JP4809767B2 - 発現ベクター、ポリペプチドディスプレイライブラリ、並びにそれらの作製及び使用方法 - Google Patents
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Description
Clackson, T. and J.A. Wells (1994) Trends In Biotech. 12(5):173-184 Shusta, E.V., et al. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10(2):117-122 Kodadek, T., (2001) Chem. Biol. 8(2):105-158 Lee, S.W., et al. (2002) Science 296 (5569):892-859 Nixon, A.E. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3(1): 1-12 Scott, J.K. and G.P. Smith (1990) Science 249(4967):386-390 Norris, J.D., et al. (1999) Science 285(5428):744-765 Arap, W., et al (1998) Science 279(5349):377-806 Whaley, S.R., et al. (2000) Nature 405(6787) :665-668 Wilson, D.S, et al. (2001) PNAS USA 98(7):3750-3755 Muller, O.J., et al. (2003) Nat. Biotechnol. 3:312 Bupp, K. and M.J. Roth (2002) Mol. Ther. 5(3):329-3513 Georgiou, G., et al., (1997) Nat. Biotechnol. 15(1):29-34 Boder, E.T. and K.D. Wittrup (1997) Nature Biotech. 15(6):553-557 Daugherty, P.S., et al. (2000) J. Immunol. Methods 243(1-2):211-227 Georgiou, G. (2000) Adv. Protein Chem. 55:293-315 Daugherty, P.S., et al. (2000) PNAS USA 97(5):2029-3418 Olsen, M.J., et al (2003) Methods Mol. Biol. 230:329-342 Boder, E.T. et al. (2000) PNAS USA 97(20):10701-10705 Lowman, H.B., et al. (1991) Biochem. 30(45):10832-10838 Zahn, G. (1999) Protein Eng. 12(12): 1031-1034 Mattheakis, L.C, et al. (1994) PNAS USA 91(19): 9022-9026 Maurer, J., et al. (1997) J. Bacteriol. 179(3):794-804 Samuelson, P., et al. (1995) J. Bacteriol. 177(6): 1470-1476 Robert, A., et al. (1996) FEES Letters 390(3): 327-333 Stathopoulos, C., et al. (1996) Appl. Microbiol. & Biotech. 45(1-2): 112-119 Georgiou, G., et al., (1996) Protein Engineering 9(2): 239-247 Haddad, D., et al., (1995) FEMS Immunol. & Medical Microbiol. 12(3-4):175-186 Pallesen, L., et al, (1995) Microbiol. 141(Pt 11): 2839-2848 Xu, Z. and S.Y. Lee (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65(11):5142-5147 Wernerus, H. and S. Stahl (2002) FEMS Microbiol. Lett. 212(1): 47-54 Westerlund-Wikstrom, B. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290(3):223-230 Brown, S. (1992) PNAS USA 89(18):8651-8655 Lang, H., et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267(1):163-170 Klemm, P. and M.A. Schembri (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290(3):215-221 Klemm, P. and M.A. Schembri (2000) Microbiol. 146(Pt 12):3025-3032 Kjaergaard, K., et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66(1): 10-14 Schembri, M.A., (1999) FEMS Microbiol. Lett. 170(2):363-371 Benhar, I., et al. (2000) J. Mol. Biol. 301(4):893-904 Lang, H., et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 485:133-136 Francisco, J.A., et al. (1993) PNAS USA 90(22):10444-10448 Taschner, S., et al. (2002) Biochem. J. 367(Pt 2):393-402 Etz, H., et al. (2001) J. Bacteriol. 183(23):6924-6935 Camaj, P., et al. (2001) Biol. Chem. 382(12):1669-1677 Lu, Z., et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(4):366-372 Christmann, A., et al. (1999) Protein Eng. 12(9):797-806 Lee, S.Y., et al. (2003) Trends Biotechnol. 21(1):45-52 Camaj, P., et al. (2001) Biol. Chem. 382(12):1669-1677 Schembri, M.A., et al. (2000) Infect. Immun. 68(5) :2638-2646 Tripp, B.C., et al., (2001) Protein Eng. 14(5):367-377 Kjaergaard, K., et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67(12):5467-5473 Lang, H., et al. (2000) Exp. Med. Biol. 485: 133-136
「細胞表面ディスプレイ」系の目的は生細胞上のポリペプチドをあらゆるサイズ及び分子組成の細胞外標的にディスプレイすることであるが、先行技術におけるLppOmpA’、周辺質ディスプレイ(PECS)、及び係留周辺質発現(APEx)系はこの目的を可能にすることができない。Stathopoulos, C., et al. (1996) Appl. Microbiol. & Biotech. 45(1-2): 112-119;Lang, H. (2000) Int. J. Med. Microbiol. 290(7):579-585;Lang, H., et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267(1):163-170;Lang, H., et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 485:133-136;及びChen, G., et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(6):537-542;Harvey, B. et al (2004). PNAS. 101(25) 9193-9198(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。LppOmpA’を用いる表面ディスプレイは、必ずしも必要とされるわけではないが任意の細胞外標的への結合を可能にする方法での、大腸菌の外膜にポリペプチドを局在化するのに遺伝的融合を使用することを指す。周辺質ディスプレイ及びLppOmpA’を用いる外膜局在化は、希少な例を除いて、細胞外巨大分子への結合と両立する方法でディスプレイタンパク質をもたらすことはない。Francisco, J.A., et al. (1992) PNAS USA 89(7):2713-2717;Stathopoulos, C., et al. (1996) Appl. Microbiol. & Biotech. 45(1-2):112-119;Francisco, J.A., et al. (1993) PNAS USA 90(22):10444-10448; Francisco, J.A.., et al. (1993) Bio/Technology 11(4):491-495;Francisco, J.A. and G. Georgiou (1994) Annals NY Acad. Sci. 745:372-382;及びGeorgiou, G., et al. (1993) Trends In Biotechnology 11(1):6-10(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。
pBAD33L1は、LppOmpAにおいて用いられるLppリーダー配列ではなくOmpAシグナル配列を利用することにより、内膜を通過する分泌を最適化する。
本件明細書に示されるように、ベクターの設計は2つのSfiI部位をOmp読み取り枠内に直接取り込み、かつ、好ましいサイズ(約108〜約1012)のライブラリの効率的な構築及び使用を可能にする最小化されたサイズを提供する。具体的には、pBAD33L1はOmpAループ1及び4内に直接設計されたSfiI制限部位を含むため、クローン化遺伝子を高い効率で挿入し、大きなライブラリを構築することが可能となる。
pBAD33L1は、cat及びベータラクタマーゼの両者ではなく、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする1つの耐性遺伝子のみを含む。そのため、プラスミドpBAD33L1はより小さく、それによりpB30Dよりも高い形質転換効率をもたらす。重要なことには、そのサイズ及びベータ−ラクタマーゼを有していないことにより、発現pBAD33L1が細胞の成長に強いる負荷は従来のベクターよりも小さいため、ライブラリスクリーニングが改善される。さらに、選択に殺菌性抗生物質を用いる能力は、プラスミドの損失及びその抗生物質に対して共通に耐性である細菌細胞の成長を防止するために好ましい。
p15A複製起点を利用する低コピープラスミドの使用により、細胞生存能力の大きな低下を伴わない発現が可能となった。図4を参照のこと。対照的に、pMB1起点を有する類似のディスプレイベクターは、高レベルの発現をもたらしたものの、誘導後ほどなく細胞成長の急激な停止を生じた(データ示さず)。ある態様においては、ディスプレイされるタンパク質の発現は、ライブラリの多様性を減少させ、かつ選択を妨害するクローン競合を防止するため、細胞成長を妨害することがない。低コピープラスミド使用の代替として、より高コピーのプラスミド、例えば、pMB1複製起点を含むプラスミドを、転写活性を低下させたプロモーターと組み合わせて用いることができた。
本発明の発現ベクターは、転写を調節するため、厳密に制御されたプロモーターを組み込む。本件明細書で例示されるように、用いられるプロモーターは大腸菌のアラビノースaraBADオペロンに由来するものである。Guzman, L., el al. (1995) J. Bacteriol. 177(14):4121-4130;Johnson, C.M. and R.F. Schleif(1995) J. Bacteriol. 177(12):3438-3442;Khlebnikov, A., et al. (2000) J. Bacteriol. 182(24):7029-7034;及びLutz, R. and H. Bujard (1997) Nucleic Acids Res. 25(6): 1203-1210(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。タンパク質産生は糖L−アラビノースを添加することによって開始され、アラビノースの除去及びグルコースの添加によって停止される。調節は、選択またはスクリーニング工程前後の成長の間の、希な望ましい標的細胞のディスプレイ頻度における望ましくない変化を防止する。
B.OmpX発現ベクター
に類似する実験がOmpX発現ベクターに対して実施され、同様の結果を伴った。
本発明の以前、ポリペプチドは、多くは外膜への挿入融合体もしくは外膜または細胞外付属器官(例えば、海馬采及び鞭毛融合タンパク質)への「サンドイッチ融合体」のいずれかとして、あるいは、より低い頻度で、細胞表面上に局在するものと考えられる短縮タンパク質もしくはハイブリッドタンパク質との融合体として細胞表面上にディスプレイされた。Lee, et al. (2003) Trends in Biotech 23(l):45-52;Pallesen, et al., (1995) Microbiology 141 :2839;及びEtz, et al. (2001) J. Bacteriol. 183(23):6924(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。後者の例にはLpp(OmpAaa46−159)系及び氷核形成タンパク質(InP)が含まれる。Georgiou, et al. (1997) Nat. Biotech. 15(l):29-34;及びShimazu, et al. (2001) Biotech. Prog. 17(1):76-80(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。
おいて公知の細胞ソーティング法を直接用いて単離する。
D1.生存している動物における腫瘍または組織/器官局在化細菌の選択
実施例4において示されるように、本発明によるライブラリまたはライブラリの所定のサブセットを、異種移植(zenografted)腫瘍を有する動物に注射することができる。数分〜数日の期間の後、所望の組織/体液、または腫瘍をその生物から取り出し、細菌増幅のためにその試料を細菌成長培地に移すことによって腫瘍または組織標的細菌を単離する。
本発明のディスプレイ系は、免疫応答が標的とする優性エピトープを同定する目的で、ヒト血清または動物血清に適用することができる。例えば、免疫応答は、後天性及び遺伝性疾患の両方(例えば、自己免疫疾患、癌、ウイルス感染等)において、疾患の原因、効果、及び潜在的な治療処置の点を同定するため、定量的に精査することができる。
配列の複雑性と安定性及び折り畳み及びOmpAの搬出の維持とのバランスを提供する15量体無作為挿入配列を選択した。図2を参照のこと。より長い挿入配列(例えば15量体)ライブラリは、10以上のアミノ酸を必要とする可能なより長い細胞結合モチーフを許容しながら短い配列のより多くのコピーを提供することを注記する。改変されたジスルフィド架橋を安定化のために用いることができるが、大腸菌周辺質におけるシステイン酸化は凝集及び搬出の減少につながる可能性があり、かつジスルフィドが偶然に出現する潜在的可能性があったため、該架橋は用いなかった。さらに、OmpAの膜さしわたしドメイン(membrane spanning domain)はより柔軟なループへのペプチド挿入のための強固な構造的錨を既に提供している。
すべての作業は、FA113において行ったYFP発現を除いて、大腸菌株MC1061(F araD139 Δ(ara−leu)7696 galE15 galK16 Δ(lac)X74 rpsL (StrR)hsdR2(rK -mK +)mcrA mcrB1)で行った。Bessette, P.M., et al., (1999) PNAS USA 96(24):13703-13849;及びCasadaban, M.J. and S.N. Cohen, (1980) J. Mol. Biol. 138(2): 179-207(これらは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。プライマーは、Integrated DNA Technology(Coralville、IA)、Operon-Qiagen(Valencia、CA)、及びInvitrogen(Carlsbad、CA)から得た。制限酵素はNew England BioLabs(Beverly、MA)製であった。ストレプトアビジン、R−フィコエリトリン結合体はMolecular Probes(Eugene、OR)から購入した。ビオチニル化、及びHRP結合、抗T7タグモノクローナル抗体はNovagen(Madison、WI)から得た。ストレプトアビジン被覆磁性微小ビーズはQiagen(Valencia、CA)、Dynal(Brown Deer、WI)、またはMiltenyi Biotec(Auburn、CA)から得た。抗ビオチンmAb被覆磁性ビーズ及び抗ビオチンmAb R−フィコエリトリンはMiltenyi Biotec(Auburn、CA)製であった。ビオチニル化及びAlexaFluor488を用いる蛍光標識は、それぞれ、Molecular Probes (Eugene、OR)製のFluoReporterR Mini-biotin-XX Protein Labeling Kit及びAlexa FluorR 488 Monoclonal Antibody Labeling Kitを用いて行った。ヒトC反応性タンパク質(カタログ番号C4063)及び血清アルブミン(カタログ番号A3782)はSigma(St. Louis、MO)製であった。ビオチニル化HIV−1 gp120はImmunoDiagnostics(Woburn、MA)から得た。
ライブラリ構築効率を最大化するため、非対称SfiI制限部位をOmpA発現ベクターのループ1の直前及びループ4の後に導入した。無作為エピトープ挿入を含むDNA断片群をPCRによって合成し、SfiIで消化し、ディスプレイベクターにライゲートして、高度に形質転換適格にすることができ、かつOmpA発現の制御へのaraBADプロモーターの使用を許容するara−である大腸菌株MC1061を形質転換した。Sidhu, S.S. (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11(6):610-616(これは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。
次に、特異的に標識された細胞を混合物から取り除くためにライブラリを保持する容器の外面に有意の強度の磁気を適用することによる富化サイクルの連続適用によって、所定のポリペプチドをディスプレイする細胞をそうではないものから分離した。図21を参照のこと。その後、磁性粒子に付着しない細胞を容器から除去し、関心がない細胞である場合には廃棄した。次いで、磁気を取り除き、無菌バッファを容器に加え、当該技術分野において公知の方法を用いて細胞及び磁性粒子を完全に再懸濁させた。
磁気的に富化されたライブラリ集団のフローサイトメトリースクリーニングを用いて、最も緊密に結合するペプチドのみをより正確に分離した。ペプチドリガンドの選択効率を評価するため、磁気選択で富化されたプールを、フローサイトメトリーを用いて、ビオチニル化T7抗体(100pMの最終濃度)、次いでストレプトアビジン−フィコエリトリンと共にインキュベートした後に高度に蛍光性の細胞についてスクリーニングに供した。図21を参照のこと。その後、保存された集団から無作為に選択されたクローンの配列決定を行った。図11を参照のこと。
多くの環境において、タンパク質と、別のタンパク質が結合するタンパク質部位とを決定すること、またはタンパク質結合エピトープをマッピングすることが望ましい。本発明を(1)タンパク質結合性ペプチドの単離、及び(2)選択されたタンパク質が結合するタンパク質配列の決定に用いうることを示すため、タンパク質マッピング実験を以下のように行った。
ライブラリをストレプトアビジン被覆ナノ球体(50nM)及びストレプトアビジン被覆微小粒子(Qiagen、Valencia、CA)の1:1混合物と共にインキュベートした。磁気選択を用いて結合性クローンを非結合性クローンから分離した。2回の選択で約25%を上回るストレプトアビジン結合性細胞の集団が得られた。その富化された集団を1nM濃度のストレプトアビジンで標識し、PBSで1×洗浄して、競合体としてのビオチンを100μM含むPBSに再懸濁した。この処理工程を用いて低解離速度定数を有するクローンを選択する。1時間後、検出可能な蛍光を保持する細胞をFACSを用いてソーティングした。寒天プレートに塗布し、一晩成長させた後にコロニーを採集することによって個々のクローンを単離した。磁気選択及び磁気選択+FACSの両者からのクローンを配列決定し、それらの解離速度定数をフローサイトメトリーを用いて測定した。図24を参照のこと。解離速度及び平衡解離定数はフローサイトメトリーを用いて測定した。図13及び図17を参照のこと。親和性が最も高いクローンは4nMの親和性及び0.0007s-1の解離速度定数を有していた。この配列機能データは配列機能関係の確立に用いることができる。
薬物送達及び精製用途への適合性を決定するため、上記処理を(潜在的なウイルス侵入阻害剤としての)HIV−1 gp120及びヒト血清アルブミンに結合するペプチドの単離に適用した。Sato, A.K., et al. (2002)Biotechnol. Prog. 18(2):182-192(これは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。選択されたペプチドの例が図25及び図26に示されている。本発明の方法を用いて単離されたペプチドの親和性は、同一の標的についてファージディスプレイを用いて単離されたペプチドの親和性を有意に上回ることが見出される。表6を参照のこと。
平衡結合曲線を得るため、上述のように、細胞を一連の範囲にわたる濃度(例えば約0.1〜200nM)の蛍光性結合標的タンパク質(ストレプトアビジン−フィコエリトリンまたはCRP−AlexaFluor488)で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。対応する平均蛍光対濃度データを一価結合等温式にフィットさせ、見かけのKDを得た。ストレプトアビジン結合性クローンの解離速度は約1〜2μMビオチンの存在下で測定した。細胞を50nMストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて30分間、室温で標識した。次に、それらの細胞をペレット化し、ビオチンと共にPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーによって直ちに分析した。蛍光データを約5分間連続的に収集した。その後、解離速度定数を前述のように決定した。Daugherty, P.S., et al. (1998)Protein Eng. 11(9):825-832(これは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。
OmpXループ2及びOmpXループ3発現ベクター
以下のプロトコルはポリペプチド及びポリペプチドライブラリをOmpXのループ2内にディスプレイするためのベクターの構築を具体的に説明するが、この手順は、表3に記載されるループ3の非保存領域を考慮することにより、当該技術分野における熟練者がOmpXのループ3に容易に適用することができる。ループ3において、ペプチド挿入は、Pro96を除去して、残基94〜99の間が好ましく、好ましくは残基95〜97の間である。大腸菌MC1061に由来する野生型OmpX:
atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagctgcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc/tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatac/ccg/acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttctaataa
(配列番号102)
を、KpnI切断部位を該遺伝子の前に導入し、またSfiI及びHindIII切断部位を該遺伝子の最後に導入して、プライマー1及びプライマー2を用いて増幅し、KpnI及びHindIII消化を用いてpBAD33に挿入し、pB33OmpXを創出した。 表7は使用したプライマーを示す。
循環置換(circularly permuted)OmpX(CPX)
パッセンジャーポリペプチドのNまたはC末端融合体としてのディスプレイ及び発現を、図14に示されるようにOmpの位相幾何的順序置換によって達成する。N末端融合構築体又はC末端融合構築体を創出するため、外膜タンパク質(この場合にはOmpX)の配列再配置を当該技術分野において公知のオーバーラップ伸長PCRを用いて達成した。Ho, et al. (1989)Gene 77(1):51-59(これは参照により本件明細書に組み込まれる);並びに図14、図27、図28、図30、及び図32を参照のこと。ポリペプチドパッセンジャー挿入点は、表面露出タンパク質、例えば、単量体Omp(OmpA、OmpX、OmpT等を含む)の非保存表面露出ループ配列内に生じるように、当該技術分野において公知の方法を用いて選択する。
1.N末端リーダーペプチド、例えば、外膜に局在するタンパク質(例えば、OmpX、OmpA等)に由来する天然N末端リーダーペプチドをコードするDNA配列、
2.(効率的なライブラリ構築のための)DNA制限酵素開裂部位、
3.細胞表面上に発現及びディスプレイさせるべき所定のポリペプチドをコードするDNA配列、
4.組換えDNA及びタンパク質工学技術において通常用いられる実体(例えば、細胞表面からのペプチド放出を可能にするタンパク分解性開裂部位等)を含みうる、ペプチドリンカーをコードするDNA配列、
5.ディスプレイが望まれる位置の挿入点(例えば、wtOmpXaa54)の下流(好ましくはすぐ下流)のアミノ酸で開始され、本来の停止コドン以外の本来の末端で終止する、キャリアタンパク質配列、
6.短く柔軟なペプチドリンカー配列(例えば、GGSGG(配列番号78)、または当該技術分野において公知の他のもの)をコードするDNA配列、
7.本来のリーダーペプチドの上流(好ましくはすぐ上流)のアミノ酸で開始され、選択された挿入部位の上流(好ましくはすぐ上流)のアミノ酸で終止するキャリアタンパク質の配列をコードするDNA配列、並びに
8.適切な制限酵素開裂部位(例えば、SfiI等)が後続する、効率的な終了のための2つの停止コドン。
本発明において公知の方法を用いる、図14の仕様によるN/C末端融合発現ベクター及び生じるDNA配列の構築に、以下の配列及びプライマーを用いた:
野生型大腸菌pro−OmpXのタンパク質配列(シグナルペプチド前開裂):
M K K I A C L S A L A A V L A F T A G T S V A A T S T V T G G Y A Q S D A Q G Q M N K M G G F N L K Y R Y E E D N S P L G V IG S F T Y T E K S R T A S / S G D Y N K N Q Y Y G I T A G P A Y R I N D W A S I Y G V V G V G Y G K F Q T T E Y / P / T Y K H D T S D Y G F S Y G A G L Q F N P M E N V A L D F S Y E Q S R I R S V D V G T W I A G V G Y R F * *(配列番号111)
野生型大腸菌OmpXのDNA配列:
atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagctgcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc/tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatac/ccg/acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttctaataa(配列番号112)
A.T7タグペプチドエピトープをOmpXループ2内のN末端融合体としてディスプレイするための連続(融合)DNA配列(成熟OmpXのアミノ酸53及び54の間):
(SS)atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct-gcgacttctact(配列番号113)
T7タグ:
atggcgagcatgaccggcggccagcagatgggt(配列番号114)
リンカー:
ggaggccagtctggccag(配列番号115)
OmpXアミノ酸54から最後(停止)まで:
tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatacccgacctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttc(配列番号116)
ペプチドリンカー:ggaggaagcgga(配列番号117)
OmpXaa1(構造の第1残基)−53:
gcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc(配列番号118)
停止コドン:taataa(配列番号119)
上記DNA配列の翻訳から生じるタンパク質配列=OmpXシグナル配列/T7/SfiI/AA54/AA148/AA1/AA53:
MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVA/MASMTGGQQMG/G/GQSGQ/SGDYNKNQYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGKFQTTEYPTYKHDTSDYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWIAGVGYRF/GGSG/ATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTEKSRTAS**(配列番号120)
C−末端ループ3ディスプレイベクターをコードする遺伝子要素の順序は:シグナル配列/OmpX 97−148/リンカー/OmpX 1−95/リンカー/T7タグペプチド/停止コドンである:この融合タンパク質は以下のDNA配列によってコードされる:
atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagctacctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttc/ggaggaagcgga/gcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagctctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatac/ggaggaagcggaggaa/tggcgagcatgaccggcggccagcagatgggt/taataa(配列番号121)
すぐ上のDNA配列=シグナルペプチド/AA97−AA148/リンカー/AA1−AA95/リンカー/T7タグの翻訳から生じるタンパク質配列:
MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVA/TYKHDTSDYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWIAGVGYRF/GGSG/ATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTEKSRTASSGDYNKNQYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGKFQTTEY/GGSGGMASMTGGQQMG**(配列番号122)
T7タグペプチドをコードする配列:
5' tggcgagcatgaccggcggccagcagatgggt(配列番号123)
MASMTGGQQMG(配列番号124)
ストレプトアビジン結合性ペプチドをコードする配列:
5' accgtgctgatttgcatgaacatctgttggacgggcgaaactcag(配列番号125)
TVLICMNICWTGETQ(配列番号126)
SacI及びKpnI5’部位:
ttcgagctcggtacctttgaggtggtt(配列番号127)
シグナル配列:
atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct(配列番号128)
MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVA(配列番号129)
SfiI&HindIII 3’部位:
ggccaaggtggccaagcttggctgtttt(配列番号130)
N−末端T7タグディスプレイベクターを構築するため、プライマー1〜14:
プライマー(5’→3’)1:長さ60融解温度48センス鎖
ttcgagctcggtacctttgaggtggttatgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggcc(配列番号131)
プライマー(5’→3’)2:長さ60融解温度49センス鎖
tttcagcagtggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagctatggcgagca(配列番号132)
プライマー(5’→3’)3:長さ60融解温度49センス鎖
agctatggcgagcatgaccggcggccagcagatgggtggaggaagcggaggatctggtga(配列番号133)
プライマー(5’→3’)4:長さ60融解温度50センス鎖
cggaggatctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggctta(配列番号134)
プライマー(5’→3’)5:長さ60融解温度49センス鎖
gctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggt(配列番号135)
プライマー(5’→3’)6:長さ60融解温度50センス鎖
gtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatacccgacctacaaacacgac(配列番号136)
プライマー(5’→3’)7:長さ60融解温度51センス鎖
cgacctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttca(配列番号137)
プライマー(5’→3’)8:長さ60融解温度48センス鎖
cgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagcc(配列番号138)
プライマー(5’→3’)9:長さ60融解温度50センス鎖
cttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggtt(配列番号139)
プライマー(5’→3’)10:長さ60融解温度48センス鎖
tgccggtgttggttaccgcttcggaggaagcggagcgacttctactgtaactggcggtta(配列番号140)
プライマー(5’→3’)11:長さ60融解温度48センス鎖
ctgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtt(配列番号141)
プライマー(5’→3’)12:長さ60融解温度51センス鎖
acaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtg(配列番号142)
プライマー(5’→3’)13:長さ60融解温度49センス鎖
gcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagctaat(配列番号143)
プライマー(5’→3’)14:長さ47融解温度49アンチセンス鎖
aaaacagccaagcttggccaccttggccttattagcttgcagtacgg(配列番号144)
並びに図28及び図29に相当するナンバリングされたスキームを当該技術分野において公知の標準PCRにおいて用いて以下の配列を得た:
5’隣接&シグナル配列:
/ttcgagctcggtacctttgaggtggtt/atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct/(配列番号145)
nt1〜159:
/gcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc/(配列番号146)
nt160〜285:
tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatac/ccg/(配列番号147)
nt289〜441:
acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttc/taataa(配列番号148)
5'ttcgagctcggtacctttgaggtggtt/atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct/gcgacttctact/atggcgagcatgaccggcggccagcagatgggt/ggaggccagtctggccag/tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatac/ccg/acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttc/ggaggaagcgga/gcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc/taataa 3'(配列番号149)
D.図28及び29によるN末端ループ2並びに図30及び図31によるC末端ループ3ディスプレイベクターを構築するため、下記DNA配列:
5’フランキング&シグナル配列(プライムw/PSD515)
ttcgagctcggtacctttgaggtggtt/atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct(配列番号150)
nt1〜159:
gcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc(配列番号151)
nt160〜285:
tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcatt
aacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccact
gaatac(配列番号152)
nt289〜441:
acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttctaataa(配列番号153)
を合成し、以下のプライマー1〜16:
プライマー(5’→3’)1:長さ45融解温度49センス鎖:
ttcgagctcggtacctttgaggtggttatgaaaaaaattgcatgt(配列番号154)
プライマー(5’→3’)2:長さ57融解温度48アンチセンス鎖:
gcggtgaaagccagaactgcggccagtgctgaaagacatgcaatttttttcataacc(配列番号155)
プライマー(5’→3’)3:長さ57融解温度48センス鎖:
tggctttcaccgcaggtacttccgtagctacctacaaacacgacaccagcgactacg(配列番号156)
プライマー(5’→3’)4:長さ57融解温度49アンチセンス鎖:
ttttccatcgggttgaactgcagacccgcaccgtaggagaaaccgtagtcgctggtg(配列番号157)
プライマー(5’→3’)5:長さ57融解温度48センス鎖:
ttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgt(配列番号158)
プライマー(5’→3’)6:長さ57融解温度50アンチセンス鎖:
gcggtaaccaacaccggcaatccaggtgcctacgtcaacgctacgaatacggctctg(配列番号159)
プライマー(5’→3’)7:長さ57融解温度48センス鎖:
ggtgttggttaccgcttcggaggaagcggagcgacttctactgtaactggcggttac(配列番号160)
プライマー(5’→3’)8:長さ57融解温度48アンチセンス鎖:
ccgcccattttgttcatttggccctgagcgtcgctctgtgcgtaaccgccagttaca(配列番号161)
プライマー(5’→3’)9:長さ57融解温度49センス鎖:
gaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaaca gcccgct(配列番号162)
プライマー(5’→3’)10:長さ57融解温度51アンチセンス鎖:
cagtacggcttttctcggtgtaagtgaaagaaccgatcacacccagcgggctgttgt(配列番号163)
プライマー(5’→3’)11:長さ57融解温度49センス鎖:
cgagaaaagccgtactgcaagctctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcat(配列番号164)
プライマー(5’→3’)12:長さ57融解温度51アンチセンス鎖:
tgcttgcccagtcgttaatgcggtaagccggaccagcagtgatgccgtagtactggt(配列番号165)
プライマー(5’→3’)13:長さ57融解温度49センス鎖:
cgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccac(配列番号166)
プライマー(5’→3’)14:長さ57融解温度48アンチセンス鎖:
ccggtcatgctcgccattcctccgcttcctccgtattcagtggtctggaatttacca(配列番号167)
プライマー(5’→3’)15:長さ57融解温度48センス鎖:
cgagcatgaccggcggccagcagatgggttaataaggccaaggtggccaagcttggc(配列番号168)
プライマー(5’→3’)16:長さ19融解温度49アンチセンス鎖:
aaaacagccaagcttggcc(配列番号169)
を用いるPCRを図30のスキームに従って用いて重複させ:
ttcgagctcggtacctttgaggtggttatgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagct/acctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgcgggtctgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttc/ggaggaagcggagcgacttctactgtaactggcggttacgcacagagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagc/tctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatacg/gaggaagcggagga/atggcgagcatgaccggcggccagcagatgggt/taataa(配列番号170)
によってコードされる完全長C末端ディスプレイベクターを得た。
プラスミドpB33NLXT2(ループ2にT7タグを有するロイシン非含有OmpX)を、ループ2内にT7タグペプチドが挿入されているOmpXをコードするプラスミド発現ベクターpBAD33OmpX−T7タグ−L2に構築された非ロイシン含有OmpXライブラリ(NLL)から、アラビノースプロモーター(B)の転写制御の下、p15A複製起点を有する低コピープラスミドで、ロイシンを欠く最小培地において成長するロイシン栄養要求体(MC1061)におけるT7タグディスプレイに基づいてFACSを用いて選択することにより単離した。このOmpX変種は突然変異L17V、L14V、L10V、L26V、L37I、L113V、L123Vを有し、ここでアミノ酸のナンバリングは野生型OmpXの成熟形態に基づくものである。
NLCPX−C7Cライブラリを、プライマーPD707/180を用いるpB33NLCPXのPCR増幅によって構築した。5’末端の断片の長さを伸長するため、生成物を25倍に希釈してプライマーPD753/180を含む新鮮なPCRに入れた。生じる生成物を精製し、SfiIで消化して再精製し、pB33NLCPXのSfiI/HindIIIによる消化で生じる大断片にライゲートした。次に、電気穿孔法を用いて該ライゲーション混合物で電気コンピタント大腸菌MC1061を形質転換し、グルコース補充LB中で細胞を一晩成長させてN末端ペプチドディスプレイライブラリを得た。これは等分することも、成長によってさらに増幅することもできる。
天然または改変された細胞の翻訳機構によって認識及び取り込みされ得る非正準アミノ酸類似体を、足場を以下で説明されるように再設計することにより、より効率的にディスプレイすることができる。Link, A.J. et al.(2003)Curr. Opin. Biotechnol. 14(6):604(これは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。1以上の天然アミノ酸に対応するすべてのコドンを、まず、内部のすべてのコドンをランダム化して代替アミノ酸をコードするコドンを生成する遺伝子組み立て突然変異誘発(gene assembly mutagenesis)によってOmp遺伝子変種ライブラリを構築することにより除去する。Bessette, et al. (2003) Methods. Mol. Biol. 231 :29-37(これは参照により本件明細書に組み込まれる)を参照のこと。その後、選択またはスクリーニングを用いて、対応する天然アミノ酸の不在下でパッセンジャータンパク質を効率的にディスプレイするOmp変種を単離する。
発現ベクターを用いるアッセイ
以下の2つの方策を用いて、腫瘍細胞に結合し、かつ潜在的に内在化される配列を単離した。まず、腫瘍細胞と共にインキュベートし、腫瘍細胞を選択沈殿させることにより、細菌ディスプレイライブラリを結合性に基づいて選択した。沈殿による1回の富化を結合性または内在化性配列の富化に用いた。細胞外細菌を抗生物質ゲンタマイシンで選択的に殺すように設計された工程を含めたさらに2回の富化を実施した。その後、細胞内細菌を、腫瘍細胞溶解を優先的に生じる浸透圧ショック条件によって回収した。ゲンタマイシン選択工程を含む2回の選択により、FACS侵襲アッセイにおける緑色腫瘍細胞のパーセンテージがさらに増加した。図23を参照のこと。腫瘍細胞に付着する細菌の簡単な同時沈殿及びゲンタマイシン選択による最初の3回の富化の後、定量的かつ効率的なFACSスクリーニングを促進するため、GFP発現ベクターを各回から得られたライブラリプールの各々に電気穿孔で入れ、ライブラリ集団の残存に成功する選択をモニターした。図23を参照のこと。2回のFACSスクリーニングによりさらなる富化がもたらされた。図20を参照のこと。ATCC(Manassas、VA)から入手したZR−75−1腫瘍細胞株(ATCC No. CRL−1500)への内在化性に基づく5回の選択の後、1個のクローンを単離し、ゲンタマイシン保護アッセイに示されると同様にそれらの内在化効率についてアッセイした。単離されたクローンは、陰性対照に対して、標的細胞株中に内在化する能力を約200倍(0.005□ 1.0%)まで示した。第5回選択から単離された配列のパネルの配列を図7に示す。
本願は、Patrick S. Daugherty、Paul H. Bessette、及びJeffrey Riceを共同発明者として列挙する2003年8月18日出願の米国仮特許出願第60/495,698号(これは参照によりその全体がここに組み込まれる)の利益を主張する。
Claims (22)
- 細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において、細菌性外膜タンパク質の細胞外ループを含むキャリアタンパク質に融合した所定のパッセンジャーポリペプチドを発現及びディスプレイする発現ベクターであって、前記パッセンジャーポリペプチドは所定のリガンドと相互作用可能であり、前記細胞外ループは開裂して前記細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞の外表面に露出したN末端、C末端、またはその両方を生じて該末端には前記所定のパッセンジャーポリペプチドが融合しており、天然のC末端及び天然のN末端はペプチドリンカーを介して互いに融合している、前記発現ベクター。
- 前記外表面に露出した前記N末端及び前記C末端に、リガンドが接近可能である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記パッセンジャーポリペプチドのC末端が前記キャリアタンパク質のN末端に融合しているか、あるいは前記パッセンジャーポリペプチドのN末端が前記キャリアタンパク質のC末端に融合している、請求項1または2に記載の発現ベクター。
- 前記細菌性外膜タンパク質がOmpAまたはOmpXである、請求項1記載の発現ベクター。
- 前記細胞外ループが、OmpAの第1細胞外ループ、OmpXの第2細胞外ループ、またはOmpXの第3細胞外ループである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記パッセンジャーポリペプチドがストレプトアビジンまたはT7結合性ペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記細菌細胞が、大腸菌(Escherichia coli)、ソネ赤痢菌(Shigella sonnei)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、フレクスナー赤痢菌(Shingella flexneri)、サルモネラ菌(Salmonella typhimurium)、腸炎菌(Salmonella enterica)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、ペスト菌(Yersinia pestis)、または肺炎桿菌(Klebsiella pnewnoniae)である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 低コピー複製起点をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記低コピー複製起点がp15A複製起点である、請求項8に記載の発現ベクター。
- 殺菌性抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記殺菌性抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする、請求項10に記載の発現ベクター。
- 少なくとも1つのSfilエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- アラビノースaraBAD大腸菌オペロンプロモーターをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 発現がL−アラビノースの添加で誘導され、アラビノースの除去及びグルコースの添加によって停止する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記キャリアタンパク質が核酸分子によってコードされ、前記核酸分子はロイシンをコードするコドンがバリンまたはイソロイシンをコードする置換コドンで置換されているコドンを少なくとも1つ含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- ロイシンをコードするすべてのコドンが置換されている、請求項15に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 複数のポリペプチドを発現することが可能な、複数の、請求項1〜16のいずれか1項に記載の発現ベクターを創出すること、及び発現を誘導することを含む、ポリペプチドディスプレイライブラリの製造方法。
- 請求項1から16のいずれか1項に記載の発現ベクターの発現を誘導することにより細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞の外表面に発現した、キャリアタンパク質の細胞外ループに融合したパッセンジャーポリペプチド。
- 前記細胞外ループが、OmpAの第1細胞外ループ、OmpXの第2細胞外ループ、またはOmpXの第3細胞外ループである、請求項19に記載のパッセンジャーポリペプチド。
- 請求項19または20に記載のパッセンジャーポリペプチドを含む、パッセンジャーポリペプチドライブラリー。
- 試料中の所定のリガンドを検出、モニター、または測定するためのアッセイ方法であって、請求項19または20記載のパッセンジャーポリペプチドを前記試料と接触させ、前記パッセンジャーポリペプチドが前記リガンドと相互作用するかどうかを観察することを含む、前記アッセイ方法。
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