末端から5アミ
ノ酸位置以内にシステイン残基を含み、前記第1要素と第2要素の間にジスルフィ
ド結合が形成されうるようにした請求項1記載の方法。 - 【請求項５】 システイン残基が切断点末端にある請求項4記載の方法。
- 【請求項６】 タンパク質が酵素である請求項1記載の方法。
- 【請求項７】 酵素がβラクタマーゼである請求項５記載の方法。
- 【請求項８】 マーカータンパク質の断片がそれぞれfosまたはjun転写因子
との融合タンパク質として発現する請求項1記載の方法。 - 【請求項９】 第1オリゴペプチドの結合相手である第2オリゴペプチドを検
出する方法において、 第1オリゴペプチドとライブラリー要素によってコードされる第2オリゴペプチ
ドとをそれぞれ、請求項1記載の方法に従ってそれぞれ得られるマーカータンパ
ク質の断片対の第1要素と第2要素との融合タンパク質として非常に多数の宿主細
胞中で同時発現させ、その過程で前記第1オリゴペプチドの前記第2オリゴペプチ
ドへの結合により前記マーカータンパク質が機能的に再構成される結果となるよ
うにすること すでに相互作用した第1オリゴペプチドと第2オリゴペプチドを含んでいる細胞
の指標となる前記マーカータンパク質を発現させる宿主細胞を単離すること 前記融合タンパク質をコードする発現カセットを収めたプラスミドの配列を決
定し、もって第1オリゴペプチドの結合相手である第2ペプチドが検出されるよう
にすること を含む方法。 - 【請求項１０】 各融合タンパク質がさらにシグナルペプチドを含む請求項
9記載の方法。 - 【請求項１１】 シグナルペプチドが細菌細胞のペリプラズムへの転位を導
く請求項10記載の方法。 - 【請求項１２】 第1オリゴペプチドと第2オリゴペプチドが細胞外タンパク
質である請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】 各融合タンパク質がさらに、切断点末端と第1または第2オ
リゴヌクレオチドの間にフレキシブルポリペプチドリンカーを含む請求項10記載
の方法。 - 【請求項１４】 融合タンパク質がさらに、次のもののうち少なくとも1つ
を含む請求項9記載の方法: i) 切断点末端とフレキシブルポリペプチドリンカーの間の、アミノ酸数3〜1
2のランダムコード化ペプチド ii) 切断点末端から5アミノ酸位置以内のシステイン残基、および iii) 断片対の要素をコードするヌクレオチド配列の誤りがち(error-prone)
の条件下でのPCR増幅によって導入された、再構成マーカータンパク質の折りた
たみ安定性を強めるための前記断片対要素内の1〜3個のコドン変更。 - 【請求項１５】 チオレドキシンのN末端への融合体として別個に同時発現
させたアミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチドをさらに含む請求項9記載の
方法。 - 【請求項１６】 宿主細胞が大腸菌（E. coli）細胞である請求項9記載の方
法。 - 【請求項１７】 マーカータンパク質が酵素である請求項9記載の方法。
- 【請求項１８】 酵素がβラクタマーゼである請求項17記載の方法。
- 【請求項１９】 第1オリゴペプチドが一本鎖抗体Fv断片、抗体軽鎖可変領
域および細胞表面分子から成る群より選択され、また第2オリゴペプチドがチオ
レドキシンまたはリン酸化調節シグナル伝達タンパク質の活性部位に挿入された
ランダムコード化ペプチドである請求項9記載の方法。 - 【請求項２０】 細胞表面分子がCD40である請求項19記載の方法。
- 【請求項２１】 リン酸化調節シグナル伝達タンパク質がチロシンキナーゼ
である請求項19記載の方法。 - 【請求項２２】 C末端切断点をもつN末端断片を含む第1オリゴペプチドとN
末端切断点をもつC末端断片を含む第2オリゴペプチドとを含む断片相補システム
において、前記N末端断片と前記C末端断片がそれぞれ一マーカータンパク質に由
来し、かつ再び組み立てられて機能的に再構成されたマーカータンパク質を形成
するような断片相補システム。 - 【請求項２３】 第1オリゴペプチドと第2オリゴペプチドがそれぞれさらに
、切断点から5アミノ酸位置以内にシステイン残基を含む請求項22記載の断片相
補システム。 - 【請求項２４】 システイン残基が切断点にある請求項23記載の方法。
- 【請求項２５】 切断点を介してフレキシブルポリペプチドリンカーへと融
合されたN末端断片と第1相互作用因子ドメインとを含む第1オリゴペプチドおよ
び第2相互作用因子ドメインと切断点を介してC末端断片へと融合されたフレキシ
ブルポリペプチドリンカーとを含む第2オリゴペプチドを含む断片相補システム
において、前記N末端断片と前記C末端断片がどちらも直接選択可能なシグナルを
備える一マーカータンパク質に由来し、また前記N末端断片と前記C末端断片が請
求項1記載の方法に従って得られ、また前記N末端断片と前記C末端断片は前記第1
相互作用因子ドメインが前記第2相互作用因子ドメインと結合する場合に限って
前記マーカータンパク質を機能的に再構成するような断片相補システム。 - 【請求項２６】 第1および第2オリゴペプチドがさらにシグナルペプチドを
含む請求項25記載の断片相補システム。 - 【請求項２７】 N末端およびC末端断片が共にマーカータンパク質の不連続
、連続または重複配列の1つを含み、また前記マーカータンパク質の全長の約90
〜110%を占める請求項25記載の断片相補システム。 - 【請求項２８】 マーカータンパク質の機能的再構成が、第1および第2オリ
ゴペプチド配列の少なくとも1つに、次の修飾のうち少なくとも1つを導入するこ
とにより増進される請求項27記載の断片相補システム: i) 断片とフレキシブルポリペプチドリンカーの間にコードされたアミノ酸数
3〜12のランダムコード化ペプチド ii) 別個に発現し、かつチオレドキシンのN末端へと作動可能に融合されたア
ミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチド iii) 断片とフレキシブルポリペプチドリンカーの間にコードされたシステイ
ン残基、または iv) 断片をコードするヌクレオチド配列を誤りがちの条件下でPCR増幅するこ
とにより導入された、再構成マーカータンパク質のより安定した折りたたみを可
能にするための断片分子当たり1〜3個のコドン変更。 - 【請求項２９】 直接選択可能なシグナルが明確な表現型変化または抗生物
質耐性である請求項25記載の断片相補システム。 - 【請求項３０】 直接選択可能なシグナルを備えるタンパク質が酵素である
請求項25記載の断片相補システム。 - 【請求項３１】 第1相互作用因子ドメインが一本鎖抗体Fv断片、抗体軽鎖
可変領域および細胞表面分子から成る群より選択され、また第2相互作用因子ド
メインがE. coliチオレドキシンまたはリン酸化調節シグナル伝達タンパク質の
活性部位に挿入されたランダムコード化ペプチドを含む請求項28記載の断片相補
システム。 - 【請求項３２】 細胞表面分子がCD40である請求項31記載の断片相補システ
ム。 - 【請求項３３】 リン酸化調節シグナル伝達タンパク質がチロシンキナーゼ
である請求項31記載の断片相補システム。 - 【請求項３４】 第1相互作用因子ドメインが第1ライブラリー由来のポリペ
プチドをコードし、また第2相互作用因子ドメインが第2ライブラリー由来のポリ
ペプチドをコードする請求項25記載の断片相補システム。 - 【請求項３５】 切断点を介してフレキシブルポリペプチドリンカーへと融
合されたβラクタマーゼのN末端断片と第1相互作用因子ドメインとを含む第1オ
リゴペプチドおよび第2相互作用因子ドメインと切断点を介してβラクタマーゼ
のC末端断片へと融合されたフレキシブルポリペプチドリンカーとを含む第2オリ
ゴペプチドを含む断片相補システムにおいて、前記N末端断片と前記C末端断片が
、前記第1相互作用因子ドメインが前記第2相互作用因子ドメインと結合する場合
に前記βラクタマーゼを機能的に再構成するような断片相補システム。 - 【請求項３６】 βラクタマーゼの機能的再構成が、第1および第2オリゴペ
プチド配列の少なくとも1つに、次の修飾のうち少なくとも1つを導入することに
より増進される請求項35記載の断片相補システム: i) 断片とフレキシブルポリペプチドリンカーの間にコードされたアミノ酸数
3〜12のランダムコード化ペプチド、 ii) 別個に発現し、かつチオレドキシンのN末端へと作動可能に融合されたア
ミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチド、 iii) 断片とフレキシブルポリペプチドリンカーの間にコードされたシステイ
ン残基、または iv) 断片をコードするヌクレオチド配列を誤りがちの条件下でPCR増幅するこ
とにより導入された、再構成βラクタマーゼのより安定した折りたたみを可能に
するための断片分子当たり1〜3個のコドン変更。 - 【請求項３７】 アミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチドがトリペプ
チドであり、またN末端断片に融合されたトリペプチドがHSE、NGR、GREおよびEK
Rから成る群より選択され、かつC末端断片に融合されたトリペプチドがREQ、QGN
、DGR、GRRおよびGNSから成る群より選択される請求項35記載の断片相補システ
ム。 - 【請求項３８】 N末端断片またはC末端断片の切断点がN52/S53、E63/E64、
Q99/N100、P174/N175、E197/L198、K215/V216、A227/G228およびG253/K254から
なる群より選択されるアミノ酸残基間の接合部からいずれかの方向で10残基以内
にある請求項36記載の断片相補システム。 - 【請求項３９】 N末端断片またはC末端断片の切断点がアミノ酸残基E197お
よびL198の接合部からいずれかの方向で10残基以内にある請求項36記載の断片相
補システム。 - 【請求項４０】 アミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチドがトリペプ
チドGREを含む請求項39記載の断片相補システム。 - 【請求項４１】 N末端断片が、K55E、P62SおよびM182Tから成る群より選択
される少なくとも1つの突然変異を含む請求項35記載の断片相補システム。 - 【請求項４２】 転写方向に作動可能に結合された構成要素として (i) 宿主細胞内で機能するプロモーター (ii) ポリペプチド相互作用因子ドメイン (iii) フレキシブルポリペプチドリンカー、および (iv) 選択可能な表現型をもたらすマーカータンパク質のC末端断片 をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット。
- 【請求項４３】 転写方向に作動可能に結合された構成要素として (i) 宿主細胞内で機能するプロモーター (ii) 選択可能な表現型をもたらすマーカータンパク質のN末端断片 (iii) フレキシブルポリペプチドリンカー、および (iv) ポリペプチド相互作用因子ドメイン をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット。
- 【請求項４４】 シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む請求項42
または43記載の発現カセット。 - 【請求項４５】 シグナルペプチドが細菌ペリプラズムへの転位を誘導する
請求項44記載の発現カセット。 - 【請求項４６】 相互作用因子ドメインが細胞外タンパク質である請求項45
記載の発現カセット。 - 【請求項４７】 選択可能な表現型をもたらすマーカータンパク質がβラク
タマーゼである請求項42または43記載の発現カセット。 - 【請求項４８】 アミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチドまたはN末端
断片をコードする配列とフレキシブルポリペプチドリンカーをコードする配列と
の間に作動可能に結合されたシステイン残基のうち少なくとも1つをコードする
配列をさらに含む請求項42記載の発現カセット。 - 【請求項４９】 アミノ酸数3〜12のランダムコード化ペプチドまたはフレ
キシブルポリペプチドリンカーをコードする配列とC末端断片をコードする配列
との間に作動可能に結合されたシステイン残基のうち少なくとも1つをコードす
る配列をさらに含む請求項43記載の発現カセット。 - 【請求項５０】 請求項42記載の発現カセットである第1発現カセットおよ
び請求項43記載のカセットである第2発現カセットを含む宿主細胞。 - 【請求項５１】 免疫グロブリン可変領域に結合するエピトープを検出する
方法において、 枠内でシステイン残基または安定化トリペプチドを介してフレキシブルポリペ
プチドリンカーへと作動可能に融合されたβラクタマーゼのN末端断片とチオレ
ドキシンの活性部位に挿入されたランダムコード化ペプチドから成る第1相互作
用因子ドメインとを含む第1オリゴペプチドおよび一本鎖Fv断片または抗体軽鎖
可変領域から成る第2相互作用因子ドメインと枠内でシステイン残基または安定
化トリペプチドを介してβラクタマーゼのC末端断片へと作動可能に融合された
フレキシブルポリペプチドリンカーとを含む第2オリゴペプチドを、宿主細胞中
に共に収めたプラスミドから同時発現させ、その過程で前記第1相互作用因子ド
メインの前記第2相互作用因子ドメインとの結合の結果として前記βラクタマー
ゼが機能的に再構成されるようにすること アンピシリン耐性の宿主細胞を単離すること、および 前記第1および第2オリゴペプチドをコードする発現カセットを収めたプラスミ
ドの配列を決定し、もって前記免疫グロブリン可変領域に結合する前記エピトー
プが検出されるようにすること を含んで成る方法。 - 【請求項５２】 膜貫通タンパク質の細胞外ドメインとポリペプチドの間の
相互作用を検出する方法において、 枠内でシステイン残基または安定化トリペプチドを介してフレキシブルポリペ
プチドリンカーへと作動可能に融合されたβラクタマーゼのN末端断片とチオレ
ドキシンの活性部位に挿入されたランダムコード化ペプチドから成る第1相互作
用因子ドメインとを含む第1オリゴペプチドおよび膜貫通タンパク質から成る第2
相互作用因子ドメインと枠内でシステイン残基または安定化トリペプチドを介し
てβラクタマーゼのC末端断片へと作動可能に融合されたフレキシブルポリペプ
チドリンカーとを含む第2オリゴペプチドを、宿主細胞中に共に収めたプラスミ
ドから個別に発現させ、その過程で前記第1相互作用因子ドメインの前記第2相互
作用因子ドメインとの結合の結果として前記βラクタマーゼが機能的に再構成さ
れるようにすること アンピシリン耐性の宿主細胞を単離すること、および 前記第1および第2オリゴペプチドをコードする発現カセットを収めたプラスミ
ドの配列を決定し、もって前記膜貫通タンパク質に結合する前記ポリペプチドが
検出されるようにすること を含んで成る方法。 - 【請求項５３】 膜貫通タンパク質が免疫細胞タンパク質である請求項52記
載の方法。 - 【請求項５４】 前記細胞がＣＤ４０である請求項53記載の方法。
- 【請求項５５】 試料中のタンパク質-タンパク質相互作用の発生を監視す
る方法において、 第1細胞ライブラリーの第1オリゴペプチド要素と第2細胞ライブラリーの第2オ
リゴペプチド要素をそれぞれ、請求項1記載の方法に従ってそれぞれ得られるマ
ーカータンパク質の断片対の第1要素と第2要素との融合タンパク質として宿主細
胞中で同時発現させ、その過程で前記第1オリゴペプチドの前記第2オリゴペプチ
ドへの結合の結果として前記マーカータンパク質が機能的に再組み立てされるよ
うにすること すでに前記マーカータンパク質を機能的に再構成した断片対の第1要素と第2要
素を含む細胞の指標となる前記マーカータンパク質を発現する宿主細胞を単離す
ること、および 前記融合タンパク質をコードする発現カセットを収めたプラスミドの配列を決
定し、もって前記タンパク質-タンパク質相互作用が監視されるようにすること を含む方法。 - 【請求項５６】 2つの異なるプロテオーム間のオリゴペプチド相互作用を
検出する方法において、 第1細胞ライブラリーの第1オリゴペプチド要素と第2細胞ライブラリーの第2オ
リゴペプチド要素をそれぞれ、請求項1記載の方法に従ってそれぞれ得られるβ
ラクタマーゼの断片対の第1要素と第2要素との融合タンパク質として宿主細胞中
で同時発現させ、その過程で前記第1オリゴペプチドの前記第2オリゴペプチドへ
の結合の結果として前記βラクタマーゼが機能的に再組み立てされるようにする
こと アンピシリン耐性の宿主細胞を単離すること、および 前記融合タンパク質をコードする発現カセットを収めたプラスミドの配列を決
定し、もって2つの異なるプロテオーム間の前記オリゴペプチド相互作用が検出
されるようにすること を含む方法。 - 【請求項５７】 細胞ライブラリーが腫瘍細胞または免疫細胞に由来する請
求項55または56記載の方法。 - 【請求項５８】 リン酸化調節細胞シグナル変換器を阻害する化合物のハイ
スループット検出方法において、 枠内でシステイン残基または安定化トリペプチドを介してフレキシブルポリペ
プチドリンカーへと作動可能に融合されたβラクタマーゼのN末端断片とリン酸
化調節細胞シグナル伝達因子の非リン酸化活性部位を結合する一本鎖Fv断片また
は抗体軽鎖可変領域から成る第1相互作用因子ドメインとを含む第1オリゴペプチ
ドおよびリン酸化調節細胞シグナル伝達タンパク質から成る第2相互作用因子ド
メインと枠内でシステイン残基または安定化トリペプチドを介してβラクタマー
ゼのC末端へと作動可能に融合されたフレキシブルポリペプチドリンカーとを含
む第2オリゴペプチドを、宿主細胞中に共に収めたプラスミドから同時発現させ
、その過程で前記第1相互作用因子ドメインの前記第2相互作用因子ドメインとの
結合の結果として前記βラクタマーゼが機能的に再構成されるようにすること βラクタマーゼ色原基質の存在下で宿主細胞の色を変える結果となる前記化合
物を検出すること を含んで成る方法。 - 【請求項５９】 リン酸化調節細胞シグナル伝達タンパク質がチロシンキナ
ーゼである請求項58記載の方法。 - 【請求項６０】 チロシンキナーゼがHer-2/neuである請求項59記載の方法
。 - 【請求項６１】 多重遺伝要素の宿主細胞への同時組み込み用の選択のため
の酵素相補システムにおいて、 抗生物質耐性タンパク質のN末端断片とC末端断片を宿主細胞中で同時発現させ
、その過程で前記N末端断片が第1形質をもコードする第1組み換え配列から発現
し、また前記C末端断片が第2形質をもコードする第2組み換え配列から発現する
ようにし、第1および第2組み換え配列の両方からポリペプチドを発現させる前記
細胞が前記抗生物質耐性タンパク質を再構成するに足る量の前記N末端断片およ
び前記C末端断片を産生するようにすること、および 前記抗生物質に対する耐性をもつ細胞を単離すること を含んで成る酵素相補システム。 - 【請求項６２】 抗腫瘍化合物のβラクタム誘導体を、それを必要とする宿
主中で活性化する方法において、 i) 前記宿主に対し、βラクタマーゼのN末端断片、フレキシブルポリペプチ
ドリンカーおよび腫瘍タンパク質のエピトープに対する第1一本鎖Fv断片を含む
第1オリゴペプチドと、前期腫瘍タンパク質の第2非重複エピトープに対する第2
一本鎖Fv断片、フレキシブルポリペプチドリンカーおよびβラクタマーゼのC末
端断片を含む第2オリゴペプチドとを同時に投与して、前記一本鎖Fv断片の前記
エピトープへの結合の結果としてβラクタマーゼが機能的に再構成されるように
すること、および ii) 前記抗腫瘍化合物の前記βラクタム誘導体を前記宿主に投与し、もって
前記誘導体が腫瘍タンパク質の近くで前記再構成βラクタマーゼにより活性化さ
れるようにすること を含んで成る方法。
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