CN114585730A - 工程化调节性t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种工程化调节性T细胞(Treg)，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域。本发明还提供了一种在受试者中促进肝脏组织修复和/或再生的方法，其包括向所述受试者施用包含CAR的工程化Treg或包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。

Description

工程化调节性T细胞
技术领域
本发明涉及工程化调节性T细胞以及此类细胞在免疫介导的肝脏损伤中的治疗用途。特别地，本发明涉及能够识别肝细胞、治疗和/或预防移植排斥或免疫介导的损伤以及促进肝细胞再生的工程化调节性T细胞。
背景技术
肝脏是一个重要的器官，它支持着身体中几乎所有其他器官。由于其关键位置和重要功能，肝脏很容易发生疾病，特别是免疫介导的损伤。全世界每年约有200万人死于肝病，其中100万人死于肝硬化的并发症，100万人死于病毒性肝炎和肝细胞癌。肝硬化目前是全球第11位最常见的死亡原因。肝硬化是造成伤残调整寿命年和寿命损失年的前20大原因，占全世界负担的1.6％和2.1％(Asrani,S.K.,等.,2018.Journal of hepatology,70,第151-171页)。
常见的自身免疫性肝脏疾病，如原发性胆汁性胆管炎和原发性硬化性胆管炎，可能会损害肝脏并导致肝硬化。原发性胆汁性胆管炎的疾病负担通常表现为生活质量差、健康状况受损以及明显的疲劳、瘙痒和抑郁症状。原发性硬化性胆管炎是胆管癌、胆囊癌和结直肠癌的风险因素，并可能导致过早死亡。与普通人群相比，原发性硬化性胆管炎患者的死亡风险增加4倍，但特别是患胆管癌的风险增加了398倍(Asrani,S.K.,等.2018.Journalof hepatology,70,第151-171页)。
肝硬化也可以由炎症性肝脏疾病引起，如病毒性肝炎或脂肪性肝炎。2010年，每年因病毒性肝炎死亡的人数为30万，比1990年增加了46％。病毒性肝炎从第10位主要死因(1990年)上升到2013年的第7位主要死因。2015年，病毒性肝炎相关疾病导致134万人死亡，与结核病造成的死亡人数(137万)相似，高于HIV(106万死亡)或疟疾(44万死亡)造成的死亡人数(Asrani,S.K.,等.2018.Journal of hepatology,70,第151-171页)。
此外，移植物耐受和存活是在肝移植过程中的一个重要的问题。15-25％的肝移植受者在基于他克莫司的免疫抑制方案中发生急性细胞排斥反应，一般在使用类固醇后会改善。虽然急性排斥反应通常对治疗反应良好，但慢性排斥反应代表了一种困难的情况，相当一部分患者对增加的免疫抑制没有反应。慢性排斥反应经常导致再移植或死亡(Choudhary,N.S.,等,2017.Journal of clinical and experimental hepatology,7(4),第358-366页)。因原发性胆汁性胆管炎而接受肝移植的患者中五年死亡率最低。可复发的疾病包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎(Hirschfield,G.M.,等,2009.BMJ,338,p.b1670)。
肝移植还可能导致由移植物抗宿主病引起的免疫介导的损伤。报道的移植物抗宿主病的发生率从0.1％至2％不等，死亡率超过75％(Akbulut,S.,等,2012.World journalof gastroenterology,18(37),第5240页)。
肝脏具有独特的再生特性，可以帮助减轻免疫介导的损伤。然而，在慢性免疫介导的损伤的情况下，肝细胞会发生衰老，其再生能力受损，这导致了肝衰竭的发展，并导致显著的患者发病率和死亡率(Aravinthan,A.D.和Alexander,G.J.,2016.Journalofhepatology,65(4),第825-834页)。此外，响应免疫介导的损伤的肝脏再生会产生不利影响，导致肝硬化和肝癌(Michalopoulos,G.K.,2017.Hepatology,65(4),第1384-1392页)。
因此，能够治疗和/或预防免疫介导的损伤并促进肝脏再生的疗法将对肝脏疾病的处理具有巨大的治疗潜力。
因此，需要有治疗和/或预防免疫介导的损伤并促进肝脏再生的疗法。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含胞内结构域，所述胞内结构域包含STAT5结合基序以及JAK1结合基序和/或JAK2结合基序。在一些进一步的实施方案中，所述胞内结构域包含JAK3结合基序和/或不包含STAT3结合基序。
适当地，所述CAR胞内结构域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)。适当地，所述CAR胞内结构域的IL2Rβ部分不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)。
与受试者的一般T细胞群相比，本发明的具有STAT5信号传导的工程化Treg在抗原识别后为工程化CAR-Treg提供生存优势方面可能特别有效。特别地，在例如使用免疫抑制药物降低IL-2可用性的移植的情况下，CAR-Treg的STAT5信号传导在原本不利的微环境中为本发明的Treg提供了额外的存活和功能影响。
在另一方面，本发明提供了一种包含根据本发明的工程化Treg的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的工程化Treg或药物组合物用于诱导受试者对肝移植的耐受性，或者用于治疗和/或预防受试者的肝移植排斥、肝移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病。
在另一方面，本发明提供了一种诱导受试者对肝移植的耐受性的方法，或者治疗和/或预防受试者的肝移植排斥、肝移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病的方法，其中，所述方法包括将根据本发明的工程化Treg或药物组合物施用于所述受试者的步骤。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的工程化Treg在制备用于诱导受试者对肝移植的耐受性的药物中的用途，或者在制备治疗和/或预防受试者的肝移植排斥、肝移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)或者包含所述工程化Treg的药物组合物用于在受试者中修复和/或再生肝脏组织，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
在另一方面，本发明提供了在受试者中促进肝脏组织修复和/或再生的方法，其包括向所述受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg或者包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
在另一方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg在制备用于促进受试者肝脏组织修复和/或再生的药物中的用途，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
在另一方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)或包含所述工程化Treg的药物组合物用于在受试者中治疗和/或预防肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗和/或预防肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的方法，其包括向所述受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg或包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
在另一方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg在制备用于治疗和/或预防受试者肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的药物中的用途，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
本发明进一步提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域，还进一步包含CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含胞内结构域，所述胞内结构域包含STAT5结合基序以及JAK1结合基序和/或JAK2结合基序。在一些进一步的实施方案中，所述胞内结构域包含JAK3结合基序和/或不包含STAT3结合基序。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种CAR，其中所述CAR包含特异性结合ASGR的抗原识别结构域，还包含STAT5结合基序以及JAK1结合基序和/或JAK2结合基序，并且所述CAR优选包含JAK3结合基序和/或不包含STAT3结合基序。
本发明进一步提供了编码本发明所述CAR的多核苷酸、核酸或载体。
本发明进一步提供了一种生产根据本发明的工程化Treg的方法，包括如下步骤：
(i)从受试者中分离含有细胞的样品，或提供含有细胞的样品；以及
(ii)用编码所述CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染所述含有细胞的样品，以提供工程化细胞群；
其中所述含有细胞的样品包含Treg，和/或，在步骤(ii)之前或之后从所述含有细胞的样品富集和/或生成Treg。
附图说明
图1-抗ASGR1 CAR构建体的示例性设计
示例性抗ASGR1 CAR构建体的示意图。(A)抗ASGR1 CAR构建体，包含：ASGR1 VH抗原识别结构域；CD8α铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；CD3z信号传导结构域；P2A裂解结构域；以及eGFP。(B)抗ASGR1 CAR构建体，包含：ASGR1 VH抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；CD3z信号传导结构域；P2A裂解结构域；以及eGFP。
图2-抗ASGR1 CAR-Treg的生成
直方图显示了通过FACS评估的抗ASGR1 CAR-Treg的生成。(A)未转导的Treg。(B)转导的Treg。将分离的CD4+CD25高CD127-细胞分离出来并用抗CD3/CD28珠子活化。活化两天后，用含有ASGR1-CAR和GFP报告基因的慢病毒转导Treg。将转导和未转导的Treg培养10天，测量GFP以评估转导效率。
图3-在HepG2细胞系上ASGR1表达的验证
直方图显示了通过FACS评估的在K562细胞和HepG2细胞中的ASGR1水平。(A)K562细胞。(B)HepG2细胞。
图4-抗ASGR1 CAR-Treg的抗原特异性的评估
直方图显示了通过FACS评估的与(i)仅培养基；(ii)HepG2细胞；以及(iii)抗CD3/CD28珠子培养时CD69所响应的表达。(A)转导的Treg(GFP+)。(B)转导的Treg(GFP-)。(C)未转导的Treg(GFP-)。在仅存在培养基时，没有观察到CD69的上调。与HepG2细胞培养后，只有GFP+转导的Treg(而不是GPF阴性转导的细胞或未转导的细胞)上调CD69。相反，当用非特异性抗CD3/CD28珠子刺激培养时，所有细胞都上调了CD69。
图5-抗ASGR1 CAR-Treg的抗原特异性抑制功能的评估(Treg:Teff为1:1)
直方图显示通过FACS评估的活化效应CD4+CD25-T细胞的增殖。抑制试验显示了抗ASGR1 CAR-Treg对用增殖染料染色并用抗CD3/CD28珠子预活化的效应T细胞的增殖能力的影响。在对HepG2刺激的响应中，抗ASGR1 CAR Treg能够有效抑制常规T细胞的增殖。
图6-抗ASGR1 CAR-Treg的抗原特异性抑制功能的评估(Treg:Teff为1:1、1:2和1:5)
Treg:Teff为1:1、1:2和1:5的抑制试验结果。抑制试验显示抗ASGR1 CAR-Treg对用增殖染料染色和用抗CD3/CD28珠子预活化的效应T细胞的增殖能力的影响。在对HepG2刺激的响应中，抗ASGR1 CARTreg能够以比未转导的Treg更低的Treg:T效应比例有效抑制常规T细胞的增殖。
图7-抗HLA.A2 IL2RCAR构建体的示例性设计
示例性的抗HLA.A2 CAR构建体的示意图，包括IL2R胞内结构域的不同组合。(A)dCAR构建体：HLA.A2 scFv抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM和eGFP。(B)CD28z构建体：HLA.A2 scFv抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；CD3z信号传导结构域和eGFP。(C)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；截短的IL2RB胞内结构域；CD3z信号传导域和eGFP。(D)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；截短的IL2RG；截短的IL2RB胞内结构域；CD3z信号传导结构域和eGFP。(E)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别结构域；CD28铰链结构域；CD28 TM；CD28信号传导结构域；截短的IL2RB胞内结构域；CD3z信号传导结构域；FP2A裂解结构域和eGFP。
图8-抗HLA.A2 IL2RCAR-Treg的生成
示意图显示了抗HLA.A2 IL2R CAR-Treg的生成和扩增。(A)将分离的CD4+CD25高CD127低细胞分离出来并用抗CD3/CD28珠子活化。活化三天后，用含有HLA.A2-CAR和GFP报告基因的慢病毒转导Treg。每2天加入新鲜培养基和1000IU/ml IL-2。将转导和未转导的Treg培养10天，测量GFP以评估转导效率。用新鲜的抗CD3/CD28珠子进一步扩增Treg。(B)活化后第10天，未转导或转导不同CAR构建体的Treg的倍数变化扩增。
图9-抗HLA.A2 IL2R构建体的转导效率随着时间推移的量化
在细胞活化后的不同时间点，对未转导的Treg和用CAR构建体转导的Treg进行GFP表达分析。(A)转导7天后HLA-A2 IL2R CARTreg的GFP表达的代表性等高线图。(B)转导7天后，活CD4+细胞中GFP+CARTreg的量化。(C)HLA-A2 IL2R CARTreg的GFP表达随着时间推移的量化。
图10-抗HLA.A2 IL2RCAR构建体在转导的Treg上的细胞表面表达的量化
通过PE偶联的HLA-A*0201/CINGVCWTV dextramer(Immudex，哥本哈根，丹麦)分析CAR构建体在未转导的Treg和转导的Treg上的膜表达。(A)转导7天后GFP+Dextramer+CARTreg的代表性等高线图。(B)转导后第7天GFP+Treg中Dextramer+细胞的量化。
图11-多克隆细胞扩增后CARTreg的表型特征
在抗CD3/CD28活化珠子和IL-2的存在下，对Treg进行15天的培养和扩增。通过FACS分析未转导的Treg和转导的Treg上的Treg相关标志物FOXP3、HELIOS、CTLA4和TIGIT，以评估培养第15天的表型谱系稳定性。
图12-抗HLA.A2 IL2RCARTreg的抗原特异性的评估
在不同刺激的存在下，将未转导的Treg和转导的Treg培养18小时。分析CD69和CD137活化标志物以评估特异性和非特异性的细胞活化。(A)代表性的等高线图显示了用HLA.A1分子或HLA.A2分子转导的K562细胞培养时CD69所响应的表达。GFP信号用于选择转导的Treg。(B)与仅培养基(未刺激)、抗CD3/CD28珠子(非特异性刺激)、K562-HLA.A1细胞和K562-HLA.A2细胞培养18小时后，Treg上CD69和CD137表达的量化。(C)代表性的直方图显示了与HLA.A1细胞系和HLA.A2 B细胞系培养18小时后CD69在Treg上的表达。使用了不同的细胞与细胞比例。
图13-STAT5磷酸化分析作为IL2R CAR信号传导的指标
将转导的CARTreg在不含IL2的培养基中静置过夜。在仅培养基、1000IU/ml IL-2或基于HLA.A2-Ig的人工APC(按照DOI:10.3791/2801描述的方案制备)存在下培养10分钟和120分钟后，通过FACS分析评估Treg的STAT5磷酸化。(A)等高线图显示了在仅培养基、HLA.A2珠子以1:1的比例和1000IU/ml IL-2培养10分钟后，转导的CAR-Treg上GFP和磷酸化STAT5的表达。(B)直方图显示了用HLA.A2珠子1:1的比例或仅培养基(未刺激)培养120分钟，Treg的STAT5的磷酸化。
图14-在没有IL-2的情况下对非特异性活化和HLA.A2特异性活化后Treg存活的评估
在不存在IL-2的情况下，将不同构建体的CAR转导的Treg与抗CD3/28活化珠子和K562.A2表达细胞进行培养。活化后7天通过FACS分析评估细胞存活。(A)CAR-Treg的代表性直方图显示了在没有IL-2的活化后第7天，基于Viability染料染色的GFP+细胞的细胞存活。(B)在没有IL-2的情况下，抗CD3/28珠子和K562-HLA.A2细胞培养7天后，GFP+Treg中活细胞的百分比(*p<0.05，方差分析和Tukey事后检验)。
图15-Treg抑制效力测试：通过分析B细胞上共刺激分子的调节来评估Treg的免疫调节功能
对与Treg共培养后的B细胞的CD80和CD86的表达进行分析，以评估Treg降低抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。将固定数量的表达A2的活B细胞(20K/孔)与滴定数量(200、100、50、25、12.5K)的Treg产物(A2阴性供体)共同培养过夜。对B细胞上的CD86和CD80共刺激标志物进行FACS分析。
图16-预活化的非转导Treg在体外对原代肝细胞产生白蛋白的影响的评估
将原代肝细胞单独培养或在事先活化的调节性T细胞的存在下培养7天。调节性T细胞的加入导致在上清液中可检测到白蛋白分泌的改善。当将肝细胞在没有调节性T细胞但存在从含有活化的调节性T细胞的培养物中获得的条件培养基的情况下培养时，注意到了类似的效果。该图显示，在体外加入预活化的非转导Treg增加了原代肝细胞的白蛋白产量。
图17-预活化的非转导Treg和效应T细胞在体外对原代肝细胞产生白蛋白的影响的评估
将原代肝细胞单独培养或在事先活化的调节性T、预活化的效应T细胞或两者的存在下培养3天。调节性T细胞的加入导致上清液中可检测到白蛋白分泌的改善。当将肝细胞与效应T细胞培养时，没有观察到这种情况，而是导致白蛋白水平降低的趋势。甚至当调节性T细胞与预活化的效应T细胞结合时，仍观察到调节性T细胞对白蛋白水平的有利影响。该图显示，在体外加入预活化的非转导Treg而非效应T细胞，增加了原代肝细胞的白蛋白产量。
图18-抗ASGPR CARTreg在体外对原代肝细胞产生白蛋白的影响的评估
将原代肝细胞单独培养，或在静息(resting)未操作的调节性T细胞或静息的调节性T细胞的存在下进行慢病毒转导以表达抗ASGPR CAR。只有携带抗ASGPR的Treg，因此能够对肝细胞表达的ASGPR进行抗原特异性活化响应，对上清液中的白蛋白水平产生显著影响。该图显示，在体外加入表达抗ASGPR CAR的非预活化的Treg增加了原代肝细胞的白细胞产量，超过了使用非转导Treg时所达到的产量。
具体实施方式
本发明提供了一种包含CAR的工程化Treg，该CAR仅在CAR与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合时向Treg提供活化信号；从而增强了工程化Treg特异性地在肝脏微环境中的保留、功能和存活。
本发明的所述工程化Treg在与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合后可以增加或改善肝脏再生和组织修复。
现在将通过非限制性实例的方式描述本发明的各种优选特征和实施方案。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”是同义的，并且是包容性或开放式的，不排除额外的、非列举的成员、要素或方法步骤。术语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised of)”也包含术语“由...组成(consisting of)”。
本文所讨论的出版物仅为了它们在本申请的申请日之前的公开而提供。本文的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。
本公开不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，与本文所描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列都是按5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基方向从左到右书写。
工程化调节性T细胞(Treg)
调节性T细胞(Treg)是具有抑制功能的免疫细胞，可控制细胞病变性免疫反应，并对维持免疫耐受至关重要。
如本文所用，术语Treg是指具有免疫抑制功能的T细胞。
适当地，“免疫抑制功能”可以指Treg减少或抑制免疫系统响应于如病原体、抗原(例如异体抗原)或自身抗原等的刺激而产生的生理效应和细胞效应中的一种或多种的能力。这种效应的实例包括增加的常规T细胞(Tconv)增殖和促炎性细胞因子的分泌。任何这种效应都可以作为免疫反应强度的指标。在存在Treg的情况下，Tconv的免疫反应相对较弱，这表明Treg具有抑制免疫反应的能力。例如，细胞因子分泌的相对减少表明免疫反应较弱，从而表明Treg抑制免疫反应的能力。Treg也可以通过调节抗原呈递细胞(APC)(如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞)上的共刺激分子的表达来抑制免疫反应。CD80和CD86的表达水平可用于评估活化的Treg在体外共培养后的抑制功效。
本领域已知检测方法用于测量免疫反应强度的指标，从而测量Treg的抑制能力。特别地，可将抗原特异性Tconv细胞与Treg共培养，并将相应抗原的肽添加到共培养物中以刺激来自所述Tconv细胞的反应。所述Tconv细胞的增殖程度和/或它们响应于肽的添加而分泌的细胞因子IL-2的量可用作共培养的Treg的抑制能力的指标。
与本发明的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞的增殖可以比不存在本发明的Treg的情况下培养相同的Tconv细胞少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。
与本发明的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞表达的效应细胞因子可以比在没有本发明的Treg的情况下培养的相应Tconv细胞少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。
所述效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。
适当地，所述效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF和IFN-γ。
适当地，所述Treg是一种表达CD4、CD25和FOXP3(CD4+CD25+FOXP3+)标志物的T细胞。“FOXP3”是叉头框P3蛋白的简称。FOXP3是转录因子FOX蛋白家族的成员，在调节性T细胞的发育和功能中作为调节途径的主要调节因子发挥作用。
标志物水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如流式细胞术。
Treg还可以表达CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关分子4)和/或GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体)。Treg细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。
适当地，可以在不表达表面蛋白CD127或结合低水平表达表面蛋白CD127的情况下(CD4+CD25+CD127-或CD4+CD25+CD127低或CD4+CD25高CD127-或CD4+CD25高CD127低)，使用细胞表面标志物CD4和CD25来识别所述Treg。使用此类标志物来识别Treg是本领域已知的，并且在例如Liu等(JEM；2006；203；7(10)；1701-1711)中有所描述。
所述Treg可以是CD4+CD25+FOXP3+T细胞或CD4+CD25高FOXP3+T细胞。
所述Treg可以是CD4+CD25+CD127-T细胞或CD4+CD25高CD127-T细胞。
所述Treg可以是CD4+CD25+FOXP3+CD127-T细胞或CD4+CD25高FOXP3+CD127-T细胞。
所述Treg可以具有去甲基化的Treg特异性去甲基化区(TSDR)。TSDR是调节FOXP3表达的一个重要的甲基化敏感元件(Polansky,J.K.,等,2008.European journal ofimmunology,38(6),第1654-1663页)。
所述Treg可以是天然的或胸腺来源的，适应性的或外周来源的，或体外诱导的(Abbas,A.K.,等,2013.Nature immunology,14(4),第307-308页)。适当地，所述Treg可以是CD4+CD25+FOXP3+Helios+神经纤毛蛋白1+。
进一步合适的Treg包括但不限于Tr1细胞(其不表达Foxp3且具有高的IL-10产量)；CD8+FOXP3+T细胞；以及γδFOXP3+T细胞。
适当地，所述Treg是从获取自受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离的。合适的所述受试者为哺乳动物，优选人类。
适当地，所述Treg与将被施用工程化Treg的受试者相匹配(例如HLA匹配)或是受试者自体的。适当地，将被施用工程化Treg的所述受试者为哺乳动物，优选人类。所述Treg可以从患者自己的外周血(第一方)，或在造血干细胞移植的情况下从供体的外周血(第二方)，或从无关联的供体的外周血(第三方)离体生成。适当地，所述Treg是将被施用工程化Treg的所述受试者自体的。
在一个优选实施方案中，所述Treg是从获取自受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离的，并且与将被施用工程化Treg的受试者相匹配(例如HLA匹配)或是受试者自体的。
适当地，所述Treg是Treg群的一部分。适当地，所述Treg群包括至少70％的Treg，如至少75、85、90、95、97、98或99％的Treg。这样的群可以被称为“富集的Treg群”或“富集的Treg样品”。
在一些方面，所述Treg可以源自诱导性祖细胞或胚胎祖细胞离体分化成Treg。
如本文所用，术语“常规T细胞”或Tcon是指表达αβT细胞受体(TCR)以及辅助受体的T淋巴细胞，所述辅助受体可以是分化簇4(CD4)或分化簇8(CD8)，并且所述常规T细胞不具有免疫抑制功能。常规T细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。适当地，通过引入编码FOXP3的DNA或RNA以及编码本文所描述的所述CAR的DNA或RNA，所述工程化Treg可以从Tcon产生，诸多引入方法之一包括用病毒载体转导，或用DNA或RNA转染(在相同或不同的载体上)。或者，通过在IL-2和TGF-β的存在下体外培养CD4+CD25-FOXP3-细胞，所述工程化Treg可以从Tcon产生。
所述Treg可以从诱导性祖细胞或胚胎祖细胞离体分化成Treg。本发明的多核苷酸或载体可以在诱导性祖细胞或胚胎祖细胞分化为Treg之前或之后引入。
如本文所用，“工程化Treg”是指经过修饰以包含或表达不由细胞天然编码的多核苷酸的Treg，特别是如本文所描述的CAR。工程化Treg的方法是本领域已知的，包括但不限于Treg的基因修饰，例如通过转导(如逆转录病毒转导或慢病毒转导)、包括脂染、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔的转染(如基于DNA或RNA的瞬时转染)。任何合适的方法都可以用于将核酸序列引入Treg中。
嵌合抗原受体
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指将抗原特异性赋予细胞的工程化受体，在这种情况下为Treg。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。本发明的CAR包含对肝脏抗原(例如ASGR)特异性的结合结构域，任选的铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域(包含胞内信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激结构域)。通常，本发明的CAR可以以单个多肽链表达或存在，例如，包含对肝脏抗原(例如ASGR)特异性的结合结构域，任选的铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域(包含胞内信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激结构域)的单个多肽链。特别地，通常，胞内信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激结构域可以与单个多肽链一起存在。因此，尽管，本发明的CAR有可能包含多于一条的多肽链，例如包含双重多肽或CAR系统，在一个具体实施方案中，本发明的所述CAR不是双重CAR。
可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的多核苷酸转移至Treg。通过这种方式，可以产生大量的抗原特异性T细胞用于过继细胞转移。当所述CAR与靶抗原结合时，这会导致活化信号传输到其表达的Treg。因此，所述CAR将工程化Treg引导至表达所述靶抗原的细胞。
本发明的Treg可以包含一个或多个本发明不同的CAR，并且可以另外包含编码其他多肽的外源多核苷酸。
抗原识别结构域
本发明的所述CAR包含抗原识别结构域。
如本文所用，“抗原识别结构域”是指所述CAR的胞外部分，其决定了所述CAR的抗原结合能力。在本发明的某些方面，所述抗原识别结构域使所述CAR具有结合肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))的能力。因此，所述抗原识别结构域靶向肝脏特异性抗原，优选ASGR。
肝脏特异性抗原是优先在肝脏组织中表达的抗原，例如在肝细胞、实质细胞、库普弗细胞、星状细胞和/或肝脏窦状内皮细胞中。适当地，肝脏特异性抗原是与其他组织相比在肝脏组织(例如在肝细胞、实质细胞、库普弗细胞、星状细胞和肝窦内皮细胞中的至少一种)中具有更高表达水平的抗原。例如，肝脏特异性抗原可以是与其他组织的表达水平相比，其表达水平至少高10％，至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高100％，至少高200％，至少高300％，至少高400％，至少高500％，或至少高1000％的抗原。优选地，肝脏特异性抗原是仅在肝脏组织中表达的抗原，即在其他组织中检测不到表达。
所述肝脏特异性抗原将被Treg细胞接触到(尽管可以理解的是，所述肝脏特异性抗原不需要在每种表达所述抗原的肝细胞类型上都能被接触到)，例如肝脏特异性抗原可以在细胞表面表达。
合适的肝脏特异性抗原的实例包括去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、钠/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)、甘露糖-6-磷酸受体、VI型胶原受体、PDGF受体、A类清道夫受体、B类I型清道夫受体、硫酸乙酰肝素、甘草素受体、HDL-受体、LDL-受体、转铁蛋白受体、胰岛素受体、α-2-巨球蛋白受体、铁蛋白受体、尿纤溶酶原受体和凝血酶受体。
优选地，所述抗原识别结构域特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)。最优选地，所述抗原识别结构域结合人ASGR。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域结合人ASGR和来自其他动物的ASGR，例如小鼠ASGR。适当地，所述抗原识别结构域可以特异性结合人ASGR。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGR或ASGPR)是一种C型凝集素，主要表达在肝细胞的窦道表面。ASGR由一个48kDa的主要亚基(ASGR1)和一个40kDa的次要亚基(ASGR2)组成。ASGR的主要作用是与含有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)结合、内化并随后从循环中清除。(Roggenbuck,D.,等,2012.Autoimmunity Highlights,3(3),第119页)。在正常的肝细胞中，ASGR以极性的方式表达在肝细胞浆膜的窦道和基底外侧表面。然而，在肝脏炎症期间，ASGR的表达向胆管侧膜转移。在终末期肝病(肝硬化)中，ASGR过表达，且去唾液酸糖蛋白的血清水平升高。(Roggenbuck,D.,等,2012.AutoimmunityHighlights,3(3),第119页)。
所述抗原识别结构域可以结合ASGR1和/或ASGR2，优选ASGR1。所述抗原识别结构域可以特异性结合ASGR1和/或ASGR2，优选ASGR1。
人ASGR1(UniProt登记号P07306)由ASGR1基因编码。已经观察到该基因的编码多种同种型的剪接转录变体(Harris,R.L.,等,2012.Molecular biology international,2012,Article ID 283974,10页)。较长的转录本包含所有的8个外显子，是迄今为止最丰富的，并编码全长ASGR1(同种型a，291个氨基酸)。较短的转录本具有第3外显子的框内缺失，导致39个残基的丢失(同种型b，252个氨基酸)。同种型b没有跨膜结构域，以可溶性蛋白的形式分泌。人ASGR1同种型a和b的示例性说明序列如下所示(分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)。
SEQ ID NO:1-人ASGR1同种型a(NP_001662.1)
MTKEYQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGPRLLLLSLGLSLLLLVVVCVIGSQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL
SEQ ID NO:2-人ASGR1同种型b(NP_001184145.1)
MTKEYQDLQHLDNEESDHHQLRKDSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL
所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合人ASGR1同种型a和/或人ASGR1同种型b，优选人ASGR1同种型a。所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合与SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽。优选地，所述抗原识别结构域结合、适当地特异性结合与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的多肽。
人ASGR2(UniProt登记号P07307)由ASGR2基因编码。已经观察到该基因的编码多种同种型的替代剪接转录变体(Harris,R.L.,等,2012.Molecular biologyinternational,2012,Article ID 283974,10页)。ASGR2产生五个转录本(TH2'、T1、T2、T3和T4)，编码四种同种型(a至d)，所述同种型包含由替代外显子剪接事件引起的不同框内缺失。同种型a和c含有5个氨基酸，其在跨膜结构域和CRD之间的连接处附近作为蛋白水解切割信号。同种型b和d没有这种信号，因此它们不会被蛋白酶水解切割，而是保持膜结合，在那里它们可能与ASGR1同种型a寡聚化，在细胞表面形成天然ASGR。ASGR2同种型a-d的示例性序列如下所示(SEQ ID NO:3-6)。
SEQ ID NO:3-人ASGR2同种型a(NP_001172.1和NP_550434.1)
MAKDFQDIQQLSSEENDHPFHQGEGPGTRRLNPRRGNPFLKGPPPAQPLAQRLCSMVCFSLLALSFNILLLVVICVTGSQSEGHRGAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLEKQQQDLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGSQRTCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLVVINSWEEQKFIVQHTNPFNTWIGLTDSDGSWKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCVEVQPDGRWNDDFCLQVYRWVCEKRRNATGEVA
SEQ ID NO:4-人ASGR2同种型b(NP_550435.1)
MAKDFQDIQQLSSEENDHPFHQGPPPAQPLAQRLCSMVCFSLLALSFNILLLVVICVTGSQSAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLEKQQQDLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGSQRTCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLVVINSWEEQKFIVQHTNPFNTWIGLTDSDGSWKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCVEVQPDGRWNDDFCLQVYRWVCEKRRNATGEVA
SEQ ID NO:5-人ASGR2同种型c(NP_550436.1)
MAKDFQDIQQLSSEENDHPFHQGPPPAQPLAQRLCSMVCFSLLALSFNILLLVVICVTGSQSEGHRGAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLEKQQQDLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGSQRTCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLVVINSWEEQKFIVQHTNPFNTWIGLTDSDGSWKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCVEVQPDGRWNDDFCLQVYRWVCEKRRNATGEVA
SEQ ID NO:6-人ASGR2同种型d(NP_001188281.1)
MAKDFQDIQQLSSEENDHPFHQGEGPGTRRLNPRRGNPFLKGPPPAQPLAQRLCSMVCFSLLALSFNILLLVVICVTGSQSAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLEKQQQDLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGSQRTCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLVVINSWEEQKFIVQHTNPFNTWIGLTDSDGSWKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCVEVQPDGRWNDDFCLQVYRWVCEKRRNATGEVA
所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合人ASGR2同种型a、b、c和/或d，优选人ASGR2同种型b和/或d。所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合与SEQ IDNO:3-6中的一个或多个具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽。优选地，所述抗原识别结构域结合、适当地特异性结合与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的多肽，或与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的多肽。
所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合：(a)包含人ASGR1同种型a和人ASGR2同种型b的人ASGR；和/或(b)包含人ASGR1同种型a和人ASGR2同种型d的人ASGR。所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合：(a)一个或多个多肽寡聚体，其包含：(i)与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽；以及(ii)与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽；和/或(b)一个或多个多肽寡聚体，其包含：(i)与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽；以及(ii)与SEQ IDNO:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽。
在一些实施方案中，所述抗原识别结构域结合人ASGR1和/或ASGR2以及来自其他动物的ASGR1和/或ASGR2，例如小鼠ASGR1和/或小鼠ASGR2。因此，在一些实施方案中，所述抗原识别结构域在人ASGR和小鼠ASGR之间显示出交叉反应。例如，如果所述抗原识别结构域结合人ASGR1同种型a，在一些实施方案中，其也结合小鼠ASGR1同种型a。示例性的小鼠ASGR1同种型a和b，以及小鼠ASGR2同种型a和b如下所示(SEQ ID NO:7-10)。
SEQ ID NO:7-小鼠ASGR1同种型a(NP_033844.1和NP_001278060.1)
MTKDYQDFQHLDNDNDHHQLRRGPPPTPRLLQRLCSGSRLLLLSSSLSILLLVVVCVITSQNSQLREDLLALRQNFSNLTVSTEDQVKALSTQGSSVGRKMKLVESKLEKQQKDLTEDHSSLLLHVKQLVSDVRSLSCQMAAFRGNGSERTCCPINWVEYEGSCYWFSSSVRPWTEADKYCQLENAHLVVVTSRDEQNFLQRHMGPLNTWIGLTDQNGPWKWVDGTDYETGFQNWRPEQPDNWYGHGLGGGEDCAHFTTDGRWNDDVCRRPYRWVCETKLDKAN
SEQ ID NO:8-小鼠ASGR1同种型b(NP_001278061.1)
MTKDYQDFQHLDNDNDHHQLRRGPPPTPRLLQRLCSGSRLLLLSSSLSILLLVVVCVITSQNSQLREDLLALRQNFSNLTVSTEDQVKALSTQGSSVGRKMKLVESKLEKQQKDLTEGSERTCCPINWVEYEGSCYWFSSSVRPWTEADKYCQLENAHLVVVTSRDEQNFLQRHMGPLNTWIGLTDQNGPWKWVDGTDYETGFQNWRPEQPDNWYGHGLGGGEDCAHFTTDGRWNDDVCRRPYRWVCETKLDKAN
SEQ ID NO:9-小鼠ASGR2同种型a(NP_031519.1、NP_001300854.1和NP_001300855.1)
MEKDCQDIQQLDSEENDHQLSGDDEHGSHVQDPRIENPHWKGQPLSRPFPQRLCSTFRLSLLALAFNILLLVVICVVSSQSIQLQEEFRTLKETFSNFSSSTLMEFGALDTLGGSTNAILTSWLAQLEEKQQQLKADHSTLLFHLKHFPMDLRTLTCQLAYFQSNGTECCPVNWVEFGGSCYWFSRDGLTWAEADQYCQLENAHLLVINSREEQDFVVKHRSQFHIWIGLTDRDGSWKWVDGTDYRSNYRNWAFTQPDNWQGHEQGGGEDCAEILSDGHWNDNFCQQVNRWVCEKRRNITH
SEQ ID NO:10-小鼠ASGR2同种型b(NP_001300856.1)
MEFGALDTLGGSTNAILTSWLAQLEEKQQQLKADHSTLLFHLKHFPMDLRTLTCQLAYFQSNGTECCPVNWVEFGGSCYWFSRDGLTWAEADQYCQLENAHLLVINSREEQDFVVKHRSQFHIWIGLTDRDGSWKWVDGTDYRSNYRNWAFTQPDNWQGHEQGGGEDCAEILSDGHWNDNFCQQVNRWVCEKRRNITH
所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合小鼠ASGR1同种型a、小鼠ASGR1同种型b、小鼠ASGR2同种型a和/或小鼠ASGR2同种型b，优选小鼠ASGR1同种型a。所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合等效的人蛋白质。所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合与SEQ ID NO:7-10中的一个或多个具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的一个或多个多肽。优选地，所述抗原识别结构域结合、适当地特异性结合与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性且与SEQ IDNO:7具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的多肽。
所述抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合肝脏特异性抗原内的一个或多个区域或表位，例如ASGR。表位，也被称为抗原决定簇，是被抗原识别结构域(例如抗体)所识别的抗原的部分。换言之，所述表位是抗原识别结构域所结合的抗原的特定片段。适当地，所述抗原识别结构域结合、适当地特异性结合肝脏特异性抗原中的一个区域或表位，例如ASGR。
本发明中使用的所述抗原识别结构域可以选择性地或特异性地结合肝脏特异性抗原，优选ASGR，因此与对其他蛋白质/分子的结合亲和力相比，其对肝脏特异性抗原(优选ASGR)的结合亲和力可能更高。适当地，如本文所用的“特异性结合”是指所述抗原识别结构域不结合、或以与其特异性结合的抗原的结合亲和力相比大大降低的亲和力结合其他蛋白(例如，以比其特异性结合的抗原的亲和力至少低10、50、100、500、1000或10000倍的亲和力结合其他蛋白)。因此，本文所指的所述抗原识别结构域可以与其抗原(例如ASGR)结合，其亲和力至少是所述抗原识别结构域与其他蛋白结合的10、50、100、500、1000或10000倍。所述抗原识别结构域的结合亲和力可以使用本领域熟知的方法来确定，如用Biacore系统。
所述抗原识别结构域可以对肝脏特异性抗原(例如ASGR)具有高结合亲和力，即可以具有在10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、或者10-12M或更小的范围内的Kd。所述抗原识别结构域可以对肝脏特异性抗原(例如ASGR)的结合亲和力相当于Kd小于100nM、50nM、20nM或10nM，更优选小于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1nM，最优选小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM。所述抗原识别结构域可以对肝脏特异性抗原(例如ASGR)的结合亲和力相当于Kd为约1pM至约100nM，约1pM至约10nM，或约1pm至约1nM。
可以使用任何合适的确定Kd的方法。然而，方便地，可以在表面等离子体共振(SPR)检测或系统(例如BIAcore检测或系统)中确定Kd。例如，可以通过在体外测试不同浓度的抗原识别结构域与不同浓度的抗原以建立饱和曲线来确定Kd，例如使用Lineweaver-Burk法，或通过使用商购的结合模型软件，如BIAcore 1000评估软件中的1:1结合模型。适当地，使用HBS-P缓冲系统(0.01M Hepes、pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％表面活性剂P20)。特别地，当所述抗原识别结构域是抗体、抗体片段或从衍生自抗体，且当所述抗原识别结构域为任何形式时(例如当其是scFv或sdAb形式，或者是本文别处所述的其他形式时)，则上述Kd是合适的。
所述抗原识别结构域可以具有50℃、55℃、60℃、65℃或更高、优选55℃或更高、例如55℃至75℃的熔解温度。所述熔解温度可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定。适当地，所述熔解温度通过差示扫描量热法确定。适当地，所述抗原识别结构域在1mg/mLPBS中以每小时180℃加热，并测量可检测到的热变化。转变中点为表观熔解温度。
所述抗原识别结构域(也称为抗原特异性靶向结构域)可以是具有特异性识别和结合至肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))的能力的任何蛋白或肽。所述抗原识别结构域包括任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))的结合配偶体。示例性的抗原识别结构域包括抗体、抗体片段或衍生物、受体的胞外结构域、细胞表面分子/受体的配体或其受体结合结构域，以及肿瘤结合蛋白。例如，ASGR的合适配体包括β-D-半乳糖和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
优选地，所述抗原识别结构域是抗体(Ab)或衍生自抗体。抗体衍生的抗原识别结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，所述片段参与与抗原的结合。实例包括骆驼抗体(VHH)、抗原结合片段(Fab)、可变区(Fv)、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和互补决定区(CDR)。
在优选实施方案中，所述抗原识别结构域为单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。最优选地，所述抗原识别结构域为单域抗体(sdAb)。
抗体通过抗原结合片段(Fab)可变区识别抗原。抗体是属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白。它们构成了血液蛋白的大部分γ球蛋白部分。它们通常由基本结构单元组成，每个结构单元有两条大的重链和两条小的轻链。骆驼抗体(VHH)没有轻链，由连接到可变结构域的两条重链组成。
“抗原结合片段”(Fab)是指抗体上与抗原结合的区域。其由重链和轻链各自的一个恒定区和一个可变区组成。
“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由结合至单个重链可变区的单个轻链可变区组成。“单链抗体”(scFv)是指由轻链可变区和重链可变区直接或通过肽接头序列相互连接而组成。所述肽接头序列的长度通常为10至25个氨基酸，富含甘氨酸以提高灵活性，丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。所述肽接头序列可以连接重链可变区域的N末端和轻链可变区域的C末端，反之亦然。
“单域抗体”(sdAb)，也被称为纳米抗体，是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。因此，sdAb可以是重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。
“重链可变区”或“VH”是指抗体的重链的片段，其包含插入在称为框架区的侧翼延伸之间的三个CDR，框架区比CDR更高度保守并形成支撑CDR的支架。“轻链可变区”或“VL”是指抗体的轻链的片段，其包含插入在框架区之间的三个CDR。
关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“CDR”是指在抗体的重链或轻链的的可变区中的高度可变环。CDR可以与抗原构象相互作用，并在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与了结合)。重链可变区和轻链可变区各包含3个CDR(重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，从氨基末端到羧基末端编号)。
可以使用本领域可用的预测软件、例如使用Abysis算法，或使用IMGT/V-QUEST软件，例如IMGT算法(ImMunoGeneTics)，其可在www.IMGT.org找到(参见例如Lefranc等,2009NAR 37:D1006-D1012和Lefranc 2003,Leukemia 17:260-266)，由抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列预测抗体重链和轻链的可变区的CDR。通过任一算法识别的CDR区被认为同样适合用于本发明。CDR的长度可能不同，取决于预测它们的抗体以及重链和轻链之间。因此，完整的抗体的三个重链CDR可以是不同的长度(或可以是相同的长度)，并且完整的抗体的三个轻链CDR可以是不同的长度(或可以是相同的长度)。例如，CDR的长度可以是2或3个氨基酸至5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的范围。特别地，CDR的长度可以是3-14个氨基酸，例如至少3个氨基酸且少于15个氨基酸。应注意的是，本文在必要时遵循Kabat命名法(Kabat等,1991,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,MD,647-669)，以便定义CDR的定位。
可以使用本领域技术人员熟知的方法制备与肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))特异性结合的抗体及其衍生物和片段。这些方法包括噬菌体展示、产生人或人源化抗体的方法，或使用工程化以生产人抗体的转基因动物或植物的方法。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可用的，并且可以筛选出能与目标分子结合的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。一旦鉴定，就可以分离和/或确定编码抗体(或其衍生物或片段)的氨基酸序列或多核苷酸序列。抗体的序列可以用于设计合适的其衍生物或片段。
与肝脏特异性抗原、优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)特异性结合的合适抗体及其衍生物和片段是已知的。例如，抗NTCP抗体描述于Stieger,B.,等,1994.Gastroenterology,107(6),第1781-1787页；抗甘露糖-6-磷酸受体抗体描述于vonFigura,K.,等,1984.The EMBO journal,3(6),第1281-1286页；抗PDGF受体抗体描述于Ogawa,S.,等,2010.Hepatology Research,40(11),第1128-1141页；抗A类清道夫受体抗体描述于Tomokiyo,R.I.,等,2002.Atherosclerosis,161(1),第123-132页；抗B类I型清道夫受体抗体描述于Meuleman,P.,等,2012.Hepatology,55(2),第364-372页；以及抗硫酸乙酰肝素抗体描述于Gao,W.,等,2014.Hepatology,60(2),第576-587页。与肝脏特异性抗原特异性结合的抗体及其衍生物和片段是可商购的。已知抗体的序列可以用于设计合适的其衍生物或片段。
下文进一步描述了可以用于本发明的抗体及其片段和衍生物的实例。
抗原识别结构域可以包含至少一个CDR(例如CDR3)，其可以从结合肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))的抗体预测(或这种预测的CDR的变体(例如具有一个、两个或三个氨基酸取代的变体))。可以理解的是，含有三个或更少CDR区的分子(例如单个CDR或甚至其一部分)可能能够保留CDR来源的抗体的抗原结合活性。含有两个CDR区的分子在本领域被描述为能够结合靶抗原，例如以微型抗体的形式(Vaughan和Sollazzo,2001,Combinational Chemistry&High Throughput Screening,4,417-430)。已经描述了含有单个CDR的分子，其可以显示出与靶标的强结合活性(Nicaise等,2004,Protein Science,13:1882-91)。
在这方面，所述抗原识别结构域可以包含一个或多个可变重链CDR，例如一个、两个或三个可变重链CDR。或者，或另外地，所述抗原识别结构域可以包含一个或多个可变轻链CDR，例如一个、两个或三个可变轻链CDR。所述抗原识别结构域可以包含三个重链CDR和/或三个轻链CDR(更具体地，包含三个CDR的重链可变区和/或包含三个CDR的轻链可变区)，其中至少一个CDR(优选所有CDR)可以来自与肝脏特异性抗原(优选ASGR)结合的抗体，或者可以选自以下提供的CDR序列之一。
所述抗原识别结构域可以包含可变重链和轻链CDR的任何组合，例如一个可变重链CDR与一个可变轻链CDR，两个可变重链CDR与一个可变轻链CDR，两个可变重链CDR与两个可变轻链CDR，三个可变重链CDR与一个或两个可变轻链CDR，一个可变重链CDR与两个或三个可变轻链CDR，或者三个可变重链CDR与三个可变轻链CDR。优选地，所述抗原识别结构域包含三个可变重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)或三个可变轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，即包含三个CDR。或者，所述抗原识别结构域可以包含三个可变重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和三个可变轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，或者其他包含六个CDR的方式。
存在于所述抗原识别结构域中的一个或多个CDR可能不都来自相同的抗体，只要结构域具有上述的结合活性即可。因此，一个CDR可以从与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的一个抗体的重链或轻链中预测，而另一个CDR可以从与同一肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的不同抗体中预测。在这种情况下，可以优选从与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的抗体中预测出CDR3。然而，特别是如果抗原识别结构域中存在一个以上的CDR，优选从与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的抗体中预测CDR。可以使用来自不同抗体的CDR的组合，特别是来自与相同的期望区域或表位结合的抗体。示例性的和优选的CDR序列在本文别处描述。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗原识别结构域包含从与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的抗体的可变重链序列中预测的三个CDR和/或从与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的抗体的可变轻链序列中预测的三个CDR(优选相同的抗体)。示例性的和优选的CDR序列在本文别处描述。
在一些实施方案中，所述抗原识别结构域是或衍生自抗体(例如是Fab、scFv或sdAb)，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:11-73或其衍生物的一个或多个CDR区。换言之，在一些实施方案中，所述抗原识别结构域包含选自SEQ ID NO:11-73或其衍生物的一个或多个CDR区。适当地，所述抗原识别结构域包含选自SEQ ID NO:11-73或其衍生物的三个CDR区。
Figure BDA0003595329260000171
Figure BDA0003595329260000181
优选地，所述抗原结合结构域包含选自相同可变链的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)或其衍生物。例如，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:14-16、SEQ IDNO:17-19、SEQ ID NO:20-22、SEQ ID NO:23-25、SEQ ID NO:26-28、SEQ ID NO:29-31、SEQID NO:32-34、SEQ ID NO:35-37、SEQ ID NO:38-40、SEQ ID NO:41-43、SEQ ID NO:44-46、SEQ ID NO:47-49、SEQ ID NO:50-52、SEQ ID NO:53-55、SEQ ID NO:56-58、SEQ ID NO:59-61、SEQ ID NO:62-64、SEQ ID NO:65-67、SEQ ID NO:68-70和/或SEQ ID NO:71-73，或其衍生物。
优选地，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:14-16、SEQID NO:17-19、SEQ ID NO:20-22、SEQ ID NO:23-25、SEQ ID NO:26-28和/或SEQ ID NO:29-31，或其衍生物。
优选地，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:14-16、SEQID NO:17-19、SEQ ID NO:23-25、SEQ ID NO:26-28和/或SEQ ID NO:29-31，或其衍生物。
优选地，所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:14-16或SEQID NO:17-19，和/或SEQ ID NO:23-25、SEQ ID NO:26-28或SEQ ID NO:29-31，或其衍生物。
在优选实施方案中，所述抗原识别结构域包含选自SEQ ID NO:11-31的一个或多个CDR区。适当地，所述抗原识别结构域包含选自SEQ ID NO:11-31或其衍生物的三个CDR区。
在优选实施方案中，所述抗原识别结构域包含：
(i)CDR1序列EKYAMA(SEQ ID NO:11)、CDR2序列RISARGVT(SEQ ID NO:12)和CDR3序列HKRHEHTRFDS(SEQ ID NO:13)，或其衍生物；
(ii)CDR1序列RYTMG(SEQ ID NO:14)、CDR2序列AIGPPGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO:15)和CDR3序列WVMLRGRFDY(SEQ ID NO:16)，或其衍生物；
(iii)CDR1序列DYGMG(SEQ ID NO:17)、CDR2序列AIGRNGSQTYYADSVKG(SEQ ID NO:18)和CDR3序列LRRGRGLNTFTLDY(SEQ ID NO:19)，或其衍生物；
(iv)CDR1序列AAGMG(SEQ ID NO:20)、CDR2序列AIGRNGSQTYYADSVKG(SEQ ID NO:21)和CDR3序列LRRGRGLNTFTLDY(SEQ ID NO:22)，或其衍生物；
(v)CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQ ID NO:23)、CDR2序列PGSRLRS(SEQ ID NO:24)和CDR3序列QQAYAWPPT(SEQ ID NO:25)，或其衍生物；
(vi)CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQ ID NO:26)、CDR2序列PGSRLQS(SEQ ID NO:27)和CDR3序列QQAYQLPVT(SEQ ID NO:28)，或其衍生物；
(vii)CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQ ID NO:29)、CDR2序列PGSRLQS(SEQ ID NO:30)和CDR3序列QQAYSLPPT(SEQ ID NO:31)，或其衍生物。
最优选地，所述抗原识别结构域包含CDR1序列EKYAMA(SEQ ID NO:11)、CDR2序列RISARGVT(SEQ ID NO:12)和CDR3序列HKRHEHTRFDS(SEQ ID NO:13)，或其衍生物。优选地，所述抗原识别结构域是包含CDR1序列EKYAMA(SEQ ID NO:11)、CDR2序列RISARGVT(SEQ IDNO:12)和CDR3序列HKRHEHTRFDS(SEQ ID NO:13)或其衍生物的sdAb。
在其他实施方案中，所述抗原识别结构域包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其含有：
(i)分别为SEQ ID NO:11、12和13，或其衍生物；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:26、27和28，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31，或其衍生物；优选地，其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13以及分别为SEQ ID NO:23、24和25的CDR1区、CDR2区和CDR3区；
(ii)分别为SEQ ID NO:14、15和16，或其衍生物；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:26、27和28，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31，或其衍生物；优选地，其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:14、15和16以及分别为SEQ ID NO:26、27和28的CDR1区、CDR2区和CDR3区；或者
(iii)分别为SEQ ID NO:17、18和19，或其衍生物；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:26、27和28，或其衍生物；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31，或其衍生物；优选地，其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:17、18和19以及分别为SEQ ID NO:29、30和31的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
因此，在此类实施方案中，所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:23、24和25或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:26、27和28或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:29、30和31或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:14、15和16或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:23、24和25或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:14、15和16或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:26、27和28或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:14、15和16或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:29、30和31或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:17、18和19或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:23、24和25或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:17、18和19或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:26、27和28或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
所述抗原识别结构域可以包含含有分别为SEQ ID NO:17、18和19或其衍生物的、以及分别为SEQ ID NO:29、30和31或其衍生物的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
包含该抗原识别结构域的CAR构成了本发明的又一个方面。
优选地，上述包含六个CDR的抗原识别结构域为scFv。
本发明包括上文和本文其他地方描述的CDR区(和VH和VL(VK)区，以及所述区内的CDR区)的“衍生物”。如本文所用的术语“衍生物”在下文“变体、衍生物和片段”部分中定义。可以理解的是，在保留抗原结合能力的同时，可以在CDR中进行一个或多个氨基酸取代。例如，所述CDR衍生物可以包含3个或更少的氨基酸取代，例如3个氨基酸取代、2个氨基酸取代或1个氨基酸取代。特别地，在一些实施方案中，所述CDR衍生物包含一个氨基酸取代并保留抗原结合能力。所述衍生物可以是变体，例如与CDR具有至少80％或90％同一性的变体。
在一些实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:74-94的一个或多个具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
Figure BDA0003595329260000211
Figure BDA0003595329260000221
在优选实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:74-80的一个或多个具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
更优选地，所述抗原识别结构域包含或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与ASGR1 VH1(SEQ ID NO:74)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由：SEQ ID NO:74、75或76的氨基酸序列或其衍生物，和/或SEQ ID NO:78、79或80的氨基酸序列或其衍生物组成。在优选实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由：SEQ ID NO:74和78的氨基酸序列或其衍生物；SEQ ID NO:75和79的氨基酸序列或其衍生物；或者SEQ ID NO:76和80的氨基酸序列或其衍生物组成。
因此，在此类实施方案中，所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:74和78的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:74和79的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:74和80的氨基酸序列或其衍生物组成。
所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:75和78的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:75和79的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:75和80的氨基酸序列或其衍生物组成。
所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:76和78的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:76和79的氨基酸序列或其衍生物组成。所述抗原识别结构域可以包含或由SEQ ID NO:76和80的氨基酸序列或其衍生物组成。
优选地，上述包含VH结构域和VL(VK)结构域的抗原识别结构域是scFv。该scFv在VH结构域和VL(VK)结构域之间可以包含接头。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.74或其衍生物以及SEQ ID No81、82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.75或其衍生物以及SEQ ID No81、82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.76或其衍生物以及SEQ ID No81、82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.77或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.83或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.84或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.85或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.86或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
所述抗原识别结构域可以进一步包含SEQ ID NO.87或其衍生物以及SEQ ID No78至82或88至94中的任意一个或其衍生物。
一些示例性的scFv(scFv片段)概述如下：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKLLIGPGSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFVTYYCQQAYAWPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:173)
ELQLLEFGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFSRYTMGWVRQAPGKGLEWVSAIGPPGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVMLRGRFDYWGQGTLVTVSSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKHLIGPGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYQLPVTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:174)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSAIGRNGSQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLRRGRGLNTFTLDYWGQGTLVTVSSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKLLIGPGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIGSLQPEDFATYYCQQAYSLPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:175)
包含该抗原识别结构域的CAR构成本发明的又一个方面。
本文所述的抗原识别结构域变体保留了抗原结合能力。例如，所述变体可能能够以与相应参考氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的水平结合ASGR。所述变体可能能够以与相应的参考氨基酸序列相似或相同的水平结合ASGR，或者可能能够以比相应的参考氨基酸序列更高的水平结合ASGR(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。因此，所述抗原识别结构域可以包含或由含有ASGR1 VH1-4(SEQ ID NO:11-22)和/或ASGR1VK1-3(SEQID NO:23-31)的CDR的氨基酸序列组成(分别在上文的SEQ ID NO:74-77和SEQ ID NO:78-80中用下划线表示)。所述抗原识别结构域可以包含或由含有ASGR1VH1-3(SEQ ID NO:11-19)和/或ASGR1 VK1-3(SEQ ID NO:23-31)的CDR的氨基酸序列组成(分别在上文的SEQ IDNO:74-76和SEQ ID NO:78-80中用下划线表示)。一个(或多个)氨基酸残基的取代、变化、修饰、置换、缺失和/或添加可以发生在框架区中。
因此，在一些实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由以下组成：
(i)与ASGR1 VH1(SEQ ID NO:74)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列EKYAMA(SEQ IDNO:11)、CDR2序列RISARGVT(SEQ ID NO:12)以及CDR3序列HKRHEHTRFDS(SEQ ID NO:13)；
(ii)与ASGR1 VH2(SEQ ID NO:75)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列RYTMG(SEQ IDNO:14)、CDR2序列AIGPPGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO:15)以及CDR3序列WVMLRGRFDY(SEQ IDNO:16)；
(iii)与ASGR1 VH3(SEQ ID NO:76)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列DYGMG(SEQID NO:17)、CDR2序列AIGRNGSQTYYADSVKG(SEQ ID NO:18)以及CDR3序列LRRGRGLNTFTLDY(SEQ ID NO:19)；
(iv)与ASGR1 VH4(SEQ ID NO:77)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列AAGMG(SEQ IDNO:20)、CDR2序列AIGRNGSQTYYADSVKG(SEQ ID NO:21)以及CDR3序列LRRGRGLNTFTLDY(SEQID NO:22)；
(v)与ASGR1 VK1(SEQ ID NO:78)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQID NO:23)、CDR2序列PGSRLRS(SEQ ID NO:24)以及CDR3序列QQAYAWPPT(SEQ ID NO:25)；
(vi)与ASGR1 VK2(SEQ ID NO:79)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQID NO:26)、CDR2序列PGSRLQS(SEQ ID NO:27)以及CDR3序列QQAYQLPVT(SEQ ID NO:28)；或者
(vii)与ASGR1 VK3(SEQ ID NO:80)具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列RASQAIGRWLL(SEQ ID NO:29)、CDR2序列PGSRLQS(SEQ ID NO:30)以及CDR3序列QQAYSLPPT(SEQ ID NO:31)。
在一个优选实施方案中，所述抗原识别结构域包含或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有与ASGR1 VH1(SEQ ID NO:74)至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性，其中所述氨基酸序列包含CDR1序列EKYAMA(SEQ ID NO:11)、CDR2序列RISARGVT(SEQ ID NO:12)以及CDR3序列HKRHEHTRFDS(SEQ ID NO:13)，或其衍生物。
尽管本发明的CAR可以包含多于一个的抗原识别结构域，即可以与多于一种的肝脏特异性抗原结合，或与如上定义的肝脏特异性抗原内的多于一个的表位结合，例如，作为双重或双多肽CAR系统的一部分，在一个具体实施方案中，本发明的CAR可以仅包含一个或单个抗原识别结构域。
铰链结构域
所述CAR可以包含铰链结构域。
如本文所用的“铰链结构域”，也称为“间隔结构域”，是指将抗原结合结构域和跨膜结构域分开的CAR的胞外部分。铰链可以提供灵活性以接近靶抗原。例如，长的间隔为CAR提供了额外的灵活性，并允许更好地接近膜近端表位。
合适的铰链结构域对于本领域技术人员而言会是显而易见的(例如Guedan,S.,等.,2018.Molecular Therapy-Methods&Clinical Development,12,145-156)。合适的铰链结构域包括但不限于：CD28铰链结构域、CD8α铰链结构域、IgG铰链结构域和IgD铰链结构域。优选地，所述铰链结构域是CD8α铰链结构域或CD28铰链结构域。
适当地，所述铰链结构域可以包含如SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:95至少80％相同的变体。
说明性的CD28铰链结构域(SEQ ID NO:95)：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:95至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述铰链结构域可以包含如SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:96至少80％相同的变体。
说明性的CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:96)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:96至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR可以编码标签，如c-Myc标签(EQKLISEEDL-SEQ ID NO:97)。适当地，所述标签可以被整合到CAR的胞外结构域中，例如胞外结构域的铰链结构域中。带有整合的c-Myc标签的说明性的CD28铰链结构域如下所示。
带有整合的c-Myc标签的说明性的CD28铰链结构域(SEQ ID NO:98)：
IEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:98至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
跨膜结构域
所述CAR可以包含跨膜结构域。
如本文所用，“跨膜结构域”是指将CAR锚定至Treg的细胞膜中的CAR部分。因此，所述跨膜结构域能够跨越或存在于Treg的细胞膜内。所述跨膜结构域可以来源于包含胞外和/或胞内部分的蛋白质，因此本文所用的跨膜结构域除了在细胞膜内或跨越细胞膜的部分外，还可以连接到来源于原生蛋白质的胞外和/或胞内残基。例如，所述跨膜结构域可以连接到来源于原生蛋白质的铰链结构域，例如来源于CD8α的跨膜结构域可以连接到来源于CD8α的铰链结构域。可以使用本领域已知的任何合适的方法评估细胞膜内跨膜结构域的存在，包括用荧光显微镜进行荧光标记。
合适的跨膜结构域对于本领域技术人员而言会是显而易见的。所述跨膜结构域可以包含来自任何具有跨膜结构域的蛋白质的跨膜序列，包括任何I型、II型或III型跨膜蛋白。CAR的跨膜结构域也可以包含人工疏水序列。可以选择跨膜结构域以使其不发生二聚化。
用于CAR构建体的跨膜(TM)结构域的实例有：1)CD28 TM结构域(Pule等,MolTher,2005,11月；12(5):933-41；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Casucci等,Blood,2013,11月14日；122(20):3461-72.)；2)OX40 TM结构域(Pule等,MolTher,2005,11月；12(5):933-41)；3)41BB TM结构域(Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35)；4)CD3ζTM结构域(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41；Savoldo B,Blood,2009,6月18日；113(25):6392-402.)；5)CD8αTM结构域(Maher等,NatBiotechnol,2002,1月；20(1):70-5.；Imai C,Leukemia,2004,4月；18(4):676-84；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Milone等,Mol Ther,2009,8月；17(8):1453-64.)；6)ICOS TM结构域；7)CD4 TM结构域。
适当地，所述CAR可以包含CD28跨膜结构域。适当地，所述跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:99至少80％相同的变体。
说明性的CD28 TM结构域(153至179位氨基酸)(SEQ ID NO:99)：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:99至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR可以包含CD8α跨膜结构域。适当地，所述跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:165至少80％相同的变体。
说明性的CD8αTM结构域(183至203位氨基酸)(SEQ ID NO:165)：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:165至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR可以包含CD28铰链结构域和跨膜结构域(任选地带有c-Myc标签)。适当地，所述铰链结构域和跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101至少80％相同的变体。
说明性的CD28铰链结构域和跨膜结构域(SEQ ID NO:100)：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
说明性的带有c-Myc标签的CD28铰链结构域和跨膜结构域(SEQ ID NO:101)：
IEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR可以包含CD8α铰链结构域和CD28跨膜结构域。适当地，所述铰链结构域和跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:102至少80％相同的变体。
说明性的CD8α铰链结构域和CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:102)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:102至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR可以包含CD28铰链结构域和CD8α跨膜结构域。适当地，所述铰链结构域和跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:166所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:166至少80％相同的变体。
说明性的CD28铰链结构域和CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO:166)：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:166至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
胞内结构域
所述CAR可以包含含有一个或多个胞内信号传导结构域以及任选地一个或多个共刺激结构域的胞内结构域。
所述CAR可以包含一个或多个胞内信号传导结构域。
如本文所用，“胞内信号传导结构域”是指CAR的细胞内部分，其参与将有效的CAR与肝脏特异性抗原(例如ASGR)结合的信息转导到Treg内部，以激发Treg功能，例如免疫抑制功能。
合适的胞内信号传导结构域对于本领域技术人员而言会是显而易见的。所述胞内信号传导结构域是转导效应功能信号和指导Treg在抗原结合后执行其专门功能所必需的。胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。所述胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ信号传导结构域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾部、带有细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其组合。
优选地，所述胞内信号传导结构域包含人CD3ζ信号传导结构域的胞内信号传导结构域。优选地，所述CD3ζ信号传导结构域与结合或特异性结合ASGR的抗原识别结构域在同一肽链中。适当地，所述胞内信号传导结构域可以包含如SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:103至少80％相同的变体。
说明性的CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:103)：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:103至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
CAR的所述胞内信号传导结构域可以包含CD28信号传导结构域。适当地，所述胞内信号传导结构域可以包含如SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:104至少80％相同的变体。
说明性的CD28信号传导结构域(SEQ ID NO:104)：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:104至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
CAR的所述胞内信号传导结构域可以包含CD27信号传导结构域。适当地，所述胞内信号传导结构域可以包含如SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:105至少80％相同的变体。
说明性的CD27信号传导结构域(SEQ ID NO:105)：
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含信号传导基序，其与SEQ IDNO:105具有85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
额外的胞内信号传导结构域对于本领域技术人员而言会是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。
所述CAR也可以包含一个或多个共刺激结构域。
如本文所用，“共刺激结构域”是指CAR的胞内部分，其可以促进Treg功能(例如免疫抑制功能)、扩增和/或持久性。
相应地，所述CAR可以包含复合的胞内结构域，其包含一个或多个共刺激结构域与胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的融合。这种复合的胞内结构域可以称为第二代CAR，其可以在抗原识别后同时传递活化和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是CD28的结构域。这提供了最有效的共刺激信号——即触发Treg增殖的免疫信号2。合适的共刺激结构域对于本领域技术人员而言会是显而易见的。
适当地，一个或多个共刺激结构域可以包含如SEQ ID NO:104或105所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:104或105至少80％相似(例如至少85％、90％、95％、97％、98％或99％)的变体。
适当地，一个或多个共刺激结构域可以包含一个或多个TNF受体家族信号传导结构域，如OX40、4-1BB、ICOS或TNFRSF25的信号传导结构域。
OX40、4-1BB、ICOS和TNFRSF25信号传导结构域的说明性的序列如下所示。一个或多个共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:106-109中的一个或多个，或与SEQ ID NO:106-109中的一个或多个至少80％相同的变体。
说明性的OX40信号传导结构域(SEQ ID NO:106)
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
说明性的41BB信号传导结构域(SEQ ID NO:107)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
说明性的ICOS信号传导结构域(SEQ ID NO:108)
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
说明性的TNFRSF25信号传导结构域(SEQ ID NO:109)
TYTYRHCWPHKPLVTADEAGMEALTPPPATHLSPLDSAHTLLAPPDSSEKICTVQLVGNSWTPGYPETQEALCPQVTWSWDQLPSRALGPAAAPTLSPESPAGSPAMMLQPGPQLYDVMDAVPARRWKEFVRTLGLREAEIEAVEVEIGRFRDQQYEMLKRWRQQQPAGLGAVYAALERMGLDGCVEDLRSRLQRGP
一个或多个共刺激结构域可以包含OX40、4-1BB、ICOS和TNFRSF25信号传导结构域中的一个或多个的变体，其与SEQ ID NO:106-109中任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
所述CAR的胞内结构域可包含CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。适当地，所述胞内结构域可以包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:110至少80％相同的变体。
说明性的CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:110)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:110至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方案中，所述CAR包含胞内结构域，其包含STAT5结合基序以及JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序。
“信号转导和转录活化因子5”(STAT5)是一种参与IL-2信号传导通路的转录因子，通过促进如FOXP3、IL2RA和BCLXL等基因的表达，在Treg功能、稳定性和存活中发挥关键作用。为了发挥功能并转入细胞核中，STAT5需要被磷酸化。IL-2连接通过分别存在于IL-2Rβ和IL-2Rγ链中的特定信号结构域激活Jak1和Jak3激酶，从而导致STAT5的磷酸化。尽管Jak1(或Jak2)可以使STAT5磷酸化而不需要Jak3，但Jak1和Jak3的转磷酸化会增加STAT5的活性，从而稳定其活性。
如本文所用，“STAT5结合基序”是指包含酪氨酸并能够结合STAT5多肽的氨基酸基序。本领域中任何已知的用于确定蛋白质:蛋白质相互作用的方法都可以用于确定连接基序是否能够与STAT5结合。例如，免疫共沉淀法，然后是蛋白质印迹法。
因此，本发明提供了一种工程化Treg，其包含具有与肝脏特异性抗原(优选去唾液酸糖蛋白受体(ASGR))结合的能力的CAR，所述CAR仅在其与抗原结合后向Treg专门提供STAT5介导的促存活信号。特别是在抗原识别后，CAR聚集并通过CAR的胞内信号传导结构域(胞内结构域)将信号传递给工程化Treg。当所述CAR包含含有STAT5结合基序以及JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序的胞内结构域时，所述CAR的聚集导致STAT5以及JAK1和/或JAK2的招募和活化；并因此提供信号，所述信号以抗原特异性的方式增强工程化Treg的功能和存活，而不依赖于微环境中IL-2的可用性。
与受试者的一般T细胞群相比，本发明的具有STAT5信号传导的工程化Treg在抗原识别后为工程化CAR-Treg提供存活优势方面可能特别有效。特别是在例如移植的情况下，免疫抑制药物的使用降低了IL-2的可用性，CAR-Treg的STAT5信号传导在原本不利的微环境中为本发明的细胞提供了额外的存活和功能影响。
适当地，所述CAR胞内结构域可以包含两个或更多个如本文定义的STAT5结合基序。例如，所述CAR胞内结构域可以包含两个、三个、四个、五个或更多个如本文定义的STAT5结合基序。优选地，所述CAR胞内结构域可以包含两个或三个如本文定义的STAT5结合基序。
适当地，所述STAT5结合基序可以内源性地存在于跨膜蛋白的细胞质结构域中。例如，所述STAT5结合基序可以来自白介素受体(IL)受体胞内结构域或激素受体。
所述CAR胞内结构域可以包含选自白细胞介素受体的任何链的氨基酸序列，其中STAT5是下游组分，例如，可以使用包含：IL-2受体β链的氨基酸编号266至551(NCBIREFSEQ:NP_000869.1，SEQ ID NO:111)、IL-7Rα链的氨基酸编号265至459(NCBI REFSEQ:NP_002176.2，SEQ ID NO:112)、截短的IL-7RA2Y链(SEQ ID NO:113)、IL-9R链的氨基酸编号292至521(NCBI REFSEQ:NP_002177.2，SEQ ID NO:114)、IL-4Rα链的氨基酸编号257至825(NCBI REFSEQ:NPJD00409.1，SEQ ID NO:115)、IL-3Rβ链的氨基酸编号461至897(NCBIREFSEQ:NP_000386.1，SEQ ID NO:116)或IL-17Rβ链的氨基酸编号314至502(NCBI REFSEQ:NP_061195.2，SEQ ID NO:117)的细胞质结构域。可以使用白细胞介素受体链的细胞质结构域的整个区域。
SEQ ID NO:111-IL7RB(NP_000869.1的265至551位氨基酸)
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
SEQ ID NO:112-IL7RA(NP_002176.2的265至459位氨基酸)
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO:113-截短的IL7RA 2Y：
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO:114-IL9R(NP_002177.2的292至521位氨基酸)
KLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHGAGVLLSQDCAGTPQGALEPCVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQEDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALACGLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF
SEQ ID NO:115-IL4RA(NPJD00409.1的257至825位氨基酸)
KIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEHNMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISVVRCVELFEAPVECEEEEEVEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGSTSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSFSNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGFGASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEKVEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCGCCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTPKIVNFVSVGPTYMRVS
SEQ ID NO:116-IL3RB(NP_000386.1的461至897位氨基酸)
RFCGIYGYRLRRKWEEKIPNPSKSHLFQNGSAELWPPGSMSAFTSGSPPHQGPWGSRFPELEGVFPVGFGDSEVSPLTIEDPKHVCDPPSGPDTTPAASDLPTEQPPSPQPGPPAASHTPEKQASSFDFNGPYLGPPHSRSLPDILGQPEPPQEGGSQKSPPPGSLEYLCLPAGGQVQLVPLAQAMGPGQAVEVERRPSQGAAGSPSLESGGGPAPPALGPRVGGQDQKDSPVAIPMSSGDTEDPGVASGYVSSADLVFTPNSGASSVSLVPSLGLPSDQTPSLCPGLASGPPGAPGPVKSGFEGYVELPPIEGRSPRSPRNNPVPPEAKSPVLNPGERPADVSPTSPQPEGLLVLQQVGDYCFLPGLGPGPLSLRSKPSSPGPGPEIKNLDQAFQVKKPPGQAVPQVPVIQLFKALKQQDYLSLPPWEVNKPGEVC
SEQ ID NO:117-IL17RB(NP_061195.2的314至502位氨基酸)
RHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFREIDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL
所述CAR胞内结构域可以包含STAT5结合基序，其包含如SEQ ID NO:111-117之一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:111-117之一至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的变体。例如，所述变体可能能够以与如SEQ ID NO:111-117之一所示的氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的水平结合STAT5。所述变体可能能够以与SEQ ID NO:111-117之一相似或相同的水平结合STAT5，或者可能能够以与如SEQ ID NO:111-117之一所示的氨基酸序列更高的水平结合STAT5(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
例如，所述STAT5结合基序可以来自IL2Rβ、IL7Rα、IL-3Rβ(CSF2RB)、IL-9R、IL-4Rα、IL-17Rβ、红细胞生成素受体、血小板生成素受体、生长激素受体和催乳素受体。
所述STAT5结合基序可以包含氨基酸基序YXXF/L(SEQ ID NO:118)；其中X是任意氨基酸。
适当地，所述STAT5结合基序可以包含氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:119)、YFFF(SEQ ID NO:120)、YLSL(SEQ ID NO:121)或YLSLQ(SEQ ID NO:122)。
适当地，所述STAT5结合基序可以包含氨基酸基序YLSLQ(SEQ ID NO:122)。
所述CAR胞内结构域可以包含一个或多个含有氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:119)、YFFF(SEQ ID NO:120)、YLSL(SEQ ID NO:121)和/或YLSLQ(SEQ ID NO:122)的STAT5结合基序。
所述CAR胞内结构域可以包含含有氨基酸基序YLSLQ(SEQ ID NO:122)的第一STAT5结合基序，以及含有氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:119)或YFFF(SEQ ID NO:120)的第二STAT5结合基序。
所述CAR胞内结构域可以包含以下STAT5结合基序：YLSLQ(SEQ ID NO:122)、YCTF(SEQ ID NO:119)和YFFF(SEQ ID NO:120)。
如本文所用的，“JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序”是指允许酪氨酸激酶JAK1和/或JAK2结合的BOX基序。合适的JAK1-结合基序和JAK2-结合基序描述在例如Ferrao&Lupardus(Frontiers in Endocrinology；2017；8(71)；其通过引入并入本文)。
任何本领域已知的确定蛋白质:蛋白质相互作用的方法可以用于确定基序是否能够与JAK1和/或JAK2结合。例如，免疫共沉淀法，然后是蛋白质印迹法。
所述JAK1结合基序和/或JAK2结合基序可以内源性地存在于跨膜蛋白的细胞质结构域中。
例如，所述JAK1结合基序和/或JAK2结合基序可以来自IFNLR1、IFNAR、IFNGR1、IL10RA、IL20RA、IL22RA、IFNGR2或IL10RB。
所述JAK1-结合基序可以包含如SEQ ID NO:123-129所示的氨基酸基序，或其能够结合JAK1的变体。例如，所述变体可能能够以与如SEQ ID NO:123-129之一所示的氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的水平结合JAK1。所述变体可能能够以与SEQ ID NO:123-129之一相似或相同的水平结合JAK1，或者可能能够以与如SEQ ID NO:123-129之一所示的氨基酸序列更高的水平结合JAK1(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
Figure BDA0003595329260000331
Figure BDA0003595329260000341
与任何SEQ ID NO:123-129相比，所述变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异，并保留结合JAK1的能力。
所述变体可以与SEQ ID NO:123-129的任意一个至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
在一个优选实施方案中，所述JAK-1结合结构域包含SEQ ID NO:123或其能够结合JAK1的变体。
所述JAK2-结合基序可以包含如SEQ ID NO:130-132所示的氨基酸基序，或其能够结合JAK2的变体。例如，所述变体可能能够以与如SEQ ID NO:130-132之一所示的氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的水平结合JAK2。所述变体可能能够以与SEQ ID NO:130-132之一相似或相同的水平结合JAK2，或者可能能够以与如SEQ ID NO:130-132之一所示的氨基酸序列更高的水平结合JAK2(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
Figure BDA0003595329260000342
与任何SEQ ID NO:130-132相比，所述变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异，并保留结合JAK2的能力。
所述变体可以与SEQ ID NO:130-132的任意一个至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
任何本领域已知的确定蛋白质:蛋白质相互作用的方法可以用于确定JAK1-结合基序或JAK2-结合基序是否能够与JAK1或JAK2结合。例如，免疫共沉淀法，然后是蛋白质印迹法。
适当地，本文所描述的所述CAR的胞内结构域可以不包含“信号转导和转录活化因子3”(STAT3)结合基序。
STAT3已被描述为对Treg的稳定性和功能有害的信号。例如，STAT3信号传导促进促炎基因如IL17、IL21和IL22的表达。因此，在本发明的工程化Treg的背景下，使用不包含STAT3结合基序的CAR提供了特别的优势。
STAT3结合基序可以包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)，其中“X”是任意氨基酸，并且能够结合STAT3。任何本领域已知的用于确定蛋白质:蛋白质相互作用的方法可以用于确定STAT3结合基序是否能够结合STAT3。例如，免疫共沉淀法，然后是蛋白质印迹法。
适当地，所述CAR胞内结构域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)，其中“X”是任意氨基酸。
“STAT3结合基序”可以指包含酪氨酸并且当存在于Treg中时能够功能性结合(即导致活化)STAT3多肽的氨基酸基序。
适当地，所述CAR胞内结构域不包含含有酪氨酸且能够结合STAT3多肽的氨基酸基序。例如，适当地，所述CAR胞内结构域不包含含有酪氨酸并且当存在于Treg中时能够功能性结合(即导致活化)STAT3多肽的氨基酸基序。
适当地，当在Treg中表达时，本CAR的胞内结构域不能诱导生产性STAT3和/或STAT1信号传导。换言之，当在Treg中表达时，本CAR不能在功能上结合和/或诱导STAT3和/或STAT1的磷酸化和活化。适当地，当在Treg中表达时，所述CAR不能够诱导STAT3和/或STAT1依赖性的转录活化。
适当地，所述CAR胞内结构域的IL2Rβ胞内结构域部分不包含如本文定义的STAT3结合基序。
适当地，所述CAR胞内结构域可以包含IL2Rβ胞内结构域。适当地，所述CAR胞内结构域可以包含如SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO:134具有至少80％序列同一性的变体。
说明性的IL2Rβ胞内结构域(SEQ ID NO:134)
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
所述变体可以与SEQ ID NO:134至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述CAR胞内结构域可以包含截短的IL2Rβ胞内结构域。适当地，所述CAR胞内结构域可以包含如SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列；或者与SEQ IDNO:135或SEQ ID NO:136具有至少80％序列同一性的变体。
说明性的截短的IL2RB–Y510(SEQ ID NO:135)
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
说明性的截短的IL2RB–Y510&Y392(SEQ ID NO:136)
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
所述变体可以与SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:136至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
Jak1/2和Jak3的转磷酸化增加了STAT5的活性，因为这稳定了它们的活性。适当地，如本文所述的CAR胞内结构域可以进一步包含JAK3-结合基序。如本文所用，“JAK3-结合基序”是指允许酪氨酸激酶JAK3的BOX基序。合适的JAK3-结合基序例如Ferrao&Lupardus所描述(Frontiers in Endocrinology；2017；8(71)；其通过引用并入本文)。
任何本领域已知的用于确定蛋白质:蛋白质相互作用的方法可以用于确定基序是否能够结合JAK3。例如，免疫共沉淀法，然后是蛋白质印迹法。
JAK3-结合基序可以内源性地存在于跨膜蛋白的细胞质结构域中。
例如，所述JAK3-结合基序可以来自IL-2Rγ多肽。
所述JAK3-结合基序可以包含如JSEQ ID NO:137或138所示的氨基酸基序，或其能够结合JAK3的变体。
JAK3-结合基序1(SEQ ID NO:137)
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEI
JAK3-结合基序2(SEQ ID NO:138)
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
所述变体可以与SEQ ID NO:137或138至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方案中，所述CAR包含含有STAT5基序基序、JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序以及JAK3-结合基序的胞内结构域。
在一个优选实施方案中，所述CAR胞内结构域包含一个或多个JAK1-结合结构域和至少一个JAK3-结合结构域。
适当地，所述CAR胞内结构域可以包含SEQ ID NO:139或与SEQ ID NO:139具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的变体。
SEQ ID NO:139(包含CD28、IL2RG-T52、IL2RB-Y510和CD3ζ信号传导结构域的说明性的胞内结构域序列)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
适当地，所述CAR胞内结构域可以包含SEQ ID NO:140或与SEQ ID NO:140具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的变体。
SEQID NO:140(包含CD28、IL2RG-T52、IL7RA-2Y和CD3ζ信号传导结构域的说明性的胞内结构域序列)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG
其他结构域
在一些实施方案中，所述CAR包含一个或多个信号肽。
所述CAR可以包含将其靶向至内质网途径以在细胞表面上表达的先导序列。一个说明性的先导序列为CD8先导序列(SEQ ID NO:141)。
CD8先导(SEQ ID NO:141)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
在一些实施方案中，所述CAR包含一个或多个报告结构域，任选地与自切割结构域或切割结构域组合。
合适的报告结构域在本领域是众所周知的，包括但不限于荧光蛋白——如GFP。报告结构域的使用是有利的，因为它允许使用普通方法(例如流式细胞术)从起始细胞群中选择和分离已成功引入本发明的多核苷酸或载体的Treg(从而表达编码的CAR)。
适当地，所述报告结构域可以是荧光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、tdTomato、dsRed或其变体。在一些实施方案中，所述荧光蛋白为GFP或GFP变体。适当地，所述GFP可以包含如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:142至少80％相同的变体。
说明性的eGFP(SEQ ID NO:142)：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
适当地，所述变体可以与SEQ ID NO:142至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
适当地，所述报告结构域可以是基于荧光素的报告因子、PET报告因子(例如碘化钠同向转运体(NIS))或膜蛋白(例如CD34、低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))。
编码CAR和报告子结构域的核酸序列可以被共表达位点分开，从而使每个多肽能够作为离散实体表达。合适的共表达位点是本领域已知的，并且包括例如内部核糖体进入位点(IRES)和自切割肽。
相应地，所述CAR可以进一步包含自切割结构域或切割结构域。此类序列可以在蛋白质生产过程中自动切割，也可以被细胞中存在的普通酶切割。因此，在多肽序列中包含此类自切割结构域或切割结构域使得第一多肽和第二多肽表达为单个多肽，随后被裂解以提供离散的、分离的功能性多肽。合适的自切割结构域或切割结构域包括但不限于P2A肽、T2A肽、E2A肽、F2A肽和弗林(furin)位点(SEQ ID NO:143-148)。
P2A肽–切割结构域：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:143)
T2A肽–切割结构域：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:144)
E2A肽–切割结构域：GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:145)
F2A肽–切割结构域：GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:146)
弗林位点–切割结构域：RXXR(SEQ ID NO:147)(优选地：RRKR(SEQ ID NO:148))
说明性的CAR
用于本发明的说明性的CAR如下所示。CAR可以包含与SEQ ID NO:149-152或167-169中的一个或多个具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。优选为与SEQ ID NO:149-152或167-169相比具有至少部分功能性的此类变体。例如，所述变体可以具有如SEQ ID NO:149-152或167-169所示的氨基酸序列之一的功能的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。所述变体可以与SEQ ID NO:149-152或167-169之一具有相似或相同水平的功能性，或者可以具有比SEQ ID NO:149-152或167-169所示的氨基酸序列之一更高水平的功能性(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
SEQ ID NO:149-说明性的CAR 1：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:150-说明性的CAR 2：含有CD8先导、ASGR1 VH、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:151-说明性的CAR 3：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质、FP2A结构域、GFP的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRRKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPTRGGGATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO:152-说明性的CAR 4：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质、FP2A结构域、GFP的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRRKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPTRGGGATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO:167-说明性的CAR 5：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH1，SEQ ID NO:74)、接头、ASGR1 VL(VK1，SEQ ID NO:78)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSLVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKLLIGPGSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFVTYYCQQAYAWPPTFGQGTKVEIKRAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQIDNO:168-说明性的CAR 6：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH2,SEQIDNO:75)、接头、ASGR1 VL(VK2,SEQ ID NO:79)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPELQLLEFGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFSRYTMGWVRQAPGKGLEWVSAIGPPGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVMLRGRFDYWGQGTLVTVSSLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKHLIGPGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYQLPVTFGQGTKVEIKRAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:169-说明性的CAR 7：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH3,SEQ ID NO:76)、接头、ASGR1 VL(VK3,SEQ ID NO:80)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYGMGWVRQAPGKGLEWVSAIGRNGSQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLRRGRGLNTFTLDYWGQGTLVTVSSLV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIGRWLLWYQQKPGKAPKLLIGPGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIGSLQPEDFATYYCQQAYSLPPTFGQGTKVEIKRAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
变体、衍生物和片段
除了本文提到的特定蛋白质、肽和核苷酸外，本发明还包括其衍生物、变体和片段的用途。
如本文所用，与本发明的蛋白质或多肽有关的术语“衍生物”包括对序列中的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变化、修饰、置换、缺失和/或添加，条件是所得蛋白质或多肽保留所需的功能(例如，当衍生物或变体是抗原结合结构域时，所需的功能可以是抗原结合结构域结合其靶抗原的能力，或者当衍生物或变体是信号传导结构域时，所需的功能可以是该结构域发出信号的能力(例如激活或不激活下游分子)。与相应的参考序列相比，所述变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的功能；与相应的参考序列相比，具有相似或相同的功能水平；或者与相应的参考序列相比具有增加的功能水平，例如与未修饰序列相比，功能增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
通常，可以进行氨基酸取代，例如从1、2或3至10或20个取代，条件是修饰的序列保留所需的活性或能力，例如与相应的参考序列相比至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的活性；与相应的参考序列相比，具有相似或相同的活性水平；或者与相应的参考序列相比具有增加的活性水平，例如与未修饰的序列相比，活性增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。氨基酸取代可以包括非天然存在的类似物的使用。
本发明中使用的蛋白质或肽还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生悄然的变化并产生功能上等同的蛋白质。只要保留内源性功能，就可以根据残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性端基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
可以进行保守的取代，例如根据下表。第二列中同一区块的氨基酸，优选第三列中同一行的氨基酸可以相互取代。
Figure BDA0003595329260000411
所述衍生物可以是同源物或变体。如本文所用，术语“同源物”或“变体”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
同源序列或变体序列可以包括与主体序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同、优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列或核苷酸序列。通常，同源物将具有相似的化学性质/功能，例如包括与主体氨基酸序列或由主体核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的结合位点等。尽管同源性也可以根据相似性(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的上下文中，优选用序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助现成的序列比较程序进行。这些市售的计算机程序可以计算出两个或多个序列之间的同源性或同一性百分比。
同源性百分比可以在连续的序列上计算，即一条序列与另一条序列对齐，并且一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。通常，这种无空位的比对仅在相对较少数量的残基上进行。
尽管这是一个非常简单和一致的方法，但它没有考虑到，例如，在另一对完全相同的序列中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能会导致后面的密码子对不齐，从而可能导致在进行全局比对时同源性百分比的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳的比对，考虑可能的插入和缺失，而不对总体同源性得分造成不适当的罚分。这是通过在序列比对中插入“空位(gap)”以尝试最大化局部同源性来实现的。
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分(gap penalties)”分配给比对中出现的每个空位，因此，对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对，反映了两个比较序列之间更高的关联性，将获得比有许多空位的序列更高的分数。“仿射空位成本(affine gap costs)”通常用于对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中的每个后续残基进行较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，在使用这种软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是一个空位-12，并且每个延伸-4。
因此，计算最大同源性百分比首先需要产生最佳比对，同时考虑空位罚分。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(美国威斯康星大学；Devereux等.(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。其他可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等(1999)出处同上-第18章)，FASTA(Atschul等.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA都可用于离线和在线检索(参见Ausubel等(1999)出处同上，第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用来说，最好使用GCG Bestfit程序。另一种工具称为BLAST 2Sequences，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。
尽管最终的同源性百分比可以用同一性来衡量，但比对过程本身通常不是基于全或无的配对比较。取而代之的是，通常使用缩放的相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。通常使用这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵——BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供的话)(有关进一步信息，参见用户手册)。对于某些应用，最好使用GCG软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，如BLOSUM62。适当地，在整个参考和/或查询序列中确定同一性百分比。
一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，最好是序列同一性百分比。该软件通常将此作为序列比较的一部分，并生成数字结果。
“片段”通常是指在功能上感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
此类衍生物、变体和片段可以使用标准的重组DNA技术，如定点诱变来制备。如果要进行插入，可以制备编码该插入的合成DNA，以及对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5'和3'侧翼区域。所述侧翼区域将包含与天然存在的序列中的位点相对应的方便的限制性位点，以便用适当的酶切割该序列，并将合成DNA连接到切割处。然后根据本发明对DNA进行表达，以制备编码的蛋白质。这些方法仅说明本领域已知的用于操纵DNA序列的众多标准技术，也可以使用其他已知的技术。
药物组合物
还提供了一种包含本发明的工程化Treg或CAR的药物组合物。
一种药物组合物，其是包含或由治疗有效量的药学活性剂(即所述Treg)组成的组合物。其优选包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
“药学上可接受的”包括制剂是无菌且无热原的。载体、稀释剂和/或赋形剂必须在与所述Treg相容且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。通常，载体、稀释剂和赋形剂将是生理盐水或输液介质，其是无菌且无热原的，然而，也可以使用其他可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
用于治疗用途的可接受的载体、稀释剂和赋形剂在制药领域是众所周知的。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践来选择。所述药物组合物可以包含作为(或除此之外的)载体、赋形剂或稀释剂的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。
药学上可接受的载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇类、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
根据本发明的Treg或药物组合物可以以适合治疗和/或预防本文所述疾病的方式给药。给药的数量和频率将由受试者的状况以及受试者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可通过临床试验确定。所述药物组合物可以相应地进行配制。
如本文所述的Treg或药物组合物可以通过肠胃外给药，例如静脉内，或者它们可以通过输注技术给药。所述Treg或药物组合物可以以无菌水溶液的形式给药，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。可以适当地缓冲所述水溶液(优选pH值为3至9)。所述药物组合物可以相应地进行配制。在无菌条件下制备合适的肠道外制剂很容易通过本领域技术人员熟知的标准制药技术来完成。
所述药物组合物可以在输液介质(例如无菌等渗溶液)中包含本发明的Treg。所述药物组合物可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
所述Treg或药物组合物可以以单剂量或多剂量给药。特别地，所述Treg或药物组合物可以以单一的、一次性的剂量给药。所述药物组合物可以相应地进行配制。
根据疾病和要治疗的受试者以及给药途径，所述Treg或药物组合物可以以不同的剂量给药(例如以细胞/kg或细胞/受试者为单位测量)。在任何情况下，医生将决定最适合任何个体受试者的实际剂量，并且会随着特定受试者的年龄、体重和反应而变化。然而，通常，对于本发明的Treg，每个受试者可以施用5×107至3×109个细胞，或108至2×109个细胞的剂量。
所述Treg可以被适当地修饰以用于药物组合物。例如，在输注到受试者体内之前，可以在适当的时间冷冻保存和解冻Treg。
所述药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂，如淋巴耗竭剂(例如胸腺球蛋白、campath-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激通路的药物(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子(IL-6、IL-17、TNFα、IL18)的药物。
发明进一步包括了包含本发明所述Treg和/或药物组合物的试剂盒的用途。优选地所述试剂盒用于如本文所述的方法和用途中，例如，如本文所述的治疗方法。优选地所述试剂盒包含所述试剂盒组分的使用说明。
治疗和/或预防疾病的方法
所述工程化Treg可以被施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
例如，所述工程化Treg可以被施用于患有肝脏疾病(例如肝移植排斥、肝脏GvHD、自身免疫性肝脏疾病、肝脏炎症、肝衰竭)的受试者，以减轻、减少或改善至少一种肝脏疾病的症状，如黄疸、深色尿液、瘙痒、腹部肿胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐和/或食欲不振。至少一种症状可以减轻、减少或改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者至少一种症状可以完全缓解。
所述工程化Treg可以被施用于患有肝脏疾病(例如肝移植排斥、肝脏GvHD、自身免疫性肝脏疾病、肝脏炎症、肝衰竭)的受试者，以减缓、减少或阻止肝脏疾病的进展。与未施用工程化Treg的受试者相比，疾病的进展可以被减缓、减少或阻断至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者疾病的进展可以完全停止。
另外，所述工程化Treg可以被施用于尚未感染疾病和/或未表现出任何疾病症状的受试者，以预防疾病或减少或预防与疾病相关的至少一种症状的发展。所述受试者可能具有该疾病的易感性，或被认为有发生该疾病的风险。
例如，所述工程化Treg可以被施用于尚未感染和/或未表现出任何肝脏疾病(例如肝移植排斥、肝脏GvHD、自身免疫性肝脏疾病、肝脏炎症、肝衰竭)症状的受试者，以减少或预防至少一种肝病症状，如黄疸、深色尿液、瘙痒、腹部肿胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐和/或食欲不振。与未施用工程化Treg的受试者相比，至少一种症状可以减轻至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者至少一种症状可以完全被预防。
所述工程化Treg可以被施用于尚未感染和/或未表现出任何肝脏疾病(例如肝移植排斥、肝脏GvHD、自身免疫性肝脏疾病、肝脏炎症、肝衰竭)症状的受试者，以预防肝脏疾病。与未施用工程化Treg的受试者相比，所述肝脏疾病可以减轻至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者所述肝脏疾病可以完全被预防。
肝脏疾病包括如肝移植排斥反应、肝脏GvHD、自身免疫性肝脏疾病、肝脏炎症和肝脏衰竭等情况，特别是包括可能导致肝脏损伤或破坏的受试者中不希望增加的免疫反应相关的肝脏疾病。在一个具体实施方案中，肝脏疾病可以不包括，例如，肝癌，更具体地可以不包括肝细胞癌(HCC)。因此，肝脏疾病优选包括可以通过减少免疫反应(例如减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)来治疗或预防的病症，特别是在肝脏内或肝脏附近。
适当地，本发明的治疗方法可以包括向受试者施用根据本发明的工程化Treg、或者通过根据本发明的方法可以获得(例如已经获得的)工程化Treg、或者如本文所定义的多核苷酸或载体(例如在如本文所述的药物组合物中)的步骤。
适当地，用于治疗和/或预防疾病的本方法可以包括向受试者施用根据本发明的工程化Treg(例如在如本文所述的药物组合物中)。
所述方法可以涉及以下步骤：
(i)分离含有细胞的样品或提供含有细胞的样品；
(ii)将本文定义的多核苷酸或载体引入所述细胞；以及
(iii)将来自步骤(ii)的细胞施用于受试者。
适当地，所述细胞为如本文定义的Treg。
适当地，在所述方法的步骤(ii)之前和/或之后，可以从所述含有细胞的样品中分离和/或生成富集的Treg群。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行分离和/或生成，以分离和/或生成富集的Treg样品。富集可以在步骤(ii)之后进行，以富集包含本发明的CAR、多核苷酸和/或载体的细胞和/或Treg。
适当地，所述多核苷酸或载体可以通过转导和/或转染引入。
适当地，所述细胞可以是自体的和/或异体的。
适当地，所述工程化Treg可以与一种或多种其他治疗剂组合施用，如淋巴耗竭剂(例如胸腺球蛋白、campath-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激通路的药物(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子(IL-6、IL-17、TNFα、IL18)的药物。工程化Treg可以与一种或多种其他治疗剂同时或顺序施用(即，之前或之后)。
肝移植
肝移植是目前可用于终末期肝脏疾病患者的唯一治愈性治疗选择。尽管最近在免疫抑制剂方面取得了进展，但急性同种异体移植物排斥反应仍然是肝移植的常见并发症，其发生率在肝移植的20％至40％之间。在大多数情况下，排斥反应发生在肝移植后的第一个月内。早期排斥反应发作并不明显损害长期移植的成功或患者预后。相比之下，迟发性同种异体移植物排斥反应(肝移植后>3-6个月)与移植物存活率低相关(Dogan,N.,等,2018.Journal of International Medical Research,46(9),第3979-3990页)。
本发明提供了一种诱导对肝移植物的耐受性的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。
如本文所用，“诱导对肝移植物的耐受性”是指诱导受体对移植肝脏的耐受性。换言之，诱导对肝移植的耐受性意味着降低受体对供体移植器官的免疫反应水平。诱导对移植肝脏的耐受性可以降低排斥反应的发生率，减少移植患者需要的免疫抑制药物的量，或者可以使免疫抑制药物停用。
本发明还提供了一种治疗和/或预防肝移植排斥反应的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。适当地，治疗和/或预防肝移植排斥反应可以指减少肝移植受体需要的免疫抑制药物的量，或者可以使免疫抑制药物停用。
在一个实施方案中，所述受试者是正在接受免疫抑制治疗的肝移植受体。
在一个实施方案中，除了诱导对肝移植的耐受性或治疗和/或预防肝移植排斥反应外，本发明优选地促进肝脏组织修复和/或肝脏再生。
移植物抗宿主病
本发明提供了一种治疗和/或预防肝脏移植物抗宿主病(GvHD)的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。所述受试者可以是肝移植的受体。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。
GvHD是接受来自基因不同的人的移植组织后的一种常见并发症。GvHD通常与干细胞移植有关，如那些发生在骨髓移植上的疾病。GvHD也适用于其他形式的移植组织，如肝移植。保留在供体组织(移植物)内的供体免疫系统的白细胞将受体(宿主)识别为外来的(非自身的)。存在于移植组织内的白细胞随后会攻击受体的身体细胞，从而导致GvHD。在经典意义上，急性移植物抗宿主病的特点是对肝脏、皮肤、粘膜和胃肠道的选择性损伤。因此，所述受试者可能有肝脏损伤，即肝脏GvHD。
在一些实施方案中，所述受试者是移植受体，其中所述移植物选自肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、带血管的复合组织移植物和皮肤移植物。优选地，所述受试者是肝移植受体。
在一个实施方案中，所述受试者是正在接受免疫抑制治疗的肝移植受体。
在一个实施方案中，除了治疗和/或预防肝脏GvHD外，本发明还促进肝脏组织修复和/或肝脏再生。
自身免疫性肝脏疾病
本发明提供了一种治疗和/或预防自身免疫性肝脏疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。
适当地，所述自身免疫性肝脏疾病是慢性自身免疫性肝脏疾病。
所述自身免疫性肝脏疾病可以选自自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和/或(原发性)硬化性胆管炎中的一种或多种。自身免疫性肝脏疾病是可能具有重叠特征的慢性、缓慢进展的炎症性肝脏疾病(Decock,S.,McGee,P.和Hirschfield,G.M.,2009.Bmj,339,p.b3305)。
自身免疫性肝炎通常是一种复发性免疫介导的肝炎。如果有症状，患者临床表现为关节痛和疲劳，三分之一的患者表现为肝硬化。肝酶(转氨酶)升高是实验室异常的最初特点。(Decock,S.,McGee,P.和Hirschfield,G.M.,2009.Bmj,339,p.b3305)。自身免疫性肝炎也可以表现为一种急性疾病，如果不加以治疗，会导致肝衰竭和死亡。
原发性胆汁性胆管炎是一种缓慢进展的慢性胆汁淤积性疾病，其特点是小导管肉芽肿性胆管炎和生化胆汁淤积(碱性磷酸酶升高)。目前，60％被诊断为原发性胆汁性胆管炎的病人没有症状，并且大多数患有非肝硬化疾病。当出现症状时，疲劳、瘙痒和右上腹不适很常见，但并不表明疾病的严重程度。然而，即使没有症状，与一般人群相比，原发性胆汁性胆管炎患者的长期存活率也显著降低(Decock,S.,McGee,P.和Hirschfield,GM,2009.Bmj,339,p.b3305)。
原发性硬化性胆管炎是一种慢性胆汁淤积性肝病，其特点是肝内和/或肝外胆管树的纤维化炎症性破坏。目前没有治疗原发性硬化性胆管炎的方法。一旦出现症状，大约有50％的机会需要移植，且10年内有10％的风险发生胆管癌。(Decock,S.,McGee,P.和Hirschfield,GM,2009.Bmj,339,p.b3305)。
在一个实施方案中，除了治疗和/或预防自身免疫性肝脏疾病外，本发明还促进肝脏组织修复和/或肝脏再生。
肝脏炎症
本发明提供了一种治疗和/或预防炎症性肝病的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。
肝脏组织的炎症也称为肝炎。肝炎可以是急性或慢性的。急性肝炎有时会自行消退，发展为慢性肝炎，或很少地导致急性肝衰竭。随着时间的推移，慢性形式可能发展为肝脏的疤痕(肝硬化)、慢性肝衰竭和/或肝癌。肝硬化的体征和症状包括黄疸、腹水(腹腔积液)、疲劳和肝性脑病(肝衰竭导致的脑功能障碍)。
肝炎的病因可分为以下几大类：感染性、代谢性、酒精性、缺血性、自身免疫性、遗传性。因此，在一些实施方案中，所述肝炎选自感染性肝炎、代谢性肝炎、酒精性肝炎、缺血性肝炎、自身免疫性肝炎和遗传性肝炎。
感染性肝炎包括病毒性肝炎、寄生虫性肝炎和细菌性肝炎。
病毒性肝炎是由于病毒感染引起的肝脏炎症。其可能以急性形式出现，即起病相对较快的近期感染，或以慢性形式出现。病毒性肝炎最常见的病因是五种不相关的嗜肝病毒甲、乙、丙、丁和戊。其他病毒也可以引起肝脏炎症，包括巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和黄热病。还有数十个由单纯疱疹病毒引起的病毒性肝炎的记录病例。
寄生虫性肝炎是由于寄生虫感染引起的肝脏炎症。在原生动物中，克氏锥虫、利什曼原虫和引起疟疾的疟原虫都可以引起肝脏炎症。在蠕虫类中，狗绦虫感染肝脏并形成特征性的肝包虫囊肿。肝吸虫肝片吸虫和华支睾吸虫生活在胆管中，引起进行性肝炎和肝脏纤维化。
细菌性肝炎是由于细菌感染引起的肝脏炎症。急性肝炎由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、沙门氏菌属、布鲁氏菌属和弯曲杆菌属引起。慢性或肉芽肿性肝炎见于分枝杆菌属、惠普尔养障体(Tropherymawhipplei)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、伯纳特氏立克次氏体(Coxiellaburnetii)和立克次氏体属的感染。
酒精性肝炎是由于过量摄入酒精引起的肝脏炎症。酒精性肝炎可以有一个慢性病程，可导致肝硬化、肝衰竭和/或癌症，或急性表现。急性酒精性肝炎的重症病例3个月的死亡率为50％。许多化学制剂，包括药物、工业毒素以及草药和膳食补充剂，也会引起中毒性肝炎。
非酒精性脂肪肝炎是代谢性肝炎的最常见形式，属于非酒精性脂肪肝脏疾病(NAFLD)的范畴。非酒精性脂肪肝发生在很少或没有饮酒史的人身上，而是与代谢综合征、肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病以及高甘油三酯血症密切相关。非酒精性脂肪肝可导致非酒精性脂肪性肝炎。脂肪性肝炎是脂肪肝的一种类型，其特点是肝脏发炎，同时肝脏内积聚脂肪，这可导致肝硬化、肝衰竭和/或肝癌。
缺血性肝炎也称为缺血性肝病或休克肝，是一种被定义为由肝脏血流不足(从而导致氧气输送不足)引起的急性肝损伤。
肝炎的遗传原因包括α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、血色素沉着症和威尔逊氏病。
在一些实施方案中，所述肝脏炎症没有可识别的原因。
在一个实施方案中，除了治疗和/或预防肝脏炎症外，本发明还促进肝脏组织修复和/或肝脏再生。
肝脏修复或再生
本发明提供了一种促进肝脏组织修复和/或肝脏再生的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。适当地，所述受试者是哺乳动物，优选人类。所述受试者可能有肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭。
如本文所用，“肝脏再生”可以指损伤(例如急性损伤)后肝脏结构和功能的重建，而不留下疤痕(Cordero-Espinoza,L.和Huch,M.,2018.The Journal ofclinicalinvestigation,128(1),第85-96页)。例如，肝脏再生可引起原始肝脏质量的至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的恢复。本发明的方法可以缩短达到最大肝脏质量的时间，例如，与未施用工程化Treg或药物组合物的受试者相比，可以缩短至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的时间。
如本文所用，“肝脏组织修复”可以指损伤(例如慢性损伤)后肝脏结构和功能的重建，并伴有瘢痕(即纤维化)(Cordero-Espinoza,L.和Huch,M.,2018.The Journal ofclinical investigation,128(1),第85-96页)。这可以通过用细胞外基质(ECM)的网状结构替代功能性组织实质来表征。肝脏结构可能会改变，且最佳功能可能会受到阻碍。例如，肝脏修复可能引起原始肝脏功能的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的恢复。本发明的方法可以缩短达到最大肝脏功能的时间，例如，与未施用工程化Treg或药物组合物的受试者相比，可以缩短至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的时间。
本发明的所述工程化Treg可以表达参与肝脏再生和组织修复的基因，进而促进稳健的肝脏修复和/或再生。
尽管成体肝细胞寿命很长并通常不经历细胞分裂，但它们在响应炎症损伤或部分肝切除后保持增殖的能力。这种能力在啮齿动物的三分之二部分肝切除模型中表现得最为明显。在该模型中，三分之二的肝脏通过手术被切除，剩余的肝脏会增大，直到恢复原来的肝脏质量——大约在手术后1周——之后再生过程停止。在人体中，肝脏再生最经常发生在缺血或肝炎引起的肝脏损伤之后。(Taub,R.,2004.Nature reviews Molecular cellbiology,5(10),第836-847页)。在接受部分肝脏切除作为肝脏肿瘤治疗或活体肝移植期间的人类中会发生非常相似的现象。此外，在人体中，由于缺血、毒物以及急性或慢性肝炎对肝细胞造成损伤后，会发生肝脏再生。
适当地，肝脏可能因肝炎而受伤和/或损坏。在一些实施方案中，除了促进肝脏组织修复和/或肝脏再生外，本发明的工程化Treg进一步治疗肝炎。所述肝炎可以选自感染性肝炎、代谢性肝炎、酒精性肝炎、缺血性肝炎、自身免疫性肝炎和遗传性肝炎。在一个实施方案中，肝炎可以不是暴发性肝炎或慢性肝炎。
由于肝脏的再生，使用活体供体的部分肝脏进行移植已经成为可能，从而增加了可用于移植的器官数量。越来越多的肝移植正在使用活的相关供体组织和小型移植器官进行，对于这些器官的成功移植至少需要一些肝脏再生和修复。(Taub,R.,2004.NatureReviews Molecular cell Biology,5(10),第836-847页)。
因此，所述受试者可以是肝移植受体或正在接受部分肝切除术的患者(例如作为脏移植的活体供体或由于存在需要手术切除的肝脏肿瘤)。所述肝脏可以是移植的肝脏。
患有某些肝脏疾病(包括肝硬化(肝脏纤维化)、脂肪变性(脂肪肝)，甚至那些由于年老而引起的疾病)的人，其肝脏再生能力受损，导致因肝脏损伤或损坏的发病率和死亡率增加。(Taub,R.,2004.Nature reviews Molecular cell biology,5(10),第836-847页)。
因此，所述受试者可能有肝脏再生障碍，优选是由于急性肝衰竭、肝硬化、慢加急性肝衰竭、肝炎、脂肪变性、脂肪性肝炎和年老中的一个或多个原因。
在一个实施方案中，除了促进肝脏组织修复和/或肝脏再生外，本发明还可以治疗和/或预防免疫介导的损伤。例如，本发明还可以诱导受试者对肝移植的耐受性，或者治疗和/或预防受试者的肝移植排斥反应、肝移植抗宿主疾病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病。
用于这些修复和/或再生的实施方案(以及本文所述的其中涉及修复和/或再生的其他实施方案)的优选的CARTreg能够增加或刺激白蛋白的产生，例如能够增加肝脏中(例如在肝脏细胞或肝脏组织中，例如在肝细胞中)的白蛋白浓度或水平和/或刺激白蛋白的产生。
因此，本发明的又一方面提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)，或者包含所述工程化Treg的药物组合物，用于在受试者的肝脏组织或肝脏细胞中增加或刺激白蛋白产生，或者用于增加白蛋白水平或刺激白蛋白产生，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
换个角度来看，本发明的该方面提供了一种在受试者的肝脏组织或肝脏细胞中增加或刺激白蛋白产生的方法，或者增加白蛋白水平的方法，其中包括向受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)或者包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
换个角度来看，本发明的该方面提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)或者包含所述工程化Treg的药物组合物在制备用于在受试者的肝脏组织或肝脏细胞中增加或刺激白蛋白的产生或者增加白蛋白的水平的药物或组合物中的用途，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
用于白蛋白水平增加的这些方面的适当和优选的肝脏特异性抗原识别结构域在本文别处描述，例如与ASGR结合或特异性结合的抗原识别结构域。这方面的其他优选实施方案也在本文别处描述。
肝细胞通常构成肝脏质量的大部分，当肝细胞或肝脏组织样品在体外培养或在患者血液中培养时，肝细胞的上清液中的白蛋白水平或白蛋白浓度是肝脏细胞(例如肝细胞)分化、功能和活力的标志物。因此，确定包含嵌合抗原受体(CAR)的Treg对此类细胞内白蛋白水平的影响，提供了所述CAR Treg在响应抗原刺激时对肝脏细胞或肝脏组织介导营养(例如促进肝细胞功能和/或活力的营养信号)和/或细胞保护的能力的评估或指示。
可以用任何合适的测定方法来鉴定能够增加或刺激白蛋白产生或者增加白蛋白水平或浓度的包含嵌合抗原受体(CAR)的Treg。合适的测定方法在本领域中是众所周知的。例如，使用适当的肝脏细胞并通过常规技术(例如ELISA)测量这些细胞中或来自这些细胞的上清液中的白蛋白水平(例如评估分泌的白蛋白水平)的体外检测可以容易地使用。在存在或不存在适当的CAR Treg的情况下，可以方便地测量和比较水平。肝细胞，特别是人肝细胞(例如原代人肝细胞)是特别合适的。示例性的检测方法如实施例14所示。如上所述，在相应抗原刺激时，这种CAR Treg可以转而有对肝脏细胞介导营养和/或细胞保护的能力，从而使它们特别适合用于本发明涉及肝脏修复和/或再生的方面。用如本文定义的工程化Treg治疗后，患者体内的白蛋白水平或浓度可以使用上述的常规技术通过血液样品进行测量。
本文提到的肝脏细胞或肝脏组织中的白蛋白产生或者白蛋白水平或浓度的增加或刺激(或等效术语)，包括与适当的对照相比时的任何可测量的增加或增强或改善。优选地是此类增加等是显著的增加，优选临床上的显著增加或统计学上的显著增加例如与适当的对照水平或数值相比具有<0.05的概率值。
适当的对照将由本领域技术人员容易地识别并且可以包括例如在本发明的CARTreg(例如本发明的转导的CAR Treg)存在下与不存在所述CAR Treg的情况下观察到的白蛋白的产生、水平或浓度相比较(例如与未处理的样品相比较，例如仅与适当的对照培养基相比较)，或者可以包括例如在本发明的CAR Treg(例如本发明的转导的CAR Treg)存在下与非转导的Treg(例如活化或未活化/静息的未转导Treg)存在下观察到的白蛋白的产生、水平或浓度相比较。
在用本发明的CAR Treg(例如本发明的转导的CAR Treg)观察到肝脏细胞中白蛋白产生、水平或浓度增加的此类实施方案中，优选观察到白蛋白水平或浓度的改善或增加至少(或达到)1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。例如，与不存在本发明的CAR Treg时观察到的水平或浓度相比(例如与未处理的样品或仅与适当的对照培养基相比较)，可以观察到本发明的优选CAR Treg的白蛋白水平或浓度至少(或达到)5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍的改善或增加。例如，与非转导的或非转染的Treg观察到的水平相比(例如与非转导的活化或非活化/静息的Treg相比)，可以观察到本发明的优选CAR Treg的白蛋白水平至少(或达到)1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍或10倍的改善或增加。
肝脏纤维化、肝硬化、急性肝衰竭和慢加急性肝衰竭
本发明提供了一种治疗和/或预防肝脏纤维化、肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的方法。
肝脏纤维化、肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的改善通常需要治疗和/或预防肝脏的免疫介导的损伤并促进肝脏再生。
肝脏纤维化是导致死亡的主要原因之一，因为它改变了某些器官的结构并破坏了正常功能。肝脏纤维化是慢性肝病(如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和其他肝脏疾病)导致的伤口愈合过程的组织学结果。富含纤维形成胶原蛋白的过量细胞外基质(ECM)的沉积是肝脏纤维化的一个典型表现。ECM的过量沉积改变了肝脏的正常结构，导致器官的病理生理损伤(Suk,K.T.和Kim,D.J.,2015.World Journal ofHepatology,7(3),第607页)。
肝硬化被定义为肝脏纤维化的晚期阶段，伴有肝血管系统和结构的扭曲。组织学上，具有纤维组织的再生结节在慢性损伤中形成并导致肝硬化。因此，由于肝脏纤维化和/或肝硬化导致的肝脏结构破坏会引起血液动力学不稳定和门静脉高压(Suk,K.T.和Kim,D.J.,2015.World Journal ofHepatology,7(3),第607页)。
急性肝衰竭在本文中定义为肝细胞功能障碍的快速发展，特别是在没有已知的既往肝脏疾病的患者中的凝血障碍和脑病。例如，“急性肝衰竭”可以定义为在出现任何肝脏症状的26周内发展为脑病。这可以细分为“暴发性肝衰竭”和“亚暴发性”，前者要求在8周内出现脑病，后者描述8周后但26周前出现的脑病。另一个方案将“超急性”定义为7天内发病，“急性”定义为7至28天之间发病，而“亚急性”定义为28天至24周内发病。
慢加急性肝衰竭的特点是与器官衰竭和高短期死亡率相关的慢性肝病的急性失代偿。酒精和慢性病毒性肝炎是最常见的基础肝病(Hernaez,R.,等,2017.Gut,66(3),第541-553页)。
多核苷酸
本发明提供了一种编码本发明所述CAR的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解的是，技术人员可以使用常规技术进行不影响本发明多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映本发明多肽将在任何特定宿主生物体中表达的密码子用法。
所述多核苷酸可以通过本领域现有的任何方法进行修饰。为了提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命，可以进行这样的修饰。
多核苷酸(如DNA多核苷酸)可以通过重组、合成或本领域技术人员可利用的任何方法生产。它们也可以通过标准技术进行克隆。
较长的多核苷酸通常将使用重组方式生产，例如使用聚合酶链式反应(PCR)克隆技术。这包括制作一对引物(例如大约15至30个核苷酸)，并使其位于希望克隆的靶序列的两侧，使所述引物与从动物或人类细胞中获得的mRNA或cDNA接触，在使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。所述引物可以被设计成含有合适的限制性酶识别位点，以便将扩增的DNA克隆到合适的载体中。
本发明中使用的多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化先前已在WO 1999/41397和WO 2001/79518中描述。不同的细胞对特定密码子的使用情况不同。这种密码子的偏差对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏差。通过改变序列中的密码子，使其与相应tRNA的相对丰度相匹配，就有可能增加表达。同样地，可以通过故意选择已知相应的tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来减少表达。因此，可以使用额外程度的转录控制。
编码本发明的说明性CAR(SEQ ID NO:149-152或167-169)的说明性核苷酸序列如下所示。编码本发明的CAR的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:153-156或170-172中的一个或多个具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列。
SEQ ID NO:153–编码说明性CAR 1的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAAGTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCGGCGAGGGGTGTGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATAAGCGGCACGAGCATACTCGTTTTGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
SEQ ID NO:154-编码说明性CAR 2的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAAGTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCGGCGAGGGGTGTGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATAAGCGGCACGAGCATACTCGTTTTGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCCATCGAGGTGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
SEQ ID NO:155-编码说明性CAR 3的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质、FP2A结构域、GFP的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAAGTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCGGCGAGGGGTGTGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATAAGCGGCACGAGCATACTCGTTTTGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCAGGAGAAAAAGAGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACGCGTGGAGGTGGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEQ ID NO:156-编码说明性CAR 4的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH、CD8α铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质、FP2A结构域、GFP的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAAGTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCGGCGAGGGGTGTGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATAAGCGGCACGAGCATACTCGTTTTGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCCATCGAGGTGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCAGGAGAAAAAGAGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACGCGTGGAGGTGGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEQ ID NO:170-编码说明性CAR 5的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH1，SEQ ID NO:74)、接头、ASGR1 VL(VK1，SEQ ID NO:78)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAAGTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACGGATTTCGGCGAGGGGTGTGACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATAAGCGGCACGAGCATACTCGTTTTGACTCCTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGTGGCGGAGGCAGCGGCGGAGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATTACTTGCCGGGCAAGTCAGGCGATTGGGCGGTGGTTATTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGGTCCGGGTTCCCGGTTGCGAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTACAACCTGAAGATTTTGTTACGTACTACTGTCAACAGGCGTATGCCTGGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCCATCGAGGTGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO:171-编码说明性CAR 6的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH2，SEQ ID NO:75)、接头、ASGR1 VL(VK2,SEQ ID NO:79)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGTTGCAGCTGTTGGAGTTTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACAACCTCCGGATTCACCTTTTCGAGGTATACTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCCATTGGCCCGCCCGGGTCGAACACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGGGTGATGTTGCGGGGGCGCTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGTGGCGGAGGCAGCGGCGGAGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATTACTTGCCGGGCAAGTCAGGCGATTGGGCGGTGGTTATTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCACCTGATCGGTCCGGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGCGTATCAGCTGCCTGTCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCCATCGAGGTGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO:172-编码说明性CAR 7的说明性核苷酸序列：含有CD8先导、ASGR1 VH(VH3，SEQ ID NO:76)、接头、ASGR1 VL(VK3，SEQ ID NO:80)、带有c-Myc标签的CD28铰链、CD28跨膜、CD28细胞质、CD3z细胞质的CAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGATTATGGTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTGGCCGCAACGGGTCGCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCGGAGGGGGCGGGGTCTGAATACGTTTACGTTAGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGTGGCGGAGGCAGCGGCGGAGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATTACTTGCCGGGCAAGTCAGGCGATTGGGCGGTGGTTATTGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGGTCCGGGTTCCCGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGCGTATAGTCTGCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGCGGCCGCCATCGAGGTGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGCGGCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
如前所述，本发明的多核苷酸还可以编码除本文定义的CAR之外的多肽，例如报告因子或标志物多肽或蛋白质。特别地，本发明的多核苷酸可以额外地编码FOXP3多肽。
在一个实施方案中，本发明的Treg可以包含一个或多个编码本发明的CAR和FOXP3多肽(外源FOXP3多肽)的多核苷酸，因此本发明的Treg可以通过将编码本发明的CAR和FOXP3多肽的多核苷酸引入细胞而产生。可以理解的是，本发明的CAR和FOXP3多肽可以由单个多核苷酸序列编码或由不同的多核苷酸编码。
“FOXP3”是叉头框P3蛋白的简称。FOXP3是转录因子FOX蛋白家族的成员，在调节性T细胞的发育和功能中作为调节途径的主要操纵子发挥作用。如本文所用的“FOXP3”包括FOXP3的变体、同种型和功能性片段。
“FOXP3多肽”是具有FOXP3活性的多肽，即能够结合FOXP3靶DNA并作为转录因子调控Treg的发育和功能的多肽。特别地，FOXP3多肽可以具有与野生型FOXP3(SEQ ID NO.157)相同或相似的活性，例如可以具有野生型FOXP3多肽活性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％。因此，由本文所述的核苷酸序列编码的FOXP3多肽与野生型FOXP3相比，可以具有增加或减少的活性。用于测量转录因子活性的技术是本领域众所周知的。例如，可以通过ChIP测量转录因子DNA结合活性。转录因子的转录调控活性可以通过量化它所调控的基因的表达水平来测量。基因表达可以通过使用RNA印迹法、SAGE、qPCR、HPLC、LC/MS、蛋白质印迹法或ELISA等技术测量由基因产生的mRNA和/或蛋白质的水平来量化。受FOXP3调控的基因包括细胞因子，如IL-2、IL-4和IFN-γ(Siegler等.Annu.Rev.Immunol.2006,24:209-26，通过引用并入本文)。如下文和前文详细讨论的，FOXP3或FOXP3多肽包括其功能性片段、变体和同种型，例如SEQ ID NO.157。
“FOXP3的功能性片段”可以指FOXP3多肽或编码FOXP3多肽的多核苷酸(即核苷酸序列)的一部分或区域，其具有与全长FOXP3多肽或多核苷酸相同或相似的活性。所述功能性片段可以具有全长FOXP3多肽或多核苷酸的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的活性。本领域技术人员能够基于FOXP3的已知结构和功能特征生成功能性片段。这些描述于例如Song,X.,等,2012.Cell reports,1(6),第665-675页；Lopes,J.E.,等,2006.The Journal of Immunology,177(5),第3133-3142页；以及Lozano,T.,等,2013.Frontiers in oncology,3,第294页。此外，在WO2019/241549(通过引用并入本文)中描述了N末端和C末端截短的FOXP3片段，例如，具有下文讨论的SEQ IDNO.157的序列。
“FOXP3变体”可以包含氨基酸序列或核苷酸序列，其与FOXP3多肽或编码FOXP3多肽的多核苷酸(例如SEQ ID NO.157)至少有50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％相同，优选至少95％或至少97％或至少99％相同。FOXP3变体可以具有与野生型FOXP3多肽或多核苷酸相同或相似的活性，例如可以具有野生型FOXP3多肽或多核苷酸的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。本领域技术人员能够基于FOXP3的已知结构和功能特征和/或使用保守的取代方法来生成FOXP3变体。与野生型FOXP3相比，FOXP3变体在Treg细胞内可以具有相似或相同的周转时间(或降解率)，例如，在Treg中的周转时间(或降解率)至少是野生型FOXP3在Treg中的40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。与野生型FOXP3相比，一些FOXP3变体可以具有减少的周转时间(或降解率)，例如，在SEQ IDNO.157的第418位氨基酸和/或第422位氨基酸具有氨基酸取代的FOXP3变体，例如S418E和/或S422A，如WO2019/241549(通过引用并入本文)所述，并在SEQ ID NO.158至160中列出，它们分别代表第418位氨基酸突变体、第422位氨基酸突变体以及第418位和第422位氨基酸突变体。
适当地，本文所述的核酸分子、构建体或载体编码的FOXP3多肽可以包含或由人FOXP3的多肽序列组成，如UniProtKB登录号Q9BZS1(SEQ ID NO:157)或其功能性片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，所述FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO:157或其功能性片段至少70％相同的氨基酸序列组成。适当地，所述FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO:157或其功能性片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述FOXP3多肽包含或由SEQ ID NO:157或其功能性片段组成。
在一些实施方案中，如上所述，所述FOXP3多肽可以包含SEQ ID NO.157的残基418和/或422的突变，如SEQ ID NO.158、SEQ ID NO.159或SEQ ID NO.160中所列。
在本发明的一些实施方案中，所述FOXP3多肽可以在N末端和/或C末端截短，从而产生功能性片段。特别地，FOXP3的N末端和C末端截短的功能性片段可以包含或由SEQ IDNO.161的氨基酸序列或其功能性变体组成，所述功能性变体与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性。
适当地，所述FOXP3多肽可以是SEQ ID NO:157的变体，例如天然变体。适当地，所述FOXP3多肽是SEQ ID NO:157的同种型。例如，所述FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO:157的第72-106位氨基酸的缺失。或者，所述FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO:157的第246-272位氨基酸的缺失。
适当地，所述FOXP3多肽包含SEQ ID NO:162或其功能性片段。SEQ ID NO:162代表了一个说明性的FOXP3多肽。
适当地，所述FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO:162或其功能性片段至少70％相同的氨基酸序列组成。适当地，所述FOXP3多肽包含与SEQ ID NO:162或其功能性片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述FOXP3多肽包含或由SEQ ID NO:162或其功能性片段组成。
适当地，所述FOXP3多肽可以是SEQ ID NO:162的变体，例如天然变体。适当地，所述FOXP3多肽是SEQ ID NO:162的同种型或其功能性片段。例如，所述FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO:162的第72-106位氨基酸的缺失。或者，所述FOXP3多肽可以包含相对于SEQID NO:162的第246-272位氨基酸的缺失。
适当地，编码FOXP3多肽的多核苷酸包含或由如SEQ ID NO:163所示的核苷酸序列组成，其代表了一个说明性的FOXP3核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ IDNO:163或其编码功能性FOXP3多肽的片段至少70％相同的核苷酸序列。适当地，编码所述FOXP3多肽或变体的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:163或其编码功能性FOXP3多肽的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列。在本发明的一些实施方案中，编码所述FOXP3多肽或变体的所述多核苷酸包含或由SEQ ID NO:163或其编码功能性FOXP3多肽的片段组成。
适当地，编码FOXP3多肽的所述多核苷酸包含或由如SEQ ID NO:164所示的多核苷酸序列组成，其代表了另一个说明性的FOXP3核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，编码所述FOXP3多肽或变体的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:164或其编码功能性FOXP3多肽的片段至少70％相同的核苷酸序列。适当地，编码所述FOXP3多肽或变体的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:164或其编码功能性FOXP3多肽的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列。在本发明的一些实施方案中，编码所述FOXP3多肽或变体的所述多核苷酸包含或由SEQID NO:164或其编码功能性FOXP3多肽的片段组成。
适当地，编码所述FOXP3多肽或其功能性片段或变体的所述多核苷酸可以进行密码子优化。适当地，编码所述FOXP3多肽或其功能性片段或变体的所述多核苷酸可以为了在人类细胞中表达而进行密码子优化。
SEQ ID NO.157 FOXP3，UniProtKB登录号Q9BZS1：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP
SEQ ID NO.158 FOXP3，第418位氨基酸突变体：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKREQRPSRCSNPTPGP
SEQ ID NO.159 FOXP3，第422位氨基酸突变体：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPARCSNPTPGP
SEQ ID NO.160 FOXP3，第418位氨基酸和第422位氨基酸突变体：MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKREQRPARCSNPTPGP
SEQ ID NO.161 FOXP3，截短的变体：
Figure BDA0003595329260000611
SEQ ID NO.162 FOXP3，说明性的变体：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQVEELSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGPEGRGSLLTCGDVEEN
SEQ ID NO.163 FOXP3，说明性的FOXP3多核苷酸：
ATGCCCAACCCCAGGCCTGGCAAGCCCTCGGCCCCTTCCTTGGCCCTTGGCCCATCCCCAGGAGCCTCGCCCAGCTGGAGGGCTGCACCCAAAGCCTCAGACCTGCTGGGGGCCCGGGGCCCAGGGGGAACCTTCCAGGGCCGAGATCTTCGAGGCGGGGCCCATGCCTCCTCTTCTTCCTTGAACCCCATGCCACCATCGCAGCTGCAGCTGCCCACACTGCCCCTAGTCATGGTGGCACCCTCCGGGGCACGGCTGGGCCCCTTGCCCCACTTACAGGCACTCCTCCAGGACAGGCCACATTTCATGCACCAGCTCTCAACGGTGGATGCCCACGCCCGGACCCCTGTGCTGCAGGTGCACCCCCTGGAGAGCCCAGCCATGATCAGCCTCACACCACCCACCACCGCCACTGGGGTCTTCTCCCTCAAGGCCCGGCCTGGCCTCCCACCTGGGATCAACGTGGCCAGCCTGGAATGGGTGTCCAGGGAGCCGGCACTGCTCTGCACCTTCCCAAATCCCAGTGCACCCAGGAAGGACAGCACCCTTTCGGCTGTGCCCCAGAGCTCCTACCCACTGCTGGCAAATGGTGTCTGCAAGTGGCCCGGATGTGAGAAGGTCTTCGAAGAGCCAGAGGACTTCCTCAAGCACTGCCAGGCGGACCATCTTCTGGATGAGAAGGGCAGGGCACAATGTCTCCTCCAGAGAGAGATGGTACAGTCTCTGGAGCAGCAGCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAGCTGAGTGCCATGCAGGCCCACCTGGCTGGGAAAATGGCACTGACCAAGGCTTCATCTGTGGCATCATCCGACAAGGGCTCCTGCTGCATCGTAGCTGCTGGCAGCCAAGGCCCTGTCGTCCCAGCCTGGTCTGGCCCCCGGGAGGCCCCTGACAGCCTGTTTGCTGTCCGGAGGCACCTGTGGGGTAGCCATGGAAACAGCACATTCCCAGAGTTCCTCCACAACATGGACTACTTCAAGTTCCACAACATGCGACCCCCTTTCACCTACGCCACGCTCATCCGCTGGGCCATCCTGGAGGCTCCAGAGAAGCAGCGGACACTCAATGAGATCTACCACTGGTTCACACGCATGTTTGCCTTCTTCAGAAACCATCCTGCCACCTGGAAGAACGCCATCCGCCACAACCTGAGTCTGCACAAGTGCTTTGTGCGGGTGGAGAGCGAGAAGGGGGCTGTGTGGACCGTGGATGAGCTGGAGTTCCGCAAGAAACGGAGCCAGAGGCCCAGCAGGTGTTCCAACCCTACACCTGGCCCCTGA
SEQ ID NO.164 FOXP3，说明性的FOXP3多核苷酸：
GAATTCGTCGACATGCCCAACCCCAGACCCGGCAAGCCTTCTGCCCCTTCTCTGGCCCTGGGACCATCTCCTGGCGCCTCCCCATCTTGGAGAGCCGCCCCTAAAGCCAGCGATCTGCTGGGAGCTAGAGGCCCTGGCGGCACATTCCAGGGCAGAGATCTGAGAGGCGGAGCCCACGCCTCTAGCAGCAGCCTGAATCCCATGCCCCCTAGCCAGCTGCAGCTGCCTACACTGCCTCTCGTGATGGTGGCCCCTAGCGGAGCTAGACTGGGCCCTCTGCCTCATCTGCAGGCTCTGCTGCAGGACCGGCCCCACTTTATGCACCAGCTGAGCACCGTGGACGCCCACGCCAGAACACCTGTGCTGCAGGTGCACCCCCTGGAAAGCCCTGCCATGATCAGCCTGACCCCTCCAACCACAGCCACCGGCGTGTTCAGCCTGAAGGCCAGACCTGGACTGCCCCCTGGCATCAATGTGGCCAGCCTGGAATGGGTGTCCCGCGAACCTGCCCTGCTGTGCACCTTCCCCAATCCTAGCGCCCCCAGAAAGGACAGCACACTGTCTGCCGTGCCCCAGAGCAGCTATCCCCTGCTGGCTAACGGCGTGTGCAAGTGGCCTGGCTGCGAGAAGGTGTTCGAGGAACCCGAGGACTTCCTGAAGCACTGCCAGGCCGACCATCTGCTGGACGAGAAAGGCAGAGCCCAGTGCCTGCTGCAGCGCGAGATGGTGCAGTCCCTGGAACAGCAGCTGGTGCTGGAAAAAGAAAAGCTGAGCGCCATGCAGGCCCACCTGGCCGGAAAGATGGCCCTGACAAAAGCCAGCAGCGTGGCCAGCTCCGACAAGGGCAGCTGTTGTATCGTGGCCGCTGGCAGCCAGGGACCTGTGGTGCCTGCTTGGAGCGGACCTAGAGAGGCCCCCGATAGCCTGTTTGCCGTGCGGAGACACCTGTGGGGCAGCCACGGCAACTCTACCTTCCCCGAGTTCCTGCACAACATGGACTACTTCAAGTTCCACAACATGAGGCCCCCCTTCACCTACGCCACCCTGATCAGATGGGCCATTCTGGAAGCCCCCGAGAAGCAGCGGACCCTGAACGAGATCTACCACTGGTTTACCCGGATGTTCGCCTTCTTCCGGAACCACCCCGCCACCTGGAAGAACGCCATCCGGCACAATCTGAGCCTGCACAAGTGCTTCGTGCGGGTGGAAAGCGAGAAGGGCGCCGTGTGGACAGTGGACGAGCTGGAATTTCGGAAGAAGCGGTCCCAGAGGCCCAGCCGGTGTAGCAATCCTACACCTGGCCCTGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCC
载体
本发明提供了一种编码本发明所述CAR的载体。所述载体可以包含本发明的多核苷酸，例如编码本发明的CAR并任选地编码另外的多肽(例如FOXP3多肽)的多核苷酸。
载体是一种允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。根据本发明，举例来说，在重组核酸技术中使用的一些载体允许将实体，如核酸片段(例如异源DNA片段，如异源cDNA片段)转移到靶细胞中。载体可以是非病毒性的或病毒性的。重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、mRNA分子(例如体外转录的mRNA)、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。在其最简单的形式中，所述载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
本发明使用的所述载体可以是例如质粒、mRNA或病毒载体，并可以包括用于表达多核苷酸的启动子以及任选地启动子的操纵子。
包含本发明多核苷酸的载体可以用本领域已知的各种技术引入细胞，如转化和转导。本领域已知几种技术，例如用重组病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体)感染；直接注射核酸以及基因枪转化。
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体向靶细胞递送基因的过程。非病毒递送系统可以包括脂质体或两亲性细胞穿透肽，优选与本发明的多核苷酸复合。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪类、脂质介导的转染、压缩的DNA介导的转染、脂质体类(liposome)、免疫脂质体类、lipofectin、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(Nat.Biotechnol.(1996)14:556)及其组合。
多个载体(例如编码本发明的不同的CAR，或编码本发明的一种CAR和另外的多肽)可以用于转导/转染。
制备细胞的方法
可以通过引入编码本文定义的CAR的DNA或RNA，通过许多手段之一(包括用病毒载体转导，或者用DNA或RNA转染)来生成本发明的工程化Treg。
本发明的工程化Treg可以通过向Treg引入(例如通过转导或转染)如本文定义的多核苷酸或载体来制备。或者，本发明的工程化Treg可以通过将本文定义的多核苷酸或载体引入不是Treg的细胞并转变(例如分化或重新编程所述细胞)以具有Treg表型来制备，如下文进一步的描述。所述多核苷酸或载体可以在任何转变之前或之后引入。
适当地，Treg可以来自分离自受试者的样品。所述Treg可以通过任何合适的方法从样品中进一步分离，例如磁分离。
本发明的工程化Treg可以通过包括以下步骤的方法产生：
(i)从受试者中分离含有细胞的样品或提供含有细胞的样品；以及
(ii)用编码本发明CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染所述含有细胞的样品，以提供工程化细胞群。
适当地，可以在所述方法的步骤(ii)之前和/或之后从所述含有细胞的样品中分离、富集和/或生成富含Treg的样品。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行Treg的分离、富集和/或生成，以分离、富集或生成富含Treg的样品。可以在步骤(ii)之后进行分离和/或富集以富集包含本发明的CAR、多核苷酸和/或载体的细胞和/或Treg。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离或富集富含Treg的样品，例如通过FACS和/或磁珠分选。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从所述含有细胞的样品中生成富含Treg的样品，例如通过将编码FOXP3的DNA或RNA引入Tcon细胞，和/或将来自离体分化的诱导型祖细胞或胚胎祖细胞引入至Tcon细胞。
适当地，所述细胞是如本文定义的Treg。
适当地，本发明所述工程化Treg可以通过包括以下步骤的方法生成：
(i)从受试者中分离富含Treg的样品或提供富含Treg的样品；以及
(ii)用编码本发明的CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染所述富含Treg的样品，以提供根据本发明的工程化Treg细胞群。
所述细胞和/或Treg可以在引入编码本文所述的CAR的多核苷酸之前或之后被活化和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理或者同时用抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体处理。
所述细胞和/或Treg也可以在抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体与IL-2组合存在的情况下扩增。适当地，IL-2可以用IL-15替代。可用于Treg扩增方案的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式维甲酸(ATRA)和TGFβ。
如本文所用，“活化”是指细胞或细胞群已被刺激，引起细胞增殖。如本文所用，“扩增”是指细胞或细胞群已被诱导增殖。例如，可以通过计数存在于群体中的细胞数量来测量细胞群的扩增。细胞的表型可以通过本领域已知的方法如流式细胞术来确定。
在所述方法的每个步骤之后，特别是在扩增之后，可以洗涤所述细胞和/或Treg。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过FACS和/或磁珠分选来进一步富集工程化细胞群或Treg群。
生产方法的步骤可以在封闭且无菌的细胞培养系统中进行。
实施例
现将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明并且不意为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1-抗ASGR1 CAR构建体的设计
嵌合抗原受体(CAR)设计为包含：抗原识别结构域，源自已知与ASGR特异性结合的单域抗体(sdAb)；跨膜结构域(TM)，源自CD28(第153至179位氨基酸)；以及包含CD3ζ信号传导结构域和CD28信号传导结构域的胞内信号传导结构域。示例性的构建体如下文和图1所示。
包含：CD8先导、ASGR1 VH抗原识别结构域、CD8α铰链结构域、CD28跨膜、CD28细胞质信号传导结构域、CD3z细胞质信号传导结构域、FP2A结构域、GFP的抗ASGR1 CAR构建体1(SEQ ID NO:151)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRRKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPTRGGGATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
包含：CD8先导、ASGR1 VH抗原识别结构域、带有c-Myc标签的CD28铰链结构域、CD28跨膜、CD28细胞质信号传导结构域、CD3z细胞质信号传导结构域、FP2A结构域、GFP的抗ASGR1 CAR构建体2(SEQ ID NO:152)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSSAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRRKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPTRGGGATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
实施例2-抗ASGR1 CAR-Treg的生成
生成了抗ASGR1 CAR-Treg。将分离的CD4+CD25高CD127-进行分离并用抗CD3/CD28珠子活化。活化两天后，用含有抗ASGR1 CAR和GFP报告基因的慢病毒转导Treg。将转导的和未转导的Treg培养10天，并测量GFP以评估转导效率。图2显示了67.3％的转导的Treg表达GFP(即含有抗ASGR1 CAR构建体)。
实施例3-ASGR1在HepG2细胞系上表达的验证
HepG2细胞是一种适合研究极化人肝细胞的体外模型系统。通过FACS证实ASGR1在HepG2中表达，并与K562细胞(一种永生化的人骨髓性白血病细胞系)进行比较。图3显示了在HepG2细胞中ASGR1高表达。HepG2细胞将在以下实验中用作CAR-Treg靶细胞
实施例4-抗ASGR1 CAR-Treg的抗原特异性的评估
我们评估了用表达ASGR1的细胞系HepG2培养后Treg的活化和增殖，并证实只有表达抗ASGR1 CAR的Treg在响应ASGR1刺激时会上调CD69。
图4显示了在仅存在培养基的情况下没有观察到CD69的上调。与HepG2细胞培养后，只有GFP+转导的Treg(但不是GPF阴性的转导细胞或未转导细胞)上调CD69。相反，当用非特异性抗CD3/CD28珠子刺激培养时，所有细胞都上调了CD69。
实施例5-抗ASGR1 CAR-Treg的抗原特异性抑制功能的评估
为了评估抗ASGR1 CARTreg以抗原特异性方式抑制活化的效应CD4+CD25-T细胞增殖的能力，在HepG2细胞的存在下，将预活化的CD4+CD25-效应T细胞与抗ASGR1 CAR Treg或未转导的Treg共培养。
Teff预活化的条件如下：活化CD4+CD25-T细胞；aCD3/CD28珠子1:10；14小时。抑制试验的条件如下：培养3天；100,000个Teff；30,000个HepG2；未转导的Treg与抗ASGR1 CAR-Treg相比较。
抑制试验(图5和图6)显示了抗ASGR1 CAR-Treg对用增殖染料染色并用抗CD3/CD28珠子预活化的效应T细胞的增殖能力的影响。在响应HepG2刺激下，抗ASGR1 CARTreg能够以比未转导的Treg更低的Treg与T效应的比率来有效地抑制常规T细胞增殖。
实施例6-抗HLA.A2 IL2RCAR-Treg的生成
在实施例6-13中，使用HLA.A2-CAR构建体证明了包含STAT5结合基序和JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序(并任选地包含JAK3-结合基序和/或不包含STAT3结合基序)的胞内结构域的功效。尽管例举的抗原结合结构域靶向HLA.A2，但胞内结构域被认为是广泛适用的，例如适用于包含抗原结合结构域的CAR构建体，其靶向肝脏特异性抗原，例如ASGR。
将CD4+CD25高CD127低细胞分离并用抗CD3/CD28珠子活化。活化三天后，用含有HLA.A2-CAR构建体(图7)和GFP报告基因的慢病毒转导Treg。多克隆活化后总Treg的细胞扩增显示未转导或转导的Treg之间没有显著差异(图8)。
实施例7-抗HLA.A2 IL2R构建体的转导效率随着时间推移的量化
在细胞活化后的不同时间点，对未转导的Treg和用CAR构建体转导的Treg进行GFP表达分析。
分析GFP+细胞的频率以评估不同构建体在Treg扩增期的转导效率和表达持久性。含有dCAR、CD28z、构建体1、构建体2和构建体3的Treg在转导后显示出相似的表达频率。在多克隆细胞扩增期间，整个Treg中GFP+细胞的百分比保持不变(图9)。
实施例8-抗HLA.A2 IL2RCAR构建体在转导的Treg上的细胞表面表达的量化
通过PE偶联的HLA-A*0201/CINGVCWTVdextramer(Immudex公司，哥本哈根，丹麦)分析CAR构建体在未转导的Treg和转导的Treg上的膜表达。所有构建体之间，在Treg细胞表面(HLA-A2 dextramer+)表达CAR蛋白的频率相似(图10)。
实施例9-多克隆细胞扩增后CARTreg的表型特征
在抗CD3/CD28活化珠子和IL-2的存在下，对Treg进行15天的培养和扩增。通过FACS分析未转导的Treg和转导的Treg上的Treg相关标志物FOXP3、HELIOS、CTLA4和TIGIT，以评估培养第15天的表型谱系稳定性。
未转导的和CAR转导的在多克隆扩增后显示出与Treg谱系和功能相关的蛋白质相似的表达水平(图11)。
实施例10-抗HLA.A2 IL2RCARTreg的抗原特异性的评估
在不同刺激的存在下，将未转导的Treg和转导的Treg培养18小时。分析CD69和CD137活化标志物以评估特异性和非特异性的细胞活化。
基于T细胞活化标志物的表达，用CD28z、构建体1、构建体2和构建体3CAR转导的Treg对HLA-A2分子显示出相似的特异性。CD69和CD137的表达在未活化的细胞或与表达HLA-A1的细胞培养后没有增加。由于缺乏信号传导胞内结构域，dCAR构建体没有表现出活化(图12)。
实施例11-STAT5磷酸化分析作为IL2R CAR信号传导的指标
将转导的CAR Treg在不含IL2的培养基中静置过夜。在仅培养基、1000IU/ml IL-2或基于HLA.A2-Ig的人工APC(按照DOI:10.3791/2801描述的方案制备)存在下培养10分钟和120分钟后，通过FACS分析评估Treg的STAT5磷酸化。
IL2R胞内结构域整合到CAR构建体中显示了HLA-A2分子活化CAR后STAT5的有效磷酸化。与HLA-A2珠子培养后，在没有IL2R胞内结构域的CAR-Treg上没有检测到pSTAT5的显著增加(图13)。
实施例12-在没有IL-2的情况下对非特异性活化和HLA.A2特异性活化后Treg存活的评估
在不存在IL-2的情况下，将不同构建体的CAR转导的Treg与抗CD3/28活化珠子和K562.A2表达细胞进行培养。活化后7天通过FACS分析评估细胞存活。
与参考CD28z相比，表达含有IL2R胞内结构域的CAR构建体的Treg在与表达HLA-A2的细胞进行细胞培养后显示出增加的细胞活力。在Treg多克隆活化后，没有观察到这种差异，这表明该效果取决于CAR信号传导(图14)。
实施例13-Treg抑制效力测试：通过分析B细胞上共刺激分子的调节来评估Treg的免疫调节功能
对与Treg共培养后的B细胞的CD80和CD86的表达进行分析，以评估Treg降低抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。
表达CD28z、构建体1和构建体2CAR的Treg与未转导的Treg或表达dCAR的Treg相比，显示出增加的抑制功能。B细胞上的CD80和CD86的表达只有在与通过CAR分子发出信号的Treg培养后才会被下调(图15)。
实施例14-CAR Treg对肝细胞中生产白蛋白的影响的评估
方法：
在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％ITS、10nM Hepes、100U/L青霉素/链霉素、含/不含50IU/mL人重组白细胞介素-2(Aldesleukin，诺华)的Williams E培养基(Gibco)中，将冷冻保存的成人原代肝细胞(龙沙)以225K/cm2的细胞密度(在96孔板半区或transwell板中为36K/孔)接种在包被有I型胶原蛋白(源自大鼠尾巴)的板上。一旦肝细胞附着24小时后，在存在或存在CD4+CD25-效应T细胞的情况下，将CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞添加到培养物中。每48小时更换一次上清液并冷冻保存用于分析。使用HTS Transwell膜(孔径0.4um；康宁)进行间接共培养。对于一些实验，调节性T细胞和效应T细胞在抗CD3和抗CD28珠子的存在下被预活化。对于其他实验，未预活化的调节性T细胞在添加到培养板前用抗ASGPR1 CAR(如实施例1所述的构建体1)进行慢病毒转导。在一些实验中，用从含有扩增调节性T细胞的培养物中获得的条件培养基培养肝细胞。使用人白蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA-Bethyl Laboratories)测量培养基中的白蛋白浓度，这是肝细胞功能和活力的标志物。对于统计分析，我们使用Dunn的组间后测进行了Kruskal-Wallis非参数检验。星号表示P<0.05。仅显示了与单独的肝细胞的成对比较并且p<0.05。所示的图是3个独立实验的代表。
结果：为了确定抗ASGPR CAR Treg在响应抗原刺激时对肝细胞介导营养和细胞保护作用的能力，我们建立了共培养实验，其中将原代人肝细胞与不同组合的Treg和/或效应T细胞培养长达7天。为了评估对肝细胞表型稳定性和功能的影响，我们量化了与肝细胞合成功能、活力和谱系稳定性相关的上清液中白蛋白的产生。将先前在抗CD3/抗CD28珠子存在下活化的Treg添加到培养的原代肝细胞中，导致白蛋白水平增加。这种作用在共培养3天后很显著，但在第7天不再显著，这反映了Treg需要接受反复的抗原刺激，以对肝细胞发挥营养作用(图16)。Treg的有益作用不需要细胞间接触，因为它可以通过用从活化的Treg获得的条件培养基培养肝细胞来复制(图17)。值得注意的是，与通常需要每周重新活化的预活化Treg相比，将条件培养基每48小时重复添加到培养板中诱导了更持久的有益效果。与Treg相反，效应T细胞不能增加白蛋白水平(图17)。
使用静息的(非预活化的)Treg产生了较弱的非显著效果(图18)。只有当静息的Treg表达能够识别培养的肝细胞上的ASGPR并诱导Treg活化的抗ASGPR CAR时，才能达到显著的效果(图18)。
这些结果表明调节性T细胞(Treg)能够为肝细胞提供营养性细胞保护作用。这需要Treg活化并且可以在没有细胞间接触的情况下发生。Treg的活化可以通过用常规T细胞刺激剂(如抗CD3/抗CD28珠子)刺激它们、或通过在识别肝细胞特异性抗原(如ASGPR)后用能够诱导T细胞活化的CAR转导它们来实现。
上述说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所公开的本发明的方法、细胞、组合物以及用途的各种修改和变化对技术人员来说将是显而易见的。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行了披露，但应该理解的是，所要求保护的本发明不应该被不适当地限制在这些具体的实施方案中。实际上，对本领域技术人员来说显而易见的用于实施本发明的公开模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 伦敦国王学院
<120> 工程化调节性T细胞
<130> FSP1V221188ZX
<150> GB1912515.2
<151> 2019-08-30
<160> 175
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser
1 5 10 15
Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu
20 25 30
Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser
50 55 60
Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe
65 70 75 80
Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly
85 90 95
Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln
100 105 110
Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys
115 120 125
Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu
130 135 140
Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu
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180 185 190
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Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala
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<211> 311
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn
1 5 10 15
Asp His Pro Phe His Gln Gly Glu Gly Pro Gly Thr Arg Arg Leu Asn
20 25 30
Pro Arg Arg Gly Asn Pro Phe Leu Lys Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro
35 40 45
Leu Ala Gln Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu
50 55 60
Ser Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln
65 70 75 80
Ser Glu Gly His Arg Gly Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu
85 90 95
Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln
100 105 110
Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu
115 120 125
Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp
130 135 140
Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val
145 150 155 160
Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys
165 170 175
Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser
180 185 190
His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu
195 200 205
Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile
210 215 220
Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser
225 230 235 240
Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr
245 250 255
Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu
260 265 270
Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn
275 280 285
Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg
290 295 300
Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala
305 310
<210> 4
<211> 287
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn
1 5 10 15
Asp His Pro Phe His Gln Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro Leu Ala Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu Ser Phe Asn
35 40 45
Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln Ser Ala Gln
50 55 60
Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser
65 70 75 80
Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser
85 90 95
Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln
100 105 110
Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His
115 120 125
Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His
130 135 140
Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His
145 150 155 160
Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu
165 170 175
Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn
180 185 190
Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn
195 200 205
Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp
210 215 220
Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro
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Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu
245 250 255
Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr
260 265 270
Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala
275 280 285
<210> 5
<211> 292
<212> PRT
<213> 人类
<400> 5
Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn
1 5 10 15
Asp His Pro Phe His Gln Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro Leu Ala Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu Ser Phe Asn
35 40 45
Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln Ser Glu Gly
50 55 60
His Arg Gly Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala
65 70 75 80
Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser
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Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys
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Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln
130 135 140
Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val
145 150 155 160
Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly
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Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His
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260 265 270
Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr
275 280 285
Gly Glu Val Ala
290
<210> 6
<211> 306
<212> PRT
<213> 人类
<400> 6
Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn
1 5 10 15
Asp His Pro Phe His Gln Gly Glu Gly Pro Gly Thr Arg Arg Leu Asn
20 25 30
Pro Arg Arg Gly Asn Pro Phe Leu Lys Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro
35 40 45
Leu Ala Gln Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu
50 55 60
Ser Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln
65 70 75 80
Ser Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala Phe Ser
85 90 95
Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser Thr His
100 105 110
Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys Leu Glu
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Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu Phe His
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Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln Met Glu
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260 265 270
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Val Ala
305
<210> 7
<211> 284
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
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1 5 10 15
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Arg Leu Cys Ser Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser
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Leu Arg Glu Asp Leu Leu Ala Leu Arg Gln Asn Phe Ser Asn Leu Thr
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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245 250 255
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Glu Ile Leu Ser Asp Gly His Trp Asn Asp Asn Phe Cys Gln Gln Val
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gly
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Gly
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Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Asn Thr Phe Thr Leu Asp Tyr
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Gln Ala Ser Lys Asn Ile Gly Glu Arg Leu Val
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Asp Ala Ser Arg Phe Arg Gln Pro Phe Asp Tyr
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<212> PRT
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<220>
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Pro Lys Tyr Gly Met Ala
1 5
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
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His Arg Gly Thr Ala His Ser Ser Phe Phe Asp Tyr
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<220>
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Ser Ala Asn Gly Met His
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<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
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Val Ile Ser Ala Thr Gly Asp Gln
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
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Ala Asp Tyr Ser Met Tyr
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Asp Ile Ser Pro Ser Gly Ser Met
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Gly Leu Pro Gly Gln Asn Met His Val Gly Phe Asp Tyr
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Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp Leu Leu
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Gly Gln Tyr Ala Glu Glu Pro Phe Thr
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Arg Asp Ala Ser Leu Leu Gln Ser
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Gly Gln Ser Trp Met Arg Pro Tyr Thr
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Arg Ala Ser Ser Tyr Ile Gly Gly Glu Leu Trp
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Ser Gly Thr Ser Gly Leu Gln Ser
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Gly Gln Ala Ala Lys Arg Pro Phe Thr
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<220>
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<400> 71
Arg Ala Ser Ser Trp Ile Asn Ser Asp Leu Val
1 5 10
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<220>
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<400> 72
Ala Gly Gly Ser Leu Leu Gln Ser
1 5
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<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 73
Gly Gln Tyr Leu Glu Glu Pro Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 75
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Pro Pro Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Val Met Leu Arg Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Ser Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Asn Thr Phe Thr Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ala Ala
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Ser Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Asn Thr Phe Thr Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gly Pro Gly Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ala Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Gly Pro Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gly Pro Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asp Ile Gly His Ala
20 25 30
Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Gly Gly Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser His Val Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Lys Asn Ile Gly Glu Arg
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gly Phe Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Tyr Arg Trp Val Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 83
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Pro Met His Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Ala Leu Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Pro Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Thr Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ala Ser Arg Phe Arg Gln Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 85
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Lys Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Gly Ala Thr Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Arg Gly Thr Ala His Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 86
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Ala Thr Gly Asp Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Tyr Asp Arg Arg His Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Pro Ser Gly Ser Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Met His Val Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Met Ser Ile Asp Glu Ser
20 25 30
Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Gly Gly Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ala Ala Arg Arg Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Tyr Ile Gly Asn Glu
20 25 30
Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Arg Arg Gly Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 91
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Asn Ile Gly Arg Ser
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ala Gly Gly Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Val Lys Ile Gly Glu Arg
20 25 30
Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Asp Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Tyr Ile Gly Gly Glu
20 25 30
Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 94
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Trp Ile Asn Ser Asp
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ala Gly Gly Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Glu Glu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg
100 105
<210> 95
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 95
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 96
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 96
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 97
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 98
Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn
1 5 10 15
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
20 25 30
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 99
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 99
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 100
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 100
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 101
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 101
Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn
1 5 10 15
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
20 25 30
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
35 40 45
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
50 55 60
Phe Ile Ile Phe Trp Val
65 70
<210> 102
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 102
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val
35 40 45
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
50 55 60
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
65 70
<210> 103
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 103
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 104
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 104
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 105
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 105
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 106
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 106
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 107
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 107
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 108
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 108
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 109
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 109
Thr Tyr Thr Tyr Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Asp Glu Ala Gly Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Lys Ile Cys Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly
50 55 60
Tyr Pro Glu Thr Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp
65 70 75 80
Asp Gln Leu Pro Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu
85 90 95
Ser Pro Glu Ser Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Gln Leu Tyr Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys
115 120 125
Glu Phe Val Arg Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val
130 135 140
Glu Val Glu Ile Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys
145 150 155 160
Arg Trp Arg Gln Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Arg Met Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg
180 185 190
Leu Gln Arg Gly Pro
195
<210> 110
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 110
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
85 90 95
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
100 105 110
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
115 120 125
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
130 135 140
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 111
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 111
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 112
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 112
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
20 25 30
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
35 40 45
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
65 70 75 80
Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
85 90 95
Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
100 105 110
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
115 120 125
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
165 170 175
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
180 185 190
Gln Asn Gln
195
<210> 113
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 113
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
20 25 30
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
35 40 45
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
Pro Gln Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala
65 70 75 80
Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
85 90
<210> 114
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 114
Lys Leu Ser Pro Arg Val Lys Arg Ile Phe Tyr Gln Asn Val Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ala Met Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Ser Val His Asn Gly Asn Phe
20 25 30
Gln Thr Trp Met Gly Ala His Gly Ala Gly Val Leu Leu Ser Gln Asp
35 40 45
Cys Ala Gly Thr Pro Gln Gly Ala Leu Glu Pro Cys Val Gln Glu Ala
50 55 60
Thr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Pro Ala Arg Pro Trp Lys Ser Val Ala
65 70 75 80
Leu Glu Glu Glu Gln Glu Gly Pro Gly Thr Arg Leu Pro Gly Asn Leu
85 90 95
Ser Ser Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Cys Thr Glu Trp Arg Val Gln
100 105 110
Thr Leu Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Thr Ser Leu Thr
115 120 125
Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ser Glu Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Cys Ala Leu Gly Cys Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Trp His Leu Ser Ala Leu Pro Gly Asn Thr Gln Ser Ser Gly Pro Ile
165 170 175
Pro Ala Leu Ala Cys Gly Leu Ser Cys Asp His Gln Gly Leu Glu Thr
180 185 190
Gln Gln Gly Val Ala Trp Val Leu Ala Gly His Cys Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Leu His Glu Asp Leu Gln Gly Met Leu Leu Pro Ser Val Leu Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Ser Trp Thr Phe
225 230
<210> 115
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 115
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
1 5 10 15
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
35 40 45
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
50 55 60
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
85 90 95
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
100 105 110
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
115 120 125
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
130 135 140
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
145 150 155 160
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
165 170 175
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
195 200 205
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
210 215 220
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
245 250 255
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
260 265 270
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
275 280 285
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
290 295 300
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
325 330 335
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
340 345 350
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
355 360 365
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
370 375 380
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly
385 390 395 400
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
420 425 430
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
435 440 445
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
450 455 460
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
465 470 475 480
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
485 490 495
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
500 505 510
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
515 520 525
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
530 535 540
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
545 550 555 560
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
565
<210> 116
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 116
Arg Phe Cys Gly Ile Tyr Gly Tyr Arg Leu Arg Arg Lys Trp Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ile Pro Asn Pro Ser Lys Ser His Leu Phe Gln Asn Gly Ser Ala
20 25 30
Glu Leu Trp Pro Pro Gly Ser Met Ser Ala Phe Thr Ser Gly Ser Pro
35 40 45
Pro His Gln Gly Pro Trp Gly Ser Arg Phe Pro Glu Leu Glu Gly Val
50 55 60
Phe Pro Val Gly Phe Gly Asp Ser Glu Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu
65 70 75 80
Asp Pro Lys His Val Cys Asp Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro
85 90 95
Ala Ala Ser Asp Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Ser Pro Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Ala Ala Ser His Thr Pro Glu Lys Gln Ala Ser Ser Phe Asp
115 120 125
Phe Asn Gly Pro Tyr Leu Gly Pro Pro His Ser Arg Ser Leu Pro Asp
130 135 140
Ile Leu Gly Gln Pro Glu Pro Pro Gln Glu Gly Gly Ser Gln Lys Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Gly Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Gly Gly Gln
165 170 175
Val Gln Leu Val Pro Leu Ala Gln Ala Met Gly Pro Gly Gln Ala Val
180 185 190
Glu Val Glu Arg Arg Pro Ser Gln Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ser Leu
195 200 205
Glu Ser Gly Gly Gly Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Gly
210 215 220
Gly Gln Asp Gln Lys Asp Ser Pro Val Ala Ile Pro Met Ser Ser Gly
225 230 235 240
Asp Thr Glu Asp Pro Gly Val Ala Ser Gly Tyr Val Ser Ser Ala Asp
245 250 255
Leu Val Phe Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ser Ser Val Ser Leu Val Pro
260 265 270
Ser Leu Gly Leu Pro Ser Asp Gln Thr Pro Ser Leu Cys Pro Gly Leu
275 280 285
Ala Ser Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Lys Ser Gly Phe Glu
290 295 300
Gly Tyr Val Glu Leu Pro Pro Ile Glu Gly Arg Ser Pro Arg Ser Pro
305 310 315 320
Arg Asn Asn Pro Val Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Val Leu Asn Pro
325 330 335
Gly Glu Arg Pro Ala Asp Val Ser Pro Thr Ser Pro Gln Pro Glu Gly
340 345 350
Leu Leu Val Leu Gln Gln Val Gly Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu
355 360 365
Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Arg Ser Lys Pro Ser Ser Pro Gly Pro
370 375 380
Gly Pro Glu Ile Lys Asn Leu Asp Gln Ala Phe Gln Val Lys Lys Pro
385 390 395 400
Pro Gly Gln Ala Val Pro Gln Val Pro Val Ile Gln Leu Phe Lys Ala
405 410 415
Leu Lys Gln Gln Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Glu Val Asn Lys
420 425 430
Pro Gly Glu Val Cys
435
<210> 117
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 117
Arg His Glu Arg Ile Lys Lys Thr Ser Phe Ser Thr Thr Thr Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Ile Lys Val Leu Val Val Tyr Pro Ser Glu Ile Cys Phe His
20 25 30
His Thr Ile Cys Tyr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Asn His Cys Arg Ser
35 40 45
Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp Gln Lys Lys Lys Ile Ala Glu Met Gly
50 55 60
Pro Val Gln Trp Leu Ala Thr Gln Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Val
65 70 75 80
Phe Leu Leu Ser Asn Asp Val Asn Ser Val Cys Asp Gly Thr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Glu Gly Ser Pro Ser Glu Asn Ser Gln Asp Leu Phe Pro Leu
100 105 110
Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser Asp Leu Arg Ser Gln Ile His Leu His
115 120 125
Lys Tyr Val Val Val Tyr Phe Arg Glu Ile Asp Thr Lys Asp Asp Tyr
130 135 140
Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro Lys Tyr His Leu Met Lys Asp Ala Thr
145 150 155 160
Ala Phe Cys Ala Glu Leu Leu His Val Lys Gln Gln Val Ser Ala Gly
165 170 175
Lys Arg Ser Gln Ala Cys His Asp Gly Cys Cys Ser Leu
180 185
<210> 118
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> F或L
<400> 118
Tyr Xaa Xaa Xaa
1
<210> 119
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 119
Tyr Cys Thr Phe
1
<210> 120
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 120
Tyr Phe Phe Phe
1
<210> 121
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 121
Tyr Leu Ser Leu
1
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 122
Tyr Leu Ser Leu Gln
1 5
<210> 123
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 123
Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro
20 25 30
Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser
35 40 45
Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys
50 55
<210> 124
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 124
Asn Pro Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg Ala Leu Asp Phe Ser
1 5 10 15
Gly His Thr His Pro Val Ala Thr Phe Gln Pro Ser Arg Pro Glu Ser
20 25 30
Val Asn Asp Leu Phe Leu Cys Pro Gln Lys Glu Leu Thr
35 40 45
<210> 125
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 125
Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu Asn Phe His
1 5 10 15
Asn Phe Leu Ala Trp Pro Phe Pro Asn Leu Pro Pro Leu Glu Ala Met
20 25 30
Asp Met Val Glu Val Ile Tyr Ile Asn Arg
35 40
<210> 126
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 126
Pro Leu Lys Glu Lys Ser Ile Ile Leu Pro Lys Ser Leu Ile Ser Val
1 5 10 15
Val Arg Ser Ala Thr Leu Glu Thr Lys Pro Glu Ser Lys Tyr Val Ser
20 25 30
Leu Ile Thr Ser Tyr Gln Pro Phe Ser Leu
35 40
<210> 127
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 127
Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe Lys Lys Pro Ser
1 5 10 15
Pro Phe Ile Phe Ile Ser Gln Arg Pro Ser Pro Glu Thr Gln Asp Thr
20 25 30
Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys
35 40
<210> 128
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 128
Tyr Ile His Val Gly Lys Glu Lys His Pro Ala Asn Leu Ile Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Gly Asn Glu Phe Asp Lys Arg Phe Phe Val Pro Ala Glu Lys Ile
20 25 30
Val Ile Asn Phe Ile Thr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Ser
35 40 45
<210> 129
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 129
Arg Tyr Val Thr Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln
1 5 10 15
Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu
20 25 30
Ile Pro Val Phe Asp Leu Ser Gly Pro
35 40
<210> 130
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 130
Asn Tyr Val Phe Phe Pro Ser Leu Lys Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu
1 5 10 15
Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu
20 25 30
Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile Glu Asn
35 40
<210> 131
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 131
Tyr Trp Phe His Thr Pro Pro Ser Ile Pro Leu Gln Ile Glu Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Asp Pro Thr Gln Pro Ile Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Ser
20 25 30
Ser Pro Lys Asp Asp Val Trp Asp Ser Val Ser Ile Ile Ser Phe Pro
35 40 45
Glu
<210> 132
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 132
Tyr Ala Phe Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly His Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu
20 25 30
Ser Asp Glu Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp
35 40 45
Ser Glu Ser
50
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<400> 133
Tyr Xaa Xaa Gln
1
<210> 134
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 134
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 135
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 135
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
85 90
<210> 136
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 136
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser
65 70 75 80
Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser
85 90 95
Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met
100 105 110
Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro
115 120 125
Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro
130 135 140
Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala
145 150 155 160
Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala
180 185 190
Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200 205
<210> 137
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 137
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile
50
<210> 138
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 138
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 139
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 139
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile
35 40 45
Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn
50 55 60
Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Asn Cys Arg
85 90 95
Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp
100 105 110
Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val
115 120 125
Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly
130 135 140
Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys
145 150 155 160
Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln
165 170 175
Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Arg Val Lys Phe Ser
180 185 190
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
195 200 205
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
210 215 220
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
225 230 235 240
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
245 250 255
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
260 265 270
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
275 280 285
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
290 295
<210> 140
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 140
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile
35 40 45
Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn
50 55 60
Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Lys Lys Arg
85 90 95
Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu
100 105 110
Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn
115 120 125
Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln
130 135 140
Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln
145 150 155 160
Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr
165 170 175
Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
180 185 190
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
195 200 205
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
210 215 220
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
245 250 255
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
260 265 270
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
275 280 285
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
290 295 300
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
305 310 315
<210> 141
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 141
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 142
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 142
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 143
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 144
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 144
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 145
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 145
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 146
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 146
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 147
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<400> 147
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 148
Arg Arg Lys Arg
1
<210> 149
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 149
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Lys Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val
180 185 190
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
195 200 205
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
210 215 220
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
225 230 235 240
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
245 250 255
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
260 265 270
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
275 280 285
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
290 295 300
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
305 310 315 320
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
325 330 335
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
340 345 350
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 150
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 150
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Lys Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
130 135 140
Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn
145 150 155 160
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
165 170 175
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
180 185 190
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
195 200 205
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
210 215 220
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
225 230 235 240
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
245 250 255
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
260 265 270
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
275 280 285
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
290 295 300
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
305 310 315 320
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
325 330 335
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 151
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 151
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Lys Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val
180 185 190
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
195 200 205
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
210 215 220
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
225 230 235 240
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
245 250 255
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
260 265 270
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
275 280 285
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
290 295 300
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
305 310 315 320
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
325 330 335
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
340 345 350
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Arg
355 360 365
Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
370 375 380
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Gly Gly Gly Ala Thr Met
385 390 395 400
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
405 410 415
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
420 425 430
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
435 440 445
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
450 455 460
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
465 470 475 480
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
485 490 495
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
500 505 510
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515 520 525
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
530 535 540
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
545 550 555 560
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
565 570 575
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
580 585 590
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser
595 600 605
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
610 615 620
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
625 630 635
<210> 152
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 152
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Lys Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
130 135 140
Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn
145 150 155 160
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
165 170 175
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
180 185 190
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
195 200 205
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
210 215 220
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
225 230 235 240
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
245 250 255
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
260 265 270
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
275 280 285
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
290 295 300
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
305 310 315 320
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
325 330 335
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg
355 360 365
Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
370 375 380
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Gly Gly Gly Ala Thr
385 390 395 400
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
405 410 415
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
420 425 430
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
435 440 445
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
450 455 460
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
465 470 475 480
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
485 490 495
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
500 505 510
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
515 520 525
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
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Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
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580 585 590
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595 600 605
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Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
625 630 635
<210> 153
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 153
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gagaagtatg cgatggcgtg ggtccgccag 180
gccccaggga agggtctgga gtgggtctca cggatttcgg cgaggggtgt gacgacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaacat 360
aagcggcacg agcatactcg ttttgactcc tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 420
agcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 480
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
ctggacttcg cctgtgattt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 600
agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtgc ggagcaagcg gagccggctg 660
ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc cggcggcctg ggcccacccg caagcattac 720
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg 780
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 840
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 900
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 960
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1020
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1080
caggccctgc cccctcgcta a 1101
<210> 154
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 154
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gagaagtatg cgatggcgtg ggtccgccag 180
gccccaggga agggtctgga gtgggtctca cggatttcgg cgaggggtgt gacgacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaacat 360
aagcggcacg agcatactcg ttttgactcc tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 420
agcgcggccg ccatcgaggt ggagcagaag ctgatcagcg aggaggacct gctggacaac 480
gagaagagca acggcaccat catccacgtg aagggcaagc acctgtgccc cagccccctg 540
ttccccggcc ccagcaagcc cttctgggtg ctggtggtgg tgggcggcgt gctggcctgc 600
tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc atcttctggg tgcggagcaa gcggagccgg 660
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccccggcggc ctgggcccac ccgcaagcat 720
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 780
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 840
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 900
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 960
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1020
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1080
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1104
<210> 155
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 155
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gagaagtatg cgatggcgtg ggtccgccag 180
gccccaggga agggtctgga gtgggtctca cggatttcgg cgaggggtgt gacgacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaacat 360
aagcggcacg agcatactcg ttttgactcc tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 420
agcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 480
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
ctggacttcg cctgtgattt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 600
agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtgc ggagcaagcg gagccggctg 660
ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc cggcggcctg ggcccacccg caagcattac 720
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg 780
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 840
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 900
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 960
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1020
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1080
caggccctgc cccctcgcag gagaaaaaga ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 1140
aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctacgc gtggaggtgg cgccaccatg 1200
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 1260
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 1320
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 1380
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 1440
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 1500
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1560
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1620
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1680
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1740
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1800
ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1860
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 1917
<210> 156
<211> 1920
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 156
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gagaagtatg cgatggcgtg ggtccgccag 180
gccccaggga agggtctgga gtgggtctca cggatttcgg cgaggggtgt gacgacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaacat 360
aagcggcacg agcatactcg ttttgactcc tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 420
agcgcggccg ccatcgaggt ggagcagaag ctgatcagcg aggaggacct gctggacaac 480
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tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc atcttctggg tgcggagcaa gcggagccgg 660
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccccggcggc ctgggcccac ccgcaagcat 720
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 780
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 840
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 900
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 960
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1020
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1080
atgcaggccc tgccccctcg caggagaaaa agaggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1140
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta cgcgtggagg tggcgccacc 1200
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 1260
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 1320
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 1380
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 1440
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 1500
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 1560
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 1620
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 1680
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 1740
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 1800
tacctgagca cccagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 1860
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 1920
<210> 157
<211> 431
<212> PRT
<213> 人类
<400> 157
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 158
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 158
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Glu Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 159
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 159
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
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210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Ser Gln Arg Pro Ala Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 160
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 160
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
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Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
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Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
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Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
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Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 161
Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met Pro Pro Ser
1 5 10 15
Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala Pro Ser Gly
20 25 30
Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asp Arg
35 40 45
Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His Ala Arg Thr
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Lys
115 120 125
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165 170 175
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Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His
195 200 205
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Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala
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Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly
340 345 350
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355 360
<210> 162
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 162
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
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115 120 125
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Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
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Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Val Glu Glu Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala
245 250 255
Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys
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Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro
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Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln
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Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val
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Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro
405 410 415
Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu
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Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
435 440
<210> 163
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 163
atgcccaacc ccaggcctgg caagccctcg gccccttcct tggcccttgg cccatcccca 60
ggagcctcgc ccagctggag ggctgcaccc aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc 120
ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc 180
ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag ctgcccacac tgcccctagt catggtggca 240
ccctccgggg cacggctggg ccccttgccc cacttacagg cactcctcca ggacaggcca 300
catttcatgc accagctctc aacggtggat gcccacgccc ggacccctgt gctgcaggtg 360
caccccctgg agagcccagc catgatcagc ctcacaccac ccaccaccgc cactggggtc 420
ttctccctca aggcccggcc tggcctccca cctgggatca acgtggccag cctggaatgg 480
gtgtccaggg agccggcact gctctgcacc ttcccaaatc ccagtgcacc caggaaggac 540
agcacccttt cggctgtgcc ccagagctcc tacccactgc tggcaaatgg tgtctgcaag 600
tggcccggat gtgagaaggt cttcgaagag ccagaggact tcctcaagca ctgccaggcg 660
gaccatcttc tggatgagaa gggcagggca caatgtctcc tccagagaga gatggtacag 720
tctctggagc agcagctggt gctggagaag gagaagctga gtgccatgca ggcccacctg 780
gctgggaaaa tggcactgac caaggcttca tctgtggcat catccgacaa gggctcctgc 840
tgcatcgtag ctgctggcag ccaaggccct gtcgtcccag cctggtctgg cccccgggag 900
gcccctgaca gcctgtttgc tgtccggagg cacctgtggg gtagccatgg aaacagcaca 960
ttcccagagt tcctccacaa catggactac ttcaagttcc acaacatgcg accccctttc 1020
acctacgcca cgctcatccg ctgggccatc ctggaggctc cagagaagca gcggacactc 1080
aatgagatct accactggtt cacacgcatg tttgccttct tcagaaacca tcctgccacc 1140
tggaagaacg ccatccgcca caacctgagt ctgcacaagt gctttgtgcg ggtggagagc 1200
gagaaggggg ctgtgtggac cgtggatgag ctggagttcc gcaagaaacg gagccagagg 1260
cccagcaggt gttccaaccc tacacctggc ccctga 1296
<210> 164
<211> 1352
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 164
gaattcgtcg acatgcccaa ccccagaccc ggcaagcctt ctgccccttc tctggccctg 60
ggaccatctc ctggcgcctc cccatcttgg agagccgccc ctaaagccag cgatctgctg 120
ggagctagag gccctggcgg cacattccag ggcagagatc tgagaggcgg agcccacgcc 180
tctagcagca gcctgaatcc catgccccct agccagctgc agctgcctac actgcctctc 240
gtgatggtgg cccctagcgg agctagactg ggccctctgc ctcatctgca ggctctgctg 300
caggaccggc cccactttat gcaccagctg agcaccgtgg acgcccacgc cagaacacct 360
gtgctgcagg tgcaccccct ggaaagccct gccatgatca gcctgacccc tccaaccaca 420
gccaccggcg tgttcagcct gaaggccaga cctggactgc cccctggcat caatgtggcc 480
agcctggaat gggtgtcccg cgaacctgcc ctgctgtgca ccttccccaa tcctagcgcc 540
cccagaaagg acagcacact gtctgccgtg ccccagagca gctatcccct gctggctaac 600
ggcgtgtgca agtggcctgg ctgcgagaag gtgttcgagg aacccgagga cttcctgaag 660
cactgccagg ccgaccatct gctggacgag aaaggcagag cccagtgcct gctgcagcgc 720
gagatggtgc agtccctgga acagcagctg gtgctggaaa aagaaaagct gagcgccatg 780
caggcccacc tggccggaaa gatggccctg acaaaagcca gcagcgtggc cagctccgac 840
aagggcagct gttgtatcgt ggccgctggc agccagggac ctgtggtgcc tgcttggagc 900
ggacctagag aggcccccga tagcctgttt gccgtgcgga gacacctgtg gggcagccac 960
ggcaactcta ccttccccga gttcctgcac aacatggact acttcaagtt ccacaacatg 1020
aggcccccct tcacctacgc caccctgatc agatgggcca ttctggaagc ccccgagaag 1080
cagcggaccc tgaacgagat ctaccactgg tttacccgga tgttcgcctt cttccggaac 1140
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<210> 165
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 165
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 166
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 166
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
35 40 45
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
50 55 60
<210> 167
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 167
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Lys Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165 170 175
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly
180 185 190
Arg Trp Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Gly Pro Gly Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
225 230 235 240
Gln Pro Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ala Trp
245 250 255
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala
260 265 270
Ala Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp
275 280 285
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
290 295 300
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
305 310 315 320
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
325 330 335
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
340 345 350
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
355 360 365
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
370 375 380
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
385 390 395 400
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 168
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 168
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Leu Gln Leu Leu Glu Phe Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Arg Tyr Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Pro Pro Gly Ser Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Trp Val Met Leu Arg Gly Arg Phe Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg
180 185 190
Trp Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys His Leu
195 200 205
Ile Gly Pro Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Gln Leu Pro
245 250 255
Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
260 265 270
Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn
275 280 285
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
290 295 300
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
305 310 315 320
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325 330 335
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
340 345 350
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355 360 365
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
450 455 460
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
465 470 475 480
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 169
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 169
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Glu Asp Tyr Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Ser Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Asn Thr
115 120 125
Phe Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
165 170 175
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
180 185 190
Ala Ile Gly Arg Trp Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Gly Pro Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro
210 215 220
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Gly Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala
245 250 255
Tyr Ser Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
275 280 285
Leu Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
290 295 300
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
305 310 315 320
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
325 330 335
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
340 345 350
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
355 360 365
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
370 375 380
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405 410 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420 425 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450 455 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465 470 475 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Arg
<210> 170
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 170
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gagaagtatg cgatggcgtg ggtccgccag 180
gccccaggga agggtctgga gtgggtctca cggatttcgg cgaggggtgt gacgacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgctgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaacat 360
aagcggcacg agcatactcg ttttgactcc tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 420
agcctggtga ccgtgagcag cggcggcgga ggcagcggtg gcggaggcag cggcggaggc 480
ggtagcgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 540
gtcaccatta cttgccgggc aagtcaggcg attgggcggt ggttattgtg gtatcagcag 600
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc ggtccgggtt cccggttgcg aagtggggtc 660
ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtcta 720
caacctgaag attttgttac gtactactgt caacaggcgt atgcctggcc tccgacgttc 780
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg gcggccgcca tcgaggtgga gcagaagctg 840
atcagcgagg aggacctgct ggacaacgag aagagcaacg gcaccatcat ccacgtgaag 900
ggcaagcacc tgtgccccag ccccctgttc cccggcccca gcaagccctt ctgggtgctg 960
gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc 1020
ttctgggtgc ggagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 1080
cggcggcctg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1140
gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1200
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1260
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1320
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1380
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1440
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1488
<210> 171
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 171
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggagttgc agctgttgga gtttggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgta caacctccgg attcaccttt tcgaggtata ctatgggttg ggtccgccag 180
gctccaggga agggtctaga gtgggtctca gccattggcc cgcccgggtc gaacacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg tcggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgccgag gacaccgcgg tatattactg tgcgaaatgg 360
gtgatgttgc gggggcgctt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 420
ctggtgaccg tgagcagcgg cggcggaggc agcggtggcg gaggcagcgg cggaggcggt 480
agcgacatcc agatgaccca gtccccatcc tccctgtctg catctgtagg agaccgtgtc 540
accattactt gccgggcaag tcaggcgatt gggcggtggt tattgtggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag cccctaagca cctgatcggt ccgggttccc ggttgcaaag tggggtccca 660
tcacgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 720
cctgaagatt ttgctacgta ctactgtcaa caggcgtatc agctgcctgt cacgttcggc 780
caagggacca aggtggaaat caaacgggcg gccgccatcg aggtggagca gaagctgatc 840
agcgaggagg acctgctgga caacgagaag agcaacggca ccatcatcca cgtgaagggc 900
aagcacctgt gccccagccc cctgttcccc ggccccagca agcccttctg ggtgctggtg 960
gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga ccgtggcctt catcatcttc 1020
tgggtgcgga gcaagcggag ccggctgctg cacagcgact acatgaacat gaccccccgg 1080
cggcctgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1140
tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1200
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1260
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1485
<210> 172
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 172
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgcgt 120
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt gaggattatg gtatggggtg ggtccgccag 180
gctccaggaa agggtctaga gtgggtctca gcgattggcc gcaacgggtc gcagacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccgcg acaattccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gcgtgccgag gataccgcgg tatattactg tgcgaaactt 360
cggagggggc ggggtctgaa tacgtttacg ttagactact ggggtcaagg aaccctggtc 420
accgtctcaa gcctggtgac cgtgagcagc ggcggcggag gcagcggtgg cggaggcagc 480
ggcggaggcg gtagcgacat ccagatgacc cagtccccat cctccctgtc tgcatctgta 540
ggagaccgtg tcaccattac ttgccgggca agtcaggcga ttgggcggtg gttattgtgg 600
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatcg gtccgggttc ccggttgcaa 660
agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720
ggcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg tactactgtc aacaggcgta tagtctgcct 780
ccgacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacggg cggccgccat cgaggtggag 840
cagaagctga tcagcgagga ggacctgctg gacaacgaga agagcaacgg caccatcatc 900
cacgtgaagg gcaagcacct gtgccccagc cccctgttcc ccggccccag caagcccttc 960
tgggtgctgg tggtggtggg cggcgtgctg gcctgctaca gcctgctggt gaccgtggcc 1020
ttcatcatct tctgggtgcg gagcaagcgg agccggctgc tgcacagcga ctacatgaac 1080
atgacccccc ggcggcctgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1140
gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1200
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1260
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1320
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1380
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1440
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1497
<210> 173
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 173
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ala Arg Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Lys Arg His Glu His Thr Arg Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp Leu Leu Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Gly Pro Gly
180 185 190
Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ala Trp Pro Pro Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 174
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 174
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Pro Pro Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Val Met Leu Arg Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp Leu Leu Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys His Leu Ile Gly Pro Gly Ser
180 185 190
Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Gln Leu Pro Val Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 175
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 175
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Ser Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Asn Thr Phe Thr Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
145 150 155 160
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Arg Trp
165 170 175
Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Gly Pro Gly Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro
210 215 220
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Leu Pro Pro
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250

Claims (55)

1.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域。
2.根据权利要求1所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域特异性结合ASGR1和/或ASGR2，优选ASGR1。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域结合人ASGR。
4.根据权利要求1至3任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域结合一种或多种选自人ASGR1同种型a、人ASGR1同种型b、人ASGR2同种型a、人ASGR2同种型b、人ASGR2同种型c和人ASGR2同种型d的多肽，优选地其中所述抗原识别结构域结合人ASGR1同种型a。
5.根据权利要求1至4任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域以约1pM至约100nM、约1pM至约10nM或者约1pm至约1nM的亲和力结合ASGR。
6.根据权利要求1至5任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域为抗体、抗体片段或源自抗体。
7.根据权利要求1至6任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域为抗原结合片段(Fab)、单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)，优选单域抗体(sdAb)。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域包含一个或多个选自SEQ ID NO:11-73或其含有三个或更少的氨基酸取代的衍生物的CDR区。
9.根据权利要求6至8任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域包含含有：分别为SEQ ID NO:11、12和13；分别为SEQ ID NO:14、15和16；分别为SEQ ID NO:17、18和19；分别为SEQ ID NO:20、21和22；分别为SEQ ID NO:23、24和25；分别为SEQ ID NO:26、27和28；和/或分别为SEQ ID NO:29、30和31的CDR1区、CDR2区和CDR3区；优选地其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
10.根据权利要求6至9任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其含有：
(i)分别为SEQ ID NO:11、12和13；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25；或者分别为SEQID NO:26、27和28；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31；优选地其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:11、12和13以及分别为SEQ ID NO:23、24和25的CDR1区、CDR2区和CDR3区；
(ii)分别为SEQ ID NO:14、15和16；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25；或者分别为SEQID NO:26、27和28；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31；优选地其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:14、15和16以及分别为SEQ ID NO:26、27和28的CDR1区、CDR2区和CDR3区；或者
(iii)分别为SEQ ID NO:17、18和19；以及分别为SEQ ID NO:23、24和25；或者分别为SEQ ID NO:26、27和28；或者分别为SEQ ID NO:29、30和31；优选地其中所述抗原识别结构域包含含有分别为SEQ ID NO:17、18和19以及分别为SEQ ID NO:29、30和31的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
11.根据权利要求1至10任一项所述的工程化Treg，其中所述抗原识别结构域包含或由与SEQ ID NO:74-80的一个或多个具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成，优选地其中所述抗原识别结构域包含或由与SEQ ID NO:74具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。
12.根据权利要求1至11任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含跨膜(TM)结构域和胞内信号传导结构域，以及任选地其中所述CAR包含铰链结构域和/或一个或多个共刺激结构域。
13.根据权利要求1至12任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含一个或多个选自由CD28铰链结构域、CD8α铰链结构域、IgG铰链结构域和IgD铰链结构域组成的组的铰链结构域，优选地所述CAR包含CD8α铰链结构域或CD28铰链结构域。
14.根据权利要求1至13任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含一个或多个选自由CD28 TM结构域、ICOS TM结构域、CD8αTM结构域、CD4 TM结构域、OX40 TM结构域、4-1BBTM结构域和CD3ζTM结构域组成的组的TM结构域，优选地所述CAR包含CD28 TM结构域。
15.根据权利要求1至14任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含一个或多个选自由CD28信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、OX40信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域、CD27信号传导结构域或TNFRSF25信号传导结构域组成的组的共刺激结构域，优选地其中所述CAR包含CD28信号传导结构域。
16.根据权利要求1至15任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含选自由CD3ζ信号传导结构域或其任何同源物、CD3多肽、syk家族酪氨酸激酶、src家族酪氨酸激酶、CD2、CD5和CD8组成的组的胞内信号传导结构域，优选地其中所述CAR包含所述CD3ζ信号传导结构域。
17.根据权利要求1至16任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含：CD8α铰链结构域或CD28铰链结构域；CD28 TM结构域；CD28信号传导结构域；以及所述CD3ζ信号传导结构域。
18.根据权利要求1至17任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含通过自切割或切割结构域连接的信号肽和/或报告肽。
19.根据权利要求1至18任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含或由与SEQ IDNO:149-152或167-169中的一个或多个具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。
20.根据权利要求1至19任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR包含含有STAT5结合基序以及JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序的胞内结构域。
21.根据权利要求20所述的工程化Treg，其中所述胞内结构域包含JAK3-结合基序。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的工程化Treg，其中所述胞内结构域不包含STAT3结合基序。
23.根据权利要求20或权利要求21所述的工程化Treg，其中所述胞内结构域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)。
24.根据权利要求1至19任一项所述的工程化Treg，其中所述CAR不包含含有STAT5结合基序、JAK-1结合基序和/或JAK-2结合基序的胞内结构域，优选地所述胞内结构域不包含STAT5结合基序。
25.根据权利要求1至24任一项所述的工程化Treg，其中所述Treg为CD4+CD25+CD127-T细胞和/或CD4+CD25+FOXP3+T细胞。
26.根据权利要求1至25任一项所述的工程化Treg，其中所述Treg包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸。
27.包含根据权利要求1至26任一项所述的工程化Treg的药物组合物。
28.根据权利要求1至26任一项所述的工程化Treg，或根据权利要求27所述的药物组合物，用于诱导受试者对肝移植的耐受性，或用于治疗和/或预防受试者中的肝移植排斥反应、肝移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病。
29.一种在受试者中诱导对肝移植的耐受性、或者在受试者中治疗和/或预防肝移植排斥反应、肝移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性肝病或炎症性肝病的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至26任一项所述的工程化Treg或根据权利要求27所述的药物组合物的步骤。
30.根据权利要求28所述的用于治疗和/或预防自身免疫性肝病的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求29所述的治疗和/或预防自身免疫性肝病的方法，其中所述自身免疫性肝病是原发性胆汁性胆管炎和/或原发性硬化性胆管炎。
31.根据权利要求28所述的用于治疗和/或预防肝脏炎症性疾病的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求29所述的治疗和/或预防肝脏炎症性疾病的方法，其中所述肝脏炎症性疾病是肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭；和/或其中所述肝脏炎症由酒精、病毒性肝炎、脂肪性肝炎、局部缺血或药物毒性引起，或其中所述肝脏炎症没有可识别的原因。
32.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化调节性T细胞(Treg)或包含所述工程化Treg的药物组合物，用于在受试者中修复和/或再生肝脏组织，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
33.一种促进受试者中肝脏组织修复和/或再生的方法，其包括向所述受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg或包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
34.根据权利要求32所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求33所述的方法，其中所述肝脏已经因局部缺血、部分肝切除术或炎症而损伤和/或损坏。
35.根据权利要求34所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求34所述的方法，其中所述肝脏已经因炎症损伤和/或损坏，其中所述炎症是肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭；和/或其中所述炎症由酒精、病毒性肝炎、脂肪性肝炎、局部缺血或药物毒性引起，或其中所述炎症没有可识别的原因。
36.根据权利要求32、34或35任一项所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求33-35任一项所述的方法，其中所述受试者具有受损的肝再生，优选地由于急性肝衰竭、肝硬化、慢加急性肝衰竭、肝炎、脂肪变性、脂肪性肝炎和年老的一种或多种引起。
37.根据权利要求32或34-36任一项所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求33-36任一项所述的方法，其中所述受试者患有肝硬化、急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭。
38.根据权利要求32或34-37任一项所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求33-37任一项所述的方法，其中所述抗原识别结构域特异性结合一种或多种选自由去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、钠/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)、甘露糖-6-磷酸受体、VI型胶原受体、PDGF受体、A类清道夫受体、B类I型清道夫受体、硫酸乙酰肝素、甘草素受体、HDL-受体、LDL-受体、转铁蛋白受体、胰岛素受体、α-2-巨球蛋白受体、铁蛋白受体、尿纤溶酶原受体、凝血酶受体组成的组的肝脏特异性抗原，优选地所述抗原识别结构域特异性结合ASGR。
39.根据权利要求32或34-38任一项所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求33-38任一项所述的方法，其中所述工程化Treg是根据权利要求1至26任一项定义的。
40.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg，或包含所述工程化Treg的药物组合物，用于增加或刺激受试者肝脏组织中白蛋白的产生，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
41.一种增加或刺激受试者肝脏组织中白蛋白产生的方法，其包括向所述受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg或包含所述工程化Treg的药物组合物的步骤，其中所述CAR包含肝脏特异性抗原识别结构域。
42.根据权利要求40所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求41所述的方法，其中所述抗原识别结构域特异性结合一种或多种选自由去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、钠/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)、甘露糖-6-磷酸受体、VI型胶原受体、PDGF受体、A类清道夫受体、B类I型清道夫受体、硫酸乙酰肝素、甘草素受体、HDL-受体、LDL-受体、转铁蛋白受体、胰岛素受体、α-2-巨球蛋白受体、铁蛋白受体、尿纤溶酶原受体、凝血酶受体组成的组的肝脏特异性抗原，优选地所述抗原识别结构域特异性结合ASGR。
43.根据权利要求40或42所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求41或42所述的方法，其中所述工程化Treg是根据权利要求1至26任一项定义的。
44.一种根据权利要求29-31或33-39或41-43任一项所述的方法，其中所述方法包括如下步骤：
(i)分离或提供来自受试者的富含Treg的样品；
(ii)用编码所述CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染所述Treg细胞，以提供工程化Treg细胞；以及
(iii)将所述工程化Treg细胞施用于所述受试者。
45.根据权利要求28、30-32或34-40或42-43任一项所述用途的工程化Treg或药物组合物，或根据权利要求29-31或33-39或41-44任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物，优选地为人类。
46.一种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域，并且所述CAR进一步包含CD3ζ信号传导结构域。
47.根据权利要求46所述的CAR，其中所述CAR包含含有STAT5结合基序以及JAK1-结合基序和/或JAK2-结合基序的胞内结构域。
48.根据权利要求47所述的CAR，其中所述胞内结构域包含JAK3-结合基序。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的CAR，其中所述胞内结构域不包含STAT3结合基序。
50.根据权利要求47或权利要求48所述的CAR，其中所述胞内结构域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:133)。
51.根据权利要求46所述的CAR，其中所述CAR包含或由与SEQ ID NO:149-152或167-169中的一个或多个具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。
52.一种抗原嵌合受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域包含如权利要求10定义的CDR1区、CDR2区和CDR3区，优选地所述CAR是如权利要求46-51任一项定义的CAR。
53.编码根据权利要求46至52任一项所述的CAR的多核苷酸、核酸或载体。
54.根据权利要求53所述的多核苷酸、核酸或载体，其进一步编码FOXP3多肽。
55.权利要求1至26任一项所述的工程化Treg的生产方法，包括如下步骤：
(i)从受试者中分离含有细胞的样品，或提供含有细胞的样品；以及
(ii)用编码所述CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染所述含有细胞的样品，以提供工程化细胞群；
其中所述含有细胞的样品包含Treg，和/或，在步骤(ii)之前或之后从所述含有细胞的样品富集和/或生成Treg。
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